CN113424720B

CN113424720B - 一种青稞抗散黑穗病的鉴定方法

Info

Publication number: CN113424720B
Application number: CN202110724995.6A
Authority: CN
Inventors: 姚小波; 蔺瑞明; 刘何春; 扎罗; 雷雷萍; 李杨; 次仁央垃; 赵远; 庞博; 何东; 安震
Original assignee: Institute Of Agriculture Tibet Autonomous Region Academy Of Agriculture And Animal Husbandry
Current assignee: Institute Of Agriculture Tibet Autonomous Region Academy Of Agriculture And Animal Husbandry
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2041-06-29
Also published as: NL2031391A; CN113424720A; NL2031391B1

Abstract

本发明提供了一种青稞抗散黑穗病的鉴定方法，属于植物抗病技术领域。青稞散黑穗病病原菌通过侵染胚部而使种子带菌，播种后种子发芽随生长点而系统侵染，最后导致花器被侵染形成冬孢子粉。本发明通过分离提取病穗的冬孢子，配制冬孢子悬浮液，利用注射接种法将悬浮液精准接种在青稞小花内，引起胚部侵染，导致种子带菌，待青稞成熟后，收获接种病原菌的青稞种子；将青稞种子播种，抽穗期统计病株率，根据抗散黑穗病分级标准确定青稞材料抗性，得到青稞品种(系)的抗性水平。本发明提供的鉴定方法具有鉴定准确率高、操作简便的特点，能够准确反映青稞品种的抗性水平。相比于田间自然发病进行抗性鉴定，更能客观反映品种的抗行水平。

Description

一种青稞抗散黑穗病的鉴定方法

技术领域

本发明属于植物抗病技术领域，具体涉及一种青稞抗散黑穗病的鉴定方法。

背景技术

散黑穗病是青稞种传真菌病害，病原为裸黑粉菌(Ustilago nuda(Jens.)Rosrr.或Ustilago nuda(C.N.Jensen)Rosrr.)，西藏青稞种植区均有不同程度发生。一般地块发病率为4％～5％，造成的产量损失5％左右。抗病品种是控制青稞散黑穗病最经济有效的方法，抗源的鉴定与筛选是抗病品种选育的关键。

裸黑粉菌在花期通过侵染胚部(Embryo infecting)使种子带菌，播种后种子发芽随生长点而系统侵染，最后导致花器被侵染形成冬孢子粉，进而形成散黑穗。裸黑粉菌是种传幼胚侵染入的系统侵染病害。迄今为止，国内对青稞资源的抗散黑穗病鉴定研究少，主要采用田间自然发病，进行抗性鉴定及抗源筛选。此种方法鉴定，在无法保证黑粉菌是否侵染条件下进行鉴定，鉴定的结果与材料抗性差异大，不能准确反映材料的抗病性水平等。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种青稞抗散黑穗病的鉴定方法，能将青稞裸黑粉菌精确接种到青稞种子上，诱发青稞散黑穗病，能客观准确反映品种(系)抗性水平。

本发明提供了一种青稞抗散黑穗病的鉴定方法，包括以下步骤：

1)种植青稞，得到青稞植株；

2)待步骤1)中所述青稞植株长出穗状花序时，将冬孢子悬浮液注射至小花内稃中，待青稞成熟后，收获接种病原菌的青稞种子；

3)将步骤2)中收获的青稞种子播种，抽穗后统计青稞的病株率，根据抗散黑穗病分级标准判断青稞抗散黑穗病的抗性。

优选的，步骤2)中所述冬孢子悬浮液为含体积百分含量为0.024％～0.026％的吐温20的0.8～1.2g/L冬孢子悬浮液。

优选的，所述冬孢子的获得方法，将感染裸黑粉菌的青稞病穗风干，粉碎后过筛，收集筛下物。

优选的，步骤2)中所述冬孢子悬浮液在所述注射前配制。

优选的，步骤2)中在所述注射前，将所述穗状花序中已经授粉结实的花序和花序下部较小的花剔除。

优选的，在所述注射时，注射用针头与穗轴上方呈5°～10°夹角。

优选的，步骤2)中所述注射的剂量为每毫升冬孢子悬浮液注射50～60个小花。

优选的，步骤2)中所述注射从穗状花序的基部向上注射；

所述注射后，剪去麦穗的顶部0.8～1.2cm长的花序。

优选的，步骤3)中所述播种为每个品种播种2～3行，行长2～3m，每行播种约20～30粒种子，播种深度8～12cm，不同青稞品种之间间隔1～2行。

优选的，所述抗散黑穗病分级标准如下：

青稞抗散黑穗病的抗性分为6个等级：

病株率为0，青稞植株为散黑穗病免疫品种；

病株率为1％～15％，青稞植株为高抗品种；

病株率为15％～35％，青稞植株为中抗品种；

病株率为35％～55％，青稞植株为中间过渡品种；

病株率为55％～75％，青稞植株为中感品种；

病株率为75％～100％，青稞植株为高感品种。

本发明提供了一种青稞抗散黑穗病的鉴定方法，本发明利用注射接种法，将冬孢子悬浮液精准接种在青稞穗状花序上，诱发青稞散黑穗病，相较于田间自然发病具有较高的发病率，然后按照抗散黑穗病分级标准进行青稞品种抗性鉴定，得到不同青稞品种的抗性水平。本发明提供的鉴定方法具有鉴定准确率高、操作简便的特点，能够准确反映青稞品种的抗性水平。

