BR112019018200B1

BR112019018200B1 - Método para medir a quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo,método para medir estaquiose, método para processar sementes de soja geneticamente modificadas

Info

Publication number: BR112019018200B1
Application number: BR112019018200-4A
Authority: BR
Inventors: Ross M. Allen; John D. Everard; Min Ren
Original assignee: Pioneer Hi-Bred International, Inc
Priority date: 2017-03-03
Filing date: 2018-02-26
Publication date: 2024-02-20
Also published as: US11307139B2; AR111114A1; US20240060886A1; US20190383733A1; BR112019018200A2; US20220221399A1; EP3589935A1; CA3054926A1; WO2018160485A1; US11668651B2

Abstract

são divulgados métodos e sistemas para visualização espectral de amostras de soja para medir exatamente e não destrutivamente a quantidade de sucrosil-oligossacarídeo nas amostras de soja. as populações contendo sementes de soja modificadas e não modificadas e tendo quantidades variáveis de sucrosil-oligossacarídeos, óleo ou proteína podem ser divididas e separadas e adicionalmente usadas no processamento ou melhoramento da soja.

Description

ANTECEDENTES

[0001] Os feijões de soja são o maior fornecedor mundial de proteína e óleo vegetais. O óleo de soja é usado em produtos alimentares e industriais. Os flocos de soja que permanecem após a remoção de óleo podem ser processados em vários produtos de proteína de soja comestíveis ou usados para produzir farelo de soja para rações animais.

[0002] As reservas de sementes de soja podem ser redivididas através de técnicas de investigação e melhoramento vegetais. As técnicas analíticas facilitam a investigação ao permitirem a avaliação da composição da semente de soja, flocos de soja e farelo de soja.

SUMÁRIO

[0003] São proporcionados métodos não destrutivos para medir exatamente a quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo, tal como estaquiose, ou uma combinação de estaquiose e rafinose, em uma semente de soja que incluem passos de direcionar luz no infravermelho próximo de uma fonte de luz para uma semente de soja para formar luz modificada a partir da semente de soja, receber a luz modificada em um dispositivo de imagens e medir a quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo na semente de soja com base na luz modificada recebida. A quantidade do sucrosil- oligossacarídeo pode ser medida até uma exatidão que está dentro de 0,2% em peso, 0,3% em peso, 0,4% em peso, 0,5% em peso, 0,6% em peso, 0,7% em peso, 0,8% em peso, 0,9% em peso, 1% em peso, 1,1% em peso, 1,2% em peso, 1,3% em peso, 1,4% em peso ou 1,5% em peso da quantidade medida usando um método analítico de referência padrão. Após medições, a semente pode ser opcionalmente transportada para uma primeira ou segunda localização dependendo de se a quantidade de sucrosil- oligossacarídeo medida está acima ou abaixo de um valor limiar. O valor limiar para estaquiose pode ser selecionado para ser, por exemplo, 1% em peso, 0,9% em peso, 0,8% em peso, 0,7% em peso, 0,6% em peso, 0,5% em peso, 0,4% em peso, 0,3% em peso, 0,2% em peso ou 0,1% em peso.

[0004] Os métodos podem ser usados com uma semente única ou uma pluralidade de sementes em um lote ou os passos dos métodos podem ser repetidos múltiplas vezes. O sucrosil- oligossacarídeo pode ser exatamente medido em pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das medições realizadas. Os métodos são não destrutivos e preservam a viabilidade da semente ou de outro modo permitem que outras análises composicionais ou processamento sejam realizados. Para medições de estaquiose, o dispositivo de imagens pode ser calibrado usando uma pluralidade de sementes de soja tendo teores de estaquiose variáveis residindo em uma gama que inclui valores de menos do que 0,1% em peso, 0,2% em peso ou 0,3% em peso de estaquiose e mais do que 4,5% em peso, 5% em peso ou 5,5% em peso de estaquiose. Em algumas modalidades, a semente é geneticamente modificada para sobre-expressar uma diglicerídeo aciltransferase.

[0005] São proporcionados métodos para medir a estaquiose em uma população de sementes de soja por direcionamento de luz no infravermelho próximo de uma fonte de luz em uma primeira e segunda subamostra de uma população de sementes de soja para formar uma primeira e segunda luz modificada, que é recebida em um dispositivo de imagens e usada para medir a quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo nas primeira e segunda subamostras. As primeira e segunda subamostras são separadas quando a quantidade de estaquiose medida difere em pelo menos 1 ponto percentual entre as subamostras e são combinadas quando a quantidade de estaquiose difere em menos do que 0,2 pontos percentuais entre as primeira e segunda subamostras. A população pode, por exemplo, incluir sementes de soja geneticamente modificadas e não modificadas, tais como uma diacilglicerol transferase modificada. e o conteúdo de óleo dos feijões modificados pode ser pelo menos 1 ponto percentual mais elevado do que das sementes de soja não modificadas.

[0006] São proporcionados métodos para processar sementes de soja que foram geneticamente modificadas para conter elevado teor de óleo, elevado teor de proteína, ou uma sua combinação, em comparação com sementes de soja não modificadas que incluem os passos de direcionar luz no infravermelho próximo de uma fonte de luz para uma amostra compreendendo ou sendo uma semente de soja para formar luz modificada a partir da semente de soja que é recebida em um dispositivo de imagens e usada para medir a quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo, tal como estaquiose ou uma combinação de estaquiose e rafinose, na amostra. Os passos do método podem ser repetidos para pelo menos 10 amostras e as sementes de soja acima de um valor limiar, que indica elevado teor de óleo, elevado teor de proteína, ou uma sua combinação, podem ser separadas de sementes de soja abaixo do valor limiar. O método é suficientemente robusto tal que pelo menos 90% das sementes de soja abaixo do valor limiar sejam sementes de soja modificadas ou pelo menos 90% das sementes acima do valor limiar sejam sementes de soja não modificadas. A quantidade de sucrosil-oligossacarídeo pode ser medida até uma exatidão que está dentro de 0,2% em peso, 0,3% em peso, 0,4% em peso, 0,5% em peso, 0,6% em peso, 0,7% em peso, 0,8% em peso, 0,9% em peso, 1% em peso, 1,1% em peso, 1,2% em peso, 1,3% em peso, 1,4% em peso ou 1,5% em peso da quantidade medida usando um método analítico de referência padrão. Em algumas modalidades, pelo menos uma das sementes modificadas que é separada é cultivada e cruzada com a mesma planta de soja ou uma planta de soja diferente para produzir semente de descendência. A semente de descendência pode ser cultivada e cruzada com outra planta tendo uma modificação genética, tal como um construto recombinante incorporado em seu genoma, para produzir semente de descendência adicional, a modificação genética proporcionando opcionalmente um ou mais traços tais como tolerância a herbicidas, resistência a doenças, resistência a insetos, rendimento de grãos aumentado, conteúdo nutricional aumentado, taxa de crescimento aumentada, tolerância ao estresse intensificada, maturidade alterada. O método pode incluir um passo inicial de separar a amostra compreendendo a semente de soja da pluralidade de sementes tal como em um método automatizado. O método pode incluir o passo de medir a quantidade de óleo na semente com base na luz modificada recebida.

[0007] São proporcionados métodos para processar sementes de soja que incluem sementes geneticamente modificadas para conterem teor de óleo aumentado e teor de proteína aumentado e sementes de soja não modificadas. Os métodos incluem os passos de direcionar luz no infravermelho próximo de uma fonte de luz para uma amostra compreendendo uma semente de soja para formar luz modificada a partir da semente de soja que é recebida em um dispositivo de imagens e usada para medir a quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo, tal como estaquiose ou uma combinação de estaquiose e rafinose, na semente de soja. Os passos dos métodos são repetidos para pelo menos 100 amostras ou sementes. A quantidade de sucrosil-oligossacarídeo medida abaixo de um valor limiar indica elevado teor de óleo e elevado teor de proteína na semente de soja e as medidas realizadas são tais que pelo menos 90% das sementes de soja abaixo do valor limiar são as sementes de soja modificadas ou pelo menos 90% das sementes acima do valor limiar são as sementes de soja não modificadas As sementes acima do valor limiar podem diferir em pelo menos 1% em peso de estaquiose das sementes abaixo do valor limiar. As sementes podem ser adicionalmente processadas para remoção de óleo e produção de flocos ou farelo de soja.

[0008] São proporcionados métodos para medir a quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo, tal como estaquiose, ou uma combinação de estaquiose e rafinose, em farelo de soja ou flocos de soja. Os métodos incluem os passos de direcionar luz no infravermelho próximo de uma fonte de luz para uma amostra de farelo de soja para formar luz modificada a partir da amostra de farelo de soja que é recebida em um dispositivo de imagens e usada para medir a quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo na amostra de farelo de soja. A quantidade do sucrosil- oligossacarídeo pode ser medida até uma exatidão que está dentro de 0,1% em peso, 0,2% em peso, 0,3% em peso, 0,4% em peso, 0,5% em peso, 0,6% em peso, 0,7% em peso, 0,8% em peso, 0,9% em peso, 1% em peso, 1,1% em peso, 1,2% em peso, 1,3% em peso, 1,4% em peso ou 1,5% em peso da quantidade medida usando um método analítico de referência padrão.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0009] São proporcionados sistemas e métodos para a amostragem de sementes de soja e medição de componentes de sementes de soja, que permitem análise de sementes individuais, análise de farelo, flocos ou pós de soja ou análise de sementes a granel de uma maneira precisa, não destrutiva e eficiente. O termo “soja” se refere à espécie Glycine max, Glycine soja ou qualquer espécie ou linha que seja compatível sexualmente de modo cruzado com Glycine max. A não ser que indicado o contrário, semente como usada aqui significa semente de soja. Após análise, as sementes de soja podem ser cultivadas e deixadas a autocruzarem ou serem cruzadas com plantas de soja geneticamente diferentes para produzir semente de descendência que pode ser usada em um programa de melhoramento de plantas. Os sistemas e métodos permitem adicionalmente processamento eficiente dos feijões de soja de acordo com sua composição, tal como para produzir óleo e flocos ou farelo de soja. A análise inclui medição precisa de um ou mais sucrosil-oligossacarídeos. Um sucrosil-oligossacarídeo é geralmente entendido como sendo um oligossacarídeo não digestível, de cadeia curta tal como estaquiose, rafinose e verbascose. Como a verbascose e outros sucrosil-oligossacarídeos menores estão presentes em quantidades muito baixas, como usado em este pedido, um sucrosil- oligossacarídeo significa uma ou mais de estaquiose e rafinose.

[0010] Métodos analíticos destrutivos para a medição de componentes de sementes tais como óleo, ácidos graxos, proteína e sucrosil-oligossacarídeos são aqueles que medem diretamente o componente incluindo passos tais como pulverização do material, extração do sucrosil-oligossacarídeo e detecção da quantidade ou concentração de sucrosil-oligossacarídeo usando métodos cromatográficos. Certos destes métodos são acreditados por associações profissionais (p.ex., American Oil Chemists Society (AOCS); a American Association of Analytical Chemists (AOAC); American Association of Cereal Chemists (AACC) ou agências de acreditação de padrões internacionais, p.ex., The Codex Alimentarius, International Organization for Standards (ISO) e a International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC)). Embora exatos, tais métodos são morosos e requerem tipicamente um grande tamanho de amostra; por exemplo, 60 g ou mais de feijões de sojas inteiros, uma porção das quais pode ser usada para determinar os teores de umidade das amostras, para permitir relatório composicional em uma base de umidade definida. Por exemplo, um método acreditado para conteúdo de óleo é o Método Oficial AOCS Ba 3-38 que mede gravimetricamente o conteúdo de óleo de material de semente em pó após extração com éter de petróleo. Um exemplo de um método acreditado para conteúdo de proteína é AOAC 990.03 ou AOCS Ba 4e-93 que determina o conteúdo de proteína de pós de soja triturados por análise de combustão.

[0011] Os métodos analíticos destrutivos para análise de rafinose e estaquiose podem ser baseados em métodos que foram validados para quantificação de açúcares simples em produtos de cereal (p.ex., Método AACC 80-04 Determinação de Açúcares Simples (frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose) em Produtos de Cereal-Método de HPLC; Método Oficial AOAC 982.14 Glucose, Frutose, Sacarose e Maltose em Cereais Pré-Adoçados; Black, L.T. e Glover, J.D., 1980. A Simple and rapid HPLC analysis of sugars in soybeans and the factors affecting their standardization. Journal of the American Oil Chemists Society 1980; 143. No entanto, um método validado de modo cruzado harmonizado não está disponível.

[0012] Os métodos, sistemas e dispositivos proporcionados aqui medem a quantidade de um ou mais sucrosil- oligossacarídeos em uma semente de soja usando métodos não destrutivos até uma exatidão que é representativa da quantidade medida usando métodos analíticos de referência padrão. O termo “exatidão” se refere ao grau ao qual o resultado de uma medição, cálculo ou especificação está de acordo com o valor correto, um padrão ou valor de referência. Exemplos úteis de tais valores que podem ser alcançados são precisões dentro de pelo menos 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%,15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% da quantidade medida usando um método analítico de referência padrão como descrito aqui, tal como em peso. As medições precisas podem ser alcançadas para pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, ou 99,9% de uma população de sementes, uma pluralidade de sementes, uma pluralidade de individuais ou uma pluralidade de amostras de sementes medidas. O tamanho da população ou pluralidade de sementes pode ser pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000, 10000, 100000, ou 1,000,000 sementes individuais ou lotes de sementes. O termo “química de referência” se refere aos valores de referência obtidos para as medições das composições analisadas aqui, usando métodos analíticos de referência padrão. Como usado aqui, o “método analítico de referência padrão” usado para medir estaquiose, rafinose ou uma sua combinação é uma técnica cromatográfica (química úmida) realizada como se segue. Um perito na técnica entenderá que certas substituições nos componentes e passos usados nos seguintes métodos podem ser feitas sem afetar os resultados da análise:

Trituração:

[0013] A análise é realizada em feijões de soja, triturados até pós finos com um tamanho de partículas variando entre 0,5 e 0,9 mm. Para semente de soja única, a trituração é realizada em frascos de policarbonato de ^ x 2” da Spex Certiprep com tampa (cat# 3116PC). Um aparelho de bolas de aço inoxidável 3/8” é usado para pulverizar a semente usando um 2000 Geno/Grinder da Spex Certiprep a 1500 batidas/min durante três estouros de 30 segundos, com um repouso de 1 min entre cada ciclo. As amostras são retidas no frasco de trituração à temperatura ambiente, no escuro, para minimizar perda de umidade antes de análise adicional.

[0014] Para amostras a granel, lotes de aproximadamente setenta e cinco gramas de feijões são triturados em um triturador Knifetec 1095 da Foss (comercialmente disponível a partir da FOSS North America, Eden Prairie, MN). A câmara de trituração é resfriada antes e durante o processo por um refrigerador circulante definido a 14 °C. As amostras são trituradas durante 6 x estouros de 10 segundos usando uma lâmina de rotor padrão. No final de cada estouro triturado de 10 segundos, a câmara é aberta e o pó na câmara é solto e qualquer material aderindo à parede da câmara é devolvido ao centro da câmara, usando uma pequena espátula de borracha. Após trituração, os pós são quantitativamente recuperados a partir da câmara e transferidos para copos de amostras de plástico equipados com tampas hermeticamente fechadas (Fisher Brand, número da parte 14828321) para assegurar perda de umidade mínima antes da análise. A câmara de amostras e lâmina são limpas cuidadosamente com uma escova macia e ar pneumático antes da introdução da próxima amostra. Os copos de amostras são armazenados à temperatura ambiente no escuro antes de análise adicional. As amostras trituradas não foram peneiradas ou de outro modo tratadas antes de análise adicional, isto garantiu que a subalíquota analisada fosse totalmente representativa da amostra a granel original e permite que pequenas subamostras sejam usadas para proporcionar dados que sejam representativos do todo.

Determinação do conteúdo de umidade do pó:

[0015] Os teores de umidade dos pós de soja triturados são determinados de acordo com o Método Oficial AOCS Ba 2a-38, que pode ser modificado para pequenas amostras como descrito em baixo. De modo a padronizar os resultados analíticos para o conteúdo de umidade, amostras de 100 - 200 mg são pesadas (registradas até uma exatidão de 0,1 mg) em tubos de amostras de 13 x 100 mm (VWR número da parte 53283-800). As amostras são colocadas em um forno de tiragem forçada, definido até 130 ° C, durante duas horas e depois deixadas a equilibrar até à temperatura ambiente, em um dessecador, antes da repesagem. Os teores de umidade são calculados de acordo com a seguinte fórmula:

[0016] Os teores de umidade são usados para ajustar os resultados analíticos até um teor de umidade comum usando a seguinte fórmula:

[0017] Onde F é a % em peso medida do analito na amostra triturada.

Extração de carboidratos solúveis:

[0018] Antes da análise de carboidratos, as amostras são desengorduradas como se segue: Pesar amostra em pó (aproximadamente 20 - 30 mg; até uma exatidão de 0,1 mg) em tubo de 13 X 100 mm (com tampa revestida com Teflon®; VWR (53283800)) e registrar peso. Adicionar 2 mL de Heptano, submeter a vórtex e colocar em um banho ultrassônico (VWR Modeo Científico 750D) a 60 °C durante 15 min à potência de sonicação total (~360 W). Centrifugar durante 5 min a 1700 x g à temperatura ambiente.Decantar o sobrenadante para um tubo de vidro de 13 X 100 mm limpo; esta amostra é usada para determinar os perfis de ácidos graxos do óleo extraído. Adicionar 1 mL de acetona ao pélete desengordurado, submeter a vórtex para dispersar o material na acetona e secar em um SpeedVac (Thermo Fisher Scientific 275 Aiken Road, Ashville, NC 28804). Ao pélete seco adicionar 2 mL de etanol a 80%. Submeter a vórtex para desagregar o pélete tanto quanto possível. Extrair em sonicador durante 15 min a 60 °C. Centrifugar durante 5 min a 1700 x g. Transferir sobrenadante para um tubo de 13 x 100 mm limpo. Repetir a extração com etanol duas vezes mais, combinando todos os sobrenadantes. Adicionar 100 μL de padrão interno de fenil-β-D glucopiranosídeo (0,5000 +/- 0,0010 g de estoque de fenil-β-D glucopiranosídeo em 100 mL de água) ao sobrenadante combinado. Secar o extrato no SpeedVac e analisar quanto a carboidratos solúveis como descrito em baixo. Adicionar 1 mL de acetona aos péletes extraídos e secas no SpeedVac.

Digestão e extração de amido:

[0019] A digestão de amido é realizada diretamente nos péletes secos em acetona a partir da extração de carboidratos solúveis. Adicionar 100 unidades de α-Amilase (α-amilase; Estável ao Calor de Bacillus licheniformis Sigma-Aldrich A-4551) em 0,9 mL de tampão MOPS (Ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico) a 50 mM pH 7,0, contendo CaCl2 a 5 mM, e misturar. Colocar tubos em um tubo de aquecimento a 90 °C durante 75 minutos. Misturar várias vezes durante a hidrólise. Deixar os tubos a resfriar até à temperatura ambiente e adicionar 5 unidades de Amiloglucosidase (comercialmente disponível a partir da Roche 11 202 367 001) em 0,6 mL de tampão de acetato a 285 mM, pH 4,5 e incubar em um banho de água reciprocante a 55 °C durante 15-18 horas. Remover grade de tubos e levar até à temperatura ambiente. Adicionar 4,5 mL de etanol absoluto a cada tubo, para alcançar uma concentração final de etanol de 80% e submeter a mistura com vórtex. Extrair em sonicador durante 15 min a 60 °C. Centrifugar 5 min a 1700 x g e decantar sobrenadante para um tubo de 13 x 100 mm e imediatamente colocar tubo em SpeedVac para reduzir o volume. Extrair pélete 2 vezes adicionais com 2 mL de etanol a 80%, combinando sobrenadante com o acima todas as vezes. Adicionar 100 μL de fenil-β-D glucopiranosídeo (ver acima) ao sobrenadante combinado antes de estar totalmente seco. Logo que o extrato no SpeedVac esteja seco analisar quanto a carboidratos solúveis como descrito em baixo.

Derivatização e análise de Carboidratos solúveis totais:

[0020] As amostras secas das extrações de solúveis e amido descritas acima em conjunto com conjuntos de misturas padrão de açúcares (contendo: pinitol, sorbitol, frutose,glucose, mio-inositol, sacarose, rafinose e estaquiose; a 0, 0,05, 0,1, 0,5, 1,00, 2,00 e 3,00 mg/tubo, cada um contendo a mesma quantidade (0,5 mg) de padrão interno de fenil-β-D glucopiranosídeo) foram solubilizadas em 1 mL de piridina anidra (Sigma-Aldrich P57506) contendo 30 mg/mL de hidroxilamina HCl (Sigma-Aldrich 159417). As amostras foram colocadas em um agitador orbital (350 rpm) durante a noite e foram depois aquecidas durante 1 hr (75 ° C) com mistura de vórtex vigorosa aplicada a cada 15 min. Após resfriamento até à temperatura ambiente, 1 mL de hexametildissilazano (Sigma-Aldrich H-4875) e 100 μL de ácido trifluoroacético (Sigma-Aldrich T-6508) são adicionados. As amostras são misturadas com vórtex e os precipitados são deixados a repousar antes da transferência dos sobrenadantes para frascos de amostras GC.

[0021] As amostras são analisadas em um sistema de cromatografia gasosa 6890 da Agilent equipado com uma coluna capilar DB-17MS (filme de 30 m x 0,32 mm x 0,25 um). As temperaturas de entrada e do detector são ambas 275 °C. Após injeção (2 μL, divisão 20:1), a temperatura inicial da coluna (150 °C) foi aumentada para 180 °C a uma taxa de 3 °C/min e depois a 25 °C/min até uma temperatura final de 320 °C. A temperature final é mantida durante 10 min. Gás de hidrogênio é usado como o transportador a uma velocidade linear de 51 cm/seg. A detecção é por ionização por chama. Um comprimento de 1 m de tubo capilar de 0,320 mm simples (Agilent; 160-2325-5) é inserido entre a entrada e a coluna analítica para atuar como uma coluna de guarda. As duas seções de coluna são conectadas usando um conector de encaixe. Antes de todas as operações analíticas, três injeções de uma mistura padrão contendo 3 mg de cada açúcar são feitas para passivar o sistema de cromatografia. Foi descoberto que este processo permitia recuperação total de estaquiose a partir das amostras analíticas, especialmente à medida que a coluna envelhecia. Forros de Entrada Ultrainertes (Agilent; 5190-3164) são usados e são rotineiramente mudados com base em indicações de perda na recuperação de estaquiose a partir do padrão com concentração mais baixa.

