ES2848155T3 - Procedimientos para acoplar alelos de resistencia en tomate - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para seleccionar una planta de Lycopersicon esculentum que comprende al menos un alelo de resistencia al TYLCV y al menos un alelo de resistencia al nematodo del nudo de la raíz en la fase de acoplamiento en dos loci en un cromosoma, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (a) analizar una planta de Lycopersicon esculentum para determinar la presencia de alelos de resistencia en cada uno de los dos loci usando uno o más ensayos moleculares, en el que dicho al menos un alelo de resistencia al nematodo del nudo de la raíz es Mi-1 de Lycopersicon peruvianum, dicho al menos un alelo de resistencia al TYLCV es Ty-1 de Lycopersicon chilense, y (b) seleccionar una o más plantas que comprenden dichos alelos de resistencia en la fase de acoplamiento en un cromosoma, en el que dicho cromosoma es el cromosoma 6; en el que dicho uno o más ensayos moleculares comprenden el uso de cebadores o sondas de PCR que hibridan con la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 10; o en el que dicho uno o más ensayos moleculares comprenden el uso de al menos un par de secuencias de cebadores seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 y 2, las SEQ ID NO: 3 y 4, y las SEQ ID NO: 5 y 6.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos para acoplar alelos de resistencia en tomate

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para piramidar genes estrechamente ligados de importancia comercial en tomate (Lycopersicon esculentum, L.). Específicamente, la invención se refiere a la creación de plantas de tomate que comprenden el gen de resistencia más eficaz al virus de rizado de la hoja amarilla del tomate (Ty-1) y el gen de resistencia más eficaz a los nematodos (Mi-1) en fase de acoplamiento (in cis), de manera que estos genes estrechamente relacionados sean conjuntamente heredados como si fueran una sola unidad.

Antecedentes de la presente invención

Hay más de doscientas enfermedades documentadas del tomate cultivado (Compendium of Tomato Diseases. J.B. Jones, J.P. Jones, R.E. Stall, T.A. Zitter, editores, (1997) American Phytopathological Society Press, St. Paul, MN). Para combatir el daño causado por estos patógenos, los cultivadores suelen emplear una estrategia integrada de manejo de plagas que incluye tanto prácticas culturales como el uso de pesticidas. Un ejemplo de una práctica cultural es el uso de redes sobre las plantas de tomate, que proporciona una barrera física que puede ser eficaz para evitar que los insectos portadores de enfermedades infecten el cultivo.

A pesar de numerosos estudios de investigación que han demostrado enfoques transgénicos eficaces contra las enfermedades de las plantas, actualmente no existen variedades de tomate transgénicas disponibles para el cultivador que sean resistentes a cualquier patógeno. Además, sigue existiendo un problema de resistencia pública, particularmente en la Unión Europea, que, combinado con el alto coste de obtener la aprobación regulatoria, ha prohibido efectivamente que esta tecnología prometedora se utilice en el cultivo comercial de tomate.

La introgresión de genes de resistencia a enfermedades en variedades de cultivo modernas usando enfoques de cultivo tradicionales sigue siendo una tecnología eficaz disponible para combatir la mayoría de las enfermedades de las plantas. Debido a su éxito continuo, el enfoque sigue siendo un enfoque principal en los programas académicos y comerciales de cultivo de tomates.

Entre los cientos de patógenos del tomate, las enfermedades causadas por nematodos y el virus del rizado de la hoja amarilla del tomate (TYLCV) se encuentran entre los más importantes para el cultivador comercial. Los nematodos son pandémicos y su distribución se extiende casi de un polo a otro. Además de su amplia distribución, varias especies de nematodos son agentes etiológicos con diversos intervalos de hospedadores, incluida la mayoría de plantas y animales. Por ejemplo, los nematodos causan enfermedades tan diversas como una enfermedad por oxiuros en los seres humanos (Enterobius vermicularis es el agente etiológico) hasta una enfermedad de los nudos de la raíz en los tomates. Aunque existen más de cincuenta especies de nematodos de los nudos de la raíz, las tres especies más importantes que infectan el tomate son Meloidogyne arenaria, M. incógnita y M. javanica.

Las especies de nematodos de los nudos de la raíz se nombran por el tipo de estructura de la raíz que produce su infección en la planta. Tras una infección exitosa, el nematodo produce inductores que hacen que la planta engrose sus raíces, lo que resulta en la producción de grumos o agallas de 1 mm a 10 mm en las raíces. Estos cambios facilitan el transporte de nutrientes de la planta al nematodo. Las raíces infectadas y morfológicamente alteradas tienen una capacidad concomitantemente disminuida para suministrar agua y nutrientes a la planta. Las plantas manifiestan esta capacidad reducida de absorción de nutrientes con una reducción general del vigor que se puede observar en la superficie. Las plantas infectadas también pueden presentar síntomas más específicos tales como retraso en el crecimiento, marchitez y clorosis. A medida que la población de nematodos aumenta durante la temporada de crecimiento, el marchitamiento se vuelve más pronunciado y la aparición de frutos puede verse afectada.

El control químico de los nematodos de los nudos de la raíz es eficaz, y el nematicida bromuro de metilo proporciona un control excelente para todas las especies de Meloidogyne. Por diversas razones, incluidas las preocupaciones sobre la salud de los aplicadores de plaguicidas y la preocupación por el agotamiento del ozono, el uso de bromuro de metilo se está reduciendo en todo el mundo. Una eventual prohibición de este agente de control químico destaca la importancia de desarrollar procedimientos alternativos para controlar la enfermedad de los nematodos en los tomates.

TYLCV es un geminivirus y se clasifica en el grupo de Begomovirus. A diferencia de los nematodos, que son omnipresentes en casi todos los suelos, la distribución del virus del rizado de la hoja amarilla del tomate está limitada por el intervalo del insecto vector que transmite el virus, la mosca blanca Bemisia tabaci.

La producción comercial de tomate ha cambiado durante los últimos veinticinco años de regiones de cultivo templadas a más tropicales en el mundo, debido a menores costes laborales, mejor transporte y tratados como el Acuerdo de Libre Comercio de América del Norte y el Acuerdo de la Organización Mundial del Comercio. Este cambio en la geografía coincide con la distribución de B. tabaci. Por lo tanto, a medida que las regiones productoras de tomate se han desplazado hacia climas tropicales, la enfermedad causada por TYLCV se ha vuelto más pronunciada. TYLCV puede transmitirse rápidamente a los tomates mediante la alimentación de la mosca blanca. Una vez en la planta, el virus se replica y se propaga por toda la planta, aunque normalmente se limita al floema. TYLCV causa síntomas severos en la planta, que van desde el rizado y amarilleo de las hojas, hasta un retraso en el crecimiento causado por un acortamiento de la longitud del entrenudo y la detención del crecimiento floral. Juntos, esto da como resultado plantas con apariencia de arbusto. Las pérdidas de cultivos pueden ser graves; a principios de la década de 1990, se perdió aproximadamente el 95% de la cosecha de tomate en la República Dominicana, y en una sola temporada (1991­ 1992), se informó una pérdida de aproximadamente 140 millones de dólares en Florida (Moffat, Science (1999) 286: 1835).

El control químico de la mosca blanca puede ser eficaz, pero el mal uso de pesticidas en la producción comercial de tomate ha dado como resultado B. tabaci resistente a pesticidas que puede vectorizar más de 20 begomovirus diferentes que infectan el tomate (Morales, (2001), Crop Protection; Polston y Anderson (1997) Plant Disease 81: 1358-1369; Zeidan y col., (1999) Asia Trop. Res. Ext. 1: 107-115).

Al igual que la principal opción química para el control de nematodos en tomates se está eliminando, las opciones de control químico para TYLCV también se están reduciendo, por razones que van desde que el insecto vector se vuelve resistente al pesticida hasta preocupaciones de salud pública sobre el uso de pesticidas. Los altos costes de desarrollo que conlleva la producción de variedades de cultivo resistentes a los transgénicos también son un impedimento para el desarrollo de variedades de cultivo resistentes al TYLCV utilizando un enfoque de ingeniería genética. Los expertos en la técnica reconocerán así la necesidad de alternativas a estas estrategias de control químico y estrategias transgénicas para el control de nematodos, geminivirus (TYLCV) y otras enfermedades de las plantas en la producción de tomate. La introgresión de genes de resistencia naturales sigue siendo la opción más eficaz para controlar los patógenos del tomate en la actualidad.

Aunque la herencia de un fenotipo de resistencia puede ser cuantitativa y poligénica, es común en las plantas tener muchos genes de resistencia dominantes a semi-dominantes controlados por loci únicos individuales. Los genes de resistencia de las plantas a menudo codifican proteínas que actúan como receptores que se unen a ligandos codificados por patógenos específicos. Este reconocimiento específico de patógenos y la respuesta posterior de la planta es un fenómeno descrito por primera vez por Flor a fines de la década de 1940 y denominado resistencia "gen por gen" (revisado por Flor (1971) Ann. Review of Phytopathology 9: 275-296). Este complejo receptor-ligando específico desencadena una ruta de transducción de señales que finalmente da como resultado un fenotipo de resistencia (Bakery col., (1997), Science 276: 726-733; Staskawicz y col., (1995) Science 268: 661-667). En respuesta a este reconocimiento del ataque de patógenos, el huésped puede responder con un fortalecimiento de la pared celular, un estallido oxidativo, la inducción de la expresión del gen de defensa y, en ocasiones, la muerte celular rápida en el sitio de la infección llamada respuesta hipersensible.

Para la mayoría de los objetivos de cultivo, los cultivadores comerciales trabajan con germoplasma al que a menudo se hace referencia como "tipo cultivado". Este germoplasma es más fácil de reproducir porque generalmente se desempeña bien cuando se evalúa para determinar su desempeño hortícola. La ventaja de rendimiento que proporcionan los tipos cultivados a menudo se ve compensada por la falta de diversidad alélica. Esta es la compensación que acepta un cultivador cuando trabaja con germoplasma cultivado: mejor rendimiento general, pero falta de diversidad alélica. Los cultivadores generalmente aceptan esta compensación porque el progreso es más rápido cuando se trabaja con material cultivado que cuando se cultivan con fuentes genéticamente diversas.

Por el contrario, cuando un cultivador hace cruces intraespecíficos o cruces interespecíficos amplios, se produce una compensación inversa. En estos ejemplos, un cultivador típicamente cruza germoplasma cultivado con un tipo no cultivado. En tales cruces, el cultivador puede obtener acceso a nuevos alelos del tipo no cultivado, pero tiene que superar el arrastre genético asociado con el progenitor donante. Además de esta dificultad con esta estrategia de cultivo, este enfoque a menudo falla debido a problemas de fertilidad o fecundidad.

Hay muchos parientes silvestres que se pueden cruzar con tomate cultivado, incluidos L. pennellii, L. hirsutum, L. peruvianum, L. chilense, L. parviflorum, L. chmielewskii, L. cheesmanii, L. cerasiforme y L. pimpinellifolium. La distancia genética entre la especie silvestre y el L. esculentum cultivado se correlaciona con la dificultad tanto de realizar el cruce interespecífico como de crear con éxito una nueva variedad de cultivo comercial con un rasgo añadido (Genetics and breeding. MA Stevens y CM Rick. En: The tomato crop: A scientific basis for improvement. JG Atherton y J Rudich, editores. Chapman y Hall, (1994), Londres). Por ejemplo, especies como L. pimpinellifolium, L. cerasiforme, L. cheesmanii, L. chmielewskii y L. parviflorum son las especies silvestres más fáciles de usar como donantes para la introgresión de rasgos en el tomate moderno. Por el contrario, L. pennellii, L. chilense, L. hirsutum y L. peruvianum son especies mucho más difíciles para la introgresión de rasgos en el tomate moderno (ibídem). Cuando se usan estas especies relacionadas más lejanamente, no es raro tener que usar especies puente y rescate de embriones para cruces de generaciones tempranas. Incluso con estas etapas adicionales, se puede enfrentar una distorsión de segregación significativa, problemas de fertilidad, recombinación reducida y arrastre genético. Incluso en generaciones avanzadas, una supresión de la recombinación en el área introgresada del genoma presenta el principal obstáculo para reducir el arrastre genético lo suficiente como para crear una variedad comercial exitosa.

Por lo tanto, aunque se pueda identificar un rasgo útil en una especie silvestre y apuntar a ese rasgo para la introgresión en la especie cultivada, no hay garantía de éxito. La mayoría de los cultivadores de tomates comerciales exitosos trabajan toda su carrera sin completar con éxito una introgresión de una especie silvestre para crear variedades de cultivo comerciales. Las barreras para el éxito incluyen la distorsión de la segregación, que puede resultar en áreas del genoma silvestre que pueden ser difíciles o imposibles de introducir. Además, algunas de las especies silvestres del tomate moderno son autoincompatibles, lo que significa que no pueden autopolinizarse. Como resultado de la autoincompatibilidad, estas plantas son muy heterogéneas y tienen diferentes alelos en muchos loci. La naturaleza altamente heterogénea de estas especies silvestres también puede dificultar la introgresión del alelo de interés más eficaz.

