MX2007003794A - Plantas de frijol de soya de alto rendimiento con bajo contenido de acido linolenico. - Google Patents

Plantas de frijol de soya de alto rendimiento con bajo contenido de acido linolenico.

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MX2007003794A
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Kunsheng Wu
Paul Mclaird
Joshep R Byrum
Robert Reiter
Mark Erickson
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Monsanto Technology Llc
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Abstract

La invencion supera las deficiencias de la tecnica precedente al proveer metodos para marcar una seleccion asistida para crear plantas de una variedad de frijol de soya que exhibe un contenido medio/bajo de acido linolenico con un rendimiento comercialmente significativo y un fenotipo agronomicamente selecto; la invencion tambien provee derivados y partes vegetales de estas plantas; ademas se proveen por la invencion metodos para el uso de estas plantas; la invencion es significativa en tanto que el aceite conacido linolenico disminuido exhibe numerosas caracteristicas beneficas aun cuando las variedades previas en la tecnica con acido linolenico disminuido tambien exhibieron un rendimiento disminuido y una pobre calidadagronomica.

Description

PLANTAS DE FRIJOL DE SOYA DE ALTO RENDIMIENTO CON BAJO CONTENIDO DE ACIDO LINOLENICO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta solicitud reclama la prioridad a la Solicitud de Patente Provisional de los E.U.A. No. de serie 60/614,331 , presentada el 29 de septiembre de 2004, la descripción total de la cual se incorpora específicamente en la presente invención como referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente al campo de la cruza de plantas. En particular, la invención se refiere a variedades de frijol de soya agronómicamente selectas con un rendimiento comercialmente significativo y un contenido medio/bajo de ácido linolénico.
DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA Las semillas de frijol de soya son una fuente importante de aceite vegetal, el cual se utiliza en productos alimenticios en todo el mundo. El nivel relativamente elevado (usualmente de aproximadamente 8%) de ácido linolénico (18:3) en el aceite de frijol de soya reduce su estabilidad y sabor.
La hidrogenación del aceite de frijol de soya se utiliza para disminuir el nivel de ácido linolénico (18:3) y mejorar tanto la estabilidad como el sabor de los aceites de frijol de soya (Dutton et al., 1951 ; Lui y White, 1992). Sin embargo, la hidrogenación resulta en la producción de ácidos grasos trans, los cuales incrementan el riesgo de enfermedad cardiaca coronaria cuando se consumen (Hu et al., 1997). Las variedades de frijol de soya con bajo contenido de ácido linolénico se han producido a través de la mutación, selección y cruza (Fehr et al., 1992; Rahman y Takagi, 1997; Ross et al., 2000; Byrum et al., 1997; Stoisin et al., 1998). Se han producido las variedades con un contenido de ácido linolénico en el orden de 1 % o menor en particular (Patentes de E.U.A. Nos. 5,534,425 y 5,714,670). Sin embargo, las líneas con bajo contenido de ácido linolénico producidas hasta la fecha han tenido problemas con un bajo rendimiento de semilla y otras características agronómicas deseadas para la producción comercial. El problema ha sido difícil de resolver y se complica por la naturaleza cuantitativa de los rasgos agronómicos tales como contenido y rendimiento de ácido linolénico. Por lo tanto la utilidad del frijol de soya con un bajo contenido de ácido linolénico se ha limitado en la mayoría de las aplicaciones comerciales. El desarrollo de un producto con rendimiento de semilla comercialmente significativo es una alta prioridad en la mayoría de los programas para desarrollo de cultivares de frijol de soya. El rendimiento se controla por muchos genes y es influido fuertemente por el medioambiente. Es una característica de importancia central al valor comercial de una variedad y de criadores que continuamente intentan mejorar el rendimiento más allá de lo que es posible actualmente. Es un reto difícil el incorporar el contenido bajo de ácido linolénico dentro de cultivares con alto rendimiento. Probablemente debido a la dificultad, la técnica previa no ha podido proveer variedades de frijol de soya con alto rendimiento que también poseen un bajo contenido de ácido linolénico y características agronómicamente selectas. Sin embargo, existe una gran necesidad en la técnica para dichas plantas de frijol de soya. La Food and Drug Administration (FDA) ha propuesto regulaciones sobre las etiquetas de nutrición para que se requiera que la cantidad de ácidos grasos trans en un alimento se incluyan en el panel de datos de nutrición. Además de los beneficios a la salud de la reducción de nuestra confianza sobre la hidrogenación de los aceites del frijol de soya, la propuesta anteriormente mencionada por la FDA ha despertado un gran interés en la producción de frijol de soya con bajo contenido de ácido linolénico (menor de 3%) que no requiere, o requiere menos hidrogenación. El contenido disminuido de ácido linolénico puede mejorar significativamente el valor de una cosecha de frijol de soya. Para que el contenido disminuido de ácido linolénico tenga importancia comercial, el rendimiento y/o rasgos agronómicos selectos no deben ser impactados de manera sustancial. Por lo tanto, la provisión de plantas de frijol de soya que son agronómicamente selectas a la vez que tanto el rendimiento alto como la posesión de ácido linolénico disminuido podrían representar un avance sustancial en la técnica e igualmente benéficos a los agricultores y consumidores.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención provee una planta de frijol de soya de una variedad agronómicamente selecta que tiene un contenido medio/bajo de ácido linolénico y un rendimiento comercialmente significativo. También se proveen las partes de esta planta, incluyendo, pero no limitadas a, polen, un óvulo, una célula y una semilla. Adicionalmente se provee un cultivo de tejido de células regenerables de la planta, en donde el cultivo de tejido regenera las plantas de frijol de soya capaces de expresar todas las características fisiológicas y morfológicas de la planta. En una modalidad de la invención, las células regenerables son embriones, células meristemáticas, polen, hojas, raíces, puntas de raíces o flores o son protoplastos o callos derivados a partir de éstos. Adicionalmente se provee por la invención una planta de frijol de soya regenerada a partir del cultivo de tejido capaz de expresar todas las características fisiológicas y morfológicas de la planta inicial. En ciertas modalidades de la invención, se define un contenido medio/bajo de ácido linolénico como un contenido de ácido linolénico de aproximadamente 1.0% a aproximadamente 3.0% en peso de los ácidos grasos totales de la semilla, incluyendo de aproximadamente 1.5% a aproximadamente 3.0%, de aproximadamente 2% a aproximadamente 2.6%, de aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 2.6%, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 2.2%, de aproximadamente 1.6% a aproximadamente 2.6% y de aproximadamente 2% a aproximadamente 2.4% en peso de los ácidos grasos totales de la semilla. Dichas plantas que se pueden definir adicionalmente como que tienen un rendimiento de granos de, por ejemplo, al menos aproximadamente 90%, 94%, 98%, 100%, 103% 105% o aproximadamente 110% de las líneas para monitoreo AG2703 y DKB23-51. La línea AG2703, la cual también tiene las designaciones SN79553 y 9323265446452, se patentó en la Patente de E.U.A. No. 6,184,442, la descripción de la cual se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad. La línea designada DKB23-51 , la cual también tiene las designaciones 02122920 y 958361722350, se patentó en la Patente de E.U.A. No. 6,369,302, la descripción de la cual se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad. Las semillas de AG2703 y DKB23-51 se han depositado con la ATCC bajo los números de acceso ATCC PTA-2577 y PTA-3933, respectivamente. En incluso otro aspecto, la invención provee partes vegetales de una planta de la invención. Los ejemplos de dichas partes incluyen polen, un óvulo, un meristemo o una célula. La invención también provee semillas de una planta descrita en la presente invención, así como cultivos de tejido que comprenden células de dicha planta, en donde el cultivo de tejidos regenera plantas de frijol de soya que expresan las características fisiológicas y morfológicas de la planta. El cultivo de tejido puede estar comprendido de células regenerables tales como embriones, células meristemáticas, polen, hojas, raíces, puntas de raíces o flores. En incluso otro aspecto, la invención provee una planta de frijol de soya de la invención que comprende un transgén. El transgén se puede definir en una modalidad como un elemento que confiere un rasgo seleccionado a partir del grupo que consiste de tolerancia al herbicida; resistencia a la enfermedad; resistencia al insecto o a la plaga; metabolismo alterado de ácidos grasos, proteínas o carbohidratos; rendimiento incrementado del grano; madurez alterada de la planta, y características morfológicas alteradas. Un ejemplo de una resistencia al herbicida es resistencia a glifosato. En modalidades particulares, una planta de la invención se puede definir adicionalmente como que se produce por un método que comprende los pasos de: a) cruzar una Sintéticoa y una segunda plantas de frijol de soya, en donde las plantas comprenden los alelos Fad3-1b y Fad3-1c que confieren contenido disminuido de ácido linolénico, en donde la Sintéticoa planta tiene un contenido medio/bajo de ácido linolénico, y en donde la segunda planta comprende un rendimiento comercialmente significativo; b) ensayar la progenie de plantas de frijol de soya que resultan a partir de la cruza para rendimiento y para la presencia de polimorfismos localizados en una región genómica de la planta de frijol de soya en 50 cM de dichos alelos Fad3-1b y Fad3-1c; y c) seleccionar al menos una Sintéticoa progenie vegetal agronómicamente selecta que comprende dichos polimorfismos y un rendimiento comercialmente significativo para obtener la planta de conformidad con la reivindicación 1. En incluso otro aspecto, la invención provee un método para la obtención de un germoplasma de frijol de soya, que comprende los pasos de: a) identificar al menos un Sintético polimorfismo en una región genómica de la planta de frijol de soya en 50 cM de un alelo Fad3-1b o Fad3-1c que confiere contenido disminuido de ácido linolénico; b) ensayar las plantas de frijol de soya para la presencia del polimorfismo; y c) seleccionar al menos una planta de frijol de soya que comprende el polimorfismo. El método puede comprender la identificación de polimorfismos en una región genómica de la planta de frijol de soya en 50 cM de ambos alelos Fad3-1b y Fad3-1c y ensayar para la presencia de dichos polimorfismos. En una modalidad, el Sintético polimorfismo comprende un polimorfismo de nucleótido particular en una posición en la secuencia del gen Fad3-1b que corresponde al nucleótido 2021 de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, el Sintético polimorfismo comprende un polimorfismo de nucleótido particular en una posición en la secuencia del gen Fad3-1c que corresponde al nucleótido 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 ó 3743 de SEQ ID NO: 2. El Sintético polimorfismo también puede comprender una deleción en la secuencia del gen Fad3-1c, y puede comprender un polimorfismo en el promotor Fad3-1c, tal como un polimorfismo de nucleótido particular en una posición que corresponde al nucleótido 334, 364, 385, 387, 393, 729 ó 747 de SEQ ID NO: 3. La detección del polimorfismo se puede llevar a cabo mediante cualquier método, incluyendo PCR, análisis de polimorfismo conformacional de cadena sencilla, electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, análisis de polimorfismo por escisión de longitud de fragmento y/o secuenciación de ADN. En incluso otro aspecto, la invención provee un método de cruza vegetal que comprende los pasos de: a) ensayar las plantas de frijol de soya para la presencia de al menos un Sintético polimorfismo en una región genómica de la planta de frijol de soya en 50 cM de un alelo Fad3-1b o Fad3-1c que confiere contenido disminuido de ácido linolénico; b) seleccionar al menos una planta de frijol de soya que comprende el polimorfismo; y c) cruzar la Sintéticoa planta de frijol de soya con una segunda planta de frijol de soya para producir las plantas de la progenie que comprenden el polimorfismo. El método puede comprender adicionalmente el paso de: d) seleccionar una planta de la progenie que comprende el polimorfismo y cruzar la planta de la progenie con una tercera planta de frijol de soya para producir plantas adicionales de la progenie. En el método la segunda y tercera plantas pueden ser de la misma variedad. En ciertas modalidades, el método comprende adicionalmente repetir el paso d) aproximadamente 2-10 veces. El método incluso puede comprender adicionalmente ensayar las plantas de frijol de soya para la presencia de polimorfismos en las regiones genómica de la planta de frijol de soya en 50 cM de dichos alelos Fad3-1b y Fad3-1c y seleccionar dicha Sintéticoa planta de frijol de soya que se puede basar en la presencia de los polimorfismos. En ciertas modalidades, los marcadores asociados a Fad3-1b y Fad3-1 c se pueden ensayar sin llevar a cabo ensayo para marcadores estrechamente asociados a Fad3-1a, puesto que los inventores han mostrado que son los alelos Fad3-1b y Fad3-1c los que contribuyen a un bajo contenido de ácido linolénico. En ciertas modalidades del método, el Sintético polimorfismo comprende un polimorfismo de nucleótido particular en una posición en el gen Fad3-1b que corresponde al nucleótido 2021 de SEQ ID NO: 1. El Sintético polimorfismo también puede comprender un polimorfismo de nucleótído particular en una posición en el gen Fad3-1c que corresponde al nucleótido 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 ó 3743 de SEQ ID NO: 2. En incluso otras modalidades el Sintético polimorfismo comprende una deleción en la secuencia del gen Fad3-1c y/o un polimorfismo de nucleótido particular en una posición en el promotor Fad3-1c que corresponde al nucleótido 334, 364, 385, 387, 393, 729 ó 747 de SEQ ID NO: 3. La selección de al menos una planta de frijol de soya que comprende el polimorfismo se puede llevar a cabo mediante cualquier método, tales como, por ejemplo, PCR, análisis de polimorfismo conformacional de cadena sencilla, electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, análisis de polimorfismo por escisión de longitud de fragmento y/o secuenciación de ADN. En incluso otro aspecto, la invención provee una sonda o iniciador que hibrida bajo condiciones severas a una región genómica de la planta de frijol de soya en 50 cM de un alelo Fad3-1b o un alelo Fad3-1c, en donde la sonda o iniciador es una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4-98.
