KR20220069950A

KR20220069950A - 수령 식물의 꽃의 봉쇄된 암술머리에 액체-매개 방식으로 꽃가루를 전달하는 타가 수분

Info

Publication number: KR20220069950A
Application number: KR1020227010014A
Authority: KR
Inventors: 화췬 왕 라루; 리 린
Original assignee: 몬산토 테크놀로지 엘엘씨
Priority date: 2019-10-01
Filing date: 2019-10-01
Publication date: 2022-05-27
Also published as: EP4037473A1; CA3156113A1; EP4037473A4; BR112022005239A2; WO2021066813A1; CN114501985A; US20220338432A1; CN114501985B

Abstract

본 발명은 수령 자성 꽃의 봉쇄된 암술 머리에 꽃가루를 액체-매개로 전달하는 신규한 방법을 제공한다. 예를 들어, 액체-매개 수분을 위한 방법이 제공된다. 제공된 방법은 공여 식물로부터 꽃가루를 채취하는 단계, 채취한 꽃가루를 액체 용액에 현탁하는 단계, 및 수령 식물의 수령 꽃봉오리의 봉쇄된 암술머리에 상기 용액을 도입시켜, 공여 식물로부터 나온 꽃가루로 상기 꽃을 수분시키는 단계를 포함한다.

Description

수령 식물의 꽃의 봉쇄된 암술머리에 액체-매개 방식으로 꽃가루를 전달하는 타가 수분

본 개시 내용은 농업 생명공학 분야에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 공여 식물의 꽃가루 입자(pollen grain)를 수령 식물의 꽃의 봉쇄된 암술머리로 액체-매개 방식으로 전달함으로써 타가 수분(cross-pollination)의 효율성을 개선시키는 방법에 관한 것이다.

서열 목록의 포함

"MONS456WO_ST25.txt"이라는 명칭의 파일에 포함된 서열 목록은 Microsoft Windows 운영 체제에서 측정할 때 12 Kb이며, 2019년 10월 1일에 작성되어, 전자적으로 제출되며, 본원에 참고로 포함된다.

배경

교잡화(Hybridization)는 일시적인 잡종 강세(hybrid vigor)의 도입, 상이한 생식질에서의 바람직한 변화, 전이성 형질 도입(transgenic trait integration)이 가능해지고, 신규한 표현형을 생성할 수 있기 때문에, 농작물 육종에서 중요한 양태이다(Goulet 외, 2017). 식물 육종자는 상이한 작물에서 육종 주기의 시작점으로 교잡화 또는 제어된 타가 수분을 사용한다. 대두와 같은 많은 작물 종을 타가 수분하기 위한 종래의 방법은, 전형적으로 핀셋으로 꽃받침과 꽃잎을 수동적으로 조심스럽게 떼어내어 꽃의 암술머리를 노출시키는 종래의 수분과 관련된다. 이 과정은 꽃의 해부학적 구조와 크기로 인해 복잡하고, 시간이 많이 걸리며, 노동력이 많이 소모된다 (Walker 외, 1979; Talukdar 외, 2012). 전형적인 상업적 육종 프로그램은 개발 교배(development cross), 역교배(backcross) 및 형질 도입(trait integration)과 같은 작업 흐름에서 수천 또는 심지어 수백만 번의 교배가 필요하다. 육종자는 작물 품종 개발을 가속화하고 노동력 요구를 줄이기 위해 더 높은 처리량을 촉진하고 효율성을 개선하는 개선된 교배 방법을 개발하는 것이 중요하다.

요약

일 양태에서, 본 발명은 a) 공여 식물(donor plant)에서 꽃가루를 얻는 단계; b) 상기 꽃가루를 포함한 액체 용액을 생산하는 단계; 및 c) 상기 용액을 수령 식물의 봉쇄된 암술머리(enclosed stigma)에 도입함으로써, 상기 공여 식물의 꽃가루로 꽃을 수분시키는 단계를 포함한, 식물의 봉쇄된 암술머리에 액체-매개로 꽃가루를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 꽃가루 입자는 공여 식물로부터의 복수의 꽃으로부터 얻는다. 다른 구현예에서, 수령 식물의 봉쇄된 암술머리에 상기 용액을 도입하는 단계는 상기 용액을 꽃봉오리에 주입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 상기 수분에 의해 생성된 자손 종자 또는 식물을 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 추가적인 구현예에서, 상기 공여 식물은 상기 자손 식물 또는 종자의 선별을 용이하게 하는 대립 형질(allele)을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 공여 식물에서 꽃가루를 얻는 단계; b) 상기 꽃가루를 포함한 액체 용액을 생산하는 단계; 및 c) 상기 용액을 수령 식물의 봉쇄된 암술머리에 도입함으로써, 꽃봉오리를 공여 식물로부터의 꽃가루로 수분시키되, 여기서 수령 꽃봉오리는 상기 수분 시점에서 웅성 불임(male sterile)인 단계를 포함하는, 식물의 봉쇄된 암술머리에 액체-매개로 꽃가루를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 수령 식물은 유전적으로 웅성 불임이다. 일부 구현에서, 상기 꽃봉오리 또는 상기 수령 식물은 웅성 불임제(gametocide)로 처리되어 웅성 불임을 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 수령 식물은 대두 식물이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 공여 식물에서 꽃가루를 얻는 단계; b) 상기 꽃가루를 포함한 액체 용액을 생산하는 단계; 및 c) 상기 용액을 수령 식물의 봉쇄된 암술머리에 도입함으로써, 꽃봉오리를 공여 식물로부터의 꽃가루로 수분시키되, 여기서 상기 용액은 펙티나아제(pectinase), 증점제, 계면활성제, 수크로스, 미네랄 이온, 식물 성장 조절제, 운반 단백질 및 핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제1 성분을 포함하는 단계를 포함하는, 식물의 봉쇄된 암술머리에 액체-매개로 꽃가루를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 제1 성분은 펙티나아제이다. 추가적인 구현예에서, 상기 펙티나아제는 펙틴 메틸에스테라제이다. 또 다른 추가적인 구현예에서, 상기 용액은 펙틴 메틸에스테라제를 약 1.5 단위/L 내지 약 1500 단위/L의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 제1 성분은 증점제이다. 추가적인 구현에서, 상기 증점제는 잔탄검이다. 또 다른 추가적인 구현예에서, 상기 용액은 약 0.04 중량% 내지 약 0.08 중량%의 잔탄검을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 제1 성분은 계면활성제이다. 추가적인 구현예에서, 상기 계면활성제는 Tween 20이다. 또 다른 추가적인 구현예에서, 상기 용액은 약 0.001 중량% 내지 약 0.01 중량%의 Tween 20을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 제1 성분은 수크로스이다. 추가적인 구현예에서, 상기 용액은 약 10 중량% 내지 약 20 중량%의 수크로스를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 적어도 하나의 제1 성분은 미네랄 이온이다. 추가적인 구현에서, 상기 미네랄 이온은 MgSO₄, ZnSO₄ 및 붕산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가적인 구현예에서, 상기 용액은 약 0.01 중량% 내지 약 0.05 중량%의 MgSO₄을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 용액은 약 0.01 중량% 내지 약 0.05 중량%의 ZnSO₄를 포함한다. 또 다른 추가적인 구현예에서, 상기 용액은 약 0.005 중량% 내지 약 0.02 중량%의 붕산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 제1 성분은 운반 단백질이다. 다른 구현예에서, 운반 단백질은 소 혈청 알부민(BSA)을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 상기 용액은 약 0.01 중량% 내지 약 0.1 중량%의 소 혈청 알부민(BSA)을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 공여 식물에서 꽃가루를 얻는 단계; b) 상기 꽃가루를 포함한 액체 용액을 생산하는 단계; 및 c) 상기 용액을 수령 식물의 꽃봉오리의 봉쇄된 암술머리로 도입함으로써, 상기 꽃봉오리를 공여 식물의 꽃가루로 수분시키는 단계를 포함하는, 식물의 봉쇄된 암술머리에 액체-매개로 꽃가루를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 수분으로부터 생성된 종자를 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 종자로부터 자라난 자손 식물은 자체로 교배되거나, 제2 식물과 교배된다.

