KR101333362B1 - 토마토에서 내성 대립유전자의 커플링 방법 - Google Patents

Abstract

게놈 내에 1종 이상의 토마토 황화 잎 마름 바이러스(TYLCV) 내성 대립유전자 및 1종 이상의 근류선충 내성 대립유전자를 포함하는 라이코페르시콘 에스큘렌튬(Lycopersicon esculentum) 식물로, 상기 내성 대립유전자들이 한 염색체 상의 상이한 유전자 좌에서 커플링 상으로 존재하고, 상기 식물이 TYLCV, 및 멜로이드지네 아레나리아(Meloidgyne arenaria), 멜로이도지네 인코그니타(Meloidogyne incognita) 및 멜로이도지네 자바니카(Meloidogyne javanica)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 근류선충 종 모두에 대해 높은 내성을 나타냄을 특징으로 한다.

Description

토마토에서 내성 대립유전자의 커플링 방법{METHODS FOR COUPLING RESISTANCE ALLELES IN TOMATO}

본 발명은 토마토(라이코페르시콘 에스큘렌튬(Lycopersicon esculentum , L.))에서 상업적으로 중요한 밀접하게 결합된 유전자의 피라미드화 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 가장 유효한 토마토 황화 잎 마름 바이러스 내성 유전자(Ty-1) 및 가장 유효한 선충류 내성 유전자(Mi-1)를 커플링 상(phase)(시스(cis))으로 포함하는(따라서 이들 밀접하게 결합된 유전자들은 마치 단일 단위로서 동시-유전된다(co-inherited)) 토마토 식물의 생산에 관한 것이다.

배양된 토마토와 관련된 200종을 초과하는 질병이 문헌에 보고되어 있다(Compendium of Tomato Diseases. J.B. Jones, J.P. Jones, R.E. Stall, T.A. Zitter, editors, (1997) American Phytopathological Society Press, St. Paul, MN). 이들 병원체에 의해 유발된 손상에 대항하기 위해서, 재배자들은 전형적으로는 재배 실습과 살충제 사용을 모두 포함한 통합적인 해충 관리 전략을 사용한다. 재배 실습의 일례는 토마토 식물 위에 투망을 사용하는 것으로, 이는 질병을 갖는 곤충들이 농작물을 감염시키는 것을 차단하는데 유용할 수 있는 물리적 장벽을 제공한다.

식물 질병에 효능 있는 트랜스제닉(transgenic) 접근법들을 입증한 다수의 연구 조사에도 불구하고, 재배자들은 현재 어떠한 병원체에도 내성을 나타내는 트랜스제닉 토마토 품종을 입수할 수 없다. 더욱이, 특히 유럽 연합에서, 규제 승인을 얻기 위한 고 비용과 함께, 이러한 유망한 기술이 상업적인 토마토 재배에 사용되는 것을 실제로 방해하는 공적인 저항의 문제가 여전히 남아있다.

전통적인 육종 접근법을 사용하여 현대의 재배종에 질병 내성 유전자를 유전자 이입(introgression)시키는 것이 여전히 대부분의 식물 질병들에 저항하기 위해 이용할 수 있는 유효 기술이다. 상기 접근법은 그의 계속적인 성공으로 인해 학술적 및 상업적 토마토 육종 프로그램 모두에서 여전히 주요 초점이다.

수백 종의 토마토 병원체 중에서, 상업적인 재배자에게 가장 중요한 것은 선충류 및 토마토 황화 잎 마름 바이러스(TYLCV)에 의해 유발된 질병이다. 선충류는 범 유행성이며 그의 분포는 거의 온 세계로 확장된다. 그의 만연된 분포 이외에, 다양한 종의 선충류는 대부분의 식물 및 동물을 포함하여, 다양한 숙주 범위를 갖는 병인체이다. 예를 들어, 선충류는 인간의 요충(엔테로비우스 버미큘라리스(Enterobius vermicularis)가 병인체이다)에서 토마토의 근류병까지 다양한 질병을 일으킨다. 50종을 초과하는 근류선충(root knot nematode)이 존재하지만, 토마토를 감염시키는 3종의 중요한 종은 멜로이도지네 아레나리아(Meloidogyne arenaria), 멜로이도지네 인코그니타(Meloidogyne incognita) 및 멜로이도지네 자바니카(Meloidogyne javanica)이다.

선충류의 근류병 종을 식물에서 감염이 발생하는 뿌리 구조의 유형에 따라 명명한다. 성공적인 감염 시, 선충류는 식물의 뿌리를 두껍게 하여, 상기 뿌리 상에 1 내지 10 ㎜의 덩어리 또는 혹을 생성시키는 유도물질을 생산한다. 이러한 변화는 상기 식물에서 선충류로의 양분의 운반을 촉진시킨다. 상기 감염되고 형태학적으로 변경된 뿌리는 식물에 물과 양분을 공급하는 능력이 동반하여 감소한다. 식물은 일반적인 활력의 감소와 함께 양분 흡수 능력의 감소를 나타내며, 이는 땅 위에서 관찰될 수 있다. 감염된 식물은 또한 생장 방해, 시듦 및 백화와 같은 보다 특정한 증상들을 나타낼 수 있다. 선충류 집단이 생장기 중에 형성됨에 따라, 시듦이 보다 현저해지고 열매 맺음에도 영향을 미칠 수 있다.

근류선충의 화학적 구제가 효과적이며, 선충구제제인 메틸 브로마이드는 모든 멜로이도지네 종들에 대해 탁월한 구제를 제공한다. 살충제 도포자에 대한 건강상 염려 및 오존 고갈에 대한 우려를 비롯한 다양한 이유들 때문에, 메틸 브로마이드의 사용은 전 세계적으로 감소되고 있다. 이러한 화학적 구제제의 종국의 금지는 토마토에서 선충류 질병을 구제하기 위한 대체 방법의 개발 중요성을 강조한다.

TYLCV는 제미니바이러스이며, 베고모바이러스 군으로 분류된다. 거의 모든 토양에 편재하는 상기 선충류와 달리, 토마토 황색 잎 마름 바이러스의 분포는 상기 바이러스를 옮기는 곤충 벡터, 가루이 베미시아 타바치(Bemisia tabaci)의 분포 구역에 의해 한정된다.

상업적인 토마토 생산은 과거 25년에 걸쳐, 보다 저렴한 인건비, 보다 양호한 운송비, 및 북아메리카 자유 무역 협정 및 세계 무역 기구 협정과 같은 조약으로 인해, 세계에서 온대로부터 더 열대 재배 지역으로 옮겨가고 있다. 이러한 지리학적 이동은 베미시아 타바치의 분포와 일치한다. 따라서, 토마토 재배 지역이 열대 기후쪽으로 이동함에 따라, TYLCV에 의해 유발되는 질병은 점점 더 현저해지고 있다. TYLCV는 가루이의 영양 공급에 의해 토마토로 급속히 전파될 수 있다. 일단 식물에서, 상기 바이러스는 복제하고 상기 식물 전체로 확산되지만, 이는 전형적으로는 체관부로 제한된다. TYLCV는 상기 식물에서 잎 마름 및 황화에서부터, 마디와 마디 사이의 길이의 단축 및 꽃 생장의 정지에 의해 유발되는 생장 방해에 이르는 심한 증상들을 유발시킨다. 동시에, 상기는 상기 식물이 덤불 같은 외관을 갖게 한다. 작물 손실은 심각할 수 있으며; 1990년대 초기에 도미니카 공화국에서 토마토 작물의 약 95%가 손실되었고, 플로리다에서는 단일 시즌에(1991-1992) 대략 1억 4천만 달러의 손실이 보고되었다(Moffat, Science(1999) 286:1835).

상기 가루이의 화학적 구제는 유효할 수 있지만, 상업적인 토마토 생산에서 살충제의 오용은 20종을 초과하는 상이한 토마토 감염성 베고모바이러스에 대한 벡터일 수 있는 살충제-내성 베미시아 타바치를 생성시켰다(Morales, (2001), Crop Protection; Polston and Anderson(1997) Plant Disease 81:1358-1369; Zeidan et al.(1999) Asia Trop. Res. Ext. 1:107-115).

토마토에서 선충류 구제에 선도적인 화학적 선택권이 점차로 감소되는 바와 같이, TYLCV에 대한 화학적 구제 선택권도, 상기 곤충 벡터가 살충제에 대해 내성으로 되는 것에서부터 살충제의 사용에 대한 공중 보건 우려에 이르는 이유들로 인해 또한 감소되고 있다. 트랜스제닉 내성 재배종의 생산에 수반되는 높은 개발 비용도 마찬가지로 유전자 공학적 접근법을 사용하여 TYLCV 내성 재배종을 개발하는데 장애가 된다. 따라서 당해 분야의 숙련가들은 토마토 생산에서 선충류, 제미니바이러스(TYLCV) 및 다른 식물 질병의 구제를 위한 상기 화학적 구제 전략 및 트랜스제닉 전략들에 대한 대안의 필요성을 인식할 것이다. 현재 천연의 내성 유전자의 유전자 이입이 토마토 병원체를 구제하는데 여전히 가장 유효한 선택권이다.

내성 표현형의 유전은 정량적이고 다 인자성일 수 있지만, 식물에서는 개별적인 단일 유전자 좌에 의해 조절되는 다수의 우성 내지 반 우성 내성 유전자를 갖는 것이 통상적이다. 식물 내성 유전자는 종종 특이적인 병원체 암호화된 리간드에 결합하는 수용체로서 작용하는 단백질을 암호화한다. 상기 병원체 특이적인 인식 및 식물에 의한 후속 반응은 플로어(Flor)에 의해 1940년대 말에 최초로 개시된 현상이며 '유전자에 대한 유전자(gene-for-gene)' 내성이라 칭한다(Flor(1971) Ann. Review of Phytopathology 9:275-296). 이러한 특이적인 수용체 리간드 복합체는 신호 전달 경로를 촉발하고 결국에는 내성 표현형을 생성시킨다(Baker et al.(1997), Science 276:726-733; Staskawicz et al.(1995) Science 268:661-667). 이러한 병원체 공격의 인식에 반응하여, 숙주는 세포 벽의 강화, 산화성 파열, 방어 유전자 발현의 유도 및 때때로 과민성 반응이라 칭하는 감염 부위에서의 급속한 세포사에 의해 반응할 수 있다.

대부분의 육종 대상에 대해서, 상업적인 육종가들은 종종 '배양된 유형'이라 칭하는 생식질을 사용하여 연구한다. 상기 생식질은 일반적으로 원예 수행성능에 대해 평가될 때 잘 수행되므로 육종이 보다 용이하다. 상기 배양된 유형이 제공하는 수행성능 이점은 종종 대립유전자 다양성의 결여에 의해 상쇄된다. 이는 배양된 생식질(수행성능은 전반적으로 보다 양호하지만 대립유전자 다양성이 부족하다)을 사용하여 연구될 때 육종가의 허용과 맞교환된다. 육종가들은 일반적으로 이러한 맞교환을 허용하는데, 그 이유는 배양된 물질을 사용하여 작업하는 경우가 유전적으로 다양한 소스를 사용하여 육종하는 경우보다 진행이 더 빠르기 때문이다.

대조적으로, 육종가가 광범위한 동종교배 또는 이종교배를 수행하는 경우, 역 교환이 일어난다. 이러한 예에서, 육종가는 전형적으로는 배양된 생식질을 배양되지 않은 유형과 교배한다. 상기와 같은 교배에서, 육종가는 배양되지 않은 유형으로부터의 신규의 대립유전자에 대한 접근을 획득할 수 있으나, 공여 모체와 관련된 유전적 장애(genetic drag)를 극복해야 한다. 상기 육종 전략에 대한 어려움 이외에, 상기 접근법은 종종 번식성 또는 생식성 문제로 인해 실패한다.

배양된 토마토와 교배할 수 있는 다수의 야생 일가(relatives), 예를 들어 라이코페르시콘 페넬리(Lycopersicon pennellii), 라이코페르시콘 히르수튬(Lycopersicon hirstum), 라이코페르시콘 페루비아늄(Lycopersicon peruvianum), 라이코페르시콘 칠렌세(Lycopersicon chilense), 라이코페르시콘 파르비플로룸(Lycopersicon parviflorum), 라이코페르시콘 크미엘레브스키(Lycopersicon chmielewskii), 라이코페르시콘 치스마니(Lycopersicon cheesmanii), 라이코페르시콘 세라시포르메(Lycopersicon ceraeiforme), 및 라이코페르시콘 핌피넬리폴륨(Lycopersicon pimpinellifolium)이 존재한다. 상기 야생 종들과 배양된 라이코페르시콘 에스큘렌튬 간의 유전자 거리는 이종교배를 이루는 것과 성공적으로 소질이 가해진 새로운 상업적 재배종을 생산하는 것 모두에 대한 어려움과 상관이 있다(Genetics and breeding. MA Stevens and CM Rick. In: The tomato crop: A scientific basis for improvement. JG Atherton and J Rudich, editors. Chapman and Hall, (1994), London). 예를 들어 라이코페르시콘 핌피넬리폴륨, 라이코페르시콘 세라시포르메, 라이코페르시콘 치스마니, 라이코페르시콘 크미엘레브스키 및 라이코페르시콘 파르비플로룸과 같은 종들은 현대의 토마토에 유전 소질 이입을 위한 공여체로서 사용하기에 가장 쉬운 야생종들이다. 대조적으로, 라이코페르시콘 페넬리, 라이코페르시콘 칠렌세, 라이코페르시콘 히르스툼 및 라이코페르시콘 페루비아늄은 현대의 토마토에 유전 소질 이입이 훨씬 더 어려운 종들이다. 이들 보다 멀리 관련된 종들을 사용하는 경우, 조기 발생 교배를 위해 교량 종 및 배아 구조를 사용해야 하는 것은 드문 경우가 아니다. 이러한 여분의 단계들을 사용하고서도, 현저한 분리 왜곡, 수정 문제, 감소된 재조합 및 유전적 장애에 직면할 수 있다. 진행된 발생에서조차도, 게놈의 유전자 이입된 영역에서의 재조합 억제가 성공적인 상업적 육종을 생성시키기에 충분히 유전적 장애를 감소시키는데 주된 방해물을 제공한다.

따라서, 야생 종에서 유용한 소질을 확인하고 배양 종 내로 유전자 이입을 위해 상기 소질을 표적화할 수 있지만, 성공의 보장은 없다. 대부분의 성공적인 상업적 토마토 육종가들은 상업적인 재배종을 생산하기 위해 야생 종으로부터 유전자 이입의 성공적인 완성 없이 평생 연구한다. 성공의 장벽에는 분리 왜곡이 포함되는데, 이는 유전자 이입을 어려움 내지 불가능하게 할 수 있는 야생형 게놈 영역을 생성시킬 수 있다. 더욱이, 현대 토마토의 야생 종들 중 일부는 자가 불친화성이며, 이는 이들이 자가 수분할 수 없음을 의미한다. 상기 자가 불친화성의 결과, 상기 식물은 고도로 이종성이며, 다수의 유전자 좌에 상이한 대립유전자들을 갖는다. 이들 야생 종의 고도의 이종성 성질은 또한 가장 효능 있는 관심 대립유전자의 유전자 이입을 방해할 수 있다.

토지에 순화시킨 작물의 야생 일가로부터 신규의 대립유전자를 유전자 이입하기 어려움은 많은 작물들로 연장되며, 이는 선충류 내성 유전자 이입에 의한 토마토로 예시된다. 베일리(Bailey, (1941) Proc. Am. Hort. Sci. 38:573-575)는 선충류 내성에 대한 잠재적인 출처로서 야생 종 라이코페르시콘 페루비아늄을 처음으로 동정하였다. 스미스(Smith, (1944) Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 44:413-416)는 나중에 배아 구조를 사용하여 선충류 내성 소질을 함유하는 이종교배 잡종(hybrid)을 성공적으로 회수하였다. 길버트와 맥과이어(Gilbert and McGuire, (1955))는 상기 유전자 좌 Mi를 주조화하였고 후속적으로 Mi를 염색체 6에 지도화하였다(Gilbert(1958) Tomato Genet. Coop Rep. 8:15-17). 라이코페르시콘 페루비아늄으로부터 유래된, 상기 Mi 유전자 좌의 내성 대립유전자를 Mi-1 대립유전자라 칭한다. 라이코페르시콘 에스큘렌튬으로부터의 감수성 대립유전자를 야생형 대립유전자라 칭하며, '+'로 표시한다. 상기 Mi-1 내성 대립유전자를 함유하는 모든 상업적인 토마토 재배종은 스미스에 의해 탄생된 이종교배 잡종으로부터 유래한다. 동종접합성 Mi-1 주가 1949년에 이미 개발되었지만(Frazier and Dennett, (1949) Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 54:225-236), 1970년대 중반까지는 상기 Mi-1 대립유전자가 상업적인 재배종에 통상적으로 사용되기 시작하지 못했다. 2가지 발전이 이러한 상업적인 실행을 도출시켰다. 첫 번째, 릭과 포브스(Rick and Fobes)는 알칼리성 포스파타제(Aps)라 불리는 아이소자임 마커와 Mi 유전자 좌간의 결합을 보고하였다((1974) Tomato Genet Coop. Rep. 24:25). 분자 마커 시험의 조기 사용은 육종가가 병리학 시험의 수행 없이 상기 소질을 추적할 수 있게 하였다. 두 번째, 잡종 토마토 재배종이 상업적인 재배가에 의해 점점 더 받아들여졌다. 60년간 Mi-1 대립유전자를 사용한 육종에도 불구하고, 현재 스트레스 조건 하에서 국소화된 괴사 반응(Ho et al. (1992) The Plant Journal, 2:971), 보다 작은 열매 및 보다 적은 열매 맺음을 포함한, 라이코페르시콘 페루비아늄으로부터의 Mi-1 유전자 이입과 관련된 현저한 유전적 장애는 여전하다.