Incluso otro aspecto de la invención es un método para la producción de un producto alimenticio para consumo humano o animal que comprende: (a) obtener una planta de la invención; (b) cultivar la planta hasta la madurez; y (c) preparar un producto alimenticio a partir de la planta. En ciertas modalidades de la invención, el producto alimenticio puede ser un concentrado de proteína, aislado de proteína, harina, aceite, grano molido o hollejos de frijol de soya.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN [ O La invención supera las deficiencias de la técnica precedente al proveer variedades de frijol de soya agronómicamente selectas con un contenido medio/bajo de ácido linolénico y rendimiento del grano comercialmente aceptable. La invención es significativa en tanto que, aunque 15 los beneficios de estas características se han llevado a cabo individualmente, éstas no han sido combinadas previamente en una variedad particular. La provisión de un contenido medio/bajo de ácido linolénico en combinación con otras características deseables provee muchos beneficios. Por ejemplo, los aceites de frijol de soya actuales típicamente deben estar al menos 0 parcialmente hidrogenados y/o mezclados con otros aceites debido a problemas con la estabilidad del aceite. El contenido reducido de ácido linolénico reduce la necesidad de cualquier solución al mejorar la estabilidad y, dependiendo del uso, puede eliminar la necesidad de la hidrogenación. Por lo tanto el costo y calidad del aceite de frijol de soya se pueden mejorar marcadamente al disminuir el contenido de ácido linolénico, haciendo al aceite mucho más competitivo en relación con otros aceites de semillas. El bajo contenido de ácido linolénico también reduce los sabores raros y por lo tanto las líneas con esta característica tienen mayor valor comercial (Liu y White, 1992). Sin embargo, la amplia adopción de variedades de bajo contenido de ácido linolénico ha sido impedida hasta la fecha por los rendimientos bajos o calidad agronómica baja. La invención provee marcadores genéticos y métodos para su uso para la creación de dichas plantas mejoradas. Esto es importante debido a que la herencia del complejo de rasgos cuantitativos, tales como rendimiento y contenido de ácido linolénico, se realiza de manera exponencial cuando se intenta combinar los rasgos. Los marcadores se identificaron utilizando el método del gen candidato. Los iniciadores anidados específicos del locus se diseñan para abarcar toda la familia del gen FAD3 que consiste de tres loci independientes. Los amplicones se generaron a partir de 25 genotipos diferentes que comprenden 9 mutantes y 16 tipos silvestres. Los SNPs e Indels se identificaron a través del alineamiento de secuencia. El análisis de segregación genética confirmó que los marcadores identificados se asocian a los alelos Fad3-1b y Fad3-1c, los cuales se asocian con las mutaciones en las secuencias de tipo silvestre correspondientes que producen fenotipos con bajo contenido de ácido linolénico. El análisis de la segregación de las plantas demostró que Fad3-1b y Fad3-1c controla de manera aditiva el contenido de ácido linolénico en el frijol de soya. Por lo tanto, utilizando una combinación de marcadores para Fad3-1b y Fad3-1c, la invención permite la predicción precisa del contenido de ácido linolénico en plantas sin la necesidad de llevar a cabo un análisis bioquímico costoso. Estos marcadores se demostraron exitosamente para uso en programas de cruza de frijol de soya con bajo contenido de ácido linolénico y permitieron, por Sintéticoa vez, el desarrollo de variedades de frijol de soya que combinan un fenotipo con bajo contenido de ácido linolénico con un rendimiento comercialmente significativo y características agronómicamente selectas. La técnica precedente no ha podido proveer plantas de dicha variedad, presumiblemente debido a la dificultad para combinar rasgos diferentes con una herencia compleja y a la falta de medios para superar estas dificultades. Mediante la descripción de métodos para la producción de dichas plantas y la provisión de ejemplos de estas plantas, la invención actualmente permite la preparación de un número potencialmente ilimitado de variedades novedosas de frijol de soya que exhiben un rendimiento comercialmente significativo combinado con un contenido bajo de ácido linolénico y específicamente un contenido medio/bajo de ácido linolénico. Una vez que dicha variedad selecta se produce, el rendimiento combinado y el contenido bajo de ácido linolénico se puede transferir hacia otras variedades que se retro-cruza de manera adecuada y se puede realizar la selección para mantener los rasgos deseables como se describe en la presente invención a continuación.
I. Plantas de la invención La invención provee por Sintéticoa vez plantas y derivados de las mismas de variedades de frijol de soya que combinan rendimiento comercialmente significativo y contenido medio/bajo de ácido linolénico con un fenotipo agronómicamente selecto. Dichas plantas se pueden definir como que tienen un rendimiento comercialmente significativo, por ejemplo, que se define como un rendimiento de al menos 103% de las líneas para monitoreo AG2703 y DKB23-51. En ciertas modalidades adicionales, se proveen plantas que tienen un contenido medio/bajo de ácido linolénico y un rendimiento de granos de al menos de aproximadamente 90%, 94%, 98%, 100%, 105% o de aproximadamente 110% de estas líneas. Dichas plantas se pueden definir, en ciertas modalidades de la invención, como que tienen un rendimiento en exceso de aproximadamente 35, 37, 39, 41 , 43 ó 45 áridos por 0.405 hectárea en al menos 10 ambientes. En modalidades particulares de la invención, el contenido medio/bajo de ácido linolénico se puede definir como de aproximadamente 1 % a aproximadamente 3% de contenido de ácido graso en la semilla, incluyendo de aproximadamente 1.3% a aproximadamente 3%, de aproximadamente 1.5% a aproximadamente 3%, de aproximadamente 1.8% a aproximadamente 3%, de aproximadamente 2.1 % a aproximadamente 3%, de aproximadamente 2.4% a aproximadamente 3%, de aproximadamente 2.6% a aproximadamente 3%, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 2.6%, de aproximadamente 1.3% a aproximadamente 2.6%, de aproximadamente 1.8% a aproximadamente 2.6%, de aproximadamente 2% a aproximadamente 2.6%, de aproximadamente 2% a aproximadamente 2.4% y de aproximadamente 1.6% a aproximadamente 2.4% de contenido de ácido graso en la semilla. Por lo tanto un aspecto de la presente invención se dirige a las plantas anteriormente mencionadas y partes de las mismas y métodos para uso de estas plantas y partes vegetales. Las partes vegetales incluyen, pero no se limitan a, polen, un óvulo y una célula. La invención provee adicionalmente cultivos de tejido de células regenerables de estas plantas, dichos cultivos regeneran las plantas de frijol de soya capaces de expresar todas las características fisiológicas y morfológicas de la variedad inicial. Dichas células regenerables pueden incluir embriones, células meristemáticas, polen, hojas, raíces, puntas de raíces o flores, o protoplastos o callos depvados a partir de éstos. También se proveen por la invención plantas de frijol de soya regeneradas a partir de dicho cultivo de tejido, en donde la plantas son capaces de expresar todas las características fisiológicas y morfológicas de la variedad de la planta inicial a partir de la cual se obtienen las células regenerables.
II. Selección asistida por marcador para la producción de variedades de frijol de soya con contenido medio/bajo de ácido linolénico La presente invención provee marcadores genéticos y métodos para la introducción de loci que confieren un contenido medio/bajo de ácido linolénico en plantas de frijol de soya. Por lo tanto la invención permite por Sintéticoa vez la creación de plantas que combinan a este contenido de ácido linolénico con un rendimiento comercialmente significativo y un fondo genético agronómicamente selecto. Utilizando los métodos de la invención, los loci que confieren contenido disminuido de ácido linolénico se pueden introducir dentro de potencialmente cualquier fondo genético deseado de frijol de soya, por ejemplo, en la producción de nuevas variedades con un rendimiento comercialmente significativo y un contenido medio/bajo de ácido linolénico. La introducción asistida por marcador incluye la transferencia de una región del cromosoma definida por uno o más marcadores a partir de un germoplasma hasta un segundo germoplasma. El paso inicial en ese proceso es la localización del rasgo mediante mapeo del gen, el cual es el procedimiento para la determinación de la posición de un gen en relación con otros genes y marcadores genéticos a través del análisis de enlace. El principio básico para el mapeo por enlace es que conforme más cercanos se encuentren los dos genes en el cromosoma, mayor probabilidad existe de que se hereden juntos. Brevemente, generalmente se realiza una cruza entre dos parentales genéticamente compatibles pero divergentes en relación con los rasgos bajo estudio. Los marcadores genéticos se pueden utilizar entonces para seguir la segregación de los rasgos bajo estudio en la progenie a partir de la cruza, frecuentemente una retro-cruza (BC1 ), F2, o población endogámica recombinante. El término loci del rasgo cuantitativo, o QTL, se utiliza para describir regiones de un genoma que muestran efectos cualitativos o aditivos sobre un fenotipo. Los presentes inventores han identificado marcadores genéticos para dos de QTLs, Fad3-1b y Fad3-1c. Por lo tanto la invención permite el uso de herramientas moleculares para combinar estos QTLs con características deseadas.
A. Desarrollo de marcadores genéticos asociados Una Sintéticoa muestra de la población vegetal se puede genotipificar para que un marcador genético heredado forme una base de datos genotípica. Como se utiliza en ia presente invención, un "marcador genético heredado" es un alelo en un locus particular. Un locus en una posición sobre un cromosoma, y un alelo se refiere a las condiciones de los genes; es decir, diferentes secuencias nucleotídicas, en estos loci. La composición del marcador alérgico de cada locus puede ser ya sea homocigota o heterocigota. Con el objeto de obtener información a partir de un marcador genético en una cruza, el marcador debe ser polimórfico; es decir, debe existir en diferentes formas de manera que el cromosoma que porta el gen mutante se puede distinguir a partir del cromosoma con el gen normal mediante la forma del marcador que también porta. La formación de una base de datos fenotípíca se puede realizar al elaborar observaciones directas de uno o más rasgos sobre la progenie derivada a partir de la polinización artificial o de la auto-polinización natural de una planta muestra o mediante la evaluación cuantitativa de la capacidad combinada de una planta muestra. A manera de ejemplo, una línea vegetal se puede cruzar a, o por, uno o más probadores. Los probadores pueden ser líneas endogámicas, híbridas de cruza particular, doble, o múltiple, o cualquier otro ensamblaje de plantas producidas o mantenidas por cruza controlada o cruza libre, o cualquier combinación de las mismas. Para algunas plantas auto-polinizantes, se prefiere la evaluación directa sin prueba de la progenie. Los genotipos del marcador se pueden determinar en la generación de cruza de prueba y se pueden mapear los loci marcadores. Para mapear un rasgo particular mediante el método de asociación, es necesario establecer una correlación positiva en la herencia de un locus cromosomal específico con la herencia del rasgo. En el caso de la herencia del complejo, tal como con los rasgos cuantitativos, incluyendo específicamente contenido de ácido linolénico y rendimiento, la asociación generalmente será mucho más difícil de discernir. En este caso, los procedimientos estadísticos pueden necesitar establecer la correlación entre el fenotipo y el genotipo. Esto puede necesitar adicionalmente el examen de muchos descendientes a partir de una cruza particular, puesto que los loci individuales pueden tener pequeñas contribuciones al fenotipo general. La co-herencia, o asociación genética, de un rasgo particular y de un marcador sugiere que se encuentra físicamente cercanas en el cromosoma. La asociación se determina mediante el análisis del patrón de herencia de un gen y un marcador en una cruza. La unidad de recombinación es el centimorgan (cM). Dos marcadores se encuentran un centimorgan aparte si se combinan en meiosis una vez cada 100 oportunidades que tienen para hacerlo. El centimorgan es una medición genética, no una medición física. Aquellos marcadores localizados menos de 50 cM a partir de un segundo locus se dice que están genéticamente asociados, debido a que no se heredan de manera independiente entre sí. Por lo tanto, el porcentaje de recombinación observado entre los loci por generación será menor de 50%. En modalidades particulares de la invención, los marcadores se pueden utilizar cuando se localizan a menos de aproximadamente 45, 35, 25, 15, 10, 5, 4, 3, 2, o 1 o menos cM aparte en un cromosoma. En ciertas modalidades de la invención los marcadores se pueden utilizar para detectar polimorfismos dentro de los loci mismos contribuyentes y por lo tanto se localizan a 0 cM con respecto a los loci, por ejemplo, que comprenden una mutación dentro de la secuencia codificante de Fad3-1b o de Fad3-1c o del elemento regulador. Durante la meiosis, los pares de cromosomas homólogos se unen e intercambian segmentos en un proceso denominado recombinación. Cuanto más alejado se encuentre un marcador a partir de un gen, existe una mayor probabilidad de que se presente recombinación entre el gen y el marcador. En un análisis de asociación, la co-herencia del marcador y del gen o del rasgo es seguido por una cruza particular. Se calcula la probabilidad de que su patrón de herencia observado se puede presentar solamente por azar, por ejemplo, de que éstos no se encuentren completamente asociados. Se repite el cálculo asumiendo un grado particular de asociación, y se determina la relación de las dos probabilidades (no asociación contra un grado especificado de asociación). Esta relación expresa las probabilidades para (y en contra) ese grado de asociación, y debido a que se utiliza el algoritmo de la relación, se conoce como el algoritmo de las probabilidades, por ejemplo una evaluación lod. Una evaluación lod que es igual a o mayor que 3, por ejemplo, se considera para confirmar que el gen y el marcador se encuentran asociados. Esto representa una probabilidad 1000:1 de que los dos loci se encuentren asociados. Los cálculos para la asociación generalmente se facilitan mediante el uso de programas que emplean análisis estadístico. La asociación genética de las moléculas marcadoras se puede establecer mediante un modelo de mapeo genético tales como, sin limitación, el modelo de marcador flanqueante reportado por Lander y Botstein (1989), y el mapeo de intervalo, basado en los métodos de probabilidad máxima descritos por Lander y Botstein (1989), e implementados en el paquete de software MAPMAKER/QTL (Lincoln y Lander, 1990). El software adicional incluye Qgene, Versión 2.23 (1996) (Department of Plant Breeding and Biometry, 266 Emerson Hall, Cornell University, Ithaca, NY).