La dificultad con la introgresión de nuevos alelos de parientes silvestres de cultivos domesticados se extiende a muchos cultivos y se ejemplifica en el tomate por una introgresión de resistencia a nematodos. Bailey ((1941) Proc. Am. Hort. Sci. 38: 573-575) identificó por primera vez la especie silvestre L. peruvianum como una fuente potencial de resistencia a los nematodos. Smith (1944, Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 44: 413-416) utilizó posteriormente el rescate de embriones para recuperar con éxito un híbrido interespecífico que contenía el rasgo de resistencia a nematodos. Gilbert y McGuire ((1955) acuñaron este locus de Mi, y posteriormente mapearon Mi en el cromosoma 6 (Gilbert (1958) Tomato Genet. Coop Rep. 8: 15-17). El alelo de resistencia en el locus de Mi, derivado de L. peruvianum, se llama alelo Mi-1. El alelo susceptible de L. esculentum, se conoce como el alelo de tipo silvestre y se designa '+'. Se cree que todos las variedades de cultivo comerciales de tomate que contienen el alelo de resistencia Mi-1 se derivan de el híbrido interespecífico creado por Smith. Aunque las líneas homocigóticas Mi-1 se desarrollaron ya en 1949 (Frazier y Dennett, (1949) Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 54: 225-236), no fue hasta mediados de 1970 que el alelo Mi-1 comenzó a usarse comúnmente en variedades de cultivo comerciales. Dos desarrollos llevaron a esta implementación comercial. Primero, Rick y Fobes informaron un vínculo entre un marcador de isoenzima llamado fosfatasa alcalina (Aps) y el locus de Mi ((1974) Tomato Genet Coop. Rep. 24:25). El uso temprano de una prueba de marcador molecular permitió a los cultivadores seguir el rasgo sin realizar pruebas de patología. En segundo lugar, las variedades de cultivo de tomate híbridos se estaban volviendo más aceptadas por los cultivadores comerciales. A pesar de la reproducción con el alelo Mi-1 durante seis décadas, en la actualidad sigue existiendo un arrastre genético significativo asociado con la introgresión de Mi-1 de L. peruvianum, incluida una respuesta necrótica localizada (Ho y col., (1992) The Plant Journal, 2: 971), frutos más pequeños y menos producción de frutos bajo condiciones de estrés.

Los cultivadores encontraron que el alelo Mi-1 era eficaz cuando estaba presente como heterocigoto, lo que les permitía proporcionar el rasgo de resistencia a nematodos al híbrido de un solo progenitor. Esto, a su vez, permitió a los cultivadores superar en gran medida el arrastre genético mediante el uso de un segundo progenitor endogámico que tiene genes de esculentum en esta región del cromosoma 6. La creación de variedades de cultivo híbridas permitió la implementación de esta estrategia de cultivo. El alelo dominante Mi-1 se cruzó en uno de los progenitores endogámicos, y el alelo susceptible ('+') con los alelos de esculentum circundantes que permitieron enmascarar la mayor parte del arrastre genético se cruzaron en el segundo progenitor endogámico. El hecho de que el arrastre genético podría estar enmascarado en la condición heterocigótica proporciona evidencia indirecta de que hay genes en esta región del genoma que afectan la salud general de la planta, el tamaño del fruto y el rendimiento del fruto debido a la capacidad de enmascarar respectivamente la respuesta necrótica localizada, menor tamaño del fruto y menor producción de frutos bajo condiciones de estrés.

Se ha demostrado que los genes de resistencia de las plantas están agrupados en el genoma y, en el tomate, se encuentran comúnmente cerca de los centrómeros. El locus de Mi está ubicado en uno de estos grupos de resistencia a enfermedades, cerca del centrómero en el cromosoma 6. Además de tener el locus de resistencia de Mi, otros genes de resistencia para geminivirus, Oidium lycopersicum (van de Beek y col., (1994) Theoret Appl. Genet.89: 467-473) y dos genes de resistencia para Cladosporium fulvum razas 2 y 5 (Dickinson y col., Mol. Plant Microbe Interact. (1993) 6: 341-347) están todos estrechamente ligados genéticamente en esta región centromérica del cromosoma 6.

La dificultad de la introgresión de Mi-1, incluso después de muchas décadas, ha sido la incapacidad de reducir el arrastre genético asociado con el rasgo. Las explicaciones alternativas para esta dificultad son que el gen de resistencia Mi-1 es pleiotrópico y contribuye directamente al arrastre genético, o que existe una supresión de la recombinación en esta región genómica que limita el progreso de la reducción del arrastre genético. Varios enfoques experimentales han abordado esta cuestión. Usando una combinación de genética y citogenética, Zhong y col., ((1999) Theoret. Appl. Genet. 98: 365-370) mostraron que, según el tamaño del genoma del tomate, la distancia física entre el locus de Mi y el locus de Aps debería ser de aproximadamente 750.000 pares de bases, según la estimación genética de ~ 1cM de distancia genética. Sin embargo, sus resultados de hibridación in situ por fluorescencia (FISH) mostraron que esta distancia física es en realidad de 40.000.000 pares de bases. Esta discrepancia entre las distancias genéticas y físicas entre estos loci llevó a Zhong y col., a predecir que la recombinación alrededor del locus de Mi se reduce aproximadamente 50 veces en comparación con el promedio del genoma. Kaloshian y col., ((1998) Mol. Gen. Genet. 257: 376-385) adoptó un enfoque genético comparativo y mostró que un cruce de L. peruvianum x L. peruvianum tenía una recombinación 8 veces mayor en esta región en comparación con la población derivada de L. esculentum x L. peruvianum. Además de estos experimentos, es bien conocido que la recombinación generalmente se suprime en las regiones centroméricas. Milligan et al,. (1998, Plant Cell 10: 1307-1320) utilizaron complementación transgénica para introducir el gen de resistencia Mi clonado en la variedad de cultivo susceptible Moneymaker. El hecho de que no se observaron efectos pleiotrópicos en estas pruebas de complementación sugiere fuertemente que los defectos hortícolas asociados con la introgresión de Mi se deben al arrastre genético. Estos estudios proporcionaron información sobre la dificultad asociada con la introgresión de genes de resistencia a enfermedades en esta región del cromosoma 6.

En 1998, Kaloshian y col., describieron un marcador molecular codominante basado en PCR llamado REX-1, que estaba más cerca del locus de Mi que el marcador de isoenzima Aps (Mol Gen Genet. 257: 376-385). Este marcador basado en ADN fue adoptado rápidamente por los programas de cultivo de tomates y facilitó enormemente el desarrollo de nuevas variedades de cultivo híbridas resistentes a nematodos.

Aunque la comunidad de cultivo de tomate ha revelado rápidamente su progreso en la introgresión del alelo de resistencia al nematodo Mi-1 a través de publicaciones científicas, la USPTO ha reconocido la improbabilidad de éxito de este difícil enfoque de cultivo en la emisión de varias patentes en esta área (patentes de los Estados Unidos Nos.

6.414.226, 6.096.944, 5.866.764 y 6.639.132).

Los informes de resistencia al geminivirus del rizo de la hoja amarilla del tomate (TYLCV) han existido durante casi 40 años. Cohen informó por primera vez sobre algunos genotipos tolerantes ya en 1964 (Cohen y Harpaz (1964) Entomol. Exp. Appl. 7: 155-166), luego identificó que L. pimpinellifolium y L. peruvianum contenían niveles más altos de resistencia al TYLCV (Cohen y Nitzany (1966) Phytopathology 56: 1127-1131). En la década de 1990, Pilowski y Cohen informaron tolerancia de L. peruvianum (PI126935) con hasta cinco genes recesivos (Plant Disease 74: 248­ 250). Michelson y col., descubrieron ((1994) Phytopathology 84: 928-933), y Hoogstraten (patente de los Estados Unidos Nos 6.414.226) confirmaron posteriormente de forma independiente la resistencia al TYLCV en L. chilense. Este locus de resistencia se denomina locus de Ty y el alelo de resistencia de L. chilense se denomina Ty-1.

Al igual que el locus de Mi, el alelo susceptible en el locus de Ty se denomina de tipo silvestre o '+'. Zamir y col., mapearon el locus de Ty en la región centromérica del cromosoma 6 ((1994) Theoret. Appl. Genet. 88: 141-146). El alelo Ty-1 actúa como un alelo dominante, por lo que ambas líneas que están fijadas para el alelo Ty-1 o que son heterocigotas (Ty-1/'+') son resistentes a TYLCV.

La línea de tomate endogámico FDR16-2045, que contiene el gen de resistencia Ty-1 de L. chilense, también confiere resistencia a los nematodos debido a un gen de resistencia de L. chilense que también fue introgresado en el locus de Mi cercano (Hoogstraten, patente de los Estados Unidos No. 6.414.226). El hecho de que estos dos genes de resistencia para nematodos y geminivirus sean co-heredados en la línea FDR16-2045 demuestra que los loci Ty y Mi están en una posición cercana genéticamente. El alelo de resistencia a nematodos en el locus de Mi, como se introgresó a partir de L. chilense en la línea FDR16-2045, se conoce como Mi-J. La línea FDR16-2045 es un cultivo endogámico valioso porque permite a los cultivadores crear híbridos comerciales que contienen alelos de resistencia eficaces para nematodos y geminivirus, con la capacidad de contrarrestar la mayor parte del arrastre genético mediante el uso de un segundo progenitor endogámico con los alelos de tipo '+' en los loci de Mi y Ty. El arrastre genético de esta introgresión puede manifestarse como autonecrosis, entrenudos más largos, frutos más pequeños y menos producción de frutos bajo condiciones de estrés.

Sin embargo, mediante pruebas de patología se ha encontrado que el alelo Mi-J de L. chilense no es tan eficaz como el alelo Mi-1 de L. peruvianum. Esto es particularmente evidente cuando el alelo Mi-J se empareja en un híbrido F1 con el alelo susceptible '+' en el locus de Mi. Usando técnicas moleculares, los presentes inventores pudieron diseñar pruebas de marcadores moleculares para distinguir los tres posibles alelos (Mi-1, Mi-J y '+') en el locus de Mi.

Los cultivadores de tomates se enfrentan, por lo tanto, a una limitación en su capacidad para entregar múltiples genes de resistencia que mapean la región centromérica del cromosoma 6 mientras retienen la capacidad de enmascarar el arrastre genético asociado con estas introgresiones. Para hacer una pirámide de todos los genes de resistencia conocidos que mapean en esta región del cromosoma 6 en una variedad de cultivo híbrida, un cultivador debería tener un progenitor con la introgresión de L. peruvianum que contenga el gen Mi-1 de resistencia a nematodos, otro progenitor con la introgresión de L. chilense que contiene el gen de resistencia al TYLCV Ty-1, otro progenitor con la introgresión de L. hirsutum que contiene el gen de resistencia para Oidium, otro progenitor con la introgresión de L. pimpinellifolium que contiene los genes de resistencia para las razas de Cladosporium, y otro progenitor más que contienen los alelos de tipo '+' de esculentum para enmascarar el arrastre genético asociado con algunas de estas introgresiones. Esta tarea es imposible para el cultivador porque solo tienen dos líneas parentales para elegir para hacer variedades de cultivo híbridos. Este dilema también se muestra gráficamente por Ho et al., ((1992) The Plant Journal 2: 971-982, ver figura 6), y por Liharska et al., ((1996) Genome 39: 485-491, véase la figura 1).