육종가들은 상기 Mi-1 대립유전자가 이종접합체(hetrozygous)로서 제공될 때 효능이 있었으며, 이는 상기 육종가들로 하여금 단지 하나의 모체로부터의 잡종에 선충류 내성 소질을 전달할 수 있게 하였다. 차례로 이는 육종가들이 상기 염색체 6의 부위에 에스큘렌튬 유전자를 갖는 제 2의 순계교배(inbred) 모체를 사용함으로써 상기 유전적 장애를 크게 극복하게 하였다. 잡종 재배종의 생산은 이러한 육종 전략을 실행할 수 있게 하였다. 우성 Mi-1 대립유전자를 상기 순계교배 모체들 중 하나로 육종하였으며, 상기 유전적 장애의 대부분을 차폐하는 주변의 에스큘렌튬 대립유전자를 갖는 감수성 대립유전자('+')를 상기 제 2의 순계교배 모체로 육종하였다. 상기 유전적 장애를 이종접합성 조건 하에서 차폐시킬 수 있음은 상기 게놈 부위에 스트레스 조건 하에서 상기 국소화된 괴사 반응, 보다 작은 열매 크기 및 보다 적은 열매 맺음을 각각 차폐시키는 능력으로 인해 식물의 일반적인 건강, 열매 크기 및 열매 수확량에 영향을 미치는 유전자가 존재한다는 간접적인 증거를 제공한다.

식물 내성 유전자는 상기 게놈에서 군생하는 것으로 밝혀졌으며, 토마토에서는 중심체 부근에서 흔히 발견된다. 상기 Mi 유전자 좌는 염색체 6 상의 중심체 부근의 이들 질병 내성 클러스터(cluster) 중 하나에 위치한다. 상기 Mi 내성 유전자 좌를 갖는 것 이외에, 제미니바이러스, 오이듐 라이코페르시큠(Oiduim lycopersicum)에 대한 다른 내성 유전자(van de Beek et al.(1994) Theoret. Appl. Genet. 89:467-473) 및 클라도스포륨 풀븀(Cladosporium fulvum) 품종 2 및 5에 대한 2종의 내성 유전자(Dickinson et al. Mol. Plant Microbe Interact.(1993) 6:341-347)가 모두 상기 염색체 6의 중심체 부위에 유전적으로 결합된다.

상기 Mi-1 유전자 이입의 어려움은 수십 년 후에도 상기 소질과 관련된 유전적 장애를 감소시키지 못하였다. 이러한 어려움에 대한 또 다른 설명은 상기 Mi-1 내성 유전자가 다면적이고, 유전적 장애에 직접적으로 기여하거나, 또는 상기 게놈 부위에 유전적 장애 감소의 진보를 제한하는 재조합의 억제가 존재한다는 것이다. 다양한 실험적 접근법들이 이러한 문제를 다루었다. 유전학 및 세포 유전학의 조합을 사용하여(Zhong et al.(1999) Theoret. Appl. Genet. 98:365-370), 상기 토마토의 게놈 크기를 근거로, 상기 Mi 유전자 좌와 Aps 유전자 좌 사이의 물리적인 거리는 약 750,000 염기쌍이고, 유전적 평가를 근거로 ∼1 cM의 유전자 거리일 것으로 나타났다. 그러나, 이들의 형광 제자리 잡종화(FISH) 결과는 상기 물리적 거리가 실제로는 40,000,000 염기 쌍임을 입증하였다. 이들 유전자 좌간의 이러한 유전적 및 물리적 거리간의 불일치는 종(Zhong) 등이 상기 Mi 유전자 좌 주위의 재조합이 상기 게놈의 평균에 비해 대략 50 배 감소함을 예견하게 하였다. 문헌[Kaloshian et al.(1998) Mol. Gen. Genet. 257:376-385]은 비교 유전 접근법을 취하였으며, 라이코페르시콘 페루비아늄과 라이코페르시콘 페루비아늄의 교배가 라이코페르시콘 에스큘렌튬과 라이코페르시콘 페루비아늄 유래된 집단에 비해 상기 부위에서 8 배 이상 더 큰 재조합을 가짐을 입증하였다. 이러한 실험 이외에, 재조합이 일반적으로 중심체 부위에서 억제됨은 널리 공지되어 있다. 문헌[Milligan et al. 1998, Pant Cell 10:1307-1320]은 트랜스제닉 상보성을 사용하여 클로닝된 Mi 내성 유전자를 감수성 재배종인 머니메이커(Moneymaker)에 도입시켰다. 이들 상보성 시험에서 다면적인 효과가 관찰되지 않은 것은 상기 Mi 유전자 이입과 관련된 원예학적 결함이 유전적 장애에 기인함을 강하게 시사한다. 이들 연구는 상기 염색체 6의 부위에서 질병 내성 유전자를 유전자 이입시키는 것과 관련된 어려움을 통찰하게 하였다.

1998년에, 칼로쉬안(Kaloshian) 등은 Asp 아이소자임 마커보다 Mi 유전자 좌에 더 가까운, 공동 우성인 PCR 계 분자 마커(REX-1이라 칭함)를 개시하였다(Mol Gen Genet. 257:376-385). 이러한 DNA계 마커는 토마토 육종 프로그램에 의해 급속히 채택되었으며, 새로운 선충류 내성 잡종 재배종의 개발을 크게 촉진시켰다.

토마토 육종 단체는 과학 간행물을 통해 Mi-1 선충류 내성 대립유전자의 유전자이입에 있어서 그의 진보를 빠르게 개시하였지만, 이러한 어려운 육종 접근법에 대한 성공은 이 분야의 다수의 특허(미국 특허 제 6,414,226, 6,096,944, 5,866,764 및 6,639,132 호) 허여에서 USPTO에 의해 가망이 없는 것으로 인식되었다.

토마토 황화 잎 마름 제미니바이러스(TYLCV)에 대한 내성의 보고서들이 거의 40년 동안 존재하여 왔다. 코헨(Cohen)은 1964년에 이미 일부 내성 유전자형을 처음으로 보고하였으며(Cohen and Harpaz(1964) Entomol. Exp. Appl. 7:155-166), 이때 더 높은 수준의 TYLCV 내성을 함유하는 것으로서 라이코페르시콘 핌피넬리폴륨과 라이코페르시콘 페루비아늄을 동정하였다(Cohen and Nitzany(1966) Phytopathology 56:1127-1131). 1990년대에, 필로우스키(Pilowski)와 코헨은 5종의 많은 열성 유전자를 갖는 라이코페르시콘 페루비아늄(PI126935)으로부터의 허용성을 보고하였다(Plant Disease 74:248-250). 미켈슨(Michelson) 등은 라이코페르시콘 칠렌세에서 TYLCV 내성을 발견하였으며((1994) Phytopathology 84:928-933), 후그스트라텐(Hoogstraten)은 이를 나중에 독립적으로 입증하였다. 이러한 내성 유전자 좌를 Ty 유전자 좌로서 지칭하며, 라이코페르시콘 칠렌세로부터의 내성 대립유전자를 Ty-1이라 명명하였다.

상기 Mi 유전자 좌와 마찬가지로, 상기 Ty 유전자 좌의 감수성 대립유전자를 야생형 또는 '+'로서 지칭한다. 자미어(Zamir) 등은 염색체 6의 중심체 부위에 Ty 유전자 좌를 지도화하였다((1994) Theoret. Appl. Genet. 88:141-146). 상기 Ty-1 대립유전자는 우성 대립유전자로서 작용하며, 따라서 상기 Ty-1 대립유전자에 대해 고정되어 있거나 이종접합성을 나타내는 (Ty-1/'+') 상기 2종의 계통이 모두 TYLCV에 대해 내성을 나타낸다.

라이코페르시콘 칠렌세로부터의 Ty-1 내성 유전자를 함유하는 순계교배 토마토 계통 FDR16-2045는 또한 가까운 Mi 유전자 좌에 또한 유전자 이입된 라이코페르시콘 칠렌세로부터의 내성 유전자로 인해 선충류에 대한 내성을 부여한다(Hoogstraten, 미국 특허 제 6,414,226 호). 선충류 및 제미니바이러스에 대한 상기 2종의 내성 유전자가 계통 FDR16-2045에 함께 유전되는 것은 상기 Ty와 Mi 유전자 좌가 유전적으로 가깝게 위치함을 입증한다. 계통 FDR16-2045에서 라이코페르시콘 칠렌세로부터 유전자 이입될 때, 상기 Mi 유전자 좌에서의 선충류 내성 대립유전자를 Mi-J라 지칭한다. 계통 FDR16-2045는 육종가가, Mi 및 Ty 유전자 좌에서 '+' 유형 대립유전자를 갖는 제 2 순계교배 모체를 사용함으로써 대부분의 유전적 장애를 철회하는 능력을 갖는, 선충류 및 제미니바이러스에 대해 효능 있는 내성 대립유전자를 함유하는 상업적인 잡종을 생산할 수 있게하므로, 귀중한 육종 순계이다. 상기 유전자 이입으로부터의 유전적 장애는 스트레스 조건 하에서 자기괴사, 보다 긴 마디 사이의 길이, 보다 작은 열매 및 보다 적은 열매 맺음으로서 나타날 수 있다.

그러나, 병리학 시험을 통해, 라이코페르시콘 칠렌세로부터의 Mi-J 대립유전자가 라이코페르시콘 페루비아늄으로부터의 Mi-l 대립유전자만큼 유효하지 않음을 발견하였다. 이는 Mi-J 대립유전자가 Mi 유전자 좌에서 '+' 감수성 대립유전자와 F1 잡종으로 쌍을 이루는 경우 특히 명백하다. 본 발명자들은 분자 기법을 사용하여 Mi 유전자 좌에서 3종의 가능한 대립유전자(Mi-1, Mi-J 및 '+')를 구분하는 분자 마커 시험을 디자인할 수 있었다.

따라서 토마토 육종가들은 이러한 유전자 이입과 관련된 유전적 장애를 차폐하는 능력은 유지하면서 염색체 6의 중심체 부위에 지도화한 다수의 내성 유전자들을 전달하는 능력의 한계에 직면한다. 잡종 재배종에서 상기 염색체 6의 부위에 지도화한 모든 공지된 내성 유전자들을 피라미드화하기 위해서, 육종가는 선충류 내성 유전자 Mi-1을 함유하는 라이코페르시콘 페루비아늄으로부터 유전자 이입된 하나의 모체, TYLCV 내성 유전자 Ty-1을 함유하는 라이코페르시콘 칠렌세로부터 유전자 이입된 또 다른 모체, 오이듐에 대한 내성 유전자를 함유하는 라이코페르시콘 히르수툼으로부터 유전자 이입된 또 다른 모체, 클라도스포륨 품종에 대한 내성 유전자를 함유하는 라이코페르시콘 핌피넬리폴륨으로부터 유전자 이입된 또 다른 모체, 및 이들 유전자 이입 중 일부와 관련된 유전적 장애를 차폐하기 위해 에스큘렌튬으로부터의 '+' 유형 대립유전자를 함유하는 더욱 또 다른 모체를 가져야 할 것이다. 이러한 과제는 잡종 재배종들을 제조하기 위해서 상기로부터 단지 2종의 모체 계통만을 선택해야 하기 때문에 육종가에게는 불가능하다. 이러한 딜레마는 문헌[Ho et al. (1992) The Plant Journal 2:971-982, 도 6 참조] 및 [Liharska et al. (1996) Genome 39:485-491, 도 1 참조]에 의해 사실적으로 나타난다.

따라서, 심하게 억제된 재조합을 갖고, 원래 라이코페르시콘 칠렌세로부터 유전자 이입된, TYLCV 내성에 가장 효능 있는 대립유전자 Ty-1과 함께 원래 라이코페르시콘 페루비아늄으로부터 유전자 이입된, 선충류 내성에 대해 가장 효능 있는 대립유전자 Mi-1을 함유하는 것으로 공지된 상기 게놈 영역의 재조합 사건을 동정할 필요가 여전하다. 이러한 방식으로 나란히 놓여 밀접하게 결합된 대립유전자들을 커플링 상으로, 또는 시스로 있다고 한다. 상기와 같은 효능 있는 내성 대립유전자들의 시스 조합은 토마토 육종가가, 유전적 장애를 차폐하거나 또는 추가적인 내성 유전자들, 예를 들어 오이듐, 클라도스포륨에 대해 내성을 나타내는 유전자, 또는 이러한 질병 클러스터 중에서 발견되는 내성 대립유전자를 전달하는데 제 2 순계교배 모체를 자유롭게 이용할 수 있으면서 TYLCV 및 선충류에 가장 효능 있는 내성을 갖는 토마토 잡종을 생산할 수 있게 한다.

발명의 요약

본 발명에 의해 게놈 내에 1종 이상의 토마토 황색 잎 마름 바이러스(TYLCV) 내성 대립유전자 및 1종 이상의 근류선충 내성 대립유전자를 함유하는 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물을 제공하며, 상기 내성 대립유전자들이 한 염색체 상의 상이한 유전자 좌에서 커플링 상으로 존재하고, 상기 식물이 TYLCV에 대해 내성을 나타내며 멜로이드지네 아레나리아(Meloidgyne arenaria), 멜로이도지네 인코그니타(Meloidogyne incognita) 및 멜로이도지네 자바니카(Meloidogyne javanica)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 근류선충 종에 대해 높은 내성을 나타냄을 특징으로 한다.

또한 게놈 내에 1종 이상의 토마토 황색 잎 마름 바이러스(TYLCV) 내성 대립유전자 및 1종 이상의 근류선충 내성 대립유전자를 포함하는 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물을 제공하며, 상기 내성 대립유전자들이 한 염색체 상의 상이한 유전자 좌에서 커플링 상으로 존재하고, 상기 식물이 TYLCV, 및 멜로이드지네 아레나리아, 멜로이도지네 인코그니타 및 멜로이도지네 자바니카 중에서 선택된 1종 이상의 근류선충 종 모두에 대해 내성을 나타내고, 이때 상기 근류선충 내성 대립 유전자가 라이코페르시콘 칠렌세로부터의 Mi-J 대립유전자가 아님을 특징으로 한다.

하나의 바람직한 실시태양에서, 약 1.0 미만의 근류선충 내성 점수를 갖는 본 발명의 식물을 제공하며, 추가의 바람직한 실시태양에서 약 0.5 미만, 보다 바람직하게는 약 0.25 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.05 미만의 근류선충 내성 점수를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 식물은 잡종 식물이다.

하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 TYLCV 내성 대립유전자는 Ty-1로 명명된 대립유전자이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서 상기 근류선충 내성 대립유전자는 Mi-1로 명명된 대립유전자이다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 TYLCV 내성 대립유전자 및 근류선충 내성 대립유전자는 각각 라이코페르시콘 칠렌세(Lycopersicon chilense) 및 라이코페르시콘 페루비아늄(Lycopersicon peruvianum)으로부터의 것들이다.

바람직하게는, 상기 TYLCV 내성 대립유전자 및 근류선충 내성은 트랜스제닉이 아니다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 상기와 같은 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물의 열매 또는 종자를 제공한다.

본 발명은 순계교배된 상업적인 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물을 제공하거나, 또는 한편으로 본 발명에 따른 식물을 또 다른 라이코페르시콘 에스큘렌튬과의 교배에서 모체로서 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 식물과 TYLCV 내성 대립유전자 및 근류선충 내성 대립유전자가 없는 순계교배 식물과의 교배 방법에 의해 생산된 잡종 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물을 제공한다.

본 발명의 상기 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 TYLCV 내성 대립유전자 및 근류선충 내성 대립유전자가 모두 이종접합체인 잡종 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물을 제공한다. 보다 바람직하게는 상기와 같은 잡종 식물은 양호한 원예학 특성을 가지며, TYLCV 내성 대립유전자 및 근류선충 내성 대립유전자를 제공하는 야생 토마토 종 유전자 이입과 통상적으로 관련된 유전적 장애가 크게 감소된 잡종 식물이 훨씬 더 바람직하다.

바람직하게는, 상기 잡종 식물은 야생종 라이코페르시콘 칠렌세와 관련된 바와 같은 유전적 장애 결과의 큰 감소를 나타내며, 야생 종 라이코페르시콘 페루비아늄과 관련된 바와 같은 유전적 장애 결과의 큰 감소를 나타낸다. 보다 바람직하게는, 상기 잡종 식물은 자기 괴사, 보다 긴 마디사이의 길이, 보다 작은 열매, 보다 적은 열매 맺음 및 원예학적으로 열등한 식물 구조로 이루어진 증상들의 군 중에서 선택된 유전적 장애 증상들이 크게 감소되었다.

