ES2941684T3

ES2941684T3 - Plantas del género Diplotaxis portadoras de una androesterilidad citoplasmática

Info

Publication number: ES2941684T3
Application number: ES10709872T
Authority: ES
Inventors: Danièle Hosemans; Rémi Levieil
Original assignee: Hm Clause; HMClause SA
Current assignee: Hm Clause; HMClause SA
Priority date: 2009-03-02
Filing date: 2010-03-02
Publication date: 2023-05-24
Anticipated expiration: 2030-03-02
Also published as: FR2942583A1; FR2942584A1; EP2403950A1; WO2010100346A1; US9970023B2; FR2942584B1; EP2403950B1; US20120185962A1; US20150368664A1; US9133476B2

Abstract

La invención se refiere a plantas, semillas y células del género Diplotaxis, que presentan esterilidad masculina citoplasmática, y en particular a plantas, semillas y células de la especie Diplotaxis tenuifolia. La esterilidad masculina citoplasmática es preferiblemente la importada de Raphanus sativus, denominada esterilidad de Ogura. La invención también se refiere a un método para producir plantas de Diplotaxis tenuifolia que tienen esterilidad masculina citoplasmática, ya los diversos usos de la esterilidad masculina citoplasmática de las plantas de la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Plantas del género Diplotaxis portadoras de una androesterilidad citoplasmática

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a plantas de la especie Diplotaxis tenuifolia, portadoras de una androesterilidad citoplasmática, a las semillas y a las células de estas plantas o que dan origen a ellas.

Estado de la técnica

Las plantas de la especie Diplotaxis tenuifolia se conocen con el nombre genérico de "rúcula". Sin embargo, el término rúcula en realidad representa dos géneros diferentes, Eruca y Diplotaxis, que no tienen nada en común excepto que pertenecen a la misma familia de las brasicáceas (anteriormente conocidas como crucíferas). La rúcula "cultivada" es Eruca sativa L. y la rúcula "silvestre", Diplotaxis tenuifolia L.

La rúcula se consume desde hace mucho tiempo en Europa, pero la especie denominada silvestre no se cultivaba sino que simplemente se recolectaba en la naturaleza, de ahí los términos "silvestre" y "cultivada" provenientes de las antiguas técnicas de producción.

La presente invención se refiere más particularmente a la denominada rúcula "silvestre" Diplotaxis tenuifolia. Se trata de una verdura con hoja que se consume como ensalada, a veces mezclada como en el tradicional Mézclum, que aporta una nota más picante y menos amarga que la rúcula cultivada.

El reciente desarrollo del cultivo industrial de canónigos, principalmente en la región de Nantes, gracias a la aparición de la cuarta gama, se ha propiciado el desarrollo de la producción de lechugas de "brotes tiernos" y después el de la rúcula. Por tanto, el cultivo de la denominada rúcula "silvestre" se ha desarrollado mucho en los últimos años en Europa, donde se prefiere a la denominada rúcula "cultivada", sobre todo en Alemania e Italia, donde su desarrollo es muy rápido.

Debido a la evolución de la producción de rúcula, y en particular de la especie Diplotaxis tenuifolia, la mejora de estas plantas se ha convertido en un objetivo importante de los productores y las empresas de semillas.

Las plantas del género Diplotaxis, y en particular de la especie Diplotaxis tenuifolia, son preferentemente alógamas, consistiendo la mejor solución para conseguir mejoras sustanciales en beneficio de los productores, en crear variedades denominadas "híbridas F1". Las plantas híbridas presentan, de hecho, mejores características de homogeneidad en los campos, lo que permite obtener, en particular, una cosecha uniforme, también son más vigorosas que las variedades de población (o pA por "Polinización Abierta"). Además, la producción de híbridos permite la mejora varietal (por variedades vegetales), mejoras cualitativas (forma de la hoja, porte de la planta, color de la hoja, sabor...) y ganancias de rendimiento gracias a una mejor productividad. También permite introducir y acumular resistencias a determinados patógenos o depredadores que afectan al cultivo, así como tolerancia al estrés abiótico.

Sin embargo, dichas plantas denominadas "F1" no existen en Diplotaxis tenuifolia y no se mencionan en la bibliografía.

En efecto, la producción de plantas híbridas F1 solo es económicamente factible con la posibilidad de producir semillas comerciales a un coste razonable. De este modo, la polinización manual (un operario toma el polen del progenitor masculino y lo deposita en los órganos reproductores del progenitor femenino, asegurándose de que el progenitor femenino no se autopolinice) queda, de entrada, excluida, así como la emasculación de las flores (necesaria para garantizar la ausencia de autopolinización).

En cuanto a la polinización entomófila, como ésta no es dirigida, es necesario poder disponer de un sistema biológico que permita forzar la polinización cruzada entre estirpes parentales. Asimismo, también supone la emasculación manual preliminar de las flores, incompatible con una producción industrial.

Por lo tanto, los presentes inventores han buscado aportar mejoras al cultivo de la rúcula, gracias a la obtención de plantas del género Diplotaxis portadoras de androesterilidad citoplasmática, y de plantas híbridas F1.

Existen dos categorías de sistemas naturales que pueden utilizarse en la brasicáceas para obtener plantas híbridas, la autoincompatibilidad y la androesterilidad (o esterilidad masculina).

La primera (autoincompatibilidad) es muy conocida en las brasicáceas; sin embargo, conlleva ciertas limitaciones en su uso; en las brasicáceas, la autoincompatibilidad se ha utilizado durante mucho tiempo; sin embargo, este fenómeno no es fiable y los lotes de semillas producidos son a menudo mezclas de semillas F1 y de semillas obtenidas por autofertilización.

La segunda se basa en la ausencia de polen viable (androesterilidad) en una de las estirpes parentales, lo que permite obtener lotes de semillas 100 % híbridas.

Esta esterilidad puede ser de dos tipos, génica o citoplasmática. La esterilidad génica, recesiva o dominante, se utiliza en ocasiones, pero técnicamente es difícil de utilizar. Además, no se conoce androesterilidad génica en Diplotaxis.

Por lo tanto, los presentes inventores tuvieron la idea de utilizar una androesterilidad citoplasmática para producir híbridos F1. Esta técnica se ha utilizado para producir híbridos F1, en particular en rábano, zanahoria, apio, remolacha, cebolla, girasol, hinojo, etc...

Pero en el caso del género Diplotaxis, y en particular, en la especie Diplotaxis tenuifolia, no se ha encontrado androesterilidad citoplasmática en cultivares existentes o en poblaciones silvestres, a diferencia de las plantas mencionadas anteriormente.

Otra posibilidad es importar al género Diplotaxis androesterilidades citoplasmáticas de especies "relacionadas".

Sin embargo, de acuerdo con la bibliografía, no existen especies del género Diplotaxis que sean portadoras de una androesterilidad citoplasmática bien caracterizada que sean adecuadas para la importación a otras especies del género Diplotaxis.

Por lo tanto, los inventores utilizaron la esterilidad citoplasmática proveniente de plantas de un género "relacionado", y no de una especie relacionada, en este caso, de plantas provenientes del género Raphanus (especie Raphanus sativus), por cruzamiento, siguiendo protocolos originales.

Esta estrategia es muy ingeniosa porque implica, por un lado, cruzamientos intergenéricos (es decir, entre plantas de diferentes géneros y no solo de diferentes especies), y el experto en la materia sabe bien que dichos cruzamientos rara vez son viables, en particular cuando el número de cromosomas es diferente, que es el caso de la presente invención, teniendo Raphanus sativus 2n=18 cromosomas y Diplotaxis tenuifolia 2n=22 cromosomas.

Además, dichos cruzamientos, cuando son viables, son incluso más raramente fértiles. Los inventores han demostrado que, un cruzamiento intergenérico entre plantas de la especie Brassica rapa, portadoras de una androesterilidad citoplasmática y plantas de la especie Diplotaxis tenuifolia, no permite obtener descendencia y que sucede lo mismo con un cruzamiento intergenérico entre plantas Brassica oleracea portadoras de una androesterilidad citoplasmática y plantas de Diplotaxis tenuifolia.

Por otro lado, esta estrategia implica la cohabitación, en una misma célula, de genomas cloroplásticos y nucleares provenientes de diferentes géneros. En efecto, el genoma cloroplástico proviene del género conocido como "relacionado", que aporta la androesterilidad citoplasmática como progenitor femenino, es decir, el género Raphanus (Raphanus sativus), mientras que el genoma nuclear es del género Diplotaxis. Ahora bien, en la crucíferas (brasicáceas), la patente EPO 549 726 enseña que la asociación en la misma célula de genomas nucleares y cloroplásticos de diferentes géneros conduce a un fenómeno de clorosis. Este fenómeno de clorosis es totalmente incompatible con un objetivo de comercialización para el consumo.

En una publicación de 2003, Bang S.W. et al., describen el cruzamiento entre una planta de la especie Diplotaxis tenuifolia (progenitor femenino) y una planta de la especie R. sativus (progenitor masculino), por rescate de embriones e inducción de anfidiploidía, seguido de diferentes cruzamientos con plantas de D. tenuifolia o R. sativus. En este artículo no se menciona la androesterilidad citoplasmática.

Asimismo, también cabe señalar que los autores del artículo indican que no se pudo obtener ningún embrión en el cruzamiento intergenérico donde R. sativus es el progenitor femenino y Diplotaxis tenuifolia el masculino, por lo tanto, consideran que este cruzamiento es un cruzamiento incompatible.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere a plantas androestériles, de la especie Diplotaxis tenuifolia, mediante una androesterilidad citoplasmática, a sus diferentes constituyentes, en particular, células, a las semillas de estas plantas o provenientes de ellas.

En el contexto de la presente invención, los términos que a continuación se exponen tienen más particularmente el siguiente significado:

Cruzamiento de retorno o retrocruzamiento o backcross (retrocruzamiento en inglés), significa el cruzamiento de un híbrido con uno de los dos (2) tipos parentales que se utilizaron para formarlo.

