CN109511547A - 一种非转基因质不育抗除草剂杂种制种技术 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于非转基因抗除草剂油菜杂交种制种的技术方法，本方法将广谱性非转基因除草剂抗性基因导入到油菜细胞质雄性不育系中，获得纯合非转基因抗除草剂油菜母本品系；父本品系为不抗除草剂油菜细胞质雄性不育恢复系；制种时，利用非抗除草剂父本的花粉给具有非转基因抗除草剂的母本授粉，从而在母本群体上收获非转基因抗除草剂杂交种子；对所获得的油菜杂交种子可进行除草剂包衣处理，或在大田种植管理过程中对杂交种群体喷施相应的除草剂，在去除田间杂草的同时去除杂种中混杂的假杂种，得到杂种一致性群体，以保证油菜生产安全。

Description

一种非转基因质不育抗除草剂杂种制种技术

技术领域

本发明属于植物育种技术领域,涉及一种非转基因抗除草剂油菜细胞质雄性不育系的选育和非转基因抗除草剂油菜杂交种制种方法及其应用。

背景技术

油菜的发展在我国大致经历了三个阶段，第一阶段是白菜型油菜及农家种的栽培，第二阶段是从国外引入甘蓝型油菜，常规种的种植，第三阶段是以“秦油2号”为代表的杂交种的种植。目前油菜产量的大幅度提高主要得益于杂种优势的利用，甘蓝型油菜杂交种的种植面积占到我国油菜种植面积的80％以上。

在我国，油菜杂种优势的利用途径主要有细胞质雄性不育三系法、细胞核雄性不育三系法、细胞核雄性不育两系法、化学诱导雄性不育两系法等，在这么多的油菜杂种优势利用途径中，都有着各自的优缺点，细胞质雄性不育三系法是应用最早也是最成熟的杂优利用方法，以“秦优2号”为代表，但缺点是不育系在初花期低温下会产生微量花粉；细胞核雄性不育三系法不育系的不育性很彻底，但较难配出强优势的杂交组合；细胞核雄性不育系两系法不育系的育性很彻底，但在制种时需要拔除母本系中分离的50％可育株，在实际杂种生产中工作量大，成本高，难以保证种子纯度；化学诱导雄性不育两系法尽管组合测配自由，父母本选择范围广，在大面积制种时对母本进行化学诱导雄性不育过程中，受多个因素的限制，较难保证母本雄性不育性诱导的彻底和持续。综合所有因素，在实践中油菜杂种优势利用途径应用最多最广泛的是油菜细胞质雄性不育三系法，但在目前品种的特性下，制种时父母本必须分开种植和人工割除父本，较难实现机械化制种。

杂草是农作物生长过程中除虫害外对农作物生长影响最大的生物逆境胁迫，严重的制约着农作物各生长阶段的生物体建成，可造成农作物的产量和品质的下降，从而影响到农业生产活动。随着科技的发展，利用适宜的除草剂在田间进行化学除草不光可以有效的控制杂草对农作物的危害，保证农作物产量能力的发挥，还可以把人们从繁重的田间劳动中解放出来，降低人工投入成本，提高田间管理效率和生产效益。

我国推广使用的田间除草剂主要是苯磺隆类和磺酰脲类除草剂，此类除草剂主要是针对双子叶杂草，但油菜是双子叶作物，对此类除草剂表现出不耐受现象，因此油菜田间无法使用此类除草剂，因此选育能在使用较大剂量除草剂的情况下且能正常存活和生长、对除草剂有很强耐受能力的抗除草剂品种是实现油菜田间化学除草和机械化管理的基础，此类杂交种兼具除草和去杂的功能，对油菜高效生产有重要意义。