B. Marcadores heredados Los marcadores genéticos comprenden diferencias detectadas (polimorfismos) en la información genética portada por dos o más plantas. El mapeo genético de un locus con marcadores genéticos típicamente requiere dos componentes fundamentales: alelos polimorfismos detectables y recombinación o segregación de esos alelos. En las plantas, la recombinación medida es virtualmente siempre meiótica, y por lo tanto, los dos requerimientos inherentes para el mapeo genético en un animal son marcadores genéticos polimórficos y una o más plantas en las cuales esos alelos son segregados. Preferiblemente los marcadores se heredan de manera codominante de manera que la presencia de ambos alelos en un locus diploide es fácilmente detectable, y se encuentran libres de variación ambiental, por ejemplo, su heredabilidad es 1. Un genotipo del marcador típicamente comprende dos alelos marcadores en cada locus en un organismo diploide tales como frijoles de soya. La composición del marcador alélico de cada locus puede ser ya sea homocigota o heterocigota. La homocigocidad es una condición en donde ambos alelos en un locus se caracterizan por la misma secuencia nucleotídica. La heterocigocidad se refiere a diferentes condiciones del gen en un locus. Numerosos tipos marcadores diferentes están disponibles para uso en el mapeo genético. Los tipos de marcadores genéticos ejemplares para uso con la invención incluyen, pero no se limitan a, polimorfismos por longitud del fragmento de restricción (RFLPs), polimorfismos por longitud de secuencia simple (SSLPs), polimorfismos por longitud de fragmento amplificado (AFLPs), polimorfismos de núcleotido particular (SNPs), e isozimas. Los polimorfismos que comprenden tan poco como el cambio de un nucleótido particular se pueden ensayar de numerosas formas. Por ejemplo, la detección se puede realizar mediante técnicas electroforéticas incluyendo un polimorfismo conformacional de cadena sencilla (Orita et al., 1989), electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (Myers et al., 1985), o polimorfismos por longitud de fragmento escindible (Life Technologies, Inc., Gathersberg, MD 20877), pero la amplia disponibilidad de aparatos para secuenciación de ADN frecuentemente hace más fácil ajustar directamente los productos amplificados de la secuencia. Una vez que se conoce la diferencia de la secuencia polimórfica, se pueden diseñar ensayos rápidos para evaluar la progenie, típicamente incluyendo alguna versión de la amplificación de alelos específicos mediante PCR (PASA, Sommer, et al., 1992), o la amplificación de múltiples alelos específicos mediante PCR (PAMSA, Dutton y Sommer, 1991 ). Los polimorfismos por longitud del fragmento de restricción (RFLPs) son diferencias genéticas detectables mediante longitudes del fragmento de ADN, típicamente reveladas por electroforesis en gel de agarosa, después de la digestión de ADN por endonucleasa de restricción. Está disponible un gran número de endonucleasas de restricción, caracterizadas por sus sitios de escisión nucleotídica y su fuente, por ejemplo, EcoRl. Los RFLPs resultan tanto a partir de polimorfismos de una sola pb dentro de las secuencias del sitio de restricción como a partir de inserciones o deleciones mensurables dentro de un fragmento de restricción dado RFLP que son fáciles y relativamente no costosas para generar (requiere un ADN clonado, pero no la secuencia) y son co-dominantes. Los RFLPs tienen la desventaja de ser realizados solamente mediante una labor intensiva en la etapa de tipificación, aunque esto se puede evitar hasta cierto grado al multiplicar muchas de las tareas y mediante la reutilización de los blots. La mayoría de los RFLP son bialélicos y de menor contenido polimórfico que los microsatélites. Por estas razones, el uso de RFLP en el mapeo del gen animal ha disminuido. Un experto en la técnica podría reconocer que muchos tipos de marcadores moleculares son útiles como herramientas para monitorear la herencia genética y no se limitan a RFLPs, SSRs y SNPs, y un experto en la tecnifica también podría entender que se puede emplear una variedad de métodos de detección para rastrear los diversos marcadores moleculares. Un experto en la técnica también podría reconocer que los marcadores de diferentes tipos se pueden utilizar para el mapeo, especialmente conforme se desarrolla la tecnología y se identifican nuevos tipos de marcadores y medios para identificación. Para propósitos de conveniencia, los genotipos del marcador heredado pueden ser convertidos hacia evaluaciones numéricas, por ejemplo, si existen 2 formas de un SNP, u otro marcador, designado A y B, en un locus particular utilizando una enzima particular, entonces los complementos diploides se pueden convertir hacia una evaluación numérica, por ejemplo, son AA=2, AB=1 , y BB=0; o AA=1 , AB=0 y BB=1. Los valores absolutos de las evaluaciones no son importantes. Lo que es importante es la naturaleza aditiva de las designaciones numéricas. Las evaluaciones anteriormente mencionadas se refieren a marcadores codominantes. Un sistema de evaluación similar se puede proporcionar el cual es consistente con los marcadores dominantes.
C. Selección asistida por marcador La invención provee plantas de frijol de soya con un contenido medio/bajo de ácido linolénico en combinación con un rendimiento comercialmente significativo y características agronómicamente selectas. Dichas plantas se pueden producir de conformidad con la invención mediante métodos de selección asistida por marcador que comprenden ensayar el ADN genómico para la presencia de marcadores que están genéticamente asociados a un alelo Fad3-1b y/o Fad3-1c que confiere una cantidad disminuida de ácido linolénico. En ciertas modalidades de la invención se puede desear obtener los marcadores adicionales asociados a los alelos Fad3-1b y/o Fad3-1c. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, al preparar inicialmente una población F2-mediante la auto-cruza de un híbrido F1 producido mediante la cruza de las variantes endogámicas con solamente una de las que comprenden el alelo Fad3-1b y/o Fad3-1c que confiere contenido disminuido de ácido linolénico. Las líneas recombinantes endogámicas (RIL) (líneas genéticamente relacionadas; usualmente >F5, se desarrollan a partir de líneas continuamente auto-cruzadas F2 hacia la homocigocidad) se pueden preparar y utilizar como una población para mapeo. La información obtenida a partir de marcadores dominantes se puede maximizar mediante el uso de RIL debido a que todos los loci son homocigotos o casi lo son. Las poblaciones de retro-cruza (por ejemplo, generadas a partir de una cruza entre una variedad deseable (parental recurrente) y otra variedad (parental donante) que porta un rasgo que no está presente en la última también se pueden utilizar como una población para mapeo. Se puede realizar una serie de retro-cruzas con respecto al parental recurrente para recuperar la mayoría de sus rasgos deseables. Por lo tanto se crea una población que consiste de individuos similares al parental recurrente pero cada individuo porta cantidades variables de regiones genómicas a partir del parental donante. Las poblaciones de retro-cruza se pueden utilizar para marcadores dominantes de mapeo si todos los loci en el parental recurrente son homocigotos y el donante y el parental recurrente tienen alelos marcadores polimórficos contrastantes (Reiter et al., 1992). Las poblaciones útiles para propósitos de mapeo son líneas casi-isogénicas (NIL). Las NlLs se crean mediante muchas retro-cruzas para producir un arreglo de individuos que son casi idénticos en la composición genética excepto por el rasgo deseado o región genómica que se puede utilizar como una población de mapeo. En un mapeo con NlLs, solamente una porción de los loci polimórficos se espera que se mapeen en una región seleccionada. El mapeo también se puede llevar a cabo en líneas vegetales transformadas.
D. Métodos de cruza vegetal Las técnicas de cruza toman ventaja de un método de polinización de las plantas. Existen dos métodos generales de polinización: la auto-polinización que se presenta si el polen a partir de una flor se transfecta a la misma flor o a otra flor de la misma planta, y la polinización cruzada la cual se presenta si el polen se pone en contacto con una flor de una planta diferente. Las plantas que han sido auto-polinizadas y que se seleccionan para tipo durante muchas generaciones se vuelven homocigotas en casi todos los loci del gen y producen una población uniforme de la progenie de cruza real, plantas homocigotas. En el desarrollo de las variedades adecuadas, se puede utilizar la cruza por pedigree. El método de cruza por pedigree para los rasgos específicos incluye la cruza de dos genotipos. Cada genotipo puede tener una o más características deseables que están carentes en el otro; o, cada genotipo puede complementar al otro. Si los dos genotipos parentales originales no proveen todas las características deseadas, se pueden incluir otros genotipos en la población de cruza. Las plantas superiores que son los productos de estas cruzas son auto-cruzadas y avanzan de nuevo en cada generación sucesiva. Cada generación exitosa se vuelve más homogénea como un resultado de la auto-polinización y la selección. Típicamente, este método de cruza incluye cinco o más generaciones de auto-cruza y selección: ST — > S2; S2 — S3; S3 — S ; S4 -*• S5, etc. Una generación de auto-cruza (S) se puede considerar que es un tipo de generación filial (F) y como tal, se puede denominar F. Después de al menos generaciones, la planta auto-cruzada endogámico se considera genéticamente pura. Cada programa de cruza debe incluir una evaluación periódica, objetiva de la eficiencia del procedimiento de cruza. Los criterios de evaluación pueden variar dependiendo de la meta y de los objetivos. Las líneas prometedoras con una cruza avanzada se evalúan extensivamente y se comparan con los estándares apropiados en el ambiente representativo del área(s) blanco comercial por generalmente tres o más años. La identificación de los individuos que son genéticamente superiores debido al valor genotípico se puede enmascarar al confundir los rasgos vegetales o los factores ambientales. Un método para la identificación de una planta superior es observar su desempeño en relación con otras plantas experimentales y con respecto a una o más variedades estándares ampliamente crecidas. Las observaciones particulares pueden ser inconclusas, mientras que las observaciones subsecuentes proveen un mejor estimado del valor genético. Las selecciones masivas y recurrentes se pueden utilizar para mejorar las poblaciones ya sea de cosechas auto-polinizadas o polinizadas por cruza. Una población genéticamente variable de individuos heterocigotos se identifica o se crea mediante la intercruza de varios parentales diferentes. Las mejores plantas se seleccionan basándose en la superioridad individual, progenie distinguida, o excelente capacidad combinada. Las plantas seleccionadas son intercruzadas para producir una nueva población en la cual los ciclos adicionales de selección son continuos. Las descripciones de otros métodos de cruza que son comúnmente utilizados para diferentes rasgos y cosechas se pueden encontrar en uno de varios libros de referencia (por ejemplo, Allard, 1960; Simmonds, 1979; Sneep et al., 1979; Fehr, 1987a,b). La efectividad de seleccionar para genotipos con rasgos de interés {por ejemplo, alto rendimiento, resistencia a la enfermedad, perfil de ácido graso) en un programa de cruza dependerá de: 1 ) el grado en el cual la variabilidad en los rasgos de interés de plantas individuales en una población es el resultado de factores genéticos y por lo tanto se transmite a las progenies de los genotipos seleccionados; y 2) que tanto de la variabilidad en los rasgos de interés entre las plantas se debe al ambiente en el cual los diferentes genotipos se encuentran en crecimiento. La herencia de los rasgos en un intervalo en comparación con el control por un gen principal cuya expresión no se influye por el ambiente (por ejemplo, caracteres cualitativos) para controlar muchos genes cuyos efectos están influidos en gran parte por el ambiente (por ejemplo, caracteres cuantitativos). La cruza para los rasgos cuantitativos tal como el rendimiento se caracteriza adicionalmente por el hecho de que: 1 ) las diferencias que resultan a partir del efecto de cada gen son pequeñas, haciendo difícil o imposible identificarlas individualmente; 2) el número de genes que contribuye a un carácter es grande, de manera que las distintas relaciones de segregación son raras si es que se obtienen en algún momento; y 3) los efectos de los genes se pueden expresar en diferentes formas basándose en la variación ambiental. Por lo tanto, la identificación precisa de los segregantes transgresivo o genotipos superiores con los rasgos de interés es extremadamente difícil y su éxito depende de la capacidad de cruza de la planta para minimizar la variación ambiental que afecta la expresión del carácter cuantitativo en la población. La probabilidad de identificar un segregante transgresivo se reduce en gran medida conforme se incrementa el número de rasgos que se combina en un genotipo. Por ejemplo, si se realiza una cruza entre cultivares que difieren en tres caracteres complejos, tales como rendimiento, contenido de ácido linolénico y al menos un Sintético rasgo agronómico, es extremadamente difícil sin herramientas moleculares para recuperar simultáneamente mediante recombinación el número máximo de genes favorables para cada uno de los tres caracteres dentro de un genotipo. Consecuentemente, todos los criadores generalmente pueden tener esperanza para obtener una serie de genes favorables para el Sintético carácter complejo combinado con una serie favorables de genes para el segundo carácter en un genotipo en adición a un gen seleccionado. La retro-cruzada es un método eficiente para transferir rasgos deseables específicos. Esto se puede realizar, por ejemplo, mediante la cruza inicial de una variante superior endogámica (A) (parental recurrente) hacia un donante endogámico (parental no recurrente), el cual porta el gen(es) adecuado(s) para el rasgo en cuestión (Fehr, 1987). La progenie de esta cruzada se acoplan de nuevo al parental recurrente superior (A) seguido por la selección en la progenie resultante para que el rasgo deseado se transfiera a partir del parental no recurrente. Dicha selección se puede basar en los ensayos genéticos, como se menciona a continuación, o alternativamente, se puede basar en el genotipo de la planta de la progenie. Después de cinco o más generaciones de retro-cruza con la selección para el rasgo deseado, la progenie es heterocigota para los loci que controlan la característica a ser transferida, pero son similares al parental superior para la mayoría o para casi todos los otros genes. La última generación de las retro-cruza se es auto-cruzada, o cruza con consaguíneo, para producir una progenie de cruza pura para el gen(es) a ser transferido, por ejemplo, loci que proveen la planta con contenido disminuido de ácido linolénico. En una modalidad de la invención, el proceso de conversión de retro-cruza se puede definir como un proceso que incluye los pasos de: (a) cruzar una planta de un Sintético genotipo que contiene uno o más genes deseados, la secuencia de ADN o el elemento, tales como los alelos Fad3-1b y/o Fad3-1c asociados con un contenido disminuido de ácido linolénico, a una planta de un segundo genotipo que carece de dicho gen deseado, secuencia de ADN o el elemento; (b) seleccionar una o más plantas de progenie que contienen el gen deseado, secuencia de ADN o el elemento; (c) cruzar la planta de la progenie con una planta del segundo genotipo; y (d) repetir los pasos (b) y (c) para el propósito de transferir dicho gen deseado, secuencia de ADN o el elemento a partir de una planta de un Sintético genotipo hacia una planta de un segundo genotipo.
