CN106165645A

CN106165645A - 基于除草剂抗性的油菜杂交种制种方法及其应用

Info

Publication number: CN106165645A
Application number: CN201610351732.4A
Authority: CN
Inventors: 卢长明
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2016-05-25
Filing date: 2016-05-25
Publication date: 2016-11-30

Abstract

本发明公开了一种基于除草剂抗性的油菜杂交种制种方法及其应用，涉及植物育种领域。本方法是：①将广谱性除草剂抗性基因导入油菜父本品系中，得到抗除草剂油菜父本品系：抗咪唑啉酮品系12WH381或抗草铵膦品系Z7B10；②利用抗除草剂油菜父本品系的花粉与化学杀雄后不育的母本授粉，从母本群体植株上收获杂交种子；③对杂交种进行除草剂包衣处理，或在种植杂交种时对杂交种群体喷施相应的除草剂，去除杂草的同时去除假杂种，得到高纯度的油菜杂种或群体。其应用是：①用于油菜的杂交制种；②用来改进现有油菜三系制种方法；③用来改进现有油菜核不育两系制种方法；④用来改进现有油菜化学杀雄制种系统。

Description

基于除草剂抗性的油菜杂交种制种方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物育种领域，尤其涉及一种基于除草剂抗性的油菜杂交种制种方法及其应用。

背景技术

1、油菜杂交制种方法概述

油菜具有很强的杂种优势。油菜杂种F₁代比其亲本通常可以增产20～30％^[1][2]。目前，配制油菜杂交种的方法主要有三系法和两系法。三系法又可以分为细胞质不育三系法(不育系、保持系和恢复系)和细胞核不育三系法(核不育系、临保系和恢复系)^[1][2]。两系法可以分为细胞核不育两系法、环境敏感细胞核不育两系法和化学杀雄两系法以及自交不亲和系两系法^[1]。目前使用最广泛的是细胞质雄性不育三系法。

细胞质雄性不育三系法必须培育不育系、保持系和恢复系，三系配套才能开展制种。细胞质雄性不育三系法的主要缺点是：1)三系亲本的培育与繁殖程序复杂，隔离条件要求严格，三系选育周期长，育种和制种成本高；2)对细胞质雄性不育材料要求高，大多数细胞质雄性不育系稳定性较差，可产生微量花粉，导致杂交种纯度低；3)不育系只能被含对应恢复基因的恢复系才能恢复育性，因此，父本的来源狭窄，许多优良种质无法直接利用，降低了推广品种的遗传多样性；4)不育细胞质对产量具有负效应，限制了杂交种产量潜力的发挥。

细胞核不育三系法必须培育不育系、临保系和恢复系，三系配套才能制种。不育系和临保系改良周期很长，要注意在具有优异性状的组合中同时筛选两型系及与之同源的临保系，必要同时采用回交的策略，使它们的农艺、品质性状接近，以保证全不育系整齐一致。因此，亲本选育与繁殖周期长，成本高。油菜显性核不育的天然恢复材料较少，在制种过程中与外界串粉后会产生不育株，影响杂交种产量。

细胞核不育系的两系制种具有不育性比较彻底，制种纯度较高的优点，但制种时需要人工拔除母本中约50％的可育株，随着劳动力成本的不断提高，该方式会难以实施。

环境敏感细胞核雄性不育包括温敏核不育、光敏核不育、光温敏核不育等，统称光(及/或)温敏核不育^[3]。其缺点是对气候条件的要求严格，可供选择的制种区不多，一般必须在青海、甘肃或者高海拔山区春播进行制种。隐性光、温敏核不育两系制种可以直接利用优良常规品种作为恢复系，育种程序简单，但不育系的改良也需要5～10代的育种周期^[3]。

化学杀雄制种法通过化学杀雄剂诱导植物产生生理性雄性不育，优点是育种方法简单、可选择组合多，品种升级换代快。油菜中常用的化学杀雄剂有SX-1^[5]和苯磺隆等。然而，化学杀雄剂的油菜杀雄效果受到基因型、施药方式、喷药时期、药液浓度、植株个体差异以及环境因素的影响^[2]。由于化学杀雄制种法得到的杂交种种子纯度较低或杀雄效果不稳定，严重制约了其优势的发挥^[2]。化学杀雄制种法在油菜中的应用发展极为缓慢，甚至有面临被淘汰的可能。

