ES2294853T3 - Nuevos materiales geneticos para transmision al maiz. - Google Patents
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Abstract
Un método para explorar una planta para determinar si la planta es un cruce entre Tripsacum y teosinte perenne, comprendiendo dicho método las siguientes etapas: (a) cruzar un parental femenino de Tripsacum con polen de un parental de teosinte perenne para producir una semilla, o cruzar un parental femenino de teosinte perenne con un Tripsacum donante de polen para producir una semilla; después (b) recolectar la semilla producida en (a); después (c) cultivar las plantas a partir de la semilla recolectada en (b); después (d) aislar el ADN genómico total de las plantas en (c); después (e) digerir dicho ADN genómico con de una a cuatro de las enzimas de restricción seleccionadas del grupo constituido por EcoRI, EcoRV, HindIII y BamHI; después (f) sondar dicho ADN genómico digerido con uno o más marcadores de ADN seleccionados del grupo constituido por las sondas de ADN nuclear de maíz, las sondas de ADN mitocondrial de maíz y las sondas de ADN de Tripsacum que se enumeran a continuación; y después (g) determinar la presencia de uno o más de los siguientes fragmentos de restricción de los siguientes tamaños de fragmento, en los que dichos fragmentos de restricción se caracterizan por las siguientes asociaciones de marcador molecular-enzima de restricción y por los tamaños de fragmento asociados seleccionados del grupo constituido por
Description
Nuevos materiales genéticos para transmisión al
maíz.
Esta invención se refiere generalmente a los
campos de la genética molecular y de la mejora genética vegetal.
Más particularmente, se refiere a un medio de trasladar nuevas
formas variantes de ADN heredadas de manera estable al maíz
(maize) (Zea mays L.), también denominado maíz
(corn) en Estados Unidos. Estas nuevas secuencias de ADN,
obtenidas de la hibridación intergenérica entre el pasto gama
oriental (Tripsacum dactyloides L.) y el teosinte perenne
(Zea diploperennis IItis, Doebley y Guzmán) proporcionan
marcadores únicos para facilitar la selección de rasgos deseables
en los programas de mejora genética vegetal, para la detección de
secuencias de ADN diana en los análisis genéticos, y para la
identificación de nuevos genes para la mejora del maíz que puedan
potenciar la resistencia a plagas de insectos y enfermedades, la
tolerancia al estrés por sequía, la tolerancia al frío, el
perennialismo, la producción de grano, la totipotencia, la
apomixis, los sistemas de raíces mejorados, la tolerancia a suelos
anegados, la tolerancia a suelos ácidos y con alto contenido en
aluminio, la calidad de grano mejorada, la calidad de forraje
mejorada y la adaptabilidad a una atmósfera enriquecida en
CO_{2}.
Genética Molecular. La genética es el
estudio de los genes y de los rasgos heredables en organismos
biológicos. En mejora genética vegetal, el objetivo de la genética
molecular es identificar los genes que confieren los rasgos
deseados a las plantas de cultivo y usar marcadores moleculares
(indicadores de ADN que están estrechamente relacionados con genes
específicos) para identificar a los individuos que llevan el gen o
genes de interés en plantas (Morris 1998), para determinar las
secuencias de ADN y caracterizar la expresión génica y la función.
Un marcador genético es un alelo variante que se usa para marcar una
estructura o proceso biológico durante el transcurso de un
experimento. Se usan variantes de ADN y de proteínas como marcadores
en genética molecular. El análisis genético de variantes
moleculares puede identificar un gen en particular que sea
importante para un proceso biológico. La mutación es el proceso por
el que las secuencias de nucleótidos y los genes cambian de la
forma de referencia, generalmente denominada tipo silvestre, a una
forma diferente y los mutantes son la fuente de genotipos variantes
en el análisis genético que permiten la selección de nuevos
fenotipos (Griffiths et al. 1993). Las mutaciones se
producen a nivel de una secuencia de nucleótidos específica, del gen
(es decir, la secuencia de ADN) o del cromosoma (es decir, el
paquete hereditario en el que unidades de ADN que contienen
secuencias nucleotídicas y genes específicos se superenrollan con
proteínas). En una mutación genética, los nucleótidos que
comprenden el alelo de tipo silvestre de un gen (es decir, la forma
de referencia que existe en un locus en particular) se alteran. En
las mutaciones cromosómicas, segmentos de cromosomas, cromosomas
completos o conjuntos completos de cromosomas cambian por inversión,
translocación, fusiones y deleciones.
En general, las mutaciones son muy poco
frecuentes, y la mayoría de las mutaciones recién generadas son
perjudiciales. Los datos sobre frecuencias de mutación para siete
genes del maíz proporcionan unas medidas basales que indican la
escasa frecuencia de mutaciones en el maíz (Stadler 1951). La
frecuencia de mutación osciló entre el 0,000492% (es decir, 492
mutantes por millón de gametos) en el gen del color rojo (R);
el 0,000106% (es decir, 106 por millón) para el inhibidor del gen
R (I); el 0,000011% (es decir, 11 por millón) para el
gen de la aleurona morada (Pr); el 0,0000024% (es decir, 2,4
por millón) para el gen del endospermo amiláceo (Su), el
0,0000022% (es decir, 2,2 por millón) para el gen del color amarillo
(Y); el 0,0000012% (es decir, 1,2 por millón) para el gen
del grano normal (Sh) y el 0% (es decir, 0 por millón) para el gen
ceroso (Wx).
Debido a que las mutaciones espontáneas son poco
frecuentes, los genetistas y obtentores de nuevas variedades
vegetales usan típicamente mutágenos (es decir, agentes como
químicos y radiaciones para aumentar la frecuencia de las tasas de
mutación) para obtener formas variantes que pueden usarse en el
análisis genético y en la selección de nuevas variedades. Otro
método para inducir mutagénesis en el maíz es el marcado con
transposón, en el que una línea de maíz se cruza con una línea que
contiene uno de los tres sistemas de elementos transponibles que se
encuentran en el maíz. Cuando un elemento transponible se inserta en
un gen, provoca una mutación. Las frecuencias de mutación
publicadas para líneas mutantes con elementos transponibles varían
de 1 en mil a 1 en un millón (Chomet 1994). Para descubrir una
mutación usando una de estas líneas mutágenas, un obtentor genético
debe explorar un mínimo de 100.000 progenies.
Mejora genética vegetal. La mejora
genética vegetal convencional es la ciencia que utiliza cruces entre
individuos con diferentes constituciones genéticas. La
recombinación de genes resultante entre diferentes líneas, familias,
especies o géneros produce nuevos híbridos de los que se
seleccionan los rasgos deseables. La mejora genética vegetal se
consigue controlando la reproducción. Puesto que el maíz es una
planta que se reproduce sexualmente, con frecuencia se emplean
técnicas de polinización controlada para obtener nuevos híbridos.
Controlar la reproducción del maíz implica repetir continuamente
dos procedimientos básicos: (1) evaluar una serie de genotipos, y
(2) autopolinizar o cruzar entre sí las plantas de mejor calidad
para obtener la siguiente generación de genotipos o progenie. Las
polinizaciones controladas del maíz utilizan dos procedimientos: (1)
despanojado y (2) polinización manual.
El maíz es una planta monoica que tiene flores
masculinas y femeninas separadas en la misma planta. Las flores
masculinas o estaminadas producen polen en la panoja en el ápice del
tallo de maíz, y las flores femeninas o pistiladas que producen el
grano cuando se polinizan se sitúan lateralmente en las axilas de
las hojas, tangenciales al tallo. La polinización se realiza
mediante la transferencia de polen desde la panoja a los estigmas
que emergen de las mazorcas pistiladas axilares. Puesto que el maíz
se poliniza por el viento, la polinización controlada en la que el
polen se recoge de la panoja de una planta y se transfiere a mano a
los estigmas de la misma o de otra planta, es una técnica que se
usa en la mejora genética del maíz. Las etapas implicadas en
realizar cruces controlados y autopolinizaciones en el maíz son por
norma (Neuffer 1982) y son de la manera siguiente. (1) la mazorca
que emerge del vástago de la hoja se cubre con una bolsa de vástago
de mazorca uno o dos días antes de que emerjan los estigmas para
evitar la contaminación por polen del entorno; (2) antes de
realizar una polinización, la bolsa de vástago de mazorca se retira
rápidamente y los estigmas se cortan con un cuchillo para formar un
penacho corto, después la bolsa se coloca inmediatamente de nuevo
sobre la mazorca; (3) también antes de realizar una polinización, la
panoja se cubre con una bolsa de panoja para recoger el polen; (3)
el día en el que se realizan los cruces, la bolsa de panoja con el
polen deseado se lleva a la planta para realizar el cruce, la bolsa
de vástago de mazorca se retira y el polen se espolvorea sobre el
penacho de estigmas y
después se cierra la bolsa de panoja en su sitio sobre el vástago polinizado para proteger a la mazorca en desarrollo.
después se cierra la bolsa de panoja en su sitio sobre el vástago polinizado para proteger a la mazorca en desarrollo.