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de identificar un evento recombinacional en esta área del genoma que se sabe que tiene la recombinación severamente suprimida, y que contendrá el alelo más eficaz para la resistencia a los nematodos, Mi-1, originalmente introgresado de L. peruvianum, con el alelo más eficaz para la resistencia al TYLCV, Ty-1, originalmente introgresado de L. chilense. Se dice que los alelos estrechamente unidos yuxtapuestos de esta manera están en la fase de acoplamiento o in cis. Tal combinación de alelos de resistencia eficaces in cis permitiría a los cultivadores de tomates crear híbridos de tomate con la resistencia más eficaz al TYLCV y a los nematodos, al tiempo que conserva la libertad de tener un segundo progenitor endogámico para enmascarar el arrastre genético o entregar genes de resistencia adicionales tales como los genes de resistencia para Oidium, Cladosporium, o alelos de resistencia aún por descubrir en este grupo de enfermedades.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para seleccionar una planta de Lycopersicon esculentum que comprende al menos un alelo de resistencia al TYLCV y al menos un alelo de resistencia al nematodo del nudo de la raíz en fase de acoplamiento en dos loci de un cromosoma, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a) analizar una planta de Lycopersicon esculentum para determinar la presencia de alelos de resistencia en cada uno de los dos loci usando uno o más ensayos moleculares, en los que al menos dicho alelo de resistencia al nematodo del nudo de la raíz es Mi-1 de Lycopersicon peruvianum, al menos dicho alelo de resistencia al TYLCV es Ty-1 de Lycopersicon chilense, y

(b) seleccionar una o más plantas que comprenden dichos alelos de resistencia en la fase de acoplamiento en un cromosoma, en el que dicho cromosoma es el cromosoma 6;

en el que dicho uno o más ensayos moleculares comprenden el uso de cebadores o sondas de PCR que hibridan con la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 10; o

en el que dicho uno o más ensayos moleculares comprenden el uso de al menos un par de secuencias de cebadores seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1 y 2, las SEQ ID NOs: 3 y 4, y las SEQ ID NOs: 5 y 6.

En una realización, dicho alelo de resistencia al nematodo del nudo de la raíz confiere una puntuación de resistencia al nematodo del nudo de la raíz de menos de aproximadamente 0,1 usando el "ensayo de resistencia a nematodo". En una alternativa preferida del procedimiento anterior, dichos uno o más ensayos moleculares comprenden la determinación, en cada uno de los dos loci, de si el alelo de resistencia al TYLCV y el alelo de resistencia al nematodo del nudo de la raíz están presentes o ausentes y si cada locus es homocigoto o heterocigoto para dicho alelo.

También se proporciona un procedimiento como se describió anteriormente, en el que dichos uno o más ensayos moleculares se seleccionan del grupo que consiste en un ensayo de regiones amplificadas caracterizadas secuenciadas (SCAR), un ensayo de sitios polimórficos amplificados escindidos (CAPS), un ensayo polimórfico de un solo nucleótido (SNP), amplificación aleatoria de ADN polimórfico, un ensayo de polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP) y un ensayo de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP).

Breve descripción de los dibujos

Se describirán en detalle varios aspectos, con referencia a las siguientes figuras, en las que:

La Figura 1 muestra una comparación de las secuencias de polinucleótidos del locus marcador cerca de los alelos Ty+ (SEQ ID NO: 11) y Ty-1 (SEQ ID NO: 10) y la identificación en los recuadros sombreados de 19 polimorfismos de un solo nucleótido entre las secuencias de polinucleótidos. El círculo identifica dos (2) polimorfismos adyacentes en los pares de bases 97-98 en la secuencia de Ty-1 y 96-97 en la secuencia de Ty+, en la que un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Taql ocurre en el alelo Ty-1 solamente.

La Figura 2 muestra una comparación de las secuencias de polinucleótidos del locus marcador cerca de los alelos Mi+, Mi-1 y Mi-J y la identificación en los recuadros sombreados de 20 polimorfismos de un solo nucleótido entre las secuencias de polinucleótidos. Los círculos identifican polimorfismos en los pares de bases 603 y 754.

La Figura 3 muestra la clasificación promedio de resistencia a nematodos de cinco genotipos de plantas, que comprenden varias combinaciones de alelos en el locus de Mi.

Descripción detallada

La presente memoria descriptiva proporciona un procedimiento para seleccionar una planta de tomate (Lycopersicon esculentum) producida a partir de un evento recombinacional y que tiene Mi-1, originalmente introgresado de L. peruvianum, in cis con Ty-1, originalmente introgresado de L. chilense.

Definiciones

Terminología botánica: Linneo se considera el padre de la clasificación botánica. Aunque primero categorizó el tomate moderno como Solanum, su nombre científico durante muchos años ha sido Lycopersicon esculentum. Asimismo, los parientes silvestres del tomate moderno han sido clasificados dentro del género Lycopersicon, tal como L. pennellii, L. hirsutum, L. peruvianum, L. chilense, L. parviflorum, L. chmielewskii, L. cheesmanii, L. cerasiforme, y L. pimpinellifolium. En los últimos años, ha habido un debate entre los investigadores y botánicos del tomate sobre la posibilidad de reclasificar los nombres de estas especies. El nombre científico propuesto recientemente para el tomate moderno es Solanum lycopersicum. Del mismo modo, los nombres de las especies silvestres pueden modificarse. L. pennellii puede convertirse en Solanum pennellii, L. hirsutum puede convertirse en S. habrochaites, L. peruvianum puede dividirse en S. N peruvianum' y S. 'Callejon de Huayles', S. peruvianum y S. corneliomuelleri, L. parviflorum puede convertirse en S. neorickii, L. chmeilewskii puede convertirse en S. chmielewskii, L. chilense puede convertirse en S. chilense, L. cheesmaniae puede convertirse en S. cheesmaniae o S. galapagense, y L. pimpinellifolium puede convertirse en S. pimpinellifolium (Solanacea Genome Network (2005) Spooner y Knapp; http://www.sgn.comeN.edu/help/about/solanum_nomendature.html).

Por lo tanto, aunque los nombres del tomate y sus parientes pueden cambiar, con el propósito de clarificación, el tomate moderno y sus parientes silvestres se definen utilizando los nombres existentes que caen todos dentro del género Lycopersicon.

Nematodos: Los nematodos de los nudos de la raíz (Meloidogyne spp.) son comunes en el suelo y la mayoría tiene una amplia gama de huéspedes, lo que causa problemas en muchos cultivos anuales y perennes. Los tomates se encuentran entre los más gravemente afectados, y el nematodo causa problemas en todas las áreas de cultivo de tomates. Los nematodos de los nudos de la raíz son difíciles de identificar y hay más de 50 especies identificadas, aunque unas pocas especies (por ejemplo, M. javanica, M. incógnita y M. arenaria) causan la mayoría de los problemas para los cultivadores de tomate.

Como se usa en este documento, el término "alelo o alelos" significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus particular, todos cuyos alelos se relacionan con un rasgo o característica en un locus específico. En una célula diploide de un organismo, los alelos de un gen determinado se encuentran en una ubicación específica o locus (plural loci) en un cromosoma. Un alelo está presente en cada cromosoma del par de cromosomas homólogos. Una especie de planta diploide puede comprender un gran número de alelos diferentes en un locus particular.

Como se usa en este documento, el término "locus" (plural loci) significa un lugar o lugares específicos o un sitio en un cromosoma en el que, por ejemplo, se encuentra un gen o marcador genético. El "locus de Mi" se refiere en el presente documento a la ubicación en el genoma del tomate en la que se encuentran uno o más alelos, que determinan el grado de resistencia al nematodo de los nudos de la raíz que tiene la planta o el tejido vegetal. El término "locus de Ty" se refiere en este documento a la ubicación en el genoma del tomate en la que se encuentran uno o más alelos, que determinan el grado de resistencia al TYLCV que tiene la planta o el tejido vegetal.

Como se usa en este documento, los términos "en la fase de acoplamiento" e "in cis" se refieren a una condición genética en la que los alelos de dos loci diferentes se encuentran unidos juntos en un cromosoma (homólogo). Por ejemplo, cuando los alelos Ty-1 y Mi-1 están ubicados en un homólogo cromosómico, estos alelos están "en la fase de acoplamiento". Por el contrario, si los alelos Ty-1 y Mi-1 están ubicados en diferentes cromosomas homólogos de un par homólogo, se dice que están "en la fase de repulsión" o "in trans".

Un "evento recombinante" o "recombinacional" se refiere en el presente documento a una planta que tiene una nueva composición genética que surge como resultado del cruzamiento y la clasificación independiente de los cromosomas homólogos.

Un "alelo de resistencia al TYLCV" se refiere a un alelo que, cuando está presente en el genoma, confiere "resistencia" o "resistencia intermedia" a la infección y/o daño por el virus del rizo de la hoja amarilla del tomate. Se dice que una planta o una pluralidad de plantas son "resistentes" a TYLCV cuando las plantas tienen una puntuación de enfermedad promedio de entre 0 y 1, o igual a 0 o 1, usando el "ensayo de resistencia al TYLCV" (véase más abajo). Se dice que una planta o una pluralidad de plantas tienen resistencia "intermedia" al TYLCV cuando las plantas tienen una puntuación de enfermedad promedio de aproximadamente 2, usando el ensayo de resistencia al TYLCV. Se dice que las plantas que tienen una puntuación de enfermedad promedio de aproximadamente 3 o más son susceptibles.

Un "alelo de resistencia al nematodo de los nudos de la raíz" se refiere a un alelo que, cuando está presente en el genoma, confiere resistencia a al menos una o más especies de nematodos seleccionadas de M. incognata, M. javanica y M. arenaria. Se dice que una planta o una pluralidad de plantas son "altamente resistentes" a al menos una de estas especies de nematodos de los nudos de la raíz cuando las plantas tienen una puntuación de enfermedad promedio de menos de aproximadamente 0,1, cuando se utiliza el "Ensayo de resistencia al nematodo de los nudos de la raíz" (véase más abajo). Por ejemplo, las plantas Mi-1/Mi-1 y las plantas Mi-1/+ son altamente resistentes. Se dice que una planta o una pluralidad de plantas tienen "resistencia intermedia" cuando las plantas tienen una puntuación de enfermedad promedio de aproximadamente 0,1 o más, pero por debajo de 1,0 (por ejemplo, plantas con los alelos MiJ/MiJ). Se dice que las plantas que tienen un puntaje promedio de enfermedad de 1,0 o más pero por debajo de 2,0 tienen "resistencia moderada" (por ejemplo, plantas con los alelos MiJ/+), mientras que las plantas que tienen un puntaje promedio de enfermedad de 2,0 o más se dice que son susceptibles (por ejemplo plantas con los alelos /+).

Un "ensayo de resistencia al TYLCV" se refiere a una pluralidad de plantas que se cultivan en un campo en el que se produce una infección natural por TYLCV y que puntúan los síntomas de la enfermedad en uno o más puntos de tiempo después de la infección usando una escala de 0-4, como se describe más adelante en los Ejemplos, y la determinación de la calificación de enfermedad promedio para una pluralidad de plantas que tienen una composición alélica específica (genotipo) en el locus de Ty.

Un "ensayo de resistencia a nematodos" se refiere a una pluralidad de plantas que se cultivan en suelo inoculado con inóculo de M. incógnita, M. javanica o M. arenaria y puntúan las agallas de la raíz después de aproximadamente 28 días en una escala de 0-4 como se describe adicionalmente en los Ejemplos, y determinando la calificación promedio de enfermedad para una pluralidad de plantas que tienen una composición alélica específica (genotipo) en el locus de Mi.

Como se usa en este documento, el término "heterocigoto" significa una condición genética que existe cuando dos alelos diferentes residen en un locus específico, pero se colocan individualmente en los pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula de un organismo diploide (por ejemplo, Mi-1 /+). Por el contrario, como se usa en este documento, el término "homocigoto" significa una condición genética que existe cuando dos alelos idénticos residen en un locus específico, pero se colocan individualmente en los pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula de un organismo diploide (por ejemplo, Mi-1/Mi-1).

Como se usa en este documento, el término "planta" incluye la planta completa o cualquier parte o derivado de la misma, t al como células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejido celular vegetal a partir de los cuales se pueden regenerar plantas de tomate, callos vegetales, grupos de células vegetales, y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, frutos (por ejemplo, tomates cosechados), flores, hojas, semillas, raíces, puntas de raíces y similares.

Un "ensayo molecular" (o prueba) se refiere a un ensayo (basado en ADN) que indica (directa o indirectamente) la presencia o ausencia de un alelo particular en el locus de Mi o Ty. Además, permite determinar si un alelo particular es homocigoto o heterocigoto en el locus de Ty o Mi en cualquier planta individual. Por ejemplo, en una realización, un ácido nucleico unido al locus de Mi o Ty se amplifica usando cebadores de PCR, el producto de amplificación se digiere enzimáticamente y, basándose en los patrones resueltos electroforéticamente del producto de amplificación, se pueden determinar qué alelos Mi o Ty están presentes en cualquier planta individual y la cigosidad del alelo en el locus de Mi o Ty (es decir, el genotipo en cada locus). Algunos ejemplos son SCAR, CAPS y ensayos similares.

Como se usa en este documento, el término "variedad" o "variedad de cultivo" significa un grupo de plantas dentro de un único taxón botánico del intervalo conocido más bajo, que puede definirse por la expresión de las características resultantes de un genotipo o combinación de genotipos dado.

Como se usa en este documento, el término "tipo silvestre" significa el alelo natural que se encuentra dentro de L. esculentum. En el locus de Mi de resistencia a nematodos y el locus de Ty de TYLCV, estos alelos de tipo silvestre de L. esculentum confieren susceptibilidad a estos patógenos y se designan como Mi+ y Ty+ en este documento, o simplemente "+".