自交不亲和两系制种法具有4大缺陷^[3]：1)自交不亲和系选育、扩繁比较麻烦，需要大量人工剥蕾授粉，即使反复使用食盐水方法，结实率也很低，难以提供足够大面积制种的高纯度亲本；2)连续自交可能导致生活力衰退；3)缺乏形态指示性状，难以识别去杂；4)对高温等环境因素敏感，制种有风险，所以在种子行业竞争日趋激烈的情况下，很难有大的发展。

由上可见，目前的杂交油菜制种方法主要存在以下问题：1)亲本育种程序复杂，周期长，成本高；2)亲本遗传多样性低，制约了油菜杂种优势潜力发挥；3)杂种纯度低；4)不方便实施化学除草。

2、除草剂与抗除草剂油菜

除草剂是用于杀死田间杂草的化学药剂。除草剂可分成灭生型和选择性除草剂两类。灭生性除草剂可杀死所有施用对象；选择型除草剂则可选择性地杀死某一类植物。自从人类在20世纪40年代开始使用化学除草剂以来，已有几百种化学物质被发现可以应用于这一领域。由于田间杂草会与农作物竞争土壤水分和养分，所以生产上利用除草剂来控制田间杂草已变得非常必要。此外，杂草可成为某些病虫害的媒介，有毒杂草和草籽还会大大降低农作物品质。

植物的除草剂抗性是指植物对某一除草剂的施用具有耐受性的现象，即使施用较大剂量除草剂，抗除草剂植物仍能够正常存活。培育抗除草剂品种有利于开展化学除草，降低人工除草的劳动强度，同时有利于水土保持。用于培育抗除草剂作物的除草剂类型都是灭生性除草剂，如草甘膦、草铵膦和溴苯腈。在油菜中，孟山都公司通过转基因方法已培育出抗草甘膦油菜品种GT73，拜耳公司培育出抗草铵膦油菜品种和抗溴苯腈油菜品种。先锋公司通过诱变手段培育出抗咪唑啉酮油菜品种。以上四类抗除草剂油菜品种都已经在加拿大大面积商业化生产(Bright,1992；Dekker and Comstock,1992；Dyer et al.；1993；Goldburg et al.，1990；Miller，1991)。

1)咪唑啉酮

咪唑啉酮类除草剂最早由美国氰胺公司于20世纪80年代研发问世的一类以植株体内支链氨基酸生物合成关键酶乙酰乳酸合成酶(ALS)为作用靶标的除草剂，目前主要用于大豆，烟草或非耕地防治一年生或多年生阔叶草与部分禾本科杂草。该类除草剂具有用量低，杀草谱广，除草效率高等优点^[7]。

研究表明，咪唑啉酮类除草剂作用靶标乙酰乳酸合成酶(ALS)或称作乙酰羟酸合成酶(AHAS)是控制植物体内合成支链氨基酸(包括缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸)公共途径的关键酶。咪唑啉酮类除草剂能被植株叶片和根系内吸，通过与ALS形成复合物阻断底物进入酶活性位点通路，抑制ALS活性，导致支链氨基酸生物合成受阻，进而影响植株体内蛋白质的合成，使除草剂在植株分生组织内积累而使植物逐步失绿，黄化，最后逐渐死亡^[7]。

国内外研究人员通过对作物种子，花粉，小孢子和愈伤组织的诱变及自然突变等手段，已相继获得了向日葵，玉米，小麦，水稻等对ALS类除草剂具有抗性的突变体。在油菜中，加拿大Swanson等采用小孢子化学诱变的方法获得了2个抗咪唑啉酮类除草剂的油菜突变体PM1和PM2^[9]。PM1和PM2均由ALS基因点突变所致，其中PM1是BnALS1基因上的653位丝氨酸(Ser)发生突变，PM2是基因BnALS3的第574位色氨酸(Trp)发生突变(以拟南芥的ALS氨基酸位置计算)。目前，国外商品化的抗咪唑啉酮油菜品种都是由这2个突变体转育而成。