El Zea diploperennis (en lo sucesivo
denominado diploperennis), es un teosinte perenne diploide y un
pariente silvestre del maíz endémico de las montañas de Jalisco,
México. El diploperennis pertenece al mismo género que el maíz,
tiene el mismo número de cromosomas (2n = 20) y puede hibridar de
forma natural con él.
El Tripsacum es una hierba poliploide
rizomatosa y perenne que es un pariente silvestre más lejano del
maíz y que tiene un número de cromosomas diferente (x = 18, 2n = 36
ó 2n = 72). No se tiene constancia de que el Tripsacum forme
de forma natural híbridos fértiles con el maíz o con los Zeas
silvestres. La progenie de (maíz X Tripsacum) obtenida por
métodos artificiales tiene diez cromosomas del maíz y 18 ó 36
cromosomas del Tripsacum, y son machos estériles. La
fertilidad femenina puede restaurarse parcialmente usando técnicas
especiales que eliminan la mayoría de los cromosomas del
Tripsacum (Mangelsdorf 1974). Las plantas obtenidas por
cruzamiento de Tripsacum y maíz (Zea mays L.)
empleando a Tripsacum como el donante de polen, tienen
gametos no reducidos con un conjunto completo de cromosomas de
Zea y un juego completo de cromosomas de Tripsacum.
Existe una publicación de un cruce recíproco con éxito en el que se
polinizó Tripsacum con maíz, que requirió técnicas de
cultivo de embriones para llevar el embrión a la madurez, y las
plantas eran estériles (Farquharson 1957). Los híbridos de
maíz-Tripsacum se han cruzado con teosinte para generar un
híbrido trigenómico que tiene un total de 38 cromosomas; 10 del
maíz, 18 del Tripsacum y 10 del teosinte. Las plantas
trigenómicas resultantes eran todas machos estériles y tenían un
alto grado de infertilidad femenina (Mangelsdorf 1974; Galinat
1968).
Basándose en las relaciones conocidas de
posibilidades de cruce entre Zea y Tripsacum y en los
resultados de cruces anteriores entre ellos, no se ha podido
predecir que el éxito de los cruces entre Zea diploperennis
y Tripsacum dé como resultado plantas viables completamente
fértiles con números de cromosomas de 2n = 20 (Eubanks 1995, 1997).
No se esperaba una reducción en el número de cromosomas en los
cruces interespecíficos en base a la técnica anterior. También fue
inesperada la fertilidad de las plantas que se obtienen como
resultado del cruce realizado de ambas formas, con Tripsacum
como donante de polen y como receptor de polen, en base a la
técnica anterior.
Aunque el número de cromosomas de base de
Tripsacum y de Zea diploperennis es diferente, X = 10
en Zea y X = 10 y X = 18 en Tripsacum, sus longitudes
cromosómicas totales respectivas son casi iguales. La longitud
total de los 18 cromosomas de Tripsacum dactyloides es
de 492,5 \mum (Chandravadana et al. 1971) y la longitud
total de los 10 cromosomas de Zea diploperennis es de 501,64
\mum (Pasupuleti y Galinat 1982). No es fácil obtener una planta
híbrida cuando se cruzan Tripsacum y diploperennis. Se
requieren cientos de polinizaciones para obtener una semilla viable,
y aproximadamente la mitad de las plántulas que germinan mueren
poco después de la germinación. Sin embargo, como prueban la
fertilidad cruzada y el número de cromosomas, cuando se producen
alineamientos precisos entre regiones homólogas de los cromosomas de
Tripsacum y de diploperennis, existe un grado suficiente de
emparejamiento para permitir ocasionalmente que este cruzamiento
inesperado y poco frecuente tenga éxito.
La fertilidad inesperada de los híbridos de
Tripsacum-teosinte perenne, y su fertilidad cruzada con el
maíz, son de gran valor porque proporcionan la oportunidad de cruzar
directamente el germoplasma intergenérico recombinado con el maíz.
Además de proporcionar un intermediario genético para incorporar
genes de Tripsacum en el maíz, los híbridos de
Tripsacum-diploperennis proporcionan un mecanismo para
incorporar en el maíz cualquier nuevo gen de Tripsacum que
no se encuentre en el maíz o en los Zeas silvestres, y cualquier
material genético que surja de novo a partir de estos cruces entre
especies distantes usando técnicas de mejora genética vegetal
tradicionales.
La identificación genética del ADN ha revelado
que los nuevos alelos de Tripsacum que no se encuentran en
el maíz ni en los Zeas silvestres y las secuencias de novo
recién generadas mediante los cruces entre especies distantes, se
heredan de manera estable en la progenie de las generaciones
sucesivas y pueden transferirse al maíz cruzando el maíz con
Tripsacum-diploperennis que contenga las secuencias de
nucleótidos de novo y los alelos únicos de Tripsacum. Para
los fines de este documento, el material genético de novo se refiere
a regiones en las que se generan de manera repetida y fiable nuevas
formas alélicas de secuencias de ADN, cuando los cruces entre
Tripsacum y Zea diploperennis producen plantas viables
y fértiles.
Se ha demostrado la viabilidad de plantas
derivadas de cruzar Tripsacum-diploperennis con maíz que
presentan resistencia a la crisomela del maíz (Diabrotica
virgifera Le Conte) y al taladro del maíz, tolerancia a la
sequía y que tienen propiedades de perennialismo. La investigación y
la caracterización de la asociación con otros rasgos tales como la
respuesta a altos niveles de CO2 atmosférico están en curso.
4.545.146 10/1985 Davis
4.627.192 12/1986 Fick
4.684.612 8/1989 Hemphill et al.
4.737.596 4/1988 Seifert et al.
4.837.152 6/1989 Hemphill y Warshaw
5.059.745 10/1991 Foley
PP 6.906 7/1989 Eubanks
PP 7.977 9/1992 Eubanks
5.330.547 7/1994 Eubanks
PP 9.640 9/1996 Eubanks
5.750.828 5/1998 Eubanks
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la invención, se proporciona un
método para explorar una planta para determinar si la planta es un
cruce entre Tripsacum y teosinte perenne, comprendiendo dicho
método las siguientes etapas:
(a) cruzar un parental femenino de
Tripsacum con un parental de polen de teosinte perenne para
producir una semilla, o cruzar un parental femenino de teosinte
perenne con un donante de polen de Tripsacum para producir
una semilla; después
(b) recolectar la semilla producida en (a);
después
(c) cultivar las plantas a partir de la semilla
recolectada en (b); después
(d) aislar el ADN genómico total de las plantas
en (c); después