상기 TYLCV 내성 대립유전자 및 근류선충 내성 대립유전자의 유전자 좌들은 염색체 상의 동일 질병 내성 균주 군들 내에 존재한다. 따라서, 본 발명의 훨씬 더 바람직한 실시태양에서, 상기 균주 군 내의 1종 이상의 추가적인 질병 내성 대립유전자를 Ty-1 TYLCV 내성 대립유전자 및 Mi-1 근류선충 내성 대립유전자에 상반되는 상으로 또는 트랜스로 제공한다. 본 발명의 상기 태양의 하나의 또 다른 실시태양에서, 추가적인 질병 내성 대립유전자는 클라도스포륨 품종 2, 클라도스포륨 품종 5 및 오이듐으로 이루어진 군 중에서 선택된 질병에 대한 내성을 제공한다.

본 발명은 재조합 사건으로부터 생산되고, 원래 라이코페르시콘 페루비아늄으로부터 유전자 이입된 Mi-1을, 원래 라이코페르시콘 칠렌세로부터 유전자 이입된 Ty-1과 시스로 갖는 토마토 식물(라이코페르시콘 에스큘렌튬)을 제공한다.

정의

식물학 용어: 린네(Linnaeus)는 식물 분류의 아버지로 간주된다. 그는 처음으로 현대의 토마토를 솔라늄(수년간 그의 과학 명은 라이코페르시콘 에스큘렌튬이었다)으로서 분류하였다. 유사하게, 상기 현대 토마토의 야생 일가를 라이코페르시콘 속 내에서 라이코페르시콘 펜넬리, 라이코페르시콘 히르수툼, 라이코페르시콘 페루비아늄, 라이코페르시콘 칠렌세, 라이코페르시콘 파르비플로룸, 라이코페르시콘 크미엘레브스키, 라이코페르시콘 치스마니, 라이코페르시콘 세라시포르메 및 라이코페르시콘 핌피넬리폴륨과 같이 분류하였다. 과거 수년에 걸쳐, 토마토 연구가 및 식물학자들 사이에서 이들 종의 명칭을 재 분류할 것인지의 여부가 논쟁되었다. 현대 토마토에 대해 새로 제안된 과학명은 솔라늄 라이코페르시큠(Solanum lycopersicum)이다. 유사하게, 상기 야생 종들의 명칭을 변경시킬 수 있다. 라이코페르시콘 펜넬리는 솔라늄 펜넬리가 될 수 있고, 라이코페르시콘 히르수툼은 솔라늄 하브로차이테스가 될 수 있으며, 라이코페르시콘 페루비아늄은 솔라늄 '엔 페루비아늄'과 솔라늄 '칼레존 드 휴아일레스(Callejon de Huayles)', 솔라늄 페루비아늄, 및 솔라늄 코르넬리오뮤엘레리(soladum corneliomuelleri)로 나뉠 수 있고, 라이코페르시콘 파르비플로륨은 솔라늄 네오리키(soladum neorickii)로 될 수 있으며, 라이코페르시콘 크메일레브스키는 솔라늄 크미엘레브스키로 될 수 있고, 라이코페르시콘 칠렌제는 솔라늄 칠렌세로, 라이코페르시콘 치스마니아에는 솔라늄 치스마니아에 또는 솔라늄 갈라파젠세로(soladum galapagense), 라이코페르시콘 핌피넬리폴륨은 솔라늄 핌피넬리폴륨으로 될 수 있다(Solanacea Genome Network(2005) Spooner and Knapp; http://www.sgn.cornell.edu/help/about/solanum_nomenclature.html).

따라서, 토마토 및 그의 일가의 명칭을 분류를 위해 변화시킬 수 있으며, 현대의 토마토 및 그의 야생 일가를, 모두 라이코페르시콘 속 내에 있는 기존의 명칭을 사용하여 정의한다.

선충류: 근류선충(멜로이도지네 종)은 토양 중에 흔하며, 대부분 광범위한 숙주 범위를 가져서 다수의 일년생 및 다년생 작물에서 문제를 일으킨다. 가장 심각하게 영향을 받는 것들 중에 토마토가 있으며, 이때 상기 선충류는 모든 토마토 재배지에서 문제를 일으킨다. 근류선충은 동정하기가 어려우며, 50 종이 넘게 동정되었지만 몇몇 종(예를 들어 멜로이도지네 자바니카, 멜로이도지네 인코그니타 및 멜로이도지네 아레나리아)이 토마토 재배가에게 대부분의 문제를 일으킨다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "대립유전자(들)"란 용어는 특정 유전자 좌에서 1종 이상의 선택적인 형태들 중 임의의 형태를 의미하며, 이들 대립유전자들은 모두 특정 유전자 좌에서 하나의 소질 또는 특징에 관련된다. 유기체의 2배수 세포에서, 주어진 유전자의 대립유전자들은 특정한 위치, 또는 염색체 상의 유전자 좌(복수 개의 유전자 좌)에 위치한다. 하나의 대립유전자는 상동 염색체 쌍의 각 염색체 상에 존재한다. 2배수 식물 종들은 특정한 유전자 좌에 다수의 상이한 대립유전자들을 포함할 수 있다.

본 발명에 사용된 "유전자 좌"(복수의 유전자 좌)란 용어는 예를 들어 유전자 또는 유전자 마커가 발견되는 염색체 상의 특정한 장소 또는 장소들 또는 부위를 의미한다. "Mi 유전자 좌"는 본 발명에서 1종 이상의 대립유전자가 위치한 토마토 게놈 내의 위치를 지칭하며, 이는 식물 또는 식물 조직이 갖는 근류선충 내성 정도를 결정한다. "Ty 유전자 좌"란 용어는 본 발명에서 1종 이상의 대립유전자가 위치한 토마토 게놈 내의 위치를 지칭하며, 이는 식물 또는 식물 조직이 갖는 TYLCV 내성 정도를 결정한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "커플링 상" 및 "시스" 란 용어는 2개의 상이한 유전자 좌의 대립유전자들이 하나(상동)의 염색체 상에서 함께 결합되어 존재하는 유전자 상태를 지칭한다. 예를 들어, 대립유전자 Ty-1 및 Mi-1이 하나의 상동 염색체 상에 위치하는 경우, 이들 대립유전자는 "커플링 상으로" 있다. 대조적으로, 상기 대립유전자 Ty-1 및 Mi-1이 동종 쌍의 상이한 상동 염색체 상에 위치하는 경우, 이들을 "상반된 상"으로 또는 "트랜스(trans)"로 존재한다고 한다.

"재조합체" 또는 "재조합적 사건"은 본 발명에서 상동 염색체의 유전자 교환 및 독립적인 조합의 결과로서 발생하는 새로운 유전자 구성을 갖는 식물을 지칭한다.

"TYLCV 내성 대립유전자"는 게놈 중에 존재할 때 토마토 황화 잎 마름 바이러스 감염 및/또는 손상에 대한 "내성" 또는 "중등도의 내성"을 부여하는 대립유전자를 지칭한다. 식물 또는 다수의 식물들이 "TYLCV 내성 분석"(하기 참조)을 사용하여 평균 0 내지 1, 또는 0 또는 1의 질병 점수를 갖는 경우 이들 식물은 TYLCV에 "내성"이라고 한다. 식물 또는 다수의 식물들이 TYLCV 내성 분석을 사용하여 평균 약 2의 질병 점수를 갖는 경우 이들 식물은 "중등도의" TYLCV 내성을 갖는다고 한다. 약 3 이상의 평균 질병 점수를 갖는 식물은 감수성을 나타낸다고 한다.

"근류선충 내성 대립유전자"는 게놈 중에 존재 시 멜로이도지네 인코그나타, 멜로이도지네 자바니카 및 멜로이도지네 아레나리아 중에서 선택된 1종 이상의 선충류 종에 대한 내성을 부여하는 대립유전자를 지칭한다. 식물 또는 다수의 식물들이 "근류선충 내성 분석"(하기 참조)을 사용하여 약 0.1 미만의 평균 질병 점수를 갖는 경우 이들 식물은 이들 근류선충 종들 중 1종 이상에 대해 "높은 내성"을 나타낸다고 한다. 예를 들어 Mi-1/Mi-1 식물 및 Mi-1/+ 식물은 고도의 내성 물질이다. 식물 또는 다수의 식물들이 평균 약 0.1 이상 1.0 미만의 질병 점수를 갖는 경우(예를 들어 대립유전자 MiJ/MiJ를 갖는 식물) 이들 식물은 "중등도의 내성"을 나타낸다고 한다. 평균 1.0 이상 2.0 미만의 질병 점수를 갖는 식물은 "보통 내성"을 갖는다(예를 들어 대립유전자 MiJ/+를 갖는 식물)고하는 반면, 2.0 이상의 평균 질병 점수를 갖는 식물은 감수성을 나타낸다고 한다(예를 들어 대립유전자 +/+를 갖는 식물).

"TYLCV 내성 분석"은 다수의 식물을 천연 TYLCV 감염이 발생하는 들에서 재배하고, 실시예에 추가로 개시하는 바와 같이 0 내지 4의 등급을 사용하여 감염에 따른 하나 이상의 시점에서 질병 증상을 평가하고, Ty 유전자 좌에서 특이적인 대립유전자 조성(유전자형)을 갖는 다수의 식물들에 대한 평균 질병 등급을 측정함을 지칭한다.

"선충류 내성 분석"은 다수의 식물들을 멜로이도지네 인코그니타, 멜로이도지네 자바니카 또는 멜로이도지네 아레나리아 접종물로 접종한 토양에서 재배하고, 실시예에 추가로 개시하는 바와 같이, 뿌리 혹을 약 28일 후에 0 내지 4의 등급으로 평가하고, Mi 유전자 좌에서 특이적인 대립유전자 조성(유전자형)을 갖는 다수의 식물에 대한 평균 질병 등급을 측정함을 지칭한다.

본 발명에 사용된 "이종접합성"이란 용어는 소정의 유전자 좌에 2종의 상이한 대립유전자가 거주하지만 2배수 유기체의 세포 중의 상동 염색체의 상응하는 쌍에 개별적으로 위치하는 경우 존재하는 유전자 상태(예를 들어 Mi-1/+)를 의미한다. 환언하면, 본 발명에 사용된 "동종접합성"이란 용어는 2개의 동일한 대립유전자가 소정의 유전자 좌에 거주하지만 2배수 유기체의 세포 중의 상동 염색체의 상응하는 쌍에 개별적으로 위치하는 경우 존재하는 유전자 상태(예를 들어 Mi-1/Mi-1)를 의미한다.

본 발명에 사용된 "식물"이란 용어는 전체 식물 또는 그의 임의의 부분 또는 유도체, 예를 들어 식물 세포, 식물 원형질체, 토마토 식물을 재생시킬 수 있는 식물 세포 조직 배양물, 식물 유합 조직, 식물 세포 덤불, 및 식물에서 완전한 식물 세포, 또는 식물의 부분, 예를 들어 배아, 화분, 밑씨, 열매(예를 들어 수확된 토마토), 꽃, 잎, 종자, 뿌리, 뿌리 끝 등을 포함한다.

"분자 분석"(또는 시험)은 Mi 또는 Ty 유전자 좌에서 특정 대립유전자의 존재 또는 부재를 가리키는(직접 또는 간접적으로) (DNA 기본) 분석을 지칭한다. 또한 임의의 개별적인 식물에서 Ty 또는 Mi 유전자 좌에서 특정한 대립유전자가 동종접합체인지 또는 이종접합체인지를 결정할 수 있게 한다. 예를 들어 하나의 실시태양에서 Mi 또는 Ty 유전자 좌에 결합된 핵산을 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시키고, 상기 증폭 산물을 효소에 의해 절단시키며, 전기영동에 의해 분리된 상기 증폭 산물의 패턴을 근거로, Mi 또는 Ty 대립유전자가 임의의 개별적인 식물 중에 존재하는 것과 Mi 또는 Ty 유전자 좌에서 대립유전자의 접합성(즉 각 유전자 좌에서 유전자형)을 결정할 수 있다. 예로서 SCAR, CAPS 및 유사한 분석들이 있다.

본 발명에 사용된 "변종" 또는 "재배종"이란 용어는 최저로 공지된 순위(소정의 유전자형 또는 유전자형들의 조합으로부터 생성되는 특성들의 발현에 의해 한정될 수 있다)의 단일 식물 분류단위 내의 식물 무리를 의미한다.

본 발명에 사용된 "야생형"이란 용어는 라이코페르시콘 에스큘렌튬 내에서 발견되는 천연 대립유전자를 의미한다. 선충류 내성 유전자 좌 Mi, 및 TYLCV 유전자 좌 Ty에서, 라이코페르시콘 에스큘렌튬으로부터의 이들 야생형 대립유전자는 상기 병원체에 대한 감수성을 부여하며 본 발명에서 Mi+ 및 Ty+, 또는 간단히 "+"로서 표시한다.

본 발명에 사용된 "변종" 또는 "다형 변종"이란 용어는 주어진 핵산 서열과 필수적으로 유사한 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들어, "그의 변종" 또는 "서열식별번호: 1 내지 11 중 임의의 것의 변종"이란 용어는 하나 이상(예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 그 이상)의 뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 결실되거나(결실 변종) 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 다른 뉴클레오타이드로 치환되거나(치환 변종) 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 내에 삽입된(삽입 변종) 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.

서열식별번호:1 내지 11의 변종은 서열식별번호: 1 내지 11 중 임의의 것과 "필수적으로 유사한" 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열식별번호: 1 내지 11과 필수적으로 유사한 서열은 예를 들어 디폴트 매개변수를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT으로, 예를 들어 니들맨과 분취(Needleman and Wunsch) 연산을 사용하여 최적으로 정렬될 때 서열식별번호: 1 내지 11 중 하나 이상의 서열과 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 이상의 핵산 서열 일치성을 포함하는 핵산 서열이다. GAP 디폴트 매개변수는 격차 발생 벌점 = 50(뉴클레오타이드) 및 격차 연장 벌점 = 3(뉴클레오타이드)이다. 뉴클레오타이드의 경우 사용되는 상기 디폴트 득점 매트릭스는 nwsgapdna(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919)이다. 서열 배열 및 서열 일치성 퍼센트에 대한 점수를 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 GCG 위스콘신 패키지, 버전 10.3(Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, USA로부터 입수할 수 있다) 또는 윈도우용 개방 소스 소프트웨어 엠보스(Emboss, 현재 버전 2.7.1-07)를 사용하여 측정할 수 있다. 변종은 또한 이들 서열 중 임의의 서열의 단편 또는 부분을 포함한다.

본 발명에 따른 식물 및 식물 부분

하나의 실시태양에서 본 발명은 게놈 내에 원래 라이코페르시콘 페루비아늄으로부터 유전자 이입된 Mi-1 대립유전자를, 원래 라이코페르시콘 칠렌세로부터 유전자 이입된 Ty-1과 시스로 포함하는 토마토 식물(라이코페르시콘 에스큘렌튬)뿐만 아니라 상기와 같은 식물의 식물 세포 및 조직, 종자 또는 열매를 제공한다. 이들 식물을 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 상업적인 변종들(각각 관심의 (바람직하게는 고정된) 대립유전자를 포함한다)을 교배시키고 Mi-1 및 Ty-1을 시스로 포함하는 재조합체 식물을 상기 교배로부터 수득한 F2 식물, 또는 F1의 추가 자가수정 또는 교배에 의해 수득한 임의의 추가의 세대(예를 들어 F2 또는 역교배 집단)로부터 선택함으로써 제조할 수 있다. 재조합 사건이 과도하게 낮을 때(많은 수의 사건이 필요하다), 상기 선택을 바람직하게는 1종 이상의 Mi 대립유전자 특이적 또는 대립유전자 식별 분자 분석, 예를 들어 SCAR 또는 CAPS 분석을 사용하여 수행한다. 예를 들어, 실시예들에 개시한 바와 같은, 본 발명에서 "Ty 유전자 좌의 경우 SCAR 분석", "Mi 유전자 좌의 경우 1 번 SCAR 분석" 및 "Mi 유전자 좌의 경우 2 번 SCAR 분석"이라 지칭하는 3가지 SCAR 분석들 중 1가지 이상을 사용할 수 있다. 이들 분석에서, 3개의 프라이머 쌍을 PCR 반응(서열식별번호: 1 및 2, 서열식별번호: 3 및 4, 및 서열식별번호: 5 및 6)에 이어서 PCR 증폭 산물들간의 다형성을 검출하기 위해 수득한 단편들의 효소 제한 및 검출에 사용한다.

통상적인 실험을 사용하여 유사한 분석들을 개발할 수 있음은 물론이다. 예를 들어, 상기 프라이머 서열들 중 임의의 서열의 "변종", 또는 Mi 및 Ty 유전자 좌 부근 또는 그 위에서 게놈의 다른 부분들과 잡종화하는 프라이머 또는 탐침을 사용할 수 있다.