Porcentaje de identidad de dos secuencias: el grado o porcentaje de identidad entre dos secuencias (proteicas o nucleicas) se determina en particular alineando las dos secuencias para maximizar los puntos de concordancia minimizando los espacios ("del inglés gap"); se obtiene dividiendo el número de aminoácidos o ácidos nucleicos comunes entre la longitud de la secuencia más larga de las dos.

La presente invención está dirigida a una planta de la especie Diplotaxis tenuifolia, caracterizada por que es portadora de una androesterilidad citoplasmática, por que su genoma mitocondrial comprende la secuencia de ADN correspondiente a los nucleótidos 1673 a 2089 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene una identidad de al menos 70 % con esta secuencia de ADN y por que no presenta ningún síntoma de clorosis en condiciones de cultivo normales, en particular, ninguna decoloración de las hojas debido a la falta de clorofila.

Diplotaxis es un género de plantas diploides con flores, de la familia de las brasicáceas, originaria de la cuenca mediterránea.

Por androesterilidad en una planta alógama, se entiende que dicha planta no puede ser un progenitor masculino en un cruzamiento, sino opcionalmente un progenitor femenino. Aunque a veces se la denomina planta "masculina" o "femenina", cabe señalar que es por un abuso del lenguaje; en caso de androesterilidad, en realidad se trata de una flor hermafrodita que tiene órganos masculinos defectuosos (o inoperativos) y, por tanto, solo puede utilizarse como flor femenina.

La androesterilidad según la presente invención se caracteriza preferentemente por la ausencia de polen viable capaz de fertilizar órganos femeninos (órganos masculinos defectuosos). Por lo tanto, una planta con androesterilidad no puede participar en un cruzamiento como progenitor masculino. Una planta androestéril según la presente invención es, preferentemente, perfectamente ginofértil, es decir, puede participar en un cruzamiento, como progenitor femenino, con la misma tasa de fertilización que la de una planta androfértil.

Una androesterilidad citoplasmática es una androesterilidad portada por el citoplasma de la planta o célula, y más particularmente codificada por su genoma mitocondrial. Dado que el citoplasma (y, por tanto, el genoma mitocondrial) se hereda del progenitor femenino, cualquier planta resultante del cruzamiento entre una planta según la invención como progenitor femenino (es decir portadora de una androesterilidad citoplasmática) y un progenitor masculino, cualquiera que sea, también será portadora de la androesterilidad citoplasmática (o CMS por las siglas del inglés " Cytoplasmic Male Sterility") del progenitor femenino. Dado que una planta según la invención, no puede ser un progenitor masculino en un cruzamiento, debido a su androesterilidad, cualquier planta resultante del cruzamiento de una planta según la invención, también es portadora de una androesterilidad citoplasmática.

Se trata por tanto de un carácter que heredará necesariamente toda la descendencia de una planta o semilla de la invención.

La androesterilidad citoplasmática según la invención es una esterilidad estable y fiable, es decir que toda la descendencia de una planta según la invención es androestéril.

La invención se refiere a una planta de la especie Diplotaxis tenuifolia, que es la especie más extendida del género Diplotaxis. Se trata de una verdura con sabor picante y ligeramente amargo, comúnmente conocida como "rúcula silvestre". Una planta de la especie Diplotaxis tenuifolia es diploide, con 2n=22.

Una planta según la invención, presenta un fenotipo perfectamente normal, es decir, un fenotipo esencialmente idéntico al de una planta androfértil de la misma especie, siendo la única diferencia el carácter androestéril o androfértil. Para el seleccionador, no debe haber ninguna diferencia fenotípica detectable, estadísticamente significativa, en particular, en cuanto a la forma, el tamaño, el color o el sabor de las hojas. Tampoco debe haber ninguna diferencia en cuanto a la ploidía.

En particular, una planta según la presente invención, no presenta ningún síntoma de clorosis en condiciones de cultivo normales, en particular cuando la temperatura es inferior a 10 °C; por ejemplo, cuando la temperatura está comprendida entre 5 y 10 °C. Por clorosis, se entiende una decoloración más o menos pronunciada de las hojas por falta de clorofila.

Con miras a una comercialización para el consumo, es por tanto importante, que una planta según la invención no se vea afectada por clorosis en ningún estadio del desarrollo de la planta, sea cual sea, en condiciones de cultivo normales, especialmente al bajar las temperaturas.

Por condiciones de cultivo normales, se entiende condiciones de cultivo que no causan ningún síntoma de clorosis en una planta de la especie Diplotaxis tenuifolia ordinaria (androfértil y ginofértil).

Según una aplicación preferida de la invención, la planta según la invención, portadora de la androesterilidad citoplasmática, es homocigota en todo su genoma (nuclear), o al menos más del 90 %, incluso más del 95 % o más del 99 %.

Según otra aplicación preferida de la invención, la planta en cuestión es una planta híbrida denominada F1. Proviene preferentemente del cruzamiento de dos plantas de la misma especie Diplotaxis tenuifolia, que provienen de dos estirpes fenotípicamente diferentes.

En cualquier caso, el progenitor femenino de una planta híbrida F1 según la invención es una planta de la especie Diplotaxis tenuifolia, portadora de la androesterilidad citoplasmática.

Se sabe que la androesterilidad citoplasmática se produce de manera natural en la especie Raphanus sativus (rábano) y que esta androesterilidad ya ha sido utilizada con el nombre de androesterilidad citoplasmática Ogura. En particular, se ha transmitido a diferentes especies del género Brassica, como se muestra en la patente EPO 549726. Por tanto, se caracteriza por la secuencia de ADN comprendida entre los nucleótidos 928 y 2273 de la figura 1 de la patente EPO 549726 o por una secuencia que tiene una identidad de al menos 50 % con dicha secuencia y que confiere una androesterilidad citoplasmática cuando está presente en el genoma mitocondrial de una planta.

La androesterilidad citoplasmática según la presente invención, es una esterilidad resultante de la androesterilidad citoplasmática de Raphanus sativus, lo que se refleja por la presencia de secuencias originarias de R. sativus en el genoma mitocondrial de una planta de la invención, más particularmente en el genoma mitocondrial de R. sativus. Dichas secuencias provenientes del genoma mitocondrial de Raphanus sativus representan, preferentemente, al menos el 50 % del genoma mitocondrial según la invención, o tienen una longitud de al menos 50, o incluso de al menos 100, 200, 500 o 1000 pares de bases consecutivos.

En una implementación preferida, el genoma mitocondrial de una planta de la invención comprende al menos una parte de la secuencia de ADN ilustrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1 que corresponde a Z18896, que comprende el orf138 de R. sativus androestéril Ogura), comprendiendo esta parte al menos 50 pares de bases consecutivos de SEQ ID NO: 1. Preferentemente, dicha parte de SEQ ID NO: 1 tiene una longitud de al menos 100, preferentemente de al menos 200, 500, 1000 o 2000 pares de bases.

En otra implementación preferida, el genoma mitocondrial de una planta de la invención comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de al menos 70 % con una parte de la secuencia de ADN ilustrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), comprendiendo esta parte al menos 500 pares de bases consecutivos de SEQ ID NO: 1, preferentemente al menos 1000 o 2000 pares de bases. Preferentemente también, dicha secuencia presenta una identidad de al menos 80 %, o incluso una identidad de al menos 90 % o 95 % o incluso una identidad de al menos 99 % con dicha parte de SEQ ID NO: 1.

De manera particularmente preferida, la parte de SEQ ID NO: 1 presente en el genoma de una planta según la invención, confiere la androesterilidad citoplasmática.

En cualquier caso, el genoma mitocondrial de una planta de la invención comprende al menos la parte correspondiente a los nucleótidos 1673 a 2089 de SEQ ID NO: 1, que comprende el orf138, o una secuencia que tiene una identidad de al menos 70 % con esta parte. Esta secuencia es de hecho característica de la androesterilidad citoplasmática denominada Ogura. Como alternativa, dicha parte es un fragmento de 512 pares de bases correspondientes a los nucleótidos 1579 a 2090 de SEQ ID NO: 1 que comprende el orf138. Preferentemente, el genoma mitocondrial de una planta de la invención comprende un fragmento de 401 pares de bases correspondientes a los nucleótidos 1248 a 1648 de SEQ ID NO: 1, que comprende todo o parte del gen T-ARNt (ARNt de transferencia de formilmetionina).

Por ello, una planta según la invención se caracteriza preferentemente por un fragmento amplificado del siguiente tamaño, cuando se utilizan los cebadores correspondientes para amplificar por PCR el genoma mitocondrial de la planta:

- 512 pares de bases cuando se utilizan los cebadores oligo 37 y 38 (respectivamente SEQ ID NO: 22 y 23) y/o - 401 pares de bases cuando se utilizan los cebadores TRNAFM-610U y TRNAFM-987L (SEQ ID NO: 24 y 25, respectivamente).

Preferentemente, la secuencia del fragmento amplificado de 512 pares de bases es la SEQ ID NO: 20 y esta secuencia está presente en el genoma de una planta según la invención.

Preferentemente, la secuencia del fragmento amplificado de 401 pares de bases es la SEQ ID NO: 21 y esta secuencia está presente en el genoma de una planta según la invención.

Asimismo, en una realización preferida de la presente invención, una planta como la descrita, portadora de una androesterilidad citoplasmática, también se diferencia en cuanto al genoma cloroplástico, de otra planta que no sea portadora de dicha esterilidad.

Preferentemente, una planta de la invención contiene en sus cloroplastos, en el ADN cloroplástico, secuencias que no son del género Diplotaxis. Por ejemplo, al menos 200 pares de bases del genoma cloroplástico no son del género Diplotaxis, preferentemente al menos 500 o incluso mil bases. En una situación preferida, la totalidad del genoma cloroplástico no es el del género Diplotaxis.

La parte del genoma cloroplástico que no es del género Diplotaxis es preferentemente de la especie R. sativus. De manera preferente, se trata de todo o de parte del genoma cloroplástico de Raphanus sativus. Como se ha especificado anteriormente, dichas secuencias significan secuencias de ADN que comprenden al menos 200 o al menos 500 pares de bases consecutivos. Preferentemente, el genoma cloroplástico de una planta según la invención, proveniente de la especie Raphanus sativus, por tanto no contiene ninguna secuencia característica del genoma cloroplástico de B. rapa o de B. oleracea, ni de ninguna otra especie del género Brassica.