(e) digerir dicho ADN genómico con de una a
cuatro de las enzimas de restricción seleccionadas del grupo
constituido por EcoRI, EcoRV, HindIII y
BamHI; después
(f) sondar dicho ADN genómico digerido con uno o
más marcadores de ADN seleccionados del grupo constituido por las
sondas de ADN nuclear de maíz, las sondas de ADN mitocondrial de
maíz y las sondas de ADN de Tripsacum que se numeran a
continuación; y después
(g) determinar la presencia de uno o más de los
siguientes fragmentos de restricción de los siguientes tamaños de
fragmento, en la que dichos fragmentos de restricción se
caracterizan por las siguientes asociaciones de marcador
molecular-enzima de restricción y por los tamaños de
fragmento asociados seleccionados del grupo constituido por:
BNL5.62, EcoRI, 10,3 kb;
npi97, HindIII, 3,9 kb; UMC157, EcoRI,
6,5 kb y 3,3 kb; UMC157, HindIII, 5,5 kb;
UMC157, BamHI, 14,0 kb, 8,6 kb y 4,5 kb; UMC11,
BamHI, 7,0 kb; CSU3, BamHI, 10,0 kb, 7,6 kb y
3,5 kb; UMC67, EcoRI, 19,2 kb; UMC67,
BamHI 13,4 kb y 1,6 kb; CSU92, BamHI, 13,3 kb y
7,5 kb; asg62, BamHI, 12,7 kb, 9,7 kb y 6,6 kb;
UMC58, HindIII, 3,3 kb; CSU164, EcoRI,
9,0 kb y 7,0 kb; UMC128, HindIII, 6,0 kb;
UMC107, EcoRI, 6,3 kb y 5,3 kb; UMC107,
HindIII, 19,2 kb; UMC140, EcoRI, 5,0 kb;
UMC140, HindIII, 6,5 kb; UMC107, EcoRI,
6,3 kb; adh1, HindIII, 9,4 kb; adh1,
BamHI, 9,4 kb; UMC161, HindIII, 3,3 kb;
BNL8.29, HindIII, 8,3 kb; UMC53, EcoRI,
9,4 kb, 3,8 kb y 3,0 kb; UMC53, EcoRV, 8,4 kb, 3,8 kb
y 3,0 kb; UMC6, EcoRI, 3,8 kb; UMC6,
HindIII 9,4 kb; UMC6, BamHI, 13,2 kb, 12,7 kb
y 7,0 kb; UMC61, HindIII, 3,4 y 2,8 kb; UMC34,
EcoRI, 7,5 kb y 5,4 kb; UMC34, HindIII, 8,8
kb, 6,5 kb y 5,8 kb; UMC135, HindIII, 11,6 kb y 10,8
kb; UMC131, EcoRI, 10,6 kb, 5.8 kb y 4,3 kb;
UMC55, EcoRI, 3,9 kb; UMC55, HindIII,
4,3 kb; UMC5, EcoRI, 5,4 kb; UMC5,
HindIII, 6,5 kb; UMC49, BamHI, 8,2 kb, 6,0 kb,
4,2 kb y 3,2 kb; UMC36, BamHI, 4,2 kb; UMC32,
HindIII 6,7 kb; asg24, HindIII, 7,2 kb y 6,4
kb; UMC121, EcoRI, 3,7 kb y 3,2 kb; BNL8.35,
HindIII, 9,9 kb y 8,7 kb; UMC50, BamHI, 7,8
kb, 6,8 kb, 5,8 kb y 3,8 kb; UMC42, HindIII, 10,4 kb,
8,9 kb, 7,6 kb, 3,7 kb y 3,0 kb; npi247, EcoRI, 8,0
kb; npi247, HindIII 3,0 kb; UMC10,
HindIII, 5,9 kb y 3,0 kb; UMC10, EcoRI, 6,5 kb
y 5,5 kb; UMC102, EcoRI, 2,7 kb; BNL6.06,
EcoRI, 6,8 kb; BNL5.37, HindIII, 10,3 kb, 5,8
kb y 3,5 kb; npi296, EcoRI. 7,9 kb; UMC3,
EcoRI 2,5 kb y 2,0 kb; npi212, HindIII, 4,3
kb; npi212, BamHI, 5,4 kb; UMC39, EcoRI,
12,2 kb, 9,2 kb. 7,8 kb y 7,1 kb; UMC63, HindIII, 9,5
kb y 4,3kb; UMC96, HindIII, 11,8 kb, 6,4 kb y 5,5 kb;
UMC96, BamHI, 7,5 kb; UMC2, EcoRI, 11,8
kb, 10,4 kb y 8,0 kb; CSU25, HindIII, 4,5 y 4,3 kb;
agrr115, EcoRI, 8,0 kb y 5,4 kb; agrr115,
BamHI, 5,4 kb y 3,5 kb; phi20725, EcoRI, 10,3
kb, 9,7 kb y 7,2 kb; phi20725, HindIII, 1,5 kb;
UMC31, EcoRI, 5,8 kb; UMC31, BamHI 6,5
kb; BNL5.46, HindIII, 13,7 kb, 10,5 kb, 9,7 kb y 5,1
Kb; npi386, HindIII, 12,6 kb, 9,3 kb y 8,2 kb;
tda62, BamHI, 5,5 kb y 4,8 kb; BNL5.71,
EcoRV, 11,3 kb, 6,8 kb y 5,7 kb; BNL5.71,
BamHI, 11,3 kb, 6,8 kb y 5,7 kb; UMC156,
HindIII, 3,0 kb; UMC66, EcoRI, 10,5 kb y 6,5
kb; UMC66, BamHI, 3,7 kb; UMC19, BamHI,
12,3 kb; UMC104, HindIII, 12,4 kb, 11,6 kb y 7,5 kb;
UMC104, BamHI, 9,4 kb; UMC133, HindIII,
10,6 kb, 9,9 kb, 9,2 kb y 7,7 kb; UMC52, BamHI, 8,7
kb, 6,9 kb, 3,8 kb, 3,0 kb y 2,0 kb; BNL 15.07,
HindIII, 2,9 kb y 2,7 kb; npi409, EcoRI, 9,4
kb; npi409, HindIII, 10,4 kb, 9,0 kb y 3,9 kb;
UMC147, HindIII, 16,3 kb, 3,8 kb y 2,4 kb;
UMC90, HindIII, 7,8 kb, 2,8 kb y 2,5 kb;
UMC90, BamHI, 9,0 kb; UMC27, HindIII,
8,3 y 4,5 kb; tda37, BamHI, 8,2 kb y 6,5 kb;
UMC43, BamHI, 9,7 kb, 7,3 kb y 5,7 kb; UMC40,
BamHI, 7,2 kb, 4,3 kb y 4,0 kb; BNL7.71,
HindIII, 10,6 kb; tda62, BamHI, 5,5 kb;
UMC68, HindIII, 6,0 kb; phi10017, BamHI,
15,1 kb y 9,5 kb; tda50, BamHI, 8,5 kb;
npi373, HindIII, 6,5 kb, 5,6 kb y 3,0 kb;
tda204, BamHI, 4,0 kb; npi393, EcoRI,
12,1 kb, 8,5 kb, 7,0 kb y 5,6 kb; UMC65, HindIII, 2,9
kb; UMC46, EcoRI, 6,5 kb y 5,6 kb; asg7,
HindIII, 6,3 kb; UMC28, HindIII, 15,8 kb y
11,9 kb; UMC28, BamHI, 10,0 kb, 7,6 kb y 6,6 kb;
UMC134, BamHI, 4,7 kb; UMC134, HindIII,
7,5 kb; asg8, HindIII, 10,8 kb, 8,7 kb y 8,4 kb;
O2, EcoRI, 9,4 kb; BNL15.40, HindIII,
5,8 kb; UMC116, EcoRI, 9,5 kb; UMC110,
BamHI, 10,6 kb, 4,9 kb y 3,9 kb; BNL8.32,
HindIII, 8,9 kb, 7,4 kb y 7,1 kb; BNL14.07,
EcoRI, 6,4 kb; UMC80, HindIII, 10,6 kb, 8,2 kb
y 2,4 kb; BNL16.06, EcoRI, 6,8 kb y 1,9 kb;
phi20020, HindIII, 7,8 kb y 6,6 kb; npi114,
HindIII, 10,0 kb, 8,8 kb y 6,3 kb; BNL9.11,
HindIII, 3,4 kb; UMC103, HindIII, 6,9 kb y 5,7
kb; UMC124, HindIII, 8,0 y 7,0; UMC124,
BamHI, 6,6 kb y 2,6 kb; UMC120, HindIII, 3,2
kb, 2,3 kb y 1,4 kb; UMC89, EcoRI 7,3 kb;
UMC89, HindIII, 7,3 kb; UMC89, BamHI,
9,5 kb, 6,0 kb, 5,2 kb y 4,5 kb; BNL12.30, EcoRI, 3,5
kb; UMC48, HindIII, 6,2 kb, 5,3 kb, 4,7 kb, 3,5 kb y
2,2 kb; npi268, BamHI, 6,4 kb; phi10005,
EcoRI, 15,0 kb; UMC113, EcoRI, 5,9 kb y 5,4
kb; UMC113, BamHI, 12,8 kb, 11,8 kb y 10,5 kb;
UMC192, HindIII, 11,4 kb y 6,4 kb; wx
(ceroso), HindIII, 21,0 kb; CSU147, HindIII 5,9
kb; BNL5.10, HindIII, 6,1 kb y 4,4 kb; UMC114,
BamHI, 12,6 kb, 11,5 kb, 10,0 kb, 8,8 kb, 7,5 kb y 6,5 kb;
UMC95, EcoRI, 5,6 kb; UMC95, HindIII,
7,7 kb, 4,8 kb y 4,1 kb; UMC95, BamHI, 15,0 kb y 9,0
kb; CSU61, EcoRI, 8,1 kb y 4,8 kb; BNL7.57,
EcoRI, 1,0 kb; BNL7.57, BamHI, 11,6 kb, 5,9 kb
y 1,3 kb; CSU54, EcoRI, 14,7 kb y 12,6 kb;
phi20075, EcoRI, 7,1 kb; npi285, EcoRI,
12,4 kb, 9,4 kb y 6,0 kb; KSU5, EcoRI, 9,8 kb, 7,6
kb, 6,1 kb, 3,8 kb y 3,5 kb; UMC130, EcoRI, 13,5 kb y
7,0 kb; UMC130, HindIII, 4,8 kb y 3,2 kb;
UMC130, BamHI, 3,2 kb; UMC152, HindIII,
12,4, 7,1 kb y 5,6 kb; UMC64, HindIII, 3,3 kb;
phi06005, EcoRI, 12,8 kb; UMC163,
HindIII, 7,0 kb, 4,8 kb y 2,6 kb; UMC44,
HindIII, 9,8 kb, 8,7 kb, 7,2 kb, 5,5 kb y 4,0 kb;
BNL10.13, HindIII, 10,8 kb; npi306,
HindIII, 7,0 kb; pmt1, HindIII, 2,3 kb;
pmt2, HindIII, 8,0 kb, 4,2 kb, 2,8 kb y 2,1 kb;
pmt5, HindIII, 12,3 kb, 8,1 kb, 3,6 kb, 3,2 kb y 2,5
kb;
tda48, HindIII, 8,2 kb; tda53; HindIII, 3,8 kb y 2,2 kb; tda168, EcoRI, 3,6 kb; tda16, HindIII, 4,3 kb; y tda17, HindIII, 7,0 kb.
tda48, HindIII, 8,2 kb; tda53; HindIII, 3,8 kb y 2,2 kb; tda168, EcoRI, 3,6 kb; tda16, HindIII, 4,3 kb; y tda17, HindIII, 7,0 kb.