[0022] A análise de dados é realizada usando software ChemStation de Agilent. Cada açúcar é quantificado em relação à sua própria curva de calibração, após divisão de cada pico individual pela área do padrão interno em cada amostra e padrão. As concentrações finais de carboidratos são expressas corrigidas quanto ao conteúdo de umidade (ver acima). A sacarose, rafinose e estaquiose residuais recuperadas nas digestões de amido são incluídas nos valores totais relatados para cada açúcar.

[0023] Amostras de soja com uma ampla gama na quantidade de sucrosil-oligossacarídeo, tal como rafinose, estaquiose, ou uma sua combinação, podem ser exatamente medidas usando estes métodos químicos de referência padrão, facilitando o desenvolvimento técnicas espectroscópicas para medições não destrutivas precisas.

[0024] Como usado aqui, o método analítico de referência padrão usado para medir o conteúdo de umidade de grãos inteiros é o Método Oficial AOCS Ac 2-41, que mede a perda de peso de uma amostra após um período definido em um forno de tiragem forçada aquecido até 130 ° C.

[0025] Como usado aqui, o método analítico de referência padrão usado para medir o conteúdo de umidade de pós de soja é o Método Oficial AOCS Ba 2a-38, que mede a perda de peso de uma amostra após um período definido em um forno de tiragem forçada aquecido até 130 ° C.

[0026] Como usado aqui, o método analítico de referência padrão usado para medir o óleo é o Método Oficial AOCS Ba 3-38 que mede gravimetricamente o conteúdo de óleo de material de semente em pó após extração com éter de petróleo.

[0027] Como usado aqui, o método analítico de referência padrão usado para medir o conteúdo de proteína é AOCS Ba 4e-93 que determina o conteúdo de proteína de pós de soja triturados por análise de combustão.

[0028] Como usado aqui, o método analítico de referência padrão usado para medir PROIL é a adição dos teores de óleo e proteína determinados pelos métodos analíticos de referência padrão definidos acima.

[0029] Como usado aqui, o método analítico de referência padrão usado para determinar os perfis de ácidos graxos é o Método Oficial AOCS Ce 1e-91 em ésteres de metila derivados a partir de amostras de óleo extraídas a partir de pós de soja.

[0030] A quantidade de sucrosil-oligossacarídeo tal como estaquiose, rafinose ou uma sua combinação em sementes de soja intatas, inteiras, únicas ou agrupadas pode ser medida usando dispositivos de interrogação óptica empregando espectroscopia no infravermelho próximo até uma quantidade que esteja dentro de pelo menos 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% da quantidade medida usando o método analítico de referência padrão descrito aqui. A exatidão pode ser contrastada com precisão, que se refere à proximidade de duas ou mais medições entre si. Medições exatas e precisas de sucrosil-oligossacarídeos são alcançáveis de acordo com métodos descritos aqui. A precisão no que diz respeito à composição da amostra de sementes de soja sob análise se refere a como medições estreitamente replicadas da mesma amostra resultam em concentração ou quantidades similares sendo medidas de cada vez. A exatidão, no que diz respeito à composição da amostra de sementes de soja sob análise, se refere à concentração medida ou quantidade medida do componente de interesse sendo similar àquela ou a mesma que aquela obtida quando se opera método analítico de referência padrão na mesma amostra.

[0031] A exatidão obtida usando os métodos descritos aqui é reprodutível ao longo de múltiplas sementes ou amostras de sementes e facilita a avaliação de elevada produtividade na composição de sementes de soja. Por exemplo, se uma população de pelo menos 10, 20, 50, 100, 250, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 1,000,000, ou 1,000,000 sementes de soja for medida usando análise de sementes únicas individuais, a quantidade de rafinose ou estaquiose pode ser exatamente determinada até dentro de parâmetros descritos aqui para pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% da população de sementes.

[0032] A Espectroscopia no Infravermelho Próximo (NIRS) é uma ferramenta não destrutiva para analisar composição de sementes, com medições baseadas na absorção de energia luminosa (cerca de 780 a 2500 nm) por ligações H2O, CC, CH, OH, NH, SH e C=O nos constituintes orgânicos dos materiais sendo analisados.A presente divulgação proporciona métodos que são baseados em NIRS e na absorção de energia luminosa, na gama do espectro de infravermelho próximo (780 a 2500 nm), nos constituintes orgânicos dos materiais sendo analisados. Os espectros de luz de refletância no infravermelho próximo (NIR) e transmitância no infravermelho próximo (NIT) podem ser coletados e usados. Por exemplo, os métodos descritos aqui podem ser levados a cabo como NIR de semente única (SS-NIR), NIT a granel ou FT-NIR. A absorção da energia luminosa é proporcional à concentração do constituinte de interesse e a luz modificada compreendendo um ou mais espectros de luz transmitida e refletida da semente pode ser convertida para medir exatamente as quantidades ou concentrações do constituinte de interesse, tal como um sucrosil-oligossacarídeo. “Luz modificada” como usada no contexto desta divulgação significa luz que é transmitida (luz transmitida) e/ou refletida (luz refletida) a partir de uma semente ou outro objeto tal como farelo de soja ou flocos de soja desengordurados após receber luz de uma fonte de luz. A luz transfletida é uma combinação de luz refletida e transmitida e está incluída em luz modificada.

[0033] Em algumas modalidades, tal como quando é usada NIR de semente única (SS-NIR), uma gama espectral adequada para um sucrosil-oligossacarídeo tal como estaquiose inclui um ou mais valores em ou cerca de 850 nm, 866 nm, 880 nm, 890 nm, 902 nm, 910 nm, 920 nm, 930 nm, 944 nm, 952 nm, 964 nm, 978 nm, 990 nm, 1004 nm, 1016 nm, 1032 nm, e 1042 nm, tal como um ou mais valores residindo dentro de 850-852 nm, 862-868 nm, 876-884 nm, 888-892 nm, 900-904 nm, 908-912 nm, 918-922 nm, 930-934 nm, 940944 nm, 950-954 nm, 962-968 nm, 976-982 nm, 988-996 nm, 10001008 nm, 1012-1020 nm, 1026-1036 nm e 1040-1046 nm. Em algumas modalidades, tal como quando é usada FT-NIR, uma região espectral adequada para um sucrosil-oligossacarídeo tal como estaquiose inclui valores em ou cerca de 1157-1283 nm e 1437-2254 nm. Em algumas modalidades, tal como quando é usada NIR para feijões de soja inteiros, uma gama espectral adequada para um sucrosil- oligossacarídeo tal como estaquiose inclui valores em ou cerca de 918, 930, 940, 950, 964, 980 e 996 nm.

[0034] Em algumas modalidades são usados espectrômetros para coletar espectros de amostras de feijões de soja, tais como sementes únicas (p.ex., SS-NIR), lotes de sementes de uma única planta (p.ex., FT-NIR), amostras a granel de um lote de campo (p.ex., NIT) ou composições de proteínas tais como farelo de proteína e flocos de soja desengordurados (NIR). O farelo de proteína pode ser produzido por extração de óleo a partir de feijões de soja desidratados secos para produzir flocos de soja desengordurados secos e processamento dos flocos de soja desengordurados para produzir farelo de soja. As medições realizadas são comparadas com o método analítico de referência padrão quanto a tamanhos de amostras (sementes únicas ou amostras a granel). Em algumas modalidades, uma gama diversa de amostras de soja cultivadas em diferentes estações e diferentes ambientes que exibem uma ampla gama nas concentrações dos componentes é usada para gerar calibrações que proporcionam medições confiáveis e exatas dos componentes.

[0035] Nos métodos proporcionados, a conversão de espectros de luz modificada da soja na concentração do constituinte de interesse é determinada por uma referenciação aos espectros de sementes onde o constituinte de interesse foi medido usando o método analítico de referência padrão para o componente de interesse como divulgado aqui. A interpretação da região espectral no infravermelho próximo (780-2500 nm) de sementes é complexa por um número de razões. A absorção em esta região contém sobretons ou harmônicos mais fracos das frequências fundamentais e em bandas de combinação, onde a absorção ocorre em duas ou mais energias de ligação fundamentais sobrepostas. A absorção de energia e os espectros resultantes são portanto sinais vibracionais compósitos de todas as ligações ressonantes dentro dos componentes orgânicos e água na semente sendo analisada. O sinal espectral de qualquer componente específico é decifrado a partir do fundo e é influenciado pela matriz na qual está embebido. Por exemplo, o sinal molecular específico dentro de uma semente intata pode ser influenciado pelo ambiente tal como localização geográfica, estação de crescimento, condições de armazenamento e condições durante a medição, o fundo genético e a presença de moléculas similares.

[0036] Em algumas modalidades são alcançadas medições exatas de sucrosil-oligossacarídeos em uma semente por utilização de uma ampla gama de amostras nas quais compostos com composições químicas similares, tais como sacarose, estaquiose e rafinose, diferem de uma maneira recíproca. O sinal específico de sucrosil-oligossacarídeo é detectado na semente por se ter o sucrosil-oligossacarídeo presente em uma série de concentrações recíprocas de moléculas relacionadas e visa-versa. Uma coleção de sementes de soja maduras que têm diferenças significativas nas concentrações dos sucrosil-oligossacarídeos facilita esta abordagem. A quantidade ou concentração de sucrosil- oligossacarídeos pode ser também medida em sementes tendo a mesma genética ou genética similar que foram cultivadas em múltiplos ambientes e ao longo de múltiplas estações.

[0037] As medições podem ser realizadas a qualquer conteúdo de umidade da soja. O conteúdo de umidade da soja afeta as percentagens em peso dos componentes da soja, com os grãos mais secos tendo geralmente uma percentagem em peso mais elevada do componente, tal como óleo, proteína ou sucrosil- oligossacarídeo. Quando se comparam medidas baseadas em NIR com métodos analíticos de referência padrão, as medições podem ser realizadas em cada caso ao mesmo teor de umidade da soja ou, se as medições forem realizadas a diferentes teores de umidade, os valores obtidos podem ser corrigidos para o mesmo teor de umidade. As medições podem, por exemplo, ser realizadas a ou padronizadas até um conteúdo de umidade em peso de pelo menos ou pelo menos cerca de 0,01%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% ou 20% e menos do que ou menos do que cerca de 35%, 30%, 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9% ou 8%. A não ser que indicado o contrário, as medições descritas aqui são a ou cerca de 13% em peso de conteúdo de umidade.

[0038] São proporcionados métodos baseados em NIRS analítica não destrutivos exatos para medir exatamente os carboidratos solúveis tais como sacarose e os sucrosil- oligossacarídeos rafinose e estaquiose, que são apropriados tanto para feijões de soja únicos bem como para lotes a granel de feijões de soja e farelo de soja. Após medição, a semente permanece viável e pode ser cruzada com a mesma planta ou planta diferente tal como em um programa de melhoramento de plantas para produzir sementes de descendência ou processadas para extração de componentes tais como óleo e farelo de proteína.

[0039] Os métodos e sistemas proporcionados, a quantidade ou concentração de um ou mais sucrosil- oligossacarídeos na semente pode ser exatamente e não destrutivamente medida por interrogação de uma semente usando um dispositivo de interrogação óptica, tal como um espectrofotômetro, que direciona a luz no infravermelho próximo para a semente e usando os espectros de luz refletida, transmitida ou transfletida (uma combinação de luz transmitida e refletida) a partir da semente e detectada pelo dispositivo de interrogação óptica em combinação com medições usadas para gerar modelos de calibração obtidos a partir de semente previamente avaliada. Em algumas modalidades, a semente é dividida ou selecionada com base na quantidade ou concentração de sucrosil- oligossacarídeo presente na semente. A semente pode ser uma semente inteira, uma semente intata, uma semente viável, uma semente individual ou uma população de sementes individuais, inteiras, viáveis ou intatas. Em algumas modalidades podem ser feitas decisões de divisão após medição e análise de uma semente única ou após medição e análise de uma população de sementes ou um número definido de sementes avaliadas em conjunto em uma amostra de sementes. Quando um número de sementes é avaliado em conjunto, uma média para os valores medidos ao longo da população de sementes pode ser obtida por agrupamento dos dados coletados a partir de sementes individuais dessa população ou por uso de métodos nos quais uma amostra agrupada das sementes de soja é medida simultaneamente. Após análise, a semente permanece viável e pode ser plantada e cultivada para produzir uma planta de soja. As sementes permanecem inteiras, intatas e viáveis antes do e após o processo de análise. O farelo de proteína de feijões de soja pode ser similarmente analisado.

[0040] Por representação gráfica de valores do método analítico de referência padrão contra as medições realizadas por análise não destrutiva para um constituinte em particular, o valor de R2 pode ser usado para indicar a proporção dos dados que é contabilizada por uma linha ideal representada graficamente através dele. Um valor de 1 indica a exatidão mais elevada. O erro quadrático médio da calibração (RMSEC) indica a potência de resolução dos valores medidos e pode dar uma indicação da confiança estatística quanto a se dois valores diferem significativamente um do outro. Tipicamente, valores diferindo em 2 x o RMSEC diferem um do outro ao nível de confiança de 95%. O erro quadrático médio da validação cruzada (RMSECV) é outro parâmetro estatístico que é usado para avaliar a qualidade das calibrações. Logo que um modelo (calibração) seja criado, os dados para um grupo de amostras são removidos e a influência da sua omissão é avaliada. Em modelos robustos, o RMSECV é similar ao RMSEC. A validação cruzada permite também que valores aberrantes que possam influenciar incorretamente um modelo sejam identificados para análise adicional. O RMSECV dá também uma estimativa do potencial dos modelos para preverem a composição de amostras fora da gama representada no conjunto de calibração.

[0041] Usando os métodos divulgados aqui, as sementes, tais como sementes não modificadas e sementes modificadas em uma ou mais populações de sementes, diferindo no conteúdo de estaquiose em pelo menos 0,5%, 1,0%, 1,25%, 1,5%, 1,75%, 2,0%, 2,5% ou 3,0% e menos do que 6,0%, 5,0%, 4,0%, 3,5%, 3,0%, 2,5%, 2,0% ou 1,5% (os valores são pontos percentuais em peso) podem ser corretamente identificadas para pelo menos ou pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% da população de sementes contendo diferente conteúdo de estaquiose.

[0042] O termo diferença, mudança, aumento ou diminuição em “ponto percentual” (pp) se refere à diferença aritmética de duas percentagens, p.ex., [valor transgênico ou geneticamente modificado (%) - valor de controle (%)] = pontos percentuais. Por exemplo, uma semente modificada pode conter 20% em peso de um componente e a semente de controle não modificada correspondente pode conter 15% em peso desse componente. A diferença no componente entre o controle e a semente transgênica seria expressa como 5 pontos percentuais.

[0043] “Percentagem de aumento” ou “percentagem de diminuição” se refere a uma mudança ou diferença expressa como uma fração do valor de controle, p.ex., {[valor modificado/transgênico/de teste (%) - valor de controle (%)]/valor de controle (%)}x100% = percentagem de mudança, ou {[valor obtido em uma primeira localização (%) - valor obtido em segunda localização (%)]/valor na segunda localização (%)}x100 = percentagem de mudança. O termo “conteúdo de ácidos graxos totais” se refere à soma dos cinco principais componentes de ácidos graxos encontrados em feijões de soja, nomeadamente C16:0, C18:0, C18:1, C18:2 e C18:3. O termo “conteúdo de ácidos graxos polinsaturados totais” se refere ao conteúdo de C18:2 mais C18:3 total. O termo “conteúdo de ácidos graxos saturados totais” se refere ao conteúdo de C16:0 mais C18:0 total.

[0044] Usando os métodos divulgados aqui, as sementes, tais como sementes não modificadas e sementes modificadas diferindo no conteúdo de rafinose em pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1% ou 1,5% e menos do que 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1%, 0,5%, 0,3% ou 0,2% (os valores são pontos percentuais em peso) em uma ou mais populações de sementes podem ser corretamente identificadas para pelo menos ou pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% e 98% da população de sementes.

[0045] A população pode incluir pelo menos ou pelo menos cerca de 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 35, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 750, 1000, 5,000, 10,000 ou 50,000 sementes e menos do que ou menos do que cerca de 5,000,000, 1,000,000, 500,000, 400,000, 250,000, 100,000, 50,000, 10,000, 5,000, 2,500, 1,000, 750, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75, 50 ou 25 sementes.

[0046] Em algumas modalidades, feijões de soja intatos individuais únicos são analisados uma semente de cada vez, tal como com técnicas de NIR de semente única (SS-NIR) utilizando luz refletida, luz transmitida ou uma sua combinação. Tais métodos são úteis, por exemplo, para identificar uma semente individual transportando o traço desejado, tal como um transgene, gene editado ou alelo mutante, que resulta em uma composição desejada. Após análise de acordo com os métodos descritos aqui, a semente pode ser usada em programas de investigação e melhoramento de plantas. Por exemplo, a semente pode ser cultivada para produzir uma planta que é cruzada com pela própria ou outra planta diferente para produzir semente de descendência.

[0047] Em algumas modalidades, pequenas quantidades a granel de sementes, tais como a quantidade de sementes coletadas a partir de uma única planta de soja (cerca de 50-300 sementes) que podem ser homozigóticas, são analisadas em conjunto. FT-NIR, que utiliza NIR por refletância, pode ser usada como nos métodos descritos aqui para amostras de soja coletadas a partir de plantas individuais. Tais métodos são úteis, por exemplo, na avaliação ou classificação do desempenho de traços ao nível de plantas únicas e podem ser usados para fazer seleções de plantas quanto ao seu uso em investigação ou reprodução adicional. Tais avaliações podem ser usadas em avaliações de eventos transgênicos em estudos de ambiente controlado e campo.

[0048] Em algumas modalidades é proporcionada análise de sementes a granel (métodos de NIT a granel) que requerem tipicamente uma massa de pelo menos ou pelo menos cerca de 100 g, 200 g, 250 g, 300 g, 350 g ou 400 g e menos do que ou menos do que cerca de 2000 g, 1000 g, 900 g, 800 g, 700 g ou 500 g de amostra. Tais métodos são úteis, por exemplo, na análise de semente cultivada em parcelas de teste de campo e ensaios de rendimento ou a partir de uma coleta a granel e na identificação de semente modificada a partir de semente não modificada. Tais métodos podem ser usados, por exemplo, em locais de recepção de grãos tais como elevadores de grãos para determinar a composição e qualidade das sementes entregues e o valor da remessa de grãos. Tais métodos podem incluir um passo de amostragem da semente usando um sistema de amostragem tal como o Método Oficial AOCS Ac 1-45.

[0049] Os cultivares comerciais de soja são homozigotas quanto à maioria dos traços e podem ser modificados para terem traços adicionais introduzidos por retrocruzamento (p.ex., a introgressão do traço de interesse pode ser alcançada por cruzamento para uma segunda linha contendo o traço e retrocruzamento repetido para a linha original enquanto se selecionada o traço de interesse), modificação genética, mutação ou transformação. Tais traços adicionais podem incluir um ou mais transgenes ou modificações de genes que alteram a composição da semente de soja ou proporcionam outras características agronômicas tais como resistência a herbicidas ou insetos. A seleção de linhas pode incluir, por exemplo, seleções baseadas em um ou mais do desempenho da linha que produziu a semente sendo medida, determinação da presença ou ausência de um transgene, mutação ou modificação genética na semente e avaliação se um transgene, modificação genética ou gene mutante ou sequência codificante foi herdado por uma semente, por exemplo, por introgressão através de passos de cruzamento e melhoramento.

[0050] As sementes de soja usadas nos métodos e sistemas descritos aqui podem ser geradas usando uma ou mais técnicas divulgadas aqui que facilitam a integração ou expressão de uma sequência alvo na planta ou semente. Exemplos incluem uma ou mais de uma pistola de partículas, Agrobacterium, integração em local único, tecnologia CRISPR-Cas (repetições palindrômicas, curtas, agrupadas, regularmente espaçadas-Cas), TALEN (nucleases efetoras tipo ativadores da transcrição), proteínas de dedo de zinco (ZNF) ou sua combinação.

[0051] Semente modificada significa semente que contém uma modificação genética que resulta em uma alteração da composição da semente. Exemplos de composição alterada incluem um ou mais de um aumento ou diminuição em óleo, proteína, um ou mais ácidos graxos, um ou mais aminoácidos, um ou mais sucrosil- oligossacarídeos, sacarose, um ou mais carboidratos, polissacarídeos da parede celular, componentes de monossacarídeo da parede celular, fibra, amido, amido fermentável, celulose, biopolímeros, fármacos, compostos secundários, metabolitos e suas combinações.

[0052] Exemplos de modificações genéticas em semente modificada incluem transformação, tal como com um construto recombinante contendo uma sequência alvo de interesse operacionalmente ligada a um promotor heterólogo, mutações naturais ou induzidas e edição do genoma que pode englobar alteração de uma ou mais sequências de DNA genômico da soja ou uma sequência transgênica pré-existente incluindo elementos reguladores, sequências codificantes e não codificantes. A modificação pode ser uma deleção de nucleotídeo único, substituição, uma deleção de gene total ou parcial ou inserção ou alteração de uma sequência intensificada, tal como um promotor ou elemento promotor, para aumentar a expressão. As deleções podem incluir deleção de uma ou mais sequências codificantes de éxons do gene ou deleção de um ou mais elementos reguladores do gene.

[0053] Como um exemplo, a semente, célula ou planta modificada descrita aqui pode ser gerada usado endonucleases “customizadas” ou manipuladas tais como meganucleases produzidas para modificar genomas vegetais (ver, p.ex., WO 2009/114321; Gao et al. (2010) Plant Journal 1: 176-187). Outra modificação genética sítio-dirigida é através do uso de reconhecimento de domínio de dedo de zinco acoplado às propriedades de restrição da enzima de restrição. Ver, p.ex., Urnov, et al., (2010) Nat Rev Genet. 11 (9): 636-46; Shukla, et al., (2009) Nature 459 (7245): 437-41. Uma enzima de modificação de DNA efetor do tipo ativador transcricional (TAL) (TALE ou TALEN) é também usada para manipular mudanças no genoma vegetal. Ver, p.ex., US20110145940, Cermak et al., (2011) Nucleic Acids Res. 39 (12) e Boch et al., (2009), Science 326 (5959): 1509-12. A modificação sítio-específica de genomas vegetais pode ser também realizada usando o sistema CRISPR do tipo bacteriano II (repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas)/Cas (associado a CRISPR). Ver, p.ex., Belhaj et al., (2013), Plant Methods 9: 39; O sistema baseado em Cas9/RNA permite a clivagem visada de DNA genômico guiada por um pequeno RNA não codificante customizável em plantas (ver, p.ex., WO 2015026883A1, incorporada aqui por referência). Estes métodos são também úteis no direcionamento de ácidos nucleicos a sequências de reconhecimento alvo pré-manipuladas no genoma. Uma “mutação”, que é possuída por um mutante, se refere a uma mudança genética detectável e hereditária (espontânea ou induzida) não causada por segregação ou recombinação genética.

