CN1946285B

CN1946285B - 番茄抗性等位基因的偶联方法

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Publication number: CN1946285B
Application number: CN2005800121471A
Authority: CN
Inventors: J·G·J·霍格斯特拉滕; C·布劳恩三世
Original assignee: Seminis Vegetable Seeds Inc
Current assignee: Seminis Vegetable Seeds Inc
Priority date: 2004-02-12
Filing date: 2005-02-11
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2025-02-11
Also published as: MXPA06009273A; IL177460A; PT2316261T; MA29128B1; JP2009183308A; NZ549538A; AU2005214722B2; JP5312423B2; JP2005237380A; JP2011041569A; EP2316261A3; AU2005214722A1; KR101333362B1; CN1946285A; ES2848155T3; IL213779A0; EP1563727A1; JP4651728B2; CA2556186A1; EP2316261B1

Abstract

普通番茄(Lycopersicon esculentum)植物，该植物在其基因组中包含至少一个番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)抗性等位基因和至少一个根结线虫抗性等位基因，其特征在于这些抗性等位基因以互引相存在于同一条染色体的不同基因座上，该植物对TYLCV和至少一种选自花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、南方根结线虫(Meloidogyneincognita)和爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)的根结线虫都具有高度抗性。

Description

番茄抗性等位基因的偶联方法

发明技术领域

本发明涉及具有商业重要性的普通番茄(Lycopersiconesculentum，L.)紧密连锁基因的使用方法。具体地讲，本发明涉及培育番茄植物，所述植物包含呈互引相(coupling phase)(顺式)的最有效的番茄黄化曲叶病毒抗性基因(Ty-1)和最有效的线虫抗性基因(Mi-1)，使得这些紧密连锁基因作为一个单元共遗传。

发明背景

栽培番茄具有超过200种文献记载的病害(Compendium ofTomato Diseases.J.B.Jones，J.P.Jones，R.E.Stall，T.A.Zitter主编(1997)American Phytopathological Society Press，St.Paul，MN)。为了抵御这些病原体导致的损害，种植者通常采用病虫害综合治理策略，包括栽培技术和杀虫剂的使用。栽培技术的一个实例是在番茄植株上使用网，这样的网能提供有效隔离带病昆虫感染农作物的物理屏障。

尽管大量探索性研究已经证明了针对植物病害的有效的转基因方法，但是目前尚没有种植者可用的能抵御任何病原体的转基因番茄品种。此外，还存在着公众阻力的问题，尤其是在欧盟，再加上获得法规部门批准需要高成本，这些问题事实上已经阻止了这一有前景的技术用于商业化番茄栽培。

采用传统育种方法，将抗病性基因渐渗到现代栽培品种中，这一直是用于抵御大部分植物病害的有效技术。因为这一技术不断获得成功，所以仍然是番茄育种学术研究和商业化程序的主要焦点。

在上百种番茄病原体中，由线虫和番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)引起的病害对于商业种植者来说最重要。线虫是全世界流行的，其分布范围几乎从南极到北极。

除了分布广泛之外，各种不同种类的线虫还是具有包括大多数植物和动物在内的各种宿主范围的病原体。例如，线虫引起各种病害，从人类蛲虫病(蠕形蛲虫(Enterobius vermicularis)是病原体)至番茄根结病，范围如此之大。尽管有50多种根结线虫，但是感染番茄的3种最重要的线虫是花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、南方根结线虫(M.incognita)和爪哇根结线虫(M.javanica)。

线虫的根结种是按其感染植物所产生的根部结构类型而命名的。一旦成功感染后，线虫产生激发子(elicitor)，导致植物根部增厚，在根部产生1mm-10mm瘿瘤或根瘤结。这些变化促使营养物从植物转运到线虫。感染后形态发生变化的根同时也减少了对植物的水和营养物的供应。植物表现出营养摄取减少，同时从地上部分也可观察到活力普遍下降。受感染的植物也表现出更特化的病症，例如矮化、枯萎和黄萎。因为在生长季节建立起线虫虫口密度，所以枯萎越加明显并影响座果。

