CN111665217A - 一种大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法，特征在于：先将天然和人工添加蔗糖的大豆样品结合起来作为定标样品集，然后利用近红外光谱分析仪采集光谱数据，再通过酶比色法化学值测定、光谱数据预处理以及偏最小二乘回归统计方法，构建大豆种子蔗糖含量的近红外光谱定量分析预测模型，并利用上述近红外光谱数学模型检测未知大豆种子样品的蔗糖含量。其所建立近红外光谱检测方法的预测能力较强、适用性较好，能够有效应用于大豆种子蔗糖含量的准确测量，可以为快速测定原料大豆的蔗糖指标，及时调整豆制品生产工艺参数或原料配比提供数据支撑，还可满足快速准确鉴定高蔗糖大豆育种新品系的需要。
Description
技术领域
本发明涉及一种大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法，属于农产品成分检测技术领域。
背景技术
随着生活水平的日益提高，人们对自身健康越来越关注，并愈发重视增加膳食中豆制品的摄入量。已有研究证实，大豆中蔗糖含量的多少会显著影响豆制品风味、口感等食味特性。目前高蔗糖已被日本、韩国的育种者列为优质食用大豆的重要育种目标之一。
近几年，高效液相色谱、酸解比色法和酶解比色法，在食品工业的蔗糖含量测定领域获得了较大的关注。但是，以上方法存在操作复杂、速度慢、耗时长等问题，不适合优质大豆选育过程中对种子蔗糖含量的大批量鉴定。随着光学、计算机数据处理及化学计量等技术的发展，使得近红外光谱分析技术日趋完善，现已被广泛应用于大豆含水量、蛋白质、氨基酸、脂肪、脂肪酸等含量的测定工作。然而，近红外光谱分析方法在大豆蔗糖含量检测方面的应用研究较少，原因主要有二：一是缺乏高蔗糖的大豆参考样品，导致近红外预测模型的适用范围较狭窄；二是蔗糖由果糖和葡萄糖通过糖苷键相连而成，大豆中果糖和葡萄糖的存在会导致近红外预测模型的抗干扰能力较差。
如何拓宽和提高模型的预测范围和测量精准度，是当前借助近红外光谱分析仪测定大豆蔗糖组分亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法，该方法预测能力较强、适用性较好，能够有效应用于大豆种子蔗糖含量的快速、准确测量，可以为快速测定原料大豆的蔗糖指标，及时调整豆制品生产工艺参数或原料配比提供数据支撑，还可满足快速准确鉴定高蔗糖大豆新品系的需要，能加速优质食用大豆的育种及加工应用进程。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法，其特征在于具体步骤如下：
1）收集具有代表性的大豆样品：将每份样品取200克种子在室温下干燥3周，使其含水量达到8%，随后每份样品15克的大豆种子研磨粉粹并过60目筛，置于-20℃冰箱保存备用。
2）采用酶比色法对步骤1）所收集大豆样品的蔗糖含量进行化学值测定，利用紫外分光光度计在波长505纳米处测定醌亚胺的吸光度，测出试液吸光度后，以蔗糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线，按照以下公式在标准曲线上查出对应的蔗糖含量：X=C/m*V2/V1*1/1000*1000*100（式中X——样品中蔗糖的质量分数，％；C——在标准曲线上查出的试液中蔗糖的含量μg；m——试样的质量g；V1——试液的定容体积mL；V2——测定时吸取试液的体积mL。）
3）确定定标样品集：称量纯度为99.8%的蔗糖粉，定量添加到通过步骤2）已知初始蔗糖含量的大豆样品中，将所获得的大豆和蔗糖粉混合物在研磨机中充分均质化，获得人工添加蔗糖的大豆样品。将人工添加蔗糖的大豆样品和步骤1）中的天然大豆样品组合在一起作为定标样品集。