2)草甘膦

草甘膦是一种苗期使用的灭生性除草剂，在全世界使用很广。草甘膦进入植物体后主要是抑制植物体内烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶(EPSPS)的合成，导致植物因缺乏芳香族氨基酸而死亡。抗草甘膦基因已被导入很多作物中，如烟草、矮牵牛、番茄、油菜、大豆等(Dyer，1994)。孟山都公司将抗草铵膦基因SP4-EPSPS导入油菜育成抗草铵膦油菜GT73。研究表明，该基因为单拷贝完全显性，F1杂种表现为对草甘膦抗性。

3)草铵膦

草铵膦是一种低毒、环境友好型的除草剂，不会在环境中长期残留。草铵膦的有效成分是草胺磷铵盐(PPT)，施用到植物后可以抑制植物谷氨酰胺合成酶(GS)的合成(Devineet al.,1993)，引起植物体内发生代谢障碍，迅速引起植物光合作用中止。有两个基因(bar和pat基因)编码的酶可代谢这一除草剂，将这两个基因导入植物可以培育抗草铵膦植物品种。从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中发现的bar基因和从绿色产色链霉菌(S.Viridochromogenes)发现的pat基因已被转入到了20多种作物中，如小麦、油菜、水稻、玉米、高粱、大麦、番茄等。抗草铵膦油菜品种已经在加拿大大面积商业化生产，推进了油菜化学除草和免耕制实施，显著提高了加拿大油菜生产的劳动生产率。Bar基因是一个显性基因，F1杂交种表现出对草铵膦除草剂的抗性，田间筛选非常容易。

4)溴苯腈

溴苯腈以辛酸酯、钠盐，钾盐的形式在国外被广泛用作芽后茎叶处理选择性触杀型除草剂。该除草剂主要由叶片吸收，通过抑制光合作用的各个过程，迅速使组织坏死。拜耳公司将肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种(Klebsiella pneumoniae subsp.Ozaenae)oxy基因导入油菜获得对抗溴苯腈油菜品系oxy235，该品系已经在加拿大大面积商业化生产使用。

由上可见，抗除草剂油菜的利用是切实可行的。转基因抗草甘膦、抗草铵膦和抗溴苯腈品种，以及非转基因抗咪唑啉酮油菜品系都可以利用。

参考文献：

1、傅廷栋.杂交油菜的育种和利用[M].2版.武汉：湖北科学技术出版社，2000：2－84。

2、官春云等编著.油菜杂种优势利用新技术——化学杀雄剂的利用[M]，科学出版社，2012。

3、李树林，周熙荣，周志疆，等.显性核不育油莱的遗传与利用[J].作物研究，1990，4(3)：27－32。

4、于澄宇甘蓝型油菜授粉控制系统研究现状与前景[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2011，36(9)，1-8。

5、于澄宇，胡胜武，何蓓如，等.化学杀雄剂EXP对油菜的杀雄效果[J].作物学报，2005，31(11)：1455－1459。

6、葛娟等.甘蓝型油菜光、温敏雄性不育系Huiyou50S花粉败育的细胞学观察[J].作物学报,2012,38(3)：541-548。

7、于澄宇，何蓓如.植物乙酰乳酸合成酶抑制剂作用方式及机理研究进展[J]。农药学学报，2011,13(3)：221-227。

8、张宝娟，赵惠贤，胡胜武.苯磺隆对甘蓝型油菜中双9号杀雄效果的研究

[J].中国油料作物学报,2010,32(4)：467-471。

9、Swanson E B，Herrgesell M J，Arnoldo M,Sippell D W,Wong R SC.Microspore mutagenesis and selection：canola plants with fieldtolerance tothe imidazolinones[J].Theor Appl Genet，1989,78：525-530。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种基于除草剂抗性的油菜杂交种制种方法及其应用。该方法是一种安全高效生产高纯度油菜杂交种的方法，具体提供了抗除草剂油菜品系在油菜杂交种制种中的应用。

本发明的目的是这样实现的：

一、基于除草剂抗性的油菜杂种制种方法(简称方法)