또 다른 추가적인 양태에서, 본 발명은 a) 공여 식물에서 꽃가루를 얻는 단계; b) 상기 꽃가루를 포함한 액체 용액을 생산하는 단계; 및 c) 상기 용액을 수령 식물의 꽃봉오리의 봉쇄된 암술머리로 도입함으로써, 상기 꽃봉오리를 공여 식물의 꽃가루로 수분시키는 단계를 포함하는, 식물의 봉쇄된 암술머리에 액체-매개로 꽃가루를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 용액을 도입하기 전에 상기 꽃봉오리에 개구부를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 개구부를 생성하는 단계는 상기 꽃봉오리의 상부를 제거하거나 파열시키는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 웅성 부모로부터 꽃가루-방출 꽃을 채취하는 단계; b) 상기 꽃을 균질화하여 꽃가루를 방출시키는 단계; c) 상기 균질화된 꽃으로부터 꽃 잔해를 제거함으로써 꽃가루를 정제하는 단계; d) 상기 정제된 꽃가루를 정량화하는 단계; 및 e) 상기 정제된 꽃가루를 용액에 현탁시켜 원하는 꽃가루 농도를 포함한 꽃가루 현탁 용액을 생산하는 단계를 포함하는, 타가 수분을 위해 원하는 꽃가루 농도를 포함한 꽃가루 현탁 용액의 생산 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 균질화는 비드 밀(bead mill) 균질기에서 상기 꽃을 갈아주는 단계를 포함한다. 추가적인 구현예에서, 상기 균질화는 액체와 함께 또는 액체 없이 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 정제된 꽃가루는 80% 수크로스 용액 또는 옥수수 유에 현탁된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 공여 식물에서 꽃가루를 얻는 단계; b) 상기 꽃가루를 포함한 액체 용액을 생산하는 단계; c) 상기 용액을 공여 식물과 유전형이 상이한 자성 수령 부모의 꽃봉오리의 봉쇄된 암술머리에 도입하여, 상기 자성 수령 꽃을 상기 공여 식물의 꽃가루로 수분시키는 단계; d) 상기 수분에 의해 생산된 종자를 수확하는 단계; 및 e) 잡종 종자를 식별하는 단계를 포함하는, 잡종 종자를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 수령 식물은 대두 식물이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 공여 대두 식물로부터 얻은 원하는 농도의 꽃가루를 포함한 꽃가루 현탁 용액을 제조하는 단계; b) 상기 꽃가루 현탁 용액을 공여 식물과 유전형이 상이한 자성 부모의 꽃봉오리의 봉쇄된 암술머리에 도입하되, 상기 꽃가루 현탁 용액은 상기 용액을 상기 봉쇄된 꽃봉오리로 주입하거나, 꽃봉오리에 개구부를 생성하여 상기 용액을 상기 개구부로 적용함으로써 상기 암술머리에 도입됨으로써, 상기 꽃을 상기 공여 식물의 꽃가루로 꽃을 수분시키는 단계; 및 c) 상기 수분에 의해 생산된 F₁ 종자를 수확하는 단계를 포함하는, F₁ 잡종 대두 종자를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 용액은 펙티나아제, 증점제, 계면활성제, 수크로스, 식물 성장 조절제, 미네랄 이온, 운반 단백질 및 핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제1 성분을 포함한다. 다른 구현예에서, 자성 부모의 꽃봉오리는 웅성 불임이다. 추가적인 구현예에서, F₁ 종자는 표현형 또는 유전자형 마커를 사용하여 식별된다.

도 1a, 1b, 1c 및 1d: 성숙한 대두 꽃과 예시적인 수령 대두 꽃봉오리의 이미지를 나타낸다. 도 1a는 5개의 꽃잎이 암술과 10개의 수술을 감싸는 성숙한 대두 꽃의 해부구조를 나타낸다. 도 1b는 꽃가루를 배출하는 성숙한 수술군(androecium)과 암술군(gynoecium)을 나타내는데, 9개의 수술은 암술 주위에서 관을 형성하는 반면, 10번째 수술은 자유롭게 유지된다. 도 1c는 타가 수분시 수령 꽃으로 작용하기에 적합한 대표적인 꽃봉오리를 나타낸다. 도 1d는 적합한 수령 꽃봉오리의 상세 해부 구조를 나타내는데, 암술머리는 꽃밥이 아직 꽃가루를 배출하지 않는 동안 꽃가루를 수용하게 된다.
도 2: 꽃가루 입자의 수집, 정제 및 저장을 포함한 꽃가루 용액의 제조 단계에 대한 개략도를 나타낸다. 사용된 각각의 추출 완충액에 기초하여, 상이한 저장 완충액을 사용할 수 있다. 예를 들어, 20% 수크로스를 추출 완충액으로 사용하는 경우, 정제된 꽃가루는 4℃에서 80% 수크로스에 저장될 것이다. 오일을 추출 완충액으로 사용하는 경우, 정제된 꽃가루는 -20℃에서 오일에 저장될 것이다.
도 3: 계면활성제가 시험관내 꽃가루 발아율에 미치는 영향을 나타낸다. 꽃가루 입자는 표시된 농도에서 상이한 계면활성제를 함유하는 꽃가루 발아 배지 (GM: 20% 수크로스, 0.03% 질산칼슘, 0.01% 붕산)에 첨가하였다. 25℃에서 2시간 동안 배양한 후, 발아율을 기록하였다 (평균 SE; n = 3회 반복, 각 반복당 100-150개의 꽃가루 입자). 꽃가루 입자는 관의 길이가 꽃가루 입자의 직경보다 클 때 발아된 것으로 간주된다.
도 4: 상이한 농도의 잔탄검을 함유한 현탁액에서 꽃가루 균일성의 측정을 나타낸다. 수집 시점은 x-축 (분 단위)에 표시되고, 꽃가루 현탁률 (용액 상부로부터 수집/용액 하부로부터 수집)은 y-축 (평균 SE; n = 3)에 표시된다.
도 5a, 5b, 5c 및 5d: 꽃의 봉쇄된 암술머리에 액체-매개로 꽃가루를 전달하는 예시적인 방법의 이미지를 나타낸다. 도 5a는 꽃봉오리에 꽃가루 용액을 주입하는 것을 나타낸다. 도 5b는 꽃봉오리의 끝부분이 제거된 꽃봉오리에 한 방울의 꽃가루 용액을 적용하는 것을 나타낸다. 도 5c는 꽃봉오리의 끝부분을 제거하기 위한 암술머리 위의 절단선을 나타낸다. 도 5d는 적색 염료로 표시된 것처럼 암술머리에 액체가 성공적으로 전달된 것을 나타낸다. 적색 염료는 암술머리에 꽃가루 용액이 전달된 것을 나타내는 지표로서 꽃가루 용액에 포함되었다. 적색 염료 (Allura Red AC 0.01%)를 갖는 액체 꽃가루 용액 (20% 수크로스, 0.04% 잔탄검, 15 U/L PME, 0.001% Tween 20 및 꽃가루)을 꽃봉오리에 주입하였다. 5분 후, 꽃봉오리를 절개하여 암술머리의 적색 얼룩 (화살표로 표시됨)을 확인하였다.
도 6a, 6b, 6c 및 6d: 상이한 수분 기술의 대표적인 종자 착립(seed sets)의 이미지를 나타낸다. 도 6a는 종래의 수분 기술에 의해 타가 수분된 ms6 웅성-불임 식물에서의 대조 종자 착립의 이미지를 나타낸다. 도 6b는 주입에 의해 액체 용액 중에 전달된 공여 꽃가루로 타가 수분된 ms6 웅성-불임 식물에서의 종자 착립의 이미지를 나타낸다. 도 6c는 표준 대조 수분 기술에 의해 수분된 웅성-불임 식물에서의 대조 종자 착립의 이미지를 나타낸다. 도 6d는 주입에 의해 액체 용액 중에 전달된 공여 꽃가루로 타가 수분된 웅성-불임 식물에서의 종자 착립의 이미지를 나타낸다. 도 6c와 6에서, 마커-기반의 유전형 분석을 사용하여 타가 수분에 의해 생산된 종자 착립의 "잡종" 특성을 확인하였다.
도 7a, 7b 및 7c: 웅성 불임제를 사용하여 웅성 불임을 유도할 때의 종자 착립의 이미지를 나타낸다. 도 7a는 완전한 종자 착립 꼬투리(pod)를 갖는 수정 식물(fertile plant)의 대표적인 이미지를 나타낸다. 도 7b는 교배 없이 종자 착립을 생성하지 않는 웅성 불임을 유도하기 위해, 250ppm의 말레산 하이드라지드로 처리한 수정 식물의 대표적인 이미지를 나타낸다. 도 7c는 말레산 하이드라지드 처리에 의해 웅성 불임화되고 후속적으로 타가 수분된 꽃에서 생성된 종자 꼬투리의 대표적인 이미지를 나타낸다.