[0054] Semente não modificada é semente que é similar à semente modificada mas que não tem a modificação genética que altera a composição da semente.

[0055] Em algumas modalidades, os métodos incluem medir um constituinte de semente diferente, em combinação com medir um sucrosil-oligossacarídeo para proporcionar informação composicional adicional, tal como um perfil composicional, sobre a semente. Tais medições podem ser levadas a cabo simultaneamente com as medições de sucrosil-oligossacarídeo e podem ser usadas para avaliar linhas ou sementes a partir delas, tais como linhas ou sementes modificadas. Uma “linha”, quando se refere à soja, é um grupo de plantas de parentesco similar que exibe pouca ou nenhuma variação genética entre indivíduos quanto a pelo menos um traço. As linhas de soja são geralmente homozigotas quanto a quase todos os traços. As linhas podem ser criadas por uma ou mais gerações de autopolinização ou seleção ou propagação vegetativa a partir de um único genitor incluindo por técnicas de cultura em tecidos ou células.

[0056] Exemplos não limitantes de constituintes de sementes que podem ser medidos nos métodos proporcionados aqui, incluindo processamento ou divisão de sementes, incluem proteínas, óleos, carboidratos, ácidos graxos (tais como um ou mais de ácido oleico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido araquídico, ácido erúcico, ácido be-hênico, ácido lignocérico e ácido mirístico) e perfis de ácidos graxos, aminoácidos, biopolímeros, farmacêuticos, amido, amido fermentável, compostos secundários, sucrosil- oligossacarídeos, metabolitos e suas combinações. Por exemplo, alterações, tais como aumentos ou diminuições, em estes constituintes podem ser medidas em combinação com a medição da quantidade ou concentração de um ou mais sucrosil- oligossacarídeos em uma semente de soja alvo ou modificada e comparadas com uma semente de soja de controle ou não modificada comparável que contém a modificação contribuindo para o fenótipo alterado.

[0057] As sementes de soja que podem ser usadas nos métodos e sistemas proporcionados podem ser transgênicas quanto a um ou mais traços, por exemplo através de supressão ou sobre- expressão e/ou podem ter uma ou mais mutações ou modificações genéticas, que resultam em uma semente tendo uma composição suficientemente diferente de sementes de soja não mutantes, não modificadas ou não transgênicas, de mercadoria comparáveis para permitir a identificação, separação e/ou divisão da semente transgênica, mutante ou geneticamente modificada da semente comparável ou controle. Por exemplo, uma baixa quantidade ou concentração de sucrosil-oligossacarídeo em uma semente de soja pode indicar que a semente de soja é uma semente modificada contendo um ou mais traços, tal como um ou mais eventos transgênicos ou modificações genéticas, que resultam em um fenótipo de elevado teor de óleo, elevado teor de proteína e/ou perfil de ácidos graxos alterado na semente de soja em comparação com uma semente de soja comparável não contendo o traço ou modificação. As sementes de soja que têm uma quantidade ou concentração de sucrosil-oligossacarídeo abaixo de um limiar desejado (i.e., abaixo de uma quantidade máxima desejada) de sucrosil-oligossacarídeo e acima de um limiar desejado (i.e., acima de uma quantidade mínima desejada) de conteúdo de óleo, conteúdo de proteína ou conteúdo tanto de óleo como de proteína podem ser selecionadas e usadas no melhoramento de plantas ou processamento industrial. Os métodos descritos aqui podem ser também usados com sementes de soja modificadas que têm uma quantidade ou concentração de sucrosil-oligossacarídeo abaixo de um limiar desejado (i.e., abaixo de uma quantidade máxima desejada) de sucrosil-oligossacarídeo e acima ou abaixo de um limiar desejado para um ou mais ácidos graxos. O limiar é selecionado para permitir divisão ou separação de sementes modificadas das sementes comparáveis não contendo o traço transgênico ou modificação genética. O farelo de proteína pode ser também analisado rapidamente e não destrutivamente usando os métodos descritos aqui, e o farelo de proteína produzido a partir de feijões de soja contendo uma ou mais modificações genéticas tais como as modificações descritas aqui pode ser identificado a partir de farelo produzido a partir de feijões de soja não modificados.

[0058] Em algumas modalidades, as modificações genéticas incluem uma ou mais mutações ou modificações que resultam em quantidades reduzidas de estaquiose, rafinose ou uma sua combinação na semente de soja, tais como as mutações low1, low2, low3, low4 descritas nas Patentes dos EUA N.os 5,710,365, 6,147,193 e 6,653,451, mutações na estaquiose sintase tais como nas linhas de soja PI 603176A e PI 594012 (Qui et al., Theor Appl Genet 2015, 128: 2167), as mutações na rafinose sintase tais como os genes RS2 ou RS3 descritos na Patente dos EUA N.° 8728726 e Patente dos EUA Publicação N.° 20130318660, a mutação SG-ULRFO descrita na Patente dos EUA Publicação N.° 20110003045 e as mutações de baixo teor de fitato, baixo teor de estaquiose descrita na Patente dos EUA N.° 8,003,856.

[0059] Em algumas modalidades, as modificações genéticas incluem uma ou mais mutações ou modificações que resultam em ácido oleico aumentado, tal como um ou mais alelos FAD2, ver, p.ex., Patentes dos EUA N.os 9,198,365, 9,185,826, 7,531,718, 7,205,457, 7,067,722, 6,426,448, 6,229,033, 5,981,781 e Patentes dos EUA Publicações N.° 20160186195, 20130219565.

[0060] O ácido oleico pode ser aumentado até cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90% (tal como pelo menos cerca ou pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ou 85% e menos do que ou menos do que cerca de 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, ou 65%; medido como uma proporção dos ácidos graxos totais) por supressão ou inibição da expressão de um ou mais genes FAD2, tal como por mutação, edição do genoma ou transgenes, sozinhos ou em combinação com outras modificações descritas aqui.

[0061] Em algumas modalidades, as modificações genéticas incluem uma ou mais mutações ou modificações que resultam em ácido linolênico reduzido, tal como alelos FAD3 ou fan (p.ex., fan1, fan2, fan3) encontrados, por exemplo, em linhas mutantes, A5, C1640, RG10, A16, A17, A23, A29 e em linhas mutantes tendo tais alelos modificados por edição do genoma ou transformação. Ver, p.ex., Patentes dos EUA N.os 8,901,375, 7,943,818, 7,205,457, 7,067,722, 6,133,509, 5,850,030, 5,710,369, 5,714,670, 5,763,745, 5,714,668, 5,534,425 e 5,714,670 e Patentes dos EUA Publicações N.° 20160186195, 20130219565.

[0062] O ácido linolênico pode ser diminuído até cerca de 6%, 5,5%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3,0%, 2,9%, 2,8%, 2,7%, 2,6%, 2,5%, 2,4%, 2,3%, 2,3%, 2,1%, 2,0%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1% ou 1,0% (tal como pelo menos cerca ou pelo menos 0,5%, 0,6%. 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,5%, 2,9% ou 3,0% e menos do que ou menos do que cerca de 6%, 5,5%, 5,0%, 4,5%, 4,0%, 3,5%, 3,4%, 3,3%, 3,2%, 3,1%, 3,0%, 2,9%, 2,8%, 2,7%, 2,6%, 2,5%, 2,4%, 2,3%, 2,2%, 2,1%, 2,0%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1% ou 1,0% medido como uma proporção dos ácidos graxos totais) por supressão ou inibição da expressão de um ou mais genes FAD3, tais como aqueles divulgados aqui e tal como por mutação, edição do genoma ou uso de transgenes, sozinhos ou em combinação com outras modificações descritas aqui.

[0063] Em algumas modalidades, por exemplo, os componentes que podem ser usados para modificar a composição da semente incluem expressão aumentada de uma DGAT (diglicerídeo aciltransferase; p.ex., Patente dos EUA N.° 8,153,859; 8,399,736; 9,187,736), tal como DGAT1 (p.ex., uma DGAT1 de soja ou uma DGAT1 de soja expressando um polipeptídeo com uma ou mais substituições de aminoácidos, p.ex., Patentes dos EUA N.os 7,524,945, 8,497,362, 8,101,819, 8,455,714; 9,447,386) ou DGAT2 (p.ex., uma DGAT2 de Yarrowia lipolytica, p.ex., Patentes dos EUA N.os 9,574,207, 8,927,809; 8,993,840), supressão de uma ou mais galactinol sintases (GAS; tal como GAS1, GAS2 e GAS3, p.ex., Patentes dos EUA N.os 9,574,207; 7,294,756; 6,967,262; 5,648,210; 5,773,699; 5,710,365; 6,147,193; 6,653,451), expressão aumentada de um transportador de sacarose, tal como SUT2 ou SUT4 (p.ex., Patente dos EUA N.° 8,993,840), expressão de fatores de transcrição tais como proteína de desenvolvimento de óvulos (ODP; também conhecida como Wrinkled1, ver, p.ex., Patentes dos EUA N.os 8,404,926 e 9,284,571), LEC1 ou FUSCA3 (p.ex., Patente dos EUA Publicação N.° 20160186195), fosfoglucomutase (PGM; Patente dos EUA N.° 8,143,476, 8,829,273), ácido graxo dessaturase FAD3 (p.ex., Patentes dos EUA N.os 7,081,564; 8,609,935; 5,981,781; Patente dos EUA Publicação N.° 20130219565), fragmentos de amiRNA de fad2-1b, fatBF ou fad3c (p.ex., Patente dos EUA Publicação N.° 20130219565), anidrase carbônica (p.ex., Patente dos EUA Publicação N.° 20170029836), pectina acetil esterase (PAE; p.ex., Patente dos EUA N.° 9,574,204), aldolase tal como aldolases HpaIL (p.ex., Patente dos EUA N.° 9,347,066), pirofosfatase citosólica (PPiase; p.ex., Patente dos EUA Publicação N.° 20120174261), motivos de oxidorredutase e oxidorredutase (ORM; p.ex., Patente dos EUA Publicação N.° 20110219474) ou suas combinações. Promotores que podem ser usados incluem, por exemplo, um ou mais de promotores da anexina, promotor da subunidade α’ da beta-conglicinina, promotor da glicinina 1, Promotor do Inibidor de Tripsina Kunitz 3, promotor da albumina 2S, promotor da s-adenosilmetionina sintetase, promotor da sacarose sintase tal como um promotor SUS2, promotor do gene abundante da embriogênese tardia. Outros componentes que podem ser usados incluem uma FLP-Recombinase de levedura para facilitar a recombinação em locais alvo de reconhecimento de flipase (FRT) curtos. Exemplos adicionais de componentes são proporcionados na Tabela 1, construtos esses que podem ser usados para gerar sementes modificadas ou transgênicas tendo uma ampla gama de quantidades ou concentrações de um ou mais sucrosil-oligossacarídeos. Qualquer combinação em estes componentes descritos em este parágrafo e na Tabela 1 pode ser expressa em conjunto. Um ou mais destes componentes podem ser também ser combinados com uma ou mais das modificações ou mutações descritas aqui, tais como mutações ou modificações afetando o perfil de ácidos graxos tais como ácido oleico, ácido linolênico, ácido linoleico, ácido esteárico ou ácido palmítico. As sequências divulgadas aqui incluem sequências que têm pelo menos ou pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% identidade com as sequências divulgadas, contanto que a sequência funcione para o seu propósito pretendido.

[0064] Tabela 1. Lista de promotores e cassete de gene/amiRNA/RNAi e suas abreviaturas

[0065] Os feijões de soja gerados por modificação da expressão destas sequências e tendo diferentes quantidades de estaquiose, rafinose ou tanto estaquiose como rafinose podem ser usados iterativamente nos métodos descritos aqui para gerar calibrações que proporcionam medições exatas de estaquiose ou tanto estaquiose como rafinose. Em algumas modalidades, a verbascose pode ser medida. Como usado aqui, sucrosil- oligossacarídeo significa a soma de estaquiose e rafinose.

[0066] Em algumas modalidades, a soja é modificada para ter atividade de galactinol sintase (GAS) suprimida com uma ou mais sequências que suprimem a expressão de galactinol sintase (p.ex., uma ou mais de GAS1, GAS2 e GAS3) ou atividade de rafinose sintase (p.ex., RS2, RS3) (ou uma combinação de supressão de GAS e rafinose sintase), sozinha ou em combinação com atividade de DGAT aumentada (por exemplo, por transformação com uma DGAT de levedura ou soja descrita na Tabela 1 ou modificação genética do DGAT nativa ou suas sequências reguladoras para intensificar a expressão) e opcionalmente outras sequências, tais como aquelas descritas na Tabela 1, para aumentar o óleo e/ou a proteína. Tal expressão ou supressão aumentada ou pode ser alcançada por um ou mais de modificação genética, tal como por edição de genes, pelo uso de transgenes ou por mutação.

[0067] Tais sementes podem ter uma quantidade de estaquiose de cerca de 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% ou 0,5%, tal como pelo menos cerca de 0,05% ou 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% ou 0,5% e menos do que cerca de 2%, 1,5%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6% ou 0,5% de estaquiose (pontos percentuais em peso). Tais sementes podem ter uma quantidade de sucrosil-oligossacarídeo de cerca de 0,3%, 0,4%, 0,5% ou 0,6%, tal como pelo menos cerca de 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% ou 0,5% e menos do que cerca de 2%, 1,5%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6% ou 0,5% de sucrosil-oligossacarídeo (pontos percentuais em peso). Em contraste, a semente de não modificada, de controle, nula ou de tipo selvagem comparável pode ter um conteúdo de estaquiose de cerca de 4%, tal como pelo menos cerca de 1%, 2%, 2,5%, 3% ou 3,5% e menos do que cerca de 6%, 5,5%, 5% ou 4,5% (pontos percentuais em peso). A semente de não modificada, de controle, nula ou de tipo selvagem comparável pode ter um conteúdo de sucrosil-oligossacarídeo de cerca de 5%, tal como pelo menos cerca de 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4% ou 4,5% e menos do que cerca de 6,5%, 6%, 5,5% ou 5% (pontos percentuais em peso).

[0068] Tais sementes modificadas podem ter também um óleo, proteína ou sua combinação aumentados adicionalmente a sucrosil-oligossacarídeo ou estaquiose reduzido. Por exemplo, tais sementes modificadas podem ter uma quantidade de óleo em pontos percentuais em peso de cerca de 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, tal como pelo menos cerca de 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% e menos do que cerca de 40%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29% ou 28% de óleo em peso. Em contraste, uma semente de não modificada, de controle, nula ou de tipo selvagem comparável pode ter uma quantidade de óleo em pontos percentuais em peso de cerca de 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21% ou 22%, tal como pelo menos cerca de 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% ou 21% e menos do que cerca de 23%, 22%, 21%, 20%, 19% ou 18% de óleo em peso. Exemplos úteis de aumentos de pontos percentuais no conteúdo de óleo ou ácidos graxos totais em uma semente, tal como uma semente de soja modificada descrita aqui, em comparação com uma soja comparável ou de controle incluem, mas não estão limitados a, aumento de pontos percentuais em peso de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4% ou 5% e menos do que 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% ou 4%. Exemplos úteis dos aumentos percentuais no conteúdo de óleo ou ácidos graxos totais em uma semente de soja modificada descrita aqui em comparação com uma soja não modificada, de controle, nula ou de tipo selvagem comparável incluem, mas não estão limitados a, aumentos percentuais de pelo menos 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, ou 40% e menos do que 99%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 35%, 30% e 25%.

[0069] Tais sementes modificadas podem ter uma quantidade de proteína em pontos percentuais em peso de cerca de 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53% ou 54% tal como pelo menos cerca de 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50% e menos do que cerca de 55%,54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40% ou 39% de proteína. Em contraste, uma semente de não modificada, de controle, nula ou de tipo selvagem comparável pode ter uma quantidade de proteína em pontos percentuais em peso de cerca de 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37% ou 38% tal como pelo menos cerca de 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34% ou 35% e menos do que cerca de 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29% ou 28% de proteína. Exemplos úteis de aumentos de pontos percentuais em proteína (em peso) em uma semente, tal como uma semente de soja modificada, em comparação com uma soja comparável ou de controle incluem, mas não estão limitados a, aumento de pontos percentuais em peso de pelo menos 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3,0%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4%, 3,5%, 3,6%, 3,7%, 3,8%, 3,9%, 4,0%, 4,1%, 4,2%, 4,3%, 4,4%, 4,5%, 4,6%, 4,7%, 4,8%, 4,9%, 5,0%, 6%, 7%, 8%, 9%, e 10% e menos do que 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% ou 4%. Exemplos úteis dos aumentos percentuais no conteúdo de proteína em uma semente tal como uma semente modificada em comparação com uma semente de soja não modificada, de controle, nula ou de tipo selvagem descrita aqui incluem, mas não estão limitados a, aumentos percentuais de pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, ou 60% em peso e menos do que cerca de 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% ou 10%.

[0070] Os métodos podem ser usados para distinguir exatamente entre sementes de soja individuais, ou populações ou linhas de soja que diferem em pontos percentuais em cerca de 1% de estaquiose ou sucrosil-oligossacarídeo, tal como menos do que 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6% ou 0,5% de estaquiose ou sucrosil-oligossacarídeo em peso e pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,85 ou 0,9% de estaquiose ou sucrosil- oligossacarídeo em peso. Os valores são dados por percentagem em peso.

[0071] A diferença em sucrosil-oligossacarídeo, tal como estaquiose, entre tipos de sementes serem medidos, tal como uma semente modificada e não modificada como descrita aqui, pode ser detectada, por exemplo, quando a diferença é de pelo menos 0,5 pontos percentuais, 1,0 pontos percentuais, 1,5 pontos percentuais, 2,0 pontos percentuais, 2,5 pontos percentuais, 3,0 pontos percentuais, ou 4,0 pontos percentuais e menos do que 5,0 pontos percentuais, 4,5 pontos percentuais, 4,0 pontos percentuais, 3,5 pontos percentuais, 3,0 pontos percentuais, 2,5 pontos percentuais, 2,0 pontos percentuais, 1,5 pontos percentuais ou 1,0 pontos percentuais. Os valores são dados por percentagem em peso.

[0072] Exemplos úteis da quantidade de conteúdo de sucrosil-oligossacarídeo em uma semente tal como uma semente de soja modificada ou não modificada incluem, mas não estão limitados a, em pontos percentuais em peso pelo menos ou pelo menos cerca de 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0% ou 6,5% e menos do que ou menos do que cerca de 7%, 6,5%, 6,0%, 5,0%, 4,5%, 4,0%, 3,5%, 3,0%, 2,9%, 2,8%, 2,7%, 2,6%, 2,5%, 2,4%, 2,3%, 2,2%, 2,1%, 2,0%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3% ou 0,2%.

[0073] Os métodos podem ser usados para distinguir exatamente entre feijões de soja individuais, ou populações ou linhas de feições de soja que diferem em pontos percentuais em peso em ou cerca de 0,5%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5% 5%, 5,5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de óleo, tal como em pontos percentuais pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 2%. 3%, 4%, ou 5% de óleo e menos do que 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6% ou 0,5% de óleo.

[0074] Os métodos podem ser usados para distinguir exatamente entre feijões de soja individuais, ou populações ou linhas de feições de soja que diferem em pontos percentuais em peso em ou cerca de 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5% 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 7%, 8%, 9%,10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20% ou 25% de proteína, tal como pelo menos 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, e 10% de proteína e menos do que 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% de proteína.

[0075] Se uma DGAT de levedura, tal como diacilglicerol aciltransferase 2 de Yarrowia lipolytica ou uma DGAT de soja, tal como DGAT1 de soja, for expressa em uma semente de soja, opcionalmente com uma ou mais sequências que resulta em supressão de GAS ou rafinose sintase, a semente pode ter um conteúdo de ácido oleico de cerca de 30%, 31% ou 32% tal como pelo menos cerca de 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27% ou 28% e menos do que cerca de 40%, 35%, 34% ou 33%. A não ser que indicado o contrário, todos os valores percentuais para um ácido graxo particular são expressos aqui como uma percentagem do conteúdo de ácidos graxos totais. O ácido oleico pode ser medido em combinação com a medição da quantidade de sucrosil-oligossacarídeo ou estaquiose ou outros componentes descritos aqui. Em contraste, a semente de não modificada, de controle, nula ou de tipo selvagem comparável pode ter um conteúdo de ácido oleico de cerca de 22% ou 23%, tal como pelo menos cerca de 19%, 20% ou 21% e menos do que cerca de 25%, 24,5% ou 24%. Para tais grãos modificados, o limiar para o ácido oleico para distinguir entre a semente modificada e não modificada pode ser cerca de 25% ou 30% ou 35%, tal como pelo menos cerca de 21%, 22%, 23%, 23,5%, 24%, 24,5%, 25%, 25,5%, 26%, 26,5%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35% ou 36% e menos do que cerca de 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27% 27% ou 26% de ácido oleico.

[0076] Se uma DGAT de soja, tal como a diacilglicerol aciltransferase 1 de soja descrita na Tabela 1, ou uma DGAT de levedura, tal como diacilglicerol aciltransferase 2 de Yarrowia lipolytica, for expressa ou sobre-expressa em uma semente de soja, opcionalmente com uma ou mais sequências que resulta em supressão de GAS e/ou rafinose sintase, a semente pode ter um conteúdo de ácido esteárico de cerca de 5% (tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 4%, 4,5% ou 5% e menos do que ou menos do que cerca de 10%, 9%, 8%, 7% ou 6%) que pode ser medido em combinação com a medição da quantidade de estaquiose ou sucrosil- oligossacarídeo ou outros componentes descritos aqui. Em contraste, a semente não modificada comparável pode ter um conteúdo de ácido esteárico de cerca de 3,5% (tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 3%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4% ou 3,5% e menos do que ou menos do que cerca de 3,7%, 3,8%, 3,9%, 4,0%, 4,1%, 4,2%, 4,3%, 4,4%, 4,5%, 4,6%, 4,7%, 4,8% ou 4,9%, 5,0%, 5,5%).