La introducción de un elemento particular de ADN o serie de elementos dentro de un genotipo vegetal se define como el resultado de los procesos de conversión por retro-cruza. Un genotipo vegetal dentro del cual se introduce una secuencia de ADN se puede referir como un genotipo convertido por retro-cruza, línea, endogámico, o híbrido. Similarmente un genotipo vegetal que carece de la secuencia de ADN deseada se puede referir como un genotipo no convertido, línea, endogámico, o híbrido. Durante la cruza, los marcadores genéticos asociados con un contenido disminuido de ácido linolénico se pueden utilizar para ayudar en la cruza para el propósito de producir plantas de frijol de soya con contenido disminuido de ácido linolénico y preferiblemente un contenido medio/bajo de ácido linolénico. La retro-cruza y la selección asistida por marcador en particular se pueden utilizar con la presente invención para introducir el rasgo de contenido disminuido de ácido linolénico de conformidad con la presente invención dentro de cualquier variable mediante la conversión de esa variedad con los alelos Fad3-1b y/o Fad3-1c asociados con el rasgo, con ambos loci siendo preferidos. La selección de un parental recurrente adecuado es un paso importante para un procedimiento de retro-cruza exitoso. El objetivo del protocolo que retro-cruza es alterar o sustituir un rasgo o característica en el endogámico original. Para lograr esto, uno o más loci del endogámico recurrente se modifican o se sustituyen con el gen deseado a partir del parental no recurrente, a la vez que se retiene esencialmente todo el resto de la constitución genética deseada, y por lo tanto la constitución fisiológica y morfológica del endogámico original. La elección del parental no recurrente particular dependerá de los propósitos de la retro-cruza, el cual en el caso de la presente invención puede ser añadiendo uno o más alelos que confieren contenido disminuido de ácido linolénico. El protocolo exacto de retro-cruza dependerá de la característica o rasgo a ser alterado para determinar un protocolo de evaluación apropiado. Aunque los métodos de retro-cruza se simplifican cuando la característica a ser transferida es un alelo dominante, también se puede transferir un alelo recesivo. En este caso puede ser necesario introducir al menos la progenie para determinar si la característica deseada se ha transferido de manera exitosa. En el caso de la presente invención, uno puede evaluar el contenido de ácido linolénico de las líneas de la progenie generadas durante el programa de retro-cruza así como el uso del sistema marcador descrito en la presente invención para seleccionar las líneas basándose en los marcadores más bien que en los rasgos visuales. Las plantas de frijol de soya (Glycine max L.) se pueden cruzar ya sea mediante técnicas naturales o mecánicas (véase, por ejemplo, Fehr, 1980). La polinización natural se presenta en los frijoles de soya ya sea mediante auto-polinización o polinización cruza la natural, la cual típicamente es ayudada por los organismos polinizadores. Ya sea en la cruza natural o artificial, la cloración y el tiempo de floración son una importante consideración. El frijol de soya es una planta de día corto, pero existe una considerable variación genética para la sensibilidad al fotoperíodo (Hamner, 1969; Criswell y Hume, 1972). La longitud del día crítica para los intervalos de floración es de aproximadamente 13 horas para los genotipos adaptados a las latitudes tropicales y de 24 horas para los genotipos con fotoperíodo insensible que se crecen a mayores latitudes (Shibles et al., 1975). Los frijoles de soya parecen no ser sensibles a la longitud del día por 9 días después del surgimiento de la planta. Los fotoperíodo más cortos que la longitud crítica del día se requieren para 7 a 26 días para completar la inducción de la formación de flor (Borthwick y Parker, 1938; Shanmugasundaram y Tsou, 1978). Las flores del frijol de soya típicamente se auto-polinizan en el día en que se abre la corola. El estigma es receptivo al polen de aproximadamente 1 un día antes de la antesis y permanece receptivo por 2 días después de la antesis, si no se remueven los pétalos de la flor. Los filamentos de nueve estambres se fusionan, y el más cercano se encuentra libre. Los estambres forman un anillo por debajo del estigma hasta aproximadamente 1 día antes de la antesis, luego sus filamentos se empiezan a elongar rápidamente y se elevan las anteras alrededor del estigma. La dehiscencia de las anteras es el día de la antesis, los granos de polen caen sobre el estigma, y dentro de las Sintéticoas 10 horas los tubos de polen alcanzan el ovario y se lleva cabo la fertilización (Johnson y Bernard, 1963). La auto-polinización se presenta naturalmente en el frijol de soya sin manipulación de las flores. Para la cruza de dos plantas de soya, es típicamente preferible, aunque no se requiere, utilizar hibridación artificial. En la hibridación artificial, la flor utilizada como una hembra en una cruza se poliniza en cruza manualmente antes de la maduración del polen a partir de la flor, previniendo así la auto-fertilización, o alternativamente, las partes machos de la flor son emasculadas utilizando una técnica conocida en la técnica. Las técnicas para emasculación de las partes macho de una flore de frijol de soya incluyen, por ejemplo, remoción física de las partes macho, uso de un factor genético que confiere esterilidad al macho, y aplicación de un gametocida químico a las partes macho. Ya sea con o sin la emasculación de la flor hembra, la polinización a mano se puede llevar a cabo mediante la remoción de los estambres y los pistilos con un fórceps a partir de una flor del parental macho y suavemente cepillado las anteras en contra del estigma de la flor hembra. El acceso a los estambres se puede lograr mediante la remoción del sépalo frontal y carinas de los pétalos, o sujetado la carina con fórceps cerrados y permitiendo que se abra para empujar los pétalos lejos. El cepillado de las anteras sobre el estigma ocasiona la ruptura de éstos, y el mayor porcentaje de cruces exitosas se obtiene cuando el polen es claramente visible sobre el estigma. La difusión del polen se puede monitorear mediante el golpe suave de las anteras antes de cepillado del estigma. Se pueden utilizar varias flores macho para obtener la difusión del polen cuando las condiciones son desfavorables, o el mismo macho se puede utilizar para polinizar varias flores con una buena difusión del polen. La esterilidad genética del macho está disponible en frijoles de soya y puede ser útil para facilitar la hibridación en el contexto de la presente invención, particularmente para programas de selección recurrente (Brim y Stuber, 1973). La distancia requerida para completar el aislamiento de un bloque de cruza no es clara; sin embargo, la exocruza es menor del 0.5% cuando las plantas estériles macho se encuentran a 12 m o más a partir de una fuente de polen externo (Boerma y Moradshahi, 1975). Las plantas en los límites de a un bloque para cruza probablemente produce la mayor exocruza con polen externo y se pueden eliminar al cosechar para minimizar la contaminación. Una vez cosechadas, las vainas típicamente se secan al aire a no más de 38°C hasta que las semillas contienen 13% de humedad o menos, luego las semillas se remueven a mano. Las semillas se pueden almacenar de manera satisfactoria a aproximadamente 25°C por hasta un año si la humedad relativa es del 50% o menor. En climas húmedos, el porcentaje de germinación disminuye rápidamente a menos que la semilla se seque hasta 7% de humedad y se almacene en un contenedor que no permite el paso del aire a temperatura ambiente. El almacenamiento largo plazo en cualquier clima se logra de mejor manera al secar la semilla hasta 7% de humedad y almacenándola a 10°C o menos en un cuarto que se mantiene a 50% de humedad relativa o en un contenedor que no permite el paso del aire.
III. Rasgos para modificación y mejoría de las variedades de frijol de soya En ciertas modalidades, una planta de frijol de soya provista por la invención puede comprender uno o más transgén(es). Un ejemplo de dicho transgén confiere resistencia al herbicida. Los genes comunes para resistencia al herbicida incluyen un gen EPSPS que confiere resistencia a glifosato, un gen de neomicina fosfotransferasa II (nptll) que confiere resistencia a canamicina (Fraley er al., 1983), un gen de higromicina fosfotransferase que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Vanden Elzen eí al., 1985), genes que confieren resistencia al glufosinato o broxinilo (Comai et al., 1985; Gordon-Kamm et al., 1990; Stalker et al., 1988) tales como dihidrofolato reductasa y acetolactato sintasa (Eichholtz et al., 1987, Shah er al., 1986, Charest ef al., 1990). Los ejemplos adicionales incluyen enzimas mutantes ALS y AHAS que confieren resistencia a la imidazalinona o a una sulfonilurea (Lee et al., 1988; Miki et al., 1990), un gen de la fosfinotricina-acetil-transferasa que confiere resistencia a la fosfinotricina (Solicitud Europea 0 242 246), genes que confieren resistencia a los ácidos fenoxi propiónicos y cicloshexonas, tales como setoxidim y haloxifop (Marshall et al., 1992); y genes que confieren resistencia a la triazina (genes psbA y gs+) y benzonitrilo (gen de la nitrilasa) (Przibila et al., 1991 ). Una planta de la invención también puede comprender un gen que confiere resistencia al ataque de insectos, plagas, virus o bacterias. Por ejemplo, un gen que confiere resistencia a una plaga, tal como un nemátodo del quiste del frijol de soya como se describe en la solicitud de PCT WO 96/30517 y en la solicitud de PCT WO 93/19181. Jones et al., (1994) describen la clonación del gen del tomate Cf-9 para la resistencia a Cladosporium fulvum); Martin er al., (1993) describen un gen del tomate Pto para la resistencia a Pseudomonas syringae pv. y Mindrinos eí al., (1994) describen un gen de Arabidopsis RSP2 para la resistencia a Pseudomonas syringae. Las endotoxinas de Bacillus thuringiensis también se pueden utilizar para la resistencia a insectos. (Véase, por ejemplo, Geiser et al., (1986). Una proteína para unión a vitamina tal como avidina también se puede utilizar como un larvicida (solicitud de PCT US93/06487). Se sabe que el uso de proteínas de la cubierta viral en células vegetales transformadas imparte resistencia a la infección viral y/o al desarrollo de la enfermedad por el virus a partir del cual se deriva el gen de la proteína de cubierta, así como mediante virus relacionados. (Véase Beachy eí al., 1990). A la resistencia mediada por proteína de cubierta se ha conferido a las plantas transformadas en contra del virus del mosaico de la alfalfa, virus del mosaico del pepino, virus de la veta del tabaco, virus X de la patata, virus Y de la patata, virus del grabado del tabaco, virus del cascabel del tabaco y virus del mosaico del tabaco. Id. También se pueden utilizar las proteínas que detienen el desarrollo producidas en la naturaleza por un patógeno o un parásito. Por ejemplo, Logemann et al., (1992), han mostrado que las plantas transgénicas que expresan el gen que inactiva al ribosoma de la cebada tienen una resistencia incrementada con respecto al enfermedad fungal. Los transgenes también se pueden utilizar para conferir valor nutricional incrementado u otro rasgo de valor añadido. Un ejemplo es el metabolismo modificado de ácidos grasos, por ejemplo, mediante la transformación de una planta con un gen antisentido de la estearoil-ACP desaturasa para incrementar el contenido de ácido esteárico de la planta. (Véase Knutzon eí al., 1992). Un gen sentido de la desaturasa también se puede introducir para alterar el contenido de ácido graso. El contenido de fitato se puede modificar mediante la introducción de un gen que codifica la fitasa para mejorar la degradación del fitato, añadiendo más fosfato libre a la planta transformada. La composición modificada de carbohidrato también se puede afectar, por ejemplo, mediante la transformación de las plantas con un gen que codifica para una enzima que altera el patrón de ramificación del almidón. (Véase Shiroza eí al., 1988) (secuencia nucleotídica del gen de la fructosiltransferasa de Streptococcus mutants); Steinmetz eí al., (1985) (secuencia nucleotídica del gen de la levansucrasa de Bacillus subtilis); Pen eí al., (1992) (producción en plantas transgénicas que expresan la a-amilasa de Bacillus lichenifonnis); Elliot eí al., (1993) (secuencias nucleotídicas de los genes de la invertasa de tomate); Sogaard eí al., (1993) (mutagénesis sitio dirigida del gen de la a-amilasa de cebada); y Fisher eí al., (1993) (enzima ramificadora del almidón del endospermo del maíz II)). Los transgenes también se pueden utilizar para alterar el metabolismo de proteína. Por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,545,545 describe acido dihidrodipicolínic sintasa del maíz insensible a la lisina (DHPS), la cual es sustancialmente resistente a las concentraciones de L-lisina quiere otra manera inhibe la actividad de la DHPS nativa. De manera similar, EP 0640141 describes secuencias que codifican a la aspartocinasa insensible a lisina (AK) capaz de ocasionar una producción mayor de la normal de treonina, así como un subfragmento que codifica la lisina cetoglutarato reductasa antisentido para incrementar la lisina. En otra modalidad, se puede emplear un transgen que altera el metabolismo de carbohidrato en la planta. Por ejemplo, los genes de la fructocinasa se conocen para uso en la ingeniería metabólica de la expresión del gen de la fructocinasa en plantas transgénicas y sus frutos (véase la Patente de E.U.A. No. 6,031 ,154). Un ejemplo adicional de los transgenes que se pueden utilizar son los genes que altera en el rendimiento del grano. Por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 6,486,383 describe la modificación del contenido de almidón en plantas con subunidades de proteínas de adenosina difosfoglucosa pirofosforilasa ("ADPG PPasa"). En EP0797673, se discuten las plantas transgénicas en las cuales la introducción y expresión de moléculas particulares de ADN resulta en la formación de agrupamientos de fosfato con una movilidad facilitada fuera de la vacuola y una producción de biomasa mejorada y/o conducta de floración alterada. Incluso se conocen de manera adicional genes para alterar la madurez de la planta. La Patente de E.U.A. No. 6,774,284 describe ADN que codifica una lipasa de planta y métodos de uso de la misma para controlar la senescencia en las plantas. La Patente de E.U.A. No. 6,140,085 discute los genes FCA para la alteración de las características de floración, particularmente el tiempo de floración. La Patente de E.U.A. No. 5,637,785 discute plantas genéticamente modificadas que tienen un desarrollo modulado de la flor tales como aquellas que tienen un desarrollo temprano del meristemo floral y que comprenden un gen estructural que codifica la proteína LEAFY en su genoma. Los genes para alterar las características morfológicas en planta se conocen bien y se pueden utilizar de conformidad con la invención. La Patente de E.U.A. No. 6,184,440 discute plantas genéticamente diseñadas las cuales exhiben una estructura alterada o morfología como un resultado de la expresión de un transgén para la modulación de la pared celular. Los ejemplos de los transgenes que modulan la pared celular incluyen un dominio para unión a celulosa, una proteína para unión a celulosa, o una proteína o enzima que modifica la pared celular tal como una endoxiloglucan transferasa, xiloglucan endo-transglicosilasa, una expansina, una celulosa sintasa, o una endo-1 ,4-ß-glucanasa novedosa aislada. Los métodos para la introducción de un transgén se conocen bien en la técnica e incluyen protocolos biológicos y físicos para la transformación vegetal. Véase, por ejemplo, Miki eí al. (1993). Una vez que se introduce un transgén dentro de una variedad, éste se puede transferir fácilmente mediante cruza. Mediante el uso de reto-cruza, se recuperan esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas de una variedad además del locus transferido dentro de la variedad via la técnica de retro-cruza. Los métodos de retro-cruza se pueden utilizar con la presente invención para mejorar o introducir una característica dentro de una planta (Poehlman et al., 1995; Fehr, 1987a,b).