현대의 식물 육종은 각 부모 계통에서 얻은 특정 유전 형질을 가진 자손 식물을 생성하기 위해 타화수정(outcrossing) 또는 타가 수분에 의존한다. 따라서, 처리량과 효율성은 F₁ 집단의 개발과 형질 도입의 작업흐름에서 효율에 필수적인 역할을 하였다. 대두 (Glycine max)는 경제적으로 중요한 농작물이지만 제어된 교차 수분의 낮은 효율성 과정으로 인해 육종이 방해를 받고 있다. 대두는 콩과(Fabaceae family) 중 콩아과(Papilionoideae subfamily)에 속하는 개화 식물이다. 대두의 꽃은 암술을 둘러싸고 있는 5개의 꽃잎 (기판(banner petal) 1개, 익판(wing petal) 2개 및 용골판(keel petal) 2개) 및 10개의 수술로 이루어져있다. 10개의 수술 중 9개는 암술 주위에서 관을 형성하고, 10번째는 자유롭게 남아 있다. 이 구조는 꽃밥으로부터의 꽃가루를 암술머리 (도 1a 및 1b)로 직접 배출한다. 전형적으로, 꽃가루는 꽃이 피기 (개화) 직전 또는 직후에 배출되어, 높은 수준의 자가 수분이 이루어지며, 자연적인 타화수정률은 전형적으로 1% 미만이다 (Vollmann 외, 1992). 초기에, 대두 육종자들은 손으로 웅성 불임화시킨 후 수분을 통해 교잡을 수행하였다. 약 50년 전, 수분 접근법의 효율성은 웅성 불임화 단계를 건너뛰는 기술을 통해 더욱 개선되었다. 그 이후로, 이러한 개선된 접근법은 대두의 타가 수분에 대한 골드 스탠다드 (gold standard)로 남아 있었다 (Walker 외, 1979; Talukdar 외, 2012). 그러나, 이러한 기존의 수분 방법은 여전히 매우 고되고, 시간이 많이 소요되며, 전형적으로 다음과 같은 단계을 포함한다: (1) 자성 부모의 선택된 꽃봉오리에서 꽃받침을 떼어내는 단계; (2) 암술머리를 노출시키기 위해 꽃잎을 하나씩 떼어내는 단계; (3) 웅성 부모에서 활짝 핀 꽃(bright, opened flower)을 찾는 단계; (4) 꽃밥이 보일 때까지 꽃잎을 하나씩 떼어내는 단계; 및 (5) 웅성 공여 부모의 꽃밥을 자성 부모의 암술머리에 문지르는 단계. 본 발명은 놀랍게도 수령 식물 꽃의 봉쇄된 암술머리에 액체-매개로 꽃가루를 전달시켜 타가수분을 허용함으로써, 종래의 교배 기술과 같이 꽃받침 및 꽃잎을 손으로 떼어낼 필요성을 배제할 수 있다는 점에서 당업계의 유의한 발전을 나타낸다. 본원에 사용된 “봉쇄된 암술머리"는, 교배시 여전히 꽃잎 및 꽃받침과 같은 꽃의 구조로 둘러싸인 꽃의 암술머리를 지칭한다. 본원에 기재된 액체-매개의 꽃가루 전달 시스템을 사용한 성공적인 타가 수분을 보장하기 위해서는, 수령 자성 꽃을 최적 발달 단계에서 사용되어야 한다. 이 단계에서, 암술머리는 꽃가루 입자에 수용적이, 꽃밥은 아직 꽃가루를 배출하지 않았다.

따라서, 본 기재 내용은 공여 꽃가루를 수령 꽃의 봉쇄된 암술머리에 전달하기 위한 대량 처리 방법의 구현을 허용한다. 본원에 제공된 방법은 이전에 대두에서 타가 수분을 용이하게 하는데 필요했었던 시간과 노력을 실질적으로 감소시킨다. 근대의 식물 육종 프로그램에서는 형질이 개선된 새로운 식물 품종을 생산하기 위해 년간 기준으로 수천 또는 심지어 수백만 번의 개별적인 교배가 필요했었기 때문에, 이 방법은 특히 유의하다.

액체 수분 용액의 제형화

일 양태에서, 본 발명은 공여 식물로부터 꽃가루를 얻고, 수분시 추가로 사용하기 위해 상기 꽃가루를 포함한 액체 용액을 생산하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된, "꽃가루"는 적어도 하나의 꽃가루 입자를 지칭하며, 꽃가루 입자를 여러 개 포함할 수도 있다. 일반적으로, 꽃가루를 균일하게 분산하고 용액 내 꽃가루 입자의 생존성을 높게 유지하는 성분이 함유된 용액을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 용액의 생산에 사용할 수 있는 성분의 비-제한적인 예가 본원에 제공되어 있는데, 특정 구현예에서는 펙티나아제, 증점제, 계면활성제, 수크로스, 미네랄 이온, 식물 성장 조절제, 및 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 증점제는 꽃가루를 용액에 균일하게 분산시키는 작용을 하는 잔탄검일 수 있는데, 일 예로서 약 0.04 중량% 내지 약 0.08 중량% 농도의 잔탄검이 용액 중에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 용액은 수용액일 수 있거나, 또는 다른 용매에 포함될 수 있다. 추가적 구현예에서, 용액은 삼투압 조절제로 작용하는 수크로스를 포함하는데, 예를 들어 약 10 중량% 내지 약 20 중량%의 농도로 용액 중에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 펙티나아제는 꽃가루-암술머리 상호작용의 촉진제로 작용하는 펙틴 메틸에스테라제(PME)인데, 예를 들어 약 1.5 단위/L 내지 약 1500 단위/L의 농도로 용액에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 액체 침투를 개선시키는 역할을 하는 Tween 20이며, 예를 들어 약 0.001 중량% 내지 약 0.01 중량%의 농도로 용액 중에 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 용액은 복수의 대두 꽃가루 입자를 포함하며, 이하의 성분: 약 0.04% 내지 약 0.08%(w/v)의 잔탄검; 약 10% 내지 약 20%(w/v)의 수크로스; 약 0.01 mg/L 내지 약 10 mg/L의 PME; 및 약 0.001% 내지 약 0.01%(v/v)의 Tween 20를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용액은 또한 펙티나아제를 안정화하는 운반 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민(BSA)도 약 0.1mg/ml 농도로 포함할 수 있다. 식물 성장 조절인자, 예컨대 약 10^-5M 내지 약 10^-8M의 농도로 존재하여 꽃가루 발아와 화분관 성장을 조절하는 지벨렐린산(GA); 약 0.01% 내지 약 0.05%의 농도에서 Ca²⁺ 흡수 및 결합을 지원하는 MgSO₄; 및 약 0.01% 내지 약 0.05%의 농도에서 화분 발아와 화분관 성장을 촉진하는 ZnSO₄; 및 약 0.005% 내지 약 0.02%의 농도에서 꽃가루의 발아와 화분관 성장을 조절하는 붕산도 존재할 수 있다.

또한, 본 발명은 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 공여 꽃가루의 수집 및 정제 방법도 제공한다. 일부 구현예에서, 공여 꽃가루는 꽃가루를 함유한 꽃을 가공하여 꽃가루를 방출함으로써 얻는다. 바람직한 구현예에서, 비드 밀 균질기를 사용하여 꽃을 부드럽게 갈아서 꽃으로부터 꽃가루를 배출시킨다. 꽃은 액체를 사용하거나 액체 없이 갈릴 수 있다. 방출된 꽃가루를 정제하여, 꽃의 잔해를 제거하고, 회전시켜 정제된 꽃가루 입자를 모았다. 일단 꽃가루 입자가 정제되면, 본원에 기재된 수분 용액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 정제된 꽃가루 입자는 80% 수크로스 용액 또는 오일에 재현탁되어, 각각 4℃ 또는 -20℃에서 또는 꽃가루의 생존력을 보존하는 유사 조건에서 보관할 수 있다. 바람직한 구현예서, 수집된 대두 꽃가루 입자는 재현탁되어, 옥수수유에 보관된다. 옥수수유는 더 비싸고 성가신 대체품인 냉동보존만큼이나 꽃가루 보존 효과가 있는 것으로 보인다. 미네랄 오일, 대두유, 및 올리브유를 사용하여 크로탈라리아 레투사 L.(Crotalaria retusa L.)의 꽃가루 입자를 저장할 수 있다고 보고되었다(Jain and Shivanna, 1990). 또한, 일부 유기 용매, 예컨대 벤젠, 석유, 디에틸 에테르, 사이클로헥산, 부탄올, 및 프로판올은 막의 인지질을 추출하지 않은 채 꽃가루를 저장하는데 매우 적합하다(문헌[Mishra and Shivanna, 1982]; 문헌[Diaz 외, 2007]). 일부 구현예에서, 정제된 꽃가루는 예를 들어 혈구계(hemocytometer)를 사용하여 정량화된다. 이로 인해 사전-결정된 양의 꽃가루 입자를 수분 용액에 첨가할 수 있게 되어, 원하는 밀도의 꽃가루 입자를 얻을 수 있다. 당업계의 숙련자는 본 개시 내용을 고려하여, 본원에 개시된 방법을 사용하면 식물 품종과 환경 조건에 기초하여 어떠한 특정 수령 식물에 대해서도 꽃가루의 원하는 밀도 수준을 최적화할 수 있다는 점을 알 것이다.

식물의 수분을 위한 꽃가루 용액의 전달

본 발명은 놀랍게도 잠재적으로 모든 식물의 타가 수분도 허용한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 공여 식물로부터 꽃가루를 얻는 단계, 상기 꽃가루를 포함한 액체 용액을 생산하는 단계, 및 상기 용액을 수령 식물의 꽃봉오리에 도입함으로써 꽃을 공여 식물의 꽃가루로 수분시키는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 수분 용액을 꽃봉오리로 전달하기 위한 최적 발달 단계를 결정할 수 있다. 이것은 본원에 기재된 방법을 사용하여 경험적으로 결정될 수 있다. 타가 수분을 촉진하기 위해서는, 암술머리가 꽃가루를 수용하지만 아직 꽃밥이 꽃가루를 방출하지 않은 특정 시기 동안, 꽃가루 입자를 함유한 액체 용액을 수령 꽃에 전달하는 것이 바람직하다. 대두에서, 꽃봉오리 발달의 B1 단계 즈음이 타가 수분에 효과적인 것으로 밝혀졌다(Peterson 외, 1992). 이 단계 동안, 화관(corolla)은 보이지만 꽃봉오리 내의 악편(calyx lobe) 너머로 신장되지는 않으며, 암술머리는 꽃잎과 꽃받침으로 둘러싸여 있다(도 1c 및 1d).

특정 구현예에서, 꽃가루 용액은 상기 용액을 꽃봉오리로 주입하여 용액을 암술머리와 접촉시킴으로써 수령 식물의 꽃봉오리로 도입될 수 있다. 주입은 암술머리와 밑씨를 파괴시키지 않고 원하는 양의 용액을 꽃봉오리에 주입하는 기능을 갖는 임의의 장비를 사용하여 실시될 수 있다. 비-제한적인 예는 주사기이다(도 5a).

일부 구현예에서, 꽃봉오리는 공여 꽃가루를 함유한 용액을 사용하여 타가 수분이 용이하도록 변형될 수 있다. 특정 양태에서, 꽃봉오리의 끝 일부를 절단하여 제거함으로써, 꽃가루 용액을 위한 개구부를 생성하여, 꽃봉오리는 대부분 온전하나 암술머리와 접촉할 수 있게 된다(도 5b 및 5c).

추가적인 구현예에서, 본 발명의 방법은 꽃가루 용액으로 상기와 같이 수분시켜 생성된 자손 종자 또는 식물을 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 이로 인해 꽃가루 공여자의 자손 식물 또는 종자를 식별하는 작용을 하는, 꽃가루 공여자에 함유된 다형성 마커 대립형질을 용이하게 사용할 수 있게 된다. 형태 마커 또는 생화학/단백질 마커는 통상 육종시 원하는 형질을 갖는 식물을 선별하기 위한 수단으로 사용되었다. 널리 사용되었고 식물 육종에 적용하기에 특히 유망한 분자 마커 기술은 이하의 것들을 포함한다: 제한 절편 길이 다형성(RFLP), 증폭 절편 길이 다형성(AFLP), 무작위 증폭 다형성 DNA(RAPD), 현미부수체(microsatellite) 또는 단순 서열 반복부(SSR), 및 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)(Al-Khayri 외, 2016).

또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 수분 시점에서 웅성 불임인 꽃을 수분시키는 단계를 포함할 수 있다. 대두의 꽃에서 암술머리가 노출되지 않는다는 점을 고려하면, 꽃의 발달 단계에 따라서, 예를 들어 타가 수분에 적용된 공여 꽃가루가 수령 식물에 의해 생산된 꽃가루와 경쟁할 수 있다. 타가 수분의 효능을 개선시키기 위하여, 일부 경우에 자가 수정과의 경쟁을 줄이려는 노력에서 수령 식물의 꽃이 웅성 불임인 편이 유리할 수 있다. 따라서, 웅성 불임 시스템은 특정 교배시 자성(꽃) 부모 식물과 함께 이용될 수 있다. 이러한 많은 웅성 불임 시스템이 잘 알려져 있으며, 세포질 웅성 불임(CMS)과 유전자 웅성 불임(GMS)을 포함한다. CMS와 GMS는 많은 작물에서 잡종 종자의 생산을 촉진하여, 육종자가 잡종 강세(heterosis)와 관련된 수확 입자(yield gain)를 활용할 수 있게 된다. 대두에서 11개의 웅성-불임인 자성-수정 돌연변이(ms1, ms2, ms3, ms4, ms5, ms6, ms7, ms8, ms9, msMOS, 및 msp)를 식별하였다(Graybosch 및 Palmer, 1988). 웅성 불임제의 사용은 웅성 불임을 생산하기 위한 대안적인 방법을 제시한다. 몇몇 웅성 불임제는 다양한 작물에서 꽃가루 불임을 유도하는데 효과적인 것으로 보고되었고, 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 웅성 불임제는 소듐 메틸 아르세네이트, 2,3-디하이드로이소부티레이트, 소듐 2,2-디클로로프로피오네이트, 지베렐린산, 말레산 하이드라지드 (1,2-디클로로피리다진, 3-6-디온), 2,4-디클로로 페녹시 아세트산, 에틸 4-플루오로옥사닐레이트, 트리할로겐화 메틸술폰아미드, 에틸 및 메틸 아르세네이트를 포함한다(Ali 외, 1999).

일부 구현예에서, 수령 식물의 꽃봉오리의 봉쇄된 암술머리에 꽃가루 용액을 도입하는 단계는 꽃봉오리당 약 10초의 속도로 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, 수분은 꽃당 평균 약 20초, 약 30초, 약 40초 또는 약 60초 미만이 걸리는 것으로 정의된다. 이것은 꽃당 최대 5분이 걸릴 수도 있는 전통적인 수분 방법보다 유의하게 더 빠르다. 따라서, 개시된 방법은 전통적인 방법보다 약 20-30배 더 빠를 수 있다. 그렇기 때문에, 본 발명의 매우 효율적인 방법은 대량 처리 시스템에서 잘 구현될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명의 방법을 여러 식물에 대해 동시에 수행하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 여러 식물은 적어도 약 10개, 50개, 100개, 250개, 500개, 1,000개, 5,000개, 10,000개, 50,000개 또는 100,000개, 또는 그 이상의 식물을 포함한다. 상기 방법은 들판, 또는 온실이나 통제된 성장 환경, 예컨대 온실 또는 성장 챔버에서 수행할 수 있다.

본원에 개시된 방법은 암술머리가 교배 시점에 꽃잎 및 꽃받침과 같은 꽃 구조에 의해 여전히 둘러싸인 자성 수령 꽃을 갖는 잠재적으로 모든 식물의 타가 수분을 개선시키기 위해 구현될 수 있다. 이러한 식물은 대두, 보리, 밀, 쌀, 상추, 병아리콩, 땅콩, 가지, 후추 및 토마토를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

변형된 식물 및 종자

본 발명의 일 양태는 본원에 기재된 방법으로 생성된 자손 식물과 종자의 선별을 제공한다. 일부 구현예에서, 자손 식물과 종자는 부모 꽃 식물에 비해 탐지가능한 변형을 포함한다고 정의될 수 있다. 이러한 식물과 종자를 생산하는 한 가지 방법은, 식물의 유전자 형질전환에 의해 생산된 대립 형질을 이용하는 것이다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 숙주 식물 세포의 형질전환에 적합한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며(예를 들어, 재조합 DNA 제작물이 식물 염색체로 안정하게 통합됨), DNA를 세포에 도입할 수 있되 당업계에도 잘 알려져 있는 임의의 방법을 포함한다. 세포 형질전환을 위해 널리 사용되는 몇 가지 방법은, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개의 형질전환, 미세투사 유전자총(microprojectile bombardment)-매개의 형질전환, 및 DNA 변형제의 세포 침투 펩타이드-매개의 전달이다.

변형된 식물과 종자를 생산하는 또 다른 방법은, 게놈 편집을 사용하는 것이다. 본원에서 사용되는 "게놈 편집"이란 용어는, 게놈 편집 방법과 부위-특이적 게놈 변형 효소를 사용하여 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 것을 말한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 의해 정제된 공여 꽃가루는 당업계에 알려진 기술에 의해 형질전환되어, 식물에서 게놈-특이적 변형을 매개하는 하나 이상의 시약을 함유할 수 있다. 본 발명에 의하면, 임의의 현재 또는 이전 세대에서 시약을 사용하여 생성된 유전자좌위(loci)의 임의의 이러한 시약을 포함한 꽃가루 입자가 사용될 수 있다.

사전-결정된 염색체 부위의 야생-형 DNA 서열을 변화시키는 적합한 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법을 포함한다. 게놈 편집 방법 및 시약을 사용한 식물 게놈의 표적화 변형을 사용하여, 식물 게놈의 DNA를 변형시킴으로써 개선된 식물 라인을 생성할 수 있다. 또한, 게놈 편집 방법 및 시약은 식물 게놈에 관심있는 하나 이상의 핵산을 표적화 방식으로 삽입하는데 도움이 될 수 있다. 식물 게놈에 공여 폴리뉴클레오티드를 도입하거나 식물의 게놈 DNA를 변형하는 예시적인 방법은, 다음과 같은 게놈 편집 시약의 사용을 포함한다: 서열-특이적 재조합효소, 엔도뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제, 조작되거나 자연적인 메가뉴클레아제(meganuclease), TALE-엔도뉴클레아제, RNA-유도 엔도뉴클레아제(예를 들어, 규칙적으로 군집을 이루어 산재된 짧은 회문 반복부(CRISPR)/Cas9 시스템, CRISPR/Cpf1 시스템, CRISPR/CasX 시스템, CRISPR/CasY 시스템, CRISPR/캐스케이드 시스템), 및 CRISPR-관련 전이효소((Strecker 외, 2019) 및 (Klompe 외, 2019)). 몇 가지 구현예는 문헌[Sauer 외 (Plant Physiol. 170(4):1917-1928; 2016)]에 기재된 바와 같이, 식물 게놈에 정밀한 염기쌍 변형을 도입하기 위해 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 사용하는 게놈 편집 방법과 관련된다.

본원에 사용된 "부위-특이적 게놈 변형 효소"라는 용어는, 서열-특이적 방식으로 뉴클레오티드 서열을 변형시킬 수 있는 임의의 효소를 말한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 게놈 변형 효소는 단일-가닥 파괴를 유도하여 게놈을 변형시킨다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 게놈 변형 효소는 이중-가닥 파괴를 유도하여 게놈을 변형시킨다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 게놈 변형 효소는 시티딘 디아미나제(adenine deaminase)를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 게놈 변형 효소는 아데닌 디아미나제(adenine deaminase)를 포함한다. 본 개시 내용에서, 부위-특이적 게놈 변형 효소에는 엔도뉴클레아제, 재조합효소, 전이효소, 디아미나제, 헬리카제 및 이들의 임의의 조합이 포함된다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 게놈 변형 효소는 서열-특이적 뉴클레아제이다.

실시예

실시예 1. 꽃가루의 채취, 정제 및 저장을 위한 개선된 방법

일부 식물, 특히 대두에서는, 꽃의 크기와 구조 때문에 꽃가루를 채취하기 어렵다. 또한, 대두의 꽃가루 입자는 크기가 비교적 작으며(약 26 μm), 꽃 한 송이에 비교적 적은 양으로 존재한다(대략 3000-7000개의 꽃가루 입자/꽃)(Palmer 외., 1978). 본원에 기재된 방법을 사용하여 대-규모 수분에 대한 필요성을 충족시키기 위해, 공여 꽃가루의 채취, 정제 및 저장을 최적화하기 위한 액체-매개 플랫폼을 개발할 수 있다. 이것은 (예를 들어, 비드 밀 균질기를 사용하여 액체를 사용하거나 액체 없이 균질화함으로써) 채취된 꽃을 파괴하여 꽃가루를 방출시키는 단계, 파괴된 꽃을 여과하여 방출된 꽃가루를 정제하는 단계, 원심분리를 통해 정제된 꽃가루를 채취하는 단계, 및 정제된 꽃가루를 저장용 용액 또는 액체 수분에 적합한 용액에 재현탁시키는 단계를 포함한다(도 2). 정제된 꽃가루는 나중에 사용하기 위해 4℃의 80% 수크로스 용액, -20℃의 옥수수유 또는 임의의 다른 적합한 저장 용액에 보관될 수 있다.

정제된 꽃가루는 혈구계를 사용하여 정량화하여, 정제 과정에서 얻은 꽃가루 입자의 수를 결정할 수 있다. 꽃가루의 정량화를 통해 원하는 밀도의 꽃가루를 함유한 꽃가루 용액을 생산하고, 고정량이 일관되게 투여되도록 보장할 수 있는데, 이는 상이한 꽃가루 용액을 시험한 효율 검정에서 얻은 결과에 변동성이 커질 가능성을 감소시키고, 추가로 그 잔해가 수분의 효율에 미치는 영향력을 감소시킨다. 이러한 간단하고 빠른 방법은 어떠한 다른 종에 대해서도 정제된 꽃가루를 채취 및 저장할 수 있다.

실시예 2. 꽃가루 전달을 위한 용액의 개발

식물의 액체 수분을 위하여, 공여 식물에서 얻은 꽃가루 입자를 액체 용액에 혼합하여, 이를 꽃봉오리에 용이하게 전달할 수 있다. 꽃가루 액체 용액 내의 성분과 그 농도는, 꽃가루의 생존력 그 자체뿐만 아니라 수분된 식물에서 잡종 종자의 착립 성공률에도 영향을 주기 때문에, 용액의 효능에 중요하다. 그러나, 특정 꽃가루 용액내 성분과 농도를 최적화하여 효율을 개선시킬 수 있지만, 아래의 표 1에 설명된 바와 같이 수분시킬 수 있으면서도 다수의 치환과 변형이 가능하다.

표 1. 다양한 꽃가루 용액을 사용하여 수분시킬 때, 꼬투리-착립의 성공률 측정

꽃가루 액체 용액과 식물 조직 사이의 표면 장력을 낮추기 위해, 화분관 성장을 방해하지 않고 꽃가루 액체 용액을 암술머리에 전달하는 데 도움이 되는 적합한 계면활성제를 식별하기 위한 시험을 실시하였다. Tween 20, Pluronic, Silwet L-77 및 Triton X-100을 포함한 상이한 계면활성제를 용량 적정에 의해 시험하였다. 0.001% Tween 20을 함유한 발아 완충액은 대조군과 비슷한 꽃가루 발아율을 나타내었다(도 3a). 초기의 액체 수분 검사를 위해 Tween 20, Pluronic 및 Silwet L-77을 선택하여, 0.001%의 농도로 사용하였다(상기 표 1).

용액 내 꽃가루의 분산을 개선하기 위해, 상기 액체 용액에 잔탄검을 사용하는 경우도 시험하였다. 이 시험은 0.01% 내지 0.08%의 잔탄검을 함유한 용액이 든 시험관에 꽃가루를 첨가하여 실시하였고, 각각의 꽃가루 용액은 혼합한 후 건드리지 않은 상태로 두었다. 혼합 후 0분, 30분, 60분 및 90분 시점에 시험관의 상부와 하부에서 20 μl 의 꽃가루 현탁액 샘플을 채취하여, 슬라이드 위에 두었다. 꽃가루 입자의 수를 세고, 그 과정을 3회 반복하여 꽃가루 현탁률(시험관 상부에서 채취한 용액 중 꽃가루의 수 대 시험관의 하부에서 채취한 용액 중 꽃가루의 수의 비율)을 도출하였는데, 이는 현탁액 내 꽃가루의 분포 수준을 나타낸다(도 4). 이 연구에서, 0.4%-0.8% 농도로 사용된 잔탄검은 꽃가루 현탁액을 위한 최적의 범위인 것으로 나타났다.

수크로스는 삼투압의 주요 조절자로 사용된다. 농도가 너무 높거나 너무 낮으면, 삼투성의 균형이 파괴되어 용액 내 꽃가루의 생존성이 상실된다. 수크로스 농도가 액체 수분에 미치는 영향을 시험하였다(상기 표 1). 시험된 꽃가루 액체 용액 중 10%-20%의 수크로스가 양성의 결과를 가져오는 것으로 관찰되었다.

펙티나아제를 사용하여, 액체 용액 내 꽃가루에서 수분 성공률을 개선하는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 펙티나아제에는 펙틴 메틸에스테라제(PME) 또는 폴리갈락투로나제(PG)가 포함될 수 있다. 다양한 농도의 PG 또는 PME를 함유한 액체 용액내 꽃가루를 사용하여, 꼬투리-착립 성공률을 결정하기 위한 실험을 실시하였다. 각각의 꽃가루 용액은 시도당 15-20개의 샘플을 사용하여 3회의 독립적인 시도로 시험하였다. 0.005 U/L - 5 U/L 범위의 농도로 PG를 함유한 배지에 꽃가루 입자를 현탁할 때, 꼬투리 착립의 성공률은 대조군과 유의한 차이가 없었다. 1.5 U/L, 150 U/L 및 1,500 U/L의 농도로 PME를 보충한 배지도 또한 수분에 유의한 영향을 나타내지 않았지만, 15U/L의 농도로 PME를 보충한 배지는 대조군(20% 수크로스, 0.04% 잔탄검 용액에서 0 U/L PME)에 비해 꼬투리 착립의 성공률이 더 높았다. 결과는 상기 표 1에 나타나 있다. 15 U/L의 PME를 첨가함으로써 꼬투리 착립의 백분율이 증가하여, 종래의 타가 수분 기술과 비슷한 성공률을 얻었다.

본원에 기재된 꽃가루 액체 용액에는, 추가적인 성분이 이용될 수 있다. BSA(0.1mg/ml)는 펙티나아제를 포함한 용액내 운반 단백질로 사용되어, 효소 활성의 손실을 방지할 수 있다. MgSO₄(0.01%-0.05%)는 Ca²⁺ 흡수 또는 결합을 지원하는 것으로 생각된다. ZnSO₄는 화분관 성장 도중 자유 라디칼로부터 화분관을 보호하는 것으로 생각된다. 붕소는 화분관 생장과 관련하여 막의 펙틴 합성에 직접 관여하는 것으로 생각된다. 꽃가루 액체 용액에 붕산과 함께 MgSO₄ 및 ZnSO₄을 첨가하면, 액체 수분의 성공률이 개선되는 것으로 관찰되었다. 액체 수분 용액에 MgSO₄ 및 ZnSO₄ 둘 다를 PME와 함께 첨가할 때 성공률은 64%에 도달했으며, 이는 종래의 타가-수분을 사용한 타가-수분 기술을 사용할 때의 성공률과 비슷하다(상기 표 1).

실시예 3: 대두 식물의 액체-매개 꽃가루 전달

적합한 액체-매개의 꽃가루 전달 방법은 대두의 꽃봉우리를 사용한 염료 검사 방법에 의해 평가하였다. 주입 완충액(20% 수크로스, 0.04% 잔탄검, 15 U/L PME, 0.001% Tween 20 및 Allura Red AC 0.01%)은, 가장 긴 꽃받침의 접힌 지점에 주사 바늘을 삽입하고 과다 액체가 흘러 나올 때까지 완충액을 주입함으로써, 드리워진(hooded) 꽃봉오리에 주입하였다. 주사한 지 5분 후에, 꽃봉오리를 절개하여 암술머리의 적색 얼룩을 검사하였다. 암술머리의 적색 얼룩은, 투여된 액체가 암술머리와 성공적으로 접촉했음을 나타내었다(도 5d).

개별 성분을 시험한 실험에서 얻은 결과에 기초하여, 대두에서 꽃가루 전달용 용액에 유익한 성분은 이하의 성분: 잔탄검: 0.04% - 0.08%(w/v); 수크로스: 10-20%(w/v); PME: 0.01-10 mg/L; 및 Tween 20: 0.001% - 0.01%(v/v)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다고 결정하였다. 액체 용액은 또한 PME를 안정화하기 위한 BSA(0.1mg/ml); 및 미네랄 이온, 예컨대 Ca²⁺의 흡수 또는 결합을 지원하기 위한 MgSO₄ (0.01%-0.05%); 꽃가루 발아 및 화분관 성장을 촉진하기 위한 ZnSO₄(0.01%-0.05%); 및 꽃가루 발아와 화분관 성장을 조절하기 위한 붕산(0.005% ~ 0.02%)도 포함할 수 있다. 이러한 성분 및 기타 성분은 주어진 응용에 맞게 최적화될 수 있다.

이를 분석하기 위해, 다양한 농도의 성분들의 조합을 포함한 꽃가루 용액을 액체 수분 용도로 제조하였다. 꽃가루 수집을 위해, 웅성 공여 식물의 활짝 핀 꽃들을 선택하였다. 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 꽃가루를 수집하였다. 정제된 꽃가루를 다른 액체 수분 용액에 재현탁하였다(상기 표 1). 웅성-불임인 자성 부모에서, 수분을 위해 아직 피지 않은 꽃봉오리를 선택하였다. 2-5 μl 부피의 꽃가루 용액을 아직 피지 않은 각각의 꽃봉우리에 주입함으로써, 꽃가루 용액을 수령 식물의 봉쇄된 암술 머리에 전달하였다. 액체-매개 수분군 및 대조군(종래의 수분)을 꼬투리를 생성한 수분의 백분율(성공 퍼센트)과 비교하였다. 수분시킨 지 15일 후에, 꼬투리-착립을 측정하였다. 꼬투리 착립률은 대조군에서의 60%에 비해 액체-매개 수분 처리 시 7% 내지 64%으로 다양하였다(상기 표 1). 대표적인 꼬투리-착립의 이미지는 도 6a 및 6b에 나타나 있다.

실시예 4. 잡종 식물의 생산과 잡종 확인

본 연구는 자성 수정에 영향을 주지 않고도 웅성 불임제를 사용하여 식물을 웅성 불임화함으로써 타화수정된 자손의 생산이 최적화되는지를 결정하기 위해 수행하였다. 이 연구에서는, 꽃의 원기(primordia)가 시작될 때 웅성 가임성 라인의 식물 줄기에 말레산 하이드라지드(50, 150 및 250 ppm)나 증류수를 1회 분사하였다. 모든 식물에 고르게 분사되도록 주의를 기울였다. 웅성 불임 식물을 생산하였는데, 이는 대두 품종 01046197 (도 7b)에서 유래한 ms6 웅성-불임 라인의 식물과 표현형이 매우 유사하였다(종자가 없는 꼬투리를 생산함). 대두 품종 01046197은 미국 특허 제9,232,755호에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 전문이 참조로서 본원에 포함된다. 하이드라지드 처리는 자성 가임성(Female fertility)에 영향을 주지 않았고, 꽃봉오리는 타가 수분시 종자-보유 꼬투리로 발생되었는데(도 7c), 이는 비처리 대조군에 의해 생산된 종자-보유 꼬투리와 유사하게 보였다(도 7a). 따라서, 웅성 불임제-유도 웅성-불임을 사용하여, 액체 용액내 꽃가루를 사용한 타가 수분의 효율을 개선시킬 수 있다.

또한, 공여 식물의 액체-매개 꽃가루 입자의 전달이 수령 식물에서 자가-수분과 경쟁할 수 있는지를 결정하기 위한 연구도 수행하였다. 본원에 사용된 "자가-수정(self-fertile)" 식물은, (즉, 자신의 꽃가루에 의한) 자가-수분 시 성공적으로 착립하는 식물이다. 이 연구에서는, 자성 수령 식물로서 자가-수정 라인을 선택하였다. 우성 표현형 마커(자색 하배축)를 포함한 공여 라인의 꽃가루가 함유된 액체 용액을, 열성 표현형 마커(연한-녹색 하배축)를 포함하는 자가-수정의 자성 수령 라인에 적용하였다. 타가 수분이 성공적인 경우, 이러한 색상 형질은 웅성 부모에 기인하므로, 자손은 자색 하배축을 가질 것으로 기대될 것이다. 자색 하배축을 갖는 자손 식물이 관찰되었는데(도시되지 않음), 이는 자가-수정 수령 부모를 액체-매개로 수분시킴으로써 액체 용액 내에서 전달된 공여 꽃가루로부터 잡종 후손이 생산될 수 있다는 것을 나타낸다. 대표적인 종자 착립은 도 6c 및 6d에 나타나 있다.

또한, 여러 염색체에 대한 분자 마커를 사용한 유전형 분석에 기초하여, 생성된 자손 식물을 잡종성에 대해 시험하였다. 게놈 내의 다양한 다형성의 존재는 유전자 마커로 널리 사용될 수 있다. 많은 DNA 유전형 분석 방법은 이러한 유전자 마커를 이용하여 다양한 식물 라인들을 구별하고, 이들 사이의 진화적 관계를 연구한다. SNP 유전형 검정은 임의의 게놈 내 다형성 검출을 위한 매우 유연한 기술을 제공합니다.

잡종 자손 식물의 유전형 분석을 위해, TaqMan SNP 유전형 검정과 선택된 8개의 마커(서열번호: 1-8)를 함께 사용하였다. 유전형 분석의 결과는 하기 표 2에 나타나 있다. 7개의 자손 식물 중 4개는 꽃가루를 액체-매개로 자가-수정 수령 라인에 전달함으로써 생성된 잡종이었다.

표 2. 분자 마커를 사용한 잡종 식물의 확인

“*”cM= Monsanto 내부 대두 유전자 지도 상의 센티모르간

아래의 표 3에는 예시적인 분자 마커 좌위를 증폭하기 위한 프라이머 서열과 상응하는 분자 마커 서열의 유전형을 분석하는데 사용된 프로브가 제공되어 있다.

표 3. 대표적인 분자 마커의 유전형 분석에 사용되는 대표적인 프라이머와 프로브

예시적인 실시예에서, 표 3에 나타난 바와 같이, 마커 서열번호: 1은 프라이머 서열번호: 9(정방향 프라이머) 및 서열번호: 17(역방향 프라이머)을 사용하여 증폭할 수 있다. 분자 마커 서열번호: 1의 뉴클레오티드 위치 201에 있는 SNP는, TaqMan 검정을 사용하여 서열번호: 25(프로브 1) 및 서열번호: 33(프로브 2)으로 표시된 프로브에 의해 검출할 수 있다. 당업계의 숙련자는, 프라이머가 탐지될 대립 형질을 포함한 영역을 증폭시킬 수 있는 이상, 주어진 프라이머 중 어느 한 쪽의 서열을 주어진 프라이머 대신에 사용할 수 있다는 점을 알 것이다. 검출에 사용된 정밀한 프로브는 변동될 수 있는데, 예를들어, 탐지될 마커 앰플리콘 영역을 식별할 수 있는 어떠한 프로브도 본원에서 예로 든 프로브로 대체될 수 있다. 증폭 프라이머와 검출 프로브의 구성도 또한 변화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에서 구체적으로 언급된 프라이머, 프로브 또는 마커 서열에만 국한되지 않는다.

대두의 수분을 위한 액체-기반의 꽃가루 수집, 정제 및 꽃가루 입자의 전달을 위한 신규한 방법과 대두의 액체-매개 수분에 적합한 최적화된 액체 용액이 본원에 제공된다. 상기 기재된 바와 같이, 잡종 식물을 성공적으로 생산하였고, 표현형 및 유전형 검정을 사용하여 잡종을 확인하였다. 이 결과에서, 수령 꽃의 봉쇄된 암술머리에 액체 용액내 공여 꽃가루를 전달하는 것이 가능하며, 이러한 방식으로 전달된 꽃가루는 대두에서 자가-수분과 경쟁하여 종자를 생산할 수 있는 것으로 나타났다. 본원에 기재된 방법은 수령 꽃의 봉쇄된 암술머리에 액체-매개로 꽃가루 입자를 전달하여, 적은 비용으로 대두에서 효율 좋은 수분 시스템을 얻는 것을 목표로 한다. 본원에 기재된 방법은 꽃가루 용액의 자동 투여용 장치를 개발하고/하거나, 영상 식별 기술을 이용하여 최적의 꽃봉오리를 선택함으로써, 추가적으로 향상될 수 있다.

일부 구현에서, 영상 시스템을 사용하여 개화기 및 주입 각도를 결정할 수 있다. 다른 구현예에서, 디지털 피펫을 사용하여 원하는 부피의 액체 수분 용액을 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 로봇팔 또는 로봇벌과 같은 로봇 시스템(Wood 외, 2013)을 사용하여 액체-매개 꽃가루 전달 과정을 자동화할 수 있다. 예를 들어, 로봇벌에는 타가 수분에 적합한 수령 꽃을 탐지하는 이미지 인식 시스템이 장착될 수 있다. 로봇벌에는 또한 액체 꽃가루 용액이 적재된 카트리지를 운반할 수 있도록 장착될 수 있다. 일단 적합한 수령 꽃이 식별되면, 로봇벌은 수령 꽃에 적당한 부피의 액체 꽃가루 용액을 주입하여 타가 수분을 시킬 수 있다.

실시예 5. 신규한 액체-매개의 수분 플랫폼에 대한 추가적인 응용

수령 식물의 형질 전환된 종자 또는 유전자-편집된 종자는, 외인성 DNA-형질전환된 꽃가루에 의한 액체-매개 수분을 통해 직접 생성될 수 있다. 채취된 꽃가루는 전기천공, 유전자총 및 초음파 처리, 아그로박테리움 감염, 화분관-매개의 형질감염 또는 마그네토펙션(magnetofection)과 같은 물리적 방법을 통해 형질변환될 수 있다(Zhao 외, 2017). 예를 들어, CRISPR/CpF1 시약은 전기천공 또는 마그네토펙션을 사용하여 정제된 꽃가루 입자에 전달될 수 있다. 그 후, 형질전환된 꽃가루를 선별하여, 본원에 제공된 액체 용액에 넣는다. 그 후, 꽃가루 용액을 꽃봉오리에 주입하여, 게놈-편집된 종자를 생성할 수 있다. 식물의 형질 발견 및 개선을 위해, 본원에 제공된 액체-매개 수분 시스템과 CRISPR/CpF1-기반의 유전자 편집을 활용할 수 있다. 이러한 조합은 조직 배양의 번거로운 단계에 대한 필요성을 없애면서도, 단기간 내에 형질전환된 종자로부터 형질전환되거나 유전자-편집된 식물을 생산한다.

본 발명은 조직 배양-독립적인 식물 형질전환 방법을 제공하는데, 이는 대두의 형질전환을 위해 0.05%의 계면활성제 Silwet L-77을 함유한 꽃가루 용액과 형질 개선용 유전자를 포함한 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)을 꽃봉오리로 전달하는데 사용될 수 있다. 상이한 일자에 반복 접종하여 꽃의 발생을 위한 최적 단계를 표적화하고, 형질전환율을 높이기 위한 최대 과량의 아그로박테리움을 얻도록 보장할 것이다.

본원에 제공된 방법은 또한 식물의 무-병원성 형질변환-유전자 편집을 위해 수령 식물에 외인성 DNA를 전달하는 데에도 활용될 수 있다. 이전 연구에서는, 화분-관 경로 또는 씨방-점적 형질전환(ovary-drip transformation)을 통해 식물에 외인성 DNA를 도입할 수 있다고 보고되었다(Yang 외, 2009). 이러한 방법은 면화, 쌀 및 대두를 비롯한 여러 가지 작물에 사용되어 왔다. 본 발명은 정상적인 세포벽이 없는 접합자 세포의 형질전환을 위해, 원하는 외인성 DNA을 함유한 DNA 용액과 본원에 기재된 꽃가루 용액을 함께 투여함으로써, 액체 수분과 외인성 DNA를 조합하는 수단을 제공한다. 상기 용액들을 조합함으로써, 외인성 DNA가 화분관을 따라 유동하여 씨방에 도달하여, 수정은 되었지만 아직 분열되지 않은 접합자 세포에 통합될 수 있다. 형질전환된 종자는 원형질체(protoplast)의 제조, 세포 배양 및 식물 재생 없이도 직접 얻을 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Monsanto Technology LLC <120> Cross Pollination Through Liquid-Mediated Delivery of Pollen to Enclosed Stigmas of flowers from Recipient Plants <130> MONS:456WO <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 301 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (201)..(201) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 tactagtcga atgagtcggt aacaaatagg atcacaaatt taaggtttaa acctactcaa 60 caaatcatcc taatcccatn tgtnccatac tcggagagtt tacacacatg gggcctacca 120 tgtaattgga gggaagatgt aaagcgatta ccaagttggt agctatcctc aattgggtca 180 ttcatgccat atgtttaagg nagatacaag gtaagtaatc taacatgttt atcacttcgg 240 attaaactaa cttgagcgtt agaatctcaa tgtaagtatc tcaccattca ttagagagga 300 t 301 <210> 2 <211> 301 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> misc_feature <222> (201)..(201) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 aattctaaat ttctataaaa gcaatttcac tgatcatgtg atactagcta agaagcaatt 60 gccattattt agaaatagat agagaagggg gaggggaaca gtgattatta atgttcagta 120 accttatcat gcaagcaaac taccaattta tgctgtgtta atgtttctat tgagccgtgc 180 ccttctctag ttatatttga nacatcagtg ttccatcata aatattatca tctcaccatc 240 tactctgaag ctactaggaa gattgagttc aatcttcaca aaaatatatt aagacaatgt 300 c 301 <210> 3 <211> 886 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> misc_feature <222> (549)..(549) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 tccaactgaa atccaaacat gctaaagatg gttgtacttg ctttagaact taatattagt 60 actgacaatg tgacttgctt gatagtcttc tttagtttat tgcacttata acctacttaa 120 catctatatg taacattgga gttaaatcat gcttggtata tgatttattt gaaaaaaaaa 180 atggacagga tggggtgcag gtttactttc cccaagcaat tagcaaaaca tgtagggaga 240 ggggccaggt tgcccctatg ttgttggagt tgggtgtcta tttctataac ctacgtgcta 300 atataatgca aacaatgagt agtgaaagac tacgaaccat tttctagttt cattgaactt 360 atcatatgga caatgtaatc catattaaac tcatgctgtt actgttatta ttctactcaa 420 ttgataattc ttgtatatat tttctgtatc tgttcagttc ttgatattat gattttgtga 480 tagcctgatg tgtaatattt tacatttatc atctttccta gggaggcgtt ctttctggtg 540 tgagtgtgnc attactagtt tcctgataga agaaagtcta atggcacatt caacaagctt 600 gatctttatg ggccgcagtt ttagtccact tcctaaaacc aaagtcagtg tatctggaag 660 gcttgtctcc agatcttcag caggacttcg cattcaagct gtgcaagaga acggtggacc 720 acgaagacta gtggacatta ttagacttgt gcctgagctc tcaaggaatt aattacttta 780 gaagccattc tcacagggct ctgtttggtg gaatctcatt gttgggtgga ttttatgtgg 840 cacaaacaat ctctcttttg gagctctagg agtcaatgat gttatt 886 <210> 4 <211> 301 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> misc_feature <222> (201)..(201) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 cccttgcgct caacctatta tatcaaataa aaaaacataa agtttaattg tacatatagt 60 gaacaagaca aggccaaggt ttgaacagtg gtaaaatacc tacctttatc ccatgaatct 120 gaattttccc aattttcgga aagcataagg gatgttccga cagaatactc tctacataaa 180 gaaatgcatt taaagttaaa naaaaggtca tcactattaa gaacatagaa ccaaaaccga 240 tatactaaga acaaaaactg ttaacaagaa gatgaaagaa ggatctgcat gaactataaa 300 a 301 <210> 5 <211> 301 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> misc_feature <222> (280)..(280) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 cccttgcgct caacctatta tatcaaataa aaaaacataa agtttaattg tacatatagt 60 gaacaagaca aggccaaggt ttgaacagtg gtaaaatacc tacctttatc ccatgaatct 120 gaattttccc aattttcgga aagcataagg gatgttccga cagaatactc tctacataaa 180 gaaatgcatt taaagttaaa taaaaggtca tcactattaa gaacatagaa ccaaaaccga 240 tatactaaga acaaaaactg ttaacaagaa gatgaaagan ggatctgcat gaactataaa 300 a 301 <210> 6 <211> 866 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> misc_feature <222> (201)..(201) <223> n is a, c, g, or t <400> 6 cagccgaatg caatccaaca gcggtgaaac ttcacctcca tttatgaaat cttccagaaa 60 ctgtacagaa tagaagcatc taatttagta aatacatagg gaggaattta tcttgggaac 120 agatccagga caaaatatta gatacatcta tacaaaagac aacttaaaat taaggaattg 180 gtttcttatc aacactgaaa natcaaagga aaaaaatggt atcaagcatt acggaccatc 240 atacatcagc agaaataacc ataacaatta aattaatgca atgcattttc aggtctatgt 300 ttttacaaag tcggctgaac aagcaaaaga aagatgctcc atagtaattt cacccaaaag 360 atagcataaa taatcagggt aaatatgcaa tgtaccagct aaagtcaaag gagaacaata 420 ccttggcagg atcatgtgta ttatttctca tgaaaagggg ggaagtccaa aaacattaca 480 atggaggaaa taacgaacat gatgaaccaa gaaaacagat caaagccaac aatcatgact 540 ggataatatg gcatgcatat attgttttag tttccaataa ttatcaaaat tttgaagcac 600 aacagaaaaa tatgcatcta tcactgatgc caaaacgaac acaatggaaa aagaaaagca 660 aataaaaatc agttgaagag gggaattaac aaccttggta tgaggccaaa gttgatcagg 720 agatacatgc atagtgcaac cctctttacc agactcccat tcaacaacaa aacgagcaag 780 gacacctgaa ccaaagctaa accacaagct catcagtcca actgcctcaa ttctaaacgc 840 ccttctcatc tgttcagtta gtttgt 866 <210> 7 <211> 301 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> misc_feature <222> (201)..(201) <223> n is a, c, g, or t <400> 7 cccacgttag tttctccgaa tcattcattc ttccacttac gctaatttct ctcctctgcg 60 atacaaaatc cctgcagtac cgttaaacga aaaaacaaaa aaggctcacg agtaacaaaa 120 gcttttgcaa tttttttttt ttaagtaaaa agaaaaaaaa gaatcagatt tcctagtacg 180 ctccagttac cggacacact naattttgaa gaaaatgaag gagagaaata aagaaaattt 240 aatcggtaat attttaaagt tatgtgcatg tggggagagt gaatgaattt gacaaattct 300 g 301 <210> 8 <211> 301 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> misc_feature <222> (201)..(201) <223> n is a, c, g, or t <400> 8 gaagagcaaa atgacaacac tgaaaaaaaa cctaattgaa atacactaac aatataaaga 60 ttttttaagt tataattcaa tcacaaatag ctatggtagg ttcgctgact attataataa 120 ctagtaactt ccttaaaact caggttttct acattatcat ttaaccacag attggtaagt 180 gttctggacc agccttcaac ngttcaacct actgccttcc tccgctccac cgccttacat 240 gttggccacg aaagccagat tcaggacatt gttaagtctt ggattcagga gtgacattga 300 a 301 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Glycine max <400> 9 ggtagctatc ctcaattggg tcatt 25 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Glycine max <400> 10 agccgtgccc ttctctagtt at 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Glycine max <400> 11 cctagggagg cgttctttct g 21 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Glycine max <400> 12 gggatgttcc gacagaatac tctct 25 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Glycine max <400> 13 catacatcag cagaaataac cataacaa 28 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Glycine max <400> 14 gatttcctag tacgctccag ttacc 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Glycine max <400> 15 cggctgcata aatacccaaa tcaat 25 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Glycine max <400> 16 gctatggtag gttcgctgac tatt 24 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Glycine max <400> 17 cgctcaagtt agtttaatcc gaagtg 26 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Glycine max <400> 18 agcttcagag tagatggtga gatgat 26 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Glycine max <400> 19 gccattagac tttcttctat caggaaa 27 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Glycine max <400> 20 tgcagatcct tctttcatct tcttgtt 27 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Glycine max <400> 21 cttgttcagc cgactttgta aaaac 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Glycine max <400> 22 ctctccccac atgcacataa cttta 25 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Glycine max <400> 23 gatttgattt tactagatta atctgtcgag aaactg 36 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Glycine max <400> 24 gagcggagga aggcagtag 19 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Glycine max <400> 25 atgtttaagg aagatac 17 <210> 26 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Claims

수령 식물 꽃의 봉쇄된 암술머리에 액체-매개로 꽃가루를 전달하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 공여 식물에서 꽃가루를 얻는 단계;
b) 상기 꽃가루를 포함한 액체 용액을 생산하는 단계;
c) 상기 용액을 수령 식물의 꽃봉오리의 봉쇄된 암술머리에 도입함으로써, 상기 꽃봉오리를 상기 공여 식물의 꽃가루로 수분시키는 단계.
제1항에 있어서, 상기 꽃가루는 상기 공여 식물로부터의 복수의 꽃으로부터 얻는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 도입 단계는 상기 용액을 상기 꽃봉오리에 주입하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 수분에 의해 생성된 자손 종자 또는 식물을 선별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 공여 식물은 상기 자손 식물 또는 상기 종자의 선별을 용이하게 하는 대립 형질을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 꽃봉오리는 상기 수분 시점에서 웅성 불임인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 수령 식물은 유전적으로 웅성 불임인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 꽃봉오리 또는 수령 식물에는 웅성 불임제가 처리되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 수령 식물은 대두 식물인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 용액은 펙티나아제, 증점제, 계면활성제, 수크로스, 식물 성장 조절제, 미네랄 이온, 운반 단백질 및 핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제1 성분을 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 펙티나아제는 펙틴 메틸에스테라제인, 방법.
제11항에 있어서, 상기 용액은 펙틴 메틸에스테라제를 약 1.5 단위/L 내지 약 1500 단위/L의 농도로 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 증점제는 잔탄검을 포함하는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 용액은 약 0.04 중량% 내지 약 0.08 중량%의 잔탄검을 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 표면활성제는 Tween 20를 포함하는, 방법.
제15항에 있어서, 상기 용액은 약 0.001 중량% 내지 약 0.01 중량%의 Tween 20을 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 용액은 약 10 중량% 내지 약 20 중량%의 수크로스를 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 미네랄 이온은 MgSO₄, ZnSO₄ 및 붕산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 용액은 약 0.01 중량% 내지 약 0.05 중량%의 MgSO₄를 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 용액은 약 0.01 중량% 내지 약 0.05 중량%의 ZnSO₄ 을 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 용액은 약 0.005 중량% 내지 약 0.02 중량%의 붕산을 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 운반 단백질은 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 용액은 약 0.01 중량% 내지 약 0.1 중량%의 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 수분에 의해 생성된 종자를 채취하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제24항에 있어서, 상기 종자로부터 자라난 자손 식물을 자체로 교배시키거나, 제2 식물과 교배시키는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 용액을 도입하기 전에 상기 꽃봉오리에 개구부를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
제26항에 있어서, 상기 개구부를 생성하는 단계는 상기 꽃봉오리의 상부를 제거하거나 파열시키는 단계를 포함하는, 방법.
타가 수분을 위해 원하는 꽃가루 농도를 포함한 꽃가루 현탁 용액을 생산하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 웅성 부모로부터 꽃가루-배출 꽃을 채취하는 단계;
b) 상기 꽃을 균질화하여 꽃가루를 방출시키는 단계;
c) 상기 균질화된 꽃으로부터 꽃의 잔해를 제거함으로써 꽃가루를 정제하는 단계;
d) 상기 정제된 꽃가루를 정량화하는 단계; 및
e) 상기 정제된 꽃가루를 용액에 헌탁시켜 원하는 꽃가루 농도를 포함한 꽃가루 현탁 용액을 생산하는 단계.
제28항에 있어서, 상기 정제된 꽃가루는 80% 수크로스 용액 또는 옥수수 유에 현탁되는, 방법.
잡종 종자를 생산하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 공여 식물에서 꽃가루를 얻는 단계;
b) 상기 꽃가루를 포함한 액체 용액을 생산하는 단계;
c) 상기 용액을 공여 식물과 유전형이 상이한 자성 부모의 꽃봉오리로 도입하되, 상기 꽃봉오리는 봉쇄된 암술머리를 포함하여, 상기 꽃을 상기 공여 식물의 꽃가루로 수분시키는 단계;
d) 상기 수분에 의해 생산된 종자를 수확하는 단계; 및
e) 잡종 자손을 식별하는 단계.
제31항에 있어서, 상기 공여 식물은 대두 식물인, 방법.
F₁ 잡종 대두 종자를 생산하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 공여 대두 식물로부터 얻은 원하는 농도의 꽃가루를 포함한 꽃가루 현탁 용액을 제조하는 단계;
b) 상기 꽃가루 현탁 용액을 공여 식물과 유전형이 상이한 자성 부모의 꽃봉오리의 봉쇄된 암술머리에 도입하되, 상기 꽃가루 현탁 용액은 상기 용액을 봉쇄된 꽃봉오리로 주입하거나, 꽃봉오리에 개구부를 생성하여 상기 용액을 상기 개구부로 적용함으로써 상기 암술머리에 도입됨으로써, 상기 꽃을 상기 공여 식물의 꽃가루로 수분시키는 단계; 및
c) 상기 수분에 의해 생산된 F₁ 종자를 수확하는 단계.
제32항에 있어서, 상기 용액은 펙티나아제, 증점제, 계면활성제, 수크로스, 식물 성장 조절제, 미네랄 이온, 운반 단백질 및 핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제1 성분을 포함하는, 방법.
제32항에 있어서, 상기 자성 부모의 꽃봉오리는 웅성 불임인, 방법.
제32항에 있어서, 상기 F₁ 잡종 종자를 표현형 또는 유전형 마커를 사용하여 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.