进一步的，本发明具体限定了冬孢子悬浮液的成分，除包含冬孢子外，还包含Tween-20，有利于提高冬孢子的分散性，从而提高在青稞花序的染病几率，从而进一步提高青稞散黑穗病的发病率，更有利于准确鉴定青稞品种对散黑穗病的抗性。

附图说明

图1为本发明提供的一种青稞抗散黑穗病的鉴定方法流程图。

具体实施方式

1)种植青稞，得到青稞植株；

本发明将将青稞种子播种，得到青稞植株。

本发明提供的方法适用于所有品种的青稞种子，对青稞种子的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的青稞种子即可。本发明对所述青稞种子的播种方法也没有特殊限制，采用本领域所熟知的播种方法即可。

待所述青稞植株长出穗状花序时，本发明将冬孢子悬浮液注射至小花内稃中，待青稞成熟后，收获接种病原菌的青稞种子。

在本发明中，所述冬孢子悬浮液优选为含体积百分含量为0.024％～0.026％的吐温20的0.8～1.2g/L冬孢子悬浮液，更优选为含体积百分含量为0.025％的吐温20的1.0g/L冬孢子悬浮液。所述冬孢子的获得方法，优选将感染裸黑粉菌的青稞病穗风干，粉碎后过筛，收集筛下物。所述冬孢子悬浮液优选现用现配，优选在所述注射前1～3h配制。

在本发明中，在所述注射前，优选将所述穗状花序中已经授粉结实的花序和花序下部较小的花剔除。在所述注射时，注射用针头与穗轴上方优选呈5°～10°夹角，以便冬孢子悬浮液尽可能流入小花中，而不发生外漏，提高感染几率。所述注射的剂量优选为每毫升冬孢子悬浮液注射50～60个小花。所述注射优选从穗状花序的基部向上依次注射，待注射完一侧后再接种另一侧的小花。所述注射后，优选剪去麦穗的顶部0.8～1.2cm高的小穗，更优选为剪去麦穗的顶部1.0cm长的花序。

得到青稞种子后，本发明将收获的青稞种子播种，抽穗后统计青稞的病株率，根据抗散黑穗病分级标准判断青稞抗散黑穗病的抗性。

在本发明中，所述播种优选为每个品种播种2～3行，行长2～3m，每行播种约20～30粒种子，播种深度8～12cm，不同青稞品种之间间隔1～2行(接菌圃)。鉴定圃：每个品种或株系点播50-60粒接种后收获的种子，株距10cm，行长3m，播种2行，品种或株系之间间隔1行。

在本发明中，所述病株率按照公式I计算：

病株率(％)＝感病株数量/总株数×100％公式I

在本发明中，所述抗散黑穗病分级标准优选如下：青稞抗散黑穗病的抗性分为6个等级：病株率为0，青稞植株为散黑穗病免疫品种；

病株率为1％～15％，青稞植株为高抗品种；

病株率为15％～35％，青稞植株为中抗品种；

病株率为35％～55％，青稞植株为中间过渡品种；

病株率为55％～75％，青稞植株为中感品种；

病株率为75％～100％，青稞植株为高感品种。

在本发明中，优选根据连续2或3年生长季的抗病性鉴定试验中最高病株率确定待鉴定品种的抗病水平。

下面结合实施例对本发明提供的一种青稞抗散黑穗病的鉴定方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

青稞种质资源抗散黑穗病(Barley loose smut)的鉴定方法

1.冬孢子采集

在开花抽穗至灌浆乳熟期，青稞散黑穗病病穗刚抽出叶鞘冬孢子尚未散落之前，从拉萨、山南、日喀则、林芝、昌都散黑穗病穗发生区及时采集病穗，放置于玻璃纸袋中，记录采集时间、采集地点，带回实验室，在阴凉通风之处充分干燥后，密封于塑料袋中，4℃冰箱保存。

2.接菌材料

4月中旬在拉萨拉萨作物有害生物野外观测实验站病害鉴定圃种植接种的多个品种或株系，每份材料播种2行，行长1米，行距30cm，共种植鉴定材料497份，其中234份为接菌组，263份材料为不接菌，在自然条件下自然接菌。田间管理按当地正常管理。在青稞进入开花期每天调查各个品种或株系的花器发育阶段，当穗状花序的第一个小穗刚露出叶鞘至麦穗完全抽出叶鞘时，为最佳接菌时间，每天调查后给适合接种的品种挂标签，第二天进行接种。