根结线虫的化学防治是有效的，杀线虫剂甲基溴对所有根结线虫都具有良好防治效果。因为各种原因，包括对杀虫剂施药者的健康考虑和对臭氧耗竭的考虑，全球甲基溴的使用量正在减少。

该化学防治剂的最终禁用，使得开发防治番茄线虫病的替代方法变得重要起来。

TYLCV是双生病毒(geminivirus)，属于菜豆金黄花叶病毒组(Begomovirus group)。与在几乎所有土壤中广泛存在的线虫不同，番茄黄化曲叶病毒的分布仅局限在传播该病毒的昆虫媒介粉虱(烟粉虱(Bemisia tabaci))的范围内。

全球番茄商业化生产在过去25年内已经从温带移向热带种植地区，这是因为劳动力成本更低、运输更好以及有了北美自由贸易协定(North American Free Trade Agreement)和世界贸易组织协定(World Trade Organization Agreement)等协定。这样的地理迁移符合烟粉虱(B.tabaci)的分布。因此，随着番茄种植区移向热带气候，由TYLCV引起的病害变得更加明显。TYLCV可通过粉虱摄食而快速传播给番茄。一旦在植物中，病毒就复制并扩散到整个植株，尽管通常病毒局限在韧皮部。TYLCV引起植物的严重症状，从叶子卷曲黄化，到因节间长缩短而导致的矮化以及停止开花。总之，这导致植物出现灌木化现象(bush-like appearance)。作物减产可能很严重；在二十世纪九十年代早期，多米尼加共和国的番茄减产约95％，而据报道，美国佛罗里达州仅在一季(1991-1992)就造成约1.40亿美元的损失(Moffat，Science(1999)286：1835)。

对粉虱进行化学防治是有效的，但是番茄商业化生产中滥用杀虫剂，已经产生了具有杀虫剂抗性的烟粉虱，它可携带20多种不同的感染番茄的菜豆金黄花叶病毒(Morales，(2001)，CropProtection；Polston和Anderson(1997)Plant Disease 81：1358-1369；Zeidan等(1999)Asia Trop.Res.Ext.1：107-115)。

随着番茄线虫防治的最先进化学方法被逐步淘汰，TYLCV的化学防治方法也在减少，原因是多方面的，包括昆虫媒介对杀虫剂的抗性以及杀虫剂使用所带来的公众健康问题。同样，采用基因工程方法来产生转基因抗性栽培品种的高昂的开发成本，也妨碍了对TYLCV抗性栽培品种的开发。因此，本领域技术人员知道，需要这些化学防治策略和转基因策略的替代方法，以便在番茄生产中防治线虫、双生病毒(TYLCV)和其它植物病害。天然存在的抗性基因的渐渗现象，目前仍然是防治番茄病原体的最有效方法。

尽管抗性表型的遗传可以是定量的和多基因的，但是植物通常具有许多受到个体单基因座控制的显性到半显性抗性基因。植物抗性基因通常编码作为受体的蛋白质，这些受体与特异性病原体编码的配体结合。这类植物的病原体特异性识别并在随后响应的现象，首先是在二十世纪四十年代后期由Flor描述的，被称为“基因对基因(gene-for-gene)”抗性(有关综述参见Flor(1971)Ann.Reviewof Phytopathology 9：275-296)。这样的特异性受体-配体复合物触发信号转导途径，最终产生抗性表型(Baker等(1997)，Science 276：726-733；Staskawicz等(1995)Science 268：661-667)。在响应病原体攻击的所述识别过程中，宿主的反应可以是加固细胞壁，氧化爆发(oxidativeburst)，防御性基因表达的诱导，有时还有感染部位细胞快速死亡(称为超敏反应)。

对于大多数育种目的来说，商业育种者针对的是种质(germplasm)(常称为“栽培型”)。容易针对种质进行育种，因为当评价园艺性能时，它通常表现良好。栽培型提供的性能优势通常被缺乏等位基因多样性而抵消。当针对栽培种质时，会权衡育种者是否接受——更好的总体表现，仅仅是缺乏等位基因多样性。育种者通常接受这样的权衡，因为当针对栽培材料进行工作时，进程会比针对遗传多样性来源的育种工作要快。