本方法包括下列步骤：

①将广谱性除草剂抗性基因导入油菜父本品系中，得抗除草剂油菜父本品系：

抗咪唑啉酮品系12WH381或抗草铵膦品系Z7B10；

抗咪唑啉酮品系12WH381于2016年4月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：P 201610，其乙酰乳酸合成酶基因ALS1序列为序列表第1号；

抗草铵膦品系Z7B10于2016年4月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：P 201611，其外源基因插入位点的左边界序列为序列表第4号；

通过杂交转育、回交转育或/和小孢子培养的手段获得抗除草剂品系用作杂交制种的父本；

②利用抗除草剂油菜父本品系的花粉与化学杀雄后不育的母本授粉，从母本群体植株上收获杂交种子；

③对杂交种进行除草剂包衣处理，或在种植杂交种时对杂交种群体喷施相应的除草剂，去除杂草的同时去除假杂种，得到油菜杂交种；

由于假杂种植株不具有抗除草剂基因，通过包衣处理或在杂种种植过程中3～5叶期喷施除草剂，假杂种就会慢慢死亡，相反真杂种植株由于通过授粉从父本中获得除草剂抗性基因，具有除草剂抗性，因此可以存活下来。

二、应用

①用于油菜的杂交制种，提高油菜杂交种纯度，实现油菜杂种优势的高效利用；

②用来改进现有油菜三系制种方法，降低杂交种生产成本；

③用来改进现有油菜核不育两系制种方法

用抗除草剂父本与雄性核不育母本授粉杂交，杂种苗期喷洒除草剂即可杀死可育株，不用人工拔除50％可育株；

④用来改进现有油菜化学杀雄制种系统。

目前的油菜化学杀雄制种体系主要存在杂种纯度低，杀雄效果不稳定的问题；杀雄剂浓度太高容易伤害植株生长发育，降低制种产量，浓度太低又会使不育率降低，用本发明提供的方法可以很好地解决该问题，有利于提高化学杀雄制种产量。

本发明具有下列优点和积极效果：

①不需要培育三系(不育系、保持系和恢复系)，大大简化了育种程序，节约育种成本；

②配制杂交组合不受不育基因和恢复基因的限制，因此亲本来源广泛，有利于选育不同育种目标的高产杂交组合；

③母本不带不育基因，不存在细胞质负效应，可降低不育细胞质遗传来源的单一化造成的病虫害风险，有利于提高杂种产量；

④克服目前三系育种中不育系微粉导致的杂种不纯的问题，保证杂种纯度和商品性；雄性不育系即使不育不彻底也可以使用，增加了母本品种遗传多样性，可提高选育优良组合的几率；

⑤由于带有抗除草剂基因作为标记，对亲本繁殖和制种场所的隔离条件要求不严，有利于制种场地的选择和降低制种成本；

⑥种子纯度鉴定非常简单(把收获的杂交种子在培养皿中发芽，用除草剂喷洒发芽后的幼苗，通过存活植株所占比例来计算纯度)，简化了杂交种纯度鉴定的繁琐程序，也避免了由于杂种纯度问题导致和农民的法律纠纷；

⑦使用浓度稍低的杀雄剂，降低杀雄剂对植株的伤害，杂交制种产量高于一般的化学杀雄制种产量；

⑧使用本发明生产的种子可以实施化学除草，显著降低人工除草带来的劳动力成本。

附图说明

图1是本方法的流程图；

图2是抗除草剂父本育种流程图；

图3是转基因品系Z7B10除草剂抗性试验图片，草铵膦除草剂最佳浓度为原液稀释200倍(PPT浓度675mg/l)

a：原液稀释25倍,PPT浓度5400mg/l；

b：原液稀释50倍,PPT浓度2700mg/l；

c：原液稀释100倍,PPT浓度1350mg/l；

d：原液稀释200倍,PPT浓度675mg/l；

e：原液稀释400倍,PPT浓度338mg/l；

f：原液稀释800倍,PPT浓度170mg/l。

图4是咪唑啉酮包衣效果图，抗咪唑啉酮品种(12WH381)种子用0.5％咪唑啉酮除草剂包衣后生长正常，而不抗咪唑啉酮品种(中油119)种子用0.5％咪唑啉酮除草剂包衣后发芽和幼苗生长受到严重抑制，最后死亡。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明：

1、方法

1.1、本方法如图1所示。

1.1.1、将广谱性除草剂抗性基因导入油菜父本品系中，得抗除草剂油菜父本品系；通过杂交转育、回交转育或/和小孢子培养的手段获得抗除草剂品系用作杂交制种的父本：如图2，

第1年(季)，以抗除草剂品种(代号B，如12WH318或Z7B10)为除草剂抗性供体亲本与优良受体亲本A进行杂交得到F₁代；

第2年(季)，以亲本A与上面的F₁代回交得到BC₁代，喷施相应的除草剂筛选出抗除草剂优良单株；

第3年(季)，以抗除草剂的BC₁代单株与亲本A回交得到BC₂群体，喷施相应的除草剂筛选出抗除草剂优良单株；

第4年(季)，以抗除草剂的BC₂代单株与亲本A回交得到BC₃群体，喷施相应的除草剂筛选出抗除草剂优良单株；

第5年(季)，以抗除草剂的BC₃代单株与亲本A回交得到BC4群体，喷施相应的除草剂筛选出抗除草剂优良BC₄单株；

第6年(季)，对优良BC₄单株进行自交，喷施除草剂选出抗除草剂的优良单株；

之后选出遗传稳定的抗除草剂优良株系，用作制种父本。

抗咪唑啉酮类除草剂油菜12WH318来自化学诱变，乙酰乳酸合成酶基因ALS1基因发生突变，ALS1编码蛋白序列的第638位由原来的丝氨酸(AGT)突变为天冬酰胺酸(AAT)。普通油菜都是天冬酰胺酸(AAT)。

其鉴别方法为：

DNA提取：油菜DNA提取根据Saghai-Maroof的方法稍作修改，从4g新鲜叶片中大量抽提高纯度的基因组DNA；DNA样品的纯度和浓度用紫外分光光度计Lamda 25(Perkinelmer)进行检测。

PCR扩增引物：

F：5′-TCAAGAACAGTTAGATCCAC-3′，R：5′-GATCACCAGCTTCATCTCT-3′；

PCR扩增体系：PCR反应体系包括10×La PCR BufferⅡ(Mg2+free)5μL，TaKaRaLA-Taq(5units/μL)0.5μL，25mM MgCl2(终浓度2.5mM)5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)8μL，模板DNA 1μL(<1μg)，引物各1μL(0.2～1.0μM)，补ddH2O至50μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min(产物约2Kb左右)，35个循环；PCR产物用1.0％(V/W)的琼脂糖凝胶电泳分离，将目的片段切胶回收纯化，连接于克隆载体pMD-18T上转化至大肠杆菌TOP10上，涂平板过夜挑取单克隆，摇菌并进行菌落PCR验证，挑取阳性克隆测序。通过Blast程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)分析序列的同源性，采用DNAMAN软件进行序列翻译和多重比对；抗咪唑啉酮类除草剂油菜12WH318的乙酰乳酸合成酶基因ALS1编码蛋白序列的第638位是天冬酰胺酸(AAT)，普通油菜都是天冬酰胺酸(AAT)。

除草剂鉴定法：在苗期用咪唑啉酮除草剂百垄通(240mg/L)处理，15d后抗咪唑啉酮油菜12WH318的植株全部存活，而普通油菜品种全部死亡。

抗咪唑啉酮油菜12WH318于2016年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：P 201610。

1.1.2、抗草铵膦除草剂油菜品系Z7B10

Z7B10是通过农杆菌介导遗转化方法将抗草铵膦bar基因导入甘蓝型油菜品种“中双7号”后选育而成，其分子特征为在Z7B10外源基因插入位点的左边界含有序列如序列表第4号。

抗草铵膦油菜Z7B10转化事件特异性定性PCR检测方法为：

DNA提取：取叶片用于DNA提取；油菜DNA提取根据Saghai-Maroof的方法稍作修改，从4g新鲜叶片中大量抽提高纯度的基因组DNA；DNA样品的纯度和浓度用紫外分光光度计Lamda 25(Perkinelmer)进行检测；