3.冬孢子悬浮液的配制

将不同区域病穗去除杂质，病穗用搅拌器打2～3s，打碎病穗组织，用细筛去除杂质，取拉萨、山南、日喀则、林芝、昌都不同来源冬孢子粉各0.2g，用自来水配制成浓度为1g冬孢子粉/1L水的冬孢子悬浮液，剧烈摇均匀，加入5滴Tween-20，得到冬孢子悬浮液。将配制好的冬孢子悬浮液用双层显微镜擦镜纸过滤，得到的孢子悬浮液。

4.接菌

采用注射接种法接种散黑粉菌。选择大穗健康植株，注射接种前将已经授粉结实的和花序下部较小的花剔除。采用1mL注射器吸入冬孢子悬浮液，注射器与穗轴的夹角为5°～10°，将针头斜插入小花柔软内稃的上半部分，当针尖触碰到较坚硬的外稃时。将冬孢子悬浮液注入小花直至小花鼓起来。外稃的颜色略有变化。每毫升冬孢子悬浮液注射50～60个小花。注射顺序从麦穗花序基部一侧的小花开始依次向上接，然后再注射接种另一侧的小花。接种后剪去麦穗顶部约1cm长的小穗(花序)，表示麦穗已被接种。每个品种或株系接种3～4穗，待青稞成熟后，收获并脱粒接种携带病原菌的种子。

5.抗病性鉴定

第二季播种接菌的种子和没接菌的种子各263份，每个品种或株系点播50～60粒，株距10cm，行长3m，播种2行。品种或株系之间间隔1行。具体品种和株系见表2，本实施例涉及的所有品种和株系均可从商业途径购买或种子库中获得。抽穗后统计总株数和病株数，确定感病株比例。感病株为至少含有一个分蘖株的整穗或部分小穗形成黑粉状冬孢子粉，抗病株任何一个分蘖株上不产生冬孢子粉。

6.抗病性分级标准(Rating scale of resistance)见表1。

表1青稞品种抗散黑穗病分级标准

7.品种抗病性评价(Resistance assessment)

各青稞品种抗病性评价结果见表2。

表2品种抗性调查表

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通过上述结果可以看出，接菌并收获带菌材料262份，其中包括免疫材料94份，占35.88％，感病材料168份，占64.12％，高感材料21份，而对照未接菌依靠自然发病的发病材料仅有ZDM4753、昆仑2号、ZDM5566，病株率为2％、6％、1％，感病率占1.15％。可见，通过人工注射接菌方法，种子带菌率远远高于自然发病，该方法能将青稞裸黑粉菌精确接种到青稞种子上，诱发青稞散黑穗病；按照抗散黑穗病分级标准，进行青稞品种(系)穗期抗性鉴定，能客观准确反映品种(系)抗性水平，能用于青稞资源抗散黑穗病鉴定，可用于抗源筛选；该方法简单易行、准确率高、操作性强，同时工作量也较大，熟练人员每天接种约250穗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种青稞抗散黑穗病的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)种植青稞，得到青稞植株；

在所述注射前，将所述穗状花序中已经授粉结实的花序和花序下部较小的花剔除；

在所述注射时，注射用针头与穗轴上方呈5°～10°夹角；

所述冬孢子悬浮液为含体积百分含量为0.024％～0.026％的吐温20的0.8～1.2g/L冬孢子悬浮液；

所述注射从穗状花序的基部向上注射；所述注射后，剪去麦穗的顶部0.8～1.2cm长的花序；

3)将步骤2)中收获的青稞种子播种，抽穗后统计青稞的病株率，根据抗散黑穗病分级标准鉴定青稞对散黑穗病的抗性水平。

2.根据权利要求1所述青稞抗散黑穗病的鉴定方法，其特征在于，所述冬孢子的获得方法为将感染裸黑粉菌的青稞病穗风干，粉碎后过筛，收集筛下物。

3.根据权利要求1所述青稞抗散黑穗病的鉴定方法，其特征在于，步骤2)中所述冬孢子悬浮液在所述注射前1～3h配制。

4.根据权利要求1所述青稞抗散黑穗病的鉴定方法，其特征在于，步骤2)中所述注射的剂量为每毫升冬孢子悬浮液注射50～60个小花。

5.根据权利要求1所述青稞抗散黑穗病的鉴定方法，其特征在于，步骤3)中所述播种为每个品种播种2～3行，行长2～3m，每行播种20～30粒种子，播种深度8～12cm，不同青稞品种之间间隔1～2行。

6.根据权利要求1～5的任意一项所述青稞抗散黑穗病的鉴定方法，其特征在于，所述抗散黑穗病分级标准如下：

青稞抗散黑穗病的抗性分为6个等级：

病株率为0，青稞植株为散黑穗病免疫品种；

病株率为1％～15％，青稞植株为高抗品种；

病株率为16％～35％（15＜n≤35），青稞植株为中抗品种；

病株率为36％～55％（35＜n≤35），青稞植株为中间过渡品种；

病株率为56％～75％（55＜n≤35），青稞植株为中感品种；

病株率为76％～100％（75＜n≤35），青稞植株为高感品种。