[0077] Se uma DGAT, tal como a diacilglicerol aciltransferase 1 modificada descrita na Tabela 1, for expressa ou sobre-expressa em uma semente de soja, opcionalmente com uma ou mais sequências que resulta na supressão de GAS, a semente pode ter um conteúdo de ácido palmítico de cerca de 12% ou 13% (tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 11%, 11,1%, 11,2%, 11,3%, 11,4%, 11,5%, 11,6%, 11,7%, 11,8%, 11,9%, ou 12% e menos do que ou menos do que cerca de 15%, 14,5%, 14%, 14,5%, 14%, 13,5%, 13,4%, 13,3%, 13,2%, 13,1%, 13%, 12,9%, 12,8%, 12,7%, 12,6% ou 12,5%) que pode ser medido em combinação com a medição da quantidade de sucrosil-oligossacarídeo ou estaquiose ou outros componentes descritos aqui. Em contraste, a semente não modificada comparável pode ter um conteúdo de ácido palmítico de cerca de 10% ou 11% (tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 9%, 9,1%, 9,2%, 9,3%, 9,4%, 9,5%, 9,6%, 9,7%, 9,8%, 9,9% ou 10% e menos do que ou menos do que cerca de 12%, 11,9%, 11,8%, 11,7%, 11,6%, 11,5%, 11,4%, 11,3%, 11,2%, 11,1%, 11%, 10,9%, 10,8%, 10,7%, 10,6%, ou 10,5%).

[0078] Se uma DGAT, tal como a diacilglicerol aciltransferase 1 de soja descrita na Tabela 1, ou tal como diacilglicerol aciltransferase 2 de Yarrowia lipolytica, for expressa ou sobre-expressa em uma semente de soja, opcionalmente com uma ou mais sequências que resulta em supressão de GAS, a semente pode ter um conteúdo de ácido linoleico de cerca de 45% (tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 25%, 30%, 35%, 40% ou 45% e menos do que ou menos do que cerca de 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46% ou 45%) que pode ser medido em combinação com a medição da quantidade de sucrosil- oligossacarídeo, tal como estaquiose, ou sucrosil- oligossacarídeo ou outros componentes descritos aqui. Em contraste, a semente não modificada comparável pode ter um conteúdo de ácido linoleico de cerca de 55% (tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54% ou 55% e menos do que ou menos do que cerca de 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56% ou 55%).

[0079] Uma semente de soja modificada tal como uma semente de soja com atividade de diacilglicerol aciltransferase (DGAT) intensificada, tal como contendo uma DGAT1 de soja modificada, por exemplo descrita na Tabela 1, ou uma DGAT de levedura, tal como diacilglicerol aciltransferase 2 de Yarrowia lipolytica, opcionalmente com uma ou mais sequências modificadas que resulta em supressão de uma ou mais sequências de GAS, sequências de rafinose sintase ou ambas, pode ter um conteúdo de ácido linolênico de cerca de 5% ou 6% (tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 0,1%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5% ou 5% e menos do que ou menos do que cerca de 10%, 9%, 8%, 7,5%, 7%, 6,9%, 6,8%, 6,7%, 6,6%, 6,5%, 6,4%, 6,3%, 6,2%, 6,1% ou 6%) que pode ser medido em combinação com a medição da quantidade de sucrosil-oligossacarídeo ou estaquiose ou outros componentes descritos aqui. Uma semente de soja modificada tal como uma semente de soja com um ou mais genes FAD3 modificados, tal como por mutação, edição do genoma ou transgenes, sozinhos ou em combinação com uma ou mais de DGAT, GAS, rafinose sintase e sequências de FAD, pode ter um conteúdo de ácido linolênico de não mais do que cerca de 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5% ou 3% (tal como pelo menos cerca de ou pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5% ou 3% e menos do que 6%, 5,5%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,05%). Em contraste, a semente não modificada comparável pode ter um conteúdo de ácido linolênico de cerca de 7% ou 8% (tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 5%, 5,5%, 6%, 6,5% ou 7% e menos do que ou menos do que cerca de 12%, 11%, 10%, 9,5%, 9%, 8,5% ou 8%). O ácido linolênico pode ser adicionalmente reduzido em uma soja modificada por modificação de um ou mais alelos de FAD2 tal como descrito aqui.

[0080] Podem ser desenvolvidas impressões digitais no que concerne a composição de sementes com base na luz modificada da semente de soja, em que uma decisão de divisão é feita com base nas quantidades medidas de sucrosil-oligossacarídeos, em qualquer combinação com um ou mais dos ácidos graxos (tal como conteúdo de ácido oleico ou conteúdo de ácidos graxos saturados), conteúdo de óleo ou conteúdo de proteína na semente de soja. A medição combinada pode ser usada para aumentar a exatidão quanto a se uma semente é modificada ou não. Em algumas modalidades, a semente de soja pode conter baixo teor de sucrosil- oligossacarídeo e, por exemplo, elevado teor de óleo, elevado teor de proteína, um ou mais ácidos graxos alterados (aumentados ou diminuídos) ou uma sua combinação. Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui para dividir uma semente a partir de uma pluralidade de sementes incluem adicionalmente medir a quantidade de óleo, um ou mais ácidos graxos e/ou proteína na semente com base na luz modificada da semente de soja, em que uma diminuição na quantidade de sucrosil-oligossacarídeo se correlaciona com um aumento no conteúdo de óleo, proteína, ácidos graxos alterados ou sua combinação na semente de soja.

[0081] Valores limiares para um ou mais componentes podem ser úteis para determinar se uma soja é modificada ou não modificada. O valor limiar para um componente medido em uma soja é um valor selecionado para facilitar a distinção, divisão ou separação de uma soja, tal como uma soja modificada, tendo uma quantidade ou concentração do componente que é diferente (por exemplo, uma quantidade ou concentração significativamente mais elevada ou mais baixa desse componente) de outra soja, tal como uma soja não modificada.

[0082] O valor limiar pode variar dependendo do conteúdo de umidade da soja e pode ser definido ou ajustado até 13% de umidade. Os valores para sucrosil-oligossacarídeos, estaquiose, rafinose, óleo, proteína, carboidratos solúveis totais, sacarose e PROIL são proporcionados em pontos percentuais com base na percentagem em peso (% em peso). Para os ácidos graxos, tais como um ou mais de ácido oleico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, os valores descritos são expressos como uma percentagem desse ácido graxo em relação ao agrupamento total de ácidos graxos.

[0083] Para sucrosil-oligossacarídeo (uma combinação de estaquiose e rafinose), o valor limiar inclui valores a, cerca de, pelo menos ou pelo menos cerca de 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,5%, 1%, 1,25%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0% de sucrosil- oligossacarídeo e a, cerca de, menos do que ou menos do que cerca de 5,0%, 4,5%, 4,0%, 3,9%, 3,8%, 3,7%, 3,6%, 3,5%, 3,4%, 3,3%, 3,2%, 3,1%, 3,0%, 2,9%, 2,8%, 2,7%, 2,6%, 2,5%, 2,4%, 2,3%, 2,2%, 2,1%, 2,0%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3% ou 0,2% de sucrosil-oligossacarídeo.

[0084] O limiar para estaquose para distinguir entre a semente modificada e não modificada pode ser cerca de 1%, 1,5%, 2% ou 2,5%, tal como pelo menos cerca de 0,1%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5% ou 5% de estaquiose e menos do que cerca de 6,0%, 5,5%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3% ou 0,2% de estaquiose.

[0085] O limiar para rafinose para distinguir entre a semente modificada e não modificada pode ser cerca de 0,7% de rafinose tal como pelo menos cerca de 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, ou 1% de rafinose e menos do que cerca de 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1%, 0,9%, 0,8% ou 0,7% de rafinose.

[0086] O valor limiar para óleo para auxiliar em distinguir entre semente modificada e não modificada pode ser a ou cerca de 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% ou 25%, com a semente modificada, tal como descrita aqui, contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 19%, 19,5%, 20%, 20,5%, 21%, 21,5%, 22%, 22,5%, 23%, 23,5%, 24%, 24,5%, 25%, 26%, 27%, 28% ou 29% de óleo e menos do que ou menos do que cerca de 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24,5%, 24%, 23,5%, 23%, 22,5%, 22%, 21,5%, 21%, 20,5% ou 20% de óleo e a soja não modificada ou nula comparável contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5% ou 18% de óleo e menos do que ou menos do que cerca de 23%, 22,5%, 22%, 21,5%, 21%, 20,5%, 20%, 19,5%, 19%, 18,5%, 18%, 17,5% ou 17% de óleo. O valor limiar para óleo inclui valores de pelo menos ou pelo menos cerca de 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, 20%, 20,5%, 21%, 21,5%, 22%, 22,5%, 23%, 23,5% ou 24% de óleo e menos do que ou menos do que cerca de 26%, 25,5%, 25%, 24,5%, 24%, 23,5%, 23%, 22,5%, 22%, 21,5%, 21%, 20,5%, 20%, 19,5%, 19%, 18,5% ou 18% de óleo.

[0087] O valor limiar para proteína total para distinguir entre a semente modificada e não modificada pode ser a ou cerca de 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37% ou 38%, com a soja modificada, tal como descrita aqui, contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% ou 50% proteína e menos do que ou menos do que cerca de 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41% ou 40% de proteína e a soja não modificada ou nula comparável contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36% ou 37% de proteína e menos do que ou menos do que cerca de 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33% ou 32% de proteína. O valor limiar para proteína inclui valores de pelo menos 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47% ou 48% de proteína e menos do que ou menos do que cerca de 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34% ou 33% de proteína.

[0088] Para ácido palmítico, um limiar adequado pode ser a ou cerca de 10,5% ou 11%, com a soja modificada tal como descrita aqui contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 10,5%, 11%, 12% ou 13% e menos do que ou menos do que cerca de 20%, 15%, 14% ou 13% de ácido palmítico e a soja não modificada ou nula comparável contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 5%, 7%, 8%, 9% ou 10% e menos do que ou menos do que cerca de 11%, 10,5%, 10%, 9%, 8% ou 7% de ácido palmítico. O valor limiar para ácido palmítico inclui valores a, cerca de, pelo menos ou pelo menos cerca de 8%, 9%, 10%, 10,5%, 11% ou 12% e a, cerca de, menos do que ou menos do que 15%, 14%, 13%, 12%, 11% ou 10,5%.

[0089] Para ácido esteárico, um valor limiar adequado pode ser a ou cerca de 4,5%, com a soja modificada tal como descrita aqui contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 4,5%, 5%, 5,5% ou 6% de ácido esteárico e menos do que ou menos do que cerca de 10%, 9%, 8% ou 7% de ácido esteárico e a soja não modificada ou nula comparável contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 2%, 2,5%, 3%, 3,5% ou 4% de ácido esteárico e menos do que ou menos do que cerca de 4,5%, 4%, 3,5%, 3% ou 2,5% de ácido esteárico. O valor limiar para ácido esteárico inclui valores a, cerca de, pelo menos ou pelo menos cerca de 3%, 3,5%, 4%, 4,5% ou 5% e a, cerca de, menos do que ou menos do que 6%, 5,5%, 5%, 4,5%, 4% ou 3,5%.

[0090] Para ácido oleico, um limiar adequado pode ser a ou cerca de 28%, com a soja modificada tal como descrita aqui contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 28%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ou 85% de ácido oleico e menos do que ou menos do que cerca de 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% ou 30% de ácido oleico e a soja não modificada ou nula comparável contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25% ou 27% de ácido oleico e menos do que ou menos do que cerca de 28%, 25%, 20% ou 15% de ácido oleico. O valor limiar para ácido oleico inclui valores a, cerca de, pelo menos ou pelo menos cerca de 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% ou 25% e a, cerca de, menos do que ou menos do que 75%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30% ou 28%.

[0091] Para ácido linoleico, um valor limiar adequado pode ser a ou cerca de 50%, com a soja modificada tal como descrita aqui contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% de ácido linoleico e menos do que ou menos do que cerca de 60%, 55%, 50%, 45%, 40% ou 35% de ácido linoleico e a soja não modificada ou nula comparável contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 50%, 55% ou 60% de ácido linoleico e menos do que ou menos do que cerca de 65%, 60%, 55% ou 50% de ácido linoleico. O valor limiar para ácido linoleico inclui valores a, cerca de, pelo menos ou pelo menos cerca de 45%, 50% ou 55% e a, cerca de, menos do que ou menos do que 60%, 55% ou 50%.

[0092] Para ácido linolênico, um valor limiar adequado pode ser a ou cerca de 6,5%, com a soja modificada tal como descrita aqui contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5% ou 6% de ácido linolênico e menos do que ou menos do que cerca de 6,5%, 6%, 5,5%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5% ou 1% de ácido linolênico e a soja não modificada ou nula comparável contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5% ou 9% de ácido linolênico e menos do que ou menos do que cerca de 10%, 9,5%, 9%, 8,5%, 8%, 7,5% ou 7% de ácido linolênico. O valor limiar para ácido linolênico inclui valores a, cerca de, pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5% ou 6% e a, cerca de, menos do que ou menos do que 10%, 9,5%, 9%, 8,5%, 8%, 7,5%, 7% ou 6,5%.

[0093] Para ácidos graxos saturados totais (ácido esteárico mais ácido palmítico), um valor limiar adequado pode ser a ou cerca de 15,5%, com a soja modificada tal como descrita aqui contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 15,5%, 16%, 16,5%, 17 %, 17,5%, 18%, 18,5%, 19% ou 19,5% de ácidos graxos saturados totais e menos do que ou menos do que cerca de 30%, 25%, 20%, 19%, 18%, 17% ou 16% de ácidos graxos saturados totais e a soja não modificada ou nula comparável contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 9%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5% ou 15% de ácidos graxos saturados totais e menos do que ou menos do que cerca de 15,5%, 15%, 14,5%, 14%, 13,5%, 13%, 12,5%, 12%, 11,5%, 11%, 10,5% ou 10% de ácidos graxos saturados totais. O valor limiar para ácidos graxos saturados totais inclui valores a, cerca de, pelo menos ou pelo menos cerca de 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, ou 15% e a, cerca de, menos do que ou menos do que 10%, 9,5%, 9%, 8,5%, 8%, 7,5%, 7% ou 6,5%.

[0094] Em algumas modalidades, os feijões de soja podem ser modificados para ter ácidos graxos saturados totais (ácido esteárico mais ácido palmítico) mais baixos do que feijões de soja modificados, tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 4%, 5%, 6% ou 7% de ácidos graxos saturados totais e menos do que cerca de 15%, 12%, 10%, 9%, 8% ou 7% com um valor limiar de a, cerca de, pelo menos ou pelo menos cerca de 5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12% ou 12,5% e a, cerca de, menos do que ou menos do que cerca de 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, ou 8%.

[0095] Para carboidrato solúvel total, um valor limiar adequado pode ser a ou cerca de 9%, com a soja modificada tal como descrita aqui contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8% ou 8,5% de carboidrato solúvel total e menos do que ou menos do que cerca de 6,5%, 6%, 5,5%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5% ou 1% de carboidrato solúvel total e a soja não modificada ou nula comparável contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12% ou 12,5% de carboidrato solúvel total e menos do que ou menos do que cerca de 15%, 14%, 13%, 12,5%, 12%, 11,5%, 11%, 10,5%, 10% ou 9,5% de carboidrato solúvel total. O valor limiar para carboidrato solúvel total inclui valores a, cerca de, pelo menos ou pelo menos cerca de 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5% ou 9% e a, cerca de, menos do que ou menos do que 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12% ou 12,5%.

[0096] Para sacarose, um valor limiar adequado pode ser a ou cerca de 3,8%, com a soja modificada tal como descrita aqui contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% ou 3,5% de sacarose e menos do que ou menos do que cerca de 3,8%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1% ou 0,5% de sacarose e a soja não modificada ou nula comparável contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 3,8%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5% ou 6% de sacarose e menos do que ou menos do que cerca de 7%, 6,5%, 6%, 5,5%, 5%, 4,5% ou 4% de sacarose. O valor limiar para sacarose inclui valores a, cerca de, pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% ou 3,5% e a, cerca de, menos do que ou menos do que 6%, 5,5%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3% ou 2,5%.

[0097] Para a soma de conteúdo de óleo e proteína, também referida como o conteúdo de PROIL, um valor limiar adequado pode ser a ou cerca de 54%, com a soja modificada tal como descrita aqui contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62% ou 63% de PROIL e menos do que ou menos do que cerca de 70%, 65%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56% ou 55% de PROIL e a soja não modificada ou nula comparável contendo pelo menos ou pelo menos cerca de 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52% ou 53% de PROIL e menos do que ou menos do que cerca de 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50% ou 49% de PROIL. O valor limiar para PROIL inclui valores a, cerca de, pelo menos ou pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54% ou 55% e a, cerca de, menos do que ou menos do que 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56% ou 55%.

[0098] Exemplos úteis de aumentos de pontos percentuais em PROIL em uma semente, tal como uma semente de soja modificada, em comparação com uma soja comparável ou de controle incluem, mas não estão limitados a, aumento de pontos percentuais de pelo menos ou pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% e menos do que ou menos do que cerca de 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 65% 60%, 55%, 50%, 45% ou 40%.

[0099] Os métodos podem ser usados para sementes de plantas com dois, três, quatro, cinco ou dez ou mais transgenes ou modificações genéticas, em que o acúmulo ou empilhamento de regiões transgênicas ou modificações genéticas em plantas ou linhas é alcançado por adição de transgenes por transformação, por edição do genoma, por cruzamento de plantas genitoras ou linhas contendo diferentes regiões transgênicas ou modificações ou qualquer sua combinação. Podem ser conduzidas análises para selecionar sementes individuais com base na presença de uma ou mais características associadas a pelo menos um transgene ou modificação. Tais características incluem, mas não estão limitadas a, uma composição de semente, um transgene per se, um marcador genético ligado a um transgene ou modificação, mRNA expresso a partir de um transgene ou modificação e um produto de proteína de um transgene ou região ou gene modificado.

[0100] Os métodos e sistemas proporcionados aqui podem incluir o passo de confirmar um fenótipo, por exemplo, extraindo ou isolando ácidos nucleicos, tais como DNA, de uma semente ou população de sementes e usando técnicas genéticas apropriadas para analisar ou detectar o genótipo. Tais técnicas genéticas incluem, por exemplo, contatar ácidos nucleicos isolados ou extraídos com um ou mais marcadores genéticos, a detecção de polimorfismos de nucleotídeo único, repetições de sequência simples, polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição, haplótipos, SNP de marcador, alelos de marcadores genéticos, genes, sequências derivadas de DNA, sequências derivadas de RNA, promotores, regiões não traduzidas 5' de genes, regiões não traduzidas 3' de genes, microRNA, siRNA, loci de traços quantitativos (QTL), marcadores satélite, transgenes, mRNA, ds mRNA, perfis transcricionais e padrões de metilação. Exemplos de análises genéticas para identificar ou selecionar sementes para integração de traços incluem, sem limitação, identificação de frequências muito recorrentes de alelos genitores, rastreamento de transgenes de interesse ou rastreio quanto à ausência de transgenes indesejados, seleção de semente de testes híbridos, seleção de semente expressando um gene de interesse, seleção de semente expressando um fenótipo hereditário, identificação de semente com loci genéticos selecionados e teste da zigosidade.

[0101] A avaliação de sementes de soja de acordo com os métodos e sistemas proporcionados pode ser também feita rapidamente, com uma medição exata da composição, tal como a quantidade de sucrosil-oligossacarídeos, da soja única ou um lote de feijões de soja alcançada em menos do que 5, 4, 3, 2 ou 1 minuto ou menos do que um segundo após início do método. Por exemplo, usando FT-NIR, até 100 g (cerca de 400 a 500) sementes de soja como um lote único podem ser medidos em menos do que 3, 2 ou 1 minuto, por exemplo, em cerca de 1 a 2 minutos ou 1 a 3 minutos. Por exemplo, usando NIT, até 500 g (cerca de 2,500) sementes de soja podem ter a composição de sementes, incluindo sucrosil-oligossacarídeos, medida em menos do que 3, 2 ou 1 minuto, por exemplo, em cerca de 0,5 a 1 minuto, 0,5 a 2 minutos, 0,5 a 3 minutos ou 0,5 a 5 minutos. Por exemplo, usando SS-NIR, uma semente única pode ser medida em cerca de 1 ou 2 minutos, tal como 0,5 a 3 minutos, 0,5 a 4 minutos ou 0,5 a 5 minutos. Usando SS-NIR, uma semente única pode ser também medida em menos do que um segundo, tal como pelo menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 sementes de soja por segundo e menos do que cerca de 1000, 500, 400, 300, 200 ou 100 sementes por segundo.

[0102] Os métodos e sistemas proporcionados aqui podem intensificar a eficiência e facilitar a elevada produtividade de divisão e seleção de semente e plantas cultivadas a partir da semente com um traço desejado.

[0103] Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui são usados em programas transgênicos, de modificação do genoma ou melhoramento de investigação onde o tamanho da amostra pode ser limitado, tal como uma semente única de uma planta segregante e quando são requeridas sementes viáveis intatas para propagação e avanço. Em algumas modalidades, os métodos são usados para análise de sementes onde métodos analíticos destrutivos não são desejáveis porque são requeridas sementes intatas para processamento ou quando não existe tempo suficiente para realizar análise destrutiva.

[0104] A semente de descendência pode ser selecionada, engrossada e usada para fazer cruzamentos de melhoramento adicionais ou em investigação adicional. A semente de descendência pode ser sujeita aos métodos de análise não destrutiva proporcionados aqui.

[0105] É também proporcionado um método para produzir uma planta de soja com um ou mais traços desejados, p.ex., transgenes ou modificações. Plantas de soja dadoras para uma linha genitora contendo o traço desejado são selecionadas. O material vegetal selecionado pode representar, entre outros, uma linha isogênica, uma linha híbrida, uma população heterogênea de plantas de soja ou uma planta individual. De acordo com técnicas bem conhecidas na técnica de melhoramento de plantas, a linha genitora dadora é cruzada com uma segunda linha genitora. Em algumas modalidades, a segunda linha genitora é uma linha de elevado rendimento. Este cruzamento produz uma população de plantas segregantes composta por plantas geneticamente heterogêneas. As sementes de plantas da população de plantas segregantes são rastreadas quanto ao traço desejado usando os métodos analíticos como divulgados aqui. Melhoramento adicional pode incluir, entre outras técnicas, cruzamentos adicionais com outras linhas, híbridos, retrocruzamento ou autocruzamento. O resultado é uma linha de plantas de soja que tem o traço desejável e opcionalmente tem também outros traços desejáveis de uma ou mais outras linhas de soja.