转化事件特异性定性PCR反应：PCR反应在25μL的体系中进行，包括：100ng基因组DNA，1X PCR bufer，2.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP’S，0.25μmol/L primersZ7BLV-F/Z7BLG-R，1U Hot Start Taq酶(TaKaRa)；

反应条件：94℃2min，1个循环；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃2min，1个循环；琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；

PCR引物：

Z7B1LV-F4(序列为ATTTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCA))和

Z7B1LG-R3(序列为CTTGTTCATAACTGTCAGCACGG)；

内标准基因hmg基因的引物hmg-F(TCCTTCCGTTTCCTCGCC)和

hmg-R(TTCCACGCCCTCTCCGCT)；

结果判断：用引物对Z7B1LV-F4/Z7B1LG-R3扩增得到阳性结果，扩增产物大小为313bp。

1.2、利用抗除草剂油菜父本品系的花粉与化学杀雄后不育的母本授粉，从母本群体植株上收获杂交种子：

以抗除草剂品种做父本，不抗除草剂品种做母本，隔行种植，行比为：父本：母本：父本＝1：4：1；根据父母本的开花期差异，调整播种时间，确保同时开花；母本现蕾期，植株最大花蕾2毫米左右时，喷施第一次杀雄剂，10～15天后喷第二次杀雄剂；成熟期前除去父本行，成熟时收获母本行的种子。

化学杀雄剂使用方法：

用化学杀雄剂苯磺隆在油菜花蕾处于单核期即最大花蕾长约2～3mm时喷施；用0.075～0.1mg/L的苯磺隆喷施油菜母本，喷药量为15～20mL/株；如果植株长势较好，应隔10～15天左右喷施第二次，喷施剂量为10mL/株；或用化学杀雄剂SX－1进行化学杀雄：取1号药剂2支，每支1ml，加水定容到14Kg配成6mg/L浓度的喷施用药，每株着药量为2.3～2.8ml；第一次施药后12天左右用1号药剂配成7～8mg/L浓度药液进行第二次喷施，喷施剂量与第一次相同。

1.3、对杂交种进行除草剂包衣处理，或在种植杂交种时对杂交种群体喷施相应的除草剂，去除杂草的同时去除假杂种，得到油菜杂交种：

1.3.1、杂交种除草剂包衣处理

材料：母本上收获的杂交种子，悬浮种衣剂(领先作物科学公司生产)和与父本除草剂抗性对应的除草剂；

方法：如果是抗咪唑啉酮品种，可以在悬浮种衣剂中添加甲咪唑烟酸(德国巴斯夫公司生产)；如果是抗草铵膦品种，则在悬浮种衣剂中添加BASTA除草剂；

以抗咪唑啉酮品种为例，具体方法为：先配置包衣剂，将购买的悬浮种衣剂用蒸馏水稀释7倍，并加入甲咪唑烟酸使其浓度达到0.5％的稀释浓度，充分搅拌均匀；再按药种质量比1：10进行包衣，按比例称号种子和种衣剂倒入烧杯中，用双手快速翻动、搓揉，拌匀后取出放在阴凉通风处阴干；

1.3.2、除草剂的使用

根据父本抗除草剂的种类，使用相应的除草剂；除草剂可用于种子包衣，也可以在杂种苗期喷施，不同除草剂的使用浓度和方法按照使用说明书执行；

表1、除草剂使用时期和最佳浓度

2、实验证据与技术要点

2.1、抗除草剂油菜父本品系12WH318选育及其对除草剂的抗性表现

油菜品系12WH318是我们经过咪唑啉酮除草剂筛选和系统选育而获得的非转基因抗咪唑啉酮品系；研究表明，该品系的咪唑啉酮抗性受一对显性基因控制；

2.1.1、亲本和F₁杂种的抗性表现

用12WH318与4个油菜品种进行正反交获得8个组合的杂种(表2)；在苗期用咪唑啉酮除草剂百垄通(240mg/L)处理，15d后统计死苗和活苗数；结果显示，亲本12WH318(阳性对照)的植株全部存活，而4个普通油菜品种(阴性对照)全部死亡。杂种F₁正反交组合没有显著差异，均表现出对咪唑啉酮除草剂良好抗性(表2)；表1结果说明12WH318咪唑啉酮抗性属于显性基因遗传，由细胞核基因控制，不存在细胞质效应；8个杂交组合结果一致。