Como se usa en este documento, el término "variante" o "variante polimórfica" se refiere a secuencias de ácido nucleico que son esencialmente similares a una secuencia de ácido nucleico dada. Por ejemplo, el término "variantes de los mismos" o "variantes de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-11" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que tiene uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más) nucleótidos eliminados (variantes de eliminación) a partir de dicha secuencia polinucleotídica o que tiene uno o más nucleótidos sustituidos (variantes de sustitución) con otros nucleótidos o uno o más nucleótidos insertados en dicha secuencia polinucleotídica (variantes de inserción).

Las variantes de las SEQ ID NOs: 1-11 incluyen cualquier secuencia de nucleótidos que sea "esencialmente similar" a cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-11. Las secuencias que son esencialmente similares a las SEQ ID NOs: 1-11 son secuencias de ácido nucleico que comprenden al menos aproximadamente 90%, más preferiblemente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de secuencia de ácido nucleico con una o más secuencias de las SEQ ID NOs: 1-11, cuando se alinea de manera óptima usando, por ejemplo, el algoritmo de Needleman y Wunsch, con, por ejemplo, los programas GAP o BESTFIT usando parámetros predeterminados. Los parámetros predeterminados de GAP son una penalización por creación de huecos = 50 (nucleótidos) y una penalización por extensión de huecos = 3 (nucleótidos). Para los nucleótidos, la matriz de puntuación predeterminada utilizada es nwsgapdna (Henikoff y Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Las alineaciones de secuencia y las puntuaciones para el porcentaje de identidad de secuencia se pueden determinar utilizando programas informáticos, tales como el paquete GCG Wisconsin, Versión 10.3, disponible a través de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, EE. UU., o el software de código abierto Emboss para Windows (versión actual 2.7.1-07). Las variantes también incluyen fragmentos o partes de cualquiera de estas secuencias.

Plantas y partes de plantas

La planta puede ser una planta de tomate (Lycopersicon esculentum) que comprende en su genoma el alelo Mi-1, originalmente introgresado de L. peruvianum, in cis con el Ty-1, originalmente introgresado de L. chilense, así como células de la planta y tejidos, semillas o frutos de tales plantas. Estas plantas se pueden producir, por ejemplo, cruzando variedades comerciales disponibles públicamente, cada una de las cuales comprende un alelo de interés (preferiblemente fijo) (en este caso, Mi-1 o Ty-1) y seleccionando plantas recombinantes, que comprenden Mi-1 y Ty-1, in cis, de las plantas F2 obtenidas del cruzamiento, o de cualquier generación adicional obtenida por autofecundación o cruzamiento adicional de la F1 (por ejemplo, una población F2 o retrocruzamiento). Como la incidencia de recombinación es excesivamente baja, requiriendo un gran número de eventos, la selección se lleva a cabo preferiblemente usando uno o más ensayos moleculares específicos de alelo Mi o de discriminación de alelos, tales como ensayos SCAR o CAPS. Por ejemplo, se pueden utilizar uno o más de los tres ensayos SCAR a los que se hace referencia en el presente documento como "ensayo SCAR para el locus de Ty", "ensayo SCAR No. 1 para el locus de Mi" y "ensayo SCAR No. 2 para el locus de Mi", como se describe en los Ejemplos. En estos ensayos se utilizan 3 pares de cebadores en una reacción de PCR (SEQ ID NOs: 1 y 2, SEQ ID n Os: 3 y 4 y SEQ ID NOs: 5 y 6), seguido de una restricción enzimática y detección de los fragmentos obtenidos para detectar polimorfismos entre los productos de amplificación por PCR.

Se entiende que se puede utilizar la experimentación de rutina para desarrollar un ensayo similar. Por ejemplo, pueden usarse "variantes" de cualquiera de las secuencias de cebadores, o cebadores o sondas que hibridan con otras partes del genoma cerca o en el locus de Mi y Ty. Las plantas que comprenden Mi-1 y Ty-1 in cis pueden ser homocigotas o heterocigotas. Estas plantas pueden usarse en cruces adicionales para transferir los alelos como una sola unidad a otras plantas de tomate para generar, por ejemplo, híbridos o endogámicos. En una realización preferida se proporcionan plantas híbridas que comprenden los alelos Mi-1 y Ty-1 en la fase de acoplamiento y alelos susceptibles, o Mi+ y Ty+, en el cromosoma homólogo. Estas plantas tienen el beneficio de tener síntomas de arrastre genético significativamente reducido o no normalmente asociados con los alelos Mi-1 y Ty-1 cuando estos alelos están presentes en condición homocigótica.

Los síntomas de arrastre genético se refieren a uno o más síntomas seleccionados del grupo de autonecrosis, internudos más largos, frutos más pequeños, menos producción de frutos y arquitectura hortícolamente inferior, en comparación con una planta que carece de los alelos Mi-1 y Ty-1. Los expertos en la técnica reconocerán que tales síntomas de arrastre genético afectarán adversamente la aceptación comercial de líneas de plantas endogámicas o híbridas por parte de los cultivadores. Generalmente, la presencia de un nivel adverso de arrastre genético puede determinarse por la presencia de uno o más de estos síntomas hasta tal punto que la línea de la planta se vuelve comercialmente inaceptable.

Las plantas de tomate comprenden una puntuación promedio de resistencia a nematodos de menos de aproximadamente 0,25, preferiblemente menos de aproximadamente 0,2, más preferiblemente menos de aproximadamente 0,1 o menos de aproximadamente 0,05, tal como 0,03 o 0,02. Además, estas plantas son resistentes a TYLCV y tienen una puntuación promedio de resistencia al TYLCV inferior o igual a 1,0, como se determina en el ensayo descrito.

Plantas que comprenden otros alelos de resistencia a nematodos y TYLCV

La memoria descriptiva proporciona un procedimiento para seleccionar el recombinante anterior, así como un procedimiento para seleccionar otros recombinantes que tienen al menos un alelo de resistencia Mi y al menos un alelo de resistencia TYLCV en fase de acoplamiento (in cis), preferiblemente el cromosoma 6 de L .esculentum. Tales plantas se caracterizan por tener una resistencia alta, intermedia o moderada a los nematodos de las especies M. arenaria, M. incógnita y/o M. javanica y por tener resistencia o resistencia intermedia a TYLCV, cuando se utilizan los ensayos de resistencia descritos en este documento. También se proporcionan eventos de recombinación realizados usando este procedimiento, así como tejidos, células, semillas y frutos de estas plantas y el uso de cualquiera de estas plantas para generar plantas híbridas o endogámicas que comprenden los alelos de resistencia Mi y Ty in cis. Las plantas que comprenden el alelo Mi-J de L. chilense en fase de acoplamiento con el alelo Ty-1 están, sin embargo, explícitamente excluidas, ya que tales plantas ya ocurrieron naturalmente de manera accidental en la técnica anterior (documento US 6.414.226), aunque no se fabricaron de acuerdo con la presente invención. En cualquier caso, las plantas con el alelo Mi-J de L. chilense en fase de acoplamiento con el alelo Ty-1 no muestran un nivel alto de resistencia a los nematodos, es decir, no son altamente resistentes como se define en el presente documento. Por lo tanto, se prefieren particularmente las plantas que confieren resistencia al TYLCV y alta resistencia a los nematodos.

La presente memoria descriptiva se refiere a la selección de una planta de tomate que comprende un alelo que confiere resistencia al TYLCV en la fase de acoplamiento con un alelo que confiere resistencia a nematodos de los nudos de la raíz. El alelo que confiere resistencia al TYLCV y el alelo que codifica la resistencia a los nematodos de los nudos de la raíz pueden derivarse originalmente de diferentes fuentes de germoplasma (es decir, diferentes especies de tomate), tales como, pero sin limitarse a, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon cerasiforme, Lycopersicon pimpinellifolium, Lycopersicon cheesmanii, Lycopersicon parviflorum, Lycopersicon chmielewskii, Lycopersicon hirsutum, Lycopersicon pennellii, Lycopersicon peruvianum, Lycopersicon chilense o Solanum lycopersicoides.

En el presente documento se describe un procedimiento para preparar una planta de Lycopersicon esculentum que comprende al menos un alelo de resistencia al TYLCV y al menos un alelo de resistencia al nematodo del nudo de la raíz en la fase de acoplamiento en dos loci, en el que el procedimiento comprende las etapas de: (a) cruzar una planta de Lycopersicon que comprende un alelo de resistencia al TYLCV con una planta de Lycopersicon que comprende un alelo de resistencia a nematodos del nudo de la raíz, (b) analizar la progenie de dicho cruce para detectar la presencia de alelos de resistencia en cada uno de los dos loci usando uno o más ensayos moleculares, y (c) seleccionar una o más plantas que comprenden los alelos de resistencia en la fase de acoplamiento.

Los ensayos de resistencia se pueden realizar opcionalmente en cualquier etapa del procedimiento. Una etapa opcional adicional (d) comprende autofecundar la planta obtenida o cruzar la planta obtenida con otra planta de tomate para crear una planta híbrida. En un aspecto preferido descrito en el presente documento, la planta obtenida mediante el procedimiento es resistente al TYLCV y muy resistente a los nematodos (como se definió).

Las plantas de partida de la etapa (a) pueden seleccionarse usando pruebas patológicas como se describe en los Ejemplos. Pueden ser plantas silvestres o cultivadas, o plantas modificadas, tales como plantas mutagenizadas o transformadas. Por ejemplo, enfoques tales como TILLING (Lesiones locales dirigidas inducidas en el genoma; McCallum y col., 2000, Nat Biotech 18: 455, y McCallum y col., 2000, Plant Physiol. 123, 439-442) o ECOTILLING (Henikoff y col., 2004, Plant Physiology Preview, 21 de mayo de 2004) se pueden utilizar para generar y/o seleccionar plantas con resistencia modificada a patógenos y/o mutaciones en alelos del locus de Ty o Mi. Estas plantas pueden usarse luego como fuentes de alelos de resistencia Ty y Mi.

A continuación, se analiza la progenie del cruce, utilizando uno o más ensayos moleculares de acuerdo con la memoria descriptiva (que se describe a continuación). La progenie analizada y de la que se seleccionan las plantas puede ser cualquiera de varias generaciones de progenie, tales como la generación F2, F3, etc., una generación de retrocruzamiento (BC1, BC2, etc.), etc., dependiendo del esquema de cruzamiento/selección deseado y los alelos presentes en las plantas utilizadas. El ensayo molecular se realiza preferiblemente en plantas F2. Además, la progenie de diferentes generaciones se puede probar repetidamente usando ensayos patológicos y/o uno o más ensayos moleculares. Se pueden realizar varios ensayos moleculares en una generación, o se pueden llevar a cabo uno o más ensayos diferentes en diferentes generaciones. Por lo tanto, las etapas (a), (b) y/o (c) pueden repetirse varias veces. El objetivo es identificar recombinantes que comprenden los alelos de resistencia Ty y Mi deseados en la fase de acoplamiento (etapa c). En este procedimiento, cualquier alelo de resistencia Ty puede combinarse (en la fase de acoplamiento) con cualquier alelo de resistencia Mi.

Las plantas se pueden distinguir de otras plantas usando ensayos moleculares, basados, por ejemplo, en una secuencia de ácido nucleico cerca o en locus de Ty- y cerca o en el locus de Mi-. Estos análisis permiten determinar la composición alélica en estos dos loci. Por ejemplo, una planta puede comprender la SEQ ID NO: 8, o una secuencia de ácido nucleico esencialmente similar a la misma (e indicativa de un alelo de resistencia Mi en el locus Mi), cerca del locus de Mi y también la SEQ ID NO: 10, o una secuencia de ácido nucleico esencialmente similar a la misma (e indicativa de un alelo de resistencia Ty en el locus de Ty unido) cerca del locus de Ty, por lo que estas regiones están unidas en fase de acoplamiento. Preferiblemente, se usan uno o más ensayos basados en pCr , como se describe en otra parte del presente documento, para distinguir entre diferentes genotipos en los loci de Mi y Ty y para seleccionar una planta recombinante que tenga los alelos deseados en la fase de acoplamiento.

La selección de una planta recombinante que comprende un alelo de resistencia Mi y Ty en la fase de acoplamiento y la introgresión de esta única unidad mendeliana en otras plantas puede lograrse usando una combinación de biología molecular, patología vegetal y técnicas tradicionales de reproducción. La presente invención usa técnicas de biología molecular para discriminar entre diferentes alelos en los loci Ty y Mi para combinar los alelos deseables para la resistencia al TYLCV y la resistencia a los nematodos de los nudos de la raíz en el genoma del tomate cultivado in cis. La presente memoria descriptiva facilita la reproducción de híbridos de tomate con resistencia múltiple tanto a TYLCV como a nematodos de los nudos de la raíz, al tiempo que mejora la capacidad del cultivador de plantas de enmascarar el arrastre genético que se asocia típicamente con estos rasgos, al tiempo que conserva la libertad de combinar la resistencia de Ty y Mi con genes de resistencia para Oidium, Cladosporium o genes de resistencia aún por descubrir presentes en este grupo de genes.