[0106] Os métodos e sistemas proporcionados aqui proporcionam uma capacidade aumentada de avaliar um número maior de populações de melhoramento por unidade de campo e capacidade aumentada de analisar populações de melhoramento quanto a traços desejados antes do plantio. Por exemplo, os métodos e sistemas permitem que um criador analise pelo menos 100, 250, 500 ou 1,000 sementes e divida ou selecione as 5, 10, 25 ou 50 sementes desejadas daquela população para plantio sem ter de plantar, avaliar, marcar e amostrar a população original de 100, 250, 500 ou 1,000 sementes. Tamanhos muito grandes de amostras podem ser processados rapidamente por análise de semente única ou a granel, tal como pelo menos cerca de 1 kg, 5 kg, 10 kg, 100 kg, 500 kg, 1000 kg, 1500 kg, 2000 kg, 3000 kg, 4000 kg ou 5000 kg de sementes de soja por hora e menos do que 25,000 kg, 20,000 kg, 15,000 kg, 10,000 kg, 7,500 kg, 5,000 kg, 2,000 kg, 1000 kg, 500 kg, 100 kg, 10 kg ou 5 kg sementes de soja por hora.

[0107] Os métodos e sistemas proporcionados aqui permitem adicionalmente garantia de qualidade (QA) e controle de qualidade (QC) assegurando que as sementes de soja estão isentas de transgenes regulados ou indesejados, traços genéticos indesejáveis ou fenótipos herdados indesejáveis identificando tais fenótipos e descartando tal semente.

[0108] As sementes de soja que podem ser usadas podem adicionalmente conter traços agronômicas desejáveis que intensificam a produção e consistência da produção de grão de soja, tal como tolerância a herbicidas, resistência a doenças, resistência a insetos, rendimento de grãos aumentado, conteúdo nutricional aumentado, taxas de crescimento aumentadas, tolerância ao estresse intensificada, maturidade alterada e suas combinações. Traços de qualidade tais como teor mais elevado de óleo, teor mais elevado de proteína, modificações em aminoácidos essenciais e mudanças composicionais de proteínas, mudanças na composição de óleos, traços nutricionais tais como vitaminas e traços com usos industriais incluindo biodiesel, biolubrificantes e polímeros podem ser também identificados e selecionados.

[0109] Os métodos e sistemas podem ser usados em um programa de melhoramento de plantas que seleciona plantas ou sementes tendo um traço genético ou fenotípico desejado, em que um traço genético desejado inclui um ou mais de um genótipo, um haplótipo, um alelo, uma sequência, um perfil de transcrito e um padrão de metilação. Os métodos e sistemas podem ser adicionalmente usados em combinação com métodos de melhoramento de plantas em que uma semente única selecionada ou dividida é cruzada ou retrocruzada e é gerada uma única geração ou múltiplas gerações de plantas de descendência. A semente das plantas de descendência pode ser processada de acordo com os métodos descritos aqui. Os passos de cruzamento e retrocruzamento da primeira e subsequente geração de plantas e sementes de descendência podem ser levados a cabo em qualquer combinação. A escolha do método de melhoramento depende do modo de reprodução das plantas, da hereditariedade dos(s) traços(s) sendo melhorado(s) e do tipo de cultivar usado comercialmente (p.ex., cultivar híbrida, cultivar de linha pura, etc.). Abordagens não limitantes, selecionadas para melhorar as plantas são apresentadas em baixo. É adicionalmente entendido que quaisquer linhas de soja, variedades ou cultivares podem ser utilizadas em um programa de melhoramento. Fatores incluindo, por exemplo, sem limitação, vigor de emergência, vigor vegetativo, tolerância ao estresse, resistência a doenças, ramificação, floração, conjunto de sementes, tamanho das sementes, densidade das sementes, capacidade de ficar em pé e capacidade de debulhação podem ser selecionados para uso no programa de melhoramento.

[0110] Em algumas modalidades, a identidade da semente única da semente é preservada. Vários métodos de preservar a identidade de semente única podem ser usados enquanto se transfere ou transporta a semente da localização da semente, tal como na ou após a coleta, para a localização onde a análise é conduzida, até à localização no campo ou estufa onde as plantas selecionadas são para ser cultivadas. Os métodos incluem, mas não estão limitados a, transferência de indivíduos selecionados para banda de sementes, uma bandeja de cassete ou bandeja de indexação, transplante com vasos de turfa e plantio manual a partir de pacotes individuais de sementes.

[0111] O aparelho, dispositivo, sistema ou método para medir e dividir sementes pode compreender ou usar um sistema de transporte que suporta pelo menos uma semente de cada vez e expõe a pelo menos uma semente a um dispositivo de interrogação óptica ou um sistema de visualização, tal como NIT, NIR ou FT-NIR, que captura pelo menos uma imagem de infravermelho próximo da pelo menos uma semente. O sistema de visualização pode ser configurado para medir exatamente a quantidade de um ou mais sucrosil- oligossacarídeos na primeira semente em comparação com o método analítico de referência padrão proporcionado aqui. O aparelho, dispositivo, sistema ou método pode incluir um controlador eletrônico que toma uma decisão de divisão com pelo menos dois resultados de divisão no que concerne a semente com base na luz modificada, imagem ou espectro no infravermelho próximo obtido a partir da semente e um sistema de divisão para alterar o caminho da semente com base na decisão de divisão, em que o controlador eletrônico associa um primeiro resultado de divisão à primeira semente e o controlador eletrônico associa um segundo resultado de divisão à segunda semente. A semente contendo baixas quantidades de sucrosil-oligossacarídeos abaixo de (ou a) um valor limiar pode ser separada da semente contendo quantidades mais elevadas de sucrosil-oligossacarídeos acima do (ou ao) valor limiar. Por exemplo pode ser alcançada maior confiança nas decisões de divisão combinando o valor limiar de sucrosil- oligossacarídeos com um valor limiar para uma ou mais percentagens de ácidos graxos, conteúdo de óleo ou proteína alterado, tal como aumentado, mudanças nos níveis de açúcares solúveis ou uma sua combinação. Cada um destes parâmetros pode ser medido a partir dos mesmos espectros de infravermelho próximo capturados a partir de uma semente única, sementes a granel ou farelo de soja.

[0112] Em algumas modalidades, um método para determinar a quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo em uma única semente de soja ou uma amostra de sementes de soja intatas compreende direcionar luz de uma fonte de luz para uma semente ou sementes de soja para formar luz modificada a partir da semente ou sementes de soja; receber a luz modificada em um dispositivo de imagens, tal como capturar os espectros de absorção no infravermelho próximo, e medir a quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo na semente ou sementes com base na luz modificada recebida, sendo a quantidade de sucrosil- oligossacarídeo medida até uma exatidão de acordo com o método analítico de referência padrão proporcionado aqui.

[0113] O dispositivo de imagens pode ser um espectrômetro no infravermelho comercialmente disponível, incluindo, por exemplo, um espectrômetro de infravermelho, um espectrofotômetro de infravermelho com transformada de Fourier ou um espectrofotômetro com um difusor e matriz de filtros e lentes tal como descrito nas Patentes dos EUA Nos. 9,500,523, 9,383,258, 9,377,396 e 9,291,504, ou um dispositivo de divisão de sementes tal como descrito na Patente dos EUA N.° 8,907,241 ou um dispositivo útil para análise de sementes únicas tal como descrito na Patente dos EUA N.° 8,965,060.

[0114] Em algumas modalidades, um método para processar sementes ou para determinar a quantidade de um sucrosil- oligossacarídeo em uma semente de soja compreende direcionar luz de uma fonte de luz para uma semente de soja individual para formar luz modificada a partir da semente de soja; receber a luz modificada em um dispositivo de imagens; e medir a quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo na semente com base na luz modificada recebida, sendo a quantidade de sucrosil- oligossacarídeo medida até uma exatidão que está dentro dos parâmetros proporcionados aqui. A semente pode ser transportada para uma primeira localização quando a quantidade de sucrosil- oligossacarídeo medida estiver abaixo de um valor limiar e transporte da semente para uma segunda localização diferente quando a quantidade de sucrosil-oligossacarídeo medida estiver no ou acima do valor limiar. A semente pode ser separada em semente modificada e não modificada em que a quantidade de sucrosil-oligossacarídeo, tal como estaquiose ou uma combinação de estaquiose e rafinose, difere entre a semente modificada e não modificada como descrito aqui.

[0115] Em algumas modalidades, o método ou sistema inclui um método ou sistema automatizado, em que uma semente é separada de uma pluralidade de sementes antes de se direcionar a luz de uma fonte de luz para uma semente de soja individual para formar luz modificada a partir da semente de soja. A fonte de luz pode estar compreendida em um dispositivo ou sistema de interrogação óptica e compreende luz infravermelha próxima tal como uma fonte de luz de amplo espectro ou uma fonte de luz no infravermelho próximo. O sistema automatizado pode incluir um sistema de transporte para transportar sementes separadas para o dispositivo de interrogação óptica e para transportar as sementes para uma, duas, três ou mais localizações diferentes com base na composição da semente medida pelo dispositivo de interrogação óptica. As sementes individuais podem ser automaticamente transportadas para uma primeira estação para receber luz onde a luz é direcionada de uma fonte de luz na semente de soja individual em uma primeira estação para formar luz modificada, a luz modificada da semente de soja é recebida em um dispositivo de imagens e a quantidade de um ou mais sucrosil-oligossacarídeos na semente medida com base na luz modificada, até uma exatidão como proporcionada aqui. O método pode adicionalmente compreender, após a medição da quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo, transporte da semente para uma primeira localização quando a quantidade de sucrosil- oligossacarídeo medida estiver abaixo de um valor limiar e transporte da semente para uma segunda localização diferente quando a quantidade de sucrosil-oligossacarídeo medida estiver no ou acima do valor limiar. Todos os passos prévios podem ser repetidos para uma segunda semente individual e sementes individuais subsequentes.

[0116] Em algumas modalidades, uma pluralidade de sementes a serem medidas como sementes únicas ou como uma amostra de sementes intatas inclui sementes tanto modificadas como não modificadas como descritas aqui, em que as sementes modificadas são transportadas para a primeira localização e as sementes não modificadas são transportadas para a segunda localização com base nas diferenças de composição detectadas pelo dispositivo de interrogação óptica. Os passos de dividir uma semente a partir de uma pluralidade de sementes e levar a cabo este método como divulgado aqui podem ser repetidos para pelo menos uma segunda, terceira ou quarta semente. Em algumas modalidades, as sementes são selecionadas ou separadas dependendo da composição medida usando os métodos descritos aqui.

[0117] Os métodos são adequados para medir e processar tamanhos pequenos e grandes de amostras. Em algumas modalidades, uma amostra ou população de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ou 50 sementes e menos do que 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70 ou 60 sementes inteiras, intatas e/ou viáveis é avaliada em conjunto como um lote de sementes nos métodos e sistemas proporcionados. Em algumas modalidades, uma amostra de sementes de pelo menos 1 g, 5 g, 10 g, 100 g, 150 g, 200 g, 250 g ou 300 g e sementes inteiras, intatas e/ou viáveis de menos do que 5000 g, 2000 g, 1000 g, 900 g, 800 g, 700 g, 600 g ou 500 g é avaliada em conjunto como um lote de sementes nos métodos e sistemas proporcionados. Em algumas modalidades, pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 500 ou 1000 e menos do que 1,000,000, 500,000,100,000, 75,000, 50,000, 25,000, 10,000, 5,000, 2,500, 1,000, 500, 250, 100, 75, 50 ou 25 lotes de sementes individuais, sementes, farelos ou flocos de soja ou populações de sementes são medidos.

[0118] Os métodos e sistemas proporcionados podem ser usados para analisar sementes individuais ou amostras de lotes de sementes dentro de uma população de sementes para medir uma ou mais diferenças composicionais em um ou mais componentes da semente ou sementes.

[0119] Após a medição da composição das sementes, por exemplo, a quantidade de sucrosil-oligossacarídeo, óleo, proteína, açúcares, amido, carboidrato, fibra ou sua combinação, as sementes de soja podem ser processadas. Os passos de processamento podem incluir um ou mais de descasque dos feijões de soja, extração de óleo, por exemplo pelo uso de solventes, processamento de flocos de soja até farelo de soja para ração animal, trituração de flocos de soja para produzir farinha de soja, dimensionamento de flocos de soja para produzir grãos de soja ou texturização de flocos de soja para produzir proteína vegetal texturizada. Concentrados de proteína de soja e proteína de soja isolada podem ser adicionalmente refinados e produzidos a partir de flocos de soja. Os métodos e sistemas proporcionados podem incluir o passo de processar os feijões de soja até farelo sem a necessidade de descasque, com base no baixo conteúdo de carboidratos não digeríveis, incluindo uma ou mais de estaquiose e rafinose. A composição dos feijões de soja pode ser exatamente medida no campo ou no elevador de grãos para facilitar decisões de processamento em uma larga escala. O farelo de proteína pode ser exatamente medido nas fábricas de processamento de grãos para determinar a qualidade e valor do farelo.

[0120] Algumas modalidades incluem métodos e sistemas para selecionar uma planta ou semente de planta, compreendendo direcionar luz de uma fonte de luz para uma semente de soja individual para formar luz modificada a partir da semente de soja; receber a luz modificada em um dispositivo de imagens; medir a quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo na semente com base na luz modificada recebida, sendo a quantidade de sucrosil- oligossacarídeo medida até uma exatidão que está dentro de uma quantidade medida usando os métodos analíticos de referência padrão como proporcionados aqui; transportar a semente para uma primeira localização quando a quantidade de sucrosil- oligossacarídeo medida estiver abaixo de um valor limiar e transportar a semente para uma segunda localização diferente quando a quantidade de sucrosil-oligossacarídeo medida estiver no ou acima do valor limiar. A semente da primeira localização e/ou da segunda localização pode ser cultivada para produzir uma planta que pode ser cruzada com uma planta diferente ou autofecundada/deixada a se autofecundar. A semente de descendência produzida a partir da semente na primeira localização pode conter uma quantidade ou concentração de sucrosil-oligossacarídeo mais baixa ou reduzida, quando comparada com a semente de descendência produzida a partir da semente na segunda localização. A semente transportada para a primeira ou segunda localização e produzida através de cruzamento ou autofecundação pode ser transgênica ou não transgênica e pode compreender pelo menos um construto recombinante no genoma ou pode não compreender um construto recombinante no genoma. As sementes selecionadas pelos métodos como divulgados aqui podem ser adicionalmente selecionadas e usadas em melhoramento.

[0121] Algumas modalidades incluem métodos para selecionar sementes, compreendendo os métodos dirigir luz de uma fonte de luz para uma semente de soja individual para formar luz modificada a partir da semente de soja recebendo a luz modificada em um dispositivo de imagens medindo a quantidade de um sucrosil- oligossacarídeo na semente com base na luz modificada recebida, sendo a quantidade de sucrosil-oligossacarídeo medida até uma exatidão que está dentro de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, ou 2 pontos percentuais da quantidade medida usando o método analítico de referência padrão; e transportar a semente para uma primeira localização quando a quantidade de sucrosil- oligossacarídeo medida estiver abaixo de um valor limiar e transportar a semente para uma segunda localização diferente quando a quantidade de sucrosil-oligossacarídeo medida estiver no ou acima do valor limiar. O modo de divisão como divulgado aqui pode adicionalmente compreender cultivar uma planta a partir da semente dividida e cruzar a planta consigo própria ou uma planta diferente e usar a semente e a planta em um programa de melhoramento como proporcionado aqui.

[0122] Qualquer semente, incluindo sementes de monocot e dicot, pode ser adaptada para ser utilizada em um método, sistemas ou dispositivo proporcionado aqui. A semente pode ser, por exemplo, semente de alfafa, semente de maça, semente de banana, semente de cevada, semente de feijão, semente de brócolis, semente de mamona, semente de citrino, semente de trevo, semente de coco, semente de café, semente de milho, sementes de pepino, semente de abeto de Douglas, semente de Eucalipto, semente de pinheiro Loblolly, semente de linhaça, semente de melão, semente de aveia, semente de oliveira, semente de palma, semente de ervilha, semente de amendoim, semente de pimenta, semente de choupo, semente de pinheiro Radiata, semente de colza, semente de arroz, semente de centeio, semente de sorgo, semente do pinheiro do Sul, semente de soja, semente de morango, semente de beterraba-sacarina, semente de cana-de-açúcar, semente de girassol, semente de liquidâmbar, semente de chá, semente de tabaco, semente de tomate, sementes de turfa, semente de trigo e semente de Arabidopsis.

[0123] Dependendo da composição da semente, a semente pode ser descartada antes do plantio ou plantada tal como quando está sendo usada em um programa de melhoramento de plantas, ou pode ser direcionada para uma fábrica ou processo de processamento apropriado se a semente for coleta de uma cultura e destinada ao processamento. O processamento que pode ocorrer, dependendo da composição da semente, pode incluir ou excluir um ou mais dos passos de descasque, extração de óleo, processamento de farelo e produção de proteína a partir da soja. Em geral, o óleo de soja é produzido a partir de soja limpa, temperada, descascada e em flocos usando extração com solvente (hexano) ou uma combinação de pressão física e/ou extração com solvente.

[0124] Os seguintes exemplos são apresentados de modo a ilustrar mais totalmente algumas modalidades da invenção. Não devem, de modo algum, ser interpretados, no entanto, como limitando o amplo escopo da invenção. Os peritos na técnica adotarão prontamente os princípios subjacentes desta descoberta para desenhar vários compostos sem se afastarem do espírito da corrente invenção.

EXEMPLOS

[0125] Nos seguintes Exemplos, as partes e percentagens são em peso e os graus são Celsius, a não ser que de outro modo afirmado. O significado das abreviaturas é como se segue: ”s” significa segundo(s), ”min” significa minuto(s), ”h” significa” hora(s), ”d” significa dia(s), ”μL” significa microlitro(s), ”mL” significa mililitro(s), ”L” significa litro(s), ”μM” significa micromolar, ”mM” significa milimolar, ”M” significa molar, ”mmol” significa milimole(s), ”μmol” significa micromole(s), ”g” significa grama(s), ”μg” significa micrograma(s), ”ng” significa nanograma(s), ”U” significa unidade(s), ”pb” significa par(es) de bases e ”kB” significa quilobase(s).

EXEMPLO 1 Criação de Eventos Tendo Diversidade Composicional

[0126] Linhas de soja tendo uma ampla gama de diversidade composicional foram criadas como descrito em baixo.

[0127] RNAi foi usado para silenciar a expressão de genes específica de sementes de ácido graxo dessaturase 2 (fad2) de soja para produzir feijões de soja com uma composição de óleo de sementes tendo ácido oleico aumentado de acordo com a Patente dos E.U.A. N.° 7,456,014.

[0128] RNAi foi usado para silenciar a expressão de genes específica de sementes de fosfoglucomutase (PGM) de soja para produzir feijões de soja com uma composição de óleo de sementes tendo óleo e proteínas aumentados de acordo com a Patente dos E.U.A. N.° 7,323,560.

[0129] RNAi compreendendo fragmentos de polinucleotídeos foram preparados para galactinol sintase 1 (GAS1), de acordo com a Patente dos E.U.A. N.° 5,648,210,galactinol sintase 2 (GAS2) de acordo com a Patente dos E.U.A. N.° 6,967,262 e galactinol sintase 3 (GAS3) de acordo com a Patente dos E.U.A. N.° 7,294,756. O uso de silenciamento específico de sementes da expressão de genes de galactinol sintases (GAS) de soja para produzir feijões de soja com um conteúdo de carboidratos rafinose e estaquiose diminuído e conteúdo de sacarose aumentado foi levado a cabo de acordo com PCT/US14/48825.

[0130] microRNAis artificiais (amiRNAs) foram usados para silenciar a expressão de genes específica de sementes de ácido graxo dessaturase 3 (fad3) de soja para produzir feijões de soja com uma composição de óleo de sementes tendo ácido alfa- linolênico diminuído de acordo com PCT/US13/22654 e PCT/US14/48825.

[0131] microRNAis artificiais (amiRNAs) foram usados para silenciar a expressão de genes específica de sementes de ácido graxo dessaturase 2 (fad2) de soja para produzir feijões de soja com uma composição de óleo de sementes tendo ácido oleico aumentado de acordo com PCT/US08/87082, PCT/US13/22654 e PCT/US14/48825.

[0132] microRNAis artificiais (amiRNAs) foram usados para silenciar a expressão de genes específica de sementes de ácido graxo tioesterase 2 (fatB) de soja para produzir feijões de soja com uma composição de óleo de sementes tendo ácidos palmítico e esteárico diminuídos de acordo com, por exemplo, PCT/US13/22654 e PCT/US14/48825. A combinação de amiRNAs em conjunto para silenciar múltiplos genes tais como fad2 e fatB foi levada a cabo de acordo com, por exemplo, PCT/US13/22654 e PCT/US14/48825.

[0133] Um gene da diacilglicerol aciltransferase 1 da soja modificado (GM-DGAT1-C9C10C11) sob controle de um promotor específico de sementes foi usado para produzir feijões de soja tendo teores mais elevados de óleo e proteína na semente de acordo com, por exemplo, patente dos E.U.A. US 8,101,819 e PCT/US14/48825.

[0134] Um gene da diacilglicerol aciltransferase 2 de Yarrowia lipolytica (YL-DGAT2) sob controle de um promotor específico de sementes foi usado para produzir feijões de soja tendo teores mais elevados de óleo e proteína na semente de acordo com a Patente dos E.U.A. N.° 8,143,473, Patente dos E.U.A. N.° 8,143,476 e em PCT/US14/48825.

[0135] YL-DGAT2, sob o controle de um promotor específico de sementes, foi combinado com amiRNA de fad3 sob controle de um promotor específico de sementes e com um cassete de RNAi de GAS sob controle de um promotor específico de sementes de acordo com PCT/US14/48825.

[0136] Um transportador de sacarose 4 da soja (GM-SUT4) sozinho ou em combinação com YL-DGAT2 sob controle de um promotor específico de sementes foi usado para produzir feijões de soja tendo teor mais elevado de óleo de semente como de acordo com a Patente dos E.U.A. N.° 8,993,840.

[0137] Uma proteína de desenvolvimento de óvulos 1 da soja (GM-ODP1) sozinha ou em combinação com YL-DGAT2 ou GM- DGAT1-C9C10C11 sob controle do promotor da sacarose sintase da soja foi usada para produzir feijões de soja tendo teores mais elevados de óleo e proteína na semente de acordo com PCT/US12/70828.

[0138] Mutações na via de sucrosil-oligossacarídeo, tal como low2 (mutante com expressão de rafinose sintase reduzida levando a baixos teores de estaquiose e rafinose e elevados teores de sacarose e galactinol) e low4 (mutante com mio- inositol-1P-sintase reduzida levando a baixos teores de estaquiose e rafinose) de acordo para a Patente dos EUA N.° 6,653,451.