Mi-1 및 Ty-1을 시스로 포함하는 식물은 동종 접합체이거나 또는 이종접합체일 수 있다. 이들 식물을 추가의 교배에 사용하여 상기 대립유전자를 단일 단위로서 다른 토마토 식물로 전달하여, 예를 들어 잡종 또는 순계교배를 생성시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서 커플링 상의 Mi-1 및 Ty-1 대립유전자, 및 감수성, 또는 Mi+ 및 Ty+ 대립유전자를 상동 염색체 상에 포함하는 잡종 식물을 제공한다. 이들 식물은 상기 대립유전자가 동종 접합체 상태로 존재하는 경우 Mi-1 및 Ty-1 대립유전자와 통상적으로 관련된 유전적 장애 증상이 현저하게 감소되었거나 없는 이점을 갖는다.

유전적 장애 증상은 Mi-1 및 Ty-1 대립유전자가 없는 식물에 비해, 자기 괴사, 보다 긴 마디사이 길이, 보다 작은 열매, 보다 적은 열매 맺음 및 원예학적으로 열등한 구조의 군 중에서 선택된 1종 이상의 증상을 지칭한다. 당해 분야의 숙련가들은 유전적 장애의 상기와 같은 증상들이 재배가에 의한 순계교배 또는 잡종 식물 계통의 상업적인 허용에 불리한 영향을 미칠 것임을 인식할 것이다. 일반적으로는, 유전적 장애의 불리한 수준의 존재는 상기 식물 계통이 상업적으로 허용될 수 없어지는 정도로 상기 증상들 중 1종 이상의 존재에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 토마토 식물은 약 0.25 미만, 바람직하게는 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.1 미만 또는 약 0.05 미만, 예를 들어 0.03 또는 0.02의 평균 선충류 내성 점수를 포함한다. 또한, 상기 식물은 TYLCV에 대해 내성을 나타내며 상기 개시된 분석에서 측정된 바와 같이 1.0 이하의 평균 TYLCV 내성 점수를 갖는다.

다른 선충류 및 TYLCV 내성 대립유전자를 포함하는 식물

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 재조합체의 제조 및/또는 선택 방법뿐만 아니라 1종 이상의 Mi 내성 대립유전자 및 1종 이상의 TYLCV 내성 대립유전자를 커플링 상(시스)으로 갖는 다른 재조합체, 바람직하게는 라이코페르시콘 에스큘렌튬의 염색체의 제조 및/또는 선택 방법을 제공한다. 상기와 같은 식물은 본 발명에 개시된 내성 분석을 사용할 때, 멜로이도지네 아레나리아, 멜로이도지네 인코그니타 및/또는 멜로이도지네 자바니카 종의 선충류에 대한 높은 내성, 중등도의 내성 또는 보통 내성을 나타내고 TYLCV에 대한 내성 또는 중등도의 내성을 나타냄을 특징으로 한다. 상기 방법을 사용하여 제조한 재조합 사건뿐만 아니라 상기 식물의 조직, 세포, 종자 및 열매, 및 Mi 및 Ty 내성 대립유전자를 시스로 포함하는 잡종 또는 순계교배 식물을 생성시키기 위한 상기 식물들 중 임의의 식물의 용도를 또한 제공한다. 그러나, 종래 기술(미국 특허 제 6,414,226 호)에서 이미 우연히 자연적으로 나타났지만, 본 발명에 따라 제조되지 않은, 라이코페르시콘 칠렌세로부터의 Mi-J 대립유전자를 Ty-1 대립유전자와 커플링 상으로 포함하는 식물은 명백히 제외된다. 임의의 경우에, 라이코페르시콘 칠렌세로부터의 Mi-J 대립유전자를 Ty-1 대립유전자와 함께 커플링 상으로 갖는 식물은 높은 수준의 선충류 내성을 나타내지 않는다, 즉 본 발명에서 정의된 바와 같이 고도의 내성을 나타내지 않는다. 따라서, TYLCV에 대한 내성 및 선충류에 대한 높은 내성을 부여하는 식물이 특히 바람직하다.

하나의 실시태양에서, 본 발명은 근류선충에 대한 내성을 부여하는 대립유전자와 함께 TYLCV에 대한 내성을 부여하는 대립 유잔자를 커플링 상으로 포함하는 토마토 식물의 제조에 관한 것이다. TYLCV에 대한 내성을 부여하는 대립유전자 및 근류선충에 대한 내성을 암호화하는 대립유전자는 원래 상이한 생식질 출처(즉 상이한 토마토 종), 예를 들어 비제한적으로 라이코페르시콘 에스큘렌튬, 라이코페르시콘 세라시포르메, 라이코페르시콘 핌피넬리폴륨, 라이코페르시콘 치스마니, 라이코페르시콘 파르비플로룸, 라이코페르시콘 크미엘레브스키, 라이코페르시콘 히르수툼, 라이코페르시콘 펜넬리, 라이코페르시콘 페루비아늄, 라이코페르시콘 칠렌세 또는 솔라늄 라이코페르시코이데스(solanum lycopersicoides)로부터 유래한다.

따라서, 하나의 실시태양에서, 2개의 유전자 좌에서 1종 이상의 TYLCV 내성 대립유전자 및 1종 이상의 근류선충 내성 대립유전자를 커플링 상으로 포함하는 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물의 제조 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 (a) TYLCV 내성 대립유전자를 포함하는 라이코페르시콘 식물을 근류선충 내성 대립유전자를 포함하는 라이코페르시콘 식물과 교배하는 단계, (b) 1가지 이상의 분자 분석을 사용하여 상기 각각의 2개의 유전자 좌에서 상기 내성 대립유전자들의 존재에 대해 상기 교배의 자손들을 분석하는 단계, 및 (c) 상기 내성 대립유전자들을 커플링 상으로 포함하는 하나 이상의 식물을 선택하는 단계를 포함한다.

내성 분석을 상기 방법 중 임의의 단계에서 임의로 수행할 수 있다. 추가의 임의의 단계 (d)는 상기 수득된 식물을 자가 수분하거나 또는 또 다른 토마토 식물과 교배하여 잡종 식물을 생성시킴을 포함한다. 바람직한 실시태양에서 상기 방법에 의해 수득한 식물은 TYLCV에 대해 내성을 나타내고 선충류에 대해 높은 내성을 나타낸다(정의된 바와 같이).

단계 (a)의 출발 식물을 실시예에 개시된 바와 같은 병리학 시험을 사용하여 선택할 수 있다. 상기는 야생형이거나 배양된 식물, 또는 변형 식물, 예를 들어 돌연변이되거나 형질전환된 식물일 수 있다. 예를 들어, TILLING(표적화 유도된 국소 병변 IN 게놈학; McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18:455, 및 McCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442) 또는 ECOTILLING(Henikoff et al 2004, Plant Physiology Preview May 21, 2004)을 사용하여 Ty 또는 Mi 유전자 좌의 대립유전자에서 개질된 병원체 내성 및/또는 돌연변이를 갖는 식물을 발생시키고/시키거나 선택할 수 있다. 이어서 이들 식물을 Ty 및 Mi 내성 대립유전자의 출처로서 사용할 수 있다.

이어서 상기 교배의 자손을 본 발명에 따른 1가지 이상의 분자 분석(하기 개시됨)을 사용하여 분석한다. 상기 분석된 자손 및 이로부터 선택되는 식물은 목적하는 교배/선택 안 및 사용되는 식물 중에 존재하는 대립유전자에 따라 다양한 세대, 예를 들어 F2, F3 세대 등, 역교배 세대(BC1, BC2 등)의 자손들 중 임의의 것일 수 있다. 상기 분자 분석을 바람직하게는 F2 식물상에서 수행한다. 또한, 상이한 세대의 자손들을 병리학 분석 및/또는 1가지 이상의 분자 분석을 사용하여 반복 시험할 수 있다. 다수의 분자 분석들을 하나의 세대에서 수행하거나, 또는 1가지 이상의 상이한 분석들을 상이한 세대에서 수행할 수 있다. 따라서, 단계 (a), (b) 및/또는 (c)를 수회 반복할 수 있다. 목표는 목적하는 Ty 및 Mi 내성 대립유전자를 커플링 상으로 포함하는 재조합체를 동정하는 것이다(단계 c). 이러한 방법에서, 임의의 Ty 내성 대립유전자를 임의의 Mi 내성 대립유전자와 결합(커플링 상으로)시킬 수 있다.

상기 식물들을 예를 들어 Ty- 및 Mi- 유전자 좌 또는 그 부근의 핵산 서열을 근거로, 분자 분석을 사용하여 다른 식물들과 구별할 수 있다. 이러한 분석은 이들 2개의 유전자 좌에서의 상기 대립유전자 구성을 측정할 수 있게 한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 식물은 Mi 유전자 좌 부근의 서열식별번호: 8, 또는 이와 필수적으로 유사한(및 Mi 유전자 좌에서 Mi 내성 대립유전자를 가리키는) 핵산 서열 및 또한 Ty 유전자 좌 부근의 서열식별번호: 10 또는 이와 필수적으로 유사한(및 결합된 Ty 유전자 좌에서 Ty 내성 대립유전자를 가리키는) 핵산 서열을 포함하며, 이에 의해 상기 부위들은 커플링 상으로 결합된다. 바람직하게는 본 발명의 다른 곳에 개시된 바와 같은 1가지 이상의 PCR 기본 분석을 사용하여 Mi 및 Ty 유전자 좌에서 상이한 유전자형들을 식별하고 목적하는 대립유전자를 커플링 단계로 갖는 재조합체 식물을 선택한다.

Mi 및 Ty 내성 대립유전자를 커플링 상으로 포함하는 재조합체 식물의 선택 및 상기 단일 멘델 법칙 단위의 다른 식물 내로의 유전자 이입을 분자 생물학, 식물 병리학 및 전통적인 육종 기법의 조합을 사용하여 성취할 수 있다. 바람직한 접근법에서, 본 발명은 분자 생물학 기법을 사용하여 Ty 및 Mi 유전자 좌에서 상이한 대립유전자들을 식별하여 TYLCV 내성 및 근류선충 내성에 바람직한 대립유전자들을 배양된 토마토의 게놈에 시스로 결합시킨다. 본 발명은 상기 소질들과 전형적으로 관련된 유전적 장애를 차폐시키는 식물 육종가의 능력을 향상시키고, Ty 및 Mi 내성을 라이코페르시콘 , 클라도스포륨에 대한 내성 유전자 또는 상기 유전자 군에 존재하는 내성 유전자들과 자유롭게 결합시키면서, TYLCV 및 근류선충 모두에 대한 다중 내성을 갖는 토마토 잡종의 육종을 촉진시킨다.

예로서, 비제한적으로, 본 발명은 임의의 Ty 내성 대립유전자와 임의의 Mi 내성 대립유전자를 커플링 상으로, 바람직하게는 염색체 6 상에 위치한 시스의 동시-유전되는 단위로서 포함하는 토마토 생식질의 개발을 제공한다. 일단 높은 수준의 내성(예를 들어 Ty-1 및 Mi-1에 의해 제공되는 내성 수준에 필적할만한)을 갖는 식물이 동정되었으면, 본 발명에 개시된, 상기 Mi 및 Ti 유전자 좌에 가깝게 결합된 핵산 부위들을 서열화하고 상기 서열 정보(상기 결합된 마커 부위의)를 사용하여 상기 식물에서 발견되는 대립유전자들에 대한 분자 분석을 개발할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들에게 자명한 바와 같이, 다양한 생식질에서 Mi 또는 Ty 내성 대립유전자를 동정하기 위한 또 다른 방법이 존재한다. 상기와 같은 방법에 대한 추가의 상세한 설명을 하기에 제공한다.

앞서 언급한 바와 같이, 본 발명은 분자 생물학, 식물 병리학 및 전통적인 육종 기법의 조합을 사용한다. 하나의 실시태양에서, 사용되는 분자 생물학 기법은 예를 들어 상기 Mi 및/또는 Ty 유전자 좌에 결합된 핵산 부위를 하이브리드화(및 증폭)하는 핵산 프라이머를 사용하는 마커 분석(하기에 보다 상세히 논의될 것이다)을 포함한다. 본 발명은 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자를 수반하는, 실시예에 개시된 특정 분석뿐만 아니라, TYLCV에 대한 내성을 암호화하는 임의의 대립유전자를 근류선충에 대한 내성을 암호화하는 임의의 대립유전자와 커플링 상으로 토마토에 유전자 이입시키기 위해 개발되고 사용될 수 있는 임의의 분석을 고려한다. 예를 들어, 본 발명은 Ty 및/또는 Mi 유전자 좌의 임의의 변종(예를 들어 오르토로그(ortholog) 또는 진화 상 분기된 천연 대립유전자 또는 돌연변이에 의해 발생된 대립유전자)의 토마토 내로의 유전자 이입 및 상기 대립유전자들을 시스로 포함하는 식물의 발생을 고려한다.

개시된 방법들 중 임의의 방법에 의해 수득할 수 있는 식물 및 또 다른 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물과의 교배에서 모체로서의 상기 식물의 용도를 또한 본 발명에 제공한다. 본 발명은 결코 토마토의 1종 이상의 특정한 변종에 대해 기술적으로 제한되지 않으며, 토마토 식물(순계교배, 잡종 등 포함)에 일반적으로 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 분자 분석

Ty 유전자 좌에서 Ty-1과 Ty+의 존재 또는 부재, 및 식물의 Mi 유전자 좌에서, Mi-1, Mi-J 및/또는 Mi+를 식별하는 다수의 분자 분석들을 본 발명에 제공한다. 이들 분석 중 1가지 이상을 마커-지원된 선택에, 즉 상기 Mi 및 Ty 유전자 좌에서 식물의 대립유전자 구성을 측정하고 목적하는 Mi 및 Ty 내성 대립유전자를 커플링 상으로 갖는 식물을 선택하는데 사용할 수 있다. 유사한 분석들이 통상적인 분자 생물학 기법을 사용하여 임의의 Mi 및 Ty 내성 대립유전자들에 대해 개발될 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 7 내지 9(또는 변종 핵산 서열) 또는 서열식별번호: 10 또는 11(또는 그의 변종)의 10, 12, 14, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 30 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 중 임의의 단편을 사용하여 PCR 프라이머 쌍 또는 핵산 하이브리드화용 탐침을 디자인하고 상기와 같은 프라이머 쌍에 의해 증폭된 부위의 핵산 정보 또는 상기와 같은 탐침이 하이브리드화하는 핵산 서열의 핵산 정보를 근거로 하는 식별용 분자 분석을 개발할 수 있다. 개발된 분석의 정확한 유형은 상기가 Mi 및/또는 Ty 유전자 좌에서 Mi 내성 대립유전자와 Ty 내성 대립유전자 및 동종 접합체/이종접합체를 식별할 수 있는 한 중요하지 않다. 다양한 유형의 분석 예를 하기 및 실시예에 제공한다.

본 발명의 방법에서 상기 마커 지원된 선택을 수행하기 위해서, 실험 대상 토마토 식물 또는 식물 부분에 대해 예를 들어 먼저 DNA 추출을 수행하며, 상기의 기법은 당해 분야에 공지되어 있다(Hnetkovsky et al., Crop Sci., 36(2):393-400(1996) 참조). 일단 추출이 완료되면, 분자 분석, 예를 들어 비제한적으로 절단 증폭된 다형 서열(CAPS) 분석(Akopyanz et al., Nucleic Acid Research, 20:6221-6225(1992) 및 Konieczny & Ausubel, The Plant Journal, 4:403-410(1993)) 또는 SCAR 분석을 수행할 수 있다. SCAR 분석은 DNA를 유전자 좌(예를 들어 Ty 유전자 좌 또는 Mi 유전자 좌 부근의 특정한 유전자 좌)에서 PCR에 의해 증폭시킨 다음 제한 효소에 의해 절단함을 포함한다. 핵산 서열들간의 다형성은 예를 들어 상이한 크기의 제한 단편들을 생성시킴으로써 상이한 대립유전자들(예를 들어 비제한적으로 Mi+, Mi-J 및/또는 Mi-1 대립유전자)을 차별화한다.

핵산 프라이머 및 효소를, 토마토 식물의 게놈 중의 Ty 및/또는 Mi 유전자 좌에 대립유전자가 존재하는지를 확인하고 대립유전자가 존재하는 경우, 상기 대립유전자가 동종 접합 상태인지 이종접합 상태인지를 확인하기 위해 상기 분석에 사용한다. 상기 두 유전자 좌로부터 획득한 정보를 사용하여 Ty 및 Mi 유전자 좌에서 특정한 대립유전자 조합을 커플링 상(즉 시스)으로 갖는 식물들을 동정한다.

마커 지원된 선택 시험을 생성시키기 위해서, 당해 분야의 숙련가는 공여체 출처(즉 질병 내성 소질을 함유하는 생식질)로부터의 DNA 서열을 수용체 출처(즉 특정한 병원체에 대한 감수성 '+' 대립유전자를 함유하는 생식질)와 비교함으로써 출발한다. 한편으로, 상기 공여체 및 수용체로부터의 DNA들 간의 서열 비교를 관심 소질에 유전자에 의해 긴밀하게 결합된 게놈 내의 상응하는 위치들에서 수행할 수 있다. Ty 및 Mi 유전자 좌의 경우, 이들 소질 부근의 다형성의 확인은 당해 분야에 공지되어 있다(Zamir et al., Theor. Appl. Genet. 88:141(1994) 및 Williamson et al., Theor. Appl. Genet. 87:757(1994) 참조). Ty-1 대립유전자의 경우, 자미어 등은 제한 단편 길이 다형성(RFLP) TG97을 발견하였으며, 이는 탠스클리(Tanskley et al., Genetics 132:1141(1992))에 의해 상기 Ty 유전자 좌에 긴밀히 결합하는 것으로 최초로 지도화되었다. 유사하게, 윌리암슨(Williamson) 등은 상기 Mi 유전자 좌와 긴밀하게 결합되는 REX-1 유전자 좌를 발견하였다.