El germoplasma de tomate puede comprender cualquier alelo de resistencia Ty y cualquier alelo de resistencia Mi en la fase de acoplamiento, preferiblemente como una unidad co-heredada in cis ubicada en el cromosoma 6. Una vez que se han identificado las plantas que tienen altos niveles de resistencia (por ejemplo, comparables a los niveles de resistencia proporcionados por Ty-1 y Mi-1), las regiones de ácido nucleico descritas en este documento, que están estrechamente vinculadas a los loci de Mi y Ty, se pueden secuenciar y la información de secuencia (de la región marcadora vinculada) se puede utilizar para desarrollar un ensayo molecular para los alelos encontrados en esas plantas. Existen procedimientos alternativos para identificar alelos de resistencia Mi o Ty en varios germoplasmas, como será evidente para los expertos en la técnica. A continuación se proporcionan más detalles de tales procedimientos.

Como se mencionó anteriormente, la presente memoria descriptiva usa una combinación de biología molecular, patología vegetal y técnicas tradicionales de reproducción. Las técnicas de biología molecular utilizadas implican ensayos de marcadores que emplean, por ejemplo, cebadores de ácido nucleico que hibridan (y amplifican) una región de ácido nucleico unida al locus de Mi y/o Ty, que se comentarán con más detalle a continuación.

Las plantas pueden obtenerse mediante cualquiera de los procedimientos descritos y usarse como progenitores en un cruce con otra planta de L. esculentum. Cabe señalar que la presente invención de ninguna manera se limita técnicamente a una o más variedades específicas de tomate, sino que es generalmente aplicable a las plantas de tomate (incluidas las endogámicas, híbridas, etc.).

Ensayos moleculares

Se proporcionan aquí varios ensayos moleculares que discriminan entre la presencia o ausencia de Ty-1 y Ty+ en el locus de Ty- y entre Mi-1, Mi-J y/o Mi+ en el locus de Mi de una planta o más de estos ensayos pueden usarse en la selección asistida por marcadores, es decir, para determinar la composición alélica de plantas en el locus de Mi y Ty y para seleccionar plantas que tengan los alelos de resistencia Mi y Ty deseados en la fase de acoplamiento. Pueden desarrollarse ensayos similares para cualquier alelo de resistencia Mi y Ty, utilizando técnicas de biología molecular rutinarias. Por ejemplo, cualquier fragmento de 10, 12, 14, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 30 o más nucleótidos consecutivos de las SEQ ID NOs: 7-9 (o secuencias de ácido nucleico variantes) o de las SEQ ID NOs. 10 u 11 (o variantes de las mismas) se pueden usar para diseñar pares de cebadores o sondas de PCR para la hibridación de ácidos nucleicos y para desarrollar ensayos moleculares discriminantes basados en la información del ácido nucleico de la región amplificada por dichos pares de cebadores o de la secuencia de ácido nucleico con la que tales sondas hibridan. El tipo exacto de ensayo desarrollado no es importante, siempre que pueda discriminar entre alelos de resistencia Mi y alelos de resistencia Ty y homocigosidad/heterocigosidad en el locus de Mi y/o Ty. A continuación y en los Ejemplos se dan ejemplos de varios tipos de ensayos.

Para realizar la selección asistida por marcadores en los procedimientos de la presente invención, las plantas de tomate o partes de plantas en cuestión se someten, por ejemplo, primero a extracción de ADN, cuyas técnicas son conocidas en el arte (véase Hnetkovsky y col., Crop Sci., 36 (2): 393-400 (1996)). Una vez que se completa la extracción, se puede realizar un ensayo molecular, incluido un ensayo de secuencia polimórfica amplificada escindida (CAPS) (véase Akopyanz y col., Nucleic Acid Research, 20: 6221-6225 (1992) y Konieczny & Ausubel, The Plant Journal, 4: 403-410 (1993)) o un ensayo SCAR. Un ensayo SCAR implica amplificar el ADN en el locus (por ejemplo, un locus específico cerca del locus de Ty o el locus de Mi) mediante PCR seguida de digestión con enzimas de restricción. Los polimorfismos entre las secuencias de ácido nucleico diferencian entre diferentes alelos (tales como los alelos Mi+, Mi-J y/o Mi-1) dando como resultado, por ejemplo, fragmentos de restricción de diferentes tamaños.

En estos ensayos se emplean cebadores de ácido nucleico y enzimas para identificar qué alelos están presentes en los loci de Ty y/o Mi en el genoma de una planta de tomate y, si dichos alelos están presentes, si los alelos están presentes en una condición homocigótica o heterocigótica. La información obtenida de ambos loci se utiliza para identificar aquellas plantas que tienen combinaciones alélicas específicas en los loci de Ty y Mi en la fase de acoplamiento (es decir, in cis).

Para crear una prueba de selección asistida por marcadores, un experto en la técnica comienza comparando la secuencia de ADN de la fuente donante (es decir, el germoplasma que contiene el rasgo de resistencia a enfermedades) con la secuencia de ADN correspondiente de la fuente receptora (es decir, el germoplasma que contiene los alelos '+' susceptibles para el patógeno específico). Alternativamente, se puede realizar una comparación de secuencias entre los a Dn del donante y el receptor en las posiciones correspondientes del genoma que están estrechamente vinculadas genéticamente al rasgo de interés. Para los loci Ty y Mi, la identificación de polimorfismos cerca de estos rasgos es conocida en la técnica (véase, Zamir y col., Theor. Appl. Genet. 88: 141 (1994) y Williamson y col., Theor. Appl. Genet. 87: 757 (1994)). Para el alelo Ty-1, Zamir y col., encontraron que el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) TG97, que originalmente fue mapeado por Tanskley (Tanskley y col., Genetics 132: 1141 (1992)), estaba estrechamente ligado al locus Ty. Del mismo modo, Williamson y col., encontraron que el locus de REX-1 está estrechamente asociado con el locus de Mi.

En un aspecto, el ensayo molecular usado es un ensayo SCAR, o varios ensayos SCAR, como se observa en los Ejemplos. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 10 proporciona la secuencia de polinucleótidos cerca del alelo Ty-1 de L. chilense LA1969. La SEQ ID NO: 11 proporciona las secuencias de polinucleótidos cerca del alelo Ty+ de tipo silvestre de L. esculentum en el locus de TG97. La Figura 1 muestra una comparación de estas secuencias, destacando varios polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) presentes entre estas dos secuencias. Los SNP pueden ser mutantes, inserciones o eliminaciones de sustitución, que comúnmente se denominan INDELS. Usando los polimorfismos entre los alelos, los expertos en la técnica reconocerán que se puede desarrollar cualquier número de ensayos asistidos por marcadores y cebadores (o sondas) para los SNP. Dicho ensayo puede usarse para distinguir entre el alelo Ty-1 resistente del alelo Ty+ susceptible. Por ejemplo, el par de cebadores de las SEQ ID NOs: 1 y 2 amplifica un fragmento de aproximadamente 398 pb (usando amplificación por PCR con, por ejemplo, ADN genómico de tomate como molde). La incubación posterior del producto de amplificación con la enzima TaqI (que reconoce y restringe la secuencia T^CGA) da como resultado la restricción del producto de 398 pb amplificado de una planta que comprende el alelo Ty-1 en dos fragmentos de ácido nucleico de aproximadamente 95 pb y aproximadamente 303 pb. Por la tanto, una planta homocigótica para Ty-1 dará como resultado estos dos fragmentos (visualizados, por ejemplo, como bandas en un gel o de otro modo), mientras que una planta homocigótica para el alelo Ty+ dará como resultado un único fragmento de aproximadamente 398 pb. Una planta heterocigota (Ty-1/Ty+) produce los tres fragmentos.

De manera similar, basándose en los datos publicados por Williamson y col., Theoretical and Applied Genetics 87: 757-763 (1994), las secuencias de polinucleótidos de L. esculentum, L. peruvianum y L. chilense se determinaron en el locus cercano a Mi que se conoce como REX-1. Estas tres secuencias de polinucleótidos se proporcionan en las SEQ ID NOs: 7 (específicas para Mi+), 8 (Mi-1) y 9 (Mi-J). En la Figura 2 se muestra una comparación de estas secuencias de polinucleótidos, que revela 20 SNP entre estas tres secuencias.

Se entiende que los ensayos SCAR descritos en el presente documento se pueden modificar o reemplazar fácilmente por otros ensayos moleculares y se pueden desarrollar fácilmente para cualquier alelo del locus de Ty- y/o Mi-. Además, el ensayo puede basarse en otros polimorfismos distintos de los SNP, como la eliminación, inserción o sustitución de dos o más nucleótidos.

Como ya se mencionó, se pueden diseñar cebadores específicos o degenerados que hibriden y amplifiquen todo o parte de las SEQ ID NOs: 7-11, o todo o parte de cualquiera de sus variantes o regiones flanqueantes en el genoma. Alternativamente, los cebadores pueden diseñarse para amplificar partes de los alelos de resistencia directamente u otras regiones de ácido nucleico cercanas a los loci de Mi y Ty. Además, cuando se desee, los cebadores se pueden modificar para su uso en otros ensayos de selección asistida por marcadores, como el ensayo TaqMan® de Applied Biosystems, Foster City, CA, usando técnicas conocidas en la técnica, incluidas las descritas en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.464.746, 5.424.414 y 4.948.882.

Para diseñar una nueva prueba molecular para distinguir un nuevo alelo de resistencia Ty o Mi, los expertos en la técnica reconocen que, por ejemplo, se determinaría primero la secuencia de ADN en el locus del marcador en o cerca del locus de Mi o Ty (utilizando, por ejemplo, amplificación por PCR y los pares de cebadores descritos en este documento y secuenciación del producto de amplificación), y luego comparar la secuencia con el ADN correspondiente de las otras secuencias marcadoras (en o cerca de otros alelos del locus de Mi y Ty). Con esta comparación de ADN, los expertos en la técnica podrían identificar nuevos polimorfismos de secuencia o si quedan polimorfismos existentes previamente descubiertos con otras comparaciones. Con estos datos, se puede diseñar una nueva prueba molecular o utilizar una prueba existente para facilitar la selección de cualquier combinación alélica en los loci de Ty y Mi juntos in cis.

Pueden usarse procedimientos similares a los descritos anteriormente para seleccionar y/o introgresar un alelo que codifica la resistencia a los nematodos de los nudos de la raíz. A modo de ejemplo, se describirá un ensayo para determinar la presencia del alelo Mi-1 en el genoma de una planta de tomate. Se puede determinar un ensayo para determinar la presencia del alelo Mi-1 de una manera similar a las utilizadas para identificar el alelo Ty-1 descrito anteriormente. Sin embargo, si se sospecha que la planta bajo investigación podría contener el alelo Mi-J, entonces la identificación de la presencia del alelo Mi-1 en el genoma de la planta puede implicar, pero no necesariamente, la realización de dos ensayos moleculares, tal como los descritos en los Ejemplos. En cualquier caso, el orden en el que se realizan estos ensayos no es crítico. Los ensayos descritos anteriormente se pueden usar individual y colectivamente en un programa de cultivo para facilitar el cultivo y/o selección de plantas de tomate que contienen el alelo de resistencia Ty y el alelo de resistencia Mi en la fase de acoplamiento.

Un ejemplo de cómo se pueden utilizar estos procedimientos se describe a continuación, para la selección de una planta que comprende Mi-1 y Ty-1 en fase de acoplamiento. Una primera línea de tomate endogámica puede cruzarse con una segunda línea de tomate endogámica para producir una planta híbrida. Una planta de tomate utilizada en el cruce contenía el alelo Ty-1 y la segunda planta el alelo Mi-1 en su genoma. A continuación, se permite que una planta resultante (híbrido F1) se autopolinice, fertilice y produzca semillas (semilla F2). Las plantas f2 se cultivan a partir de la semilla F2 (o se autofecundan o se cruzan, por ejemplo, se retrocruzan con uno de los progenitores). A continuación, estas plantas se someten a extracción de ADN, cuyas técnicas son conocidas en la técnica (véase Hnetkovsky y col., 1996, Crop Sci., 36 (2): 393-400) y la PCR se lleva a cabo directamente en muestras de tejido triturado.