相比之下，当育种者进行广泛种内杂交或者种间杂交时，会发生相反的权衡。在这些实例中，育种者通常将栽培种质与非栽培型杂交。在这样的杂交中，育种者可得到来自非栽培型的新等位基因，但是必须克服供方亲本相关的遗传拖曳(genetic drag)。该方法除了具有这样的育种策略的困难之外，还常因为生育力或繁殖力问题而失败。

有许多可以与栽培番茄杂交的野生近缘种，包括潘那利番茄(L.pennellii)、多毛番茄(L.hirsutum)、秘鲁番茄(L.peruvianum)、智利番茄(L.chilense)、小花番茄(L.parviflorum)、克梅留斯基番茄(L.chmielewskii)、奇士曼尼番茄(L.cheesmanii)、樱桃番茄(L.cerasiforme)和醋栗番茄(L.pimpinellifolium)。野生种和普通番茄栽培种之间的遗传距离与它们之间进行种间杂交并成功培育具有新增性状的新型商业栽培品种的难度相关(Genetics and breeding.MA Stevens和CM Rick.载于：The Tomato crop：A scientific basis for improvement.JG Atherton和J Rudich主编，Chapman和Hall，(1994)，London)。例如，醋栗番茄、樱桃番茄、奇士曼尼番茄、克梅留斯基番茄和小花番茄等野生种是最容易用作将性状渐渗到现代番茄中的供体。相比之下，潘那利番茄、智利番茄、多毛番茄和秘鲁番茄要将性状渐渗到现代番茄中则困难得多(出处同上)。当使用这些更远缘的物种时，通常得使用过渡物种(bridging species)和胚胎拯救，用于早期世代杂交。甚至在采用这些额外步骤后，人们还得面对明显的分离异常(segregationdistortion)、生育力问题、减少的重组和遗传拖曳。甚至在后生世代，在基因组渐渗区内的重组抑制也存在充分减少遗传阻力的主要拖曳，以培育成功的商业化栽培品种。

因此，尽管人们在野生种中可鉴定出有用性状并将该性状渐渗到栽培种中，但是并不能保证成功。最成功的商业化番茄育种者毕生工作，但也不能成功完成野生种的渐渗以培育商业化栽培品种。阻止成功的障碍包括分离异常，它可产生难以渐渗的野生基因组区。此外，现代番茄的某些野生种是自交不亲和的，意味着它们不能自花授粉。自交不亲和性的结果是这些植物是高度杂合的，在许多基因座上都具有不同等位基因。这些野生种的高度杂合性也能阻碍最有效的目标等位基因的渐渗。

将野生近缘种的新等位基因渐渗到驯化作物的困难，在许多作物中都存在，以线虫抗性基因渐渗到番茄中为例。Bailey((1941)Proc.Am.Hort.Sci.38：573-575)首先鉴定了野生种秘鲁番茄作为线虫抗性的潜在来源。随后，Smith((1944)Proc.Am.Soc.Hort.Sci.44：413-416)采用胚胎拯救，成功获得了具有线虫抗性性状的种间杂种。Gilbert和McGuire((1955)将该基因座命名为Mi，随后将Mi作图到6号染色体上(Gilbert(1958)Tomato Genet.Coop Rep.8：15-17)。在Mi基因座上源自秘鲁番茄的抗性等位基因称为Mi-1等位基因。源自普通番茄的敏感等位基因称为野生型等位基因，记为‘+’。据信，含有Mi-1抗性等位基因的所有商业化番茄栽培品种都来自Smith所培育的种间杂种。尽管纯合Mi-1品系早在1949年就已开发出来(Frazier和Dennett，(1949)Proc.Am.Soc.Hort.Sci.54：225-236)，但是直到二十世纪七十年代中期，Mi-1等位基因才开始广泛用于商业化栽培品种。以下两个进展导致了它实现商业化。首先，Rick和Fobes报道了称为碱性磷酸酶(Aps)的同工酶标记与Mi基因座之间的连锁((1974)Tomato Genet.Coop Rep.24：25)。分子标记实验的早期使用，使得育种者不用进行病理学实验就可跟踪性状。其次，商业种植者更能接受杂种番茄栽培品种。尽管用Mi-1等位基因进行育种长达60多年，但是今天仍然存在与来自秘鲁番茄的Mi-1渐渗相关的明显遗传拖曳，包括在胁迫条件下的局部坏死反应(Ho等(1992)The Plant Journal，2：971)、果实较小、座果较少。