하나의 실시태양에서, 사용되는 분자 분석은 실시예들에 나타낸 바와 같이, SCAR 분석, 또는 다수의 SCAR 분석이다. 예를 들어 서열식별번호: 10은 라이코페르시콘 칠렌세 LA1969로부터의 Ty-1 대립유전자 부근의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 서열식별번호: 11은 TG97 유전자 좌에서 라이코페르시콘 에스큘렌튬으로부터의 야생형 Ty+ 대립유전자 부근의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 도 1은 이들 2개의 서열 사이에 존재하는 다수의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 강조하는, 상기 서열들간의 비교를 나타낸다. SNP는 통상적으로 INDELS라 명명되는 치환, 삽입 또는 결실 돌연변이체일 수 있다. 상기 대립유전자들간의 다형성을 사용하여, 당해 분야의 숙련가들은 상기 SNP에 대해 임의의 수의 마커 지원된 분석 및 프라이머(또는 탐침)를 개발할 수 있음을 인식할 것이다. 상기와 같은 분석을 사용하여 감수성 Ty+ 대립유전자로부터 내성 Ty-1 대립유전자를 구별할 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 1 및 2의 프라이머 쌍은 약 398 bp의 단편을 증폭시킨다(예를 들어 주형으로서 게놈 토마토 DNA를 사용하는 PCR 증폭을 사용하여). 상기 증폭 산물의 효소 TaqI(서열 T↓CGA를 인식하고 제한한다)와의 후속 배양은 상기 Ty-1 대립유전자를 포함하는 식물로부터 증폭된 398 bp 산물을 약 95 bp 및 약 303 pb의 2개의 핵산 단편으로 절단한다. 따라서 Ty-1에 대한 식물 동종 접합성은 상기 2개의 단편(예를 들어 젤 상에서 밴드로서 또는 달리 가시화된다)을 생성시키는 반면, Ty+ 대립유전자에 대한 식물 동종 접합성은 약 398 pb의 단일 단편을 생성시킬 것이다. 이종접합성 식물(Ty-1/Ty+)은 모두 3개의 단편을 생산한다.

유사한 방식으로, 문헌[Williamson et al., Theoretical and Applied Genetics 87:757-763(1994)]에 공개된 데이터를 근거로, 라이코페르시콘 에스큘렌튬, 라이코페르시콘 페루비아늄 및 라이코페르시콘 칠렌세의 폴리뉴클레오타이드 서열을 REX-1이라 칭하는 Mi 부근의 유전자 좌에서 측정하였다. 이들 3종의 폴리뉴클레오타이드 서열을 서열식별번호: 7(Mi+에 특이적임), 8(Mi-1) 및 9(Mi-J)로 제공한다. 이들 폴리뉴클레오타이드 서열의 비교를 도 2에 나타내며, 이는 이들 3종의 서열 사이의 20 개의 SNP를 밝혀낸다.

본 발명에 개시된 SCAR 분석을 쉽게 변형시키거나 다른 분자 분석으로 대체시킬 수 있으며 Ty- 및/또는 Mi-유전자 좌의 임의의 대립유전자에 대해서 쉽게 개발할 수 있음은 물론이다. 또한, 상기 분석은 SNP보다 다른 다형성, 예를 들어 2개 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 기본으로 할 수 있다.

이미 언급한 바와 같이, 서열식별번호: 7 내지 11의 전부 또는 일부, 또는 그의 임의의 변종의 전부 또는 일부, 또는 게놈 내의 인접 부위에 하이브리드화하고 이를 증폭시키는 특이적인 또는 변성 프라이머를 디자인할 수 있다. 한편으로, 상기 프라이머를 상기 내성 대립유전자의 일부를 직접 증폭하거나 또는 Mi 및 Ty 유전자 좌 부근의 다른 핵산 부위를 증폭하도록 디자인할 수 있다. 더욱이, 경우에 따라, 본 발명의 프라이머를 당해 분야에 공지된 기법, 예를 들어 비제한적으로 미국 특허 제 5,464,746, 5,424,414 및 4,948,882 호에 개시된 기법들을 사용하여, 다른 마커 지지된 선택 분석, 예를 들어 비제한적으로 TaqMan(등록상표) 분석(Applied Biosystems, Foster City, CA)에 사용하기 위해 변형시킬 수 있다.

새로운 Ty 또는 Mi 내성 대립유전자를 식별하기 위한 새로운 분자 시험을 디자인하기 위해서, 당해 분야의 숙련가들은 예를 들어 먼저 상기 Mi 또는 Ty 유전자 좌상의 또는 그 부근의 마커 유전자 좌에서 DNA 서열을 측정하고(예를 들어 본 발명에 개시된 PCR 증폭 및 프라이머 쌍을 사용하고 증폭 산물을 서열화하여), 이어서 상기 서열을 다른 마커 서열(상기 Mi 또는 Ty 유전자 좌의 다른 대립유전자상의 또는 그 부근의)의 상응하는 DNA와 비교할 것임을 인식한다. 이러한 DNA 비교를 사용하여, 당해 분야의 숙련가들은 새로운 서열 다형성을 확인하거나 또는 다른 비교에 의해 이전에 밝혀지지 않은 기존의 다형성이 남아있는지의 여부를 확인할 수 있다. 이러한 데이터를 사용하여, 새로운 분자 시험을 디자인하거나 또는 함께 시스 상으로 존재하는 상기 Ty 및 Mi 유전자 좌의 임의의 대립유전자 조합의 선택을 용이하게 하는 기존의 시험을 사용할 수 있다.

상술한 바와 유사한 방법들을 사용하여 근류선충에 대한 내성을 암호화하는 대립유전자를 선택 및/또는 유전자 이입할 수 있다. 예로서, 비제한적으로, 토마토 식물의 게놈 중의 Mi-1 대립유전자의 존재를 측정하기 위한 분석을 개시할 것이다. 상기 Mi-1 대립유전자의 존재를 측정하기 위한 분석을 앞서 개시한 Ty-1 대립유전자의 동정에 사용된 바와 유사한 방식으로 결정할 수 있다. 그러나, 조사 중인 식물이 Mi-J 대립유전자를 함유할 수도 있다는 의심이 가는 경우, 상기 식물의 게놈 중의 상기 Mi-1 대립유전자의 존재에 대한 확인은, 필수적인 것은 아니지만, 2종의 분자 분석, 예를 들어 실시예에 개시된 것들을 포함할 수도 있다. 어쨌든, 이들 분석을 수행하는 순서는 중요하지 않다.

상술한 분석들을 육종 프로그램에 개별적으로 또는 집합적으로 사용하여 Ty-내성 대립유전자와 Mi 내성 대립유전자를 커플링 상으로 함유하는 토마토 식물의 육종 및/또는 선택을 촉진시킬 수 있다.

이들 방법을 어떻게 사용하는가에 대한 하나의 비제한적인 예를 하기에, Mi-1 및 Ty-1을 커플링 상으로 포함하는 식물의 선택에 대해 개시한다. 1차 토마토 순계를 2차 토마토 순계와 교배하여 잡종 식물을 생산할 수 있다. 상기 교배에 사용된 하나의 토마토 식물은 Ty-1 대립유전자를 함유하였고 두 번째 식물은 게놈 내에 Mi-1 대립유전자를 함유하였다. 이어서 생성 식물(F1 잡종)을 자가수분하고, 비료를 주고, 씨(F2 종자)를 뿌리도록 한다. 상기 F2 식물은 상기 F2 종자로부터 증식한다(또는 추가로 자가수정하거나 교배한다, 예를 들어 모체 중 하나에 역교배한다). 이어서 상기 식물에 DNA 추출(상기 기법은 당해 분야에 공지되어 있다, Hnetkovsky et al., 1996, Crop Sci., 36(2):393-400 참조)을 수행하고 PCR을 분쇄된 조직 샘플 상에서 직접 수행한다.

따라서, 상술한 분석을 사용하여 이종접합체 상태의 Ty-1 대립유전자 및 동종접합체 상태의 Mi-1을 함유하는 F2 식물(또는 다른 자손)을 동정할 수 있다. 한편으로, 동종접합체 상태의 Ty-1 대립유전자 및 이종접합체 상태의 Mi-1 대립유전자를 함유하는 F2 식물을 동정할 수 있다. 따라서, 1가지 이상의 분자 분석, 예를 들어 상술한 SCAR 분석을 사용하여, Ty-1 및 Mi-1을 커플링 상으로 포함하는 재조합체 식물을 동정할 수 있다.

상기 Ty와 Mi 유전자 좌간의 재조합이 낮기 때문에, F2 세대에서 재조합체를 발견한다는 것은 드문 일이다. 본 발명에 개시된 분석들을 또한 사용하여 상기 Ty-1 및/또는 Mi-1 대립유전자가 동종접합체 또는 이종접합체 상태로 상기 식물의 게놈 중에 존재하는지를 측정할 수 있다. 상기 분석(들)의 결과에 따라, 추가의 육종 및 분자 특성화가 필요할 수도 있다. 예를 들어, 상기 육종 프로그램의 목적이 순계를 생산하는 것이고 시험되는 특정 토마토 식물에 대한 상술한 분석들 중 1가지 이상의 분석의 결과가 상기 식물이 그의 게놈 내에 동종접합체 상태의 Mi-1 대립유전자 및 이종접합체 상태의 Ty-1 대립유전자를 함유함을 밝혀낸 경우, 상기 식물 및 그의 자손이 자가수분 후 그의 게놈 내에 동종접합체 상태 하의 Mi-1 대립유전자 및 Ty-1 대립유전자를 모두 함유하는 것으로 측정될 때까지, 상기 식물에 본 발명에 개시된 분석들 중 1가지 이상의 분석을 사용하여 추가의 자가 수정, 육종 및/또는 분자 특성화를 가할 수 있다. 일단 상기 Mi-1 및 Ty-1 대립유전자가 커플링 상 또는 시스로 생성되었으면, 이들은 함께 유전될 것이다. 이러한 다중 내성 대립유전자의 유전성 블록은 식물 육종가에게 2차 순계교배 모체에 의한 야생 종 유전자 이입의 유전적 장애 결과를 차폐시키는 능력을 또한 허용하면서 새로운 잡종의 생산 용이성을 제공한다. 또한, 다른 내성 유전자들, 예를 들어 오이듐 및 클라도스포륨 내성 유전자들과의 용이한 조합도 가능하다.

상기 간단히 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용하여 신규의 우수한 순계를 생산시킬 수 있다. 이러한 순계를 후속의 육종에 사용하여 TYLCV 및 근류선충에 대해 내성을 나타내고 또한 다른 상업적으로 바람직한 특성들을 갖는 잡종 토마토 식물을 생산할 수 있다. 상기와 같은 순계는 상기 계통이 빠른 육종을 촉진시키는 단일의 동시-유전성 단위로서 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자의 전달을 허용하기 때문에 육종에 유용하다. 더욱이, 상술한 방법들은 또한 순계가 실제로 그의 게놈 중에 동종접합체 상태로 Ty-1 대립유전자 및 Mi-1 대립유전자를 함유하고 그의 동종접합성을 유지하는지를 확인하는데 유용하다. 일단 상기 확인이 이루어졌으면, 상기 순계를 2차 순계와의 교배에 사용하여 상기 Ty-1 대립유전자 및 Mi-1 대립유전자를 단일 동시-유전성 단위로서 잡종 토마토 식물로 전달할 수 있다. 상기 2차 순계는 야생형 대립유전자 Ty+ 및 Mi+를 운반하여 유전적 장애의 결과를 차폐시킬 수 있다.

본 발명에 따른 키트

더욱 추가의 실시태양에서, 상기 Mi 및/또는 Ty 유전자 좌에서 상기 대립유전자 조성을 측정하기 위한 분자 분석을 제공한다. 상기와 같은 분석은 1종 이상의 토마토 식물로부터 DNA를 추출하고, 하나 이상의 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 상기 Mi 및/또는 Ty 유전자 좌에 또는 상기 유전자 좌 상에 결합된 DNA의 부분을 증폭시키고, 임의로 상기 증폭 산물을 1종 이상의 제한 효소로 제한하고, 상기 DNA 단편을 가시화함을 포함한다.

상기 Mi 유전자 좌 및 Ty 유전자 좌에서 식물 또는 식물 조직의 대립유전자 구성을 측정하기 위한 검출 키트를 또한 제공한다. 상기와 같은 키트는 하나 이상의 프라이머 쌍, 예를 들어 서열식별번호: 1 및 2, 서열식별번호: 3 및 4 및/또는 서열식별번호: 5 및 6, 또는 이들의 변형을 포함한다. 더욱이, 설명서 및 임의로 식물 물질 또는 DNA(예를 들어 대조용 조직의 것)를 포함시킬 수 있다.

본 발명의 다양한 예시적인 실시태양을 도면을 참고로, 하기에 상세히 개시할 것이며, 도면에서:
도 1은 폴리뉴클레오타이드 서열들 사이에서 19종의 단일 뉴클레오타이드 다형태들에서 어두운 네모로 나타낸 Ty+(서열식별번호: 11) 및 Ty-1(서열식별번호: 10) 대립유전자 부근의 마커 유전자 좌의 폴리뉴클레오타이드 서열들의 비교 및 동정을 나타낸다. 원은 Ty-1 서열의 염기 쌍 97-98 및 Ty+ 서열의 96-97에서의 2종의 인접한 다형태들을 나타내며, 이때 TaqI 제한 효소 인식 부위는 단지 Ty-1 대립유전자에만 존재한다.
도 2는 폴리뉴클레오타이드 서열들 사이에서 20종의 단일 뉴클레오타이드 다형태들에서 어두운 네모로 나타낸 Mi+, Mi-1 및 Mi-J 대립유전자 부근의 마커 유전자 좌의 폴리뉴클레오타이드 서열들의 비교 및 동정을 나타낸다. 원은 염기 쌍 603 및 754에서의 다형태들을 나타낸다.
도 3은 Mi 유전자 좌의 다양한 대립유전자 조합들을 포함하는, 5종의 식물 유전자형의 평균 선충류 내성 평가를 나타낸다.

선충류 내성에 대한 효능 평가

FDR16-2045 계통은 미국 특허 제 6,414,226 호의 주제이다. 상기는 Ty 유전자 좌에서 Ty-1 대립유전자를 함유하며; 상기 대립유전자의 기원은 현대 토마토 라이코페르시콘 에스큘렌튬의 야생 일가인 라이코페르시콘 칠렌세로부터의 유전자 이입이었다. 상기 Ty-1 대립유전자는 상업적으로 중요한 병원체인 토마토 황화 잎 마름 바이러스(TYLCV)에 대한 내성을 부여한다. 상기 유전자 이입과 함께 유전된, FDR16-2045 계통은 Mi 유전자 좌의 부근에 Mi-J 대립유전자를 함유한다. 상기 Mi-J 대립유전자는 또 다른 상업적으로 중요한 병원체인 근류선충에 대한 내성을 부여한다.

육종 및 병리학 실험에서 상기 Mi-J 대립유전자에 의해 부여된 내성 수준은 Mi 유전자 좌에 또 다른 대립유전자 Mi-1이 있는 만큼 근류선충에 효능이 있지 않다. 이는 상기 Mi-J 대립유전자가 라이코페르시콘 에스큘렌튬으로부터의 '+' 유형 감수성 대립유전자와 쌍을 이룬 이종접합체 상태로 존재하는 경우 특히 명백하였다. 따라서, 본 발명에 개시된 일련의 병리학 실험은 상기 Mi-1 및 Mi-J 내성 대립유전자를 사용하여 내성 수준을 정량화한다.

실시예 1

멜로이도지네 인코그니타에 대한 내성을 측정하기 위한 병리학 시험

살아있는 병원체 분석을 사용하여, 토마토에서 근류선충 질병의 원인체인 멜로이도지네 인코그니타에 대한 내성을 평가하였다. 상기 내성 평가는 혹 형성의 정도 및 크기를 근거로 한다. 표 1은 근류선충 내성을 측정하기 위한 평가 등급 시스템을 제공한다. 0에서 4까지의 등급을 사용하여(표 1) 멜로이드지네 인코그니타의 질병 증상을 기록하였다.