Por tanto, los ensayos descritos anteriormente se pueden usar para identificar plantas F2 (u otra progenie) que contienen el alelo Ty-1 en un estado heterocigoto y el alelo Mi-1 en un estado homocigótico. Alternativamente, se puede identificar una planta F2 que contiene el alelo Ty-1 en un estado homocigoto y el alelo Mi-1 en un estado heterocigoto. Por tanto, utilizando uno o más ensayos moleculares, tales como los ensayos SCAR descritos, se pueden identificar plantas recombinantes que comprenden Ty-1 y Mi-1 en acoplamiento.

Debido a que la recombinación entre los loci de Ty y Mi es baja, es raro encontrar recombinantes en la generación F2. Los ensayos descritos en el presente documento también pueden usarse para determinar si los alelos Ty-1 y/o Mi-1 están presentes en el genoma de la planta en la condición homocigótica o heterocigótica. Dependiendo de los resultados del ensayo o ensayos, puede ser necesario un cultivo y una caracterización molecular adicionales. Por ejemplo, si el objetivo del programa de cultivo es crear una línea endogámica y los resultados de uno o más de los ensayos descritos anteriormente para una planta de tomate específica que se está probando revelan que la planta contiene el alelo Mi-1 en su genoma en una condición homocigótica y el alelo Ty-1 en una condición heterocigótica, entonces esa planta puede someterse a una autofertilización adicional, cultivo y/o caracterización molecular usando uno o más de los ensayos descritos en este documento, hasta que se haya determinado que dicha planta y su progenie, después de la autofecundación, contiene tanto el alelo Mi-1 como el alelo Ty-1 en su genoma en condiciones homocigotas. Una vez que los alelos Mi-1 y Ty-1 se crean en la fase de acoplamiento, o in cis, se heredarán juntos. Este bloque heredable de alelos de resistencia múltiple proporciona al cultivador flexibilidad para crear nuevos híbridos, al mismo tiempo que permite al cultivador la capacidad de enmascarar los efectos de resistencia genética de las introgresiones de especies silvestres con el segundo progenitor endogámico. Además, es posible una combinación fácil con otros genes de resistencia, como los genes de resistencia a Oidium y Cladosporium.

Como se mencionó brevemente anteriormente, los procedimientos descritos en este documento pueden usarse para crear líneas endogámicas nuevas y superiores. Estas líneas endogámicas se pueden usar en la reproducción posterior para crear plantas de tomate híbridas que sean resistentes a TYLCV y nematodos de los nudos de la raíz y que también posean otras características comercialmente deseables. Estas líneas endogámicas son útiles en la reproducción porque estas líneas permiten la transferencia de los alelos Ty-1 y Mi-1 como una sola unidad co­ heredable que facilita la reproducción rápida. Además, los procedimientos descritos anteriormente también son útiles para confirmar que una línea endogámica contiene de hecho el alelo Ty-1 y el alelo Mi-1 en su genoma en una condición homocigótica y mantiene su homocigosidad. Una vez que se obtiene esta confirmación, la línea endogámica puede usarse en cruces con una segunda línea endogámica para transferir el alelo Ty-1 y el alelo Mi-1 a una planta de tomate híbrida como una sola unidad conjuntamente heredable. La segunda línea endogámica puede portar los alelos de tipo silvestre Ty y Mi para enmascarar los efectos del arrastre genético.

Kits

En otro aspecto más, se proporcionan ensayos moleculares para determinar la composición alélica en el locus de Mi y/o Ty. Dichos ensayos implican extraer ADN de una o más plantas de tomate, amplificar parte del ADN unido a o en el locus de Mi y/o Ty usando al menos un par de cebadores de PCR, restringir opcionalmente el producto de amplificación con una o más enzimas de restricción y visualizar los fragmentos de ADN.

Se proporciona además un kit de detección para determinar la composición alélica de una planta o tejido vegetal en el locus de Mi y en el locus de Ty. Dicho kit comprende uno o más pares de cebadores, tales como las SEQ ID NOs: 1 y 2, las SEQ ID NOs: 3 y 4 y/o las SEQ ID NOs: 5 y 6, o variantes de las mismas. Además, se pueden incluir instrucciones y, opcionalmente, material vegetal o ADN (por ejemplo, de tejido de control).

Ejemplos

Evaluación de la eficacia de la resistencia a los nematodos

La línea FDR16-2045 es objeto de la patente estadounidense No. 6.414.226. Contiene el alelo Ty-1 en el locus de Ty; el origen de este alelo fue una introgresión de L. chilense, un pariente silvestre del tomate moderno, L. esculentum. El alelo Ty-1 confiere resistencia al patógeno comercialmente importante, el virus del rizado de la hoja amarilla del tomate (TYLCV). Conjuntamente heredada con esta introgresión, la línea FDR16-2045 contiene el alelo Mi-J en el locus de Mi cercano. El alelo Mi-J confiere resistencia a los nematodos de los nudos de la raíz, otro patógeno comercialmente importante.

En los experimentos de reproducción y patología, el nivel de resistencia conferido por el alelo Mi-J no es tan eficaz contra los nematodos de los nudos de la raíz como lo fue un alelo alternativo, Mi-1, en el locus de Mi. Esto fue particularmente evidente cuando el alelo Mi-J estaba presente en una condición heterocigótica, emparejado con el alelo susceptible de tipo '+' de L. esculentum. Por lo tanto, una serie de experimentos de patología descritos en el presente documento cuantifican los niveles de resistencia utilizando los alelos de resistencia Mi-1 y Mi-J.

Ejemplo 1: Pruebas de patología para determinar la resistencia a Meloidogyne incógnita

Se usó un ensayo de patógenos vivos para evaluar la resistencia a Meloidogyne incógnita, un agente etiológico de la enfermedad del nematodo del nodo de la raíz en tomates. La clasificación de resistencia se basa en la extensión y el tamaño de la formación de agallas. La Tabla 1 proporciona el sistema de puntuación para determinar la resistencia a los nematodos de los nudos de la raíz. Se utilizó una escala de cero a cuatro (Tabla 1) para puntuar los síntomas de la enfermedad de M. incógnita.

Tabla 1

PUNTAJE DE CALIFICACIÓN SEVERIDAD DE LOS SÍNTOMAS

0 NO HAY AGALLAS PRESENTES

1 UNA A DOS AGALLAS PEQUEÑAS (<1 MM)

2 ALGUNAS AGALLAS (3-7), DE TAMAÑO PEQUEÑO (< 1 MM),

DISEMINADAS

3 VARIAS AGALLAS (> 7), DE MAYOR TAMAÑO (> 1 MM), DISEMINADAS

4 MUCHAS AGALLAS, EN CADENAS, RAÍCES DEFORMADAS

El inóculo de Meloidogyne incógnita se preparó infectando plantas de una línea de tomate susceptible durante dos meses; en ese momento, las raíces de las plantas infectadas muestran masas de huevos maduros del patógeno. Las raíces se recolectaron para la preparación del inóculo y se cortaron en trozos de cuatro a cinco centímetros. La prueba germina semillas en presencia de inóculo infectado. Las semillas se siembran en bancos de invernadero que contienen una mezcla de tierra de turba, vermiculita y arena (proporción 4:1:1, respectivamente). Las semillas de una línea se sembraron en hileras, aproximadamente a 4 cm de distancia, con 4,5 a 5 cm entre las hileras. Se hicieron pequeños orificios, a intervalos de aproximadamente 12 cm entre cada fila, para el inóculo. En estos agujeros se insertaron dos o tres piezas del inóculo preparado y se cubrieron con tierra. Con espaciamiento alterno del inóculo a cada lado de una fila, cada semilla estaba aproximadamente a 6-7 cm del inóculo. Las plántulas fueron germinadas y cultivadas en un invernadero con un intervalo de temperatura diaria entre 22-26 °C. Las calificaciones se realizaron 28 días después de la siembra arrancando cada planta e inspeccionando las raíces para detectar la presencia de agallas.

Las pruebas se realizaron por duplicado con líneas de cultivo, híbridos y líneas de control. Los resultados de las pruebas de patología para la resistencia a los nematodos se muestran en la Tabla 2.

En la columna de la izquierda están los nombres de las líneas probadas. Estos están organizados en secciones que contienen líneas de cultivo, líneas híbridas y líneas de control. En la siguiente columna se enumeran los genotipos en los loci de Mi y Ty. Estos genotipos se determinaron mediante ensayos de marcadores moleculares descritos en este documento. La siguiente serie de cinco columnas contiene los puntajes de calificación de las pruebas calificadas en dos ocasiones distintas. Las últimas cinco columnas suman los resultados de estas dos pruebas.

Debido a que hay 14 muestras, con genotipos variables en los loci de Ty y Mi, las tendencias de rendimiento en la Tabla 2 pueden ser difíciles de reconocer. De las 14 muestras, solo hay cinco genotipos en el locus de Mi. Un genotipo es homocigoto para el alelo susceptible de L. esculentum. Esto se designa /+. Un segundo genotipo es un heterocigoto, con el alelo Mi-J emparejado con el alelo susceptible '+'. Un tercer genotipo tiene el alelo Mi-J en estado homocigótico. Los genotipos cuarto y quinto contienen el alelo Mi-1, presente como homocigoto y heterocigoto con el alelo '+', respectivamente.

Cuando los datos de la Tabla 2 se condensan y promedian de acuerdo con el genotipo en el locus de Mi, la eficacia de diferentes combinaciones alélicas para la resistencia a los nematodos se vuelve clara (Figura 3). En la Figura 3, se proporcionan las calificaciones de enfermedad promedio para los genotipos que se encuentran en la Tabla 2. Las líneas de la Tabla 2 se analizaron de acuerdo con los genotipos en el locus de Mi. Estas clases genotípicas se muestran en el eje Y. El eje X proporciona las calificaciones promedio de enfermedad para estas cinco clases genotípicas.

La Figura 3 muestra que el alelo Mi-1, originalmente introgresado de L. peruvianum, confiere el nivel más fuerte de resistencia a los nematodos. También está claro que la resistencia es fuerte independientemente de si Mi-1 está presente como heterocigoto (con el alelo '+' susceptible) o como homocigoto. Esto demuestra que el alelo Mi-1 confiere resistencia de manera dominante. En comparación con los otros genotipos, los genotipos Mi-1/Mi-1 y Mi-1/+ confieren un fenotipo altamente resistente a la resistencia a los nematodos. Esta clase "altamente resistente" se define por tener una puntuación de resistencia promedio, determinada por la metodología descrita en este documento, de menos de 0,1.

La siguiente clase más resistente es de las líneas que tienen el alelo Mi-J, introgresado de L. chilense, en el estado homocigótico. Esta clase de resistencia se define como "resistencia intermedia" y está dentro del intervalo de puntuación promedio igual o superior a 0,1, pero inferior a 1,0. Por lo tanto, la línea endogámica FDR16-2045 tiene un nivel de resistencia intermedio.

Una tercera clase de resistencia, definida como "resistencia moderada", está ejemplificada por líneas que tienen el alelo Mi-J en la condición heterocigótica, emparejadas con el alelo susceptible, '+'. Esta clase tiene una clasificación de resistencia promedio mayor o igual a 1,0 pero menor a 2,0. Si la línea endogámica FDR16-2045 se utiliza como progenitor endogámico para crear una variedad de cultivo híbrido, y si el segundo progenitor contiene el alelo '+' susceptible, entonces ese híbrido mostraría solo una resistencia modesta. Al comparar el comportamiento del alelo Mi-J en la clase de resistencia intermedia y resistencia modesta, es evidente que este gen actúa de forma semidominante.

La clase final se define como susceptible y contiene aquellas líneas que son homocigotas para el alelo susceptible de L. esculentum, o /+. Esta clase susceptible se define por tener un puntaje promedio de calificación de enfermedad superior a 2.

Los resultados de estos ensayos muestran los diferentes niveles de resistencia que se pueden lograr en el cultivo de tomates utilizando los alelos de L. peruvianum (Mi-1), L. chilense (Mi-J) y L. esculentum ('+'). Con base en estos datos, un cultivador de tomates puede crear un variedad de cultivo híbrido cruzando una línea endogámica que contiene el alelo de resistencia en el locus de Ty (Ty-1) con una línea endogámica que contiene el mejor alelo de resistencia en el locus de Mi (Mi-1). Sin embargo, esta estrategia tiene dos limitaciones críticas. En primer lugar, elimina la capacidad del cultivador de suministrar otros genes de resistencia a enfermedades que se mapean en el grupo de enfermedades en la región centromérica del cromosoma 6. Ejemplos de otros genes de resistencia a enfermedades que se sabe que mapean en esta área son los genes de resistencia de Cladosporium, raza 2 y raza 5 y el gen de resistencia para Oidium. En segundo lugar, debido a que el cultivador está introgresando dos regiones, cada una de las cuales se origina en una especie silvestre, y se sabe que cada una de ellas produce arrastre genético, esto limita su capacidad para enmascarar los efectos del arrastre genético mediante el uso de genes del tomate moderno (L. esculentum ).