目前，在国外抗除草剂油菜品种已开始大面积推广，但多数都是转基因品种，在我国还没有批准种植此类品种，因此选育非转基因抗除草剂对我国油菜发展有重大意义。当前在我国很多科研单位通过诱变的方式获得了抗除草剂油菜种质资源，而且正在培育抗除草剂油菜杂交种，但这些多数是对父本的改良，将父本选育成具有抗除草剂特性油菜，母本为非抗除草剂油菜，在制种中需要提前割除父本，防止父本混入杂交种中，杂交种生产环节的程序没有得到简化，投入成本没有降低，投入劳动力较多难以实现机械化。

随着城镇化的发展，农村劳动力向城市的转移，用于农业方面的劳动力越来越少，油菜轻简化栽培已成油菜种植业发展的必由之路，油菜栽培正由过去的育苗移栽逐步转向油菜直播的种植方式。栽培方式的改变，使得机械化栽培油菜越来越受到人们的关注，但目前机械化多用在收获阶段，尽管已研究出适宜油菜播种的机械，但在实际生产中使用较少，多数是由于油菜籽粒小，播种量较难控制，往往导致播种密度过大，种子成本提高，油菜田间管理成本也提高。由于缺乏集约化轻简化的制种技术措施，当前油菜制种的现状还依然是以一家一户一块地的制种模式，种植、割除父本、收获均是人工化，导致制种成本较高，而且产出效益低下，农民积极性不高，大面积制种较难落实；传统细胞质雄性不育三系制种法的亩产量在150斤左右，产量较低，在制种点每公斤收购价在10元左右，随着运输加工包装销售等环节的附加，每斤种子在60元左右，在油菜机械直播条件下，每亩地0.6斤左右，而且不同的密度用种量有区别；解决制种面临的人工瓶颈问题，降低制种成本，高效化机播是油菜机械化栽培的基础，也是恢复性发展油菜生产的基础。

因此，非转基因质不育抗除草剂杂种制种技术即可减少制种用工量，降低制种成本，集约化规模化制种，也可解决机械化播种用种成本高和有效控制种植密度的难题、实现机械化化学除草田间管理，提高油菜种植效益和农民种植的积极性。

在育种实践中，通过将诱变处理得到具有非转基因抗除草剂特性的油菜保持系中双9号B，进而通过连续的回交转育，选育出具有非转基因抗除草剂特性的油菜保持系中双9号KB和不育系中双9号KA。具有非转基因抗除草剂特性的油菜不育系中双9号KA与不抗除草剂油菜恢复系16snp223-2配置组合，选育出具有非转基因抗除草剂特性的杂交油菜，命名为秦油抗1633。在制种中按照一定父母本行比进行种植，终花期可以不用割除父本，待油菜成熟时再分别收获父本系和母本系。这样不仅可以减少父本割除时人工的投入，简化了制种环节，还可以收获父本，提高油菜生产的效益。

发明内容

本发明的目的在于解决上述问题，弥补当前技术存在的不足而提供的一种非转基因质不育抗除草剂杂种制种技术及应用。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的。

附图说明

图1非转基因抗除草剂油菜育种方法流程图。

本发明包括以下步骤：

1、非转基因质不育抗除草剂杂交种的获得

(1)选取陕西省杂交油菜研究中心育成的甘蓝型油菜细胞质雄性不育保持系中双9号B20斤种子，利用1％的EMS溶液浸泡20小时后晾干，在人工气候室内，分批次播于苗盘中，同时在一苗盘中播种未处理的种子做对照。

(2)等种子萌发长至两子叶完全伸展后即用浓度为2ml/L的草甘膦溶液处理喷雾处理，同时对照也采取相同方法处理。

(3)10天后调查幼苗死亡情况，诱变油菜苗喷施草甘膦后将没有受到除草剂伤害的幼苗移栽到营养钵中放在人工气候室中继续生长。

(4)在抗性植株花期，对其套袋自交，成熟期收获种子。

(5)对步骤(4)收获的抗性种子，于9月20号左右播于试验田中，同时播种未处理的种子做对照，在油菜生长到三叶一心期时喷施浓度为2ml/L的草甘膦溶液处理。10天后调查幼苗死亡情况，对除草剂伤害不明显幼苗进行二次喷施该除草剂以去除假抗性株。

(6)对正常生长的诱变抗性植株在花期全部套袋自交，对每个抗性植株编号，成熟期收获种子后，对所收获的抗性种子做抗性基因检测和转基因鉴定。

(7)对步骤(6)所收到的抗性种子继续做苗期抗性鉴定，同时在花期与非抗除草剂甘蓝型油菜不育系中双9号A进行杂交。

(8)第二年9月20号左右对步骤(7)中所得到杂交组合及相应父母本进行种植，在三叶一心期时喷施浓度为2ml/L的草甘膦溶液处理。

(9)对未受草甘膦影响的杂交组合在花期调查其雄性不育性，同时对相应父本套袋自交。选择对测组合全为雄性不育的组合与其相应父本继续进行回交。

(10)通过步骤(8)和步骤(9)连续多代在苗期喷施草甘膦选择抗性植株和连续相应回交转育，育成抗草甘膦除草剂细胞质雄性不育系，对纯和抗草甘膦回交父本保持系命名为中双9号KB，对抗草甘膦纯和不育系命名为中双9号KA。

(11)对步骤(10)中所获得纯系抗草甘膦保持系中双9号KB在专业机构做转基因检查，结果为未检出转基因成分。

(12)育成非转基因抗除草剂油菜细胞质雄性不育保持系中双9号KB和不育系中双9号KA。

(13)利用步骤(12)中所育成的非转基因抗除草剂油菜细胞质雄性不育系中双9号KA与本单位自育的优良细胞质雄性不育恢复系16snp223-2配制出抗除草剂杂交油菜秦油抗1633。

非转基因质不育抗除草剂杂种具体实施例过程：

1、非转基因抗除草剂油菜的获得

(1)2008年3月选取陕西省杂交油菜研究中心育成的甘蓝型油菜细胞质雄性不育保持系中双9号B20斤种子，利用1％的EMS溶液浸泡20小时后晾干，在人工气候室内，分批次播于苗盘中，同时在一苗盘中播种未处理的种子做对照。

(2)等过程(1)播于苗盘的种子萌发长至两子叶完全伸展后即用浓度为2ml/L的草甘膦溶液喷雾处理，同时对照也采取相同方法处理。

(3)10天后调查过程(2)幼苗死亡情况，诱变油菜苗喷施草甘膦后将没有受到除草剂伤害的幼苗移栽到营养钵中放在人工气候室中继续生长。

(4)对过程(3)中没有受到除草剂伤害的油菜，在抗性油菜植株花期，对其套袋自交，2008年7月收获种子。

(5)对过程(4)所收获的抗性种子继续做苗期抗性鉴定，同时做抗性基因检测和转基因鉴定。

(6)过程(5)所得到的非转基因抗除草剂油菜中双9号，于2008年9月20号左右播于试验田中，同时播种未处理的种子做对照，在油菜生长到三叶一心期时喷施浓度为2ml/L的草甘膦溶液处理；10天后调查幼苗死亡情况，对除草剂伤害不明显的幼苗进行二次喷施该除草剂以去除假抗性株。

(7)2009年4月对过程(6)中正常生长的诱变抗性植株在花期全部套袋自交，对每个抗性植株编号，同时在花期与非抗除草剂甘蓝型油菜不育系中双9号A进行单株对测，得F1。

(8)2009年9月20号左右对过程(7)中所得到单株对测组合及相应父本进行种植，在三叶一心期时喷施浓度为2ml/L的草甘膦溶液处理。

(9)2010年4月对过程(8)中未受草甘膦影响的对测组合在花期调查其雄性不育性，同时对相应父本套袋自交。选择对测组合全为雄性不育的组合与其相应父本继续进行单株回交，成熟期收获对测组合和相应父本，得BC1代。

(10)2010年9月通过对过程(9)所获的回交组合及相应父本进行种植，在三叶一心期时喷施浓度为2ml/L的草甘膦溶液处理。

(11)2011年4月对过程(10)中未受草甘膦影响的回交组合在花期调查其雄性不育性，同时对相应父本套袋自交。选择对测组合全为雄性不育的回交组合与其相应父本继续进行回交，成熟期收获回交组合和相应父本，得BC2代。

(12)2011年9月通过对过程(11)所获的回交组合及相应父本进行种植，在三叶一心期时喷施浓度为2ml/L的草甘膦溶液处理。

(13)2012年4月对过程(12)中未受草甘膦影响的回交组合在花期调查其雄性不育性，同时对相应父本套袋自交。选择对测组合全为雄性不育的回交组合与其相应父本继续进行回交，成熟期收获回交组合和相应父本，得BC3代。

(14)2012年9月通过对过程(13)所获的回交组合及相应父本进行种植，在三叶一心期时喷施浓度为2ml/L的草甘膦溶液处理。

(15)2013年4月对过程(14)中未受草甘膦影响的回交组合在花期调查其雄性不育性，同时对相应父本套袋自交。选择对测组合全为雄性不育的回交组合与其相应父本继续进行回交，成熟期收获回交组合和相应父本，得BC4代。

(16)2013年9月通过对过程(15)所获的回交组合及相应父本进行种植，在三叶一心期时喷施浓度为2ml/L的草甘膦溶液处理。

(17)2014年4月对过程(16)中未受草甘膦影响的回交组合在花期调查其雄性不育性，同时对相应父本套袋自交。选择对测组合全为雄性不育的回交组合与其相应父本继续进行回交，成熟期收获回交组合和相应父本，得BC5代。

(18)2014年9月通过对过程(17)所获的回交组合及相应父本进行种植，在三叶一心期时喷施浓度为2ml/L的草甘膦溶液处理。

(19)2015年4月对过程(18)中未受草甘膦影响的回交组合在花期调查其雄性不育性，同时对相应父本套袋自交。选择对测组合全为雄性不育的回交组合与其相应父本继续进行回交，成熟期收获回交组合和相应父本，得BC6代；将纯和的回交父本命名为中双9号KB，回交转育得到的纯和不育系命名为中双9号KA。

(20)2015年9月播种过程(19)中所选育出来的非转基因抗除草剂细胞质雄性不育系中双9号KA和单位自育非抗除草剂恢复系16snp223-2。

(21)2016年4月将过程(20)中所选育出来的非转基因抗除草剂细胞质雄性不育系中双9号KA做母本，非抗除草剂恢复系16snp223-2做父本，进行杂交组合配制，成熟期收获杂交种。

(22)2016年9月将过程(21)所配制的杂交组合播于杨凌试验地，在三叶一心期时喷施除草剂，喷施十天后，杂交组合表现出抗除草剂特性，对该杂交组合命名为秦油抗1633。

2、非转基因质不育抗除草剂杂种制种

(1)隔离区的选择：抗除草剂杂交油菜秦油抗1633种植点选择在甘肃张掖市民乐县丰乐乡，该制种点四面环山，隔离区条件优良。

(2)种植方式：2017年3月28日采取春播的方式在隔离区内，对抗除草剂杂交油菜秦油抗1633的父本系、母本系按照母本5行父本2行的行比覆黑膜进行种植(可有效防治田间自生苗和杂草的生长，同时保证一播全苗)。

(3)苗期管理：对抗除草剂杂交油菜秦油抗1633制种田父母本中的杂株进行去除。

(4)终花期管理：由于抗除草剂杂交油菜秦油抗1633的父本系不具有抗除草剂的性状，可在父本终花时不必割除父本(非抗除草剂杂交种制种田父本终花后，需要割除父本，以免成熟期分别收获时母本中混杂父本)。

(5)在收获期：可对成熟的抗除草剂杂交油菜秦油抗1633的父母本进行单收，在收获母本种子时，还可以额外收获到父本种子(传统制种在父本终花后割除父本，以免混杂)，提高制种产出率。

3、非转基因抗除草剂杂交油菜秦油抗1633的制种效益

非转基因抗除草剂杂交油菜秦油抗1633在制种过程中，母本系为抗除草剂油菜，父本系为非抗除草剂油菜，在父本终花后不用及时割除父本，可在成熟期时再单独进行割除，农户收获期可较割除父本的管理方式额外收获父本，在秦优抗1633油菜品种制种中每亩平均额外收获父本157.3斤，若按照普通商品菜籽每斤2.5元计算，可额外收入393.25元。

表1秦油抗1633制种田父本割除效益比较

4、非转基因抗除草剂杂交油菜秦油抗1633田间应用

由于抗除草剂杂交油菜秦油抗1633的父本系及假杂种不具有抗除草剂的性状，在大田种植管理过程中苗期对抗除草剂杂交油菜秦油抗1633群体喷施草甘膦除草剂，在去除田间杂草的同时去除杂种中混杂的父本和假杂种，得到一致性杂种群体，以保证油菜生产安全。

Claims (6)

1.一种非转基因质不育抗除草剂杂种制种方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对非抗除草剂中双9号B保持系进行EMS诱变处理，通过抗性筛选、抗性基因鉴定和转基因检测，获得广谱性非转基因抗草甘膦除草剂油菜品系中双9号B，对其命名为中双9号KB；

(2)将步骤(1)中所获的非转基因抗草甘膦除草剂油菜品系中双9号KB作为父本与油菜细胞质雄性不育系母本进行杂交得F1代，F1代表现出全雄性不育性状，近而测得非转基因抗草甘膦除草剂油菜品系中双9号KB为纯合油菜细胞质雄性不育保持系；

(3)利用步骤(2)中所获得的纯合非转基因抗除草剂油菜细胞质雄性不育保持系中双9号KB，再与非抗除草剂细胞质雄性不育系杂交、回交，转育成具有稳定遗传的非转基因抗除草剂性状的细胞质雄性不育系，将该不育系命名为中双9号KA；

(4)利用步骤(3)中选育的具有非转基因抗除草剂性状的细胞质雄性不育系中双9号KA做母本与非抗除草剂油菜细胞质雄性恢复系16snp223-2做父本进行杂交组合配制，获得具有抗除草剂性状的优良杂交组合，将该杂交组合命名为秦油抗1633。

(5)对步骤(4)中选育的抗除草剂杂交油菜秦油抗1633的父本系、母本系按照母本5行父本2行的行比进行种植。

2.权利要求1所述的方法，其中步骤(4)利用非抗除草剂油菜细胞质雄性恢复系16snp223-2做父本的花粉给具有非转基因抗除草剂油菜雄性不育系中双9号KA做母本授粉，从而在母本群体上收获非转基因抗除草剂杂交种子。

3.权利要求1所述的方法，其中步骤(4)在杂交种制种过程中，对父本系、母本系按照一定的行比进行种植。

4.权利要求1所述的方法，其中步骤(4)杂交种制种过程中，父本可在终花期后不割除父本，等到成熟期进行割除收获。

5.权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中所选育的杂交种的种植方法，其特征在于对杂交种子可进行除草剂包衣处理；或者在大田种植管理过程中对杂交种群体喷施相应的除草剂，去除田间杂草的同时去除杂种中混杂的假杂种。

6.权利要求1-5中所述的油菜杂种制种方法的应用,其特征在于：

(1)用于甘蓝型油菜的杂交种生产；

(2)用来改进现有油菜细胞质三系制种方法，降低制种的难度和成本、提高制种效益；

(3)用于杂交组合的配制，父本的选择范围更广。