表2亲本及杂交F₁对咪唑啉酮的抗性表现

2.1.2、分离世代咪唑啉酮抗性的遗传表现

对4个正交F₂代分离群体和4个BC₁回交群体的咪唑啉酮抗性表现进行鉴定，结果列于表3；结果显示，4个F₂代分离群体和4个BC₁回交后代均出现除草剂抗性分离，4个F₂代分离群体死苗与活苗数之比接近3：1，4个BC₁回交群体死苗与活苗数之比接近1:1。卡平方测验显示，卡方值均在0.07-1.86之间，显著性概率值均大于0.05，符合一对基因的理论分离比，说明油菜种质12WH318的咪唑啉酮抗性受一对显性基因控制。

表3咪唑啉酮抗性在分离群体中的遗传分析

2.2、抗草铵膦油菜Z7B10的选育及其除草剂抗性遗传表现

Z7B10是我们利用转基因方法获得的抗草铵膦除草剂甘蓝型油菜品系；外源基因呈单拷贝显性遗传；在油菜苗长至3-4片叶时，用Basta原液稀释150倍(即PPT浓度1000mg/L)喷施，3-5天即会出现反应，非转基因油菜表现为不同程度的失水状或枯黄状，最后死亡，而转基因抗草铵膦油菜生长正常(图3)；

根据转基因植株Southern杂交结果，转基因株系Z7B10、Z7B16和Z7B22中bar基因都是1个拷贝；从表4可知，Z7B10、Z7B16和Z7B22其抗性比率均在71-76％之间，符合孟德尔遗传规律一对基因遗传。用Z7B10做父本与5个非转基因油菜品种授粉杂交，杂种全部显示为对草铵膦除草剂具有抗性；说明抗草铵膦油菜品系Z7B10及其草铵膦抗性适合本制种体系使用。

表4转基因油菜T₁代除草剂抗性比率统计表

2.3、母本的化学杀雄实验

我们分别用化学杂交剂苯磺隆和SX－1进行油菜化学杀雄实验，均取得理想的效果。

2.3.1、化学杂交剂苯磺隆杀雄实验

苯磺隆(Monosulphuronester sodium，MES)是一种磺酰脲类除草剂，常用来防除小麦田间阔叶杂草。我们用3个不同浓度的苯磺隆分别处理6个甘蓝型油菜品种的现蕾期植株，花期调查花粉育性。在0.05-0.1mg/L浓度范围内，绵航油9号、青油14号、中双7号、中双9号、中双11号和恩油4号6个品种的花粉败育率均达到了90％以上，但即使是最高浓度的处理，仍观察到少量正常花粉存在。结果显示，随着苯磺隆浓度增加花粉败育率呈上升趋势，而且花蕾中的花粉总数量逐渐减少。不同的油菜品种对化学杂交剂的敏感性略有差异；

在喷施化学杀雄剂苯磺隆后，6个甘蓝型油菜品种均表现株高变矮，主花序长缩短，一次有效分枝数增加，单株有效角果数和每角果粒数减少。浓度越高影响越显著。

表5化学杂交剂对油菜植株农艺性状的影响

随着苯磺隆处理浓度的升高，6个油菜品种的全不育率逐渐升高，每角粒数逐渐减少；千粒重无明显变化；化学杂交剂苯磺隆对6个油菜品种农艺性状的影响具有极显著品种差异性。

表6化学杂交剂对油菜育性影响

根据前人研究和本实验结果，我们的结论是：在油菜花蕾处于单核期(约2-3mm)喷施化学杀雄剂效果最佳；用0.075-0.1mg/L的苯磺隆喷施油菜母本,喷药量为15-20mL；如果植株长势较好,应隔10-15天左右喷施第二次,喷施剂量为10mL。

2.3.2、化学杀雄剂SX-1

供试的化学杀雄剂SX-1由陕西农垦科教中心李殿荣研究员提供。SX-1有2种剂量，分别标有1和2二个代号，其中1号制剂可配制成药液直接喷施，2号制剂可配制成涂茎用母液。具体使用方法是：取2支1号药剂(每支1ml)，加水定容到14Kg配成6mg/L浓度使用。第一次喷药浓度为6mg/L，在油菜主花序最大花蕾长约1.5-2mm(花粉母细胞在单核期)时使用。每株着药量一般为2.3-2.8ml。第一次施药后12天左右用1号药剂配成7-8mg/L浓度药液喷第二次，喷施剂量与第一次相同。

2.4、化学杂交制种产量与纯度分析

2.4.1、抗草铵膦油菜品系Z7B10在油菜杂交制种中的应用

父本为抗草铵膦油菜品系Z7B10，母本分别为中双10号，中双12号和中双4号。因父母本花期基本一致,父母本同时播种(否则需错期播种，保证油菜父母本花期相遇)。父母本按1:2:1的比例种植,两边母本,中间父本，在油菜花蕾处于单核期(约2-3mm)，用0.075mg/L的苯磺隆喷施油菜母本,喷药量为15-20mL,10-15天左右喷施第二次,喷施剂量为10mL。喷施化学杀雄剂时,使用塑料薄膜遮挡父本,避免父本接触药液,降低父本花粉活力影响制种效果。

成熟期在从母本上收获杂交种子，播种至5-6叶期，喷施对应的除草剂(草铵膦)杀死非杂交种植株和杂草，统计总苗数和死亡苗数，鉴定化学杀雄杂交种纯度；并对收获杂交种进行产量分析。

从表7获知，3个杂交组合生产的杂交种亩产为31.28-43.52公斤，纯度为88％-97％。表7制种产量与纯度试验(以抗草铵膦品系Z7B10做父本与化学杀雄母本进行杂交)

2.5、除草剂包衣处理实验

包衣试剂：悬浮种衣剂由领先作物科学公司生产，甲咪唑烟酸由德国巴斯夫公司生产。将购买的悬浮种衣剂用蒸馏水稀释7倍，并加入甲咪唑烟酸使其浓度达到0.5％的稀释浓度，充分搅拌均匀后待用；

包衣过程：按包衣剂和种子质量比1:10，称好种子和种衣剂倒入容器中，用双手快速搅拌，搓揉，拌匀后取出放在阴凉通风处阴干。大量种子可以采用专门的机械加工。

结果：用0.5％浓度的除草剂(咪唑啉酮)对种子进行包衣处理，抗咪唑啉酮的品种12WH318发芽正常，根系长，生长受影响很小，成苗率80％以上。不抗咪唑啉酮的品种中油119发芽受到抑制，根系缩短，子叶黄化，生长过程中逐渐死亡(图4)。

表8、咪唑啉酮除草剂包衣对出苗率的影响

表9、咪唑啉酮除草剂包衣对成苗率的影响

实验表明，除草剂包衣对除草剂抗性品种的出苗几乎没有影响而对不抗除草剂的品种影响较大。抗性品种出苗后可以正常生长，而不抗的品种则逐渐变黄枯萎死亡。通过比较幼苗的生长情况可以看出0.5％的除草剂包衣可以明显抑制不抗品种的生长又对抗性品种几乎没有影响。

Claims

1.一种基于除草剂抗性的油菜杂交种制种方法，其特征在于包括下列步骤：

①将广谱性除草剂抗性基因导入油菜父本品系中，得到抗除草剂油菜父本品系：

抗咪唑啉酮品系12WH381或抗草铵膦品系Z7B10；

抗咪唑啉酮品系12WH381保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：P201610，其乙酰乳酸合成酶基因ALS1序列为序列表第1号；

抗草铵膦品系Z7B10保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：P201611，其外源基因插入位点的左边界序列为序列表第4号；

③对杂交种进行除草剂包衣处理，或在种植杂交种时对杂交种群体喷施相应的除草剂，去除杂草的同时去除假杂种，得到高纯度的油菜杂种或群体。

2.按权利要求1所述的油菜杂种制种方法的应用，其特征在于：

①用于油菜的杂交制种；

②用来改进现有油菜三系制种方法；

③用来改进现有油菜核不育两系制种方法；

④用来改进现有油菜化学杀雄制种系统。