Las plantas de tomate con Ty-1 y Mi -1 in cis descritas en el presente documento proporcionan una nueva combinación de alelos que pueden abordar estas limitaciones y permiten a los cultivadores de tomates más opciones para crear variedades de cultivo con múltiples resistencias a enfermedades.

Ejemplo 2: Protocolo para determinar la resistencia al virus del rizado de la hoja amarilla del tomate (TYLCV)

Este ejemplo describe un protocolo para determinar si las plantas de tomate son resistentes, resistentes intermedias o susceptibles a TYLCV.

Las plantas se cultivan en un campo con infección natural de TYLCV a través de Bemisia tabaci. La infección de campo que ocurre naturalmente es un procedimiento preferido para determinar la resistencia en áreas en las que el virus es endémico, ya que el movimiento del patógeno viral puede ser controlado por varias agencias gubernamentales (enfermedad de cuarentena). Por ejemplo, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos normalmente no permitirá la introducción del patógeno TYLCV en la mayoría de las regiones productoras de tomate de los Estados Unidos en las que el patógeno normalmente no existe. La realización de exámenes de detección de enfermedades en condiciones controladas es engorrosa debido a la necesidad de criar insectos (Bemisia tabaci) para la transmisión del virus.

Se utilizó una escala de 0 a 4 (Tabla 3) para puntuar los síntomas de la enfermedad de TYLCV:

Tabla 3

Una línea o variedad de plantas se clasifica como resistente a TYLCV cuando la puntuación promedio es 0-1, resistencia intermedia cuando la puntuación promedio es aproximadamente 2 y susceptible cuando la puntuación promedio es superior a 3. Alternativamente, protocolos para determinar TYLCV que se conocen en la técnica también se pueden utilizar. "Tomato Yellow Leaf Curl Virus from Sardinia is a whiteflytransmitted monopartite geminivirus"; A. Keyyr-Pour, M. Bendahmane, V. Matzeit, G.P. Acotto, S. Crespi, B. Gronenborn.; Nucleic Acids Research, Volumen 19, páginas 6763-6769.; Tomato Yellow Leaf Curl Virus: a whitefly transmitted geminivirus with a single genomic component", N. Navot, E. Pichersky, M. Zeidan, D. Zamir, H. Czosnek. Virology, 185, 1991, páginas 151-161.

Pruebas moleculares para discriminar composiciones alélicas en los loci de Mi y Ty

Se usó una combinación de tres pruebas de marcadores moleculares para determinar los genotipos en los loci de Mi y Ty. En el locus de Ty, solo se requiere una única prueba de marcador molecular codominante para discernir entre los dos alelos alternativos posibles, Ty-1 y '+'. Los expertos en la técnica reconocerán que los ensayos codominantes se definen como ensayos que pueden discernir las tres posibilidades alélicas en los loci bialélicos. En estos loci, se pueden puntuar tres genotipos: cada una de las clases homocigotas y la clase heterocigótica. Típicamente, los ensayos de marcadores como regiones amplificadas caracterizadas secuenciadas, o ensayos SCAR, sitios polimórficos amplificados escindidos o ensayo CAPS y ensayos polimórficos de un solo nucleótido o SNP son todos ensayos típicamente codominantes. Por el contrario, la amplificación aleatoria de ADN polimórfico y el polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP) son típicamente marcadores dominantes y no proporcionan tanta información como los marcadores codominantes. En el locus de Mi, se requieren dos pruebas para determinar las posibles combinaciones entre los tres alelos (Mi-1, Mi-J y '+'). Aunque de ninguna manera limitante, los ensayos de marcadores descritos en este documento son todos ensayos de tipo SCAR.

Como la mayoría de las otras pruebas de marcadores moleculares, los ensayos SCAR realizados utilizan la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, que puede amplificar el ADN alrededor de mil millones de veces a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida. El uso de la PCR es bien conocido por los expertos en la técnica y permite al investigador recolectar solo cantidades muy pequeñas de muestras de plantas para realizar la prueba. Para realizar estas pruebas se necesita menos de 1 cm12 de material foliar, preferiblemente tejido joven en crecimiento activo. Esta es una muestra tan pequeña que a estas pruebas de marcadores se las suele denominar no destructivas. Se consideran no destructivas ya que la toma de muestra no interfiere en absoluto en el desarrollo de la planta. Por lo tanto, esta pequeña muestra no afecta el resultado de ninguna cantidad de pruebas posteriores, desde pruebas de patología, análisis bioquímicos de frutos, pruebas de rendimiento o evaluaciones hortícolas. Además de no ser destructivo, un ensayo SCAR también proporciona la ventaja adicional del tiempo. Normalmente, el genotipo en el locus o loci de interés se puede determinar en 24 horas.

Cada una de las tres pruebas de marcadores moleculares utilizadas requiere el aislamiento de ADN genómico.

Ejemplo 3: Aislamiento de ADN de tomate para pruebas de marcadores

De ninguna manera limitante, el siguiente protocolo se puede usar para extraer ADN de tomate para posterior ensayo de marcadores moleculares. Los expertos en la técnica reconocen que muchos protocolos de extracción de ADN están disponibles en la técnica anterior. Todos los productos químicos descritos en el protocolo se pueden obtener a través de Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri. El procedimiento incluye las siguientes etapas:

1. Recolectar una parte de la planta que tenga aproximadamente el tamaño de un pocillo en el formato de placa de microtitulación de 96 pocillos. Preferiblemente, se usa una muestra de semilla o se toma una muestra de tejido de hojas jóvenes.

2. Agregar 150 |jl de tampón de extracción (Tris-HCl 200 mM, pH 7,5; NaCI 250 mM; EDTA 25 mM; SDS al 0,5%) a la muestra y macerar el tejido.

3. Centrifugar la placa durante 15 minutos a 1900 x g a 15 °C.

4. Transferir 100 j l de la fracción sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos que contenga 100 j l de acetato de potasio 2,5 M (pH 6,5) en cada pocillo. Mezclar agitando durante aproximadamente 2 minutos a 200 rpm. 5. Centrifugar la placa durante 15 minutos a 1900 x g a 15 °C.

6. Transferir 75 j l de la fracción sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos que contenga 75 j l de isopropanol. Mezclar, luego agitar durante 2 minutos a 200 rpm.

7. Centrifugar la placa durante 15 minutos a 1900 x g a 15 °C.

8. Eliminar la fracción sobrenadante y agregar 200 j l de etanol al 70% a la fracción de sedimento. Agitar a 200 rpm durante 5 minutos y luego incubar durante la noche a -20 °C.

9. Centrifugar la placa durante 15 minutos a 1900 x g a 15 °C.

10. Eliminar la fracción sobrenadante. Agregar 200 j l de etanol al 70% al sedimento, permitiendo que el alcohol lave el sedimento durante 1 hora a temperatura ambiente.

11. Centrifugar la placa durante 15 minutos a 1900 x g a 15 °C.

12. Descartar la fracción sobrenadante y secar la fracción de sedimento a temperatura ambiente. Esto demora aproximadamente 1 hora.

13. Disolver la fracción de sedimento en 100 j l de TE (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, 5 jg/m l de ARNasa A) durante 15 minutos a 37 °C. A menos que se proceda a la etapa de PCR, el ADN se puede almacenar a 4 °C o -20 °C.

Ejemplo 4: Condiciones generales de PCR para los ensayos SCAR

Cada uno de los tres ensayos de marcadores SCAR comparte un diseño y ejecución similares. Cada ensayo contiene un par de oligonucleótidos de ADN específicos, denominados cebadores porque se utilizarán en la reacción de PCR para cebar la síntesis de ADN. Estos cebadores tienen típicamente entre 15 y 25 nucleótidos de longitud; estos tramos de nucleótidos coinciden con la secuencia de ADN del sustrato en el locus marcador a amplificar. Estos cebadores están diseñados de manera que facilitarán la síntesis de un amplicón, normalmente entre 100 y 1000 pares de bases. Los expertos en la técnica saben cómo diseñar estos cebadores para crear ensayos de tipo SCAr y, a menudo, utilizan programas de software, tales como el software Primer3 disponible públicamente (Whitehead Institute, Cambridge, MA) para ayudar en el diseño. Los cebadores se pueden sintetizar usando una metodología conocida en la técnica, o se pueden adquirir en cualquier número de compañías de oligonucleótidos personalizados. Todos los cebadores utilizados en estos ensayos se adquirieron a través de la Operon Company, Alameda, CA. Pueden adquirirse otros reactivos de la reacción de PCR de cualquier número de proveedores comerciales; en los ensayos descritos en el presente documento, se adquirieron los cuatro trifosfatos de desoxirribonucleótido-5' (dNTP) a través de la Pharmacia Company, Kalamazoo, MI, el tampón de PCR y la enzima polimerasa Taq a través de la Applied Biosystems Company, Foster City, CA. Los expertos en la técnica reconocen que existe cierta flexibilidad en la realización de ensayos SCAR porque hay muchos tipos de máquinas de PCR y condiciones de ensayo que pueden usarse. Se utilizó una máquina de PCR modelo 9700 de Applied Biosystems Company, Foster City, CA, con los siguientes parámetros de ejecución para cada uno de los tres ensayos. Una etapa de desnaturalización inicial durante 2 minutos a 94 °C fue seguida por 35 ciclos de amplificación. Cada ciclo de amplificación tenía tres etapas de 30 segundos a 92 °C, luego 30 segundos a 50 °C, luego 90 segundos a 72 °C. Después del ciclo 35, las muestras se mantuvieron a 72 °C durante 5 minutos. Aunque esto finaliza el ensayo de amplificación por PCR, las máquinas de PCR se programaron para mantener las reacciones terminadas a 25 °C hasta que las recupere el investigador.

Los expertos en la técnica reconocen que se permite una flexibilidad considerable en las condiciones del ensayo de PCR. Las reacciones de PCR se prepararon con 1 jL de la plantilla de ADN, 10 picomoles de cada uno de los dos cebadores de PCR específicos del ensayo, un volumen final de 200 jM para cada uno de los cuatro dNTP, 2,5 j l de tampón de PCR 10X y 1,25 unidades de Taq polimerasa. Se utilizó agua estéril para llevar el volumen final de las reacciones a 25 jl.

Cada ensayo SCAR también tiene características comunes en la forma en que se revelan los polimorfismos después de que se hayan completado las reacciones de PCR. Para cada prueba, la región amplificada de ADN de la reacción de PCR puede contener un sitio de reconocimiento de enzima de restricción polimórfica. Los alelos alternativos tienen o no tienen este sitio de reconocimiento. Cuando los productos de la PCR se digieren con una enzima de restricción específica, el amplicón no se corta porque el sitio de la enzima de restricción no está presente o se digiere asimétricamente en dos fragmentos. El genotipo del locus se puede determinar resolviendo electroforéticamente estos fragmentos en un gel de agarosa, tiñendo el gel con bromuro de etidio, que es una tinción que se une al ADN, y luego visualizando los fragmentos excitando el ADN con luz ultravioleta. Los tamaños de los fragmentos de las reacciones de PCR se determinan comparándolos con estándares de tamaño conocidos, que se someten a electroforesis en carriles cercanos en el gel de agarosa. Dos de los ensayos SCAR utilizan la enzima de restricción Taql para revelar los polimorfismos. Para estos ensayos, se añaden 3 j l de tampón de enzima de restricción 10X, 0,25 j l de enzima de restricción Taql y 1,75 j l de agua a la reacción post-PCR y se incuban a 65 °C durante aproximadamente 3 horas. El tercer ensayo utiliza la enzima de restricción Malll para revelar los genotipos. En esta prueba, se añaden 3,5 j l de tampón de enzima de restricción 10X, 0,25 j l de Malll y 6,25 j l de agua a la reacción post-PCR y luego se incuban a 37 °C durante aproximadamente 3 horas. Los expertos en la técnica reconocen que varios proveedores comerciales venden enzimas de restricción y tampones. Se usaron reactivos de New Englands Biolabs, Beverly, MA. Después de la digestión con las enzimas de restricción, los productos se resolvieron electroforéticamente en geles de agarosa entre el 1 y el 2% (p/v), de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (Current protocols in molecular biology (1994) F. Ausubel, editor, John Wiley and Sons, Nueva York).

Ejemplo 5: prueba SCAR en el locus de Ty

Zamir mapeó el gen Ty-1 cerca de un marcador de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) llamado TG97 ((1994) Theoret. Appl. Genet. 88: 141-146). Debido a que los ensayos RFLP son más difíciles de realizar, son destructivos para la planta, costosos y lentos de realizar, este RFLP se convirtió en un marcador SCAR secuenciando el locus RFLP utilizando tanto el alelo '+' como el alelo de resistencia Ty-1 como sustratos. La comparación de estas secuencias permitió el descubrimiento del sitio de restricción polimórfica.