Según una realización más particularmente ilustrada en la sección experimental de esta solicitud, una planta según la invención se caracteriza por células que poseen el ADN genómico de Diplotaxis tenuifolia, el ADN mitocondrial de Raphanus sativus esterilidad Ogura y el ADN cloroplástico de Raphanus sativus.

En la sección experimental se describen protocolos que permiten la determinación de secuencias dentro del genoma mitocondrial y cloroplástico de una célula vegetal (para el genoma cloroplástico y el genoma mitocondrial véase el ejemplo 2). Estos pueden utilizarse para determinar si una planta determinada, citoplasmáticamente androestéril, comprende la esterilidad denominada Ogura en su ADN mitocondrial y si comprende ADN cloroplástico de Raphanus sativus.

Una planta según la invención se caracteriza preferentemente por un fragmento amplificado del siguiente tamaño, cuando se utilizan los cebadores correspondientes para amplificar por PCR el genoma cloroplástico de la planta:

- 193 pares de bases cuando se utilizan los cebadores oligo MF2_M13F y MF2_R (respectivamente SEQ ID NO: 4 y 5) y/o

- 264 pares de bases cuando se utilizan los cebadores MF8_M13F y MF8_R (respectivamente SEQ ID NO: 16 y 17) y/o

- 180 pares de bases cuando se utilizan los cebadores MF7_M13F y MF7_R (respectivamente SEQ ID NO: 14 y 15) y/o

- 319 pares de bases cuando se utilizan los cebadores MF9_M13F y MF9_R (respectivamente SEQ ID NO: 18 y 19) y/o

- 303 pares de bases cuando se utilizan los cebadores MF3_M13F y MF3_R (respectivamente SEQ ID NO: 6 y 7) y/o

- 183 pares de bases cuando se utilizan los cebadores MF6_M13F y MF6_R (respectivamente SEQ ID NO: 12 y 13).

Dichos cebadores en realidad se hibridan con el genoma cloroplástico de las plantas D. tenuifolia, R. sativus CMS y B. oleracea CMS ogura, pero el tamaño del fragmento amplificado varía y caracteriza a las plantas según la invención, cuyo citoplasma es originario de R. sativus CMS, como se muestra en el ejemplo 2.

Para determinar si una planta androestéril es portadora de una esterilidad citoplasmática o génica, un protocolo de ensayo sencillo consiste en hacer cruzamientos con una planta fértil y determinar la proporción de la descendencia que también es androestéril. En el caso de una androesterilidad citoplasmática, cualquier planta resultante de este cruzamiento también es androestéril, así como cualquier planta resultante de este cruzamiento por retrocruzamiento con la planta fértil.

En el caso de una esterilidad génica recesiva, por regla general, ninguna planta resultante de este cruzamiento es androestéril.

En el caso de una esterilidad génica dominante, la mitad de las plantas resultantes de este cruzamiento también son androestériles. En efecto, si la esterilidad genética es dominante, el progenitor femenino solo puede ser heterocigoto para este gen de esterilidad y, por lo tanto, solo transmite este rasgo a la mitad de la descendencia. Por tanto, en el caso de una esterilidad génica, la segregación se efectúa de manera mendeliana en la descendencia, mientras que en el caso de una esterilidad citoplasmática no hay segregación, siendo la herencia femenina.

Cabe señalar que la diferenciación entre una planta androestéril (citoplasmática) según la invención y una planta androfértil, puede hacerse a simple vista; en efecto, en el caso de las plantas androestériles éstas son fenotípicamente diferentes debido a la ausencia de polen.

Las plantas según la presente invención, se obtienen preferentemente sin tener que recurrir a la fusión de protoplastos, y sin inducción de una duplicación del número de cromosomas en cualquier estadio de obtención, para conservar la diploidía.

La presente invención también se refiere a semillas de la especie Diplotaxis tenuifolia, y más particularmente a semillas portadoras de androesterilidad citoplasmática y cuyo genoma mitocondrial comprende la secuencia de ADN correspondiente a los nucleótidos 1673 a 2089 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene una identidad de al menos 70 % con esta secuencia de ADN. La invención se refiere en particular a semillas que, después de la germinación, permiten obtener una planta como la descrita anteriormente, es decir, portadora de una androesterilidad citoplasmática y de la especie Diplotaxis tenuifolia. También se refiere a semillas resultantes del cruzamiento de una planta como se describe anteriormente, con otra planta de la especie Diplotaxis tenuifolia, que sea androfértil. Como se ha indicado anteriormente, cualquier semilla resultante del cruzamiento de una planta según la invención y de otra planta de la especie Diplotaxis tenuifolia también dará lugar a una planta de la especie Diplotaxis tenuifolia portadora de una androesterilidad citoplasmática.

Ya se ha definido anteriormente lo que se entiende por "androesterilidad citoplasmática", en el marco de las plantas de la invención, y las definiciones y aplicaciones preferidas son las mismas en lo que respecta a las semillas según la invención.

Cabe señalar que la androesterilidad citoplasmática a la que se hace referencia, es una esterilidad estable y fiable. De manera muy particularmente preferida, esta androesterilidad no viene acompañada de una ginoesterilidad. En efecto, las semillas y plantas preferidas en el contexto de la presente invención son ginofértiles.

Una semilla según la invención es una semilla de la especie Diplotaxis tenuifolia, y por lo tanto diploide con 2n=22.

Una semilla según la invención comprende en su ADN mitocondrial secuencias provenientes de Raphanus sativus, como es el caso de las plantas de la invención, y más particularmente secuencias del genoma mitocondrial de R. sativus CMS. En efecto, la androesterilidad citoplasmática proviene de la androesterilidad citoplasmática de R. sativus, lo que se refleja por la presencia de secuencias originarias de R. sativus CMS en el genoma mitocondrial de una semilla de la invención.

Dichas secuencias provenientes del genoma mitocondrial de Raphanus sativus representan, preferentemente, al menos el 50 % del genoma mitocondrial de una semilla según la invención, preferentemente, al menos el 80 %, o tienen una longitud de al menos 50, o incluso de al menos 100, 200, 500 o 1000 pares de bases consecutivos.

El genoma mitocondrial de una semilla comprende la secuencia de ADN comprendida entre los nucleótidos 1673 y 2089 de la figura 1 (SEQ ID NO: 1) o una secuencia que tiene una identidad de al menos 70 % con dicha secuencia y que confiere la androesterilidad citoplasmática. Preferentemente, el genoma mitocondrial de una semilla según la invención comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 80 %, o incluso de al menos 90 % o 95 % o una identidad de al menos 99 % con dicha secuencia de ADN.

De manera particularmente preferida, la parte de SEQ ID NO: 1 presente en el genoma de una semilla según la invención confiere la androesterilidad citoplasmática.

Preferentemente, dicha parte corresponde a los nucleótidos 1673 a 2089 de SEQ ID NO: 1, que comprende el orf138. Esta secuencia es de hecho característica de la androesterilidad citoplasmática denominada Ogura. Como alternativa, dicha parte es un fragmento de 512 pares de bases correspondientes a los nucleótidos 1579 a 2090 de SEQ ID NO: 1 que comprende el orf138. Preferentemente, el genoma mitocondrial de una semilla de la invención comprende un fragmento de 401 pares de bases correspondientes a los nucleótidos 1248 a 1648 de SEQ ID NO: 1, que comprende todo o parte del gen T-ARNt (ARNt de transferencia de formilmetionina).

Por ello, una semilla según la invención se caracteriza preferentemente por un fragmento amplificado del siguiente tamaño, cuando se utilizan los cebadores correspondientes para amplificar por PCR su genoma mitocondrial:

Preferentemente, la secuencia del fragmento amplificado de 512 pares de bases es SEQ ID NO: 20 y esta secuencia está presente en el genoma de una semilla según la invención.

Preferentemente, la secuencia del fragmento amplificado de 401 pares de bases es SEQ ID NO: 21 y esta secuencia está presente en el genoma de una semilla según la invención.

La secuencia mitocondrial inicialmente descrita como relacionada con la CMS Ogura en plantas del género Brassica, es la secuencia mencionada en la patente EP 0549726; desde entonces se han descrito variantes de esta secuencia, en particular con los números de registro Z12626 y Z18896 (SEQ ID NO: 1).

Asimismo, en una realización preferida, una semilla como la descrita, portadora de una androesterilidad citoplasmática, también se diferencia en cuanto al genoma cloroplástico, de otra semilla que no sea portadora de dicha esterilidad mediante un cruzamiento intergenérico con una planta del género Raphanus.

Preferentemente, una semilla de la invención contiene en sus cloroplastos, en el ADN cloroplástico, secuencias que no son del género Diplotaxis. Por ejemplo, al menos 200 pares de bases del genoma cloroplástico no son del género Diplotaxis, preferentemente al menos 500, preferentemente incluso al menos mil bases. En una situación preferida, la totalidad del genoma cloroplástico no es el del género Diplotaxis.

La parte del genoma cloroplástico que no es del género Diplotaxis es preferentemente del género Raphanus. De manera particularmente preferida, se trata de secuencias provenientes del genoma cloroplástico de Raphanus sativus. Como se ha especificado anteriormente, se entiende que dichas secuencias son secuencias de ADN que comprenden al menos 200 pares de bases consecutivos, preferentemente al menos 500 pares de bases. Preferentemente, el genoma cloroplástico de una semilla según la invención proviene de la especie Raphanus sativus, por tanto no contiene ninguna secuencia característica del genoma cloroplástico de B. rapa o de B. oleracea, ni de ninguna otra especie del género Brassica.

Una semilla según la invención se caracteriza preferentemente por un fragmento amplificado del siguiente tamaño, cuando se utilizan los cebadores correspondientes para amplificar por PCR su genoma cloroplástico:

El ejemplo 2 ilustra este punto.

La presente invención también se refiere a células vegetales, que son portadores de una androesterilidad citoplasmática, de la especie Diplotaxis tenuifolia y cuyo genoma mitocondrial comprende la secuencia de ADN correspondiente a los nucleótidos 1673 a 2089 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene una identidad de al menos 70 % con esta secuencia de ADN.

Preferentemente, una célula según la presente invención, proviene de una planta o de una semilla como se ha descrito anteriormente. Puede tratarse de una célula en cualquier estadio de desarrollo o diferenciación. Puede tratarse de células reproductoras, de células de callo, del sistema radicular, foliar, del vértice, meristema, o cualquier otra parte de la planta.

La célula en cuestión puede aislarse, en grupos o dentro de un tejido. Puede estar en suspensión o en medio sólido. Una célula dentro del marco de la invención es una célula de la especie Diplotaxis tenuifolia y por tanto diploide, con 2n=22.

Como se explicó anteriormente en relación con las plantas y las semillas, una célula de la invención comprende en su genoma mitocondrial secuencias provenientes de R. sativus, más particularmente secuencias provenientes del genoma mitocondrial de R. sativus portador de androesterilidad citoplasmática denominada Ogura. Dichas secuencias provenientes del genoma mitocondrial de R. sativus representan, preferentemente, al menos el 50 % del genoma mitocondrial de una célula según la invención, preferentemente, al menos el 80 %, o tienen una longitud de al menos 50, o incluso de al menos 100, 200, 500 o 1000 pares de bases consecutivos.

El genoma mitocondrial de una célula comprende la secuencia de ADN comprendida entre los nucleótidos 1673 y 2089 de la figura 1 (SEQ ID NO: 1) correspondiente al orf138 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 70 % con dicha secuencia y que confiere la androesterilidad citoplasmática. Preferentemente, el genoma mitocondrial de una célula según la invención comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 80 %, o incluso de al menos 90 % o 95 % o una identidad de al menos 99 % con dicha secuencia de ADN, es decir, que posee la androesterilidad citoplasmática denominada androesterilidad Ogura tal como se aplica en la patente EPO 549726 del INRA.

De manera particularmente preferida, la parte de SEQ ID NO: 1 presente en el genoma de una planta según la invención, confiere la androesterilidad citoplasmática. Preferentemente, dicha parte corresponde a los nucleótidos 1673 a 2089 de SEQ ID NO: 1, que comprende el orf138. Esta secuencia es de hecho característica de la androesterilidad citoplasmática denominada esterilidad Ogura. Como alternativa, dicha parte es un fragmento de 512 pares de bases correspondientes a los nucleótidos 1579 a 2090 de SEQ ID NO: 1 que comprende el orf138. Preferentemente, el genoma mitocondrial de una célula de la invención comprende un fragmento de 401 pares de bases correspondientes a los nucleótidos 1248 a 1648 de SEQ ID NO: 1, que comprende todo o parte del gen T-ARNt (ARNt de transferencia de formilmetionina).

Por ello, una célula según la invención se caracteriza preferentemente por un fragmento amplificado del siguiente tamaño, cuando se utilizan los cebadores correspondientes para amplificar por PCR su genoma mitocondrial: - 512 pares de bases cuando se utilizan los cebadores oligo 37 y 38 (respectivamente SEQ ID NO: 22 y 23) y/o - 401 pares de bases cuando se utilizan los cebadores TRNAFM-610U y TRNAFM-987L (SEQ ID NO: 24 y 25, respectivamente).

Preferentemente, la secuencia del fragmento amplificado de 512 pares de bases es SEQ ID NO: 20 y esta secuencia está presente en el genoma de una célula según la invención.

Preferentemente, la secuencia del fragmento amplificado de 401 pares de bases es SEQ ID NO: 21 y esta secuencia está presente en el genoma de una célula según la invención.

Asimismo, en una realización preferida, una célula vegetal como la descrita, portadora de una androesterilidad citoplasmática, también se diferencia en cuanto al genoma cloroplástico, de otra célula de la especie Diplotaxis tenuifolia. En particular, una célula de la invención contiene preferentemente en su ADN cloroplástico, secuencias que no son del género Diplotaxis. Como ya se ha explicado en relación con las plantas y semillas de la invención, puede tratarse, por ejemplo, de al menos 200 pares de bases del genoma cloroplástico que no son del género Diplotaxis, preferentemente al menos 500, preferentemente incluso al menos mil bases. En una situación preferida, la totalidad del genoma cloroplástico no es el del género Diplotaxis.

La parte del genoma cloroplástico que no es del género Diplotaxis es preferentemente del género Raphanus. De manera particularmente preferida, se trata de secuencias provenientes del genoma cloroplástico de Raphanus sativus. Como se ha especificado anteriormente, se entiende que dichas secuencias son secuencias de ADN que comprenden al menos 200 pares de bases consecutivos, incluso al menos 500.

Preferentemente, el genoma cloroplástico de una célula según la invención proviene de la especie Raphanus sativus, por tanto no contiene ninguna secuencia característica del genoma cloroplástico de B. rapa o de B. oleracea, ni de ninguna otra especie del género Brassica.

Una célula según la invención se caracteriza preferentemente por un fragmento amplificado del siguiente tamaño, cuando se utilizan los cebadores correspondientes para amplificar por PCR el genoma cloroplástico:

- 180 pares de bases cuando se utilizan los cebadores M F7 _M 13F y MF7_R (respectivamente SEQ ID NO: 14 y 15) y/o

La presente descripción también se refiere a diferentes procedimientos, no reivindicados, que permiten obtener plantas, células o semillas como las descritas en las secciones anteriores.

Según un aspecto no reivindicado, la descripción se refiere en particular a un procedimiento de obtención de una planta o una semilla, preferentemente de la especie Diplotaxis tenuifolia, que comprende:

a) el cruzamiento intergenérico de una planta Raphanus sativus, portadora de una androesterilidad citoplasmática, como progenitor femenino, y de una planta Diplotaxis tenuifolia androfértil, como progenitor masculino;

b) la obtención de una planta resultante del cruzamiento anterior por rescate de embriones;

c) el cruzamiento de una resultante de la etapa b), como progenitor femenino, con una planta Diplotaxis tenuifolia androfértil, como progenitor masculino;

d) la obtención de una planta resultante del cruzamiento c), opcionalmente por rescate de embriones.

Las plantas Raphanus sativus portadoras de androesterilidad citoplasmática, están disponibles en el comercio (por ejemplo: variedad Clementina). Lo mismo ocurre con las plantas de Diplotaxis tenuifolia (androfértiles), que permiten realizar el primer cruzamiento intergenérico.

Los inventores han demostrado que dicho cruzamiento intergenérico, puede conducir a la obtención de híbridos viables y androestériles. Sin embargo, a efectos de dicha obtención, es necesario, después de la fertilización, recolectar las silicuas y después los óvulos y cultivarlos un vitro, es decir, realizar una etapa de rescate de embriones. Mediante esta técnica, es posible obtener y desarrollar una planta correspondiente al cruzamiento intergenérico de una planta Raphanus sativus, portadora de una androesterilidad citoplasmática, como progenitor femenino, y de una planta Diplotaxis tenuifolia androfértil, como progenitor masculino.

No obstante, cabe señalar que la obtención de una planta resultante de este cruzamiento puede requerir realizar un gran número de cruzamientos y el cultivo de óvulos. Sin embargo, los inventores repitieron este cruzamiento intergenérico varias veces y demostraron la factibilidad, la viabilidad y la fertilidad (femenina) de dicho cruzamiento (véase el ejemplo 1).

Cabe señalar a este respecto, que las dos especies no tienen el mismo número de cromosomas (2n=22 en el caso de Diplotaxis tenuifolia y 2n=18 en el de Raphanus sativus).

El procedimiento comprende entonces un nuevo retrocruzamiento ( backcross) con una planta de la especie D. tenuifolia utilizada como progenitor masculino, y de nuevo la obtención de una planta resultante de este cruzamiento. También en este estadio puede ser necesario realizar un rescate de embriones en caso de que no se desarrolle ningún óvulo in vivo. Estas etapas de retrocruzamiento y obtención de una planta (etapas c y d del procedimiento) pueden repetirse varias veces. Se implementan preferentemente al menos dos o incluso al menos tres veces, de modo que la planta obtenida sea fenotípicamente de la especie D. tenuifolia, o sea una semilla también de la especie D. tenuifolia, por tanto diploide y que su número de cromosomas sea equivalente al de D. tenuifolia, es decir, 2n=22.

Después de la primera o segunda aplicación de las etapas c y d, por lo general, no es necesario realizar un rescate de embriones para obtener una planta viable.

Según la aplicación preferida del procedimiento, las plantas se obtienen sin que se lleve a cabo ninguna etapa de fusión de protoplastos. Preferentemente, tampoco hay ninguna etapa de inducción de una duplicación del número de cromosomas. Sin embargo, no se excluye que la duplicación del número de cromosomas se produzca de forma natural, aunque preferentemente, no es el caso.

Las plantas obtenidas mediante este procedimiento o las semillas resultantes del mismo, son portadoras de androesterilidad citoplasmática.

La invención también se refiere a plantas, semillas y células, que pueden obtenerse aplicando el procedimiento tal como se describe, así como cualquier material biológico derivado de las mismas.

Una planta, semilla o célula que puede obtenerse aplicando el procedimiento tal como se describe, se caracteriza, en particular, en cuanto a su genoma mitocondrial, portador de androesterilidad citoplasmática, que comprende la parte correspondiente a los nucleótidos 1673 a 2089 de SEQ ID NO: 1 (ORF138).

Una planta, semilla o célula que puede obtenerse aplicando el procedimiento tal como se describe, se caracteriza, en particular, en cuanto a su genoma mitocondrial, preferentemente por un fragmento amplificado del siguiente tamaño, cuando se utilizan los cebadores correspondientes para amplificar por PCR el genoma mitocondrial:

Preferentemente, la secuencia amplificada de 512 pares de bases es SEQ ID NO: 20 y esta secuencia está presente en el genoma de una planta, semilla o célula que puede obtenerse aplicando el procedimiento de la invención.

Del mismo modo, preferentemente, la secuencia amplificada de 401 pares de bases es SEQ ID NO: 21 y esta secuencia está presente en el genoma de una planta, semilla o célula que puede obtenerse aplicando el procedimiento de la invención.

Una planta, semilla o célula que puede obtenerse aplicando el procedimiento tal como se describe, se caracteriza también en cuanto a su genoma cloroplástico, preferentemente por un fragmento amplificado del siguiente tamaño, cuando se utilizan los cebadores correspondientes para amplificar por PCR el genoma cloroplástico:

- 183 pares de bases cuando se utilizan los cebadores MF6_M13F y MF6_R (respectivamente SEQ ID NO: 12 y 13^).

Preferentemente, el genoma cloroplástico de una planta, semilla o célula que puede obtenerse aplicando el procedimiento tal como se describe, proviene de la especie Raphanus sativus, por tanto no contiene ninguna secuencia característica del genoma cloroplástico de B. rapa o de B. olerácea, ni de ninguna otra especie del género Brassica.

En cuanto al rescate de embriones opcionalmente utilizado en el procedimiento, se trata de una técnica muy conocida por el experto en la materia y practicada regularmente en el caso de cruzamientos intergenéricos o más comúnmente interespecíficos. Esta técnica se describe más particularmente en la publicación Rahman (2004) y su aplicación se detalla en el apartado de experimentos de la solicitud (ejemplo 1).

Para la aplicación de esta técnica, en la bibliografía se describen los diferentes medios, condiciones de cultivo y tiempos y pueden adaptarse o modificarse si fuera necesario. En la sección experimental se dan ejemplos.

La presente descripción también se refiere, en un aspecto no reivindicado, al uso de una planta, tal como se describe en el contexto de la presente solicitud, como pareja femenina en un cruzamiento con otra planta androfértil del género Diplotaxis. Por ejemplo, una planta de la especie D. tenuifolia, tal como se describe en la solicitud, puede cruzarse con una planta del género Diplotaxis, que no sea androestéril.

De este modo, gracias a la utilización de una planta D. tenuifolia portadora de una androesterilidad citoplasmática, es posible, por ejemplo, a través de programas de selección, obtener para cada subespecie o variedad de D. tenuifolia conocida, una subespecie o variedad equivalente que sea androestéril. También es posible obtener plantas del género Diplotaxis pero de otras especies distintas a D. tenuifolia, realizando un primer cruzamiento interespecífico, seguido de diferentes retrocruzamientos. Por tanto, la androesterilidad citoplasmática de una planta según la invención, puede utilizarse como vector de la androesterilidad citoplasmática en otra planta del género Diplotaxis, o en una planta de la especie Diplotaxis tenuifolia de otra subespecie o variedad.

La descripción también se refiere, según un aspecto no reivindicado, al uso de una planta de la especie Raphanus sativus, portadora de una androesterilidad citoplasmática, preferentemente la androesterilidad denominada Ogura, como vector de la androesterilidad citoplasmática en una planta del género Diplotaxis, preferentemente en una planta de la especie Diplotaxis tenuifolia. Como se demuestra en la siguiente sección experimental, de manera sorprendente, los inventores han descubierto de hecho que es posible transferir la androesterilidad citoplasmática conocida de Raphanus sativus en plantas de la especie Diplotaxis tenuifolia, gracias a un cruzamiento intergenérico y sin recurrir a la fusión de protoplastos.

Asimismo demostraron que las plantas obtenidas no estaban afectadas por clorosis, contrariamente a lo que se enseña en la patente EP 0549726, lo que corresponde al prejuicio generalizado entre las personas que trabajan en el campo de la invención.

Por lo tanto, los inventores han obtenido por primera vez una planta de la familia de las brasicáceas ( Brassicaceae) pero de un género distinto de Brassica, que es portadora de una androesterilidad citoplasmática resultante de Raphanus sativus, y cuyo genoma cloroplástico es, en parte, el de Raphanus sativus, es decir, que comprende al menos 200 pares de bases consecutivos de Raphanus sativus, preferentemente al menos 500, y ello sin estar afectada por clorosis, en particular a temperaturas inferiores a 10 °C.

Descripción de las figuras

Figura 1: Esta figura ilustra la secuencia SEQ ID NO: 1 que corresponde al número de registro Z18896, que comprende la secuencia del orf138 del genoma mitocondrial de Raphanus sativus CMS. Las secuencias correspondientes a los cebadores oligo 37 y 38 (SEQ ID NO: 22 y 23, respectivamente) están subrayadas con una línea doble, las secuencias correspondientes a los cebadores t RnAFM-610U y TRNAFM-987L (SEQ ID NO: 24 y 25, respectivamente) están subrayadas con una línea sencilla.

Figura 2: Esta figura ilustra el resultado de la migración electroforética en gel de agarosa de diferentes muestras de ADN, después de la amplificación por PCR con los cebadores oligo 37 y oligo 38 (orf138, gel superior), con los cebadores TRNAFM-610U y TRNAFM-987L (T-ARNt, gel central) y con los cebadores COX1-244U y COX1-805L (cox1, gel inferior). Los tres primeros pocillos (M1, M2 y M6) corresponden a muestras de ADN provenientes de tres estirpes de R. sativus CMS, los pocillos 4°, 6° y 8° (M7, M9 y M11 respectivamente) corresponden a muestras de ADN provenientes de estirpes de D. tenuifolia fértiles; los pocillos 5°, 7° y 9° (M8, M10 y M12 respectivamente) corresponden a muestras de ADN provenientes de diferentes plantas de D. tenuifolia androestériles según la invención.

F= fértil; E= estéril.

SECCION EXPERIMENTAL

Ejemplo 1: obtención de plantas de D. tenuifolia androestériles (citoplasmática)

Resumen de las investigaciones

Los inventores cruzaron plantas de la especie Raphanus sativus portadoras de una androesterilidad citoplasmática (denominada esterilidad Ogura) con plantas fértiles de la especie Diplotaxis tenuifolia. Realizaron varios retrocruzamientos para rescatar un núcleo de Diplotaxis tenuifolia conservando al mismo tiempo la androesterilidad citoplasmática. Al final de estos diferentes retrocruzamientos, las plantas obtenidas pueden utilizarse como progenitores femeninos para la obtención de híbridos.

Para ser más exactos, los inventores realizaron cruzamientos entre plantas de la especie Raphanus sativus como progenitor femenino, portadoras de la androesterilidad citoplasmática denominada Ogura, disponibles en el comercio, con plantas de la especie Diplotaxis tenuifolia (fértiles) como progenitor masculino. Obtuvieron así nueve plantas F1 por rescate de embriones, resultantes de este cruzamiento intergenérico.

En una segunda etapa, los inventores realizaron un primer retrocruzamiento ( backcross 1 o BC1) entre las plantas F1 obtenidas (Raphanus sativus CMSx Diplotaxis tenuifolia) y plantas de la especie Diplotaxis tenuifolia, es decir, siguiendo el esquema:

(Raphanus sativus CMS x Diplotaxis tenuifolia) x Diplotaxis tenuifolia (adoptando la convención internacional según la cual el progenitor femenino se menciona en el lado izquierdo de la cruz y el progenitor masculino en el lado derecho).

Las condiciones climáticas no permitieron obtener plantas por rescate de embriones, pero al repetir los mismos cruzamientos al año siguiente se obtuvieron seis plantas androestériles.

A continuación, los inventores realizaron un segundo retrocruzamiento (BC2) siguiendo el siguiente esquema:

((Raphanus sativus CMSx Diplotaxis tenuifolia) x Diplotaxis tenuifolia) x Diplotaxis tenuifolia. Se obtuvo un embrión, por rescate de embriones, y produjo varias plantas BC2 que también eran androestériles. Las siguientes etapas consisten en un tercer retrocruzamiento, siempre con una planta de la especie Diplotaxis tenuifolia, seguido de un cuarto retrocruzamiento (BC4).

Al final de un cuarto retrocruzamiento, todas las plantas obtenidas presentan las características fenotípicas que caracterizan a la especie Diplotaxis tenuifolia y pueden utilizarse en programas de selección, sin tener que recurrir al rescate de embriones, en particular, para la obtención de estirpes celulares parentales portadoras de una androesterilidad citoplasmática listas para la producción de híbridos.

Asimismo, los inventores han realizado varios cientos de cruzamientos de B. oleracea (androesterilidad citoplasmática Ogura) x Diplotaxis tenuifolia y Brassica rapa (androesterilidad citoplasmática Ogura) x Diplotaxis tenuifolia, pero ninguno de ellos permitió obtener embriones.

Descripción más detallada de las diferentes etapas:

1. Protocolo de los cruzamientos intergenéricos o interespecíficos:

Hibridación de flores:

Sin particularidad, se utilizó el protocolo habitual descrito en la bibliografía.

Los cruzamientos fueron del tipo B. rapa x D. tenuifolia, B. oleracea x D. tenuifolia, R. sativus x D. tenuifolia, ( R. sativus x D. tenuifolia) x D. tenuifolia, etc...

Recolección de ovarios o silicuas:

Las silicuas se recolectan antes de que amarilleen en la planta, para su cultivo (entre 4 días y un mes después del cruzamiento). Con respecto a las silicuas recolectadas, solo se utilizan las silicuas largas de más de 20 mm y de mayor diámetro y con vesículas.

Desinfección:

Las silicuas se colocan en bolitas de té. Se sumergen en alcohol durante 5 minutos. Después, se sumergen en Bayrochlor 3 cp/l de agua estéril con unas gotas de Tween 20 (monolaurato de polioxietilensorbitán) durante 30 minutos, agitando regularmente la bolita de té. A continuación, se aclaran tres veces con agua estéril, agitando la bolita de té de vez en cuando.

Cultivo de óvulos:

Con respecto a las silicuas recolectadas, solo están abiertas las que se han desarrollado. Son las silicuas de más de 20 mm y de mayor diámetro.

Las silicuas se abren a lo largo de la hendidura de dehiscencia, utilizando una aguja lanceolada de separación. Se extraen los óvulos bien redondeados y blanquecinos. Se cultivan de forma que el hilio esté en contacto con el agar para permitir el desarrollo del embrión.

Los óvulos cultivados se observan regularmente y se trasplantan cada 15 días. Los óvulos que se ponen negros y/o se aplanan (lo que significa aborto) se descartan.

Condiciones de cultivo para los cultivos de ovarios y óvulos

Medio N6, en luz difusa con un fotoperíodo de 16 horas, con una temperatura de 22 °C en los periodos diurnos y de 20 °C en los nocturnos. La composición de este medio N6 se detalla en las publicaciones de Chu, 1978 y Chu et al, 1975.

2. Desarrollo y multiplicación de plántulas obtenidas a partir de embriones.

Composición de los diferentes medios de cultivo para el desarrollo y multiplicación de las plántulas obtenidas:

El medio me 01 es un medio básico de Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, 1962) complementado con vitaminas de Morel B1, sacarosa y Agar-Agar como gelificante. El pH del medio me 01 es de 5,8.

El medio me 55 es un medio básico de Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, 1962), complementado con vitaminas de Morel, sacarosa y Gelrite como gelificante, con la sustancia de crecimiento Ga3 después de esterilizar en autoclave. El pH del medio me 55 es de 5,9/6.

Desarrollo de embriones:

Los embriones aparecen entre 1 mes y 1 mes y medio después del cultivo de los óvulos. Los embriones se colocan en luz directa con un fotoperíodo de 16 horas, con una temperatura de 22 °C en los periodos diurnos y de 20 °C en los nocturnos.

Los embriones pueden evolucionar de dos maneras: o forman una plántula, o hay formación de un callo, regenerando diferentes plántulas. En efecto, los embriones en cultivo no produjeron plántulas inmediatamente, hubo formación de callos, a veces con yemas en la parte superior.

Las plántulas se aíslan en un medio de desarrollo, medio 01 (o Me 01).

Multiplicación de explantes

Para los callos:

Para regenerar las yemas, los callos se trasplantan en un medio de inducción N6 o Me55. Las yemas se trasplantan al medio Me 01.

Para las yemas:

Todas las yemas obtenidas de los callos se subcultivaron en el medio de desarrollo Me 01, para arraigar.

Resumen: para el desarrollo y la multiplicación de explantes, son posibles dos escenarios:

1) Hay un pase por callo. El cultivo de callos se efectúa en un medio de inducción. Los callos regeneran yemas.

2) Se dispone de yemas que pueden desarrollarse directamente. Este cultivo se efectúa en un medio de desarrollo Me 01.

Para multiplicar estas plántulas, si la plántula no tiene ningún problema de desarrollo, se utiliza el cultivo de nudos en medio Me 01. Estos nudos (o yemas axilares) se desarrollan en plántulas.

Si la plántula es débil y/o tiene problemas de desarrollo, se trasplanta en un medio de multiplicación Me 55.

Enraizamiento de las plántulas:

En vistas a una aclimatación, para enraizar las plántulas multiplicadas, estas últimas se cultivan en un medio de enrizamiento Me 01.

Aclimatación:

Los inventores procedieron después a la aclimatación en cuanto las plántulas tuvieron raíces bien desarrolladas. El cultivo in vitro se continuó hasta que se obtuvieron dichas raíces.

Las plantas se aclimatan en macetas individuales con sustrato hortícola Klasmann Potgrong H, y se mantienen en un mini invernadero durante una semana. Al cabo de una semana, los inventores tenían hermosas plantas con buenas raíces, que sacaron de los mini invernaderos.

Al cabo de tres semanas, las plantas presentaban un buen sistema radicular y un buen desarrollo foliar. Después, las plantas se plantaron en el suelo, bajo un túnel. El fenotipado de las plantas así obtenidas se realiza con el fin de seleccionar aquellas cuyas características fenotípicas sean las más parecidas a las de D. tenuifolia, siendo portadoras de la androesterilidad citoplasmática (fenotípicamente detectable debido a la ausencia de polen).

3. Resultados

Cruzamientos intergenéricos

• Los inventores han realizado los siguientes cruzamientos intergenéricos:

Brassica rapa CMS x Diplotaxis tenuifolia y B. olerácea CMS x Diplotaxis tenuifolia, seguido de los siguientes primeros retrocruzamientos:

(Brassica rapa CMS x Diplotaxis tenuifolia) x Diplotaxis tenuifolia y (B. oleracea CMS x Diplotaxis tenuifolia) x Diplotaxis tenuifolia.

En estos dos retrocruzamientos, no se pudo obtener ningún embrión y, por lo tanto, ninguna descendencia.

• Los inventores procedieron entonces a realzar el siguiente cruzamiento intergenérico:

Raphanus sativus (CMS) x Diplotaxis tenuifolia

Se recolectaron las silicuas y se cultivaron los ovarios. En total, se realizaron 135 hibridaciones Raphanus sativus (CMS) x Diplotaxis tenuifolia, se recolectaron 1857 silicuas y se cultivaron 207 óvulos; mediante esta técnica, se obtuvieron 9 embriones, con los códigos RD1 a RD9.

De esta manera se obtuvieron plantas in vitro, que posteriormente se aclimataron.

Primera retrocruzamiento:

El año siguiente, los inventores realizaron el primer retrocruzamiento, siguiendo el esquema: [Raphanus sativus (CMS) x Diplotaxis tenuifolia ]x Diplotaxis tenuifolia.

En la tabla 1 se resume el número de silicuas recolectadas con óvulos.

Tabla n°1:

La tasa de silicuas que contienen óvulos es media (frecuencia del 39,1% de media).

Los óvulos se trasplantaron dos veces en medio N6 reciente. En los 2891 óvulos cultivados no se obtuvo ningún embrión BC1. Sin embargo, cabe señalar, que los primeros cruzamientos se realizaron en malas condiciones climáticas.

Los inventores llevaron a cabo un nuevo ensayo de retrocruzamiento al año siguiente, cambiando el método de fertilización con respecto al año anterior. En efecto, se decidió no efectuar todas las fertilizaciones simultáneamente, sino repartirlas a lo largo de un mes, para limitar la influencia de las condiciones climáticas, y producir como máximo 200 yemas cada día de fertilización.

En la tabla 2 se resumen los resultados de este segundo intento de retrocruzamiento.

Como se muestra en esta tabla 2, se obtuvieron 7 embriones en total, denominados D1 a D7. La plántula D7 no se desarrolló.

El trasplante de los embriones en medio N6 permite la proliferación de las yemas: cada embrión puede así clonarse en varias copias. De este modo, es posible aclimatar plantas que después se utilizan para retrocruzamientos posteriores, manteniendo las plántulas in vitro.

El material F1 y BC1 también se mantiene regularmente in vitro, o en invernadero (cuando surgen problemas de contaminación).

Las plantas aclimatadas se vuelven a cultivar a partir de axilares. Las secciones de los tallos se desinfectan con una solución de Bayrochlor (3 cp/l) durante 30 minutos. Los axilares se depositan en un medio basal (por ejemplo Me01).

Segundo retrocruzamiento:

A continuación, los inventores llevaron a cabo el segundo retrocruzamiento, siguiendo el esquema:

[[Raphanus sativus (CMS) x Diplotaxis tenuifolia ]x Diplotaxis tenuifolia] x Diplotaxis tenuifolia

Para el cultivo de los óvulos, las silicuas se recolectaron unos días después de la hibridación.

Con las 60 hibridaciones realizadas, se recolectaron 1149 silicuas y se cultivaron 5505 óvulos.

Se obtuvo un solo embrión, que se trasplantó cada 15 días en medio me 55 o N6 para obtener un callo, y después yemas, que se desarrollaron en plántulas.

Ejemplo 2: Caracterización del genoma mitocondrial y cloroplástico de plantas de Diplotaxis tenuifolia. El genoma cloroplástico y mitocondrial de las brasicáceas se caracterizan por una herencia exclusivamente materna. Los inventores utilizaron tres genes mitocondriales, descritos en la patente EP 0549726, y marcadores microsatélites (o SSR "del inglés simple sequence repeat' que significa repetición de una secuencia simple) cloroplásticos, descritos en la publicación Flannery et al (2006), para caracterizar el citoplasma masculino en las plantas de Diplotaxis tenuifolia androestériles según la invención.

En efecto, se recuerda que una planta Diplotaxis tenuifolia según la invención comprende, en su genoma mitocondrial y cloroplástico, secuencias provenientes de Raphanus sativus.

Los oligonucleótidos definidos dentro del gen orf138 y del gen del ARNt de transferencia de formilmetionina, permiten la amplificación de un fragmento de 512 y 401 pares de bases respectivamente, únicamente en plantas que comprenden la esterilidad Ogura. La amplificación dentro del gen cox I (subunidad 1 pequeña de la citocromo oxidasa) de un fragmento del genoma mitocondrial del rábano de 655 pares de bases, sirve como control, ya que este fragmento debe amplificarse en todas las estirpes sometidas a ensayo.

Dependiendo de la presencia o ausencia de amplificación de fragmentos de secuencias mitocondriales utilizando estos cebadores, es posible caracterizar las diferentes plantas utilizadas en la presente invención con respecto a su androesterilidad citoplasmática.

La variación alélica de los marcadores microsatélites SSR cloroplásticos sometidos a ensayo permite caracterizar la procedencia del genoma cloroplástico de las plantas de Diplotaxis tenuifolia de la invención, más particularmente la presencia de secuencias cloroplásticas características de Raphanus sativus.

Dependiendo de la longitud del fragmento de amplificación de las secuencias cloroplásticas utilizando estos cebadores, es posible caracterizar las diferentes plantas utilizadas en la presente invención en cuanto a la naturaleza de su genoma cloroplástico.

Las plantas de Diplotaxis tenuifolia obtenidas según el procedimiento descrito en la presente invención, difieren en cuanto a su genoma cloroplástico, de otras plantas de Diplotaxis tenuifolia cuyo genoma cloroplástico no procede del género Raphanus.

A. Análisis de marcadores mitocondriales y condiciones de PCR.

El ADN total (genomas nuclear y citoplasmático) de plantas de D. tenuifolia fértiles y androestériles según la invención, se aisló de hojas de plantas de 8 semanas de vida, según el protocolo de Dellaporta (1983). - Uso de marcadores específicos de orf138 y T-ARNt para detectar la androesterilidad citoplasmática Ogura:

Orf138

Cebador en 'sentido': oligo 37: 5'-GCATCACTCTCCCTGTCGTTATCG-3' (8 pM) (SEQ ID NO: 22);

Cebador en 'antisentido': oligo38: 5'-ATTATTTTCTCGGTCCATTTTCCA-3' (8 pM) (SEQ ID NO: 23).

T-ARNt

Cebador en 'sentido': TRNAFM-610U: 5'-ACGTGTAGCCCTGTATGGACT-3' (8 pM) (SEQ ID NO: 24);

Cebador en 'antisentido': TRNAFM-987L: 5'-GGTATTGTCACTTCCCGTTTC-3' (8 pM) (SEQ ID NO: 25). La posición de estos diferentes cebadores se ilustra en la figura 1 (los cebadores relacionados con T-ARNt se subrayan con una línea sencilla y los cebadores relacionados con orf138 se subrayan con una línea doble).

- Uso de marcadores específicos para amplificar un control mitocondrial positivo en todas las plantas sometidas a ensayo:

Cebador en 'sentido': COX1-244U: 5'-GGTAATTGGTTTGTTCCGATT-3' (8 |jM) (SEQ ID NO: 26);

Cebador en 'antisentido': COX1-805L: 5'-CATGCCTAGATACCCGAAGAC-3' (8 jM ) (SEQ ID NO: 27).

- La reacción de PCR para estos marcadores se realiza en muestras de 20 j l que comprenden:

5.0 j l del ADN total diluido (de 2 a 10 ng/jl)

2.0 j l de tampón PCR 10 x (Invitrogen)

2.0 j l de MgCl225 mM (Invitrogen)

1,5 j l de mezcla de dNTP (2 mM de cada dNTP; SIGMA)

0,7 j l de cebador en 'sentido' (8 jM )

0,7 j l de cebador en 'antisentido' (8 jM )

0,15 j l de ADN polimerasa Taq 5 U /jl (Invitrogen)

7,95 j l de H2O.

El perfil de los termociclos de PCR es el siguiente:

- para amplificación de ORF138 y T-ARNt

3 minutos a 94 °C; después, 35 ciclos de (30 seg a 94 °C, 45 seg a 68,5 °C, 1 min a 72 °C); 7 min a 72 °C y después volver a 4 °C, en un sistema PCT GeneAmp® 2700 (Applied Biosystems).

- para la amplificación de COX1:

3 minutos a 94 °C; después, 35 ciclos de (30 seg a 94 °C, 45 seg a 54 °C, 1 min a 72 °C); 7 min a 72 °C y después volver a 4 °C, en un sistema PCT GeneAmp® 2700 (Applied Biosystems).

Una parte de los productos de PCR se comprueba en un gel de agarosa al 1,5 % y el resto se somete a secuenciación según el método de Sanger.

La figura 2 muestra una banda correspondiente a la amplificación de COX1 en todas las muestras. Las bandas de amplificación que representan los fragmentos de ORF138 y T-ARNt solo están presentes en las columnas cargadas con el ADN mitocondrial de plantas portadoras de la androesterilidad citoplasmática Ogura.

La escala de tamaño presente en la parte más a la izquierda del gel confirma que los fragmentos amplificados son de un tamaño conforme a las predicciones, es decir, de aproximadamente 512 pares de bases para ORF138, de aproximadamente 401 para T-ARNt y de aproximadamente 655 para COX1.

Los inventores también realizaron una secuenciación de dos fragmentos amplificados (ORF138 y T-ARNt), lo que permitió confirmar que su tamaño era conforme a los tamaños esperados, pero también que la secuencia de los fragmentos amplificados era idéntica o casi idéntica a la de la secuencia identificada como relacionada con la CMS Ogura, en Raphanus sativus, es decir, Z18896.

La secuenciación de los fragmentos amplificados (secuenciación consenso de varios fragmentos) dio los siguientes resultados (las secuencias subrayadas corresponden a las secuencias de los cebadores):

- Fragmento amplificado de 512 pares de bases del orf138:

GCATCACTCTCCCTGTCGTTATCGACCTCGCAAGGTTTTTGAGACGGCCGAAACGGGAAGTGACAA

TACCGCTTTTCTTCAGCATATAAATGCAATGATTACCTTTTTCGAAAAATTGTCCACTTTTTGTCA

TAATCTCACTCCTACTGAATGTAAAGTTAGTGTAATAAGTTTCTTTCTTTTAGCTTTTTTACTAAT

GGCCCATATTTGGCTAAGCTGGTTTTCTAACAACCAACATTGTTTACGAACCATGAGACATCTAGA

GAAGTTAAAAATTCCATATGAATTTCAGTATGGGTGGCTAGGTGTCAAAATTACAATAAAATCAAA

TGTACCTAACGATGAAGTGACGAAAAAAGTCTCACCTATCATTAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGA

GGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAAT

AGAGGGGAAAAGGAAAAAAAAAGAGGTGGAAAATGGACCGAGAAAAATAAT (SEQ ID NO: 20).

Se encontró una sola discrepancia de un nucleótido (posición 43 de SEQ ID NO: 20) con respecto a la secuencia correspondiente de Z18896 (SEQ ID NO: 1).

- Fragmento amplificado de 401 pares de bases T-ARNt:

ACGTGTAGCCCTGTATGGACTCGCGAAGCAGGTCTCCGGTCGGTGTCCAAGATTTGATCTAACTAT

TGAGTGAGGACTACTTACCGATTGATAGAATAATACGTATATAAGAAGAAGGCTGCTTTGTGGAGT

GATCTTTCTCGAAATGAATTAAGTAAGGGCGCTATGTTCAGATTCTGAACCAAAGCACTAGTTGAG

GTCTGAAAGCCTTATGAGCAGAAGTAATAAATACCTCGGGGAAGAAGCGGGGTAGAGGAATTGGTC

AACTCATCAGGCTCATGACCTGAAGATTACAGGTTCAAATCCTGTCCCCGCACCGTAGTTTCATTC

TGCATCACTCTCCCTGTCGTTATCGACCTCGCAAGGTTTTTGAAACGGCCGAAACGGGAAGTGACA

ATACO (SEQ ID NO: 21).

No se encontraron discrepancias entre SEQ ID NO: 21 y la secuencia correspondiente de Z18896 (SEQ ID NO: 1).

Esto lleva a la conclusión de que el genoma mitocondrial de las plantas de Diplotaxis tenuifolia androestériles según la presente invención, es efectivamente el del progenitor femenino en el cruzamiento intergenérico, es decir, el de Raphanus sativus CMS.

B. Análisis de marcadores cloroplásticos y condiciones de PCR.

- Uso de SSR (repetición de una secuencia simple o marcador microsatélite) para distinguir entre plantas fértiles y plantas portadoras de la androesterilidad citoplasmática según la invención.

Los marcadores utilizados se enumeran en la Tabla 3.

El análisis de polimorfismos de marcadores SSR se realiza en un sistema de análisis de ADN MegaBACE®, utilizando una matriz de separación LPA de alta resolución, con una resolución de una sola base (General Electrics Healthcare Inc).

Estos marcadores SSR se amplifican utilizando la cola universal M13 que permite la amplificación de numerosos fragmentos SSR específicos utilizando un solo cebador M13 marcado (diferentes colorantes disponibles tales como FAM, HEX o NED) y numerosos cebadores M13 en 'sentido'.

- El medio de reacción para la PCR consiste en una muestra de 10 pl que comprende:

5.0 pl del ADN total diluido (de 2 a 10 ng/pl)

1.0 pl de tampón PCR10 x (Invitrogen)

1.0 pl de MgCl225 mM (Invitrogen)

1.0 pl de mezcla de dNTP (2 mM de cada dNTP; SIGMA)

0,6 pl de Cebador M13 en 'sentido' (2 pM)

0,6 pl de Cebador en 'antisentido' (8 pM)

0,12 pl de Cebador M13 marcado con FAM, HEX o NED (8 pM)

0,12 pl de ADN polimerasa Taq 5 U/pl (Invitrogen)

0,56 pl de H2O.

El perfil de los termociclos de PCR es el siguiente:

3 minutos a 94 °C; después, 35 ciclos de (15 seg a 94 °C, 20 seg a 50 °C, 15 seg a 72 °C); 7 min a 72 °C y después volver a 4 °C, en un sistema PCT GeneAmp® 2700 (Applied Biosystems). El análisis de genotipado se realiza en MegaBACE®.

De cuatro a seis productos SSR se diluyen una vigésima parte y se multiplexan en el mismo capilar con 5 pl de ET-400 ROX (escala de tamaño estándar). Las condiciones de uso son las siguientes:

Tiempo de inyección: 110 segundos;

Voltaje de inyección: 3 kV;

Tiempo de recorrido: 65 minutos

Voltaje durante el recorrido: 9 kV

Filtros: conjunto de colorantes II

El programa MegaBACE® Fragment Profiler 1.0 convierte los datos sin procesar en datos de tamaño. La tabla 4 contiene los alelos SSR obtenidos en diferentes plantas fértiles y androestériles según la presente invención.

El análisis se efectuó en 2 estirpes diferentes de Diplotaxis tenuifolia fértiles y en 2 estirpes de Diplotaxis tenuifolia según la presente invención, así como en una estirpe de B. oleracea portadora de la androesterilidad citoplasmática denominada Ogura según la patente EP0 549 726, y en una estirpe de R. sativus portadora de la androesterilidad citoplasmática Ogura.

Tabla 3: cebadores utilizados para el genotipado cloroplástico.

cebador secuencia SEQ ID gen MF1_M13F 5'- SEQ ID Gen trnL-F

CACGACGTT GT AAAACGACT CAATT GCACATT CTAGAATT CTAAG- NO: 2

3’

MF1_R 5 ’ - CAATT C AAT ATG GTT AT AT ATT AG AG-3 ’ SEQ ID

NO: 3

MF2_M13F 5’-CACGACGTTGTAAAACGACGGTTCCGTCGTTCCCATCGC-3’ SEQ ID Gen NO: 4 RPL16 MF2_R 5’-CATAATAATTAGATAAATCTGTTCC-3’ SEQ ID

NO: 5

MF3_M13F 5’-CACGACGTT GT AAAACGACAAT GGT AT GACT AGCTT ATAAGG-3’ SEQ ID Gen trnE-NO: 6 trnT MF3_R 5’-CTTAACAATGAGATGAGGCAATC-3’ SEQ ID

NO: 7

MF4_M13F 5’-CACGACGTT GT AAAACGACCGGAT CT ATT AT GACAT ATCC-3’ SEQ ID Gen psaA-NO: 8 ycf3 MF4_R 5 ’ - G AAAT AT G AAT ACACTAGATTAGG-3’ SEQ ID

NO: 9

MF5_M13F 5’-CACGACGTT GT AAAACGACCCT GGCGGTAT CAAGAT GCCACT - SEQ ID Gen trnT-3’ NO: 10 rpoC2 MF5_R 5’-GCCATAATGGTACAGAACTAT-3’ SEQ ID

NO: 11

MF6_M13F 5’-CACGACGTT GT AAAACGACGAAGGAAT AGTCGTTTT CAAG-3’ SEQ ID Gen atpB-NO: 12 rbcL MF6_R 5 ’ - C ATAATT AGAGTTCCATTTCGG-3’ SEQ ID

NO: 13

MF7_M13F 5’-CACGACGTT GT AAAACGACCGGCAGGAGTCATT GGTT CAAA-3’ SEQ ID Gen TrnM-NO: 14 atpE MF7_R 5’-GATTTT GT AACT AGCT GACG-3’ SEQ ID

NO: 15

MF8_M13F 5’-CACGACGTT GT AAAACGACCTT ATATT CAT AAGCGAAGAAC-3’ SEQ ID Gen rbcL-NO: 16 accD MF8_R 5 ’ - AATAAC AAT AG AT G AAT AGTC A- 3 ’ SEQ ID

NO: 17

MF9_M13F 5’-CACGACGTT GT AAAACGACGGGCCGTT AT GCT CATT ACG-3’ SEQ ID Gen ndhB-NO: 18 rps7 MF9 R 5’-TCCTATTCATGGGGATTCCG-3’ SEQ ID

NO: 19

Tabla 4: resultados de genotipado con 9 SSR cloroplásticos. Los números representan el tamaño de los alelos de los^ fra mentos de am lificación en número de bases.

Se recuerda que los cloroplastos de una planta de Diplotaxis tenuifolia según la invención provienen de Raphanus sativus.

En plantas de tipo B. olerácea portadoras de la androesterilidad citoplasmática Ogura, después de la fusión de protoplastos que permitió importar la androesterilidad citoplasmática de R. sativus a B. olerácea, los cloroplastos se diferencian de los de R. sativus.

Los resultados de la tabla 4 confirman que las longitudes de los fragmentos amplificados son idénticas en las 2 estirpes de Diplotaxis tenuifolia según la presente invención (es decir, CMS, las dos últimas filas de la tabla), estas longitudes también son idénticas a las de los fragmentos amplificados de la estirpe de Raphanus sativus androestéril Ogura. Esto lleva a la conclusión de que el genoma cloroplástico de las plantas de Diplotaxis tenuifolia androestériles según la presente invención, es efectivamente originario de Raphanus sativus (utilizado como progenitor femenino en el cruzamiento intergenérico).

Los resultados obtenidos en relación al genoma cloroplástico confirman que el genoma cloroplástico de las plantas de la invención corresponde al genoma cloroplástico de Raphanus sativus, y que difiere del genoma cloroplástico de las plantas como se describe en la patente EP0549726.

Asimismo, el genoma cloroplástico de las plantas según la invención, portadoras de la androesterilidad citoplasmática, también difiere del de las plantas de la especie Diplotaxis tenuifolia androfértiles.

Para diferenciar entre una planta de D. tenuifolia androestéril según la presente invención y una planta de D. tenuifolia fértil, son particularmente adecuados los siguientes pares de marcadores:

- los cebadores oligo MF2_M13F y MF2_R (SEQ ID NO: 4 y 5 respectivamente) que permiten obtener un fragmento de amplificación de 193 pares de bases, característico del genoma cloroplástico de Raphanus sativus;

- los cebadores oligo MF8_M13F y MF8_R (SEQ ID NO: 16 y 17 respectivamente) que permiten obtener un fragmento de amplificación de 264 pares de bases, característico del genoma cloroplástico de Raphanus sativus; - los cebadores oligo MF8 MF7_M13f y MF7_R (SEQ ID NO: 14 y 15 respectivamente) que permiten obtener un fragmento de amplificación de 180 pares de bases, característico del genoma cloroplástico de Raphanus sativus; - los cebadores oligo MF9_M13F y MF9_R (SEQ ID NO: 18 y 19 respectivamente) que permiten obtener un fragmento de amplificación de 319 pares de bases, característico del genoma cloroplástico de Raphanus sativus; - los cebadores oligo MF3_M13F y MF3_R (SEQ ID NO: 6 y 7 respectivamente) que permiten obtener un fragmento de amplificación de 303 pares de bases, característico del genoma cloroplástico de Raphanus sativus;

- los cebadores oligo MF6_M13F y MF6_R (SEQ ID NO: 12 y 13 respectivamente) que permiten obtener un fragmento de amplificación de 183 pares de bases, característico del genoma cloroplástico de Raphanus sativus; - los cebadores oligo 37 y 38 (SEQ ID NO: 22 y 23 respectivamente) que permiten obtener un fragmento de amplificación de 512 pares de bases, característico del genoma mitocondrial de Raphanus sativus CMS (Ogura); - los cebadores TRN^aF^m-610U y TRNAFM-987L (SEQ ID NO: 24 y 25 respectivamente) que permiten obtener un fragmento de amplificación de 401 pares de bases, característico del genoma mitocondrial de Raphanus sativus CMS (Ogura).

Bibliografía:

Cao J. y Earle, E. D. Plant Cell Report 21:789-796 (2003).

Chu C.C The N-medium and its application to anther culture of Cereal crops Proc. Symp. Plant Tissue culture, Pekín 43 (1978).

Chu C.C et al Establishement of an efficient medium for anther culture of Rice through comparative experiments on the nitrogen sources, Scienta Sinic, 18,659 (1975). Flannery M.L. et al. Plastid genome characterisation in Brassica and Brassicaceae using a new set of nine SSRs. Theor Appl Genet 113:1221-1231 (2006).

Matsuzawa et al. Male sterility in alloplasmic Brassica rapa L. carrying Eruca sativa cytoplasm. Plant Breeding 118, 82 84 (1999).

Murashige, T. and Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15, 473 (1962)

Rahman, M.H. Optimum age of siliques for rescue of hybrid embryos from crosses between Brassica oleracea, B. rapa y B. carinata. Canadian Journal of Plant Science 84 (4): 965-969 (2004).

Woo Bang, S. et al. (2003). Production of Intergeneric Hybrids between the C3-C4 Intermediate Species Diplotaxis tenuifolia (L.) DC. and Raphanus sativus L. Breeding Sciences 53: 231-236

Claims

REIVINDICACIONES

1. Planta de la especie Diplotaxis tenuifolia, caracterizada por que es portadora de una androesterilidad citoplasmática, por que su genoma mitocondrial comprende la secuencia de ADN correspondiente a los nucleótidos 1673 a 2089 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene una identidad de al menos 70 % con esta secuencia de ADN, y por que no presenta ningún síntoma de clorosis en condiciones de cultivo normales, en particular, ninguna decoloración de las hojas debido a la falta de clorofila.

2. Planta según la reivindicación 1, caracterizada por que se trata de una planta híbrida.

3. Planta según la reivindicación 1, caracterizada por que en su genoma citoplasmático cloroplástico comprende una secuencia de al menos 200 pares de bases consecutivos, proveniente del genoma cloroplástico de Raphanus sativus.

4. Planta según la reivindicación 3, caracterizada por que cuando se utilizan los cebadores correspondientes para amplificar por PCR su genoma cloroplástico, se obtiene un fragmento de amplificación del siguiente tamaño:

• 193 pares de bases cuando se utilizan los

cebadores SEQ ID NO: 4 y 5 y/o

• 264 pares de bases cuando se utilizan los

cebadores SEQ ID NO: 16 y 17 y/o

• 180 pares de bases cuando se utilizan los

cebadores SEQ ID NO:

14 y 15 y/o

• 319 pares de bases cuando se utilizan los

cebadores SEQ ID NO: 18 y 19 y/o

• 303 pares de bases cuando se utilizan los cebadores SEQ ID NO: 6 y 7 y/o

• 183 pares de bases cuando se usan los cebadores SEQ ID NO: 12 y 13.

5. Planta según la reivindicación 1, caracterizada por que cuando se utilizan los cebadores correspondientes para amplificar por PCR su genoma mitocondrial, se obtiene un fragmento de amplificación del siguiente tamaño:

• 512 pares de bases cuando se utilizan los cebadores SEQ ID NO: 22 y 23 y/o

• 401 pares de bases cuando se utilizan los cebadores SEQ ID NO: 24 y 25.

6. Planta según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que sus células poseen el ADN genómico de Diplotaxis tenuifolia y el ADN mitocondrial y cloroplástico de Raphanus sativus.

7. Semilla de la especie Diplotaxis tenuifolia, caracterizada por que es portadora de una androesterilidad citoplasmática, y por que su genoma mitocondrial comprende la secuencia de ADN correspondiente a los nucleótidos 1673 a 2089 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene una identidad de al menos 70 % con esta secuencia de ADN.

8. Semilla según la reivindicación 8, caracterizada por que en su genoma cloroplástico comprende secuencias provenientes de Raphanus sativus, de al menos 200 pares de bases consecutivos.

9. Célula de una planta de la especie Diplotaxis tenuifolia, caracterizada por que es portadora de una androesterilidad citoplasmática y por que su genoma mitocondrial comprende la secuencia de ADN correspondiente a los nucleótidos 1673 a 2089 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene una identidad de al menos 70 % con esta secuencia de ADN.

10. Célula según la reivindicación 9, obtenida de una planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de una semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8.

11. Célula según la reivindicación 10, caracterizada por que en su genoma cloroplástico comprende secuencias provenientes de Raphanus sativus, de al menos 200 pares de bases consecutivos.