La invención también proporciona:
- un método para proporcionar una semilla de
maíz híbrida que contiene uno o más de los fragmentos de restricción
descritos anteriormente, que comprende las etapas de:
- (a)
- cruzar un parental hembra de Tripsacum con una planta donante de polen de Tripsacum para producir una semilla híbrida;
- (b)
- cultivar una planta híbrida a partir de dicha semilla hasta la madurez;
- (c)
- explorar dicha planta híbrida para determinar si la planta es un cruce entre Tripsacum y teosinte perenne usando el método descrito anteriormente;
- (d)
- cruzar dicha planta híbrida de (Tripsacum X teosinte perenne) o de (teosinte perenne X Tripsacum) con maíz para producir una semilla; y
- (e)
- recolectar la semilla producida en (d);
- un método para producir una planta de maíz
híbrida que contiene uno o más de los fragmentos de restricción
expuestos anteriormente, comprendiendo el método:
- (a)
- producir una semilla de maíz híbrida usando un método como se ha expuesto anteriormente; y
- (b)
- cultivar la semilla de maíz híbrido para dar una planta de maíz híbrida; y
- un método para producir un derivado, variante,
mutante, modificación, componente celular, componente molecular,
polen o cultivo de tejido a partir de una planta de maíz híbrida,
comprendiendo el método:
- (a)
- producir una semilla de maíz híbrida usando un método como se ha expuesto anteriormente;
- (b)
- cultivar la semilla de maíz híbrida para dar una planta de maíz híbrida; y
- (c)
- obtener un derivado, variante, mutante, modificación, componente celular, componente molecular, polen o cultivo de tejido a partir de la planta de maíz híbrida.
Los híbridos intergenéricos que pueden obtenerse
usando los métodos mencionados anteriormente son completamente
fértiles y tienen fertilidad cruzada con el maíz. Las plantas
híbridas se caracterizan por su utilidad como intermediario
genético para transferir nuevos materiales genéticos al maíz y por
su inesperado número de cromosomas de 2n = 20 en lugar de los
esperados 2n = 28 ó 2n = 46 si una dotación completa, no modificada,
de cromosomas haploides de teosinte perenne (n = 10) y de
cromosomas diploides de Tripsacum (n = 18) o tetraploides de
Tripsacum (n = 36) se transmitiera a la progenie híbrida
resultante.
Una planta híbrida intergenérica de
(Tripsacum X teosinte perenne) o de (teosinte perenne X
Tripsacum) se cruza con maíz mediante polinización
controlada. En el cruce, el polen de (Tripsacum X teosinte
perenne) o de (teosinte perenne X Tripsacum) se transfiere a
los estigmas del maíz, o el polen del maíz se transfiere a los
estigmas del (Tripsacum X teosinte perenne) o del (teosinte
perenne X Tripsacum).
Pueden obtenerse semillas híbridas, plantas
híbridas producidas por la semilla y/o cultivos de tejido,
variantes, mutantes, modificaciones y componentes celulares y
moleculares de las plantas híbridas que contienen nuevos materiales
genéticos derivados de (Tripsacum X teosinte perenne) o de
(teosinte perenne X Tripsacum).
En el método de la invención, para producir una
semilla de maíz híbrida, la planta híbrida trigenérica obtenida de
cruzar (Tripsacum X teosinte perenne) o (teosinte perenne X
Tripsacum) con maíz mediante polinización controlada puede
retrocruzarse con maíz o con (Tripsacum X teosinte perenne) o
con (teosinte perenne X Tripsacum). En este
retrocruzamiento, el polen de la planta híbrida trigenérica se
transfiere a los estigmas de uno de los parentales originales
(Tripsacum X teosinte perenne) o (teosinte perenne X
Tripsacum) o maíz.
Esta invención permite de este modo la
preparación de una semilla híbrida, de plantas híbridas producidas
por la semilla y/o de cultivos de tejido, variantes, mutantes,
modificaciones y componentes celulares y moleculares de las plantas
híbridas que contienen nuevos materiales genéticos derivados de
(Tripsacum X teosinte perenne) o de (teosinte perenne X
Tripsacum).
Las plantas y tejidos de plantas producidos por
el método de cruzar maíz con un híbrido de
Tripsacum-diploperennis contienen nuevos materiales
genéticos y presentan rasgos agrícolas beneficiosos. Por ejemplo,
estas plantas pueden contener nuevos genes para rasgos tales como
resistencia a plagas y patógenos, tolerancia a la sequía,
tolerancia al frío, tolerancia al anegamiento, calidad del grano
mejorada, calidad del forraje mejorada, totipotencia,
perennialismo, tolerancia a suelos ácidos, tolerancia a suelos con
alto contenido en aluminio, adaptabilidad potenciada en un entorno
enriquecido en dióxido de carbono, y pueden emplearse en programas
de mejora genética de selección constante para seleccionar maíz
híbrido que presente tales rasgos.
Para los fines de esta solicitud, se definen los
siguientes términos para proporcionar una descripción clara y
coherente de la invención.
Alelo. Una de las diferentes formas de un
gen que puede existir en un solo locus.
Autorradiografía. Un proceso en el que se
incorporan materiales radioactivos en los componentes celulares, y
después se colocan próximos a una película o emulsión fotográfica
para producir patrones en la película que se corresponden con la
localización de los compuestos radioactivos en el interior de la
célula.
Electroforesis. Una técnica para separar
los componentes de una mezcla de moléculas (proteínas, ADN o ARN)
en un campo eléctrico dentro de una matriz de gel.
Marcadores genéticos. Alelos usados como
sondas experimentales para seguir el rastro de un individuo, un
tejido, una célula, un núcleo, un cromosoma o un gen.
Gen. La unidad física y funcional
fundamental de la herencia que lleva la información de una
generación a la siguiente. El gen de plantas es "una secuencia de
ADN de la que se transcribe un segmento de manera regular o
condicional en determinados momentos, en cualquiera o ambas
generaciones de la planta. Se entiende que el ADN incluye, no sólo
los exones e intrones del gen estructural, sino también las regiones
cis 5' y 3' en las que un cambio de secuencia puede afectar a la
expresión génica" (Neuffer, Coe y Wessier 1997).
Genotipo. La composición alélica de una
célula -de la célula completa o, más comúnmente, para un cierto gen
o conjunto de genes de un individuo.
Planta híbrida. Una planta individual
producida por el cruzamiento de dos parentales de diferentes
genotipos o fondos genéticos de germoplasma.
Locus. El lugar de un cromosoma donde se
localiza un gen.
Genética molecular. El estudio de los
procesos moleculares que subyacen a la estructura y a la función de
los genes.
Mutágeno. Un agente que es capaz de
aumentar la tasa de mutación.
Mutación. (1) El proceso que produce
secuencias de nucleótidos, genes, elementos genéticos o cromosomas
diferentes de los de tipo silvestre. (2) Las secuencias de
nucleótidos, genes, elementos genéticos o cromosomas que se
obtienen como resultado de tal proceso.
Mejora genética vegetal. La aplicación
del análisis genético al desarrollo de líneas de plantas mejor
adaptadas a los fines de los seres humanos.
Sonda. Segmento de ácido nucleico
definido que puede usarse para identificar moléculas específicas que
lleven la secuencia de ADN o de ARN complementaria, habitualmente
mediante autorradiografía.
Enzima de restricción. Una endonucleasa
que reconocerá secuencias de nucleótidos diana específicas en el ADN
y cortará el ADN en esos puntos; se conoce una diversidad de estas
enzimas y se usan mucho en ingeniería genética.
RFLP. Se refiere a un polimorfismo de
longitud de fragmentos de restricción, que es una secuencia de ADN
específica que aparece como una banda de un tamaño de peso
molecular particular en una transferencia de Southern sondada con
una sonda de RFLP radiomarcada, y que se considera que es un alelo
de un gen.
Transferencia de Southern. Transferencia
de fragmentos de ADN separados electroforéticamente desde el gel a
una superficie absorbente, tal como papel o una membrana, que
después se sumerge en una solución que contiene una sonda marcada
que se unirá a secuencias de ADN homólogas.
Totipotencia. La capacidad de una célula
de continuar avanzando por todas las fases del desarrollo y producir
de este modo un adulto normal.
Tipo silvestre. Se refiere a una
referencia y puede referirse a un organismo, conjunto de genes, gen
o secuencia de nucleótidos. Para los fines de este documento, el
tipo silvestre se refiere a los parentales de la progenie
híbrida.
La Figura 1 es un dibujo esquemático de los 10
grupos de ligamiento del maíz. Los círculos en blanco representan
las posiciones aproximadas de los centrómeros. Las líneas marcadas
indican las posiciones en las que, las sondas usadas para la
identificación genética del ADN de las plantas híbridas derivadas de
cruzar Tripsacum dactyloides y Zea diploperennis así
como de las plantas de maíz cruzadas con la especie puente
Tripsacum-diploperennis, se localizan en los cromosomas del
maíz. Los marcadores moleculares que revelan los loci en los que se
encuentran alelos de novo estables y heredables están subrayados, y
los loci en los que se encuentran nuevos alelos estables y
heredables de Tripsacum que no se encuentran en el maíz o en
los Zeas silvestres están en cursiva.
Los principios y las técnicas usadas para
identificar el material genético de novo y los nuevos alelos de
Tripsacum son fundamentales de la genética molecular y se
usan comúnmente para identificar genéticamente variedades de
cultivo (Kresovich et al. 1993). En primer lugar, el ADN se
extrae y se aísla a partir de muestras de plantas; después, el ADN
se corta en fragmentos usando enzimas de restricción que cortan en
secuencias de nucleótidos concretas; los fragmentos se separan
después por tamaño, es decir, por peso molecular, en un gel de
agarosa por electroforesis; después, el ADN se desnaturaliza, es
decir, se separa en cadenas sencillas, y se transfiere a un filtro
de nitrocelulosa que se une a ADN de cadena sencilla pero no a ADN
de doble cadena, un método denominado como transferencia de
Southern. Los fragmentos de restricción se inmovilizan sobre el
filtro en un patrón que refleja sus posiciones en gel de agarosa.
Después, la membrana se incuba en una solución que contiene
múltiples copias de una sonda radiomarcada para una secuencia de ADN
en particular que se ha mapeado en un cierto locus o loci
cromosomal en el genoma del maíz; la sonda hibrida con secuencias de
ADN homólogas y el patrón de bandas distintivo formado por una
combinación particular de enzima de restricción/sonda en una planta
individual puede visualizarse en una autorradiografía. Los patrones
de bandas, que recuerdan a un código de barras, identifican de
manera precisa el genotipo de plantas individuales. Los patrones
formados por las combinaciones específicas de enzima de
restricción/sonda se denominan polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción (RFLP) y proporcionan suficiente
información para distinguir entre plantas cuya composición genética
pueda diferir ligeramente. Estas técnicas de identificación genética
permiten la identificación inequívoca de genotipos (Melchinger
et al. 1991; Messmer et al. 1993). Los perfiles de
identificación genética se usan rutinariamente para el análisis de
la identidad genética para clasificar materiales estrechamente
relacionados, estimar distancias genéticas entre tales materiales,
determinar la paternidad y complementar los registros de pedigrí
convencionales en la producción de híbridos comerciales (Smith y
Smith 1992).
Puesto que el maíz es un organismo diploide, la
progenie de los híbridos de maíz hereda un alelo para un rasgo de
un parental y otro alelo para ese rasgo del otro parental. En la
identificación genética del ADN de un único gen, que no esté
duplicado en otro sitio del genoma, si la progenie hereda el mismo
alelo para un rasgo de ambos parentales es homocigota para ese
rasgo y aparecerá una sola banda en el perfil de ADN usando una
sonda molecular que mapee en la región específica del cromosoma en
particular en el que el rasgo que se está investigando se haya
mapeado. Si la progenie hereda diferentes alelos de cada planta
parental, será heterocigota en ese locus y se detectarán dos bandas
en la autorradiografía, una banda de un parental y una banda
diferente del otro parental. En loci más complejos que implican
duplicación génica, pueden observarse múltiples bandas. En general,
la descendencia de dos parentales puede identificarse comparando el
perfil del patrón de bandas ya que la progenie presentará una
combinación de bandas de ambos parentales. A veces, sin embargo, la
progenie de parentales conocidos presenta una banda o bandas que no
se encuentran en ningún parental. Tales bandas de novo surgen de
acontecimientos de mutación o de recombinación que originan cambios
en las secuencias de nucleótidos, de tal modo que el patrón de
bandas es diferente del de ambos parentales (Griffiths et al.
1993). Tales reorganizaciones mutantes o novedosas en el material
genético se revelan mediante análisis comparativo de los patrones
de bandas de las plantas parentales y de la progenie híbrida. Las
bandas presentes en la progenie que no se encuentren en ningún
parental indican regiones del genoma en las que ha surgido nuevo
material genético, es decir, donde se han producido mutaciones.
Como se ha indicado anteriormente, las
mutaciones son poco frecuentes y en muchos casos son perjudiciales.
Hablando en términos generales, entre todos los organismos, las
tasas de mutación varían y oscilan entre 1 en 1.000 y 1 en
1.000.000 de gametos por generación, dependiendo del gen implicado
(Curtis y Barnes 1989). Por ejemplo, se espera que cada ser humano
con aproximadamente 100.000 genes lleve 2 alelos mutantes. Los
híbridos de Tripsacum-teosinte perenne no tienen precedentes
por el hecho de que su identificación genética del ADN revela que
tienen una tasa de mutación extremadamente alta, con alelos de novo
en 213 de 173 loci. Además, los alelos de novo se heredan de manera
estable en las generaciones sucesivas de la progenie de
Tripsacum-diploperennis y de la progenie de maíz X
Tripsacum-diploperennis. Además de la escasa frecuencia y de
los habituales efectos perjudiciales de las mutaciones, un
principio biológico básico es que las mutaciones se producen de
manera aleatoria o por azar (Lewin 1997). En un estudio de tasas de
mutación espontánea para alelos de nueva longitud en loci repetidos
en tándem en el ADN humano (Jeffreys et al. 1988), surgieron
mutaciones de manera esporádica y no se produjo agrupación de las
mutaciones dentro de una familia. Los hermanos nunca compartieron
un alelo mutante común. Por lo tanto, es inesperado que las mismas
mutaciones se repitan entre hermanos o entre híbridos de diferentes
parentales. De este modo, es sorprendente e inesperado que los
mismos alelos de novo se encuentren de manera repetida en la
progenie híbrida derivada de cruzar diferentes plantas parentales
de Tripsacum y de teosinte perenne, y que esos mismos alelos
de novo se hereden de manera estable en los cruces entre híbridos
de Tripsacum-teosinte perenne y maíz. Estos alelos de
novo
proporcionan una abundante nueva fuente de material genético variante para la selección en la mejora del maíz.
proporcionan una abundante nueva fuente de material genético variante para la selección en la mejora del maíz.
En ensayos moleculares realizados por Linkage
Genetics, Salt Lake City, Utah, y Biogenetics, Inc., Brookings,
Dakota del Sur, se aisló ADN de diferentes híbridos de F_{1},
F_{2}, y F_{3} entre Tripsacum dactyloides y
Zea diploperennis, siendo los parentales de estos híbridos
las líneas endogámicas de maíz W64A y B73, así como híbridos de
F_{1}, F_{2}, F_{3} y F_{4} entre maíz y
Tripsacum-diploperennis. Los protocolos para el aislamiento
del ADN, la digestión con enzimas de restricción, la transferencia
Southern, la hibridación de sondas y el análisis de
autorradiografías se han descrito en Helentjaris et al.
(1986). Se incluyeron patrones internos de pesos moleculares
conocidos y una escala en los geles para facilitar la exactitud al
describir los patrones de bandas en términos de pesos moleculares
de los alelos. Se han identificado genéticamente cinco híbridos de
Tripsacum-diploperennis diferentes: (1) Sun Dance, Zea
diploperennis 3-7 X Tripsacum
dactyloides (2n = 72); (2) Tripsacorn, Tripsacum
dactyloides (2n = 72) X Zea diploperennis
3-3; (3) Sun Star, Zea diploperennis
2-4 X Tripsacum dactyloides (2n = 36);
(4) Sun Devil, Tripsacum dactyloides (2n = 72) X
Zea diploperennis; (5) 20A self, Zea
diploperennis 2-4 X Tripsacum
dactyloides (2n = 72). Las líneas endogámicas de maíz W64A y
B73 se cruzaron con algunos de los híbridos de
Tripsacum-diploperennis anteriores.
El ADN genómico total de individuos de algunas
de las líneas enumeradas anteriormente se digirió con de una a
cuatro enzimas de restricción diferentes, EcoRI,
EcoRV, HindIII y BamHI, se transfirió a
transferencias de Southern y se sondó con 173 marcadores de ADN
disponibles públicamente, que incluyen una mayoría de sondas de ADN
nuclear de maíz mapeadas en los diez grupos de ligación del maíz
(Gardiner et al. 1993), seis sondas mitocondriales de maíz y
algunas sondas de Tripsacum (tda) cuyos loci no se han
mapeado todavía en el genoma del maíz. Los marcadores moleculares
en el mapa de ligamiento genético del maíz se mapearon mediante
análisis por recombinación basados en pruebas de la identidad de un
clon. Por lo tanto, cada locus representa un gen basado en la
identificación de clones (Neuffer, Coe y Wessler 1997). Los 173
marcadores moleculares que se emplearon en la identificación
genética del ADN de las especies parentales, de los híbridos de
Tripsacum-diploperennis y del maíz X
Tripsacum-diploperennis se enumeran en la Tabla 1. La Figura
1 representa los órdenes y localizaciones aproximadas de las sondas
mapeadas en los diez cromosomas del maíz (consúltese Neuffer, Coe y
Wessler 1997). Un gran número de sondas revelan bandas que no están
presentes en ninguno de los parentales de una progenie en
particular. Estas bandas de novo señalan loci en los que se han
producido mutaciones en el proceso de hibridación intergenérica. Sus
loci mapeados aproximados en los diez cromosomas del Zea se
muestran en la Figura 1 y se indican en la Tabla 1 mediante
subrayado. También existen loci en los híbridos de
Tripsacum-diploperennis en los que están presentes alelos de
Tripsacum que no están presentes en el maíz ni en los Zeas
silvestres. Por lo tanto, éstos son nuevos alelos que pueden ahora
transferirse al maíz mediante el intermediario genético
Tripsacum-teosinte perenne. Éstos están en cursiva en la
Tabla 1 y destacados en tipo de letra en negrita en la Figura 1.
La Tabla 2 enumera el tamaño aproximado, es
decir, el peso molecular de cada banda de novo por combinación de
enzima de restricción/sonda que ha surgido como resultado del efecto
mutágeno de la hibridación en cruces entre especies distantes. La
Tabla 3 enumera el tamaño aproximado de los nuevos alelos de
Tripsacum que no se encuentran en el maíz ni en los Zeas
silvestres, que ahora pueden transferirse al maíz mediante las
líneas híbridas de Tripsacum-diploperennis, de acuerdo con la
combinación de enzima de restricción/sonda.
La Tabla 4 identifica las secuencias de
nucleótidos mutantes y especifica su herencia en híbridos de
Tripsacum-diploperennis y en ocho líneas ejemplares de (maíz
X Tripsacum-diploperennis). La Tabla 5 identifica las
secuencias de nucleótidos que son alelos de los parentales de
Tripsacum empleados para producir los híbridos de
Tripsacum-diploperennis y especifica su herencia en los
híbridos de Tripsacum-diploperennis y en ocho líneas
ejemplares de (maíz X Tripsacum-diploperennis). Para
determinar qué alelos de Tripsacum están presentes en los
híbridos de Tripsacum-diploperennis que no están presentes
en otros Zeas, se identificó genéticamente el ADN de 5 a 13
individuos de poblaciones de dos líneas endogámicas de maíz
modernas, B73 y W64A, cuatro variedades indígenas latinoamericanas
de maíz, Nal Tel (Yuc7), Chapalote (Sin), Pollo (Col 35 ICA) y Pira
(PI44512), y los seis Zeas silvestres, Z. mexicana (PI566683
y PI566688), Z. parviglumis (PI384061 y PI331785),
Z. luxurians (PI306615), Z.
huehuetenangensis (Ames21880), Z. diploperennis
y Z. perennis (Ames21875), con las sondas de la Tabla
1 y de la Figura 1. Las secuencias de nucleótidos se identifican
mediante sonda/enzima de restricción/sonda y peso molecular.
Los nuevos materiales genéticos, incluyendo los
alelos de novo y los nuevos alelos de Tripsacum, que no se
encuentran en el maíz ni en los Zeas silvestres, se ha demostrado
que se heredan de manera estable en tres generaciones de híbridos
de Tripsacum-diploperennis y cuatro generaciones de híbridos
de Tripsacum-diploperennis que se cruzaron con maíz. Los
nuevos alelos de Tripsacum y las secuencias de nucleótidos
mutadas, su heredabilidad en las generaciones sucesivas de híbridos
de Tripsacum-diploperennis y su transmisibilidad al maíz no
tiene precedentes y es inesperada en base a la técnica anterior.
Estas nuevas secuencias de ADN tienen utilidad para el análisis
genético del Zea y para la selección de nuevos alelos variantes que
pueden potenciar rasgos tales como resistencia a insectos y
enfermedades, tolerancia al estrés por sequía, tolerancia al frío,
perennialismo, rendimiento de grano aumentado, totipotencia,
apomixis, mejores sistemas de raíces, tolerancia a suelos anegados,
tolerancia a suelos ácidos y con alto contenido en aluminio, calidad
del grano mejorada y calidad del forraje mejorada. Los nuevos
rasgos derivados de estas mutaciones o los nuevos genes de
Tripsacum pueden emplearse con éxito en programas de mejora
genética de selección constante de cultivos para la mejora del
maíz.
El método de la invención se realiza cruzando
Tripsacum dactyloides con Zea
diploperennis. Los cruces se realizan usando técnicas de
mejora genética vegetal convencionales para polinizaciones
controladas conocidas en la técnica. Algunas plantas híbridas de
Tripsacum-diploperennis que son perennes que se reproducen
asexualmente así como por semilla se han descrito en la siguientes
patentes de plantas: PP Nº 9.640 expedida el 3 de septiembre de
1996; PP Nº 7.977 expedida el 15 de septiembre de 1992 y PP Nº 6.906
expedida el 4 de julio de 1989. La patente de Estados Unidos Nº
5.330.547 expedida el 19 de julio de 1994 y la patente de Estados
Unidos Nº 5.750.828 expedida el 12 de mayo de 1998, describen un
método para emplear híbridos de Tripsacum-diploperennis para
conferir al maíz resistencia a la crisomela del maíz.
La presente invención proporciona un método para
obtener nuevos materiales genéticos, incluyendo secuencias de
nucleótidos mutantes de novo y nuevos alelos de Tripsacum,
que no se encuentran en el maíz ni en los Zeas silvestres, mediante
la producción de semillas de plantas híbridas, que comprende las
etapas de (a) polinizar un parental femenino de una especie de
Tripsacum (por ejemplo, Tripsacum dactyloides) con
polen de un parental masculino de una especie de teosinte perenne
(por ejemplo, Zea diploperennis), o polinizar un parental
femenino de una especie de teosinte perenne (por ejemplo, Zea
diploperennis) con polen de una especie de Tripsacum
(por ejemplo, Tripsacum dactyloides), para producir
una semilla; después (b) recolectar la semilla producida.
Este método produce una semilla híbrida a partir
de la cual puede cultivarse una planta híbrida que contiene nuevos
materiales genéticos, y a partir de las plantas híbridas que
contienen nuevos materiales genéticos pueden realizarse cultivos de
tejidos. Además, puede recogerse el polen producido por la planta
híbrida que contiene nuevo material genético.
El término "planta", como se usa en esta
solicitud, se refiere a la planta completa así como a las partes
que la componen, por ejemplo, flores, raíces, frutos, tallos,
rizomas y polen.
La presente invención proporciona además un
método para producir una semilla de maíz híbrida que contiene
nuevos materiales genéticos, que comprende las etapas de (a) cruzar
una planta de Tripsacum receptora de polen con una planta de
teosinte perenne donante de polen (Tripsacum X teosinte
perenne) o una planta de teosinte perenne receptora de polen con
una planta de Tripsacum donante de polen (teosinte perenne X
Tripsacum) para producir una semilla hibrida; después (b)
cultivar una planta híbrida de (Tripsacum X teosinte
perenne) o de (teosinte perenne X Tripsacum) a partir de
dicha semilla hasta la madurez; después (c) cruzar dicha planta
híbrida de (Tripsacum X teosinte perenne) o de (teosinte
perenne X Tripsacum) con una planta de maíz receptora de
polen o con una planta de maíz donante de polen para producir una
semilla y (d) recolectar la semilla producida.
Este método da como resultado la producción de
una semilla de maíz híbrida y de plantas de maíz híbridas que
contienen nuevos materiales genéticos, de las que pueden realizarse
cultivos de tejidos. Las técnicas de mejora genética vegetal y las
técnicas de cultivo de tejidos, como se describen en este documento,
se conocen y pueden realizarse de la manera conocida por los
especialistas en la técnica. Véanse, por ejemplo, la patente de
Estados Unidos Nº 4.737.596 de Seifert et al. titulada
"Hybrid Maize Plant and Seed"; la patente de Estados Unidos Nº
5.059.745 de Foley titulada "Hybrid Maize Line LH195"; la
patente de Estados Unidos Nº 4.545.146 de Davis titulada "Route
to Hybrid Soybean Production"; la patente de Estados Unidos Nº
4.627.192 de Fick titulada "Sunflower Products and Methods for
their Production", y las patentes de Estados Unidos Nº 4.837.152
y 4.684.612 tituladas "Process for Regenerating Soybeans"; las
patentes de Estados Unidos Nº 5.330.547 y 5.750.828 de Eubanks
tituladas "Methods and Materials for Conferring Tripsacum Genes in
Maize".
En las inflorescencias de Tripsacum, las
flores estaminadas (es decir, masculinas) y las flores pistiladas
(es decir, femeninas) se producen en una sola espiga con las flores
masculinas rodeadas por las femeninas. Cuando el Tripsacum
emite la inflorescencia, las flores estaminadas se abren dejando
sólo en la espiga las flores femeninas, que después se cubren con
una bolsa de polinización, es decir, con una bolsa de vástago de
mazorca convencional para maíz, para protegerlas de la contaminación
por polen no deseado. Las flores masculinas y femeninas del
teosinte perenne se encuentran en partes separadas de la planta. Las
flores estaminadas se sitúan en la panoja que emerge del ápice de
la caña; mientras que las flores pistiladas se encuentran en una
sola fila en las espigas situadas en las ramas laterales de la caña.
Cuando el teosinte perenne produce sus panojas, se cubren con una
bolsa de polinización. Cuando se comienza a desprender el polen, se
retira la bolsa y se recoge el polen para polinizar las plantas de
Tripsacum. En ese momento, se retiran las bolsas que cubren
las flores pistiladas de Tripsacum y se sacude el polen de
teosinte perenne fuera de la bolsa sobre los estigmas. La
inflorescencia de Tripsacum se cubre de nuevo con una bolsa
de polinización, inmediatamente después de la polinización, y la
bolsa se grapa de manera que permanece en la espiga hasta que la
semilla haya madurado. Al alcanzar la madurez, aproximadamente 45
días después, la semilla se recolecta. Una vez que se ha obtenido
una semilla madura del cruce, se planta, y las plantas que germinan
de las semillas se cultivan en una cámara de cultivo, invernadero o
en el campo. Los cruces controlados se realizan mejor en un
invernadero o en una cámara de cultivo, en los que las plantas se
mantienen aisladas para evitar contaminaciones cruzadas y que no
presentan el problema de que las bolsas puedan dañarse por las
condiciones climatológicas.
Este método puede usarse como alternativa para
cruzar las plantas con teosinte perenne como el parental femenino.
En esta realización, todas las panojas, es decir, las flores
masculinas, se retiran de la planta de teosinte perenne tan pronto
como emergen, y las mazorcas, es decir, las flores femeninas, se
cubren con bolsas de polinización. En lugar de retirar las flores
masculinas de Tripsacum, las espigas se dejan intactas y se
cubren con una bolsa de polinización para recoger el polen de
Tripsacum. El polen se aplica sobre las mazorcas de
diploperennis que se cubren inmediatamente después con una bolsa de
polinización que se cierra bien con grapas para asegurar que
permanece precintada hasta que la semilla haya madurado,
aproximadamente 45 días después de la polinización, cuando se
recolecta la semilla.
Después, cuando el (Tripsacum X teosinte
perenne) o el (teosinte perenne X Tripsacum) comienza a
florecer, se usan las mismas etapas descritas anteriormente para
cruzar el híbrido con el maíz. Para cruzar con maíz, tan pronto
como las plantas de maíz comienzan a producir mazorcas, antes de que
emerjan los estigmas, las mazorcas se cubren con una bolsa de
vástago de mazorca. El polen recogido de (Tripsacum X
teosinte perenne) o de (teosinte perenne X Tripsacum) se
aplica sobre los estigmas de las mazorcas de maíz. Las mazorcas se
cubren después de nuevo con una bolsa de vástago de mazorca, y se
envuelve una gran bolsa de polinización alrededor de la caña y se
asegura con una grapa. Las mazorcas permanecen cubiertas hasta que
alcanzan la madurez varias semanas después, cuando se recolectan
las mazorcas.
Para polinizar el híbrido de (Tripsacum X
teosinte perenne) o de (teosinte perenne X Tripsacum) con
polen de maíz, se cubre la panoja de la planta de maíz con una gran
bolsa de polinización, un día o dos antes de la recolección. Las
flores pistiladas de las plantas híbridas de
Tripsacum-diploperennis tienen con frecuencia puntas
estaminadas por encima de las flores femeninas, como se han descrito
para Tripsacum. Cuando las plantas de
Tripsacum-teosinte perenne van a polinizarse por otra planta,
se retiran todas las puntas estaminadas tan pronto como emergen las
mazorcas para evitar la posibilidad de autopolinización. Las flores
pistiladas del híbrido se cubren con una bolsa de vástago de mazorca
tan pronto como comienzan a aparecer en la planta, pero antes de
que emerjan los estigmas. El polen recogido del maíz se aplica sobre
los estigmas de las espigas femeninas híbridas, que se cubren
inmediatamente después con una bolsa de vástago de mazorca que se
cierra con grapas. La mazorca permanece cubierta hasta que alcanza
la madurez, aproximadamente 45 días después, y después se recolecta
la semilla.
Las plantas obtenidas de todos los cruces
descritos anteriormente tienen fertilidad masculina y femenina,
tienen fertilidad cruzada entre sí y tienen fertilidad cruzada con
el maíz, y llevan material genético nuevo, es decir, nuevos alelos
de Tripsacum que no se encuentran en el maíz ni en los Zeas
silvestres y los alelos de novo derivados de mutaciones que surgen
en el proceso de hibridación intergenérica, como se identifican en
la identificación genética del ADN empleando 173 sondas moleculares
diferentes distribuidas por todos los diez grupos de ligamiento del
maíz.
Los ejemplos y realizaciones descritos en este
documento ilustran la invención.
Se depositó una muestra que comprendía al menos
2500 semillas derivadas de cruces entre Tripsacum dactyloides
y Zea diploperennis, como se describen en este documento, en
la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852 el 28 de agosto de 1992. El número de
acceso es ATCC75297.
La presente invención no está limitada en
alcance por las semillas depositadas, ya que las realizaciones
depositadas se pretende que sean ilustraciones de la invención y
cualquier semilla, línea celular, parte de planta o planta derivada
de cultivos de tejido o de semillas que son funcionalmente
equivalentes están dentro del alcance de esta invención.
Claims (4)
1. Un método para explorar una planta para
determinar si la planta es un cruce entre Tripsacum y
teosinte perenne, comprendiendo dicho método las siguientes
etapas:
(a) cruzar un parental femenino de
Tripsacum con polen de un parental de teosinte perenne para
producir una semilla, o cruzar un parental femenino de teosinte
perenne con un Tripsacum donante de polen para producir una
semilla; después
(b) recolectar la semilla producida en (a);
después
(c) cultivar las plantas a partir de la semilla
recolectada en (b); después
(d) aislar el ADN genómico total de las plantas
en (c); después
(e) digerir dicho ADN genómico con de una a
cuatro de las enzimas de restricción seleccionadas del grupo
constituido por EcoRI, EcoRV, HindIII y
BamHI; después
(f) sondar dicho ADN genómico digerido con uno o
más marcadores de ADN seleccionados del grupo constituido por las
sondas de ADN nuclear de maíz, las sondas de ADN mitocondrial de
maíz y las sondas de ADN de Tripsacum que se enumeran a
continuación; y después
(g) determinar la presencia de uno o más de los
siguientes fragmentos de restricción de los siguientes tamaños de
fragmento, en los que dichos fragmentos de restricción se
caracterizan por las siguientes asociaciones de marcador
molecular-enzima de restricción y por los tamaños de
fragmento asociados seleccionados del grupo constituido por
BNL5.62, EcoRI, 10,3 kb;
npi97, HindIII, 3,9 kb; UMC157, EcoRI,
6,5 kb y 3,3 kb; UMC157, HindIII, 5,5 kb;
UMC157, BamHI, 14,0 kb, 8,6 kb y 4,5 kb; UMC11,
BamHI, 7,0 kb; CSU3, BamHI, 10,0 kb, 7,6 kb y
3,5 kb; UMC67, EcoRI, 19,2 kb; UMC67,
BamHI 13,4 kb y 1,6 kb; CSU92, BamHI, 13,3 kb y
7,5 kb; asg62, BamHI, 12,7 kb, 9,7 kb y 6,6 kb;
UMC58, HindIII, 3,3 kb; CSU164, EcoRI,
9,0 kb y 7,0 kb; UMC128, HindIII, 6,0 kb;
UMC107, EcoRI, 6,3 kb y 5,3 kb; UMC107,
HindIII, 19,2 kb; UMC140, EcoRI, 5,0 kb;
UMC140, HindIII, 6,5 kb; UMC107, EcoRI,
6,3 kb; adh1, HindIII, 9,4 kb; adh1,
BamHI, 9,4 kb; UMC161, HindIII, 3,3 kb;
BNL8.29, HindIII, 8,3 kb; UMC53, EcoRI,
9,4 kb, 3,8 kb y 3,0 kb; UMC53, EcoRV, 8,4 kb, 3,8 kb
y 3,0 kb; UMC6, EcoRI, 3,8 kb; UMC6,
HindIII 9,4 kb; UMC6, BamHI, 13,2 kb, 12,7 kb
y 7,0 kb; UMC61, HindIII, 3,4 y 2,8 kb; UMC34,
EcoRI, 7,5 kb y 5,4 kb; UMC34, HindIII, 8,8
kb, 6,5 kb y 5,8 kb; UMC135, HindIII, 11,6 kb y 10,8
kb; UMC131, EcoRI, 10,6 kb, 5.8 kb y 4,3 kb;
UMC55, EcoRI, 3,9 kb; UMC55, HindIII,
4,3 kb; UMC5, EcoRI, 5,4 kb; UMC5,
HindIII, 6,5 kb; UMC49, BamHI, 8,2 kb, 6,0 kb,
4,2 kb y 3,2 kb; UMC36, BamHI, 4,2 kb; UMC32,
HindIII 6,7 kb; asg24, HindIII, 7,2 kb y 6,4
kb; UMC121, EcoRI, 3,7 kb y 3,2 kb; BNL8.35,
HindIII, 9,9 kb y 8,7 kb; UMC50, BamHI, 7,8
kb, 6,8 kb, 5,8 kb y 3,8 kb; UMC42, HindIII, 10,4 kb,
8,9 kb, 7,6 kb, 3,7 kb y 3,0 kb; npi247, EcoRI, 8,0
kb; npi247, HindIII 3,0 kb; UMC10,
HindIII, 5,9 kb y 3,0 kb; UMC10, EcoRI, 6,5 kb
y 5,5 kb; UMC102, EcoRI, 2,7 kb; BNL6.06,
EcoRI, 6,8 kb; BNL5.37, HindIII, 10,3 kb, 5,8
kb y 3,5 kb; npi296, EcoRI. 7,9 kb; UMC3,
EcoRI 2,5 kb y 2,0 kb; npi212, HindIII, 4,3
kb; npi212, BamHI, 5,4 kb; UMC39, EcoRI,
12,2 kb, 9,2 kb. 7,8 kb y 7,1 kb; UMC63, HindIII, 9,5
kb y 4,3 kb; UMC96, HindIII, 11,8 kb, 6,4 kb y 5,5 kb;
UMC96, BamHI, 7,5 kb; UMC2, EcoRI, 11,8
kb, 10,4 kb y 8,0 kb; CSU25, HindIII, 4,5 y 4,3 kb;
agrr115, EcoRI, 8,0 kb y 5,4 kb; agrr115,
BamHI, 5,4 kb y 3,5 kb; phi20725, EcoRI, 10,3
kb, 9,7 kb y 7,2 kb; phi20725, HindIII, 1,5 kb;
UMC31, EcoRI, 5,8 kb; UMC31, BamHI 6,5
kb; BNL5.46, HindIII, 13,7 kb, 10,5 kb, 9,7 kb y 5,1
Kb; npi386, HindIII, 12,6 kb, 9,3 kb y 8,2 kb;
tda62, BamHI, 5,5 kb y 4,8 kb; BNL5.71,
EcoRV, 11,3 kb, 6,8 kb y 5,7 kb; BNL5.71,
BamHI, 11,3 kb, 6,8 kb y 5,7 kb; UMC156,
HindIII, 3,0 kb; UMC66, EcoRI, 10,5 kb y 6,5
kb; UMC66, BamHI, 3,7 kb; UMC19, BamHI,
12,3 kb; UMC104, HindIII, 12,4 kb, 11,6 kb y 7,5 kb;
UMC104, BamHI, 9,4 kb; UMC133, HindIII,
10,6 kb, 9,9 kb, 9,2 kb y 7,7 kb; UMC52, BamHI, 8,7
kb, 6,9 kb, 3,8 kb, 3,0 kb y 2,0 kb; BNL 15.07,
HindIII, 2,9 kb y 2,7 kb; npi409, EcoRI, 9,4
kb; npi409, HindIII, 10,4 kb, 9,0 kb y 3,9 kb;
UMC147, HindIII, 16,3 kb, 3,8 kb y 2,4 kb;
UMC90, HindIII, 7,8 kb, 2,8 kb y 2,5 kb;
UMC90, BamHI, 9,0 kb; UMC27, HindIII,
8,3 y 4,5 kb; tda37, BamHI, 8,2 kb y 6,5 kb;
UMC43, BamHI, 9,7 kb, 7,3 kb y 5,7 kb; UMC40,
BamHI, 7,2 kb, 4,3 kb y 4,0 kb; BNL7.71,
HindIII, 10,6 kb; tda62, BamHI, 5,5 kb;
UMC68, HindIII, 6,0 kb; phi10017, BamHI,
15,1 kb y 9,5 kb; tda50, BamHI, 8,5 kb;
npi373, HindIII, 6,5 kb, 5,6 kb y 3,0 kb;
tda204, BamHI, 4,0 kb; npi393, EcoRI,
12,1 kb, 8,5 kb, 7,0 kb y 5,6 kb; UMC65, HindIII, 2,9
kb; UMC46, EcoRI, 6,5 kb y 5,6 kb; asg7,
HindIII, 6,3 kb; UMC28, HindIII, 15,8 kb y
11,9 kb; UMC28, BamHI, 10,0 kb, 7,6 kb y 6,6 kb;
UMC134, BamHI, 4,7 kb; UMC134, HindIII,
7,5 kb; asg8, HindIII, 10,8 kb, 8,7 kb y 8,4 kb;
O2, EcoRI, 9,4 kb; BNL15.40, HindIII,
5,8 kb; UMC116, EcoRI, 9,5 kb; UMC110,
BamHI, 10,6 kb, 4,9 kb y 3,9 kb; BNL8.32,
HindIII, 8,9 kb, 7,4 kb y 7,1 kb; BNL14.07,
EcoRI, 6,4 kb; UMC80, HindIII, 10,6 kb, 8,2 kb
y 2,4 kb; BNL16.06, EcoRI, 6,8 kb y 1,9 kb;
phi20020, HindIII, 7,8 kb y 6,6 kb; npi114,
HindIII, 10,0 kb, 8,8 kb y 6,3 kb; BNL9.11,
HindIII, 3,4 kb; UMC103, HindIII, 6,9 kb y 5,7
kb; UMC124, HindIII, 8,0 y 7,0; UMC124,
BamHI, 6,6 kb y 2,6 kb; UMC120, HindIII, 3,2
kb, 2,3 kb y 1,4 kb; UMC89, EcoRI 7,3 kb;
UMC89, HindIII, 7,3 kb; UMC89, BamHI,
9,5 kb, 6,0 kb, 5,2 kb y 4,5 kb; BNL12.30, EcoRI, 3,5
kb; UMC48, HindIII, 6,2 kb, 5,3 kb, 4,7 kb, 3,5 kb y
2,2 kb; npi268, BamHI, 6,4 kb; phi10005,
EcoRI, 15,0 kb; UMC113, EcoRI, 5,9 kb y 5,4
kb; UMC113, BamHI, 12,8 kb, 11,8 kb y 10,5 kb;
UMC192, HindIII, 11,4 kb y 6,4 kb; wx
(ceroso), HindIII, 21,0 kb; CSU147, HindIII 5,9
kb; BNL5.10, HindIII, 6,1 kb y 4,4 kb; UMC114,
BamHI, 12,6 kb, 11,5 kb, 10,0 kb, 8,8 kb, 7,5 kb y 6,5 kb;
UMC95, EcoRI, 5,6 kb; UMC95, HindIII,
7,7 kb, 4,8 kb y 4,1 kb; UMC95, BamHI, 15,0 kb y 9,0
kb; CSU61, EcoRI, 8,1 kb y 4,8 kb; BNL7.57,
EcoRI, 1,0 kb; BNL7.57, BamHI, 11,6 kb, 5,9 kb
y 1,3 kb; CSU54, EcoRI, 14,7 kb y 12,6 kb;
phi20075, EcoRI, 7,1 kb; npi285, EcoRI,
12,4 kb, 9,4 kb y 6,0 kb; KSU5, EcoRI, 9,8 kb, 7,6
kb, 6,1 kb, 3,8 kb y 3,5 kb; UMC130, EcoRI, 13,5 kb y
7,0 kb; UMC130, HindIII, 4,8 kb y 3,2 kb;
UMC130, BamHI, 3,2 kb; UMC152, HindIII,
12,4, 7,1 kb y 5,6 kb; UMC64, HindIII, 3,3 kb;
phi06005, EcoRI, 12,8 kb; UMC163,
HindIII, 7,0 kb, 4,8 kb y 2,6 kb; UMC44,
HindIII, 9,8 kb, 8,7 kb, 7,2 kb, 5,5 kb y 4,0 kb;
BNL10.13, HindIII, 10,8 kb; npi306,
HindIII, 7,0 kb; pmt1, HindIII, 2,3 kb;
pmt2, HindIII, 8,0 kb, 4,2 kb, 2,8 kb y 2,1 kb;
pmt5, HindIII, 12,3 kb, 8,1 kb, 3,6 kb, 3,2 kb y 2,5
kb; tda48, HindIII, 8,2 kb; tda53;
HindIII, 3,8 kb y 2,2 kb; tda168, EcoRI, 3,6
kb; tda16, HindIII, 4,3 kb; y tda17,
HindIII, 7,0 kb.
2. Un método para producir una semilla de maíz
híbrida que contiene uno o más fragmentos de restricción de acuerdo
con la reivindicación 1, que comprende las etapas de:
(a) cruzar un parental femenino de
Tripsacum con un parental masculino de teosinte perenne para
producir una semilla híbrida de (Tripsacum X teosinte
perenne) o un parental femenino de teosinte perenne con una planta
de Tripsacum donante de polen para producir una semilla
híbrida;
(b) cultivar una planta híbrida a partir de
dicha semilla hasta la madurez;
(c) explorar dicha planta híbrida para
determinar si la planta es un cruce entre Tripsacum y
teosinte perenne usando el método de la reivindicación 1;
(d) cruzar dicha planta híbrida de
(Tripsacum X teosinte perenne) o (teosinte perenne X
Tripsacum) con maíz para producir una semilla; y
(e) recolectar la semilla producida en (d).
3. Un método para producir una planta de maíz
híbrida que contiene uno o más fragmentos de restricción de acuerdo
con la reivindicación 1, comprendiendo el método:
(a) producir una semilla de maíz híbrida usando
un método de acuerdo con la reivindicación 2; y
(b) cultivar la semilla de maíz híbrida para dar
una planta de maíz híbrida.
4. Un método para producir un derivado,
variante, mutante, modificación, componente celular, componente
molecular, polen o cultivo tisular a partir de una planta de maíz
híbrida, comprendiendo el método:
(a) producir una semilla de maíz híbrida usando
un método de acuerdo con la reivindicación 2;
(b) cultivar la semilla de maíz híbrida para dar
una planta de maíz híbrida; y
(c) obtener un derivado, variante, mutante,
modificación, componente celular, componente molecular, polen o
cultivo tisular a partir de la planta de maíz híbrida.
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