평가 등급	증상의 중증도
0	혹이 존재하지 않음
1	1 내지 2개의 작은 혹(<1 MM)
2	약간의 혹(3-7), 크기가 작음(<1 MM), 퍼졌음
3	여러 개의 혹(>7), 크기가 보다 큼(>1 MM), 퍼졌음
4	많은 수의 혹, 사슬 형, 기형의 혹

멜로이도지네 인코그니타 접종물을 2개월 동안 감수성 토마토 계통의 식물에 감염시켜 제조하였으며; 이때, 상기 감염된 식물의 뿌리는 상기 병원체로부터 성숙한 알 덩어리를 보인다. 뿌리를 접종물 제제에 대해 수확하고 4 내지 5 센티미터 조각으로 절단하였다. 상기 시험은 종자를 감염된 접종물의 존재 하에서 발아시킨다. 상기 종자를 토탄 질석과 모래의 토양 혼합물(각각 4:1:1의 비)을 함유하는 온실 모판 상자에 뿌린다. 한 계통의 종자를 대략 4 ㎝ 떨어진 열로 파종하였으며, 상기 열들 사이의 거리는 4.5 내지 5 ㎝이었다. 접종을 위해 각 열 사이에 대략 12 ㎝ 간격으로 작은 구멍들을 만들었다. 이러한 구멍 내에, 2 또는 3 조각의 상기 제조된 접종물을 삽입하고 토양으로 덮었다. 한 열의 양편에 상기 접종물을 교번 이격시켰으며, 각각의 종자는 상기 접종물로부터 대략 6 내지 7 ㎝의 거리에 있었다. 상기 묘종을 발아시키고 온실에서 22 내지 26 ℃의 일상의 온도로 증식시켰다. 파종 후 28일째에 각 식물을 뽑아내고 혹의 존재에 대해 뿌리를 검사함으로써 평가를 수행하였다.

시험을 육종 계통, 잡종 및 대조용 계통을 사용하여 중복 수행하였다. 선충류 내성에 대한 병리학 시험 결과를 하기 표 2 및 2a에 나타낸다.

[표 2a]

좌측 컬럼에는 시험된 계통들의 명칭이 있다. 이들은 육종 계통, 잡종 계통 및 대조용 계통을 함유하는 구획들로 구성된다. 옆의 컬럼에는 Mi 및 Ty 유전자 좌의 유전자형들이 나열된다. 이들 유전자형을 본 발명에 개시된 분자 마커 시험에 의해 측정하였다. 다음 일련의 5개 컬럼은 2 개의 별도의 경우들에 대해 득점한 시험의 평가 점수를 함유한다. 최종 5개의 컬럼은 상기 두 시험의 결과를 합한 것이다.

14개의 샘플이 존재하기 때문에, Ty 및 Mi 유전자 좌에서 다양한 유전자형을 사용하는 경우 표 2의 성능 경향을 인지하기가 어려울 수 있다. 상기 14개의 샘플들 중에서, Mi 유전자 좌에는 단지 5종의 유전자형만이 있다. 하나의 유전자 형은 라이코페르시콘 에스큘렌튬으로부터의 감수성 대립유전자에 대한 동종 접합체이다. 이를 +/+로 표시한다. 두 번째 유전자형은 감수성 '+' 대립유전자와 쌍을 이룬 Mi-J 대립유전자를 갖는 이종접합체이다. 세 번째 유전자형은 동종접합체 상태의 Mi-J 대입유전자를 갖는다. 네 번째 및 다섯 번째 유전자형은 각각 '+' 대립유전자와 동종접합체 및 이종접합체로서 존재하는 Mi-1 대립유전자를 함유한다.

표 2의 데이터를 Mi 유전자 좌의 표현형에 따라 요약하고 평균하는 경우, 선충류 내성에 대한 상이한 대립유전자 조합의 효능은 분명해진다(도 3). 도 3에서, 표 2에서 발견되는 유전자형에 대한 평균 질병 평가를 제공한다. 표 2의 계통들을 Mi 유전자 좌에서의 유전자형에 따라 분석하였다. 이들 유전자형 부류를 Y 축에 나타낸다. X 축은 상기 5종의 유전자형 부류에 대한 평균 질병 등급을 제공한다.

도 3은 원래 라이코페르시콘 페루비아늄으로부터 유전자이입된 Mi-1 대립유전자가 가장 강한 선충류에 대한 내성 수준을 부여함을 나타낸다. 상기 내성은 상기 Mi-1이 이종접합체(감수성 '+' 대립유전자를 가짐)로서 존재하든 동종접합체로서 존재하든 간에 관계없이 강한 것이 또한 분명하다. 이는 상기 Mi-1 대립유전자가 우성 방식으로 내성을 부여함을 입증한다. 다른 유전자형에 비해, 유전자형 Mi-1/Mi-1 및 Mi-1/+는 선충류 내성에 대해 높은 내성을 나타내는 표현형을 부여한다. 이러한 "고도로 내성"인 부류는 본 발명에 개시된 방법에 의해 측정 시 0.1 미만의 평균 내성 점수를 갖는 것으로서 정의된다.

다음으로 가장 높은 내성을 나타내는 부류는 라이코페르시콘 칠렌세로부터 유전자이입된, 동종접합체 상태의 Mi-J 대립유전자를 갖는 계통으로부터의 것이다. 상기 부류의 내성을 "중등도의 내성"으로서 정의하며, 이는 0.1 이상 1.0 미만의 평균 득점 범위 내에 있다. 따라서 순계 FDR16-2045는 중등도의 내성을 나타내는 것으로서 기록된다.

"보통 내성"으로서 정의되는 세 번째 내성 부류는 감수성 대립유전자('+')와 쌍을 이루는, 이종접합체 상태의 Mi-J 대립유전자를 갖는 계통에 의해 예시된다. 상기 부류는 1.0 이상 2.0 미만의 평균 내성 등급을 갖는다. 순계 FDR16-2045를 순계교배 모체로서 사용하여 잡종 재배종을 생산하는 경우, 및 두 번째 모체가 감수성 '+' 대립유전자를 함유하는 경우, 상기 잡종은 단지 적당한 내성만을 나타낼 것이다. 상기 중등도의 내성 및 적당한 내성을 나타내는 부류에서 Mi-J 대립유전자의 성능을 비교하는 경우, 이들 유전자는 반 우성 방식으로 작용함이 명백하다.

최종 부류는 감수성을 나타내는 부류로서 정의되며, 라이코페르시콘 에스큘렌튬으로부터의 감수성 대립유전자에 대해 동종접합성, 또는 +/+인 계통들을 함유한다. 감수성을 나타내는 이들 부류를 2 초과의 평균 질병 등급 점수를 갖는 것으로서 정의한다.

이러한 시험 결과들은 라이코페르시콘 페루비아늄(Mi-1), 라이코페르시콘 칠렌세(Mi-J) 및 라이코페르시콘 에스큘렌툼('+')으로부터의 대립유전자를 사용하는 토마토 육종에서 성취할 수 있는 상이한 수준의 내성을 나타낸다. 이러한 데이터를 근거로, 토마토 육종가는 Ty 유전자 좌에서 내성 대립유전자(Ty-1)를 함유하는 순계를 Mi 유전자 좌에서 최상의 내성 대립유전자(Mi-1)를 함유하는 순계와 교배시켜 잡종 재배종을 생산할 수 있다. 그러나, 상기 전략은 2 가지 결정적인 한계를 갖는다. 첫 번째, 상기는 염색체 6의 중심체 부위에서 상기 질병 균주 군을 지도화하는 다른 질병 내성 유전자들을 전달하는 육종가의 능력을 없앤다. 상기 영역에서 지도화하는 것으로 공지된 다른 질병 내성 유전자의 예는 클라도스포륨 내성 유전자 품종 2 및 품종 5, 및 오이듐에 대한 내성 유전자이다. 두 번째, 육종가는 각각 야생 종으로부터 기원하고 각각 유전적 장애를 생성시키는 것으로 공지된 2개의 부위를 유전자 이입하기 때문에, 상기는 현대 토마토(라이코페르시콘 에스큘렌튬)로부터의 유전자를 사용하여 상기 유전적 장애 결과를 차폐시키는 상기 육종가의 능력을 제한한다.

본 발명에 개시된 Ty-1 및 Mi-1 시스 토마토 식물은 이러한 제한을 다룰 수 있고 토마토 육종가가 다중 질병 내성을 갖는 재배종을 생산하는데 보다 많은 선택을 허용하는 신규의 대립유전자들의 조합을 제공한다.

실시예 2

토마토 황화 잎 마름 바이러스( TYLCV )에 대한 내성의 측정 프로토콜

본 실시예는 토마토 식물이 TYLCV에 대해 내성을 나타내는지, 중등도의 내성을 나타내는지 또는 감수성을 나타내는지를 측정하기 위한 프로토콜을 개시한다.

식물을 베미시아 타바치를 통해 TYLCV로 자연 감염된 들에서 증식시킨다. 자연적으로 발생하는 들판 감염이, 바이러스 병원체의 이동을 다양한 환경 기관들(격리 질병)에 의해 통제할 수 있기 때문에, 상기 바이러스가 풍토성인 지역에서 내성을 측정하기에 바람직한 방법이다. 예를 들어 미국 농업국은 상기 TYLCV 병원체가 통상적으로 존재하지 않는 미국의 대부분의 토마토 재배 지역들에 상기 병원체가 도입되는 것을 통상적으로는 허용하지 않을 것이다. 통제된 조건 하에서 질병 격리를 수행하는 것은 상기 바이러스의 전달을 위해 곤충(베미시아 타바치)을 키워야하는 필요성으로 인해 방해가 된다.

0 내지 4의 등급을 사용하여(표 3) TYLCV의 질병 증상을 기록하였다:

식물 계통 또는 변종을 평균 점수가 0 내지 1인 경우 TYLCV에 대해 내성을 나타내는 것으로 평가하고, 평균 점수가 대략 2인 경우 중등도의 내성을 나타내며, 평균 점수가 3을 초과하는 경우 감수성을 나타내는 것으로 평가한다. 한편으로, 당해 분야에 공지된 TYLCV의 측정 프로토콜을 또한 사용할 수 있다("사르디니아로부터의 토마토 황화 잎 마름 바이러스는 가루이 전염된 단분 제미니바이러스이다"; A. Keyyr-Pour, M. Bendahmane, V. Matzeit, G.P. Acotto, S. Crespi, B. Gronenborn.; Nucleic Acids Research, Volume 19, p. 6763-6769.; 토마토 황화 잎 마름 바이러스: 단일 게놈 성분을 갖는 가루이 전염된 제미니바이러스", N. Navot, E. Pichersky, M. Zeidan, D. Zamir, H. Czosnek. Virology, 185, 1991, p. 151-161).

Mi 및 Ty 유전자 좌에서 대립유전자 조성을 식별하기 위한 분자 시험

3종의 분자 마커 시험들의 조합을 사용하여 Mi 및 Ty 유전자 좌에서 유전자형을 측정하였다. Ty 유전자 좌에서, 2종의 가능한 교번 대립유전자, Ty-1 및 '+'를 식별하기 위해 단지 단일의 공동 우성(codominant) 분자 마커 시험이 필요하다. 당해 분야의 숙련가들은 2-대립유전자 유전자 좌의 모든 3종의 대립유전자 가능성을 식별할 수 있는 시험으로서 정의되는 공동 우성 분석을 인지할 것이다. 이들 유전자 좌에서, 각각 동종접합체 부류 및 이종접합체 부류의 3종의 유전자형을 기록할 수 있다. 전형적으로는, 서열화되고 특성화되고 증폭된 부위, 또는 SCAR 분석, 절단되고 증폭된 다형성 부위, 또는 CAPS 분석, 및 단일 뉴클레오타이드 다형, 또는 SNP 분석과 같은 마커 분석들이 모두 전형적인 공동 우성 분석이다. 대조적으로, 다형 DNA의 랜덤한 증폭 및 증폭된 단편 길이 다형성(AFLP)이전형적으로는 우성 마커이며 공동 우성 마커 만큼 많은 정보를 제공하지 못한다. 상기 Mi 유전자 좌에서, 2가지 시험이 3종의 대립유전자(Mi-1, Mi-J 및 '+')들간의 가능한 조합을 측정하는데 필요하다. 결코 제한하는 것은 아니지만, 본 발명에 개시된 마커 분석들은 모두 SCAR-유형 분석이다.

대부분의 다른 분자 마커 시험과 마찬가지로, 상기 수행되는 SCAR 분석은, 매우 소량의 출발 물질로부터 DNA를 대략 10억 배 증폭시킬 수 있는 폴리머라제 쇄 반응, 또는 PCR을 사용한다. PCR의 용도는 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있으며, 연구가들이 상기 시험을 수행하기 위해서 단지 매우 소량의 식물 샘플만을 수확하게 한다. 이들 시험을 수행하는데 1 ㎠ 미만의 잎 물질, 바람직하게는 왕성하게 자라는 어린 조직이 필요하다. 이는 상기 마커 시험을 대개는 비-파괴적이라 지칭되도록 할 만큼 작은 샘플이다. 상기는 샘플의 채취가 식물이 발육하는 방식을 조금이라도 방해하지 않으므로 비-파괴적인 것으로 간주된다. 따라서, 상기 작은 샘플은 병리학 시험, 열매 생화학 분석, 수율 시험 또는 원예학적 평가로부터, 임의의 수의 후속 시험의 결과에 영향을 미치지 않는다. SCAR 분석은 또한 비-파괴적인 것 이외에, 추가적인 시간의 이점을 제공한다. 전형적으로는, 관심 유전자 좌 또는 유전자 좌들에서의 유전자형을 24 시간 이내에 알아낼 수 있다.

상기 사용된 3가지 분자 마커 시험들은 각각 게놈 DNA의 단리를 필요로 한다.

실시예 3

마커 시험을 위한 토마토 DNA 의 단리

제한 없이, 하기의 프로토콜을 사용하여 후속의 분자 마커 시험용 토마토 DNA를 추출할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 다수의 DNA 추출 프로토콜을 종래 기술에서 입수할 수 있음을 인식한다. 상기 프로토콜에 개시된 모든 화학물질들을 시그마 케미칼 캄파니(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 수득할 수 있다. 과정은 하기의 단계들을 포함한다:

1. 대략 96 웰 미세적정 플레이트 포맷의 웰 크기인 식물 부분을 수집한다. 바람직하게는 종자 샘플을 사용하거나, 조직 샘플을 어린 잎으로부터 채취한다.

2. 150 ㎕의 추출 완충액(200 mM 트리스-HCl, pH 7.5; 250 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0.5% SDS)을 상기 샘플에 가하고 상기 조직을 잘게 부순다.

3. 상기 플레이트를 15 ℃, 1900-x g에서 15분간 원심분리시킨다.

4. 100 ㎕의 상기 상등액 분획을, 각 웰에 100 ㎕의 2.5M 칼륨 아세테이트(pH 6.5)를 함유하는 새로운 96 웰 플레이트로 옮긴다. 약 2 분간 200 rpm에서 진탕시켜 혼합한다.

5. 상기 플레이트를 15 ℃, 1900-x g에서 15 분간 원심분리시킨다.

6. 75 ㎕의 상기 상등액 분획을 75 ㎕의 아이소프로판올을 함유하는 새로운 96 웰 플레이트로 옮긴다. 혼합하고, 이어서 2 분간 200 rpm에서 진탕시킨다.

7. 상기 플레이트를 15 ℃, 1900-x g에서 15 분간 원심분리시킨다.

8. 상등액 분획을 제거하고 200 ㎕의 70% 에탄올을 펠릿 분획에 가한다. 200 rpm에서 5 분간 진탕시키고, 이어서 -20 ℃에서 밤새 배양한다.

9. 상기 플레이트를 15 ℃, 1900-x g에서 15 분간 원심분리시킨다.

10. 상등액 분획을 제거한다. 200 ㎕의 70% 에탄올을 펠릿에 가하여, 상기 알콜이 상기 펠릿을 실온에서 1 시간 동안 세척하게 한다.

11. 상기 플레이트를 15 ℃, 1900-x g에서 15 분간 원심분리시킨다.

12. 상기 상등액 분획을 버리고 상기 펠릿 분획을 실온에서 건조시킨다. 이를 수행하는데 약 1 시간이 걸린다.

13. 상기 펠릿 분획을 100 ㎕의 TE(10 mM 트리스, pH 8.0, 1 mM EDTA, 5 ㎍/㎖의 RNAase A) 중에 37 ℃에서 15 분간 용해시킨다. PCR 단계로 진행시키지 않는 경우, 상기 DNA를 4 ℃ 또는 -20 ℃에서 보관할 수 있다.

실시예 4

SCAR 분석을 위한 일반적인 PCR 조건

상기 3가지 SCAR 마커 분석들은 각각 유사한 디자인 및 실행을 공유한다. 각각의 분석은 한 쌍의 특정한 DNA 올리고뉴클레오타이드(상기는 DNA 합성을 자극하기 위해 PCR 반응에 사용될 것이므로 프라이머라 지칭된다)를 함유한다. 상기 프라이머는 전형적으로는 길이가 15 내지 25 뉴클레오타이드이며; 이러한 뉴클레오타이드의 신장부는 증폭시키려는 마커 유전자 좌 기질의 DNA 서열과 일치한다. 이들 프라이머를 상기가 전형적으로는 100 내지 1,000 염기 쌍의 증폭산물(amplicon)의 합성을 촉진하도록 디자인한다. 당해 분야의 숙련가들은 이들 프라이머를 SCAR 유형 분석을 생성하도록 디자인하는 방법, 및 종종 상기 디자인을 지원하기 위해 공개적으로 입수할 수 있는 프라이머 3 소프트웨어(화이트헤드 인스티튜트(Whitehead Institute); 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)와 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하는 방법을 안다. 프라이머를 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 합성하거나, 또는 임의의 수의 단골 올리고뉴클레오타이드 회사로부터 구입할 수 있다. 이러한 분석에 사용되는 모든 프라이머들을 오페론 캄파니(Operon Company; 미국 캘리포니아주 알라메다 소재)로부터 구입하였다. PCR 반응의 다른 시약들을 임의의 수의 상업적인 공급처로부터 구입할 수 있으며; 본 발명에 개시된 분석에서는 4개의 데옥시리보뉴클레오타이드-5' 트라이포스페이트(dNTP)를 파마시아 캄파니(미국 미시간주 칼라마주 소재)로부터, PCR 완충제 및 Taq 폴리머라제 효소를 어플라이드 바이오시스템스 캄파니(Applied Biosystems Company; 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)로부터 구입하였다. 당해 분야의 숙련가들은 사용될 수 있는 많은 유형의 PCR 기계 및 분석 조건들이 존재하기 때문에 SCAR 분석을 수행함에 있어서 어느 정도 융통성이 존재함을 인식한다. 어플라이드 바이오시스템스 캄파니로부터의 모델 9700 PCR 기계를 상기 3가지 분석 각각에 대해 하기의 실행 매개변수들과 함께 사용하였다. 94C에서 2 분간의 초기 변성 단계에 이어서 35 주기의 증폭을 수행하였다. 각각의 증폭 주기는 92C에서 30초, 이어서 50C에서 30초, 이어서 72C에서 90초의 3개 단계를 가졌다. 35 번째 주기 후에 상기 샘플을 72C에서 5 분간 유지시켰다. 이로서 PCR 증폭 분석을 마치지만, 상기 PCR 기계를 연구가에 의해 검색될 때까지 25C에서 완성된 반응들을 유지하도록 프로그램화하였다.

당해 분야의 숙련가들은 PCR 분석 조건에 상당한 융통성이 허용됨을 인식한다. PCR 반응을 1 ㎕의 DNA 주형, 10 피코몰의 각각의 2 분석 특이적 PCR 프라이머, 4종의 dNTP 각각에 대해 200 μM의 최종 부피, 2.5 ㎕의 10X PCR 완충제, 및 1.25 단위의 Taq 폴리머라제를 사용하여 준비하였다. 멸균 수를 사용하여 상기 반응의 최종 부피를 25 ㎕로 만들었다.

각각의 SCAR 분석은 또한 상기 다형성이 PCR 반응의 완료 후에 어떻게 밝혀졌는지에 대해 공통성을 갖는다. 각 시험을 위해서, 상기 PCR 반응으로부터의 DNA의 증폭된 부위는 다형성 제한 효소 인식 부위를 함유할 수 있다. 또 다른 대립유전자들은 상기 인식 부위를 갖거나 갖지 않는다. PCR 산물이 특이적인 제한 효소에 의해 절단될 때, 증폭산물은 제한 효소 부위가 존재하지 않으므로 절단되지 않거나 또는 2개의 단편으로 비-대칭적으로 절단된다. 상기 유전자 좌의 유전자 형을, 아가로스 젤 상에서 상기 단편들을 전기영동에 의해 분리시키고, 상기 젤을 에티디움 브로마이드(DNA와 결합하는 색소이다)로 염색하고, 이어서 DNA를 자외선 광으로 여기시킴으로써 상기 단편들을 가시화하여 측정할 수 있다. 상기 PCR 반응으로부터의 단편의 크기를 공지된 크기 표준(상기 아가로스 젤 상에서 가까운 레인들로 전기영동된다)과 비교하여 측정한다. 상기 SCAR 분석 중 2가지 분석은 제한 효소 TaqI를 사용하여 다형성을 밝힌다. 상기 분석을 위해서, 3 ㎕의 10X 제한 효소 완충제, 0.25 ㎕의 TaqI 제한 효소 및 1.75 ㎕의 물을 후-PCR 반응에 가하고, 65C에서 대략 3 시간 동안 배양시킨다. 세 번째 분석은 제한 효소 NlaIII을 사용하여 유전자형을 밝힌다. 이 시험에서, 3.5 ㎕의 10X 제한 효소 완충제, 0.25 ㎕의 NlaIII 및 6.25 ㎕의 물을 상기 후-PCR 반응에 가하고, 이어서 37C에서 대략 3 시간 동안 배양시킨다. 당해 분야의 숙련가는 제한 효소 및 완충제가 다수의 상인들에 의해 판매됨을 인지한다. 본 발명자들은 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs; 미국 매사추세츠주 비버리 소재)로부터의 시약을 사용하였다. 상기 산물들은 상기 제한효소에 의해 절단된 후에, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라, 1 내지 2%(w/v)의 아가로스 젤 상에서 전기영동에 의해 분리되었다(Current protocols in molecular biology(1994) F. Ausubel, editor, John Wiley and Sons, New York).

실시예 5

Ty 유전자 좌에서 SCAR 시험

자미어는 TG97이라 칭하는 제한 단편 길이의 다형태(RFLP) 마커에 가까운 Ty-1 유전자를 지도화하였다((1994) Theoret. Appl. Genet. 88:141-146). RFLP 분석은 수행하기가 보다 어렵고, 식물에 파괴적이며, 비용이 들고 느리게 수행되기 때문에, 상기 RFLP 유전자 좌를 '+' 대립유전자 및 내성 대립유전자 Ty-1을 모두 기질로서 사용하여 서열화함으로써 상기 RFLP를 SCAR 마커로 전환시켰다. 이들 서열의 비교는 다형태 제한 부위를 발견할 수 있게 하였다.

상기 SCAR 시험을 하기의 특정한 프라이머 쌍을 사용하여 본 발명에 개시된 바와 같이 수행한다.

서열식별번호 1: 5' TAA TCC GTC GTT ACC TCT CCT T 3' 및

서열식별번호 2: 5' CGG ATG ACT TCA ATA GCA ATG 3'.

상기 다형태를 제한 효소 TaqI에 의한 후-PCR 절단에 의해 밝힐 수 있다. 상기 Ty-1 대립유전자가 동종접합체로서 존재하는 경우, 398 염기 쌍 PCR 증폭산물은, 상기 대립유전자로부터 생산된 증폭산물이 TaqI 제한 인식 부위를 함유하기 때문에 95 및 303 염기 쌍 단편으로 절단될 것이다. '+' 유형 대립유전자가 동종접합체로서 존재하는 경우, 상기 398 염기 쌍 PCR 증폭 산물은 상기 TaqI 효소에 의해 절단되지 않을 것이다. 이종접합체 샘플의 경우, 상기 PCR 반응의 대략 절반이 95 및 303 염기 쌍 단편으로 절단될 것이고, 상기 PCR 반응의 대략 절반은 절단되지 않을 것이다. 전기영동에 의해 분리 시, 이종접합체는 3개의 단편, 95, 303 및 398 염기 쌍의 길이를 가질 것이다. 이러한 식으로, Ty 유전자 좌의 유전자형을 신속하고 정확하게 측정할 수 있다.

실시예 6

Mi 유전자 좌에서 SCAR 시험 1('+' 대립유전자로부터 Mi -1 또는 Mi -J 대립유전자를 식별함)

문헌[Williamson et al., Theoretical and Applied Genetics 87:757-763(1994)]에 공개된 데이터를 근거로, 라이코페르시콘 에스큘렌튬, 라이코페르시콘 페루비아늄 및 엘의 폴리뉴클레오타이드 서열을 REX-1이라 칭하는 Mi에 가까운 유전자 좌에서 측정하였다.

상기 SCAR 시험을 하기의 특정한 프라이머 쌍을 사용하여, 본 발명에 개시된 바와 같이(또한 윌리암슨 등에 의해 개시된 바와 같이) 수행한다.

서열식별번호 3: 5' AAC CGT GGA CTT TGC TTT GAC T 3' 및

서열식별번호 4: 5' TAA GAA CAG GGA CTC AGA GGA TGA 3'.

상기 Ty 유전자 좌에 대해 본 발명에 개시된 SCAR 분석과 마찬가지로, Mi 유전자 좌 SCAR 분석 #1은 또한 다형태 TaqI 제한 효소 인식 부위를 사용하며; 상기 다형성은 제한 효소 TaqI에 의한 PCR 산물의 효소 절단에 의해 밝혀질 수 있다. Mi-1 대립유전자 또는 Mi-J 대립유전자가 동종접합체로서 존재하는 경우, 또는 Mi-1 대립유전자 및 Mi-J 대립유전자가 이종접합체로서 존재하는 경우, 595 염기 쌍 PCR 증폭산물은 상기 대립유전자들이 TaqI 제한 인식 부위를 함유하므로 145와 450 염기 쌍 단편들로 절단될 것이다. '+' 유형 대립유전자가 동종접합체로서 존재하는 경우, 595 염기 쌍 PCR 증폭 산물은 TaqI 효소에 의해 절단되지 않을 것이다. 이종접합체 샘플(Mi-1/+ 또는 Mi-J/+)의 경우, 상기 PCR 반응의 대략 절반은 145 및 450 염기 쌍 단편으로 절단될 것이고 상기 PCR 반응의 대략 절반은 절단되지 않을 것이다. 전기영동에 의해 분리될 때, 상기 이종접합체들은 3개의 단편, 145, 450 및 595 염기 쌍 길이를 가질 것이다. 이러한 식으로, 상기 내성 대립유전자들(Mi-1 또는 Mi-J)이 존재하는지의 여부 또는 감수성 대립유전자('+')가 존재하는지의 여부, 또는 내성 대립유전자(Mi-1 또는 Mi-J) 및 감수성 대립유전자('+')가 이종접합체로서 존재하는지의 여부를 결정할 수 있다.

실시예 7

Mi 유전자 좌에서 SCAR 시험 2( Mi -1 또는 '+' 대립유전자로부터 Mi -J를 식별함)

상기 실시예 5에 개시된 SCAR 시험은 Mi-1과 Mi-J 내성 대립유전자의 식별을 허용하지 않기 때문에, 또 다른 SCAR 분석이 REX-1 마커에 대해 개발되었다. 이 시험은 상기 마커 유전자 좌에서 Mi-1, Mi-J 및 '+' 대립유전자들을 서열화함으로써 개발되었다. 불행하게도, 상기 3종의 대립유전자들 각각에 대해 상이한 다형성을 갖는 단일 뉴클레오타이드는 없었다. 단일 염기 다형성이 NlaIII라 칭하는 제한 효소 인식 부위에서 발견되었다. 구체적으로, 상기 Mi-J 대립유전자는 상기 인식 부위를 함유한 반면, Mi-1 및 '+' 대립유전자는 상기 인식 부위를 함유하지 않았다.

상기 다형성을 근거로, 두 번째 SCAR 분석을 개발하였으며, 하기의 특정한 프라이머 쌍들을 사용하여 본 발명에 개시된 바와 같이 수행할 수 있다:

서열식별번호 5: 5' CTA CGG AGG ATG CAA ATA GAA

서열식별번호 6: 5' AAT CAT TAT TGT CAC ACT TCC CC

상기 PCR 반응에 따라, 상기 반응물을 본 발명에 개시된 방법에 의해 제한 효소 NlaIII로 절단하여 다형성을 밝혀낼 수 있다. Mi-J 대립유전자가 존재하는 경우, 282 염기 쌍 증폭산물은 124 및 158 염기 쌍 단편으로 절단될 것이다. Mi-1 대립유전자 또는 '+' 대립유전자가 존재하는 경우 상기 증폭산물은 상기 NlaIII 효소에 의해 절단되지 않는다. 이종접합체(Mi-J/Mi-1 또는 Mi-J/+)는 모두 3개의 단편(124, 158 및 282 염기 쌍)을 가질 것이다. Mi 유전자 좌에서 상기 두 SCAR 분석들을 모두 사용하여(실시예 5 및 6), 상기 Mi 유전자 좌에서의 유전자형을 결정할 수 있으며, 이는 상기 3종의 가능한 대립유전자들(Mi-1, Mi-J 또는 '+')의 조합이 존재하는지와 무관하다.

실시예 8

Mi 및 Ty 유전자 좌에서 가장 효능 있는 대립유전자들을 결합시키기 위한 육종 프로토콜

각각 밀접하게 결합된 고정된 관심 대립유전자를 함유하는 2종의 모 계통으로 출발하여, 당해 분야의 숙련가들은 이러한 관심 소질을 시스로 결합시키는 목적을 성취하는데 가능한 다수의 유전자 전략들이 존재함을 인식할 것이다. 그러나, 이들 전략은 모두 모 계통들(각각 관심 소질을 함유하여 F1 잡종을 만든다)을 교배시킴으로써 시작한다. 바람직하게는, 상기 모 계통은 각각 관심 소질들 중 하나에 고정되어야 한다. 상기 F1 식물은 자가 수분되어 분리되는 F2 집단을 생성시키거나 또는 상기 중 어느 한 모 계통에 역교배될 수 있다. 상기 교배 전략과 무관하게, 당해 분야의 숙련가들은 상기 F1 식물이 감수분열 과정을 통해 배우자를 생산하므로 신규의 관심 재조합체들이 생산될 수 있음을 인식할 것이다.

결코 제한하지 않으면서, F2 전략을 수행하여 Mi-1과 Ty-1 대립유전자들을 시스로 결합시켰다. 구체적으로, 육종 순계 FIR16-176과 FDR16-2045간의 교배가 1997년 가을에 프랑스 님에서 이루어졌다. 이들 육종 계통은 모두 본 발명의 양수인인 세미니스 베지터블 시즈 인코포레이티드의 토마토 육종 프로그램으로부터의 것이다. 순계 FIR16-176은 Ty 유전자 좌에 감수성 대립유전자 '+'를 함유하고 부근의 Mi 유전자 좌에는 Mi-1 대립유전자를 함유한다. 순계 FDR16-2045(미국 특허 제 6,414,226 호의 주제이다)는 Ty 유전자 좌에 Ty-1 대립유전자를 함유하고 부근의 Mi 유전자 좌에는 Mi-J 대립유전자를 함유한다. 따라서 #1652817로 나타내는 F1 식물은 Ty 및 Mi 유전자 좌에서 한 쌍의 대립유전자(모체 유전자형을 나타냄)의 시스 접합을 함유한다. 이들 접합은 통상적으로는 함께 밑줄을 그어 나타내며, 상기 밑줄은 상기 유전자 좌가 유전적으로 연관됨을 나타낸다. 예를 들어, F1 식물은 '+' Mi -1 및 Ty -1 Mi -J 시스 접합을 갖는다. 모체가 감수분열을 겪은 경우 재조합이 발생할 수 있지만, 이들 계통들이 각각 Mi 및 Ty 유전자 좌에 고정되었으므로 유효 재조합은 발생할 수 없다.

F1 식물 #1652817은 자가 수분되어 F2 집단을 생성시켰다. 상기 F1 식물이 감수분열을 통해 배우자를 생산함에 따라, 상기 배우자의 대부분은 원래의 모체 ('+' Mi -1 및 Ty -1 Mi -J)로부터 대립유전자 조합을 유지한다. Ty 및 Mi 유전자 좌간의 유전적 거리는 재조합 배우자('+' Mi -1 및 Ty -1 Mi -J)가 생산되는 상대적인 빈도를 결정한다. 상기 Ty 및 Mi 유전자 좌는 가깝게 위치하며 다수의 연구가들이 상기 염색체 6의 영역에서 재조합이 억제됨을 입증하였기 때문에, 당해 분야의 숙련가들은 재조합체 배우자의 수가 모 배우자에 비해 매우 낮을 것임을 예상할 수 있다.

이어서 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자를 시스로 갖는 재조합체를 동정하기 위해서 본 발명에 개시된 일련의 분자 시험을 개발하였는데, 그 이유는 표현형 병리학 선별을 통해 상기 시스 접합을 동정하는 것은 수년, 수 세기의 선별 없이는 가능하지 않았기 때문이다. 당해 분야의 숙련가들은 상기 시스 접합의 표현형 동정은 가능하지만, 본 발명에 개시된 분자 동정 방법이 상기 대립유전자들의 유용한 조합을 동정하는데 더 빠르고 훨씬 더 효율적인 방법임이 명백함을 알 것이다.

2000년 1월에, F1 잡종 1652817의 자가수정으로부터 유도된, 504종의 F2 묘종을 DNA 추출을 위해 샘플링하였으며(실시예 3), Ty 유전자 좌에서의 유전자형을 본 발명에 개시된 방법(실시예 4 및 5)을 사용하여 각 샘플에 대해 측정하였다. 127그루의 식물이 감수성 '+' 대립유전자에 대해 동종접합체이었으며; 이들 식물은 버렸다. Ty-1 대립유전자에 대해 이종접합체(Ty-1/'+')이거나 또는 Ty-1 대립유전자에 대해 동종접합체(Ty-1/Ty-1)인 나머지 377그루의 식물을 본 발명에 개시된 방법(실시예 4, 6, 7)에 의해 분석하여 부근의 Mi 유전자 좌에서의 유전자형을 측정하였다. 이종접합체로서 하나의 유리한 대립유전자(Ty-1 또는 Mi-1)를 함유하고 동종접합체로서 고정된 다른 유리한 대립유전자(Ty-1 또는 Mi-1)를 갖는 임의의 식물을 Ty-1과 Mi-1 대립유전자를 시스로 갖는 것으로서 선택하였다.

재조합체는, 재조합이 염색체 6의 상기 부위에서 억제된다고 문헌에 잘 보고되었기 때문에, 예상되지 못했다. 따라서, 8종의 상기와 같은 재조합체가 발견된 것은 뜻밖이었다. 칼로시안 등(Kaloshian et al., (1998) Mol. Gen. Genet. 257:376-385)은 상기 부위에서 재조합의 빈도가, 페루비아늄 x 페루비아늄 교배가 에스큘렌튬 x 페루비아늄 교배와 비교될 때 대략 8 배 이상 더 큼을 입증하였다. 비교적 높은 재조합체 회수에 대한 상기 가능한 설명에도 불구하고, 상기 이루어진 교배가 칼로시안 등(상기 문헌)의 페루비아늄 x 페루비아늄 교배가 아닌, 상기 게놈 부위에 히르수툼 및 페루비아늄 DNA를 함유하기 때문임은 여전히 뜻밖이다.

상기 Mi-1 및 Ty-1 유전자 이입은 유전적 장애를 별도로 일으키는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 상기 발견된 8종의 재조합체들도 각각 마찬가지로 독특한 재조합 사건들이기 때문에, 이는 이들 소질의 유전자 이입과 관련된 장애를 감소시킬 기회였다. 상당한 원예학적 평가가 이루어졌으며, 이러한 평가로부터, 2종의 식물, 즉 #20 및 #251을 추가 실험을 위해 선택하였다. 이들 식물은 모두 Ty-1 대립유전자에 대해 이종접합체이고(Ty-1/'+') Mi-1 대립유전자에 대해서는 동종접합체이다. 따라서 이들 두 식물은 모두 Ty-1 및 Mi 대립유전자를 시스로 함유하지만, 상기 유리한 시스 조합은 고정된 것은 아니다.

2000년 봄에, F2 식물 번호 20 및 251 번이 자가 수분되어 F3 집단을 생산하였다. 이들 집단을 각각 97.5281.M20 및 97.5281.M251으로 나타내었다. 본 발명에 개시된 방법(실시예 3 내지 7)을 사용하여, 상기 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자들을 상기 두 사건 모두에 대해 동종접합체 조건으로 고정시켰다.

상기 분자 시험이 내성 표현형을 정확하게 예견하게 하기 위해서, 식물 #20 및 #251로부터 유도된 상기 고정된 계통들(97.5281.M20.M.1.1, 97.5281.M251.M.1.1, 97.5281.M251.M.2.1)을 본 발명에 개시된 방법(실시예 1)에 따라 근류선충 내성에 대해 시험하였다. 표 2는 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자의 독특한 시스 배열을 갖는 상기 계통들이 근류선충에 대해 높은 내성을 나타냄을 보여준다.

상기 동일한 계통들(97.5281.M20.M.1.1, 97.5281.M251.M.1.1, 97.5281.M251.M.2.1)이 또한 본 발명에 개시된 방법(실시예 2)을 사용하여 터키 안탈리아에서 TYLCV에 대해 시험되었다. Ty-1 및 Mi-1 대립유전자의 독특한 시스 배열을 갖는 상기 계통들은 TYLCV에 대해 내성을 나타내었다.

이러한 Ty-1 및 Mi-1의 효능 있는 내성 대립유전자들의 시스 조합은 토마토 육종가들이, 유전적 장애를 차폐하거나, 또는 오이듐 또는 클라도스포륨에 대한 추가적인 내성 유전자들, 또는 이러한 질병 균주 군에서 발견되는 내성 대립유전자를 전달하는데 제 2 순계교배 모체를 자유롭게 이용하면서, TYLCV에 대해 내성을 나타내고 선충류에 대해 높은 내성을 나타내는 토마토 잡종을 생산할 수 있게 한다. 상기 신규의 접근법은 토마토 육종가에게, 구제를 위해 오로지 화학적 살충제에만 의존하거나 또는 트랜스제닉 내성 전략에 의존함 없이, 허용 가능한 원예학적 품질과 함께 다수의 질병 병원체를 구제할 기회를 제공한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (39)

1. 게놈 내에 1종 이상의 토마토 황화 잎 마름 바이러스(TYLCV) 내성 대립유전자 Ty-1 및 1종 이상의 근류선충(root knot nematode) 내성 대립유전자 Mi-1을 포함하는 라이코페르시콘 에스큘렌튬(Lycopersicon esculentum) 식물로서, 상기 내성 대립유전자들이 한 염색체 상의 상이한 유전자 좌에서 커플링 상(phase)으로 존재하고, 상기 식물이 TYLCV에 대해 내성을 나타내며, 상기 식물이 멜로이드지네 아레나리아(Meloidgyne arenaria), 멜로이도지네 인코그니타(Meloidogyne incognita) 및 멜로이도지네 자바니카(Meloidogyne javanica)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 근류선충 종에 대해 내성을 나타내고, 상기 식물이 (i) Ty 유전자 좌에 Ty-1 대립유전자를 함유하고 Mi 유전자 좌 부근에 Mi-J 대립유전자를 함유하는 순계 및 Ty 유전자 좌에‘+’대립유전자를 함유하고 Mi 유전자 좌 부근에 Mi-1 대립유전자를 함유하는 순계를 교배하여 F₁ 식물을 수득하는 단계, (ii) 상기 F₁ 식물을 자가수정하여 F₂ 식물을 수득하는 단계, (iii) 상기 F₂ 식물에서 시스(cis)로 커플링된 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자를 갖는 재조합체를 분자 동정으로 스크리닝하는 단계 및 (iv) 상기 Ty-1 대립유전자에 대해 이종접합체(Ty-1/‘+’)이고 상기 Mi-1 대립유전자에 대해 동종접합체인 상기 재조합체를 자가수정하여 상기 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자를 동종접합체 조건으로 고정시키는 단계를 포함하는 방법에 의해서 수득되는, 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
2. 제 1 항에 있어서,
   0.1 미만의 근류선충 내성 점수를 갖는 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
3. 제 1 항에 있어서,
   0.05 미만의 근류선충 내성 점수를 갖는 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
4. 제 1 항에 있어서,
   0.04 미만의 근류선충 내성 점수를 갖는 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
5. 제 1 항에 있어서,
   0.03 미만의 근류선충 내성 점수를 갖는 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 염색체가 염색체 6인, 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
8. 제 1 항에 있어서,
   TYLCV 내성 대립유전자 및 근류선충 내성 대립유전자가 비-트랜스제닉(non-transgenic)인, 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
9. 제 1 항에 있어서,
   TYLCV 내성 대립유전자 및 근류선충 내성 대립유전자가 각각 라이코페르시콘 칠렌세(Lycopersicon chilense) 및 라이코페르시콘 페루비아늄(Lycopersicon peruvianum)으로부터 유래된 것인, 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
10. 제 1 항의 식물의 열매 또는 종자.
11. 제 1 항의 식물을, 상기 TYLCV 내성 대립유전자 및 근류선충 내성 대립유전자가 없는 순계(inbred) 식물과 교배시킴으로써 생산된 잡종(hybrid) 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물로서, 상기 TYLCV 내성 대립유전자 Ty-1 및 상기 근류선충 내성 대립유전자 Mi-1을 커플링 상으로 포함하는, 잡종 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
12. 제 11 항에 있어서,
    상기 TYLCV 내성 대립유전자 및 근류선충 내성 대립유전자가 둘다 이종접합체(heterozygous)인, 잡종 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 TYLCV 내성 대립유전자 및 근류선충 내성 대립유전자에 대한 유전자 좌가 상기 염색체 상의 동일한 질병 내성 클러스터(cluster) 내에 존재하는, 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
14. 제 13 항에 있어서,
    상기 클러스터 내에 1종 이상의 추가적인 질병 내성 대립유전자를 포함하고, 이때 상기 추가적인 질병 내성 대립유전자가 상기 TYLCV 내성 대립유전자 및 근류선충 내성 대립유전자를 갖는 상기 염색체에 대해 트랜스(trans)로 염색체 상에 위치하는, 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
15. 제 14 항에 있어서,
    상기 추가적인 질병 내성 대립유전자가 클라도스포륨(Cladosporium) 품종 2, 클라도스포륨 품종 5 및 오이듐(Oidium)으로 이루어진 군 중에서 선택된 질병에 대한 내성을 제공하는, 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
16. 제 1 항에 있어서,
    순계 라이코페르시콘 에스큘렌튬인 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
17. 게놈 내에 1종 이상의 토마토 황화 잎 마름 바이러스(TYLCV) 내성 대립유전자 Ty-1 및 1종 이상의 근류선충 내성 대립유전자 Mi-1을 포함하는 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물로서, 상기 내성 대립유전자들이 한 염색체 상의 상이한 유전자 좌에서 커플링 상으로 존재하고, 상기 식물이 TYLCV에 대해 내성을 나타내며, 상기 식물이 멜로이드지네 아레나리아, 멜로이도지네 인코그니타 및 멜로이도지네 자바니카로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 근류선충 종에 대해 높은 내성을 나타내고, 상기 식물이 (i) Ty 유전자 좌에 Ty-1 대립유전자를 함유하고 Mi 유전자 좌 부근에 Mi-J 대립유전자를 함유하는 순계 및 Ty 유전자 좌에‘+’대립유전자를 함유하고 Mi 유전자 좌 부근에 Mi-1 대립유전자를 함유하는 순계를 교배하여 F₁ 식물을 수득하는 단계, (ii) 상기 F₁ 식물을 자가수정하여 F₂ 식물을 수득하는 단계, (iii) 상기 F₂ 식물에서 시스로 커플링된 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자를 갖는 재조합체를 분자 동정으로 스크리닝하는 단계 및 (iv) 상기 Ty-1 대립유전자에 대해 이종접합체(Ty-1/‘+’)이고 상기 Mi-1 대립유전자에 대해 동종접합체인 상기 재조합체를 자가수정하여 상기 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자를 동종접합체 조건으로 고정시키는 단계를 포함하는 방법에 의해서 수득되는, 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
18. 제 17 항에 있어서,
    0.1 미만의 근류선충 내성 점수를 갖는 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
19. 게놈 내에 1종 이상의 토마토 황화 잎 마름 바이러스(TYLCV) 내성 대립유전자 Ty-1 및 1종 이상의 근류선충 내성 대립유전자 Mi-1을 포함하는 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물로서, 상기 내성 대립유전자들이 한 염색체 상에서 동시-유전되고(co-inherited), 상기 식물이 TYLCV에 대해 내성을 나타내며, 상기 식물이 멜로이드지네 아레나리아, 멜로이도지네 인코그니타 및 멜로이도지네 자바니카로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 근류선충 종에 대해 내성을 나타내고, 상기 식물이 (i) Ty 유전자 좌에 Ty-1 대립유전자를 함유하고 Mi 유전자 좌 부근에 Mi-J 대립유전자를 함유하는 순계 및 Ty 유전자 좌에‘+’대립유전자를 함유하고 Mi 유전자 좌 부근에 Mi-1 대립유전자를 함유하는 순계를 교배하여 F₁ 식물을 수득하는 단계, (ii) 상기 F₁ 식물을 자가수정하여 F₂ 식물을 수득하는 단계, (iii) 상기 F₂ 식물에서 시스로 커플링된 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자를 갖는 재조합체를 분자 동정으로 스크리닝하는 단계 및 (iv) 상기 Ty-1 대립유전자에 대해 이종접합체(Ty-1/‘+’)이고 상기 Mi-1 대립유전자에 대해 동종접합체인 상기 재조합체를 자가수정하여 상기 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자를 동종접합체 조건으로 고정시키는 단계를 포함하는 방법에 의해서 수득되는, 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
20. 제 19 항에 있어서,
    0.1 미만의 근류선충 내성 점수를 갖는 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
21. 삭제
22. 게놈 내에 1종 이상의 토마토 황화 잎 마름 바이러스(TYLCV) 내성 대립유전자 Ty-1 및 1종 이상의 근류선충 내성 대립유전자 Mi-1을 포함하는 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물로서, 상기 내성 대립유전자들이 한 염색체 상에서 동시-유전되고, 상기 식물이 TYLCV에 대해 내성을 나타내며, 상기 식물이 멜로이드지네 아레나리아, 멜로이도지네 인코그니타 및 멜로이도지네 자바니카로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 근류선충 종에 대해 높은 내성을 나타내고, 상기 식물이 (i) Ty 유전자 좌에 Ty-1 대립유전자를 함유하고 Mi 유전자 좌 부근에 Mi-J 대립유전자를 함유하는 순계 및 Ty 유전자 좌에‘+’대립유전자를 함유하고 Mi 유전자 좌 부근에 Mi-1 대립유전자를 함유하는 순계를 교배하여 F₁ 식물을 수득하는 단계, (ii) 상기 F₁ 식물을 자가수정하여 F₂ 식물을 수득하는 단계, (iii) 상기 F₂ 식물에서 시스로 커플링된 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자를 갖는 재조합체를 분자 동정으로 스크리닝하는 단계 및 (iv) 상기 Ty-1 대립유전자에 대해 이종접합체(Ty-1/‘+’)이고 상기 Mi-1 대립유전자에 대해 동종접합체인 상기 재조합체를 자가수정하여 상기 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자를 동종접합체 조건으로 고정시키는 단계를 포함하는 방법에 의해서 수득되는, 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
23. (a) 제 1 항의 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물을 제 1의 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물로서 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 제 1의 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물을, 추가적인 내성 대립유전자를 보유하는 제 2의 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물과 교배하는 단계
    를 포함하는, 커플링 상으로 존재하는 2종의 내성 대립유전자를 갖는 잡종 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물을 제조하는 방법.
24. 제 23 항에 있어서,
    커플링 상으로 존재하는 상기 2종의 내성 대립유전자가 상기 추가적인 내성 대립유전자에 대해 트랜스로 존재하는, 방법.
25. 제 23 항에 있어서,
    커플링 상으로 존재하는 상기 2종의 내성 대립유전자가 염색체 6 상에 위치하는, 방법.
26. 제 23 항에 있어서,
    커플링 상으로 존재하는 상기 2종의 내성 대립유전자 중 하나가 토마토 황화 잎 마름 바이러스(TYLCV) 내성 대립유전자인, 방법.
27. 제 23 항에 있어서,
    커플링 상으로 존재하는 상기 2종의 내성 대립유전자 중 하나가 Ty-1인, 방법.
28. 제 23 항에 있어서,
    상기 추가적인 내성 대립유전자가 클라도스포륨 품종 2, 클라도스포륨 품종 5 및 오이듐으로 이루어진 군 중에서 선택된 질병에 대한 내성을 제공하는, 방법.
29. 삭제
30. 제 16 항의 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물의 열매 또는 종자.
31. 제 17 항의 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물의 열매 또는 종자.
32. 제 19 항의 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물의 열매 또는 종자.
33. 삭제
34. 제 22 항의 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물의 열매 또는 종자.
35. 게놈 내에 시스로 커플링된 1종 이상의 토마토 황화 잎 마름 바이러스(TYLCV) 내성 대립유전자 Ty-1 및 1종 이상의 근류선충(root knot nematode) 내성 대립유전자 Mi-1을 포함하는 라이코페르시콘 에스큘렌튬(Lycopersicon esculentum) 식물의 제조방법으로서, (i) Ty 유전자 좌에 Ty-1 대립유전자를 함유하고 Mi 유전자 좌 부근에 Mi-J 대립유전자를 함유하는 순계 및 Ty 유전자 좌에‘+’대립유전자를 함유하고 Mi 유전자 좌 부근에 Mi-1 대립유전자를 함유하는 순계를 교배하여 F₁ 식물을 수득하는 단계, (ii) 상기 F₁ 식물을 자가수정하여 F₂ 식물을 수득하는 단계, (iii) 상기 F₂ 식물에서 시스로 커플링된 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자를 갖는 재조합체를 분자 동정으로 스크리닝하는 단계 및 (iv) 상기 Ty-1 대립유전자에 대해 이종접합체(Ty-1/‘+’)이고 상기 Mi-1 대립유전자에 대해 동종접합체인 상기 재조합체를 자가수정하여 상기 Ty-1 및 Mi-1 대립유전자를 동종접합체 조건으로 고정시키는 단계를 포함하는, 제조방법.
36. 제 10 항의 종자를 재배함으로써 생산된 자손 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물로서, 상기 TYLCV 내성 대립유전자 Ty-1 및 상기 근류선충 내성 대립유전자 Mi-1을 커플링 상으로 포함하는, 자손 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
37. 제 30 항의 종자를 재배함으로써 생산된 자손 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물로서, 상기 TYLCV 내성 대립유전자 Ty-1 및 상기 근류선충 내성 대립유전자 Mi-1을 커플링 상으로 포함하는, 자손 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
38. 제 31 항의 종자를 재배함으로써 생산된 자손 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물로서, 상기 TYLCV 내성 대립유전자 Ty-1 및 상기 근류선충 내성 대립유전자 Mi-1을 커플링 상으로 포함하는, 자손 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.
39. 제 32 항의 종자를 재배함으로써 생산된 자손 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물로서, 상기 TYLCV 내성 대립유전자 Ty-1 및 상기 근류선충 내성 대립유전자 Mi-1을 커플링 상으로 포함하는, 자손 라이코페르시콘 에스큘렌튬 식물.

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