La prueba SCAR se realiza como se describe en el presente documento, con los siguientes pares de cebadores específicos.

SEQ ID 1: 5' TAA TCC GTC GTT ACC TCT CCT T 3' y

SEQ ID 2: 5' CGG ATG ACT TCA ATA GCA ATG A 3'.

El polimorfismo puede revelarse mediante digestión post-PCR con la enzima de restricción TaqI. Si el alelo Ty-1 está presente como homocigoto, el amplicón de PCR de 398 pares de bases será digerido en fragmentos de 95 y 303 pares de bases porque el amplicón producido a partir de este alelo contiene el sitio de reconocimiento de restricción TaqI. Si el alelo de tipo '+' está presente como un homocigoto, el amplicón de PCR de 398 pares de bases no será digerido por la enzima TaqI. Para muestras heterocigotas, aproximadamente la mitad de la reacción de PCR se digiere en fragmentos de 95 y 303 pares de bases y aproximadamente la mitad de la reacción de PCR no se digiere. Cuando se resuelven electroforéticamente, los heterocigotos tendrán tres fragmentos: 95, 303 y 398 pares de bases de longitud. De esta manera, el genotipo en el locus de Ty se puede determinar de forma rápida y precisa.

Ejemplo 6: prueba SCAR1 en el locus de Mi (discriminando los alelos Mi-1 o Mi-J del alelo '+')

Con base en los datos publicados por Williamson y col., (Theoretical and Applied Genetics 87: 757-763 (1994)), se determinaron las secuencias de polinucleótidos de L. esculentum, L. peruvianum y L. en el locus cercano a Mi que se denomina como REX-1.

La prueba SCAR se realiza como se describe en el presente documento (también como lo describen Williamson y col.), Con los siguientes pares de cebadores específicos.

SEQ ID 3: 5' AAC CGT GGA CTT TGC TTT GAC T 3' y

SEQ ID 4: 5' TAA GAA CAG GGA CTC AGA GGA TGA 3'.

Como el ensayo SCAR descrito en el presente documento para el locus de Ty, el ensayo SCAR No. 1 del locus de Mi también usa un sitio de reconocimiento de enzima de restricción TaqI polimórfico; el polimorfismo puede revelarse mediante digestión enzimática de los productos de la PCR con la enzima de restricción TaqI. Si el alelo Mi-1 o el alelo Mi-J está presente como un homocigoto, o el alelo Mi-1 y los alelos Mi-J están presentes como un heterocigoto, el amplicón de PCR de 595 pares de bases se digiere en fragmentos de 145 y 450 pares de bases porque estos alelos contienen el sitio de reconocimiento de restricción de TaqI. Si el alelo de tipo '+' está presente como un homocigoto, el amplicón de PCR de 595 pares de bases no será digerido por la enzima TaqI. En el caso de muestras heterocigotas (Mi-1/+ o Mi-J/+, aproximadamente la mitad de la reacción de PCR se digiere en fragmentos de 145 y 450 pares de bases y aproximadamente la mitad de la reacción de PCR no se digiere. Cuando se resuelven electroforéticamente, estos heterocigotos tendrán tres fragmentos de 145, 450 y 595 pares de bases de longitud. De esta manera, se puede determinar si los alelos de resistencia (ya sea Mi-1 o Mi-J) están presentes o si el alelo susceptible ('+') está presente, o si los alelos de resistencia (ya sea Mi-1 o Mi-J) y el alelo susceptible ('+') están presentes como heterocigotos.

Ejemplo 7: prueba SCAR2 en el locus de Mi (discriminando el Mi-J de los alelos Mi-1 o '+')

Debido a que la prueba SCAR descrita en el ejemplo 6 anterior no permite la discriminación entre los alelos de resistencia Mi-1 y Mi-J, se desarrolló otro ensayo SCAR en el marcador REX-1. Esta prueba se desarrolló secuenciando los alelos Mi-1, Mi-J y '+' en este loci marcador. Desafortunadamente, no hubo un solo nucleótido que tuviera un polimorfismo diferente para cada uno de los tres alelos. Se descubrió un polimorfismo de base única en un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción llamado MaIII. Específicamente, el alelo Mi-J contenía este sitio de reconocimiento, mientras que los alelos Mi-1 y '+' no contenían este sitio de reconocimiento.

Con base en este polimorfismo, se desarrolló un segundo ensayo SCAR, y se puede realizar como se describe en este documento con los siguientes pares de cebadores específicos:

SEQ ID 5: 5' CTA CGG AGO ATG CAA ATA GAA

SEQ ID 6: 5' AAT CAT TAT TGT CAC ACT TCC CC

Después de la reacción de PCR, el polimorfismo se puede revelar digiriendo la reacción con la enzima de restricción Malil mediante los procedimientos descritos en el presente documento. Si el alelo Mi-J está presente, el amplicón de 282 pares de bases será digerido en fragmentos de 124 y 158 pares de bases. Si están presentes el alelo Mi-1 o el alelo '+', el amplicón no es digerido por la enzima MalII. Los heterocigotos (ya sea Mi-J/Mi-1 o Mi-J/+) tendrán los tres fragmentos (124, 158 y 282 pares de bases). Usando ambos ensayos SCAR en los loci de Mi (ejemplos 6 y 7), se puede determinar el genotipo en el locus de Mi, independientemente de qué combinación de los tres alelos posibles estén presentes (Mi-1, Mi-J o '+').

Ejemplo 8: Protocolo de cultivo para combinar los alelos más eficaces en los loci de Mi y Ty

Comenzando con dos líneas parentales, cada una de las cuales contiene un alelo fijo de interés que está estrechamente ligado, los expertos en la técnica reconocerán que existen varias estrategias genéticas posibles para lograr el objetivo de combinar estos rasgos de interés in cis. Todas estas estrategias, sin embargo, comienzan cruzando las líneas parentales, cada una con un rasgo de interés para hacer un híbrido F1. Preferiblemente, las líneas parentales deben fijarse cada una para uno de los rasgos de interés. La planta F1 puede autopolinizarse para crear una población F2 segregante, o puede retrocruzarse con cualquier línea parental. Independientemente de la estrategia de cruzamiento, los expertos en la técnica reconocerán que se pueden crear nuevos recombinantes de interés a medida que la planta F1 produce gametos mediante el proceso de meiosis.

De ninguna manera limitante, se siguió una estrategia F2 para combinar los alelos Mi-1 y Ty-1 in cis. Específicamente, en el otoño de 1997 se realizó un cruce entre las líneas de cultivo endogámicas FIR16-176 y FDR16-2045 en Nimes, Francia. Ambas líneas de cultivo son del programa de cultivo de tomates de Seminis Vegetable Seeds, Inc., el cesionario de la presente invención. La línea endogámica FIR16-176 contiene el alelo susceptible '+' en el locus de Ty y el alelo Mi-1 en el locus de Mi cercano. La línea endogámica FDR16-2045, que es objeto de la patente de los Estados Unidos No. 6.414.226, contiene el alelo Ty-1 en el locus de Ty y el alelo Mi-J en el locus de Mi cercano. La planta F1, designada # 1652817, contiene así un par de emparejamientos de alelos in cis en los loci de Ty y Mi, que representan los genotipos parentales. Estos emparejamientos se dibujan comúnmente subrayados juntos, el subrayado representa que los loci están genéticamente ligados. Por ejemplo, la planta F1 tiene los emparejamientos '+' Mi-1 y Ty-1 Mi-J in cis. Aunque la recombinación podría haber ocurrido cuando los progenitores se sometieron a la meiosis, no pudo haber ocurrido una recombinación efectiva porque cada una de estas líneas se fijó en los loci de Mi y Ty.

La planta F1 No. 1652817 se autopolinizó para crear una población F2. Como la planta F1 creó gametos a través de la meiosis, la mayoría de los gametos retienen las combinaciones alélicas de los progenitores originales ('+' Mi-1 y Ty-1 Mi-J). La distancia genética entre los loci de Ty y Mi determina la frecuencia relativa con la que se producirán los gametos recombinantes ('+' Mi-J y Ty-1 Mi-1). Debido a que los loci de Ty y Mi están situados cerca y numerosos investigadores han demostrado que la recombinación está suprimida en esta región del cromosoma 6, los expertos en la técnica esperarían que el número de gametos recombinantes fuera muy bajo en comparación con los gametos parentales.

Luego se desarrolló una serie de pruebas moleculares, descritas en el presente documento, para identificar recombinantes que tienen los alelos Ty-1 y Mi-1 in cis, porque identificar esto en el emparejamiento in cis a través de cribado de patología fenotípica no fue posible sin cribado multigeneracional de varios años. Los expertos en la técnica reconocerán que la identificación fenotípica de este emparejamiento in cis es posible, pero será evidente que el procedimiento de identificación molecular descrito en este documento es un procedimiento más rápido y mucho más eficaz para identificar esta útil combinación de alelos.

En enero de 2000, se tomaron muestras de quinientas cuatro plántulas F2, derivadas de la autofecundación del híbrido F1 1652817, para extracción de ADN (ejemplo 3), y se determinó el genotipo en el locus de Ty para cada muestra utilizando los procedimientos descritos en el presente documento (ejemplos 4 y 5). Ciento veintisiete plantas eran homocigotas para el alelo '+' susceptible; estas plantas fueron descartadas. Las restantes trescientas setenta y siete plantas que eran heterocigotas para el alelo Ty-1 (Ty-1/'+') u homocigotas para el alelo Ty-1 (Ty-1/Ty-1) se analizaron mediante los procedimientos descritos en este documento (ejemplos 4, 6, 7) para determinar el genotipo en el locus de Mi cercano. Cualquier planta que contenga un alelo favorable como heterocigoto (ya sea Ty-1 o Mi-1) y que tenga el otro alelo favorable (ya sea Ty-1 o Mi-1) fijado como homocigoto se seleccionó por tener alelos Ty-1 y Mi-1 in cis.

No se esperaban recombinantes, ya que está bien documentado que la recombinación se suprime en esta región del cromosoma 6. Por lo tanto, fue inesperado que se descubrieran ocho de tales recombinantes. Kaloshian y col., ((1998) Mol. Gen. Genet. 257: 376-385), mostró que la frecuencia de recombinación en esta región era aproximadamente 8 veces mayor cuando se hicieron cruces de peruvianum con peruvianum en comparación con cruces de esculentum con peruvianum. Incluso con esta posible explicación de una recuperación relativamente alta de recombinantes, todavía era inesperado porque el cruce realizado contiene ADN de hirsutum y peruvianum en esta región del genoma, y no los cruces de peruvianum con peruvianum de Kaloshian y col. (ibídem).

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para seleccionar una planta de Lycopersicon esculentum que comprende al menos un alelo de resistencia al TYLCV y al menos un alelo de resistencia al nematodo del nudo de la raíz en la fase de acoplamiento en dos loci en un cromosoma, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a) analizar una planta de Lycopersicon esculentum para determinar la presencia de alelos de resistencia en cada uno de los dos loci usando uno o más ensayos moleculares, en el que dicho al menos un alelo de resistencia al nematodo del nudo de la raíz es Mi-1 de Lycopersicon peruvianum, dicho al menos un alelo de resistencia al TYLCV es Ty-1 de Lycopersicon chilense, y

(b) seleccionar una o más plantas que comprenden dichos alelos de resistencia en la fase de acoplamiento en un cromosoma, en el que dicho cromosoma es el cromosoma 6;

en el que dicho uno o más ensayos moleculares comprenden el uso de cebadores o sondas de PCR que hibridan con la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 10; o

en el que dicho uno o más ensayos moleculares comprenden el uso de al menos un par de secuencias de cebadores seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 y 2, las SEQ ID NO: 3 y 4, y las SEQ ID NO: 5 y 6.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho alelo de resistencia al nematodo del nudo de la raíz confiere una puntuación de resistencia al nematodo del nudo de la raíz de menos de aproximadamente 0,1 usando el "ensayo de resistencia a nematodos".

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dichos uno o más ensayos moleculares comprenden la determinación, en cada uno de los dos loci, de si el alelo de resistencia al TYLCV y el alelo de resistencia al nematodo del nudo de la raíz están presentes o ausentes y si cada locus es homocigoto o heterocigoto para dicho alelo.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichos uno o más ensayos moleculares se seleccionan del grupo que consiste en un ensayo de regiones amplificadas caracterizadas y secuenciadas (SCAR), un ensayo de sitios polimórficos amplificados escindidos (CAPS), un ensayo polimórfico de un solo nucleótido (SNP), amplificación aleatoria de ADN polimórfico, un ensayo de polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP) y un ensayo de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP).