CN101090970B - 具有低亚麻酸的高产量大豆植物 - Google Patents
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Abstract
本发明通过提供用于标记辅助的选择的方法以产生显示出具有商业上重要意义的产量的中/低亚麻酸含量和农学上优良表型的大豆品种的植物，克服了现有技术的缺陷。本发明还提供了这些植物的衍生物和植物部分。本发明还提供了这些植物的使用方法。本发明的重要之处在于具有降低的亚麻酸的油显示出多种有益的特征，而具有降低的亚麻酸的现有技术品种也显示出降低的产量和差的农学品质。
Description
发明背景
本申请要求2004年9月29日提交的美国临时专利申请序号60/614,331的优先权，将其完整公开内容特别引入本文作为参考。
1.发明领域
本申请总的来说涉及植物育种领域。具体地，本发明涉及具有商业上重要意义的产量和中/低亚麻酸含量的农学上优良的大豆品种。
2.相关技术描述
大豆种子是世界上用于食品的植物油的重要来源。大豆油中相对高水平(通常约8％)的亚麻酸(18:3)降低了其稳定性和风味。
大豆油的氢化用于降低亚麻酸(18:3)的水平和提高大豆油的稳定性和风味(Dutton等人，1951；Lui和White，1992)。然而，氢化导致产生反式脂肪酸，其当被消费时增加了冠心病的风险(Hu等人，1997)。
已经通过突变、筛选和育种产生了低亚麻酸大豆品种(Fehr等人，1992；Rahman和Takagi，1997；Ross等人，2000；Byrum等人，1997；Stoisin等人，1998)。具体地已经产生了亚麻酸含量为1％或更低的品种(美国专利号5,534,425和5,714,670)。然而，迄今为止产生的低亚麻酸系具有种子产量低和商业生产所需的其他农学特征差的麻烦。该问题难以解决并且由于诸如亚麻酸含量和产量的农学性状的数量性质而复杂化。因此，低亚麻酸含量大豆的有用性在许多商业背景中受到限制。
在大多数大豆栽培种开发程序中，开发具有重要商业意义的种子产量的产品是高度优先考虑的。产量受到许多基因的控制，并且受到环境的强烈影响。它是品种的商业价值的最重要的特征并且育种者不断尝试提高产量到超过当前可得到的产量。一个艰巨的挑战是将低亚麻酸含量合并到高产量栽培种中。
同样因为该困难，现有技术不能提供也具有低亚麻酸和农学上优良特征的高产大豆品种。然而，本领域中非常需要此类大豆植物。食物和药物管理局(FoodandDrugAdministration)(FDA)已经对营养标签提出规程以要求在营养成分表(NutritionFactpanel)中包括食物中反式脂肪酸的量。除了降低我们对大豆油氢化的依赖性的健康益处外，前述FDA的提议引起了对于产生不需要或需要较少的氢化的低亚麻酸(小于3％)大豆的很大兴趣。降低的亚麻酸可以显著提高大豆收获值。为了使降低的亚麻酸具有商业重要性，必须不相当大地影响产量和/或优良农学性状。因此，提供农学上优良的同时高产并且具有降低的亚麻酸的大豆植物将代表本领域的实质性进步并且同样使农民和消费者受益。
发明概述
一方面，本发明提供了具有中/低亚麻酸含量和商业重要意义的产量的农学上优良品种的大豆植物。还提供了该植物的部分，包括但不限于，花粉、胚珠、细胞和种子。还提供了植物的可再生细胞的组织培养物，其中组织培养物再生能够表达该植物的所有生理学和形态学特征的大豆植物。在本发明的一个实施方案中，可再生的细胞是胚、分生细胞、花粉、叶、根、根尖或者花或者从它们得到的原生质体或者愈伤组织。本发明还提供了从组织培养物再生的大豆植物，其能够表达起始植物的所有生理学和形态学特征。
在本发明的一些实施方案中，中/低亚麻酸含量定义为亚麻酸含量为总的种子脂肪酸重量的约1.0％到约3.0％，包括总的种子脂肪酸重量的约1.5％到约3.0％、约2％到约2.6％、约2％到约3％、约1％到约2.6％、约1％到约2.2％、约1.6％到约2.6％和约2％到约2.4％。还可以将此类植物定义为籽粒产量(grainyield)为对照系AG2703和DKB23-51的至少约90％、94％、98％、100％、103％、105％或约110％。系AG2703也具有名称SN79553和9323265446452，在美国专利号6,184,442中获得专利，将该专利的公开内容完整引入本文作为参考。命名为DKB23-51的系也具有名称02122920和958361722350，在美国专利号6,369,302中获得专利，将该专利的公开内容完整引入本文作为参考。AG2703和DKB23-51的种子已经保藏在ATCC，ATCC保藏号分别为PTA-2577和PTA-3933。
在再一方面，本发明提供了本发明植物的植物部分。此类部分的实例包括花粉、胚珠、分生组织或者细胞。本发明还提供了本文描述的植物的种子，以及包含这种植物的细胞的组织培养物，其中组织培养物再生表达该植物的生理学和形态学特征的大豆植物。组织培养物可以包含可再生的细胞，如胚、分生细胞、花粉、叶、根、根尖或者花。
在再一方面，本发明提供了包含转基因的本发明的大豆植物。转基因可以在一个实施方案中定义为赋予一种性状，该性状选自除草剂耐受性；抗病性；昆虫或者害虫抗性；改变的脂肪酸、蛋白质或者糖类代谢；增加的籽粒产量；改变的植物成熟期，和改变的形态学特征。除草剂抗性的一个实例是草甘膦抗性。
在具体实施方案中，本发明的植物还可以定义为通过下面的方法产生，该方法包括步骤：a)将第一种和第二种大豆植物杂交，其中所述植物包含赋予降低的亚麻酸含量的Fad3-1b和Fad3-1c等位基因，其中第一种植物具有低/中亚麻酸含量，且其中第二种植物包含商业上重要的产量；b)测定杂交所得后代大豆植物的产量和所述Fad3-1b和Fad3-1c等位基因的50cM内的大豆植物基因组区中多态性的存在；和c)选择包含所述多态性和商业上重要意义的产量的至少第一种农学上优良的后代植物以得到权利要求1的植物。
在再一个方面，本发明提供了得到大豆种质的方法，其包括步骤：a)鉴定Fad3-1b或Fad3-1c等位基因的50cM内的大豆植物基因组区中赋予降低的亚麻酸含量的至少第一种多态性；b)测定大豆植物的所述多态性的存在；和c)选择包含所述多态性的至少第一种大豆植物。该方法可以包括鉴定所述Fad3-1b和Fad3-1c等位基因两者的50cM内的大豆植物基因组区中的多态性并且测定所述多态性的存在。在一个实施方案中，所述第一种多态性包含Fad3-1b基因序列的对应于SEQIDNO：1的核苷酸2021的位置上的单核苷酸多态性。在另一实施方案中，所述第一种多态性包含Fad3-1c基因序列的对应于SEQIDNO：2的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位置上的单核苷酸多态性。第一种多态性还可以包含Fad3-1c基因序列中的缺失，并且可以包含Fad3-1c启动子中的多态性，如对应于SEQIDNO：3的核苷酸334、364、385、387、393、729或747的位置上的单核苷酸多态性。可以通过任何方法检测多态性，所述方法包括PCR、单链构象多态性分析、变性梯度凝胶电泳、裂解片段长度多态性分析和/或DNA测序。
在再一方面，本发明提供了植物育种方法，其包括步骤：a)测定Fad3-1b或Fad3-1c等位基因的50cM内的大豆植物基因组区中赋予降低的亚麻酸含量的至少第一种多态性的存在；b)选择包含所述多态性的至少第一种大豆植物；和c)将该第一种大豆植物与第二种大豆植物杂交，以产生包含所述多态性的子代植物。该方法还可以包括步骤：d)选择包含所述多态性的子代植物并将所述子代植物与第三种大豆植物杂交以产生另外的子代植物。在该方法中，第二种和第三种植物可以是相同的品种。在一些实施方案中，该方法还包括重复步骤d)约2-10次。该方法可以还包括测定大豆植物Fad3-1b和Fad3-1c等位基因的50cM内的大豆植物基因组区中多态性的存在并且基于所述多态性的存在选择所述第一种大豆植物。在一些实施方案中，可以测定与Fad3-1b和Fad3-1c连锁的标记而不用测定与Fad3-1a紧密连锁的标记，因为发明人已经表明Fad3-1b和Fad3-1c等位基因有助于低亚麻酸含量。
在该方法的一些实施方案中，第一种多态性包含Fad3-1b基因中对应于SEQIDNO：1的核苷酸2021的位置上的单核苷酸多态性。该第一种多态性可以还包含Fad3-1c基因中对应于SEQIDNO：2的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位置上的单核苷酸多态性。在其他实施方案中，第一种多态性包含Fad3-1c基因序列中的缺失，和/或Fad3-1c启动子中对应于SEQIDNO：3的核苷酸334、364、385、387、393、729或747的位置上的单核苷酸多态性。可以通过任何方法选择包含所述多态性的至少第一种大豆植物，所述方法为例如PCR、单链构象多态性分析、变性梯度凝胶电泳、裂解片段长度多态性分析和/或DNA测序。
在再一方面，本发明提供了在严格条件下与Fad3-1b或Fad3-1c等位基因的50cM内大豆基因组区域杂交的探针或引物，其中该探针或引物是选自SEQIDNOs：4-98的核酸序列。
本发明的再一个方面是生产用于人或者动物消费的食品的方法，其包括：(a)得到本发明的植物；(b)栽培该植物至成熟；和(c)从该植物制备食品。在本发明的一些实施方案中，食品可以是蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、粗粉、油、面粉或者大豆外壳。
发明详述
本发明通过提供了具有中/低亚麻酸含量和商业上可接受的籽粒产量的农学上优良的大豆品种克服了现有技术的缺陷。本发明是重要的，因为尽管这些特征的益处已经单独实现，但是以前还没有将它们组合在单个品种中。提供中/低亚麻酸含量与其他所需的特征的组合提供了许多益处。例如，由于油稳定性的问题，当前的大豆油通常必须至少部分氢化和/或与其他油混合。降低的亚麻酸含量减少了提高稳定性对任一解决方案的需求，并且根据用途，可以消除对氢化的需要。因此，通过降低亚麻酸含量可以显著改善大豆油的成本和质量，从而使得大豆油相对于其他种子油的竞争力增强。低亚麻酸含量还减少了臭味，从而具有该特征的系拥有更高的商业价值(Liu和White，1992)。然而，低亚麻酸品种的广泛采用迄今为止已受到产量低或者农学品质差的阻碍。
本发明提供了遗传标记和它们用于产生此类改良的植物的方法。由于数量性状如产量和亚麻酸含量的复合遗传，这是重要的，当试图组合这些性状时所述复合遗传为指数的。使用候选基因方法鉴定了标记。设计基因座特异性嵌套引物来覆盖由三个独立基因座组成的整个FAD3基因家族。从包含9种突变型和16种野生型的25种不同的基因型产生扩增子。通过序列比对鉴定SNP和插入/缺失。遗传分离分析证实所鉴定的标记与等位基因Fad3-1b和Fad3-1c连锁，其与对应的野生型序列中产生低亚麻酸表型的突变有关。对分离植物的分析证明Fad3-1b和Fad3-1c加性地控制大豆中的亚麻酸含量。因此，使用Fad3-1b和Fad3-1c的标记组合，本发明允许准确预测植物中亚麻酸含量，而不需昂贵的生物化学分析。这些标记被成功地证明用于低亚麻酸大豆育种程序并且首次允许开发组合低亚麻酸表型与商业上重要意义的产量和农学上优良性状的大豆品种。
现有技术不能提供这种品种的植物，可能是由于组合具有复合遗传的不同性状的困难和缺少克服这些困难的手段。通过描述产生此类植物的方法和提供这些植物的实例，本发明现在允许制备可能无限数目的新的大豆品种，其显示出商业上重要意义的产量与低亚麻酸含量和特别是中/低亚麻酸含量的组合。一旦生产了这种优良品种，组合的产量和低亚麻酸含量就可以通过如下所述的合适的回交和选择转移到其他品种，以维持所需的性状。
I.本发明的植物
本发明首次提供了大豆品种的植物和其衍生物，其组合商业上重要意义的产量和中/低亚麻酸含量，具有农学上优良的表型。此类植物可以定义为具有商业上重要意义的产量，例如，定义为对照系AG2703和DKB23-51的至少103％的产量。在一些其他实施方案中，提供了具有中/低亚麻酸含量和这些系的至少约90％、94％、98％、100％、105％或约110％的籽粒产量的植物。在本发明的一些实施方案中，可以将此类植物定义为在至少10种环境中具有超过每英亩约35、37、39、41、43或45蒲式耳的产量。在本发明的具体实施方案中，可以将中/低亚麻酸含量定义为约1％到约3％种子脂肪酸含量，包括约1.3％到约3％、约1.5％到约3％、约1.8％到约3％、约2.1％到约3％、约2.4％到约3％、约2.6％到约3％、约1％到约2.6％、约1.3％到约2.6％、约1.8％到约2.6％、约2％到约2.6％、约2％到约2.4％以及约1.6％到约2.4％的种子脂肪酸含量。
本发明的一方面因此涉及前述植物和其部分和使用这些植物和植物部分的方法。植物部分包括，但不限于，花粉、胚珠和细胞。本发明还提供了这些植物的可再生细胞的组织培养物，所述培养物再生能够表达起始品种的所有生理学和形态学特征的大豆植物。此类可再生的细胞可以包括胚、分生细胞、花粉、叶、根、根尖或者花，或者从其得到的原生质体或愈伤组织。本发明还提供了从此类组织培养物再生的大豆植物，其中该植物能够表达用以得到所述可再生细胞的起始植物品种的所有生理学和形态学特征。
II.用于产生中/低亚麻酸含量的大豆品种的标记辅助的选择
本发明提供了遗传标记和将赋予中/低亚麻酸含量的基因座导入大豆植物的方法。本发明因此首次允许产生组合该亚麻酸含量与商业上重要意义的产量和农学优良的遗传背景的植物。使用本发明的方法，赋予降低的亚麻酸含量的基因座可以导入潜在的任何所需的大豆遗传背景，例如，在产生具有商业上重要意义的产量和中/低亚麻酸含量的新品种中。
标记辅助的渐渗现象涉及将来自一种种质的一种或多种标记定义的染色体区域转移到第二种种质。该方法中的最初步骤是通过基因作图对性状进行定位，基因作图是通过连锁分析确定基因相对于其他基因和遗传标记的位置的方法。连锁作图的基本原理是染色体上的两个基因越近，它们一起遗传的可能性越高。简言之，通常在两种遗传上相容的但是相对于研究中的性状不同的亲本之间进行杂交。然后可以用遗传标记跟踪杂交所得的子代(通常为回交(BC1)、F2或者重组近交群体)中所研究的性状的分离。
术语数量性状基因座或者QTL用于描述基因组的区域，该区域对表型显示出质量或者加性效应。本发明人已经鉴定了两种这样的QTL：Fad3-1b和Fad3-1c的遗传标记。本发明因此允许使用分子工具来组合这些QTL与所需的特征。
A.连锁的遗传标记的开发
可以对样品第一植物群体确定遗传的遗传标记的基因型以形成基因型数据库。本文使用的“遗传的遗传标记”是单个基因座上的等位基因。基因座是染色体上的位置，并且等位基因指这些基因座上基因的状况，即不同的核苷酸序列。每个基因座的标记等位基因组成可以是纯合或者杂合的。为了在杂交中从遗传标记得到信息，标记必须是多态的；即它必须以不同的形式存在从而携带突变基因的染色体可以通过它携带的标记的形式而与具有正常基因的染色体区分开来。
通过直接观察来自样品植物的人工或者自然自花传粉的子代的一种或多种性状或者通过定量评估样品植物的组合能力可完成基因型数据库的形成。例如，植物系可以与一种或多种测交品系(tester)杂交或者被一种或多种测交品系杂交。测交品系可以是近交系、单交杂种、双交杂种或者多交杂种，或者通过受控制的或者自由交配产生或维持的植物的任何其他集聚，或者其任意组合。对于一些自花传粉植物，优选直接评估，而不用子代测试。
可以在测交世代中确定标记基因型并对标记基因座作图。为了通过连锁方法对特定性状作图，必须在特定染色体基因座的遗传和性状的遗传之间建立正相关。对于复合遗传，如数量性状，具体包括亚麻酸含量和产量，连锁通常将更难以辨别。在该情况中，可以需要统计学方法来确立表型和基因型之间的相关。这还必须检查来自特定杂交的许多后代，因为单个基因座可以具有对总体表型的小贡献。
特定性状和标记的共同遗传或者遗传连锁提示它们在染色体上物理上接近。通过分析杂交中基因和标记的遗传模式来确定连锁。重组的单位是厘摩(cM)。两种标记如果在减数分裂中在它们必须重组的每100次机会中重组一次，那么它们相距1厘摩。厘摩是一种遗传度量，不是物理度量。位于与第二种基因座小于50cM的那些标记被认为是遗传连锁的，因为它们不相互独立地遗传。从而，每代在基因座之间观察到的重组百分比将小于50％。在本发明的具体实施方案中，可以使用在染色体上相距小于约45、35、25、15、10、5、4、3、2、或1或更小的cM的标记。在本发明的一些实施方案中，可以使用检测有贡献的基因座自身内的多态性，并从而各自对于所述基因座位于0cM处的标记，例如，包含Fad3-1b或Fad3-1c编码序列或者调节元件内的突变。
在减数分裂期间，同源染色体对聚到一起并且在称作重组的过程中交换片段。标记越是远离基因，在基因和该标记之间的重组的机会越大。在连锁分析中，在特定杂交中跟踪标记和基因或性状的共同遗传。计算它们观察到的遗传模式可以仅仅偶然发生，即它们完全不连锁的概率。重复该计算，从而假定具体的连锁程度，并确定两种概率(无连锁对特定程度的连锁)的比率。该比率表达了是(及不是)所述程度连锁的可能性，并且因为使用了比率的对数，所以它被称为可能性对数，例如，lod评分。例如，等于或者大于3的lod评分用于证实基因和标记连锁。这代表两个基因座连锁的1000:1可能性。通过使用利用程序的统计学分析极大地促进了连锁计算。
通过基因作图模型可以确立标记分子的遗传连锁，所述基因作图模型为诸如但不限于，Lander和Botstein(1989)报导的侧翼标记模型，和基于Lander和Botstein(1989)描述的最大似然法并且用软件包MAPMAKER/QTL(Lincoln和Lander，1990)实现的区间作图。其它的软件包括Qgene，版本2.23(1996)(DepartmentofPlantBreedingandBiometry，266EmersonHall，CornellUniversity，Ithaca，NY)。
B.遗传标记
遗传标记包括两个或更多个植物携带的遗传信息中检测得到的差异(多态性)。用遗传标记对基因座的遗传作图通常需要两个基本的组分：可检测的多态性等位基因和那些等位基因的重组或者分离。在植物中，测量的重组事实上总是减数分裂的，且因此，动物基因作图的两个遗传需求是多态性遗传标记，和其中所述那些等位基因是分离的一种或多种植物。
标记优选以共显性方式遗传，从而可以容易地检测在二倍体基因座上两种等位基因的存在，并且它们没有环境变异，即它们的遗传率为1。二倍体生物如大豆中标记基因型通常在每个基因座上包含两个标记等位基因。每个基因座的标记等位基因组成可以是纯合或杂合的。纯合性是其中基因座上的两个等位基因的特征是相同的核苷酸序列的情况。杂合性指基因座上该基因的不同的状况。
许多不同的标记类型可以用于遗传作图。用于本发明的示例性遗传标记类型包括但不限于限制性片段长度多态性(RFLP)、简单序列长度多态性(SSLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)和同工酶。可以以多种方法测定包含小至单个核苷酸改变的多态性。例如，通过电泳技术可以进行检测，所述技术包括单链构象多态性(Orita等人，1989)、变性梯度凝胶电泳(Myers等人，1985)，或者裂解片段长度多态性(LifeTechnologies，Inc.，Gathersberg，MD20877)，但是DNA测序机器的广泛利用使得仅仅直接测序扩增产物更容易。一旦多态性序列差异是已知的，就可以设计快速测定用于子代测试，通常包括特定等位基因的某种形式的PCR扩增(PASA，Sommer，等人，1992)，或者多个特定等位基因的PCR扩增(PAMSA，Dutton和Sommer，1991)。
限制性片段长度多态性(RFLP)是DNA经限制性内切核酸酶消化后，一般通过琼脂糖凝胶电泳显示出的DNA片段长度可以检测的遗传差异。可以利用多种限制性内切核酸酶，其特征是它们的核苷酸切割位点和它们的来源，例如，EcoRI。来自限制位点序列内的单个碱基对多态性和给定限制性片段RFLP内的可测量的插入或者缺失的RFLP结果是容易和相对廉价产生的(需要克隆的DNA，但是不需要序列)，并且是共显性的。RFLP的缺点是在分型阶段是劳动密集型的，尽管这可以通过许多任务的多路化和印迹的再利用在一定程度上减轻。大多数RFLP是双等位基因的并且比微卫星具有更小的多态性含量。由于该原因，在动物基因作图中RFLP的使用已经减少。
本领域技术人员将认识到许多类型的分子标记可以用作监控基因遗传的工具并且不限于RFLP、SSR和SNP，并且技术人员将还理解可以用多种检测方法来跟踪多种分子标记。本领域技术人员将还认识到不同类型的标记可以用于作图，特别是随着技术的发展和鉴定出了新类型的标记和新的鉴定方法。
为了方便的目的，可以将遗传的标记基因型转化成数字得分，例如，如果使用特定酶，在特定基因座上有称作A和B的两种形式的SNP，或者其他标记，那么可以将二倍体互补序列转化成数字得分，例如，为AA＝2，AB＝1，和BB＝0；或AA＝1，AB＝0和BB＝1。得分的绝对值不是重要的。重要的是数字标号的加性性质。上面的得分涉及共显性标记。可以给予类似的评分系统，其与显性标记相一致。
C.标记辅助的选择
本发明提供了具有低/中亚麻酸含量组合商业上重要意义的产量和农学上优良特征的大豆植物。此类植物可以根据本发明通过标记辅助的选择方法产生，所述方法包括测定基因组DNA中与赋予降低的亚麻酸的Fad3-1b和/或Fad3-1c等位基因遗传连锁的标记的存在。
在本发明的一些实施方案中，需要得到与Fad3-1b和/或Fad3-1c等位基因连锁的额外的标记。这可以例如如下进行：首先通过自交F1杂种制备F2群体，所述F1杂种通过近交品种的杂交产生，所述近交品种中仅一个包含赋予降低的亚麻酸含量的Fad3-1b和/或Fad3-1c等位基因。然后可以制备重组近交系(RIL)(遗传上相关的系；通常>F5，从连续自交的F2系朝纯合性开发)并将其用作作图群体。从显性标记得到的信息可以通过使用RIL最大化，因为所有基因座都是纯合的或者接近纯合的。
回交群体(例如从所需的品种(回归亲本)和携带前者中不存在的性状的另一品种(供方亲本)之间的杂交产生)也可以用作作图群体。可以进行与回归亲本的一系列回交以恢复其所需的性状的大多数。从而，产生由与回归亲本相似的个体组成的群体，但是每个个体携带来自供方亲本的不同量的基因组区域。如果回归亲本中的所有基因座都是纯合的并且供方亲本和回归亲本具有对比的多态性标记等位基因，那么回交群体可以用于显性标记作图(Reiter等人，1992)。
用于作图目的的有用的群体是近等基因系(NIL)。通过多次回交产生一系列个体来产生NIL，所述个体除了所需的性状或者基因组区域外在遗传组成上接近相同，且NIL可以用作作图群体。在用NIL作图中，预期仅部分多态性基因座作图到所选的区域。可以在转化的植物系上进行作图。
D.植物育种方法
育种技术利用了植物的传粉方法。有两种一般的传粉方法：自花传粉，其中来自一朵花的花粉转移到相同植物的相同或者另一朵花；和异花传粉，其中花粉来自不同植物上的花。已经自花传粉并且对许多世代进行类型选择的植物在几乎所有基因座上都纯合，并且产生均一群体的不分离子代，纯合植物。
在合适的品种的开发中，可以使用谱系育种。特定性状的谱系育种方法涉及杂交两种基因型。每种基因型可以具有另一种基因型中缺少的一种或多种所需的特征；或者每种基因型可以与另一种互补。如果两种最初的亲本基因型不提供所有所需的特征，那么在育种群体中可以包括其他基因型。将这些杂交产生的优良植物自交并在每个连续世代中再次自交。每个连续世代由于自花传粉和选择而变得更纯合。通常，这种育种方法涉及5代或者更多代的自交和选择：S1→S2；S2→S3；S3→S4；S4→S5等等。自交的世代(S)可以被认为是一种类型的杂交后代(F)并且同样命名为F。至少5代后，认为近交植物是遗传上纯的。
每个育种程序将包括育种步骤效率的周期性的客观评价。评价标准根据目标和目的而变。将有希望的较晚育种系充分测试并在代表商业目标区域的环境中与合适的标准一般比较3年或更多年。混杂的植物性状或者环境因素可以掩蔽由于基因型值而在遗传上更优良的个体的鉴定。鉴定优良植物的一种方法是观察其相对于其他实验植物和一种或多种广泛栽培的标准品种的性能。单次观察可能是不确定的，但是重复观察提供了对遗传价值的更好的估计。
混合选择和轮回选择可以用于改进自花或者异花传粉的农作物的群体。通过几种不同亲本的互交可以鉴定或者产生杂合个体的遗传变异群体。基于个体优越性、杰出的子代或者优秀的组合能力选择最好的植物。将所选的植物互交以产生新的群体，其中继续其他轮的选择。关于常用于不同性状和农作物的其他育种方法的描述可以见几种参考书籍之一(例如，Allard，1960；Simmonds，1979；Sneep等人，1979；Fehr，1987a，b)。
在育种程序中对具有目的性状(例如，高产量、抗病性、脂肪酸谱)的基因型的选择的有效性将取决于：1)群体中个体植物的目的性状的变异性是由于遗传因素的结果并且从而传递到所选基因型的子代的程度；和2)植物中目的性状中多少变异性是由于不同基因型所生长的环境。性状的遗传范围为通过一种主要基因控制(其表达不受环境的影响(即，质量性状))到受到许多基因的控制(其效果受到环境的很大影响(即数量性状))。对于数量性状如产量的育种的其他特征是如下事实：1)每种基因的影响导致的差异是小的，从而使得难以或者不可能单独地鉴定它们；2)有助于一种性状的基因的数目很大，从而很少(如果得到的话)得到不同的分离比；和3)基因的影响可以基于环境变异以不同方式表达。因此，超亲分离系(segragate)或者具有目的性状的优良基因型的准确鉴定极端困难，并且它的成功取决于植物育种者使得影响群体中数量性状的表达的环境变异最小化的能力。
随着组合到一种基因型的性状的数目的增加，鉴定超亲分离子的可能性很快减小。例如，如果在三种复杂性状(如产量、亚麻酸含量和至少第一种农学性状)有差别的栽培种之间进行杂交，那么不用分子工具极其难以通过将三种性状的每一种的最大数目的有利基因重组到一个基因型中同时回收。因此，所有育种者一般所希望的是得到除所选基因外到一个基因型中的第一种复杂性状的基因的有利分配与第二种性状的基因的有利分配组合。
回交是转移特定所需性状的有效方法。这可以通过例如首先将优良品种近交系(A)(回归亲本)与供方近交系(非回归亲本)杂交来实现，所述供方近交系携带对于研究中的性状合适的基因(Fehr，1987)。然后将该杂交的子代与优良回归亲本(A)回交，接着在所得子代中选择将从非回归亲本转移的所需性状。这种选择可以基于如下面提到的遗传测定法，或者备选地，可以基于子代植物的表型。经过5或者更多回交世代选择所需的性状后，子代对于控制正转移的性状的基因座是杂合的，但是对于大多数或者几乎所有其他基因与优良亲本相似。将回交的最后世代自交，或者同胞交配，以得到对于所转移的基因，例如，提供具有降低的亚麻酸含量的植物的基因座不分离的子代。
在本发明的一个实施方案中，回交转变的方法可以定义为包括下面步骤的方法：
(a)将含有一种或多种所需的基因、DNA序列或者元件，如与降低的亚麻酸含量有关的Fad3-1b和/或Fad3-1c等位基因的第一种基因型的植物与缺少所述所需的基因、DNA序列或者元件的第二种基因型的植物杂交；
(b)选择含有所述所需的基因、DNA序列或者元件的一种或多种子代植物；
(c)将所述子代植物与第二种基因型的植物杂交；并
(d)重复步骤(b)和(c)以用于将来自第一种基因型的植物的所述所需的基因、DNA序列或者元件转移到第二种基因型的植物中。
特定DNA元件或者一组元件向植物基因型的渐渗现象定义为回交转变的方法的结果。DNA序列已经渐渗入的植物基因型可以称作回交转变的基因型、系、近交系或者杂种。类似地，缺少所需的DNA序列的植物基因型可以称作未转变的基因型、系、近交系或者杂种。在育种过程中，与减少的亚麻酸含量连锁的遗传标记可以用于辅助育种以用于产生具有降低的亚麻酸含量、且优选中/低亚麻酸含量的大豆植物。回交和标记辅助的选择尤其可以用于本发明以将根据本发明的降低的亚麻酸含量性状引入任意品种，这通过用与所述性状有关的Fad3-1b和/或Fad3-1c等位基因(优选两种基因座)转变该品种来实现。
合适的回归亲本的选择是成功的回交方法的重要步骤。回交方案的目的是改变或者代替最初近交系中的性状或者特征。为了完成该目的，将回归近交系的一个或多个等位基因用来自非回归亲本的所需基因修饰或者代替，而保持基本上所有剩余的所需遗传，并且因此保持最初近交系的所需生理学和形态学组成。具体非回归亲本的选择将取决于回交的目的，其在本发明的情况中可以为加入赋予降低的亚麻酸含量的一种或多种等位基因。确切的回交方案将取决于被改变的特征或者性状以确定合适的测试方案。尽管当被转移的特征是显性等位基因时，回交方法可以简化，但也可以转移隐性等位基因。在该情况中，必须引入子代的测试以确定是否已经成功地转移了所需的特征。对于本发明，人们可以测试在回交程序期间产生的子代系的亚麻酸含量以及使用本文描述的标记系统来基于标记而不是视觉性状选择系。
通过天然或者机械技术可以杂交大豆植物(大豆(GlycinemaxL.))(见例如，Fehr，1980)。通过自花传粉或者天然异花传粉在大豆中发生天然传粉，其通常得到传粉生物的帮助。在天然或者人工杂交中，开花和开花时间是重要的考虑因素。大豆是短日照植物，但是对光周期的敏感性有相当大的遗传变异(Hamner，1969；Criswell和Hume，1972)。开花的临界日长范围为对于适应热带纬度的基因型的约13小时到对于在更高纬度生长的光周期不敏感的基因型的24小时(Shibles等人，1975)。大豆在出苗(emergence)后9天对日长似乎不敏感。需要7到26天的短于临界日长的光周期来完成花诱导(Borthwick和Parker，1938；Shanmugasundaram和Tsou，1978)。
大豆花通常在花冠开放当天是自花传粉的。柱头在开花前约1天对于对花粉是接受的并且在开花后2天保持接受花粉，如果不除去花瓣的话。9个雄蕊丝融合，并且最接近旗瓣的丝是离生的。雄蕊在柱头下形成环，直到开花前约1天，然后它们的丝开始快速延长并且在柱头周围升高花药。花药在开花当天裂开，花粉粒落到柱头上，并且在10小时内，花粉管到达子房并且完成受精(Johnson和Bernard，1963)。在不操作花的情况下，大豆天然发生自花传粉。对于杂交两种大豆植物，通常优选(尽管不是需要的)利用人工杂交。在人工杂交中，用作杂交中雌性的花在该花的花粉成熟前被手工异花传粉，从而防止自体受精，或者备选地，使用本领域中已知的技术将花的雄性部分去势。用于大豆花的雄性部分去势的技术包括例如，物理除去雄性部分、使用赋予雄性不育的遗传因子和对雄性部分应用化学杀配子剂。
使用和不使用雌花的去势，可以通过用镊子从雄性亲本的花除去雄蕊和雌蕊并对雌花的柱头轻轻刷花药进行手工传粉。通过除去前萼片和龙骨瓣花瓣，或者用闭合的镊子穿刺龙骨瓣并允许它们打开以推开花瓣可以实现接近雄蕊。在柱头上刷花药导致它们破裂，且当在柱头上清晰可见花粉时，得到最高百分比的成功杂交。可以通过在刷柱头前轻打花药检查花粉的释放。当条件不利时，可能必须使用几朵雄花以得到合适的花粉释放，或者可以使用具有良好花粉释放的相同雄花对几朵花传粉。
遗传雄性不育可以在大豆中得到并且可以用于促进本发明背景中的杂交，尤其对于轮回选择程序(Brim和Stuber，1973)。完全隔离杂交区组(block)所需的距离还不清楚；然而，当雄性不育植物与外来花粉来源为12m或者更远时，异型杂交小于0.5％(Boerma和Moradshahi，1975)。杂交区组的边界上的植物与外来花粉维持最多的异型杂交并且可以在收获时除去以使污染最小化。
一旦收获，通常将豆荚在不超过38℃的温度下风干，直到种子含有13％水分或者更小，然后手工取出种子。如果相对湿度为50％或者更低，可以将种子在约25℃下令人满意的保存最长达1年。在湿润气候中，萌发百分数快速降低，除非种子被干燥到7％水分并且在密封容器中室温下保存。通过将种子干燥到7％水分并将其在10℃或更低温度下在50％相对湿度的房间或者在密封容器中保存最好地完成了在任何气候中的长期保存。
III.用于修饰和改进大豆品种的性状
在一些实施方案中，本发明提供的大豆植物可以包含一种或多种转基因。此类转基因的一个实例赋予除草剂抗性。通常的除草剂抗性基因包括赋予草甘膦抗性的EPSPS基因，赋予对卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因(Fraley等人，1983)，赋予对抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因(VandenElzen等人，1985)，赋予对草铵膦或者broxynil的抗性的基因(Comai等人，1985；Gordon-Kamm等人，1990；Stalker等人，1988)，如二氢叶酸还原酶和乙酰乳酸合酶(Eichholtz等人，1987，Shah等人，1986，Charest等人，1990)。其他实例包括赋予对咪唑啉酮类(imidazalinone)或者磺酰脲类的抗性的突变ALS和AHAS酶(Lee等人，1988；Miki等人，1990)、赋予膦丝菌素抗性的膦丝菌素-乙酰基-转移酶基因(欧洲申请0242246)、赋予苯氧基丙酸和cycloshexones，如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾定的抗性的基因(Marshall等人，1992)；和赋予对三嗪的抗性的基因(psbA和gs+基因)和对苄腈抗性的基因(腈水解酶基因)(Przibila等人，1991)。
本发明的植物还可以包含赋予对昆虫、害虫、病毒或者细菌攻击的抗性的基因。例如，赋予对害虫如大豆胞囊线虫的抗性的基因在PCT申请WO96/30517和PCT申请WO93/19181中描述。Jones等人，(1994)描述了赋予对暗黄枝孢(Cladosporiumfulvum)的抗性的番茄Cf-9基因的克隆；Martin等人，(1993)描述了赋予对丁香假单胞菌致病变种(Pseudomonassyringaepv.)的抗性的番茄Pto基因，以及Mindrinos等人，(1994)描述了赋予对丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)的抗性的鼠耳芥(Arabidopsis)RSP2基因。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)内毒素也可以用于昆虫抗性(见，例如，Geiser等人，(1986))。维生素结合蛋白，如抗生物素蛋白也可以用作杀幼虫剂(PCT申请US93/06487)。
已知病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的应用赋予对病毒感染和/或该外壳蛋白基因所来源的病毒以及相关病毒影响的疾病发展的抗性(见Beachy等人，1990)。已经赋予转化植物对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。同前。还可以使用通过病原体或者寄生物自然产生的发育停顿蛋白。例如，Logemann等人，(1992)已经表明表达大麦核糖体灭活基因的转基因植物对真菌疾病具有增强的抗性。
转基因还可以用于赋予增加的营养价值或者另一种提高价值的性状。一个实例是修饰的脂肪酸代谢，例如，通过用硬脂酰-ACP去饱和酶的反义基因转化植物以增加植物的硬脂酸含量(见Knutzon等人，1992)。还可以引入有义去饱和酶基因以改变脂肪酸含量。通过导入肌醇六磷酸酶编码基因来增强肌醇六磷酸的分解来改变肌醇六磷酸含量，从而向转化的植物增加更多的游离磷酸。也可以例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转化植物来影响改变的糖类组成。(见Shiroza等人，1988)(变异链球菌(Streptococcusmutants)果糖基转移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetz等人，(1985)(枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)；Pen等人，(1992)(产生表达地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenifonnis)α-淀粉酶的转基因植物)；E1liot等人，(1993)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)；Sgaard等人，(1993)(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)；和Fisher等人，(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II))。
转基因还可以用于改变蛋白质代谢。例如，美国专利号5,545,545描述了赖氨酸不敏感的玉米二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)，其显著抗反过来抑制天然DHPS活性的L-赖氨酸的浓度。类似地，EP0640141描述了编码赖氨酸不敏感的天冬氨酸激酶(AK)的序列，其能够导致高于正常的苏氨酸生产，以及编码反义赖氨酸-酮戊二酸还原酶的亚片段，其用于增加赖氨酸。
在另一实施方案中，可以使用改变植物糖类代谢的转基因。例如，已知果糖激酶基因用于转基因植物和它们的果实中果糖激酶基因表达的代谢工程化(见美国专利号6,031,154)。可以使用的转基因的另一实例是改变籽粒产量的基因。例如，美国专利号6,486,383描述了用腺苷二磷酸葡糖焦磷酸化酶(“ADPGPPase”)的亚基蛋白质改变植物中的淀粉含量。在EP0797673中，讨论了转基因植物，其中特定DNA分子的导入和表达导致在液泡外形成容易移动的磷酸库和增强的生物量产生和/或改变的开花行为。还已知改变植物成熟期的基因。美国专利号6,774,284描述了编码植物脂肪酶的DNA和其用于控制植物中衰老的方法。美国专利号6,140,085讨论了改变开花特征，尤其开花时间选择的FCA基因。美国专利号5,637,785讨论了基因修饰的植物，其具有受调节的花发育，如具有早期花分生组织发育并且在其基因组中包含编码LEAFY蛋白质的结构基因。
用于改变植物形态学特征的基因也是已知的并且可以根据本发明使用。美国专利号6,184,440讨论了基因工程改造的植物，其由于表达细胞壁调节转基因而显示出改变的结构或者形态学。细胞壁调节转基因的实例包括纤维素结合结构域、纤维素结合蛋白，或者细胞壁修饰蛋白或者酶，如内切木葡聚糖(endoxyloglucan)转移酶、木葡聚糖内切转糖基酶、扩展蛋白、纤维素合酶，或者新分离的内切-1，4-β-葡聚糖酶。
导入转基因的方法是本领域公知的并且包括生物学和物理学的植物转化方案。见例如Miki等人(1993)。
一旦转基因被导入品种中，它就可以容易地通过杂交转移。通过使用回交，除了通过回交技术转移到品种中的基因座外，回收了品种的基本上所有所需的形态学和生理学特征。回交方法可以用于本发明以提高或向植物中引入特征(Poehlman等人，1995；Fehr，1987a，b)。
IV.大豆植物的组织培养物和体外再生
本发明的另一方面涉及本发明的大豆品种的组织培养物。本文使用的术语“组织培养物”指包含相同或不同类型的分离细胞的组合物或者组织成植物的部分的一组这类细胞。组织培养物的示例性类型是在植物或植物部分中完整的原生质体、愈伤组织和植物细胞，如胚、花粉、花、叶、根、根尖、花药等等。在优选实施方案中，组织培养物包含胚、原生质体、分生细胞、花粉、叶或花药。
用于制备可再生大豆细胞的组织培养物和从其再生大豆植物的示例性方法公开在美国专利号4,992,375；美国专利号5,015,580；美国专利号5,024,944和美国专利号5,416,011中，将它们每一个的公开内容都完整地特别引入本文作为参考。
组织培养物的一种重要的能力是能够再生可育的植物。这允许例如转化组织培养物细胞后再生转基因细胞。为了有效转化和成功转化，必须将DNA导入细胞中，该细胞产生植物或者种系组织。
大豆通常通过两种不同的过程再生：枝条形态发生和体细胞胚胎发生(Finer，1996)。枝条形态发生是枝条分生组织组构和发育的过程。枝条从来源组织长出并被切断和生根得到完整植物。在体细胞胚胎发生中，从体细胞植物组织形成含有枝条和根轴的胚(类似于合子胚)。从体细胞胚的萌发得到完整植物而不是生根的枝条。
枝条形态发生和体细胞胚胎发生是不同的过程并且再生的特定途径主要依赖于用于组织培养操作的外植体来源和培养基。尽管系统是不同的，但是两种系统都显示出品种特异性应答，其中一些系对于组织培养操作比其他系更有应答性。在枝条形态发生中高度应答的系不能产生许多体细胞胚。在“诱导”步骤过程中产生许多胚的系可能不产生快速生长的增殖培养物。因此，需要对每种大豆系最优化组织培养条件。这些最优化可以由组织培养技术领域中技术人员通过小规模培养研究容易地实施。除了系特异性应答外，也可以观察到增殖性培养物具有枝条形态发生和体细胞胚胎发生。增殖对于两种系统都是有益的，因为它允许单个被转化的细胞增殖到将促成种系组织的点。
Wright等人(1986)首次报导枝条形态发生为从大豆幼苗的子叶节从头得到枝条所借助的系统。枝条分生组织在表皮下形成并且形态发生组织可以在含有苄基腺嘌呤(BA)的培养基上增殖。如果认识到枝条的表皮下多细胞起点并且利用增殖培养物，那么该系统可以用于转化。想法是靶定将产生新枝条的组织并且增殖分生组织内的那些细胞以减少与嵌合状态有关的问题。如果被转化的细胞不足够增殖并且不产生种系组织，那么在分生组织内仅单个细胞的转化得到的嵌合体的形成是有问题的。一旦充分理解了该系统并且令人满意的重复该系统，那么它就可以用作大豆转化的一种靶组织。
Christianson等人(1983)首次报导大豆中体细胞胚胎发生是其中最初从合子胚轴得到胚胎发生组织的系统。这些胚胎发生培养物是增殖的，但是该系统的重复性很低并且没有报导胚的来源。后来对不同增殖性胚胎发生大豆培养物的组织学研究表明增殖性胚是顶端或者表面来源的，其中少数细胞促成胚形成。初生胚(来自最初外植体的第一个胚)的来源取决于外植体组织和诱导培养基中的生长素水平(Hartweck等人，1988)。使用增殖性胚培养物，“较老”体细胞胚的单个细胞或者小组表面细胞形成“较新”的胚。
如果认识到胚的来源并且理解了增殖性胚胎发生培养物的生物学限制，那么胚胎发生培养物还可以成功地用于再生，包括转基因植物的再生。生物学限制包括开发增殖性胚胎发生培养物的困难和与从长期增殖性胚胎发生培养物再生的植物有关的降低的生育力问题(培养物诱导的变异)。在长时间的培养过程中这些问题中的一些更明显。使用更近期培养的细胞可以减小或者消除此类问题。
V.大豆植物的利用
本发明提供的大豆植物可以用于认为有价值的任意目的。通常的用途包括制备用于人类消费的食物、用于非人动物消费的饲料和工业用途。本文使用的“工业用途”或者“工业使用”指大豆或基于大豆的产品的非食物和非饲料用途。
通常将大豆加工成两种主要产品：大豆蛋白(粗粉)和粗大豆油。这两种产品通常被进一步精炼以用于特定目的。精炼的油产品可以分解成甘油、脂肪酸和固醇。这些可以用于食物、饲料或工业使用。可食用的食品用途例子包括稀奶油盅、人造黄油、蛋黄酱、药物、色拉调料、起酥油、烘焙食品和巧克力糖衣。
大豆蛋白产品(例如，粗粉)可以分成具有食物/饲料和工业用途的大豆粉浓缩物和分离物。大豆粉和粗渣(grit)通常用于生产肉类增补剂和类似物、宠物食物、烘焙成分和其他食品。由大豆粉和分离物制备的食品包括婴儿食物、糖果产品、谷类、食物饮料、面条、酵母、啤酒、上面啤酒等等。大豆粗粉尤其常用作家畜饲养，主要是猪和家禽的蛋白质来源。饲料用途从而包括但不限于，水产业饲料、蜜蜂饲料、小牛饲料替代品、鱼饲料、家畜饲料、家禽饲料和宠物饲料等等。
完整大豆产品也可以用作食物或饲料。通常的食物使用包括这样的产品，诸如种子、豆芽、烘焙的大豆、用于各种烘焙产品的全脂大豆粉、用作糖食的烘烤大豆、大豆酱(soynutbutter)、大豆咖啡(soycoffee)和东方食物的其他大豆衍生物。对于饲料使用，通常从大豆取出外壳并将其用作饲料。
大豆还具有许多工业用途。大豆的一种常见的工业用途是制备可以用于生产复合材料的粘合剂。例如，使用改性的大豆蛋白、水解大豆蛋白和PF树脂的混合物、含有粉末树脂的大豆粉和含有起泡胶水的大豆蛋白可以生产木材复合材料。利用基于大豆的粘合剂生产常见的木材产品，如胶合板已经超过70年了。尽管脲甲醛和酚醛树脂的引入已经降低了木材产品中基于大豆的粘合剂的使用，但是环境问题和消费者对从可再生的原料生产的粘合剂的偏爱已经导致重新出现对开发用于木材复合材料工业的新的基于大豆的产品的兴趣。
粘合剂的制备代表大豆的另一常见的工业用途。大豆粘合剂的实例包括大豆水解产物粘合剂和大豆粉粘合剂。大豆水解产物是无色的水溶液，其通过将大豆蛋白分离物在5％氢氧化钠溶液中加热(120℃)和加压(30psig)反应而制备。得到的降解的大豆蛋白溶液在室温下是碱性的(pH11)和可流动的(约500cps)。大豆粉是从大豆制备的精细研磨的脱脂粗粉。可以从大豆粉制备各种粘合剂制剂，第一步通常需要将面粉溶解在氢氧化钠溶液中。所得制剂的强度和其他性质将依赖于制剂中的添加剂而变。大豆粉粘合剂还可能与其他商购的树脂组合。
大豆油还可以应用于多种工业用途。大豆油是最容易得到的和世界上成本最低的植物油之一。大豆油的常见的工业用途包括用作抗静电剂、填隙化合物、消毒剂、杀真菌剂、墨水、油漆、保护涂层、壁板、消泡剂、醇、人造黄油、油漆、墨水、橡胶、起酥油、化妆品等等的组分。大豆油多年来也是醇酸树脂的主要成分，所述醇酸树脂溶解在载体溶剂中以制备基于油的油漆。在热和压力下将植物油转化成为醇酸树脂的基本化学是本领域技术人员完全了解的。
处于可商购的未精炼或者精炼的食用级状态的大豆油是相当稳定和缓慢干燥的油。还可以改性大豆油以在环境条件下增强它的反应性，或者输入各种形式的能量，以导致大豆油共聚或者熟化成干燥膜。这些形式的改性中的一些包括环氧化作用、醇解或者酯交换、直接酯化、复分解、异构化、单体修饰、和各种形式的聚合作用，包括热增稠。对于许多工业用途，大豆油的反应性亚油酸组分与其双键可以比主要的油酸和亚油酸组分更有用。
还可以使用基于大豆的成分制备溶剂。例如，豆油脂肪酸甲酯(methylsoyate)-一种基于大豆油的甲酯-正在市场上被接受为在诸如部件清洁和脱脂、油漆和墨水去除和漏油补救应用中的优秀的溶剂替代备选方案。它还以多种配制的消费产品上市，所述产品包括洗手剂、汽车蜡和乱画除去剂。通过大豆油与甲醇的酯交换产生豆油脂肪酸甲酯。它可以从多种生产商和供应商商购得到。作为溶剂，豆油脂肪酸甲酯具有重要的环境和安全性相关的性质，其使得它对于工业应用是有吸引力的。它的毒性比大多数其他溶剂更低，容易生物降解，并且具有非常高的闪点和低水平的挥发性有机化合物(VOC)。豆油脂肪酸甲酯与金属、塑料、大多数高弹体和其他有机溶剂的相容性是优良的。豆油脂肪酸甲酯的当前用途包括清洁剂、脱漆剂、漏油清除和生物补救(bioremediation)。农药佐剂、防腐剂和生物柴油机燃料添加剂。
VI.定义
在下面的描述和表格中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书的清楚和一致的理解，提供下面的定义：
A：当与词语“包含”或者权利要求书中的其他开放措辞一起使用时，词语“一个(a)”和“一个(an)”指“一个或多个”。
农学上优良的：如本文使用的，指基因型，其具有许多可区别性状的最佳表现，如突出体、萌发势、营养势、抗病性、种子结实、站立能力和脱粒能力，其允许生产商收获具有商业重要性的产品。
等位基因：基因座的一种或多种可选形式的任一种，所有等位基因都涉及性状或者特征。在二倍体细胞或者生物中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的对应基因座。
回交：一种方法，其中育种者将杂种后代，例如，第一代杂种(F1)与杂种后代的亲本之一重复杂交。回交可以用于从一种遗传背景向另一遗传背景引入一个或多个单一基因座转变。
商业上重要意义的产量：对栽培者具有商业重要性的籽粒产量，当生长在相同条件下时，由对照系AG2703和DKB23-51的103％的实际籽粒产量来表示。
杂交：两种亲本植物的交配。
异花传粉：通过来自不同植物的两种配子的联合受精。
F1杂种：两种非等基因植物杂交的第一代后代。
基因型：细胞或生物的遗传组成。
工业用途：大豆植物的非食物或者非饲料用途。术语“大豆植物”包括大豆植物的植物部分和衍生物。
连锁：一种现象，其中相同染色体上的等位基因比如果等位基因的传递是独立的而偶然预期的更倾向于一起分离。
标记：容易检测的表型，优选以共显性方式遗传(在二倍体杂合子中基因座上的两个等位基因容易检测)，没有环境变异组分，即遗传率为1。
表型：细胞或者生物的可检测的特征，该特征是基因表达的表现。
数量性状基因座(QTL)：数量性状基因座(QTL)指在一定程度上控制通常连续分布的以数量表示的性状的遗传基因座。
严格条件：指5XSSC、50％甲酰胺和42℃下的核酸杂交条件。
基本上等同的：一种特征，当被比较时，不与平均值显示出统计学显著差异(例如，p＝0.05)。
组织培养物：组合物，其包含相同或不同类型的分离细胞或者一组组织成植物部分的此类细胞。
转基因：遗传基因座，其包含已经通过转化导入大豆植物的基因组的序列。
VII.实施例
包括下面的实施例用于证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员将明白下面实施例中公开的技术代表本发明人发现在本发明的实践中良好运行的技术，并且因此可以被认为组成它的实践的优选方式。然而，本领域技术人员根据本公开内容将明白，在所公开的特定实施方案中可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下做出许多改变并且仍然得到同样或者相似的结果。更具体地，将明白化学和生理学上相关的某些试剂可以代替本文描述的试剂而将实现相同或相似的结果。认为对本领域技术人员而言显而易见的所有此类相似的替代和修饰都在所附权利要求书定义的本发明的精神、范围和概念内。
实施例1
作图群体和多态性鉴定
选择低亚麻酸系6P248、T27111、T27190、T26767和T26830用于鉴定成熟组1-4中的低亚麻酸(low-lin)相关的多态性。这些系的亚麻酸含量为约3％。低亚麻酸系Soyola和N98-44将用于成熟组4-5。其他低亚麻酸系包括A5和C1640。还使用具有下面的商业名称的16种野生型系：A2247、AG1902、AG2402、AG2703、AG3201、AG3302、AG3702、AJB2102J0C、AJB2302K0C、CSR2533、CSR2622N、CSR3922N、DKB19-51、DKB23-95和WP25920。为了促进作图，来自以前使用的作图群体的系HS-1和PI507354(PIC)用于一些测序区域中。使用标准DNA提取方案从每种基因型分离DNA。
设计嵌套引物以完全覆盖基因座Fad3-1a、Fad3-1b和Fad3-1c。产生的扩增子来自不同的系。将这些扩增子的序列进行比对以鉴定与低亚麻酸表型有关的SNP和插入/缺失。最初，从Fad3-1a设计了13对引物，从Fad3-1b设计了6对引物，并从Fad3-1c设计了12对引物。一旦从该研究确定了它们的序列，就为来自内含子的Fad3-1c设计额外的14对引物。表1列出了用于该分析的引物。用DNAStar包的Seqman程序进行序列比对。
由AppliedBiosystems根据SNP序列设计并制造Taqman测定。根据AppliedBiosystems的说明书进行SNP检测。
表1.为对Fad3-1a、Fad3-1b和Fad3-1c基因再测序(resequencing)设计的引物(分别为SEQIDNOs：4-82)
实施例2
鉴定在Fad3-1a的多态性
该基因座的序列覆盖度是良好的。表2显示了在该基因座鉴定的多态性。检测了10个SNP和3个插入/缺失。然而，没有发现SNP或者其他标记单元型与低亚麻酸表型有关。总之，发现在该基因座上的序列变异显著高于Fad3-1b和Fad3-1c上的，从而表明它对于该性状没有处于选择压力下。
表2.Fad3-1a基因座上的多态性
注释：括号中的数字表示给定系中的序列读数的数目。
实施例3
Fad3-1b上多态性的鉴定
Fad3-1b的内含子序列与Fad3-1a的相当不同，其允许有效产生基因座特异性扩增子。除了小部分5′UTR区之外，来自大多数系的序列的质量通常是高的。在所有系中检测到2683bp的完整序列长度中2021位上的单核苷酸多态性(表3)。有趣的是，发现该SNP与低亚麻酸表型有关。发现低亚麻酸系6P248、T27111、T27190、T26767和T26830在该位置携带“C”等位基因，而所有其他系都携带“T”。对具有“C”等位基因的5个系测试了亚麻酸含量并且发现其都具有小于4％的亚麻酸。其他低亚麻酸系如A5、Soyola和N98-4445在该基因座携带野生型等位基因，从而表明一个或多个其他基因座促进这些系中的低亚麻酸表型。
为了确定2021位的SNP是否是有义突变，将ORF翻译成蛋白质。这表明在低亚麻酸系中的该突变将氨基酸残基从组氨酸改变成酪氨酸。已经发现该组氨酸残基在对于涉及去饱和的多种基因是关键的。低亚麻酸系中所发现的SNP导致基序His-Val-Ile-His-His突变成His-Val-Ile-His-Tyr。该基序与低亚麻酸表型有关并且可能造成降低的亚麻酸。
表3.Fad3-1b基因座上的多态性
注释：括号中的数字表示给定系中的序列读数的数目
实施例4
Fad3-1c上多态性的鉴定
最初没有得到Fad3-1c的基因组DNA。然而，cDNA在Fad3-1a和Fad3-1c之间在整个基因内是高度保守的，具有高于90％的序列同一性。为了使用来自外显子的引物扩增内含子，手工挑选了靶定Fad3-1c特定区域的许多引物。一旦新序列是已知的，就从内含子设计新的引物。使用该方法，成功得到了覆盖所有内含子的部分序列。序列分析表明Fad3-1c等位基因与Fad3-1a基因座甚至在内含子中都是非常相似的。在两个基因座之间接近外显子/内含子接点处观察到非常高的序列相似性，但是相似性随着序列进一步延长而降低。
从所得的序列，在Fad3-1c鉴定了四个SNP和一个插入/缺失(表4)。687、2316、3743位的SNP以及1129位的插入/缺失似乎处于连锁平衡并且与低亚麻酸表型有关。低亚麻酸系Soyola和N98-4445在687和1129位都携带与所有其他系不同的等位基因。尽管没有从所有系得到3360和3743位的序列，但是表明这些基因座与687和1129连锁平衡。所有四个阳性SNPs/插入/缺失(Indel)位于内含子中。
有趣的是注意到低亚麻酸系Soyola和N98-4445来自属于成熟组4到5的种质，而其他系属于成熟组1到4。这些突变导致低亚麻酸表型的机制还不清楚。一种解释是有另一种突变位于编码区外，可能在启动子区中，其导致该表型并且与在内含子2中检测的的标记连锁平衡。因此如下所述进行启动子序列的分析。
重要的是从表4注意到突变系6P248、T27111、T27190、T26767、T26830和A5用几乎所有Fad3-1c基因座特异性引物都不能扩增。这表明在这些系中Fad3-1c基因座上有大的缺失。缺失的长度在不同突变系中稍有不同。该结果与早期的研究一致，所述研究表明A5实际上在Fad3-1c上携带缺失。因为该完整基因的大部分都被缺失，所以可以预测催化亚油酸向亚麻酸转化的酶不能正确地发挥功能。结果，携带该突变型的植物将产生较少的亚麻酸。
表4.Fad3-1c基因座上的多态性
注释：1.NA指没有检测到扩增
2.括号中的数字指出给定系中的序列读数的数目
实施例5
Fad3-1c的启动子区的分离
为了确定有助于Soyola和N98-4445中低亚麻酸含量的因素，尝试克隆Fad3-1c基因的上游区。设计了面向上游区的三种引物并且将该引物用于根据从CloneTech购买的GenomeWalking试剂盒扩增未知的启动子序列。从A3244系得到约1kb片段。PCR产物用外切核酸酶和虾碱性磷酸酶处理后直接测序。为了鉴定与低亚麻酸含量有关的多态性，设计了三种新的引物来覆盖整个启动子和编码区的5’末端，其然后用于扩增24种不同系。将来自这些扩增子的序列进行比对以鉴定SNP。在启动子区中发现了7个SNP(表5)。Soyola在所有七个位置都携带与其他野生型系不同的等位基因。这些SNP可能是低亚麻酸表型的决定因素。为了证实该关联，对亚麻酸含量分离的群体测试这些SNP。
表5.Fad3-1c启动子区中的多态性
位置
实施例6
低亚麻酸标记测定验证
从上面鉴定的4个SNP设计Taqman终点测定(表6)。测定按照给定基因座上共有序列中SNP位置来命名。例如，FD3A842指来自Fad3-1a的在共有序列上842位的SNP。新的标记名NS0193117在后来分配给FD3A842并且用于生产。对用于再次测序的相同实验组验证测定。图1A显示了NS0193117的allelogram。来自Taqman测定的等位基因模式与序列相一致。
从Fad3-1b设计了两种测定FD3B2021A和FD3B2021B(NS0193115)。图1B显示了测序实验组上NS0193115的allelogram。具有低亚麻酸含量的所有四种系都具有与野生型不同的等位基因，从而与序列很好地对应。图1C显示了来自Fad3-1c位687的NS0193116的allelogram。系Soyola和N98-4445显示了与其他系不同的等位基因。所有测定结果都对应于序列数据。
对亚麻酸含量的8个分离群体进一步测试SNP标记(表7)。已知与fanfan基因座连锁的6个SNP也在相同的群体上进行基因分型。因为群体为F4，所以当用于Mapmaker程序时，将它们作为RI群体处理。杂合等位基因被掩蔽掉了。
NS0131053是位于连锁群B2/U26上的标记，其中fanfan基因座位于该连锁群上。表7表明NS0193116(Fad3-1c)通过约10cM距离与NS0131053连锁。因此，如我们预期的，fad3c对应于fanfan。因为发现NS0131053与NS0193116(fad3c)连锁，所以NS0131053也可以作为低亚麻酸系选择的参考标记。可以基于在NS0193116上的无效等位基因和在NS0131053上的低亚麻酸等位基因进行选择。来自这些群体的数据表明Fad3-1a、-1b和-1c等位基因都独立地遗传。
发现NS0193115和NS0193116标记的组合提供了对亚麻酸含量的准确诊断。从序列结果可以清楚地知道Fad3-1b和-1c两者在控制大豆中亚麻酸水平中起作用。仅具有Fad3-1b(NS0193115)突变的突变系含有约4.2％亚麻酸而仅Fad3-1c(NS0193116)缺失的突变系含有约3.4％(表8)。因此，通过组合包含Fad3-1b和Fad3-1c基因座上双重突变型标记的植物的选择，可以得到甚至更低水平的亚麻酸。图2显示了Fad3-1b和Fad3-1c的表型值。这清楚地表明双重突变型“TT＊＊”具有最低的亚麻酸含量而双重野生型具有最高的亚麻酸含量。
表6.用于Taqman测定法的引物和探针(分别为SEQIDNOs：83-97)
表7.NS0193116和NS0131053之间的遗传连锁
表8.不同基因型中亚麻酸含量的百分数
| Q-NS0131053 | 总计％ | Q-NS0193116 | 总计％ | Q-NS0193115 | 总计％ |
| AAATTT | 6.184.693.76 | TT** | 5.533.43 | CCCTTT | 5.264.664.17 |
| 总计 | 4.75 | 总计 | 4.75 | 总计 | 4.75 |
参考文献
在本文中具体引入下面的参考文献作为参考，其程度为它们提供补充本文所给出的那些细节的示例性方法或者其他细节。
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ctataaaaattgaatcaatagaagaa26
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aaaaattgaatcaataaaagaa22
Claims (17)
1.产生大豆种子的方法，其包括以下步骤：
a)将第一种大豆植物自交或将第一种大豆植物与第二种大豆植物杂交，其中所述第一种和第二种植物一起包含赋予降低的亚麻酸含量的Fad3-1b等位基因，其中所述第一种植物包含Fad3-1b等位基因，并且其中所述第二种植物包含商业上重要意义的产量；
b)测定杂交所得后代大豆植物的产量和所述Fad3-1b等位基因的50cM内的大豆植物基因组区中多态性的存在；和
c)选择包含所述多态性和商业上重要意义的产量的至少第一种后代植物，
其中所述第一种植物包含Fad3-1b基因序列的对应于SEQIDNO：1的核苷酸2021的位置上的单核苷酸多态性。
2.权利要求1的方法，其还定义为制备杂种大豆种子的方法，其包括将第一种植物与第二种不同的大豆植物杂交。
3.生产食物或饲料的方法，其包括：
(a)从权利要求1的方法产生的种子获得植物；
(b)栽培所述植物至成熟；和
(c)从所述植物制备食物或者饲料。
4.权利要求3的方法，其中所述食物是蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、大豆外壳、粗粉或面粉。
5.权利要求3的方法，其中所述食物是油。
6.权利要求5的方法，其中所述食物包含饮料、泡制食物、沙司、调味品、色拉调料、果汁、糖浆、甜食、糖衣和饼馅、软的冷冻产品、糖食或者半成品食物。
7.得到大豆种质的方法，其包括步骤：
a)鉴定Fad3-1b等位基因的50cM内的大豆植物基因组区中赋予降低的亚麻酸含量的至少第一种多态性，其中所述第一种多态性包括Fad3-1b基因序列的对应于SEQIDNO：1的核苷酸2021的位置上的单核苷酸多态性；
b)测定大豆植物的所述多态性的存在；和
c)选择包含所述多态性的至少第一种大豆植物。
8.权利要求7的方法，其包括鉴定所述Fad3-1b等位基因的50cM内的大豆植物基因组区中的多态性并测定所述多态性的存在。
9.权利要求7的方法，其中测定大豆植物的所述第一种多态性的存在包括PCR、单链构象多态性分析、变性梯度凝胶电泳、裂解片段长度多态性分析和/或DNA测序。
10.植物育种方法，其包括步骤：
a)测定大豆植物的Fad3-1b等位基因的50cM内的大豆植物基因组区中赋予降低的亚麻酸含量的至少第一种多态性的存在，其中所述第一种多态性包括Fad3-1b基因序列的对应于SEQIDNO：1的核苷酸2021的位置上的单核苷酸多态性；
b)选择包含所述多态性的至少第一种大豆植物；和
c)将该第一种大豆植物与第二种大豆植物杂交，以产生包含所述多态性的子代植物。
11.权利要求10的方法，其还包括步骤：
d)选择包含所述多态性的子代植物并将所述子代植物与第三种大豆植物杂交以产生另外的子代植物。
12.权利要求11的方法，其中所述第二种和第三种植物是相同的品种。
13.权利要求11的方法，其还包括重复步骤d)约2-10次。
14.权利要求10的方法，其包括测定大豆植物的所述Fad3-1b等位基因的50cM内的大豆植物基因组区中多态性的存在。
15.权利要求14的方法，其包括基于所述多态性的存在选择所述第一种大豆植物。
16.权利要求10的方法，其中选择包含所述多态性的至少第一种大豆植物包括PCR、单链构象多态性分析、变性梯度凝胶电泳、裂解片段长度多态性分析和/或DNA测序。
17.在严格条件下与Fad3-1b等位基因的50cM内的大豆植物基因组区域杂交的探针或引物，其中该探针或引物包含选自SEQIDNO：87到SEQIDNO：94的核酸序列。
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