[0139] Feijões de soja de mercadoria de tipo selvage foram também incluídos no conjunto de teste em conjunto com materiais nulos transgênicos (i.e., linhas que haviam sofrido o processo de transformação típico mas que foi descoberto, em análise subsequente, que não expressavam o traço de interesse). As variedades usadas incluíram uma ou mais das seguintes variedades comerciais ou públicas: 91M10, 92Y51, 92Y61, 93B67,93B68, 93B86, 93M02, 93M11, 93M12, 93Y21, 93Y30, 93Y41, 93Y42,93Y83, 93Y84, 94Y23, 95B34, 98Y11, ASGA232HS, EX82J07, JACK,P29T68PR, P32T80PR, SP6634911, YR25C09, YR37Y09.

[0140] Uma lista de nomes experimentais e os construtos de DNA correspondentes usados para criar eventos de soja tendo uma gama de composições como descrito aqui é mostrada na Tabela 2.

[0141] Tabela 2. Nomes experimentais e plasmídeos de DNA/fragmentos de DNA correspondentes usados para criar eventos de soja produzindo uma gama diversa de composições.

[0142] O plasmídeo Soil 2 PHP48070 contém as seguintes sequências notadas: Grampo de GAS a partir da posição: 13833-17206 de SEQ ID NO: 1, precursor de amiRNA específico de FAD2 a partir da posição: 6980-8557 de SEQ ID NO: 1 e o precursor de amiRNA específico de FAD3 a partir da posição: 10514-11472 de SEQ ID NO: 1.

[0143] O plasmídeo Soil 19 PHP50573 contém as seguintes sequências notadas: Grampo de GAS a partir da posição: 13809-17182 de SEQ ID NO: 2, precursor de amiRNA específico de FAD3 a partir da posição: 10490-11448 de SEQ ID NO: 2 e o YL-DGAT2 a partir da posição: 6996-8540 de SEQ ID NO: 2.

[0144] O plasmídeo Soil 91 PHP64612 contém as seguintes sequências notadas: Grampo de GAS a partir da posição: 15112-18485 de SEQ ID NO: 3, Gm_SUT4 a partir da posição: 12428-13945 de SEQ ID NO: 3, Gm_DGAT1 a partir da posição: 9879-11390 de SEQ ID NO: 3 e Gm_ODP1: a partir da posição: 6823-8058 de SEQ ID NO: 3.

[0145] O plasmídeo Soil 92 PHP64613 contém as seguintes sequências notadas: Grampo de GAS a partir da posição: 17136-18849 de SEQ ID NO: 4, Gm_SUT4 a partir da posição: 12961-14478 de SEQ ID NO: 4, Gm_DGAT1 a partir da posição: 9454-10998 de SEQ ID NO: 4 e Gm_ODP1: a partir da posição: 6823-8058 de SEQ ID NO: 4.

[0146] O plasmídeo Meal 18 PHP25066A contém as seguintes sequências notadas: Fragmentos de supressão de GAS a partir da posição: 76-2194 de SEQ ID NO: 5.

[0147] O plasmídeo Oil 119 PHP64207A contém as seguintes sequências notadas: Grampo de GAS a partir da posição: 10496-13869 de SEQ ID NO: 6, Gm_SUT4 a partir da posição: 78129329 de SEQ ID NO: 6 e Gm_DGAT1 a partir da posição: 5262-6773 de SEQ ID NO: 6.

[0148] O plasmídeo HOGAS PHP17734A contém as seguintes sequências notadas: Fragmentos de supressão de GAS a partir da posição: 1132-1977 de SEQ ID NO: 8 e um fragmento de supressão de FAD2 a partir da posição: 5376-5986 de SEQ ID NO: 8. O plasmídeo HOGAS PHP17522A (SEQ ID NO: 7) contém um marcador selecionável (resistência a herbicidas).

[0149] O plasmídeo Meal 34 PHP29252A contém a seguinte sequência notada: Estrutura em grampo de GAS/PGM a partir da posição: 2117-6630 de SEQ ID NO: 9. O plasmídeo Meal 34 PHP19031A (SEQ ID NO: 10) contém um marcador selecionável (resistência a herbicidas).

[0150] O plasmídeo Meal 36 PHP29882A contém a seguinte sequência notada: Grampo de PGM a partir da posição: 634-1973 de SEQ ID NO: 11. O plasmídeo Meal 36 PHP29959A contém a seguinte sequência notada: Grampo de GAS a partir da posição: 321-3694 de SEQ ID NO: 12.

[0151] Fragmentos de AscI foram preparados, transformados em soja usando bombardeamento com pistola de partículas, eventos foram selecionados, plantas cultivadas e sementes foram coletadas como descrito na Patente dos E.U.A, N.° 8,084,074 para experiências com bombardeamento aleatório de partículas [Meal18 (PHP25066A) ou Oil119 (PHP64207A)] e cobombardeamento aleatório de partículas [HOGAS (PHP17522A+PHP17734A), Meal34 (PHP29252A+PHP19031A) ou Meal36 (PHP29882A +PHP29959A)].

[0152] O evento alvo de SSI transgênica “A”, previamente descrito na Pat. dos E.U.A. N.° 8,293,533, foi transformado com os construtos dadores [Soil2 (PHP48070), Soil19 (PHP50573), Soil91 (PHP64612) ou Soil92 (PHP64613)] e o construto de FLP recombinase PHP44664 como previamente descrito em PCT/US14/48825 e eventos foram selecionados, plantas cultivadas e sementes foram coletadas como descrito previamente e na Patente dos E.U.A. N.° 8,084,074.

EXEMPLO 2 Química de Referência para Desenvolvimento de Modelos Composicionais de Sementes Únicas. 2.1. Preparação de Amostras para Química de Referência de Sementes Únicas.

[0153] Uma semente de soja única foi colocada em um frasco de policarbonato de ^ x 2” da Spex Certiprep com tampa (cat# 3116PC). Um aparelho de bolas de aço inoxidável 3/8” foi adicionado. A trituração foi realizada em um 2000 Geno/Grinder da Spex Certiprep a 1500 batidas/min durante três intervalos de 30 segundos com um repouso de 1 min entre cada ciclo.

2.2. Extração de Lipídeos e Carboidratos Não Estruturais; determinações de perfis de Ácidos graxos GC

[0154] As determinações de óleo quantitativas foram realizadas (nas amostras de semente tanto inteira como triturada) por RMN (ver em baixo). Os extratos de lipídeos dos pós de sementes únicas foram usados meramente para determinar os perfis de ácidos graxos. Três extrações replicadas foram realizadas em cada amostra como se segue:

[0155] 2.2.1. Pesar amostra (aproximadamente 20 - 50 mg; até uma exatidão de 0,1 mg) em tubo de 13 X 100 mm (com tampa revestida com Teflon®; VWR (53283-800)) e registrar peso. Em estudos posteriores, o tamanho da amostra foi padronizado a ~20,0 mg.

[0156] 2.2.2. Adicionar 2 mL de Heptano, submeter a vórtex e colocar em um banho ultrassônico (VWR Modeo Científico 750D) a 60 °C durante 15 min à potência de sonicação total (~360 W).

[0157] 2.2.3. Centrifugar durante 5 min a 1700 x g à temperatura ambiente.

[0158] 2.2.4. Decantar o sobrenadante para um tubo de vidro de 13 X 100 mm limpo.

2.3. Determinação de Perfis de Ácidos Graxos: Método GC:

[0159] 2.3.1. Transferir alíquota de 200 uL do extrato de heptano para um frasco GC com tampa de rosca limpo National Scientific (C4000-186W)

[0160] 2.3.2. Aos 200 uL adicionar 300 uL de heptano e 50 uL de hidróxido de trimetilsulfônio em metanol (JenaChem)

[0161] 2.3.3. Agitar os frascos em um agitador orbital à temperatura ambiente durante 15 minutos.

[0162] 2.3.4. Os ésteres de metila de ácidos graxos foram analisados por injeção direta de amostras de 1 uL (a uma razão de divisão de 5:1) em um sistema de cromatografia gasosa 6890 da Agilent equipado com uma coluna capilar Supelco Omegawax 320 (filme de 30 m x 0,320 mm x 0,25 um). Hidrogênio foi usado como o gás transportador (velocidade linear média de 39 cm/seg). As temperaturas de entrada e do detector FID foram mantidas a 260 °C e a temperatura da coluna de forno foi aumentada em rampa de 180 a 240 °C a uma taxa de 12 °C por minuto.

2.4. Extração de carboidratos não estruturais:

[0163] 2.4.1. Adicionar 1 mL de acetona ao pélete extraído com heptano a partir do método de perfis de ácidos graxos acima, misturar com vórtex para dispersar o material na acetona e secar em um SpeedVac.

[0164] 2.4.2. Ao pélete seco adicionar 2 mL de etanol a 80%. Submeter a vórtex para desagregar o pélete tanto quanto possível. Extrair em sonicador (ver 2.2.2) durante 15 min a 60

[0165] 2.4.3. Centrifugar durante 5 min a 1700 x g.Transferir sobrenadante para um tubo de 13 x 100 mm limpo.

[0166] 2.4.4. Repetir os Passos 2.4.2 e 2.4.3 duas vezes mais, combinando o sobrenadante com o acima (3) todas as vezes.

[0167] 2.4.5. Adicionar 100 μL de padrão interno de fenil-β-D glucopiranosídeo (0,5000 +/- 0,0010 g de estoque de β- fenilglucopiranosídeo em 100 mL de água) ao sobrenadante combinado. Secar o extrato em um SpeedVac e analisar quanto a carboidratos não estruturais como descrito em baixo.

[0168] 2.4.6. Adicionar 1 mL de acetona e secar o pélete restante no SpeedVac.

2.5. Digestão e extração de amido:

[0169] 2.5.1. Realizar digestão de amido é diretamente nos péletes secos em acetona a partir da extração de carboidratos não estruturais.

[0170] 2.5.2. Adicionar 100 unidades de α-Amilase (α- amilase; Estável ao Calor de Bacillus licheniformis, p.ex., Sigma-Aldrich A-4551) em 0,9 mL de tampão MOPS (Ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico) a 50 mM pH 7,0, contendo CaCl2 a 5 mM, e misturar.

[0171] 2.5.3. Colocar tubos em um tubo de aquecimento a 90 °C durante 75 minutos. Misturar várias vezes durante a hidrólise.

[0172] 2.5.4. Deixar os tubos a resfriar até à temperatura ambiente e adicionar 5 unidades de Amiloglucosidase (comercialmente disponível a partir da Roche 11 202 367 001) em 0,6 mL de tampão de acetato a 285 mM, pH 4,5 e incubar em um banho de água reciprocante a 55 °C durante 15-18 horas.

[0173] 2.5.5. Remover grade de tubos e levar até à temperatura ambiente.

[0174] 2.5.6. Adicionar 4,5 mL de etanol absoluto a cada tubo, para alcançar uma concentração final de etanol 80% e submeter a vórtex. Extrair em sonicador durante 15 min a 60 °C.

[0175] 2.5.7. Centrifugar 5 min a 1700 x g e decantar sobrenadante para um tubo de 13 x 100 mm e imediatamente colocar tubo em SpeedVac para reduzir o volume. 2.5.8. Extrair pélete 2 vezes adicionais com 2 mL de etanol a 80%, combinando sobrenadante com o acima todas as vezes. 2.5.9. Adicionar 100 μL de fenil-β-D glucopiranosídeo (ver 2.4.5) ao sobrenadante combinado antes de estar totalmente seco. Logo que o extrato no SpeedVac esteja seco analisar quanto a açúcares não estruturais como descrito em baixo. 2.5.10. Adicionar 1 mL de acetona e secar o pélete restante no SpeedVac e armazenar (a -20 °C) para análise de açúcares estruturais.

2.6. Derivatização e análise de Carboidratos solúveis totais.

[0176] 2.6.1. As amostras secas das extrações de solúveis e amido descritas acima em conjunto com conjuntos de misturas padrão de açúcares (pinitol, sorbitol, frutose, glucose, β-fenil glucopiranosídeo, sacarose, rafinose e estaquiose; a 0, 0,05, 0,10, 0,50, 1,00, 2,00, 3,00, 4,00 e 5,00 mg/tubo) foram solubilizadas em piridina anidra (Sigma-Aldrich P57506) contendo 30 mg/mL de hidroxilamina HCl (Sigma-Aldrich 159417).

[0177] 2.6.2. As amostras foram colocadas em um agitador orbital (300 rpm) durante a noite e foram depois aquecidas durante 1 hr (75 °C) com mistura com vórtex vigorosa aplicada a cada 15 min.

[0178] 2.6.3. Após resfriamento até à temperatura ambiente, 1 mL de hexametildissilazano (Sigma-Aldrich H-4875) e 100 μL de ácido trifluoroacético (Sigma-Aldrich T-6508) foram adicionados. As amostras são misturadas com vórtex e os precipitados foram deixados a repousar antes da transferência dos sobrenadantes para frascos de amostras GC.

[0179] 2.6.4. As amostras foram analisadas em um sistema de cromatografia gasosa 6890 da Agilent equipado com uma coluna capilar DB-17MS (filme de 30 m x 0,32 mm x 0,25 um). As temperaturas de entrada e do detector foram ambas 275 °C. Após injeção (2 μL, divisão 20:1), a temperatura inicial da coluna (150 °C) foi aumentada para 180 °C a uma taxa 3 °C/min e depois a 25 °C/min até uma temperatura final de 320 °C. A temperature final foi mantida durante 10 min. O gás transportador foi H2 a uma velocidade linear de 51 cm/seg. A detecção foi por ionização por chama. Um comprimento de 1 m de tubo capilar de 0,320 mm simples (Agilent; 160-2325-5) foi inserido entre a entrada e a coluna analítica para atuar como uma coluna de guarda. As duas seções de coluna foram conectadas usando um conector de encaixe. Antes de todas as operações analíticas, três injeções de uma mistura padrão contendo 5 mg de cada açúcar foram feitas para passivar o sistema de cromatografia. Foi descoberto que este processo permitia recuperação total de estaquiose a partir das amostras analíticas, especialmente à medida que a coluna envelhecia. Forros de Entrada Ultrainertes (Agilent; 5190-3164) foram também usados e foram rotineiramente mudados com base em indicações de perda no desempenho cromatográfico.

[0180] 2.6.5. A análise de dados foi realizada usando software ChemStation de Agilent. Cada açúcar foi quantificado em relação à sua própria curva de calibração, após divisão de cada pico individual pela área do padrão interno em cada amostra e padrão. As concentrações finais de carboidratos foram expressas em uma base de percentagem em peso, corrigidas quanto ao conteúdo de umidade como apresentado aqui. A sacarose, rafinose e estaquiose residuais recuperadas nas digestões de amido foram incluídas nos valores totais relatados para cada açúcar.

2.7. Métodos Suplementares. As determinações do conteúdo de umidade foram realizadas de acordo com a American Oil Chemists Society (Método Oficial AOCS Ba 2a-38, modificado para amostras pequenas) como se segue:

[0181] 2.7.1. Pesar material de amostra em pó (aproximadamente 100 mg; até uma exatidão de 0,1 mg) em um tubo de vidro de 13 x 100 mM pré-pesado (e registrado) VWR (53283800) e pesar novamente.

[0182] 2.7.2. Colocar amostras em um forno de ar forçado pré-aquecido até 130 °C.

[0183] 2.7.3. Deixar material a secar durante 2 h.

[0184] 2.7.4. Remover tubos em uma câmara de dessecador e deixar que regresse até à temperatura ambiente antes de pesar novamente.

[0185] 2.7.5. Tapar tubo e guardar material seco residual para análise de combustão subsequente para proteína (ver em baixo).

[0186] 2.7.6. Armazenar em um dessecador para análise adicional.2.8. Cálculo de Conteúdo de Umidade.

2.9. Calibrações de Umidade de Sementes Inteiras.

[0187] Calibrações de umidade de sementes inteiras para a SS-NIR foram desenvolvidas de acordo com os métodos descritos em baixo. Vagens foram coletadas das sojas Jack, 93B86 e 93Y21 entre o estágio R7 e R8 de desenvolvimento (i.e., estágio de vagens amarelas a marrons) quando os feijões de soja tinham teores de umidade de abaixo de 20%. Os feijões foram removidos das vagens e seu peso foi medido e registrado até exatidão de 0,0001 g antes da captura espectral usando o instrumento de SS- NIR. Os feijões foram depois sujeitos a secagem controlada (@105 °C em um forço de tiragem forçada durante curtos períodos de tempo) para alcançar uma ampla gama de teores de umidade antes da repetição da pesagem e captura espectral. Um peso seco final para cada feijão foi obtido após secagem em um forno de tiragem forçada a 105 °C durante 18 h. O conteúdo de umidade foi calculado como se segue:

[0188] Alternativamente, feijões de soja maduros foram colocados em bandejas de folha de alumínio 5 x 6” em sacos de plástico ZipLock® de 1 galão. A umidade relativa da atmosfera dentro dos sacos foi controlada por adição de uma segunda bandeja de folha na qual uma camada de dessecador DrieRite autoindicador (W.A. Hammond Inc; Xenia OH) ou uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio (200 g de NaCl em 1/3a de profundidade da bandeja de água). Um terceiro saco contendo semente mas sem qualquer controle de umidade atmosférica foi também definido. Os feijões foram expostos às atmosferas de umidade controlada durante um mês antes da pesagem seguida por captura espectral imediata na SS-NIR. De modo a manter a identidade individual de cada feijão após rastreio foram colocados em tubos de vidro Pyrex® de 16 x 125 mm. Os feijões foram depois secos de acordo com o Método Oficial AOCS Ac 2-41 (modificado para amostras pequenas) como se segue:

[0189] 2.9.1. Colocar feijão em um tubo de vidro de 16 x 125 mm pré-pesado (e registrado) e pesar novamente; registrar pesos até uma exatidão de 0,1 mg.

[0190] 2.9.2. Colocar amostras em um forno de ar forçado pré-aquecido até 130 °C.

[0191] 2.9.3. Deixar material a secar durante 3 h.

[0192] 2.9.4. Remover tubos em uma câmara de dessecador e deixar que regresse até à temperatura ambiente antes de pesar novamente.

[0193] Modelos espectrais preditores para teor de umidade de sementes foram desenvolvidos por combinação da informação espectral com os teores de umidade medidos para cada feijão.

2.10. Análise de Proteínas.

[0194] Os teores de proteína foram estimados por análise de combustão dos pós secos no forno descritos acima. A análise foi realizada em um analisador de combustão FlashTM 1112 EA (comercialmente disponível a partir da Thermo Scientific) operando no modo de Nitrogênio, Carbono, Enxofre (NCS). Amostras de amostras em pó secas no forno (de acordo com o Método Oficial AOCS Ba 2a-38 como descrito acima), 4-8 mg (Modo NCS), pesadas até uma exatidão de 0,001 mg em uma microbalança MX5 da Mettler-Toledo foram usadas para análise. Os teores de proteína foram calculados por multiplicação da % de N, determinada pelo analisado, por 6,25. Todas as amostras foram operadas em duplicado. Se a diferença entre os teores de proteína das amostras replicadas fosse >5% do valor médio, replicados adicionais foram analisados. Os teores de proteína final foram medidos em uma base de peso seco e ajustados até ao teor de umidade desejado.

[0195] Alternativamente, o analisador de combustão FlashTM 1112 EA da Thermo ScientificTM foi operado em modo de N- proteína, de acordo com as instruções do Fabricante, usando ácido aspártico como o padrão. Amostras de secas no forno (de acordo com o Método Oficial AOCS Ba 2a-38 descrito acima). As amostras em pós, 30-40 mg, pesadas até uma exatidão de 0,001 mg em uma microbalança MX5 da Mettler-Toledo foram usadas para análise. Os teores de proteína foram calculados por multiplicação da % de N, determinada pelo analisado, por 6,25. Todas as amostras foram operadas em duplicado. Se a diferença entre os teores de proteína das amostras replicadas fosse >5% do valor médio, replicados adicionais (se estivesse disponível material) foram analisados. Os teores de proteína final foram medidos em uma base de peso seco e ajustados até ao teor de umidade desejado.

2.11. Análise à base de RMN de conteúdo de óleo de sementes.

[0196] Os teores de óleo de amostras de sementes inteiras e em pó foram determinados usando um analisador de RMN Maran Ultra (Resonance Instruments Ltd, Whitney, Oxfordshire, RU). As amostras (semente de soja intata individual ou lotes ~200 mg de pó de soja triturado) foram colocados em tubos de polipropileno de 2 mL pré-pesados (Corning Inc, Corning NY, EUA; parte # 430917) previamente marcados com identificadores de código de barras únicos. As amostras foram colocadas em transportadores de 96 lugares e processadas através da seguinte série de passos por um sistema robótico Adept Cobra 600 SCARA.

[0197] 2.11.1. Escolher tubo usando armo robótico equipado com um dispositivo de recolha a vácuo.

[0198] 2.11.2. Ler código de barras.

[0199] 2.11.3. Expor tubo a dispositivo antistático para assegurar que as amostras em pó não aderem às paredes do tubo.

[0200] 2.11.4. Pesar amostra, até exatidão de 0,1 mg.

[0201] 2.11.5. Leitura de RMN; medida como a intensidade do eco de spin de próton 1 mseg após um sinal de 22,9 MHz ter sido aplicado à amostra. Os dados foram coletados para 32 rastreios de NMR por amostra.

[0202] 2.11.6. Devolver tubo à grade.

[0203] 2.11.7. Repetir processo com próximo tubo.

[0204] Os códigos de barras, pesos de sementes e leituras de RMN foram registrados por um computador conectado ao sistema.

[0205] O conteúdo de óleo das sementes foi calculado como se segue:

[0206] Os parâmetros de calibração foram determinados por pesagem exata de amostras de óleo de soja (variando de 0,0050 a 0,0700 g a intervalos de aproximadamente 0,0050 g; pesadas até uma exatidão de 0,0001 g) nos tubos de polipropileno (ver acima) e sujeição das mesmas a análise de RMN. Uma curva de calibração de conteúdo de óleo (base de % em peso de sementes; assumindo um peso de semente padrão de 0,1500 g) até o valor de RMN ter sido estabelecido.

Métodos Analíticos para amostras a granel. 2.12. Determinações de umidade e criação de calibrações de umidade de feijões a granel.

[0207] Variedades de feijões de soja cultivadas em campo ou estufa 93B86 (Patente dos EUA N.° 6,610,910) e 93Y21 (comercialmente disponível a partir da Pioneer Hybrid International) foram coletadas e as calibrações de umidade para a FT-NIR foram desenvolvidas de acordo com os métodos descritos em baixo. Vagens foram coletadas das plantas de soja entre o estágio R7 e R8 de desenvolvimento (i.e., estágio de vagens amarelas a marrons) quando os feijões de soja tinham teores de umidade abaixo de 50% em peso. Os feijões foram removidos das vagens e foram separados em grupos de aproximadamente 25 g com base no seu estado de maturidade. O peso da amostra de feijão foi medido e registrado até exatidão de 0,0001 g, antes de captura espectral de FT-NIR em um copo de spinning de 54 mm. Os feijões foram depois colocados em bandejas de folha de 5” x 6” e posicionados em uma câmara de fluxo laminar para secar à temperatura ambiente durante tempos variáveis. Após a semente ter sido submetida a secagem mensurável, os feijões foram pesados novamente e rerrastreados. Este processo foi repetido até não ter sido observada perda de peso adicional. As amostras foram depois retiradas até à secura completa usando o Método Oficial AOCS Ac 2-41 e foram deixadas a voltar até à temperatura ambiente em um dessecador antes da pesagem e rerrastreio no FT-NIR. O conteúdo de umidade foi calculado como se segue:

[0208] Alternativamente, feijões de soja maduros foram colocados em bandejas de folha de alumínio 5” x 6” em sacos seláveis de plástico da marca ZipLock® de 1 galão. A umidade relativa da atmosfera dentro dos sacos foi controlada por adição de uma segunda bandeja de folha que continha uma camada de dessecador DrieRite autoindicador (W.A. Hammond Inc; Xenia OH) ou uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Um terceiro saco contendo a bandeja de sementes mas sem qualquer controle de umidade atmosférica foi também definido. Os feijões foram expostos às atmosferas de umidade controlada durante um mês antes da pesagem seguida por captura espectral imediata na FIT-NIR. Os feijões foram depois secos de acordo com o Método Oficial AOCS Ac 2-41, como descrito acima, e rastreados novamente. Modelos espectrais preditores para teor de umidade de sementes foram desenvolvidos por combinação da informação espectral com os teores de umidade medidos para cada amostra de feijão.

2.13. Trituração de Amostras e preparação para química de referência a granel.

[0209] Lotes de setenta e cinco gramas de feijões foram triturados até um pó em um triturador Knifetec 1095 da Foss (comercialmente disponível a partir da FOSS North America, Eden Prairie, MN). A câmara de trituração foi resfriada antes e durante o processo por um refrigerador circulante definido a 14 °C. As amostras foram trituradas durante 2 x estouros de 10 segundos usando uma lâmina de rotor padrão. A amostra triturada foi transferida para um crivo de aço inoxidável com diâmetro de 6” (malha de 1 mm) e peneirada (resultando em perda menor do que 2% de material) antes de ter sido colocada em um copo de amostras hermeticamente fechado. A câmara de amostras e lâmina foram limpas cuidadosamente com uma escova macia e ar pneumático antes da introdução da próxima amostra. Os copos de amostras são armazenados à temperatura ambiente no escuro antes de análise adicional.

[0210] Nas experiências posteriores, o método de trituração foi modificado para remover a necessidade de peneiração. Sob estas condições, os feijões foram triturados durante 6 x estouros de 10 segundos sob as condições descritas acima. A câmara foi aberta entre cada estouro e o material aderindo à parede da câmara foi raspado com uma espátula de plástico e devolvido ao centro da câmara. Foi descoberto que o protocolo de trituração criava uma amostra em pó que passaria através de um crivo com malha No 20 US sem perda e era mais adequado para extração de gorduras em bruto.

2.14. Análise de Proteína em Bruto.

[0211] Os teores de Proteína em Bruto foram medidos por análise de combustão dos pós secos no forno descritos acima de acordo com o Método Oficial AOCS Ba 4e-93. As análises foram realizadas por uma organização de investigação contratada de acordo com métodos Padrão na Indústria para a soja ou de outro modo como descrito aqui. Os protocolos são essencialmente os mesmos que aqueles usados para semente única (Exemplo 2.10) mas foram modificados para acomodar um tamanho de amostra maior. A análise foi realizada em um analisado de combustão FlashTM 1112 EA da Thermo ScientificTM no modo de N-Proteína, seguindo as recomendações do fabricante. Amostras dos pós secos, 30-40 mg, pesadas até uma exatidão de 0,001 mg em uma microbalança MX5 da Mettler-Toledo, foram usadas para análise. Os teores de proteína foram calculados por multiplicação da % de N, determinada pelo analisado, por 6,25. Os teores de proteína final foram expressos em uma base corrigida quanto à umidade de 13%. Todas as amostras foram operadas em duplicado e replicação adicional foi realizada se a diferença entre as amostras de replicados fosse >5% do valor médio.

2.15. Análise de Gordura/Óleo em Bruto

[0212] As determinações de Gordura/Óleo em Bruto foram realizadas de acordo com o Método Oficial AOCS Ba 3-38. As análises foram realizadas em um laboratório de serviços comercial (Eurofins Scientific Inc., Des Moines, IA 50321) ou feitas usando uma Unidade de Extração SoxTec 8000 da Foss (comercialmente disponível a partir da Foss Analytical AB Hoganas, Suécia), de acordo com as recomendações do fabricante (Nota de Aplicação_AN 3487), com modificação ligeira. As amostras de pó retiradas aquando da análise foram sujeitas a determinações da umidade usando o Método Oficinal AOCS Ba 2a- 38, como descrito acima. Os teores de óleo em bruto final foram expressos em uma base corrigida quanto à umidade de 13%. Todas as amostras foram operadas em duplicado.

EXEMPLO 3 Análise espectral de sementes únicas de feijões de soja e desenvolvimento de medições exatas

[0213] Sementes com um elevado grau de diversidade composicional selecionadas dos materiais descritos no Exemplo 1 foram analisadas em um espectrômetro no Infravermelho Próximo de Semente Única (SS-NIR) patenteado (Patente dos EUA N.° 7,274,456 B2, emitida a 25 de set., 2007; Patente dos EUA N.° 7,508,517B2, emitida a 24 de março, 2009). Brevemente, no sistema SS-NIR, um feijão individual foi introduzido na célula analítica onde foi iluminado a partir de todos os pontos em três dimensões. A semente foi derrubada com uma corrente de ar, dentro de uma esfera integrante aproximada construída a partir de um copo de quartzo com diâmetro de 16 mm revestido com revestimento de refletância branca 6080 (Labsphere, North Hutton, NH). A iluminação foi proporcionada através de 12 fibras ópticas, conectadas a quatro bolbos de luz 8211-002 com 20 Watts (Welch Allyn, Skaneateles Falls, NY), as extremidades dos quais estavam incorporadas na cobertura da célula. A região espectral refletida de 904 a 1686 nm foi coletada através do ápice da cobertura da célula de amostragem por um espectrômetro NIR512 (Control Development, South Bend, IN). Cada semente foi rastreada durante 6 segundos para coletar espectros que foram otimizados quanto a razão máxima entre sinal e ruído. A qualidade espectral foi monitorizada durante cada rastreio de amostra por checagem regular do ruído da Raiz Média Quadrada (RMS) das linhas a 100%. As linhas a 100% foram computadas pela razão entre cada dois espectros da medição em triplicado para cada amostra. Sob condições isentas de ruído ideais, as linhas a 100% seriam linhas horizontais direitas a zero unidades de absorvância (AU) uma vez que todos os espectros de replicados vêm da mesma amostra proporcionando as mesmas características espectrais. Para minimizar o desvio instrumental, o ruído do sistema, condição das sementes e outras mudanças ambientais, ruído e compensações foram observados nas linhas a 100% reais. Após rastreio, a semente foi ejetada do copo de amostra e transferida para uma bandeja de amostras indexada. A identidade individual de cada semente foi portanto preservada, facilitando a calibração do instrumento.

[0214] Modelos separados de calibração foram gerados para cada constituinte de interesse usando análise de Mínimo Quadrado Parcial (PLS) acoplada a um número otimizado de variáveis latentes, gama espectral e pré-processamento espectral, antes de serem aplicados à análise composicional on- line/off-line de componentes de sementes individuais, tais como os sucrosil-oligossacarídeos. O número otimizado de variáveis latentes, gama espectral e pré-processamento espectral foram determinados analisando o subconjunto de treinamento e monitorização a partir dos dados de calibração onde o desempenho de calibração alcançou um nível ótimo, em termos de Erro Quadrático Médio da Calibração (RMSEC) e Erro Quadrático Médio da Validação Cruzada (RMSECV). Tomando a estaquiose como um exemplo, o número otimizado de variáveis latentes foi determinado pelos coconstituintes com pelo menos características espectrais distintas. O modelo de calibração usou dois componentes: o menor número de variáveis latentes e as informações mais relacionadas com a estaquiose. O equilíbrio de compromisso destes dois componentes é dependente da distinção do espectro de componente puro para a estaquiose dentro da matriz espectral. Para esses coconstituintes com espectros distintos, tais como óleo, algumas variáveis latentes de PLS foram usadas para capturar informação suficiente. Foram necessárias mais variáveis latentes de PLS para separar a estaquiose dos coconstituintes tais como sacarose e rafinose que são quimicamente relacionadas e portanto dão um elevado grau de sobreposição espectral. A gama espectral otimizada para a estaquiose estava na vizinhança de 1000, 1200, 1380 e 1460 nm. Estes comprimentos de onda permitiram que a estaquiose fosse medida distintamente dos outros constituintes da semente de soja. Após os espectros terem sido pré-processados quanto a correções de dispersão multiplicativas, derivadas de Savitsky- Golay e alisamento polinomial foram aplicados na região espectral entre 904 - 1540 nm. O número de variáveis latentes foi determinado como o menor número de variáveis latentes que resultaram em uma exatidão ótima de calibração/validação cruzada como determinado pelo RMSEC (Erro Quadrático Médio da Calibração) e RMSECV (Erro Quadrático Médio da Validação Cruzada), respectivamente. O modelo de calibração ideal foi selecionado com base nas estatísticas de R2 (medida estatística de quão próximos os dados químicos previstos e de referência são ajustados pela linha de regressão), RMSEC (Erro Quadrático Médio da Calibração) e RMSECV (Erro Quadrático Médio da Validação Cruzada).

[0215] Tabela 3 Estatísticas de várias calibrações de SS-NIR de componentes de sementes O número de medições químicas de referência usadas para desenvolver as calibrações para cada constituinte é mostrado na coluna n. A gama dinâmica na composição sustentando cada calibração do constituinte é mostrada na coluna da gama. Sob estas condições, a estaquiose pôde ser detectada tão baixa quanto 0, 05% em peso.

[0216] As medições de estaquiose por SS-NIR e métodos de química de referência são mostradas na Tabela 4.

[0217] Tabela 4. Teores de estaquiose de 20 sementes T1 individuais de evento Soil 2-7879-1-2-1. Cada semente foi analisada por SS-NIR e foi depois triturada e o conteúdo de estaquiose foi medido usando química de referência. Os segregantes nulos foram identificados (valores a negrito sublinhados) com base nos valores de estaquiose de química de referência. Os valores médios e de desvio padrão (SD) para a semente nula e positiva transgênica são também apresentados.

[0218] O construto usado para criar o evento Soil 92 2499.1.1.1 continha componentes transgênicos uma Yarrowia lipolytica, Diacilglicerol transferase-2 (DGAT-2) sob o controle do promotor da β-Conglicinina específico de sementes forte, o fator de transcrição da soja ODP1, um transportador de sacarose SUT4 e um componente de supressão de GAS sob o promotor kTi específico de sementes. As sementes dos eventos Soil 92 têm óleo, proteína, ácidos oleico e esteárico elevados em conjunção com ácidos linoleico e linolênico, sacarose e açúcares solúveis totais diminuídos. Teores de estaquiose mais baixos seriam esperados e foram medidos usando SS-NIR. As composições das 36 sementes T1 do evento Soil 92-2499.1.1.1 medidas por NIR são dadas nas Tabelas 5A e 5B.

[0219] Tabela 5A. Composições de sementes únicas para 36 sementes T1 do evento Soil 92-2499.1.1.1. A composição das sementes proporcionou uma impressão digital distinta que foi usada para discriminar entre sementes positivas transgênicas e segregantes nulas. As sementes identificadas como segregantes nulos são indicadas a negrito e sublinhadas.

[0220] Tabela 5B. Composições de sementes únicas (ésteres de metila de ácidos graxos como uma percentagem da soma de todos os ésteres de metila de ácidos graxos) para 36 sementes T1 de eventos Soil 92-2499.1.1.1 (como na Tabela 5A). A composição das sementes proporcionou uma impressão digital distinta que foi usada para discriminar entre sementes positivas transgênicas e segregantes nulas. As sementes identificadas como segregantes nulos são indicadas a negrito e sublinhadas.

[0221] A partir dos resultados apresentados nas Tabelas 5A e 5B, todos os componentes exceto para estaquiose foram medidos aos valores esperados. Os teores de estaquiose foram diminuídos em uma média de 1,1% (pontos percentuais), ao invés dos esperados pelo menos 3% (pontos percentuais) indicando que o construto não produziu a composição esperada. Componentes adicionais foram usados para auxiliar na distinção de sementes positivas transgênicas de segregantes nulas onde as mudanças transgênicas são sutis. Por exemplo, as sementes 14SN30-846 e 14SN30-864 tinham cada uma um conteúdo de estaquiose de 3,8%, que foi o limiar usado para discriminação entre semente positiva transgênica e segregante nula. Por inspeção dos outros componentes (27,5% de óleo, 41,8% de proteína, 32,1% de óleo, 3,5% de sacarose, 8,1% de carboidratos solúveis, 7,5% de ácido linolênico) era aparente que 14SN30-846 era uma semente transgênica positiva e que 14SN30-864 (19,9% de óleo, 41,8% de proteína, 20,9% de óleo, 4,5% de sacarose, 8,9% de carboidratos solúveis, 10,1% de ácido linolênico) era um segregante nulo.

[0222] Os métodos são também adequados para rastrear material gerado em experiências de cruzamento desenhadas para introgredir os transgenes com baixo teor de sucrosil- oligossacarídeo/elevado teor de óleo em fundos de soja de elite. Em este exemplo foi usado pólen de plantas BC1G1 heterozigóticas do evento Oil 119 (segregando os transgenes para os traços de baixo teor de sucrosil-oligossacarídeo/elevado teor de óleo) para fertilizar as flores receptivas emasculadas de três variedades de soja de elite. As plantas fertilizadas de modo cruzado foram cultivadas até à maturidade e as sementes BC2F1 resultantes coletadas a partir das flores polinizadas de modo cruzado foram analisadas por SS-NIR. Esta análise de SS-NIR permitiu a identificação não destrutiva de sementes transportando o fenótipo transgênico desejado (i.e., aquelas exibindo um fenótipo de baixo teor de estaquiose e elevado teor de óleo). Estas sementes positivamente identificadas foram cultivadas e o pólen destas plantas foi novamente usado para polinizar as flores receptivas emasculadas das mesmas três variedades de soja de elite. Os resultados na Tabela 6 mostram a composição de semente madura coleta após três rondas de retrocruzamento no genitor de elite feminina recorrente. Na maioria dos casos foi usado um valor limiar para o conteúdo de estaquiose de 2,0% para diferenciar entre as sementes de tipo selvagem (> 2,0% de estaquiose; indicado a negrito e sublinhado) e aquelas (<< 2,0%) que resultaram de introgressões de transgene bem-sucedidas (Transgênicas pos). Confirmação adicional de introgressões de transgene bem-sucedidas foi proporcionada pelos outros constituintes influenciados pelos traços transgênicos, i.e., óleo, proteína e ácido oleico elevados, níveis reduzidos de sacarose, carboidratos solúveis totais e ácido linolênico. As sementes híbridas transgênicas puderam ser identificadas usando SS-NIR por combinação do fenótipo de baixo teor de estaquiose (de <0,32%) com uma combinação de fenótipos de elevado teor de óleo, elevado teor de proteína, elevado teor de ácido oleico, baixo teor de sacarose, baixo teor de carboidratos solúveis totais e baixo teor de ácido linolênico (dependendo do fundo) que resultam da expressão dos componentes com elevado teor de óleo do cassete transgênico. As sementes de soja de fundos genéticos variados fora daquelas usadas para gerar as curvas de calibração puderam ser identificadas com sucesso como contendo transgenes introgressados.

[0223] Tabela 6A. Composições de SS-NIR (óleo/proteína/carboidrato (CBH)) para semente segregante resultando de retrocruzamentos de um evento Oil 119. O construto usado para criar o evento Oil119 continha os seguintes componentes transgênicos, uma dacilglicerol transferase-1 (DGAT- 1) de Glycine max modificada sob o controle do promotor de S- albúmen específico de sementes, um transportador de sacarose SUT4 e um componente de supressão de GAS 1,2,3 sob o controle do promotor da β-conglicinina específico de sementes forte. Este construto conferiu um fenótipo de baixo teor de estaquiose/elevado teor de óleo em três linhas de soja fêmeas de elite.

[0224] Tabela 6B. Composições de SS-NIR (perfil de ácidos graxos/peso/umidade) para semente segregante resultando de retrocruzamentos de um evento Oil 119 como descrito na Tabela 6A. Este construto conferiu um fenótipo de baixo teor de estaquiose/elevado teor de óleo em três linhas de soja fêmeas de elite. conferindo um fenótipo de baixo teor de estaquiose/elevado teor de óleo em três linhas de soja fêmeas de elite (como na Tabela 6A).

[0225] No seguinte exemplo, FT-NIT é usado para analisar semente de tamanhos de amostra de cerca de 50 sementes a 250 sementes.

Desenvolvimento de Modelos de NIR para FT-NIR

[0226] As análises e captura espectrais foram realizadas em um espectrômetro no Infravermelho Próximo (FT-NIR) com Transformada de Fourier com Analisador Multi-Purpose (MPA) da Bruker ajustado com uma montagem de copo rotativo com diâmetro de 54 mm. Tamanhos da amostra de tão pequenos quanto 50 sementes (aproximadamente 10 g de semente) até uma carga de copo total (aproximadamente 53 g de semente) foram usados, com um tamanho de amostra de aproximadamente 100 sementes (20 g) usado onde possível. O peso de cada amostra (até uma exatidão de 0,01 g) foi registrada antes do rastreio. Os espectros refletidos foram capturados para cada amostra até uma resolução de 8 cm-1 na gama de comprimentos de onda entre 833 e 2778 nm com o instrumento em modo de Macrorrefletância. O copo foi rodado sobre a fonte e detector enquanto sessenta e quatro rastreios espectrais totais eram coletados. A rotação do copo foi parada e os feijões foram vertidos em uma bandeja de folha e depois devolvidos ao copo antes do rastreio uma segunda vez. Foi descoberto que três ciclos de rastreio totais (com mistura completa da amostra entre cada rastreio) proporcionam boa qualidade de dados e produtividade de amostra. Os espectros capturados foram analisados e modelos foram desenvolvidos usando o pacote de software OPUS 7.0 da Bruker. As regiões espectrais utilizadas para a previsão de estaquiose com o MPA da Bruker após otimização do modelo foram 1157-1283 nm e 1437-2254 nm.

[0227] Tabela 7. Estatísticas de curvas de calibração de FT-NIR. O número de medições de química de referência é mostrado na coluna n. A gama (% em peso) mostra o valor medido mínimo e máximo do método de referência nas amostras para cada constituinte.

[0228] Tabela 8. Composições medidas por FT-NIR para lotes de ~20 g de eventos positivos homozigotos e nulos de sojas Soil 91 (Soil 91-1, Soil 91-2 e Soil 92-1). Os valores apresentados são médias e desvios padrão para duas réplicas positivas (pos) e duas nulas (nulas) para cada evento. Os valores delta indicam a diferença entre as médias positivas transgênicas e nulas para cada componente.

[0229] Os métodos de FT-NIR usados em este exemplo permitem a detecção de material positivo transgênico apesar das discrepâncias entre as composições previstas e medidas por química de referência.

Modelos de NIR Adicionais para FT-NIR

[0230] As medições de FT-NIR para estaquiose e outros componentes foram realizadas a partir de 13,881 amostras cultivadas no campo que foram rastreadas usando NIT para avaliar a diversidade composicional do conjunto de amostras. As amostras que representaram as concentrações extremas (tanto elevadas como baixas) foram selecionadas em conjunto com material que foi uniformemente distribuído ao longo das concentrações intermediárias para cada componente. Foram feitas seleções adicionais para maximizar a diversidade genética nas amostras, em conjunto com amostras que eram anormalidades claras (i.e., aquelas tendo composições medidas que estavam fora das gamas esperadas). Resultou um conjunto final de aproximadamente 400 amostras. Os espectros foram capturados no FT-NIT, como descrito acima. As amostras serão analisadas por química de referência para determinar as concentrações de cada constituinte e os dados serão usados para refinar as calibrações para facilitar determinações exatas dos sucrosil-oligossacarídeos e outros constituintes.

EXEMPLO 5

[0231] Desenvolvimento de Modelos de NIR para Transmitância no Infravermelho Próximo (NIT)

[0232] Espectros de NIR, de 850-1050 nm (passo de 2 nm; comprimento de percurso de 30 mm), para amostras a granel de 400-500 g de feijões de soja intatos foram adquiridas em modo de transmissão usando um analisador de grãos modelo 1241 da Foss Tecator AB (comercialmente disponível a partir da Foss Tecator AB, Hoganas, Suécia) equipado com uma tremonha de instrumento e mecanismo de transporte de amostras padrão. O espectro de absorção média de NIR para uma dada amostra foi obtido por análises duplicadas usando cada uma 10 rastreios de subamostras.

[0233] Toda a análise de dados foi realizada usando software de quimiometria InfraSoft International (ISI) WinISI II v.1.50e (comercialmente disponível a partir da NIRSystems Inc., Silver Spring, MD, EUA), MATLAB 7.10.0 R2010a com Neural Network Toolbox (Mathworks, 2010) e software ANN Trainer v1.0a12 (Foss Tecatur AB, 2002). O pré-tratamento dos dados espectrais de NIR (log 1/Transmitância) em bruto (850-1050 nm) incluiu correção de dispersão multiplicativa, centralização da média e escala vetorial unitária. O conteúdo de óleo e proteína (corrigido até uma base de umidade de 13%) foi medido de acordo com técnicas desenvolvidas por USDA-FGIS\GIPSA. Modelos para ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, sacarose, estaquiose e açúcares solúveis totais foram desenvolvidos usando técnicas de Redes Neurais Artificiais (ANN) utilizando o espectro transformado capturado a partir de material apresentando uma ampla diversidade composicional para estes componentes. A química de referência usada para as calibrações foi obtida, após captura espectral, usando os métodos a granel descritos no Exemplo 2. Todo o trabalho de desenvolvimento de calibração foi realizado usando algoritmos de ANN padrão disponíveis no software. Uma função de treinamento de Levenberg-Marquardt foi usada com entrada log-sigmoide e funções de transferência de saída linear pura. Entre quatro e nove neurônios foram usados em uma camada de nó oculto.

[0234] O número ótimo de iterações (épocas) foi escolhido quando o erro do conjunto de testes aleatoriamente selecionado foi minimizado. O coeficiente de determinação (R2) foi usado para descrever a correlação entre os valores de referência (observados) e previstos por NIR para o conjunto de calibração. A Razão entre Desempenho e Desvio (RPD), definida como a razão entre o SD dos valores de referência e o SECV (ou Erro Padrão da Previsão (SEP) do conjunto de teste) foi usada como um indicador normalizado para comparar modelos de NIR.

[0235] Os comprimentos de onda de NIT úteis na previsão da concentração de estaquiose em feijões de soja inteiros foram 850, 866, 880, 890, 902, 910, 920, 930, 944, 952, 964, 978, 990, 1004, 1016, 1032 e 1042 nm. As medições foram realizadas usando os espectros e a química de referência coletados de três anos de feijões de soja cultivados em campo de múltiplos locais dentro dos Estados Unidos, Argentina e Porto Rico. As estatísticas para a exatidão dos métodos de NIR não destrutivos comparados com os métodos padrão divulgados aqui são mostradas na Tabela 9.

[0236] Tabela 9. Estatísticas da exatidão de medições de NIT. n = número de medições de química de referência usadas para cada comparação de constituintes entre os métodos de NIR comparados com os métodos padrão divulgados aqui.

[0237] Os valores para a estaquiose medidos usando NIT e química de referência para amostras a granel de eventos positivos e negativos transgênicos de Soil 19 são dados na Tabela 10.

[0238] Tabela 10. A NIT previu o conteúdo de estaquiose de amostras a granel de eventos positivos e negativos transgênicos de Soil 19. Os feijões foram coletados a partir de plantas cultivadas em 9 locais do centro-oeste independentes. As amostras foram sujeitas a química de referência após os espectros de NIT terem sido capturados.

[0239] Os dados mostram que as medições de NIT da estaquiose nos eventos positivos transgênicos foram <1,6% ao passo que o valor medido mínimo para os eventos negativos transgênicos (nulos) foi 3,3%, permitindo que fossem feitas distinções entre os eventos positivos e negativos transgênicos, com base nas medições de estaquiose sozinha. As medições de NIT de estaquiose médias para ambos os eventos positivos e negativos transgênicos foram dentro de 0,4% daquelas medidas por química de referência (Tabela 10) mostrando um elevado grau de precisão (capacidade de diferenciar eventos positivos e negativos transgênicos) e exatidão (proximidade ao valor determinado por química de referência).

EXEMPLO 6 O uso de Espectroscopia de Transmitância no Infravermelho Próximo (NIT) para identificar material para exatidão melhorada de medições feitas com NIR ou NIT

[0240] O desenvolvimento de modelos espectroscópicos robustos para a identificação de materiais transgênicos que foram alterados em sua composição depende de vários fatores:

[0241] Os tamanhos de amostra usados para análise de NIT em este exemplo foram grandes o suficiente para serem submetidos a métodos de química de referência padrão da indústria (que requerem tipicamente mais do que 60 g de semente). As medições realizadas usando NIT foram escalonáveis e foram transferidas entre instrumentos NIR e NIT. O tamanho de amostra usado para NIT (400-500 g) foi compatível com cultura de linhas transgênicas e de melhoramento em parcelas de campo curtas (2 a 3 metros). A cultura em campo permitiu que a introdução de variação ambiental fosse contabilizada, i.e., representantes dos mesmos eventos (tais como transgenes ou modificações genéticas) cultivados em estados diferentes e sob condições de campo diferentes. O tamanho de amostra foi suficiente para proporcionar material para calibrar instrumentos com requisitos de tamanho de amostra mais pequenos, i.e., a química de referência de semente única, FT-NIR e SS-NIR, usada para SS-NIR.

[0242] A espectroscopia NIT foi usada para analisar 3692 amostras contendo 400-500 g de sementes cultivadas em parcelas de campo em Johnston, Iowa durante a temporada de 2014. Dados composicionais para cada um dos 11 constituintes listados na Tabela 11 foram coletados. Os dados foram analisados por representação gráfica das gamas inteiras de composição para cada componente. As amostras que representaram as concentrações extremas (tanto elevadas como baixas) foram selecionadas em conjunto com material que foi uniformemente distribuído ao longo das concentrações intermediárias para cada componente. Foram feitas seleções adicionais para maximizar a diversidade genética nas amostras, em conjunto com amostras que eram anormalidades claras (i.e., aquelas tendo composições medidas que estavam fora das gamas esperadas). Este processo resultou na seleção de 183 amostras para análise adicional; i.e., aproximadamente 5% do conjunto inicial. O subconjunto foi depois analisado por SS-NIR, FT-NIR (em espectrômetros MPA e Tango FT = NIR da Bruker) antes de ter sido triturado e sujeito à química de referência.

[0243] Outro conjunto de 2020 amostras de soja contendo 400-500 g de sementes cultivadas em lotes de campo na Argentina durante a estação de cultivo de 2015-2016 foi rastreado em um espectrômetro 1241 NIT da Foss. Os dados composicionais para os 11 constituintes na Tabela 11 foram gerados usando os espectros de absorção coletados. Uma seleção de 139 amostras de expansão de calibração foi feita com base na composição prevista uniforme, e espectros de amostras individuais comparados com a base de dados espectral do modelo. Este procedimento utilizou a análise de componentes principais da base de dados do modelo e a similaridade relativa do conjunto da Argentina para identificar amostras não correntemente representadas na população do modelo. Outro conjunto de 40 amostras destinadas a validar o desempenho do modelo foi selecionado com base na concentração estimada uniforme, de ampla gama e na presença de amostras similares no modelo ou sendo correntemente selecionadas para expansão da calibração.

[0244] Cada amostra foi rastreada em um MPA da Bruker e depois em um Tango da Bruker (espectrômetros de Infravermelho Próximo com Transformada de Fourier (FT-NIR)) cada um equipado com montagens de copo rotativo com diâmetro de 54 mm. Amostras de vinte gramas (aproximadamente 100 sementes) foram removidas das embalagens a granel, após mistura completa, e foram usadas para análise em um dos instrumentos de FT-NIR. As amostras de sementes foram depois devolvidas aos sacos a granel e uma segunda amostra foi usada para captura espectral no segundo instrumento. O peso de cada amostra (até uma exatidão de 0,01 g) foi registrada antes do rastreio. As condições para a captura espectral no instrumento Tango foram similares àquelas descritas para o MPA da Bruker (Exemplo 4), exceto que a gama de comprimentos de onda foi ligeiramente mais estreita (867 e 2530 nm no Tango vs. 833 e 2778 nm no MPA). Os espectros capturados de ambos os instrumentos foram analisados e modelos de previsão foram desenvolvidos usando o pacote de software OPUS 7.0 da Bruker.

[0245] Doze sementes de cada amostra foram selecionadas aleatoriamente das embalagens a granel e foram analisadas por SS-NIR. As identidades individuais de sementes foram mantidas durante o processo de captura espectral. Cada feijão foi depois colocado em tubos de polipropileno de 2 mL (Corning Inc, Corning NY, EUA; parte # 430917) previamente etiquetados com identificadores de código de barras únicos, em preparação para análise de química de referência de sementes únicas (Exemplo 2) e subsequente refinação do modelo de SS-NIR.

[0246] Amostras de setenta e cinco gramas foram depois removidas de cada uma das amostras a granel e após trituração as amostras foram sujeitas a análise de química de referência a granel (ver Exemplo 2). Os valores médios, SD, mínimos e máximos para cada componente de cada plataforma analítica são dados na Tabela 11.

[0247] Tabela 11. Valores médios, SD, mínimos e máximos componentes composicionais da soja. NA indica que não estavam disponíveis valores para estes componentes

[0248] A comparação dos valores médios, mínimos e máximos para o conjunto de amostras inteiro (representado pelos “Valores de NIT Originais” que foram desenvolvidos para 3692 amostras) e aqueles para o conjunto selecionado de 183 amostras mostra que este último conjunto abrangeu a gama dinâmica disponível para cada um dos componentes previstos (Tabela 11). Adicionalmente, a estreita concordância entre os valores médios, mínimos e máximos previstos por NIT para o conjunto selecionado de 183 amostras e os teores composicionais real medidos para estas amostras por química de referência indica o elevado grau de precisão e exatidão das medições para a maioria dos componentes. Por exemplo, os teores de estaquiose médios, mínimos e máximos previstos para o subconjunto de 183 amostras diferiram dos valores medidos por química de referência em -0,3% em peso, 0,1% em peso e -1,1% em peso, respectivamente. Em contraste, os teores de ácido palmítico médios, mínimos e máximos previstos para o subconjunto de 183 amostras diferiram dos valores medidos por química de referência em 0,2% relativa, 1,6% relativa e -5,0% relativa, respectivamente. A inclusão dos valores de química de referência nos modelos de NIT levará a melhorias na precisão das medições (i.e., a capacidade de diferenciar entre amostras desconhecidas diferindo em sua composição) e na exatidão (a capacidade de prever composições que são indistinguíveis daquelas medidas usando métodos de química de referência padrão).

EXEMPLO 7

[0249] Como uma ilustração da precisão do ensaio de química de referência para sacarose, rafinose e estaquiose, amostras a granel de feijões de três amostras de soja de mercadoria diferentes foram sujeitas a análise como duplicados cegos. Seis réplicas para cada amostra duplicada foram analisadas usando os métodos analíticos padrão para a derivatização e análise de carboidratos solúveis totais de acordo com os métodos apresentados no Exemplo 2.

[0250] Cada açúcar foi quantificado em relação à sua própria curva de calibração, após divisão de cada pico individual pela área do padrão interno em cada amostra e padrão. As concentrações finais de carboidratos foram expressas corrigidas quanto ao conteúdo de umidade como apresentado aqui. A sacarose, rafinose e estaquiose residuais recuperadas nas digestões de amido foram incluídas nos valores totais relatados para cada açúcar.

[0251] O coeficiente de variação médio (média/desvio padrão da média, expresso como uma percentagem) para sacarose, rafinose e estaquiose foi 1,43%, 1,34% e 2,11%, respectivamente.Como uma ilustração da exatidão do ensaio de química de referência para sacarose, rafinose e estaquiose, amostras a granel de feijões de três amostras de soja de mercadoria diferentes foram sujeitas a análise como duplicados cegos usando os métodos descritos aqui e em duas organizações de investigação contratadas. Os valores médios para sacarose de 4,31 +/- 0,22 (internos), 4,26 +/- 0,11, 4,26 +/- 0,21 não foram significativamente diferentes ao intervalo de confiança de 95%. Os valores médios para estaquiose foram 3,45 +/- 0,13 (internos), 3,16 +/- 0,14 e 3,36 +/- 0,27 não foram significativamente diferentes ao intervalo de confiança de 95%. Foram observadas diferenças significativas nos valores de rafinose de 0,93 +/-0,02 (internos), 0,73 +/- 0,10 e 0,47 +/- 0,03.

EXEMPLO 8 Análise de farelo de soja

[0252] Análises composicionais rápidas de farelos de soja, incluindo análises relatando sobre a concentração de fatores antinutricionais tais como o oligossacarídeo de sucrosila, rafinose e estaquiose e componentes nutricionalmente desejáveis tais como proteína, aminoácidos e sacarose, podem ser levadas a cabo.

[0253] Os pós desengordurados que permanecem após o processo de extração de óleo a granel (Exemplo 2.15) de feijões de soja são usados para capturar espectros de absorção e reflexão de NIR, em um MPA da Bruker ou em um instrumento de espectro total 6500 da Foss. O canal de esfera integrante do MPA operando no modo de macro refletância é utilizado para rastrear os pós contidos dentro de um frasco de borossilicato de 15 x 45 mm (Qorpak p/n GLC-00982) em triplicado a uma resolução de 8 cm-1 de 833-2778 nm. Alternativamente, um instrumento de refletância no infravermelho próximo 6500 da Foss/NIRSystems equipado com uma anexação de autoamostrador será utilizado para rastrear os pós contidos dentro de um copo de anel de 51 mm em duplicado a uma resolução de 2 nm de 400-2500 nm. As amostras são analisadas quanto à concentração de proteína, umidade, sacarose, rafinose, estaquiose e carboidratos solúveis totais usando métodos de química de referência descritos no Exemplo 2. Os dados espectrais e químicos resultantes permitirão determinação exata da concentração de cada constituinte.

EXEMPLO 9

[0254] Um conjunto diverso de feijões de soja cultivados no campo na América do Norte e Argentina em 2015 e América do Norte em 2016 foi selecionado pela sua diversidade composicional usando a metodologia descrita no Exemplo 6. Após captura espectral em ambas as plataformas de FT-NIR (Exemplo 4) e NIT (Exemplo 5), as amostras foram sujeitas a química de referência usando as metodologias de amostras a granel descritas no Exemplo 2. As características estatísticas dos modelos obtidos são descritas na Tabela 12. Na geração dos modelos, rafinose e ácidos graxos saturados totais foram adicionados como analitos. Os modelos de umidade não foram atualizados.

[0255] Tabela 12. Estatísticas da exatidão de medições de NIT. n = número de medições de química de referência usadas para cada comparação de constituintes entre os métodos de NIR comparados com os métodos padrão divulgados aqui. As gamas de óleo, proteína e carboidratos são apresentadas em uma base de umidade de 13%. Os ácidos graxos são apresentados em uma base de % relativa.

[0256] O desempenho do modelo de estaquiose melhorou com a adição dos novos dados; R2 0,95 vs. 0,89 (comparar as Tabelas 9 e 12); RMSEC 0,37 vs. 0,49 (o valor mais baixo indica uma resolução melhorada entre amostras no modelo); RMSECV 0,44 vs. 0,57 (um valor mais baixo indica uma resolução melhorada entre amostras não incluídas no modelo, i.e., desconhecidas). As estatísticas do modelo para sacarose e carboidratos solúvel totais não melhorou.

EXEMPLO 10

[0257] Análise de farelos de soja; Derivação de Modelo de Pó Desengordurado

[0258] Análises composicionais rápidas de farelos de soja, incluindo análises da concentração de fatores antinutricionais tais como o oligossacarídeo de sucrosila, rafinose e estaquiose e componentes nutricionalmente desejáveis tais como sacarose, podem ser levadas a cabo. Foi usado pó desengordurado; poderiam ser também usados flocos de soja desengordurados.

[0259] Os pós desengordurados que permanecem após o processo de extração de óleo a granel (Exemplo 2.15) de feijões de soja foram usados para capturar espectros de absorção e reflexão de NIR, em um MPA da Bruker. O canal de esfera integrante do MPA operando no modo de macro refletância foi utilizado para rastrear os pós contidos dentro de um frasco de borossilicato de 15 x 45 mm (Qorpak p/n GLC-00982) em triplicado a uma resolução de 8 cm-1 de 800-2778 nm. É esperado que um instrumento de refletância no infravermelho próximo 6500 da Foss/NIRSystems equipado com uma anexação de autoamostrador pudesse ser também utilizado para rastrear os pós contidos, por exemplo, dentro de um copo de anel de 51 mm em duplicado a uma resolução de 2 nm de 400-2500 nm.

[0260] Após captura espectral, as amostras foram analisadas quanto à concentração de proteína, umidade, sacarose, rafinose, estaquiose e carboidratos solúveis totais usando métodos de química de referência descritos no Exemplo 2. Os dados espectrais e químicos resultantes foram usados para gerar calibrações para a previsão das composições de farelo.

[0261] Os espectros capturados e química de referência acompanhante foram usados para derivar modelos preditivos de Mínimos Quadrados Parciais utilizando o pacote de software Opus 7.0 da Bruker. Espectros triplicados individuais foram calculados em uma única observação antes da regressão do modelo. As regiões espectrais e o pré-tratamento dos dados de absorção foram selecionados para cada analito usando o algoritmo de otimização OPUS. A rafinose, estaquiose e carboidratos solúveis totais empregaram pré-tratamento de primeira derivada e variável normal padrão enquanto usaram as regiões 1333-2355 nm, 1464-2355 nm e 1063-1125 nm mais 1465-2355 nm, respectivamente. A modelação de sacarose envolveu uso de primeira derivada e correção de dispersão multiplicativa para pré-tratar espectros e incorporar regiões no comprimento de onda de 1639-2355 nm. As estatísticas do modelo resultante são exibidas na Tabela 13.

[0262] Tabela 13. Estatísticas de curvas de calibração de FT-NIR para Pós Desengordurados. O número de medições de química de referência é mostrado na coluna n. A gama (% em peso corrigida até 13% de Umidade) mostra o valor medido mínimo e máximo do método de referência nas amostras para cada constituinte.

[0263] Os dados indicam que a estaquiose nos farelos de soja foi medida até um grau de precisão e exatidão similar àqueles alcançados para feijões inteiros usando os métodos descritos aqui, i.e., R2 0,97 e 0,95, RMSEC 0,34 e 0,37 para os modelos de NIT de farelo e feijão inteiro (Tabela 12), respectivamente.

[0264] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionadas no relatório descritivo são incorporadas por referência aqui para o propósito citado no mesmo grau como se cada uma estivesse especificamente e individualmente indicada como estando incorporada por referência aqui.

[0265] A invenção anterior foi descrita em detalhe a título de ilustração e exemplo para propósitos de clareza e entendimento. Como é prontamente aparente a um perito na técnica, a descrição anterior representa somente alguns dos métodos e composições que ilustram as modalidades da invenção anterior. Será aparente aos peritos na técnica que variações, mudanças, modificações e alterações podem ser aplicadas às composições e/ou métodos descritos aqui sem se afastarem do verdadeiro espírito, conceito e escopo da invenção.

[0266] Como usados aqui, os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “tem”, “tendo”, “contém”, “contendo”, “caracterizado por” ou qualquer outra sua variação se destinam a abranger uma inclusão não exclusiva.

[0267] A não ser que expressamente afirmado o contrário, “ou” é usado como um termo inclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou está presente) e B é falso (ou não está presente), A é falso (ou não está presente) e B é verdadeiro (ou está presente) e ambos A e B são verdadeiros (ou estão presentes). Os artigos indefinidos “um” e “uma” precedendo um elemento ou componente não são restritivos no que concerne o número de casos (i.e., ocorrências) do elemento ou componente. Portanto, “um” ou “uma” deve ser lido para incluir um ou pelo menos um, e a forma de palavra singular do elemento ou componente inclui também o plural a não ser que se pretenda obviamente que o número seja singular.

Claims

1. Método para selecionar uma semente de soja que possui uma quantidade de estaquiose entre 1% em peso e 0,1% em peso, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) direcionar luz de infravermelho próximo de uma fonte de luz para uma semente de soja para formar luz refletida, transmitida ou transfletida a partir da semente de soja; (b) receber a luz refletida, transmitida ou transfletida em um dispositivo de imagens para fornecer uma medida da luz refletida, transmitida ou transfletida; (c) comparar a medida da luz refletida, transmitida ou transfletida para um modelo de calibração obtido a partir de uma pluralidade de sementes de soja previamente testadas para medir a quantidade de estaquiose na semente de soja ; e (d) selecionar a semente de soja quando a quantidade de estaquiose medida estiver abaixo de um valor limiar entre 1% em peso e 0,1% em peso.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma pluralidade de sementes de soja é medida em conjunto.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de sementes compreende pelo menos 10 e menos do que 100 sementes.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de sementes compreende pelo menos 1 kg de sementes e menos do que 1,000 kg de sementes.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que uma semente individual é medida no passo (a).

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o método é um método automatizado, e compreendendo adicionalmente separar a semente individual de uma pluralidade de sementes antes do passo (a).

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a semente é geneticamente modificada para sobre expressar uma diglicerídeo aciltransferase.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de sementes de soja que possui teores de estaquiose variáveis dentro de uma gama que inclui valores de menos do que 0,3% em peso de estaquiose e mais do que 4,5% em peso de estaquiose.

9. Método para medir estaquiose em uma população de sementes de soja, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) direcionar luz no infravermelho próximo de uma fonte de luz para uma primeira e segunda subamostra da população de sementes de soja para formar uma primeira e segunda luz refletida, transmitida ou transfletida a partir das sementes de soja; (b) receber a primeira e segunda luz refletida, transmitida ou transfletida em um dispositivo de imagens; (c) medir a quantidade de estaquiose nas primeira e segunda subamostras com base na primeira e segunda luz refletida, transmitida ou transfletida recebida, em que (i) as primeira e segunda subamostras são separadas quando a quantidade de estaquiose medida difere em pelo menos 1 ponto percentual entre as primeira e segunda subamostras e (ii) em que as primeira e segunda subamostras são combinadas quando a quantidade de estaquiose difere em menos do que 0,2 pontos percentuais.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a população compreende sementes de soja geneticamente modificadas e não modificadas.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as sementes modificadas compreendem uma diacilglicerol transferase modificada.

12. Método para processar sementes de soja geneticamente modificadas para conterem teor aumentado de óleo e teor aumentado de proteína em comparação com sementes de soja não modificadas em uma pluralidade de sementes compreendendo as sementes de soja modificadas e as sementes de soja não modificadas, o método caracterizado pelo fato de que compreende (a) direcionar luz no infravermelho próximo de uma fonte de luz para uma amostra compreendendo uma semente de soja da pluralidade de sementes de soja para formar luz modificada a partir da semente de soja; (b) receber a luz modificada em um dispositivo de imagens; (c) medir a quantidade de um sucrosil- oligossacarídeo na semente de soja com base na luz modificada recebida; (d) repetir os passos (a) a (c) para pelo menos 100 amostras da pluralidade de sementes de soja, em que uma quantidade de sucrosil-oligossacarídeo abaixo de um valor limiar indica elevado teor de óleo e elevado teor de proteína na semente; e em que (i) pelo menos 90% da pluralidade de sementes de soja abaixo do valor limiar são as sementes de soja modificadas ou (ii) pelo menos 90% da pluralidade de sementes acima do valor limiar são as sementes de soja não modificadas.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende uma semente de soja individual.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, caracterizado pelo fato de que o sucrosil-oligossacarídeo é estaquiose.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as sementes acima do valor limiar diferem em pelo menos 1% em peso de estaquiose das sementes abaixo do valor limiar.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o valor limiar é pelo menos 0,5 pontos percentuais e menos do que 1,5 pontos percentuais.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o valor limiar é de 1 ponto percentual.