IV. Cultivos de tejido y regeneración in vitro de las plantas de frijol de soya Un aspecto adicional de la invención se refiere a los cultivos de tejido de una variedad de frijol de soya de la invención. Como se utiliza en la presente invención, el término "cultivo de tejido" indica una composición que comprende células aisladas del mismo tipo o de tipos diferentes o una colección de dichas células organizadas dentro de las partes de una planta. Los tipos de cultivos de tejido ejemplares son protoplastos, callos y células vegetales que están intactas en las plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, flores, hojas, raíces, puntas de raíces, anteras, y los similares. En una modalidad preferida, el cultivo de tejido comprende embriones, protoplastos, células meristemáticas, polen, hojas o anteras. Los procedimientos ejemplares para la preparación de cultivos de tejido de células de frijol de soya regenerables y a partir de plantas de frijol de soya regeneradas, se discuten en la Patente de E.U.A. No. 4,992,375; Patente de E.U.A. No. 5,015,580; Patente de E.U.A. No. 5,024,944, y Patente de E.U.A. No. 5,416,011 , cada una de las descripciones de éstas se incorpora específicamente en la presente invención como referencia en su totalidad. Una capacidad importante de un cultivo de tejido es la capacidad de generar plantas fértiles. Esto permite, por ejemplo, la transformación de la células de cultivo de tejido después de la regeneración de las plantas transgénicas. Para que la transformación sea eficiente y exitosa, el ADN se debe introducir dentro de las células que dan lugar a plantas o a tejido de la línea germinal. Los frijoles de soya típicamente se regeneran vía dos procesos distintos; morfogenéticas del vastago y embriogénesis somática (Finer, 1996). La morfogénesis del vastago es el proceso para la organización y desarrollo del meristemo del vastago. Los vastagos crecen por fuera de un tejido fuente y se escinden y se procesan para la producción de raíces para obtener una planta intacta. Durante la embriogénesis somática, un embrión (similar al embrión cigótico), que contiene ambos ejes del vastago y de la raíz, se forma a partir de tejido vegetal somático. De esto resulta una planta intacta en lugar de un vastago con raíces a partir de la germinación del embrión somático. La morfogénesis del vastago y la embriogénesis somática son procesos diferentes y la ruta de regeneración específica depende principalmente de la fuente del explante y del medio utilizado para las manipulaciones en cultivo de tejido. Aunque los sistemas son diferentes, ambos sistemas muestran respuestas con variedad específica en donde algunas líneas responden más a las manipulaciones en cultivo de tejidos que otras. Una línea que tienen una gran respuesta es la morfogénesis del vastago puede no generar muchos embriones somáticos. Las líneas que producen grandes números de embriones durante un paso de "inducción" pueden no dar lugar a cultivos en proliferación. Por lo tanto, se puede desear optimizar las condiciones de cultivo de tejido para cada línea de frijol de soya. Estas optimizaciones se pueden llevar a cabo fácilmente por un experto en la técnica de cultivo de tejidos a través de estudios de cultivo pequeña escala. Además de las respuestas específicas de la línea, se pueden observar cultivos en proliferación tanto en la morfogénesis del vastago como en la embriogénesis somática. La proliferación es benéfica para ambos sistemas, puesto que permite que una célula sencilla, transformada se multiplique hasta el punto que contribuirá al tejido de la línea germinal. La morfogénesis del vastago se reportó inicialmente por Wright eí al. (1986) como un sistema en donde los vastagos se obtienen de novo a partir de nodulos de cotiledones de plántulas de frijol de soya. Los meristemos de la raíz se formaron subepidermalmente y el tejido morfogenético pudo proliferar sobre un medio que contenía bencil adenina (BA). Este sistema se puede utilizar para la transformación si el origen subepidermal, multicelular de los vastagos se reconoce y se utilizan cultivos proliferantes. La idea es que el tejido blanco que dará lugar a los nuevos vastagos y que hace que proliferen dichas células dentro de tejido meristemático disminuye los problemas asociados con el quimerismo. La formación de quimeras, que resulta de la transformación de solamente una célula particular en meristema, es problemática si la célula transformada no prolifera de manera adecuada y no da lugar a tejido de la línea germinal. Una vez que el sistema se ha entendido bien y que se reproduce de manera satisfactoria, éste se fue de utilizar como un tejido blanco para la transformación del frijol de soya. La embriogénesis somática en el frijol de soya se reportó inicialmente por Christianson eí al. (1983) como un sistema en el cual el tejido embriogénico inicialmente se obtenía a partir del eje del embrión cigótico. Estos cultivos embriogénicos se hacían proliferar pero la repetición de los resultados del sistema era baja y el origen de los embriones no se reportaró. Los estudios histológicos posteriores de diferentes cultivos proliferantes de frijol de soya embriogénico mostraron que los embriones en proliferación eran de origen apical o superficial con un número de masa de células que contribuía a la formación del embrión. El origen de los embriones primarios (los Sintéticoos embriones derivados a partir del explante inicial) es dependiente del tejido del explante y de los niveles de auxina en el medio de inducción (Hartweck eí al., 1988). Con cultivos embrionarios en proliferación, las células particulares o grupos pequeños de células de la superficie de los embriones somáticos "más viejos" forman los embriones "más nuevos". Los cultivos embriogénicos también se pueden utilizar de manera exitosa para la regeneración, incluyendo regeneración de plantas transgénicas, si el origen de los embriones se reconoce y se entienden las limitaciones biológicas de los cultivos embriogénicos en proliferación. Las limitaciones biológicas incluyen la dificultad en el desarrollo de cultivos embriogénicos en proliferación y los problemas de fertilidad reducida (variación inducida por el cultivo) asociados con plantas regeneradas a partir de cultivos embriogénicos en proliferación a largo plazo. Algunos de estos problemas se acentúan en cultivos prolongados. El uso de células más recientemente cultivadas puede disminuir o eliminar dichos problemas.
V. Utilización de plantas de frijol de soya Una planta de frijol de soya provista por la invención se puede utilizar para cualquier propósito que se considera de valor. Los usos comunes incluyen la preparación de alimento para consumo humano, forraje para consumo de animal no humano y usos industriales. Como se utiliza en la presente invención, "uso industrial" o "utilidad industrial" se refiere a usos que no son para alimentación ni para forraje para los frijoles de soya o productos basados en soya. Los fríjoles de soya comúnmente se procesan hacia dos productos principales, la proteína del frijol de soya (harina) y el aceite crudo del frijol de soya. Ambos productos se refinan adicionalmente de manera común para usos particulares. Los productos de aceite refinado se pueden degradar hacia glicerol, ácidos grasos y esteróles. Estos pueden emplearse para uso en alimentos, en forraje o para uso industrial. Los ejemplos de uso de productos alimenticios comestibles incluyen cremas para café, margarina, mayonesa, elementos farmacéuticos, aderezos para ensaladas, grasas, productos para repostería, y cubiertas de chocolate. Los productos de proteína de soya (por ejemplo, harina), se pueden dividir en concentrados de grano molido de soya y aislados los cuales tienen tanto uso en alimentos/forraje como en la industria. El grano molido de soya y la sémola frecuentemente se utilizan en la elaboración de aditivos para extender la carne y análogos, alimentos para mascotas, ingredientes para repostería y otros productos alimenticios. Los productos alimenticios elaborados a partir de grano molido de soya y aislados incluyen alimento para bebé, productos para dulces, cereales, bebidas alimenticias, tallarines, levadura, cerveza, cerveza ligera, etc. La harina de frijol de soya en particular se utiliza comúnmente como una fuente de proteína en la alimentación de ganado, principalmente cerdos y aves de corral. Por lo tanto los usos como forraje incluyen, pero no se limitan a, forrajes para acuacultura, forraje para abeja, reemplazo de forraje para ternera, forraje para peces, forraje para ganado, forraje para aves de corral y forraje para mascotas, etc. También se pueden utilizar los productos de frijol de soya total como alimento o forraje. Los usos comunes para alimento incluyen productos tales como la semilla, el frijol germinado, frijol de soya horneado, grano molido de soya con grasa total utilizada en diversos productos de repostería, frijol de soya rostizado utilizado como elemento de repostería, mantequilla de nuez de soya, café de soya, y otros derivados de soya a partir de alimentos orientales. Para el uso como forraje, hollejos comúnmente se remueven a partir del frijol de soya y se utilizan como forraje. Adicionalmente los frijoles de soya pueden tener usos industriales. Un uso industrial común para los frijoles de soya es la preparación de aglutinantes que se pueden utilizar para la elaboración de compuestos. Por ejemplo, los compuestos de madera se pueden producir utilizando proteína de soya modificada, una mezcla de proteína de soya hidrolizada y resinas PF, grano molido de soya que contiene resinas en polvo, y proteína de soya que contiene pegamento en forma de espuma. Los aglutinantes basados en soya se han utilizado para la elaboración de productos comunes de madera tales como madera terciada por más de 70 años. Aunque la inducción de resinas de urea-formaldehído y fenol-formaldehído ha disminuido el uso de adhesivos basados en soya en los productos de madera, las preocupaciones medioambientales y las preferencias de los consumidores por adhesivos elaborados a partir de elementos renovables ha ocasionado un resurgimiento del interés en el desarrollo de productos novedosos basados en soya para la industria de los compuestos de madera. La preparación de adhesivos representa otro uso industrial común para los frijoles de soya. Los ejemplos de adhesivos de soya incluyen adhesivos de hidrolizado de soya y adhesivos de grano molido de soya. El hidrolizado de soya es una solución acuosa, incolora elaborada mediante la reacción del aislado de proteína de soya en una solución al 5 por ciento de hidróxido de sodio bajo calor (120°C) y presión (2.1 kg/cm2 manométricos). La solución resultante de proteína de soya degradada es básica (pH 11 ) y tiene capacidad de fluir (aproximadamente 500 cps) a temperatura ambiente. El grano molido de soya es una harina finamente molida, desgrasada elaborada a partir de frijoles de soya. Se pueden elaborar diversas formulaciones de adhesivos a partir del grano molido de soya, con el Sintético paso comúnmente requiriendo la disolución del grano molido en una solución de hidróxido de sodio. La fuerza y otras propiedades de la formulación resultante variarán dependiendo de los aditivos en la formulación. Los adhesivos de harina de soya también se pueden combinar potencialmente con otras resinas comercialmente disponibles. El aceite de frijol de soya puede encontrar aplicación en numerosos usos industriales. El aceite de frijol de soya es el aceite vegetal más fácilmente disponible y uno de los de menor costo en el mundo. Los usos industriales comunes para el aceite de frijol de soya incluyen el uso como un componente de agentes anti-estáticos, compuestos para recalcadura, desinfectantes, fungicidas, tintas, pinturas, revestimientos protectores, madera laminada, agentes anti formación de espuma, alcohol, margarina, pintura, tinta, goma, grasa, cosméticos, etc. Los aceites de frijol de soya también han sido por muchos años un ingrediente principal de las resinas de alquido, las cuales se disuelven en solventes vehículo para hacer pinturas basadas en aceite. La química básica para convertir aceites vegetales hacia una resina alkyd bajo calor y presión se entiende bien por aquellos expertos en la técnica. El aceite de frijol de soya que se encuentra en estado comercialmente disponible no refinado o refinado, grado comestible, es un aceite bastante estable y de lento secado. El aceite de frijol de soya también se puede modificar para mejorar su reatividad bajo condiciones ambientales o, con el ingreso de energía en diversas formas, se ocasiona que el aceite copolimerice o se cure hacia una película seca. Algunas de estas formas de modificación han incluido epoxidación, alcohólísis o transesterificación, esterificación directa, metátesis, isomerización, modificación de monómero, y diversas formas de polimerización, incluyendo calentamiento del cuerpo. El componente reactivo del aceite de soya del ácido linolénico con sus enlaces dobles puede ser más útil que los componentes predominantes de ácido oléico y linoléico para muchos usos industriales. Los solventes también se pueden preparar utilizando ingredientes basados en soya. Por ejemplo, metil soyato, un metil éster basado en aceite de frijol de soya, su mayor aceptación en el mercado como un reemplazo excelente de solvente alterno en aplicaciones tales como limpieza de partes y eliminación de grasa, remoción de pintura y de tinta, y reparación del aceite derramado. Este también ha sido comercializado en numerosos productos formulados para consumo incluyendo productos para limpieza de manos, ceras para auto y removedores de graffiti. El metil soyato se produce mediante la transesterificación de del aceite de frijol de soya con metanol. Esta comercialmente disponible a partir de numerosos fabricantes y abastecedores. Como un solvente, el metil soyato tiene importantes propiedades relacionadas con el medio ambiente y la seguridad que lo hace atractivo para aplicaciones industriales. Tiene una menor toxicidad en comparación con otros solventes, es fácilmente biodegradable, y tiene un punto de inflamación muy alto y un bajo nivel de compuestos orgánicos volátiles (VOCs). La compatibilidad del metil soyato es excelente con metales, plásticos, la mayoría de los elastómeros y otros solventes orgánicos. Los usos habituales del metil soyato incluyen limpiadores, eliminadores de pintura, elementos para limpieza de aceite derramado y bioremedio, adyuvantes para pesticida, elementos para prevención de corrosión y aditivos para combustibles biodisel.
VI. Definiciones En la descripción y cuadros a continuación, se utilizan numerosos términos. Con el objeto de proveer un entendimiento claro y consistente de la especificación y de las reivindicaciones, se proveen las siguientes definiciones: Un/una: Cuando se utiliza en conjunción con la palabra "que comprende" u otro lenguaje abierto en las reivindicaciones, las palabras "un" y "una" denotan "uno(a) o más". Agronómicamente selecta: Como se utiliza en la presente invención, significa un genotipo que tiene una culminación de muchos rasgos distinguibles tales como surgimiento, vigor, vigor vegetativo, resistencia a la enfermedad, población de semillas, capacidad para mantenerse de pie y capacidad para ser desgranado que permiten que un productor coseche un producto de importancia comercial. Alelo: Cualesquiera de una o más formas alternas de un locus del gen, todos esos alelos se relacionan con un rasgo o característica. En una célula diploide u organismo, los dos alelos de un gen dado ocupan loci correspondientes en un par de cromosomas homólogos. Retrocruza: un procedimiento en el cual el criador cruza repetidamente la progenie híbrida, por ejemplo una Sintéticoa generación híbrida (F^, de vuelta con uno de los parentales de la progenie híbrida. La retrocruza se puede utilizar para introducir una o más conversiones del locus particular a partir de un fondo genético dentro de otro. Rendimiento comercialmente significativo: un rendimiento de grano que tiene significancia comercial para el agricultor representado por un rendimiento de grano real de 103% de las líneas para monitoreo AG2703 y DKB23-51 cuando se crece bajo las mismas condiciones. Cruza: el acoplamiento de dos plantas parentales. Polinización cruzada: fertilización mediante la unión de los dos gametos a partir de diferentes plantas. Híbrido F0 la Sintéticoa generación de progenie de la cruza de dos plantas no isogénicas. Genotipo: la constitución genética de una célula u organismo. Uso industrial: un uso que no se relaciona con la producción de alimentos ni con la producción de forraje para una planta de frijol de soya. El término "planta de frijol de soya" incluye partes vegetales y derivados de una planta de frijol de soya. Asociación: un fenómeno en donde los alelos en el mismo cromosoma tienden a segregarse juntos más frecuentemente de lo esperado por el azar si su transmisión es independiente. Marcador: un fenotipo fácilmente detectable, preferiblemente heredable de manera codominante (ambos alelos en un locus en un heterocigoto diploide se detectan fácilmente), sin un componente de varianza ambiental, por ejemplo, heredabilidad de 1. Fenotipo: las características detectables de una célula u organismo, cuyas características son la manifestación de la expresión del gen. Loci del rasgo cuantitativo (QTL): Los loci del rasgo cuantitativo (QTL) se refieren a los loci genéticos que controlan hasta cierto grado los rasgos numéricamente representables que se distribuyen usualmente de manera continua. Condiciones severas: se refiere a las condiciones de hibridación del ácido nucleico de 5X SSC, 50% de formamida y 42°C. Sustancialmente equivalente: una característica que, cuando se compara, no muestra una diferencia estadísticamente significativa (por ejemplo, p = 0.05) a partir de la media. Cultivo de tejido: Una composición que comprende células aisladas del mismo tipo o de tipo diferente o una colección de dichas células organizadas en partes de una planta. Transgén: un locus genético que comprende una secuencia la cual ha sido introducida dentro del genoma de una planta de frijol de soya mediante transformación.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar modalidades preferidas de la invención. Se debe apreciar por aquellos expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos a continuación representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto se pueden considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que se pueden realizar muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y aún así obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están dando químicamente como fisiológicamente relacionados se pueden sustituir por los agentes descritos en la presente invención mientras que se alcanzan los mismos resultados o resultados similares. Se considera que todas esas sustituciones y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones anexas.
EJEMPLO 1 Mapeo de poblaciones e identificación de polimorfismos Las líneas con bajo contenido de ácido linolénico 6P248, T27111 , T27190, T26767 y T26830 se seleccionaron para uso en la identificación de polimorfismos asociados con bajo contenido de ácido linolénico en grupos maduros 1-4. El contenido de ácido linolénico de estas líneas fue de alrededor del 3%. Las líneas con bajo contenido de ácido linolénico Soyola y N98-44 serán utilizadas en la madurez de los grupos 4-5. Otras líneas con bajo contenido de ácido linolénico incluyen A5 y C1640. También se utilizaron dieciséis líneas de tipo silvestre con las siguientes designaciones comerciales: A2247, AG1902, AG2402, AG2703, AG3201 , AG3302, AG3702, AJB2102J0C, AJB2302K0C, CSR2533, CSR2622N, CSR3922N, DKB19-51 , DKB23-95 y WP25920. Para facilitar los esfuerzos de mapeo, las líneas a partir de poblaciones mapeadas previamente utilizadas, HS-1 y PI507354(PIC), se utilizaron en algunas regiones de secuenciación. El ADN se aisló a partir de cada genotipo utilizando protocolos estándares para extracción de ADN. Los iniciadores anidados se diseñan para cubrir completamente los loci Fad3-1a, Fad3-1b, y Fad3-1c. Los amplicones generados fueron a partir de líneas diferentes. Las secuencias de estos amplicones se alinearon para la identificación de SNPs e Indels asociados con los fenotipos de bajo contenido de ácido linolénico. Inicialmente, 13 pares de iniciadores se diseñaron para Fad3-1a, 6 pares se diseñaron para Fad3-1b, y 12 pares se diseñaron para Fad3-1c. Se diseñaron 14 pares adicionales de iniciadores para Fad3-1c de los intrones una vez que sus secuencias se determinaron a partir de este estudio. El cuadro 1 lista los iniciadores utilizados en este análisis. El alineamiento de secuencia se realizó con el programa Seqman del paquete ADN Star. Los ensayos Taqman se diseñaron y elaboraron mediante Applied Biosystems basándose en las secuencias SNP. La detección de SNP se realizó de conformidad con la instrucción de Applied Biosystems.
CUADRO 1 Iniciadores diseñados para resecuenciación en los genes Fad3-1a, Fad3- 1b v Fad3-1c (SEQ ID NOs: 4-82, respectivamente) FAD3_1 A1 F CCTATTCTAGGTTTTTACGCACCA FAD3 A1 R AAGTTGTCTAAAGCCAAATGAAGAA FAD3J A2F GGACATGATTGGTAATAATTTTTGTG FAD3JA2R AGGAAGCATAAAGATTCCCTTTTT FAD3 A3F AAAGGGAATCTTTATGCTTCCTG FAD3_1A3R TCTGCACATGATCAAACAATTACA FAD3_1 A4F ATGTAATTGTTTG ATCATGTGCAG FAD3 A4R AAAATAAAATCTTGTGGGTGCAAT FAD3 A5F TGGCGGATCTATGTAAATGAGTG FAD3 A5R AATGAAAAACGGGGCTTGTAA FAD3_1 A6F TTTTGTTGGTCAAGGGACTTAGAT FAD3_1A6R CACCACCAAGCTCCCAGTATAGTA FAD3_1 A7F CCTCCTTTCTAGGTGTACATGCTT FAD3_1 A7R ATCATGG ATCCCATGTCTCTCTAT FAD3_1 A8F TTGTTCTTGGACATG ATTGGTAAT FAD3_1A8R TTCAATGACAAATGAACAAACAAA FAD3_1A9F GAAATCACATCTGGAATGTGAAAG FAD3_1A9R AATAATGTGTTGTTGTCTTCCAAGT FAD3 A10F GAAATCACATCTGGAATGTGAAAG FAD3_1A10R GTTCAAGAACAGCCTCAGGAAG FAD3 A11 F GGTGAACACTTAAATGCGAGATAG FAD3_1 A11 R TTATGGGGGCAAAGTTTTATTTTA FAD3 A12F TCCATAAATAAGTAAAACAAGTGACAA FAD3_1 A12RCCACTTACCACACTTTCTTTGTTG FAD3_1 A13FTCATTTTCAGTTGCATGATTCTAA FAD3_1 A13RCAG AAGTATCAAAGCATGTACACC FAD3_1 B1 F CAACATGTTGGTAATGGTGCAGGGA FAD3_1 B1 R CGAACAATCATGCATAACCAA FAD3_1 B2F TGCATGATTGTTCGTTCATATGTT FAD3_1 B2R TGACATAAAGGCATAAAGACACAT FAD3 B3F GATGTGAATTTCATGAAGTGGTTC FAD3_1 B3R GGACTTGGACATGTGTTAACCTC FAD3_1 B4F TATTTGCAACCTACACCGAAGTAA FAD3 B4R ACATGGAGTAAGTTTCTACCTTCTTT FAD3_1 B5F TATTTGCAACCTACACCGAAGTAA FAD3 B5R ACATGGAGTAAGTTTCTACCTTCTTT FAD3_1 B6F TTTCTCCTATTCTACAATCAATAATCC FAD3 1 B6R AAAGTAAGTGCATTTCTAGCATAATTT FAD31 C1 F AAGATTTCATTCTTCCTCTTCTAGG FAD31 C1 R AATTGAGGAATGCAAGATGTGTC FAD3 1C2F ACACATCTTG C ATTCCTC AATTCT FAD31C2R CTTTCTGGCTCACGGTAATACTCT FAD31C3F TTCTTGGAGAGTATTACCGTGAGC FAD31C3R CAATATTTATTAATTACCACCTTAC FAD31C4F CTAGGTTATTACGCACCACCCA FAD31C4R GGAGGAGCACTGGGATCAAAAGCT FAD31C5F CACACTAAGCCAAAGCCAAAGCAGCAAT FAD31C5R AGCACTGGGATCAAAAGCTTCCTT FAD31C6F AATAATGGATACCAAAAGGAAGC FAD3 1C6R GTTGAAGTGACTTGCAGCAGCCAT FAD31C7F ATGGATACCAAAAGGAAGCTTTTG FAD31 C7R GATAGATAAGCATAGAAAACATGGTAA FAD31 C8F ACTGTGTTGGGTTACCATGTTTTCTA FAD3 1 C8R CAATAAATAACCCAAAAATTGAAA FAD31C9F GCAATATCAACACTGTGTTGGGT FAD31 C9R CTAGAATCCAATAAATAACCCAAAAAT FAD31 C10F GAGTTTCAATTTTTGGGTTATTTA FAD31 C1 OR CCATTGAGGCCCACTATGAATTCC FAD31 C11 F GAGTTTCAATTTTTGGGTT FAD31 C11 R TCCATTGAGGCCCACTATGAATTCCT FAD31C12F GACAGGAATTCATAGTGGGCCTCAA FAD31 C12R CTGACAATTCAATATTTATTAATTACC FAD31C13F ATACTTCAGATAAAGCTGTTCTTGAA FAD31C13R TTGTGATACTAGTTAAGACCCATAAAA FAD31C14F GATAAAGCTGTTCTTGAACATTT FAD31 C14R TTTTTGTGATACTAGTTAAGACCCATA FAD31C15F TTTGTCATTATCTTAGTTAACC FAD31 C15R AAAAAGAGGAAAAAGTAATGTAAGAGT FAD31 C16F CATTAATTATGTAATTGTTTGAACACG FAD31 C16R1 AAACCACATCTCCAGTGTCACTTA FAD31C16R2 TCACTTACGAAGTGGTCTTGTCTC FAD31C17F TTTGAATATTTCAATTCTCCAATTA FAD31 C17R GTTATTGATCCAACCATAGTCACG FAD31C18F CATTAATTATGTAATTGTTTGAACACG FAD31C18R GAGGTGATAATGAGGAATTTGAGG FAD31C19F TATTTGTTATGTGGCTGGACTTTG FAD31 C19R AAACCACATCTCCAGTGTCACTTA FAD31C20F ACTTTGTCACATACTTGCATCACC FAD31C20R TCACTTACGAAGTGGTCTTGTCTC EJEMPLO 2 Identificación de polimorfismos en Fad3-1a El alcance de la secuencia de este locus fue bueno. El cuadro 2 muestra el polimorfismo identificado en este locus. Se detectaron diez SNPs y tres indels. Sin embargo, no se encontró ningún SNP u otro marcador haplotipo asociado con el fenotipo de bajo contenido de ácido linolénico. En general, se encontró que la variación de secuencia en este locus era significativamente mayor que aquella en Fad3-1b y Fad3-1c, indicando que no estuvo bajo una presión de selección para este rasgo.
CUADRO 2 Polimorfismos en el locus Fad3-1a Lineas 552 841 1495 2034- 2406 2459 2482-2484 2493 2963 3400 3405 3450 3557 2042 Secuencia G c T - G C ATT - T A A A T original 6P248 G C(2) T(3) - A c ATT - T A A A T T27111 G T c + G c ATT T T G G T27190 G c T - G C ATT - T A T T26767 G T c + G T ATT T T A A G G T26830 c - - A A A A5 T(2) T T + A C ATT - G A A G T C1640 G T c - G T ATT T T A/T fi T G G Soyola T T c + A C ATT - G T T G T N98-4445 G T T + A C ATT - G T T A/G T A2247 G c T(2) - G ATT - T A/T T/A A T AG1701 G T c + G c ATT T T T T G AG1902 T T c + A c ATT - T A/T T/A G T AG2402 G T c + G T - - T T/A T/A A T AG2703 G T T - G c ATT - G T/A T/A A T AG3201 T T c + A c ATT - G T T G T AG3302 G T c + G T ATT T G T/A T/A G G AG3702 T T c + A c ATT - G A G T AJB2102J0C : G c T(3) - G c ATT - T T T A T AJB2302K0C G c T(3) - G c ATT - T A/T T/A A T CSR2533 G T c + G T ATT T T T/A T/A G G CSR2622N G T c + G T ATT T T CSR3922N G c T(3) - G c ATT - T T/A T/A A T DKB19-51 G T c + G T ATT - T DKB23-95 T T c + A c ATT - G T T A/G WP25920 G T T(2) + G c ATT - T A T Nota: el número en paréntesis indica el número de secuencias leídas en una línea dada EJEMPLO 3 Identificación del polimorfismo en Fad3-1b Las secuencias del intrón de Fad3-1b fueron bastante diferentes en comparación con Fad3-1a, lo cual permitió la generación eficiente de amplicones específicos del locus. La calidad de las secuencias a partir de la mayoría de las líneas fue generalmente elevada excepto para una pequeña porción de la región hacia 5'UTR. Se detectó un polimorfismo de un nucleótido particular en la posición 2021 entre todas las líneas en una longitud de secuencia total de 2683 pb (cuadro 3). De manera interesante, se encontró que el SNP se asocia con un fenotipo de bajo contenido de ácido linolénico. Se encontró que las líneas con bajo contenido de ácido linolénico 6P248, T27111 , T27190, T26767 y T26830 portan un alelo "C" en esta posición mientras que otras líneas portan una "T". Las cinco líneas con un alelo "C" se evaluaron para el contenido de ácido linolénico y se encontró que todas tenían menos del 4% de ácido linolénico. Otras líneas con bajo contenido de ácido linolénico tales como A5, Soyola, y N98-4445 portan un alelo de tipo silvestre en este locus, indicando que uno o más de los loci contribuyen al fenotipo de bajo contenido de ácido linolénico en estas líneas.
Para determinar si la SNP en la posición 2021 era una mutación sentido, el ORF se tradujo hacia la proteína. Esto mostró que la mutación en la línea con bajo contenido de ácido linolénico cambió un residuo de aminoácidos de Histidina por Tirosina. Se ha encontrado que el residuo de histidina es crítico en numerosos genes implicados con la desaturación. Se ha encontrado que el SNP ocasiona una mutación en el motivo His-Val-lle-His-His to His-Val-lle-His-Tyr en las líneas con bajo contenido de ácido linolénico. El motivo se ha asociado con un fenotipo con bajo contenido de ácido linolénico y probablemente ocasiona la reducción del ácido linolénico.
CUADRO 3 Polimorfismo en el locus Fad3-1b leas 1 Dosi 2021 Secuencia original C 6P248 T(4) T2711 1 T(2) T27190 T(3) T26767 T(2) T26830 T(2) A5 C(3) C1640 C(3) Soyola C(4) N98-4445 C(2) A2247 C(3) AG1701 C(2) AG1902 C(2) AG2402 C(2) AG2703 C(2) AG3201 C(2) AG3302 C(2) AG3702 C(2) AJB2102J0C C(2) AJB2302K0C C(2) CSR2533 C(2) CSR2622N C(2) CSR3922N C(2) DKB19-51 C(2) DKB23-95 C(3) WP25920 C(2) Nota: el número en el paréntesis indica el número de lecturas de n una línea dada EJEMPLO 4 Identificación del polimorfismo en Fad3-1c Ningún ADN genómico estuvo inicialmente disponible para Fad3-1c. Sin embargo, el ADNc se encontraba altamente conservado entre Fad3-1a y Fad3-1c a través de todo el gen con una identidad de la secuencia mayor de 90%. Para amplificar los intrones utilizando iniciadores a partir de los exones, se seleccionaron manualmente numerosos iniciadores para selección de las regiones específicas de Fad3-1c. Una vez que se conocieron las secuencias novedosas, se diseñaron nuevos iniciadores a partir de los intrones. Utilizando este método, se obtuvieron secuencias parciales de manera exitosa que abarcan todos los intrones. El análisis de la secuencia indicó que el alelo Fad3-1c fue muy similar al locus Fad3-1a incluso en los intrones. Una similitud muy elevada de la secuencia se observó cerca de las uniones del exón/intrón entre los dos loci, pero disminuyó conforme las secuencias se extendía adicionalmente. A partir de las secuencias obtenidas, se identificaron cuatro SNPs y un indel en Fad3-1c (cuadro 4). Las SNPs en las posiciones 687, 2316, 3743, así como el indel en 1129, parecieron estar asociadas en equilibrio y se asociar con el el fenotipo de bajo contenido de ácido linolénico. Las líneas con bajo contenido de ácido linolénico, Soyola y N98-4445 ambas portan un alelo diferente en las posiciones 687 y 1129 a partir de todas las demás líneas. Aunque no se obtuvieron las secuencias a partir de todas las líneas en las posiciones 3360 y 3743, se indicó que estos loci se encuentran en equilibrio de asociación con 687 y 1129. A los cuatro SNPs/Indel positivos se localizaron en los intrones. Fue interesante observar que las líneas con bajo contenido de ácido linolénico Soyola y N98-4445 se derivaron a partir de germplasmo que pertenece a un grupo de madurez 4 a 5, mientras que las otras líneas pertenecen a un grupo de madurez 1 a 4. El mecanismo para que estas mutaciones ocasionen el fenotipo con bajo nivel de ácido linolénico no está claro. Una explicación fue que existe otra mutación localizada por fuera de la región codificante, probablemente en la región promotora, que ocasiona el fenotipo y se encuentra en equilibrio de asociación con los marcadores detectados dentro del intrón 2. Por lo tanto, se lleva a cabo un análisis de la secuencia promotora como se describe a continuación. Fue importante observar a partir del cuadro 4 que las líneas mutantes 6P248, T27111 , T27190, T26767, T26830 y A5 no pudieron amplificar casi todos los iniciadores específicos del locus Fad3-1c. Esto indica que existió una gran deleción en el locus Fad3-1c en estas líneas. La longitud de la deleción varió ligeramente en diferentes líneas mutantes. Este resultado fue consistente con un estudio anterior que muestra que A5 portan de hecho una deleción en Fad3-1c. Puesto que se deletó una porción grande de todo el gen, la enzima que cataliza la conversión del ácido linoléico hacia el ácido linolénico se podría pronosticar pero no funciona de manera adecuada. Como un resultado, las plantas que portan este mutante podrían producir menos ácido linolénico.
CUADRO 4 Polimorfismos en el locus Fad3-1c Posición de la secuencia Líneas 687 1129 1203 2316 3292 3360 3743 6P248 NA NA NA N/A T271 1 1 NA NA NA N/A T27190 NA NA NA N/A T26767 NA NA NA N/A T26830 NA NA NA N/A A5 NA NA NA T C1640 T(2) * A Soyola C(4) T(2) A T C(3) A A N98-4445 C(2) T A A2247 T * A G T(3) * * AG1701 T * A G T(2) * AG1902 T * A T(2) * AG2402 T * A G T(2) * AG2703 T * A AG3201 T * G AG3302 T * A AG3702 T * A AJB2102J0C T * A AJB2302K0C T * A CSR2533 T * A CSR2622N T + G CSR3922N T * A DKB19-51 T * A DKB23-95 T * A WP25920 T * A Nota:1. NA significa sin detección de amplificación 2. El número en el paréntesis indica el número de lecturas de la secuencia en una línea dada EJEMPLO 5 Aislamiento de la región promotora de Fad3-1c Para determinar los factores que contribuyen al bajo contenido de ácido linolénico en Soyola y N98-4445, se realizaron esfuerzos para clonar la región hacia el extremo 5' del gen Fad3-1c. Se diseñaron tres iniciadores que miran hacia la región hacia el extremo 5' y los iniciadores se utilizaron para amplificar secuencias desconocidas del promotor de conformidad con el equipo Genome Walking, obtenido a partir de CloneTech. Se obtuvo un fragmento de aproximadamente 1 kb a partir de la línea A3244. El producto de PCR se secuenció directamente después de ser tratado con exonucleasa y fosfatasa alcalina de camarón. Para identificar los polimorfismos asociados con el bajo contenido de ácido linolénico, se diseñaron tres nuevos pares de iniciadores para cubrir todo el promotor y el extremo hacia 5' de la región codificante, los cuales se utilizaron para amplificar 24 líneas diferentes. Las secuencias a partir de estos amplicones se alinearon para identificar SNPs. Se encontraron siete SNP en la región promotora (cuadro 5). Soyola portaba un alelo diferente en las siete posiciones a partir de las otras líneas de tipo silvestre. Estos SNPs pudieron ser el factor determinante para los fenotipos con bajo contenido de ácido linolénico. Para confirmar la asociación, estos SNPs serán evaluados en una población segregante para el contenido de ácido linolénico.
CUADRO 5 Polimorfismos en la región del promotor Fad3-1c Posición 334 364 385 387 393 729 747 Soyola G C T A C G C N98-4445 G C T A C G C tipos silvestres (16 líneas) A G G T T T T EJEMPLO 6 Validación del ensayo con marcador para bajo contenido de ácido linolénico Los ensayos de punto terminal Taqman se diseñaron a partir de cuatro SNPs anteriormente identificados (cuadro 6). Los ensayos se nombraron según las posiciones SNP en las secuencias consenso en un locus dado. Por ejemplo, FD3A842 significa SNP a partir de Fad3-1a, en la posición 842 en la secuencia consenso. Posteriormente se asignó un nuevo nombre al marcador NS0193117 a FD3A842 y se utilizó en la producción. Los ensayos se validaron en el mismo panel utilizado en la re-secuenciación. La figura 1A muestra el alelograma de NS0193117. Los patrones alélicos a partir del ensayo Taqman fueron consistentes con las secuencias.
Dos ensayos, FD3B2021A y FD3B2021 B (NS0193115), se diseñaron a partir de Fad3-1b. La figura 1 B muestra el alelograma de NS0193115 sobre el panel para secuenciación. Las cuatro líneas con bajo contenido de ácido linolénico tuvieron un diferente alelo a partir del tipo silvestre, que corresponde bien con las secuencias. La figura 1 C muestra el alelograma de NS0193116, derivado a partir de Fad3-1c en la posición 687. Las líneas Soyola y N98-4445 mostraron un alelo diferente en comparación con los otros. Todos los resultados del ensayo corresponden a los datos de secuencia. Los marcadores SNP se evaluaron adicionalmente en ocho poblaciones segregantes para el contenido de ácido linolénico (cuadro 7). Seis SNPs que se sabía que estaban asociados al locus fanfan también fueron genotipificados sobre las mismas poblaciones. Puesto que las poblaciones fueron F4, éstas se trataron como poblaciones R1 cuando se utilizan en el programa de mapeo por marcador. Los alelos heterocigotos fueron enmascarados. NS0131053 es un marcador localizado en el grupo de asociación B2/U26, en donde reside el locus fanfan. El cuadro 7 muestra que NS0193116 (Fad3-1c) se asocia a NS0131053 en aproximadamente 10 cM de distancia. Por lo tanto, fad3c corresponde a fanfan, como los inventores esperaban. Puesto que se encontró que NS0131053 se asocia a NS0193116 (fad3c), NS0131053 también pudo servir como un marcador de referencia para la selección de la línea con bajo contenido de ácido linolénico. La selección se podría realizar basándose tanto en el alelo nulo en NS0193116 como en el alelo para bajo contenido de ácido linolénico en NS0131053. Los datos a partir de estas poblaciones indican que los alelos Fad3-1a, -1b y -1c se heredaban todos de manera independiente. Se encontró que una combinación de los marcadores NS0193115 y NS0193116 provee un diagnóstico preciso para el contenido de ácido linolénico. A partir de los resultados de la secuencia, fue evidente que ambos Fad3-1b y -1c desempeñan un papel en el control del nivel de ácido linolénico en el frijol de soya. Las líneas mutantes con la mutación Fad3-1b (NS0193115) sola contenían de aproximadamente 4.2% de ácido linolénico mientras que la deleción Fad3-1c (NS0193116) sola contiene aproximadamente 3.4% (cuadro 8). Por lo tanto, mediante la combinación de la selección para plantas que comprende marcadores para un doble mutante en los loci Fad3-1b y Fad3-1c, se podrían obtener incluso menores niveles de ácido linolénico. La figura 2 muestra los valores fenotípicos de Fad3-1b y Fad3-1c. Esto muestra claramente que los dobles mutantes "TT**" tienen el contenido de ácido linolénico más bajo mientras que los tipos silvestre dobles tienen el contenido más elevado.
CUADRO 6 Iniciadores y sondas para análisis Taqman (SEQ ID NOs: 83-97. respectivamente) Locus iniciadores y sondas secuencias FAD3-A FD3A842-842F AGAAATCGCATCTGGAATGTGAAAGT FAD3-A FD3A842-842R TGGGTTTCCTAGCACGCTATAAAAAT FAD3-A FD3A842-842V2 CAACGACAGATGAAG FAD3-A FD3A842-842M2 CAACGACAAATGAAG FAD3-B FD3B2021A-2021 F AGAAACTTACTCCATGTTACTCTGTCTATATGT FAD3-B FD3B2021A-2021 R TTGTGAAATAGAGAATTAATACCGCTTCGA FAD3-B FD3B2021A-2021V2 AAAGGTGATGGATAACAT FAD3-B FD3B2021A-2021M2 AAAAGGTAATGGATAACAT FAD3-B FD3B2021 B-2021 F GGTGGTCTTACAACAGTAGATCGC FAD3-B FD3B2021 B-2021 R CCGCTTCGATTAAATGATAATGTGGAAT FAD3-B FD3B2021 B-2021V2 AAAGGTGATGGATAACAT FAD3-B FD3B2021 B-2021 M2 AAAAGGTAATGGATAACAT FAD3-C FD3C690A-690F CCGGCTTTTTTGTTTGTCATTGGAA FAD3-C FD3C690A-690R TCAAGATGTATTTCATTATTTTCTGAAACGCG FAD3-C FD3C690A-690V2 CTATAAAAATTGAATCAATAGAAGAA FAD3-C FD3C690A-690M2 AAAAATTGAATCAATAAAAGAA CUADRO 7 Asociación genética entre NS0193116 y NS0131053 mapa para evaluar: Pop. 1 (1-96) Marcadores Distancia 1 N0131053 3.3 cM 5 N0193116 7.6 cM 2 N0129792 0.0 cM 3 N0096899 11.0 cM 4 marcadores probabilidad log= -47.79 Pop 2 (97-192) Marcadores Distancia 90 indiv 1 N0131053 0.0 cM 3 N0193116 0.0 cM 2 marcadores probabilidad log= -20.80 Pop. 4 (289384) Marcadores Distancia 66 indiv 1 N0131053 4.4 cM 3 N0193116 4.4 cM 2 marcadores probabilidad log= -21.10 Pop. 6 (481576) Marcadores Distancia 94 indiv 1 N0131053 6.7 cM 3 N0193116 6.7 cM 2 marcadores probabilidad log= -35.24 Pop. 7 (577- Marcadores Distancia 672) 94 ¡ndiv 1 N0131053 22.6 cM 3 N0193116 22.6 cM 2 marcadores probabilidad log= - 53.16 Pop. 8 (673- Marcadores Distancia 768) 67 indiv 1 N0131053 3.2 cM 2 N0099767 10.0 cM 4 N0193116 13.2 cM 3 marcadores probabilidad log= - 36.80 CUADRO 8 Porcentaje del contenido de ácido linolénico en diferentes genotipos Referencias Las siguientes referencias, en el grado en que provean un procedimiento ejemplar u otros detalles suplementarios a aquellos establecidos en la presente invención, se incorporan específicamente en la presente invención como referencias. Patente de E.U.A. 4,992,375 Patente de E.U.A. 5,015,580 Patente de E.U.A. 5,024,944 Patente de E.U.A. 5,416,011 Patente de E.U.A. 5,545,545 Patente de E.U.A. 5,637,785 Patente de E.U.A. 6,031 ,154 Patente de E.U.A. 6,140,085 Patente de E.U.A. 6,184,440 Patente de E.U.A. 6,184,442 Patente de E.U.A. 6,369,302 Patente de E.U.A. 6,486,383 Patente de E.U.A. 6,774,284 Allard, En: Principies of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, 0-98, 1960. Beachy et al., Ann. rev. Phytopathol. 28: 451 (1990 Boerma y Moradshahi, Crop Sci., 15: 858-861 , 1975. Borthwick y Parker, Bot. Gaz., 100: 374-387, 1938. Brim y Stuber, Crop Sci., 13: 528-530, 1973. Byrum, et al., Theor. Appl. Genet., 94: 356-359, 1997. Charest et al., Plant Cell Rep. 8: 643 (1990 Christianson et al., Science, 222: 632-634, 1983. Comai et al., Nature 317: 741-744 (1985) Criswell y Hume, Crop Sci., 12: 657-660, 1972. Dhir et al., Plant Cell Rep., 10 (2): 97-101 , 1991. Dutton y Sommer, Biotechniques, 11 (6): 700-7002, 1991. Dutton et al., J. Am. Oil Chem. Soc, 28: 115-1 18, 1951. Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13: 67 (1987) Elliot et al., Plant Molec. Biol. 21 : 515 (1993 Solicitud Europea 0 242 246 Fehr er al., Crop Sci., 32: 903-906, 1992. Fehr, En: Theory and Technique, and Crop Species Soybean, lowa State Univ., Macmillian Pub. Co., NY, (1 ) (2): 360-376, 1987b.
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Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una planta de una variedad de frijol de soya agronómicamente selecta que tiene un rendimiento comercialmente significativo y un contenido medio/bajo de ácido linolénico. 2.- La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el contenido de ácido linolénico se define adicionalmente como se selecciona a partir del grupo que consiste de aproximadamente 1.2% a aproximadamente 3.0% en peso de los ácidos grasos totales de la semilla, de aproximadamente 1.5% a aproximadamente 3.0% en peso de los ácidos grasos totales de la semilla, de aproximadamente 2% a aproximadamente 2.6% en peso de los ácidos grasos totales de la semilla, de aproximadamente 2% a aproximadamente 3% en peso de los ácidos grasos totales de la semilla, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 2.6% en peso de los ácidos grasos totales de la semilla, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 2.2% en peso de los ácidos grasos totales de la semilla, de aproximadamente 1.6% a aproximadamente 2.6% en peso de los ácidos grasos totales de la semilla, y de aproximadamente 2% a aproximadamente 2.4% en peso de los ácidos grasos totales de la semilla. 3.- Una parte de la planta de conformidad con la reivindicación 1. 4.- La parte vegetal de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque se define adicionalmente como polen, un óvulo, un meristemo o una célula. 5.- Una semilla de la planta de conformidad con la reivindicación 1 . 6.- Un cultivo de tejido de células regenerables de la planta de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el cultivo de tejidos regenera plantas de frijol de soya que expresan las características fisiológicas y morfológicas de la planta de conformidad con la reivindicación 1. 7.- El cultivo de tejidos de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque las células regenerables son embriones, células meristemáticas, polen, hojas, raíces, puntas de raíces o flores. 8.- Una planta de frijol de soya regenerada a partir del cultivo de tejidos de conformidad con la reivindicación 6, en donde la planta de frijol de soya regenerada expresa las características fisiológicas y morfológicas de la planta de conformidad con la reivindicación 1. 9.- La planta de frijol de soya de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se define como que comprende un transgén. 10.- La planta de frijol de soya de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el transgén se define adicionalmente como que confiere un rasgo seleccionado a partir del grupo que consiste de tolerancia al herbicida; resistencia a la enfermedad; resistencia al insecto o a la plaga; metabolismo alterado de ácidos grasos, proteínas o carbohidratos; rendimiento incrementado del grano; madurez alterada de la planta, y características morfológicas alteradas. 11.- La planta de frijol de soya de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el transgén confiere tolerancia al herbicida glifosato. 12.- La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se define como preparada mediante un método que comprende los pasos de: a) cruzar una Sintéticoa y una segunda plantas de frijol de soya, en donde la Sintéticoa y segunda plantas colectivamente comprenden un alelo Fad3-1b y un alelo Fad3-1c cada uno de los cuales confiere contenido disminuido de ácido linolénico, en donde la Sintéticoa planta comprende al menos uno de los alelos Fad3-1b o Fad3-1c, y en donde la segunda planta comprende un rendimiento comercialmente significativo; b) ensayar la progenie de plantas de frijol de soya que resultan a partir de la cruza para rendimiento y para la presencia de polimorfismos localizados en una región genómica de la planta de frijol de soya en 50 cM de dichos alelos Fad3-1b y Fad3-1c; y c) seleccionar al menos una Sintéticoa planta de la progenie que comprende dichos polimorfismos y un rendimiento comercialmente significativo para obtener la planta de conformidad con la reivindicación 1. 13.- Un método para producir semilla de frijol de soya, que comprende cruzar la planta de conformidad con la reivindicación 1 consigo misma o con una segunda planta de frijol de soya. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque se define adicionalmente como un método para preparar semilla de frijol de soya híbrida, que comprende cruzar la planta de conformidad con la reivindicación 1 hacia una segunda planta, distinta, de frijol de soya. 15.- Un método para producir alimento o forraje que comprende: (a) obtener la planta de conformidad con la reivindicación 1 ; (b) cultivar dicha planta hasta madurez; y (c) preparar alimento o forraje a partir de dicha planta. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el alimento es un concentrado de proteína, aislado de proteína, hollejos de frijol de soya, grano molido o harina. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el alimento es un concentrado de proteina, aislado de proteína, hollejos de frijol de soya, grano molido o harina. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el alimento es aceite. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el alimento comprende bebidas, alimentos infusionados, salsas, condimentos, aderezos para ensalada, jugos de frutas, jarabes, postres, capas de azúcar y rellenos, productos congelados suaves, alimentos para confitería o intermediarios de alimentos. 19.- Un método para la obtención de germoplasma del frijol de soya, que comprende los pasos de: a) identificar al menos un Sintético polimorfismo en una región genómica de la planta de frijol de soya en 50 cM de un alelo Fad3-1b o Fad3-1c que confiere contenido disminuido de ácido linolénico; b) ensayar las plantas de frijol de soya para la presencia del polimorfismo; y c) seleccionar al menos una planta de frijol de soya que comprende el polimorfismo. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque comprende identificar polimorfismos en una región genómica de la planta de frijol de soya en 50 cM de ambos de dichos alelos Fad3-1b y Fad3-1c y ensayar para la presencia de dichos polimorfismos. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el Sintético polimorfismo comprende un polimorfismo de un nucleótido particular en una posición en la secuencia del gen Fad3-1b que corresponde al nucleótido 2021 de SEQ ID NO: 1. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el Sintético polimorfismo comprende un polimorfismo de un nucleótido particular en una posición en la secuencia del gen Fad3-1c que corresponde al nucleótido 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 o 3743 de SEQ ID NO: 2. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el Sintético polimorfismo comprende una deleción en la secuencia del gen Fad3-1c. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el Sintético polimorfismo comprende un polimorfismo de un nucleótido particular en una posición en el promotor Fad3-1c que corresponde al nucleótido 334, 364, 385, 387, 393, 729 o 747 de SEQ ID NO: 3. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque se ensayan a las plantas de frijol de soya para la presencia del Sintético polimorfismo que comprende PCR, análisis de polimorfismo conformacional de cadena sencilla, electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, análisis de polimorfismo por escisión de longitud de fragmento y/o secuenciación de ADN. 26.- Un método para la cruza de plantas que comprende los pasos de: a) ensayar las plantas de frijol de soya para la presencia de al menos un Sintético polimorfismo en una región genómica de la planta de frijol de soya en 50 cM de un alelo Fad3-1b o Fad3-1c que confiere contenido disminuido de ácido linolénico; b) seleccionar al menos una planta de frijol de soya que comprende el polimorfismo; y c) cruzar la Sintéticoa planta de frijol de soya con una segunda planta de frijol de soya para producir las plantas de la progenie que comprenden el polimorfismo. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque comprende el paso de: d) seleccionar una planta de la progenie que comprende el polimorfismo y cruzar la planta de la progenie con una tercera planta de frijol de soya para producir plantas de la progenie adicionales. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la segunda y tercera plantas son de la misma variedad. 29.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque comprende repetir el paso d) aproximadamente 2-10 veces. 30.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque comprende ensayar las plantas de frijol de soya para la presencia de polimorfismos en regiones genómica de la planta de frijol de soya en 50 cM de dichos alelos Fad3-1b y Fad3-1c. 31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque comprende seleccionar dicha Sintéticoa planta de frijol de soya basándose en la presencia de los polimorfismos. 32.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el Sintético polimorfismo comprende un polimorfismo de un nucleótido particular en una posición en la secuencia del gen Fad3-1b que corresponde al nucleótido 2021 de SEQ ID NO: 1. 33.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el Sintético polimorfismo comprende un polimorfismo de nucleótido particular en una posición en la secuencia del gen Fad3-1c que corresponde al nucleótido 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 o 3743 de SEQ ID NO: 2. 34.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el Sintético polimorfismo comprende una deleción en la secuencia del gen Fad3-1c. 35.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el Sintético polimorfismo comprende un polimorfismo de nucleótido particular en una posición en el promotor Fad3-1c que corresponde a un nucleótido 334, 364, 385, 387, 393, 729 o 747 de SEQ ID NO: 3. 36.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque selecciona al menos una planta de frijol de soya que comprende el polimorfismo que comprende PCR, análisis de polimorfismo conformacional de cadena sencilla, electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, análisis de polimorfismo por escisión de longitud de fragmento y/o secuenciación de ADN. 37.- Una sonda o iniciador que híbrida bajo condiciones severas a una región genómica de la planta de frijol de soya en 50 cM de un alelo Fad3-1b o Fad3-1c, en donde la sonda o iniciador comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir de SEQ ID NO: 4 hasta SEQ ID NO: 98.
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