4）利用近红外光谱仪采集大豆样品的光谱数据：采用近红外光谱仪的光栅连续光谱方式，在波数10000-3500 cm-1波段范围内，对步骤3）所得的定标样品集进行近红外光谱的扫描收集，获得各样品的近红外光谱数据，每份样品重复装填3次，取平均光谱值。
5）预处理原始近红外光谱数据：将步骤4）获得的定标样品集的近红外光谱值Xij（i表示第i个波长，波长i＝1000纳米，1001纳米，1002纳米，…，1799纳米；j表示第j个样品）和步骤2）获得的蔗糖含量化学测定值Yj（j表示第j个样品）相关联，建立一个带参考数据的光谱文件；借助nirsLAB近红外光谱数据分析软件，先对原始光谱数据值Xij进行归一化处理，得到归一化吸光值，再采取卷积平滑法、二阶导数和多元散射校正中的一种或多种的组合处理方法对归一化吸光值进行预处理，得到预处理吸光值Aij；
6）采用偏最小二乘法筛选近红外光谱特征波长，建立大豆蔗糖含量的近红外光谱预测模型：Z＝∑aiBi + b，其中Z为大豆蔗糖含量的近红外检测值，Bi为预处理吸光值Aij中第j个样品的吸光值，ai为回归系数。将t检验用于对回归系数ai的显著性检验，当p值小于0.05时，自变量Bi对因变量Z有显著的线性关系，则ai处所对应的波长i为特征波长。大豆蔗糖含量特征波长分别为1325纳米、1407纳米、1600纳米、1640纳米、1682纳米、1885纳米，上述特征波长允许有±2纳米的偏差；预测模型的评价指标为决定系数、定标模型均方差、交互验证决定系数和交互验证均方差，决定系数越大，均方差越小，模型的预测效果越好。
7）未知大豆样品蔗糖含量的测定：选取未知蔗糖含量的大豆种子样品，研磨粉碎过筛后将样品放入近红外光谱仪样品分析杯中，装入样品体积占杯体2/3，轻放入杯盖，在波数10000-3500 cm-1波段范围内扫描64次，每份样品重复装填3次，取平均光谱值；将未知样品的近红外光谱值代入步骤6）的数学模型中，预测出大豆种子样品的蔗糖含量。
本发明的积极效果是：
1、大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法是一种应用性的近红外光谱定量分析方法。据美国研究者报道：天然大豆种质的蔗糖含量变化范围仅在1.6-65.4 g·kg-1之间，这根本无法满足高蔗糖优质大豆育种的需要。一直以来，高蔗糖大豆参考样品的缺乏，极大地限制了近红外光谱定量分析预测模型的开发。为了扩大数学模型中蔗糖含量的预测范围，本专利将蔗糖粉与粉粹过筛后的大豆样品加以均质混合，获得了天然与人工添加蔗糖的大豆样品加以组合的定标样品集，这一方面可以增加建模参考样品的代表性，另一方面可以避免片面追求样品的特殊性，并能更好地覆盖今后高蔗糖大豆育种材料中蔗糖组分的变化范围。
2、大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法极大地拓宽了蔗糖含量的预测范围，从原来的34.75-78.28 g·kg-1提高到了37.83-139.35 g·kg-1，这不但有助于模型自身精度的提高，而且使近红外光谱仪的仪器系统误差（由光谱噪声、杂散光、基线漂移、平缓背景等引起）被放大的程度显著降低。
3、大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法将二阶导数联合多元散射校正确定为近红外光谱数据的最佳预处理方法，这一光谱数据预处理方法不但可以消除固体颗粒大小、表面散射及光程变化对近红外漫反射光的影响，而且降低光谱漂移现象的发生概率，更重要的是能够使近红外光谱图上出现更明显的吸收峰，显著提高光谱数据间的差异。
附图说明
图1本发明一种实施例中二阶导数联合多元散射校正处理后的定标样品集的近红外光谱图。
图2本发明一种实施例中基于定标样品集的近红外光谱定量分析预测模型的回归系数曲线图。
图3 本发明一种实施例中基于定标样品集的大豆蔗糖含量近红外光谱预测值与化学实测值的相关图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
实施例
本实施例提供一种大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法，该方法包括以下步骤：
1.1 收集具有代表性的大豆样品
收集236份东北大豆种质资源，包括育成品种188份，地方品种33份，国外引种材料15份。将每份大豆样品的200克种子在室温下干燥3周，使其含水量降至8%，随后每份样品取15克的大豆种子研磨粉碎并过60目筛，用于常规化学和近红外光谱分析。
1.2 大豆样品蔗糖含量化学值的测定
1.2.1 组合试剂的准备
①1号瓶：内含β-D-果糖苷酶400U（活力单位）、柠檬酸缓冲溶液、柠檬酸三钠。
②2号瓶：内含0.2mol·L-1磷酸盐缓冲液（pH7.0）l00毫升，其中含4-氨基安替吡啉0.00154 mol·L-1。
③3号瓶：内含0.022 mol·L-1苯酚溶液200毫升。
④4号瓶：内含葡萄糖氧化酶800U（活力单位）、过氧化物酶2000U（活力单位）。
1～4号瓶须在4℃左右保存。
1.2.2 酶试剂溶液的准备
①将1号瓶中的化学物质用双蒸水溶解，使其体积为66毫升，轻轻摇动（切勿剧烈摇动），使酶完全溶解，此溶液即为β-D果糖苷酶试剂，其中柠檬酸缓冲溶液浓度为0.1 mol·L-1，pH=4.6，在4℃左右保存，有效期1个月。
②将2号瓶与3号瓶中的溶液充分混合。
③将4号瓶中的酶溶解在上述混合液中，轻轻摇动（切勿剧烈摇动），使酶完全溶解，即为葡萄糖氧化酶—过氧化物酶试剂溶液，在4℃左右保存，有效期1个月。
④0.085mol·L-1亚铁氰化钾溶液：称取3.7克亚铁氰化钾，溶于100毫升双蒸水中，摇匀。
⑤0.25mol·L-1硫酸锌溶液：称取7.7克硫酸锌（ZnSO4·7H2O），溶于l00毫升双蒸水中，摇匀。
⑥0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液：称取0.4克氢氧化钠固体，用少量双蒸水溶于小烧杯中，将烧杯中的氢氧化钠溶液转移到100毫升的容量瓶中，用蒸馏水润洗烧杯和玻璃棒2-3次，润洗液也转移到容量瓶中，用洗瓶给容量瓶加双蒸水，直到离刻度线2-3厘米，用滴管滴加双蒸水，直到液面到达刻度线，盖好塞子，上下颠倒摇匀。
⑦蔗糖标准溶液称取经（100±2）℃烘烤2小时的蔗糖0.4克，溶于双蒸水中，定容至100毫升，摇匀。将此溶液10毫升用双蒸水稀释至100毫升，即为0.004g·mL-1蔗糖标准溶液。
1.2.3标准曲线的绘制
用微量移液管取0、0.20毫升、0.40毫升、0.60毫升、0.80毫升、1.00毫升蔗糖标准溶液，分别置于10毫升比色管中，各加入l毫升β-D果糖苷酶试剂溶液，摇匀，在（36±1）℃的水浴锅中恒温20分钟，取出后加入3毫升葡萄糖氧化酶—过氧化物酶试剂溶液，在（36±1）℃的水浴锅中恒温40分钟，冷却至室温，用双蒸水定容，摇匀。用1厘米比色皿，以蔗糖标准溶液含量为0的试剂溶液调整分光光度计的零点，在波长505纳米处，测定各比色管中溶液的吸光度，以蔗糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。
1.2.4样品处理
将5克样品置于100毫升烧杯中，加少量双蒸水，移至250毫升容量瓶中，加入0.085mol·L-1亚铁氰化钾溶液5毫升、0.25mol·L-1硫酸锌溶液5毫升和0.1mol·L-1氢氧化钠溶液10毫升，用双蒸水定容，摇匀后用快速滤纸过滤，弃去最初滤液30毫升，收集滤液待测。
1.2.5试液吸光度的测定
取出1.2.4中5.00毫升试液，置于10毫升比色管中，加入1毫升β-D-果糖苷酶试剂溶液，摇匀，在（36±1）℃的水浴锅中恒温20分钟，取出后加入3毫升葡萄糖氧化酶—过氧化物酶试剂溶液，在（36±1）℃的水浴锅中恒温40分钟，冷却至室温，用双蒸水定容，摇匀。用l厘米比色皿，以等量试液调整分光光度计的零点，在波长505纳米处，测定比色管中溶液的吸光度。测出试液吸光度后，在步骤1.2.3的标准曲线上查出对应的蔗糖含量。
1.2.6结果计算
按照以下公式计算出蔗糖含量X=C/m*V2/V1*1/1000*1000*100（式中X——样品中蔗糖的质量分数，％；C——在标准曲线上查出的试液中蔗糖的含量，微克；m——试样的质量，克；V1——试液的定容体积，毫升；V2——测定时吸取试液的体积，毫升。）
1.3 确定定标样品集
称量纯度为99.8%的蔗糖粉，定量添加到已知初始蔗糖含量的大豆样品中，将所获得的大豆和蔗糖粉混合物在研磨机中充分均质化，制备人工添加蔗糖的大豆样品。
将人工添加蔗糖的大豆样品和天然大豆样品组合在一起作为大豆种子蔗糖含量近红外光谱定标建模的样品集。由表1可见，定标样品集在定标和交叉验证两个方面，均具有较高的决定系数以及较低的均方差，且所覆盖的蔗糖含量范围也较大（49.99-136.76g·kg-1）；天然大豆样品集中蔗糖含量范围仅为34.75-78.28 g·kg-1。定标样品集所覆盖的蔗糖含量范围显著高于天然样品集。
表1 大豆蔗糖含量近红外光谱定量分析预测模型的建模参数比较
1.4 利用近红外光谱仪采集大豆样品的光谱数据
采用瑞士步琦公司NIRFIEX N-500型近红外光谱仪的光栅扫描型连续光谱方式，对步骤1.3中的定标样品集进行近红外光谱数据收集，定标样品集近红外光谱的收集过程为：将样品放入样品分析杯中，装入样品体积占杯体2/3，轻放入杯盖，且保证样品杯底部无空隙；在波数10000-3500 cm-1波段范围内，对每个大豆样品逐一进行扫描，并采集其近红外光谱。近红外光谱收集时，扫描速度55degs·sec-1，光谱步长为1纳米，扫描温度为室温25℃，为减小误差，每份样品重复装填并扫描3次，取平均光谱值；扫描前，仪器预热1小时；扫描数据以吸光度形式存储。定标样品集中的377个样品的近红外光谱数据如图1所示。
1.5 原始光谱数据的预处理
将步骤1.4获得的定标样品集的近红外光谱值Xij（i表示第i个波长，波长i＝1000纳米，1001纳米，1002纳米，…，1799纳米；j表示第j个样品）和步骤1.2获得的蔗糖含量化学测定值Yj（j表示第j个样品）相关联，建立一个带参考数据的光谱文件。
借助nirsLAB近红外光谱数据分析软件，先对原始光谱数据值Xij进行归一化处理，得到归一化吸光值，再采取卷积平滑法（CS）、二阶导数（2D）和多元散射校正（MSC）中的一种或多种的组合处理方法对归一化吸光值进行预处理，得到预处理吸光值Aij。
由表1可见，二阶导数联合多元散射校正光谱预处理方法的效果较好，且删除的数据点数明显较少，将二阶导数联合多元散射校正作为近红外光谱原始数据的最佳预处理方法。
1.6 构建大豆蔗糖含量近红外光谱定量分析预测模型
将步骤1.5处理后的近红外光谱数据和步骤1.2获得的化学测定值数据进行偏最小二乘回归运算，并采用偏最小二乘法筛选近红外光谱特征波长，建立大豆蔗糖含量的近红外光谱预测模型：Z＝∑aiBi + b，其中Z为大豆蔗糖含量的近红外检测值，Bi为Aij中第j个样品的吸光值，ai为回归系数。将t检验用于对回归系数ai的显著性检验，当p值小于0.05时，自变量Bi对因变量Z有显著的线性关系，则ai处所对应的波长i为特征波长。由图2可见，大豆蔗糖含量特征波长分别为1325纳米、1407纳米、1600纳米、1640纳米、1682纳米、1885纳米，上述特征波长允许有±2纳米的偏差。
由表1可见，定标模型的蔗糖含量预测范围可达37.83-139.35 g·kg-1，且具有较高的交互验证决定系数（0.969），较低的交互验证均方差值（5.034），这说明定标模型预测效果的精度较高、稳定性较好。由图3可见，借助交互验证决定系数的最高值和交互验证均方差的最低值，偏最小二乘回归运算所建立的回归方程为y = 0.9296x + 8.765（R 2=0.969）（y为因变量，代表的是大豆样品蔗糖含量的近红外光谱检测预测值；x为自变量，代表的是大豆样品的近红外光谱吸光度值；0.9296为回归系数，即回归直线的斜率，用以说明x每变化一个单位时，影响y平均变动的数量；8.765为回归截距，即回归直线在y轴上的截距，可代表回归直线的起点；R2为回归决定系数，用于评价回归方程的相对拟合优度，即在因变量y的总变异中有多少百分比，可由自变量x来解释），即为大豆蔗糖含量的近红外光谱定量分析的最佳预测模型。
1.7 测定未知大豆样品的蔗糖含量
取40份未知蔗糖含量的大豆种子样品，每份大豆样品的200克种子在室温下干燥3周，使其含水量降至8 %，随后每份样品取15克的大豆种子研磨粉碎并过60目筛。
按照步骤1.2的方法，用酶比色化学法测定样品蔗糖含量的化学值。借助紫外分光光度计，在波长505纳米处测定醌亚胺的吸光度，测出试液吸光度后，以蔗糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线，按照以下公式在标准曲线上查出对应的蔗糖含量：X=C/m*V2/V1*1/1000*1000*100（式中X——样品中蔗糖的质量分数，％；C——在标准曲线上查出的试液中蔗糖的含量微克；m——试样的质量，克；V1——试液的定容体积，毫升；V2——测定时吸取试液的体积，毫升。）
按照步骤1.4的方法，将样品放入瑞士步琦公司NIRFIEX N-500型近红外光谱仪样品分析杯中，装入样品体积占杯体2/3，轻放入杯盖，且保证样品杯底部无空隙，在波数10000-3500 cm-1波段范围内，对每个大豆样品逐一进行扫描64次，每份样品重复装填3次，取平均光谱值。
按照步骤1.5中相同的光谱数据预处理方法（即先对原始光谱数据值进行归一化处理，得到归一化吸光值，再采取二阶导数联合多元散射校正的处理方法对归一化吸光值进行预处理），处理原始光谱数据，得到预处理后的吸光值。
使用步骤1.6中构建的大豆蔗糖含量近红外光谱定量分析预测模型，对预处理后的光谱吸光值进行预测，所得结果即为待测大豆样品的蔗糖含量。
由表2可知，所构建的近红外模型对大豆蔗糖含量预测值与酶比色化学法检测的化学值基本一致，这说明近红外光谱分析的预测结果极其可靠。此外，预测模型具有较高的的外部验证决定系数（0.943），较低的预测均方差值（3.127），以及较低的相对误差值（5.923%），这说明模型预测精度高，常规化学法测量值和近红外测量值的偏差小，具有较好的实用价值，完全可以替代常规化学测定方法，并推广应用于其他大豆样品蔗糖含量的快速、准确测定。
表2 大豆蔗糖含量近红外光谱定量分析预测模型的外部检验结果
| 蔗糖含量预测/实测值范围（g·kg<sup>-1</sup>） | 决定系数 | 预测均方差 | 相对误差（%） | |
| 近红外光谱定量分析预测模型 | 47.32-89.91 | 0.943 | 3.127 | 5.923 |
| 酶比色化学法实测 | 48.26-90.45 | - | - | - |
Claims (5)
1.一种大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法，其特征在于具体步骤如下：
1）收集具有代表性的大豆样品并测定其蔗糖含量化学值：将300份不同的大豆样品种植于田间，收获后每份样品取200克种子在室温下干燥3周，使其含水量降至8%，随后每份样品取15克的大豆种子磨碎，采用酶比色法对所收集大豆样品的蔗糖含量进行化学值测定；
2）确定定标样品集：称量纯度为99.8%的蔗糖粉，定量添加到步骤1）的大豆样品中，将大豆和蔗糖粉混合物在研磨机中充分均质化，制备获得人工添加蔗糖的大豆样品；将人工添加蔗糖的大豆样品和步骤1）中的天然大豆样品组合在一起作为定标样品集；
3）利用近红外光谱仪采集大豆样品的光谱数据：借助近红外光谱仪，对步骤2）所得的定标样品集进行近红外光谱的扫描收集，获得定标样品集内的各个样品的近红外光谱数据，其中定标样品集是由多个样品组成的集合；
4）预处理近红外光谱数据，建立定量分析预测模型：近红外定量分析需要一个待测成分已知的定标样品集，根据定标样品集的近红外光谱，运用化学计量学方法建立光谱特征值即吸光度与待测成分之间的数学关系，简称数学模型；当测定未知样品时，只需测定该样品的近红外光谱吸光度值，然后用已建好的数学模型预测出待测成分的含量；将步骤3）获知的定标样品集的近红外光谱值和步骤2）获知的蔗糖含量化学测定值相关联，借助近红外光谱数据分析软件，对采集到的原始光谱数据进行预处理，建立大豆蔗糖含量的近红外光谱定量分析数学模型；
5）测定未知大豆样品的蔗糖含量：将未知样品放入近红外光谱仪中，所获得的吸光度值代入步骤4）通过求解光谱特征值矩阵与待测成分的浓度矩阵所建立的数学模型，进行蔗糖组分的定量。
2.根据权利要求1所述的一种大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法，其特征在于步骤1）中：对收集的大豆样品经过充分室温干燥后，使其含水量降至8 %；利用小型桌面研磨机将大豆样品种子研磨粉粹后过60目筛；酶比色法测定蔗糖含量化学值时，借助紫外分光光度计，在波长505纳米处测定醌亚胺的吸光度，测出试液吸光度后，以蔗糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线，按照以下公式在标准曲线上查出对应的蔗糖含量：X=C/m*V2/V1*1/1000*1000*100，式中X——样品中蔗糖的质量分数％；C——在标准曲线上查出的试液中蔗糖的含量μg；m——试样的质量g；V1——试液的定容体积mL；V2——测定时吸取试液的体积毫升mL。
3.根据权利要求1所述的一种大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法，其特征在于步骤3）中：采用近红外光谱仪的光栅连续光谱方式，在波数10000-3500 cm-1波段范围内对其进行近红外光谱的扫描收集，获得各样品的近红外光谱数据，每份样品重复装填3次，取平均光谱值。
4.根据权利要求1所述的一种大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法，其特征在于步骤4）中：利用nirsLAB近红外光谱数据分析软件，先对采集到的原始光谱数据进行归一化处理，随后采取卷积平滑法、二阶导数和多元散射校正等方法进行光谱数据的预处理；采用偏最小二乘法建立大豆蔗糖含量的定量分析预测模型。
5.根据权利要求1所述的一种大豆种子蔗糖含量的近红外光谱检测方法，其特征在于步骤5）中：采用近红外光谱仪的光栅连续光谱方式，在波数10000-3500 cm-1波段范围内扫描64次，每份样品重复装填3次，取平均光谱值。
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