育种者发现，Mi-1等位基因当作为杂合子存在时是有效的，这使得它们能够将线虫抗性性状仅从一个亲本传递到杂种。这反过来又使得育种者通过使用在其6号染色体的该区具有普通番茄基因的第二个近交亲本，极大地克服遗传拖曳。杂交栽培品种的培育允许进行该育种策略。将显性Mi-1等位基因育种到近交亲本之一中，再将敏感等位基因(‘+’)育种到第二个近交亲本中，该敏感等位基因(‘+’)周围是普通番茄等位基因，后者允许掩蔽大部分遗传拖曳。可在杂合条件下掩蔽遗传拖曳，提供了间接证据：即该基因组区内具有影响植物一般健康、果实大小和果实收率的基因，因为能够在胁迫条件下分别掩蔽局部坏死反应、果实较小和座果较少。

已经知道，植物抗性基因在基因组中成簇存在，在番茄中通常发现是在着丝粒附近。Mi基因座位于这些抗病性簇之一上，靠近6号染色体的着丝粒。除了具有Mi抗性基因座之外，其它的双生病毒抗性基因、番茄粉孢(Oidium lycopersicum)抗性基因(van deBeek等(1994)Theoret.Appl.Genet.89：467-473)和番茄黄支孢小种2和5(Cladosporium fulvum races 2 and 5)两个抗性基因(Dickinson等Mol.Plant Microbe Interact.(1993)6：341-347)也都在6号染色体的着丝粒区在遗传上紧密连锁。

甚至过了几十年后，Mi-1渐渗的困难还是无法减少性状相关的遗传拖曳。该难题的替代性解释是：Mi-1抗性基因是多效基因，直接造成遗传拖曳；或者该基因组区存在重组抑制，限制了遗传拖曳减少的进程。为了解决该问题，已经进行了各种实验方法。采用遗传学和细胞遗传学组合，Zhong等((1999)Theoret.Appl.Genet.98：365-370)表明，根据番茄基因组大小，根据～1cM遗传距离的遗传估计，Mi基因座和Aps基因座之间的物理距离应该为约750,000碱基对。然而，对其进行荧光原位杂交(FISH)，结果表明该物理距离实际上为40,000,000碱基对。这些基因座间遗传距离和物理距离间的偏差，使Zhong等人预测，与基因组平均值相比，Mi基因座周围的重组减少了约50倍。Kaloshian等((1998)Mol.Gen.Genet.257：376-385)做了一个比较遗传实验，表明秘鲁番茄x秘鲁番茄的杂交，与源自普通番茄x秘鲁番茄的种群相比，该区的重组高出8倍。除了这些实验之外，众所周知，在着丝粒区重组通常是被抑制的。Milligan等(1998，Plant Cell 10：1307-1320)采用转基因互补方法，将克隆的Mi抗性基因引入到敏感型栽培品种Moneymaker中。在这些互补试验中没有观察到基因多效性效应，这强烈地表明，Mi渐渗相关的园艺缺陷是因为遗传拖曳。这些研究有助于人们理解抗病性基因向该6号染色体区渐渗的相关障碍。

1998年，Kaloshian等介绍了基于PCR的共显性分子标记，称为REX-1，该标记比起Aps同工酶标记更接近Mi基因座(MolGen Genet.257：376-385)。基于DNA的该标记很快就用于番茄育种程序，极大地促进了新型线虫抗性杂种栽培品种的开发。

尽管番茄育种团体已经通过科学出版物快速公开了他们在Mi-1线虫抗性等位基因渐渗方面的进展，但是USPTO从该领域颁布的若干专利(美国专利6,414,226、6,096,944、5,866,764和6,639,132)中已经知道，这些困难的育种方法是难以成功的。

有关番茄黄化曲叶双生病毒(TYLCV)抗性的报告已经存在了近40年。早在1964年，Cohen就首次报道了某些耐受性基因型(Cohen和Harpaz(1964)Entomol.Exp.Appl.7：155-166)，随后又鉴定出醋栗番茄和秘鲁番茄含有更高水平的TYLCV抗性(Cohen和Nitzany(1966)Phytopathology 56：1127-1131)。在二十世纪九十年代，Pilowski和Cohen报道了具有多达5个隐性基因的秘鲁番茄(PI126935)的耐受性(Plant Disease 74：248-250)。Michelson等人发现((1994)Phytopathology 84：928-933)、并且由Hoogstraten(美国专利6,414,226)后来独立证实了智利番茄的TYLCV抗性。该抗性基因座称为Ty基因座，而来自智利番茄的抗性等位基因称为Ty-1。

与Mi基因座相同，Ty基因座上的敏感等位基因称为野生型，即‘+’。Zamir等人将Ty基因座作图到6号染色体的着丝粒区((1994)Theoret.Appl.Genet.88：141-146)。Ty-1等位基因作为显性等位基因起作用，因此Ty-1等位基因固定的品系或是杂合的品系(Ty-1/‘+’)都对TYLCV具有抗性。

含有来自智利番茄的Ty-1抗性基因的番茄近交系FDR16-2045也具有针对线虫的抗性，因为来自智利番茄的抗性基因也渐渗到附近Mi基因座(Hoogstraten，美国专利6,414,226)。抗线虫和双生病毒的这两个抗性基因在FDR16-2045品系中共同遗传，证明Ty和Mi基因座在遗传位置上是紧密连锁的。在Mi基因座上的线虫抗性等位基因，是从智利番茄渐渗到FDR16-2045品系，称为Mi-J。FDR16-2045品系是有价值的育种近交系，因为它允许育种者培育出含有有效抗线虫和双生病毒的抗性等位基因的商业化杂种，通过使用在Mi和Ty基因座具有‘+’型等位基因的第二近交亲本，这些杂种能够消除大部分遗传拖曳。来自该渐渗的遗传拖曳在胁迫条件下可表现为自我坏死、节间较长、果实较小和座果较少。

然而，通过病理学测试已经发现，来自智利番茄的Mi-J等位基因不如来自秘鲁番茄的Mi-1等位基因有效。当F1杂种中Mi-J等位基因与Mi基因座上的‘+’敏感等位基因配对时，这一点尤为明显。采用分子技术，本发明人能够设计分子标记试验，以鉴别Mi基因座上三种可能的等位基因(Mi-l、Mi-J和‘+’)。

因此，番茄育种者面对他们能力上的局限：传递作图到6号染色体着丝粒区的多个抗性基因，同时又保留掩蔽这些渐渗相关遗传拖曳的能力。为了使用作图到杂种栽培品种6号染色体区上的所有已知抗性基因，育种者必须使用具有来自秘鲁番茄的含线虫抗性基因Mi-1的渐渗的一个亲本，来自智利番茄的含TYLCV抗性基因Ty-1的渐渗的另一亲本，来自多毛番茄的含粉孢属(Oidium)抗性基因的另一亲本，来自醋栗番茄的含支孢属(Cladosporium)各小种抗性基因的渐渗的另一亲本，以及来自普通番茄的含‘+’型等位基因的又一亲本，以便掩蔽这些渐渗中某些相关的遗传拖曳。这一任务对育种者来说是不可能的，因为他们仅有两个可供选择的亲本系，以培育杂种栽培品种。Ho等((1992)The Plant Journal 2：971-982，参见图6)和Liharska等((1996)Genome 39：485-491，参见图1)也用图解说明了这一难题。

因此，仍然需要鉴定已知具有被强烈抑制的重组的基因组区的重组事件，而且该区将含有最有效的线虫抗性等位基因Mi-1(该基因原先是来自秘鲁番茄的渐渗)，以及最有效的TYLCV抗性等位基因Ty-1(该基因原先是来自智利番茄的渐渗)。以这种方式并置的紧密连锁的等位基因被认为是呈互引相，即顺式。这种呈顺式的有效抗性等位基因的组合将允许番茄育种者培育出具有最有效抗TYLCV和线虫抗性的番茄杂种，同时又保留具有第二近交亲本的自由性，以掩蔽遗传拖曳或传递额外抗性基因(例如粉孢属抗性基因、支孢属抗性基因)或传递在该病害簇上有待发现的抗性等位基因。

发明概述

本发明提供一种普通番茄植物，所述植物在其基因组中包含至少一个番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)抗性等位基因和至少一个根结线虫抗性等位基因，其特征在于所述抗性等位基因以互引相存在于同一条染色体的不同基因座上，该植物对TYLCV具有抗性并且对至少一种选自花生根结线虫、南方根结线虫和爪哇根结线虫的根结线虫具有高度抗性。

也提供一种普通番茄植物，所述植物在其基因组中包含至少一个番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)抗性等位基因和至少一个根结线虫抗性等位基因，其特征在于所述抗性等位基因以互引相存在于同一条染色体的不同基因座上，该植物对TYLCV和至少一种选自花生根结线虫、南方根结线虫和爪哇根结线虫的根结线虫都具有抗性，其中所述根结线虫抗性等位基因不是来自智利番茄的Mi-J等位基因。

在一个优选的实施方案中，提供根结线虫抗性评分小于约1.0的本发明植物，而在又一个优选的实施方案中，提供根结线虫抗性评分小于约0.5、更优选小于约0.25和甚至更优选小于约0.05的本发明植物。在一个实施方案中，所述植物是杂种植物。

在一个优选的实施方案中，TYLCV抗性等位基因是称为Ty-1的等位基因。在另一个优选的实施方案中，根结线虫抗性等位基因是称为Mi-1的等位基因。在又一个优选的实施方案中，TYLCV抗性等位基因和根结线虫抗性等位基因分别来自智利番茄和秘鲁番茄。

优选TYLCV抗性等位基因和根结线虫抗性是非转基因的。

本发明的另一方面提供所述普通番茄植物的果实或种子。

本发明可提供近交的商业化普通番茄植物，或者本发明的植物可用作与另一普通番茄植物杂交的亲本。因此，本发明提供杂种普通番茄植物，所述植物是通过将本发明植物与缺乏TYLCV抗性等位基因和缺乏根结线虫抗性等位基因的近交植物杂交的方法而产生的。

在本发明该方面的一个优选实施方案中，提供杂种普通番茄植物，其中TYLCV抗性等位基因和根结线虫抗性等位基因都是杂合的。更优选所述杂种植物具有良好园艺特征，甚至更优选杂种植物具有高度降低的通常与野生番茄品种渐渗相关的遗传拖曳，提供TYLCV抗性等位基因和根结线虫抗性等位基因。

优选所述杂种植物表现出高度降低的与野生种智利番茄相关的遗传拖曳效应以及高度降低的与野生种秘鲁番茄相关的遗传拖曳效应。更优选所述杂种植物表现出高度降低的选自以下症状的遗传拖曳症状：自我坏死、节间较长、果实较小、座果较少及园艺上低劣的植物结构(architecture)。

TYLCV抗性等位基因和根结线虫抗性等位基因的基因座出现在染色体的同一抗病性簇内。因此，在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，在簇内提供与Ty-1TYLCV抗性等位基因和Mi-1根结线虫抗性等位基因呈互斥相(repulsion phase)即反式(in trans)的至少一个额外抗病性等位基因。在本发明该方面的一个替代实施方案中，额外的抗病性等位基因提供对选自支孢属小种2、支孢属小种5和粉孢属的病害的抗性。

附图简述

参考以下附图，将会更详细地描述本发明的各种示例性实施方案，附图中：

图1显示Ty+(SEQ ID NO：11)和Ty-1(SEQ ID NO：10)等位基因附近的标记基因座多核苷酸序列的比较以及对阴影框内多核苷酸序列之间的19个单核苷酸多态性的鉴定。圆圈表明在Ty-1序列中的碱基对97-98和Ty+序列中的96-97的两个(2)相邻多态性，其中TaqI限制酶识别位点仅出现在Ty-1等位基因内。

图2显示Mi+、Mi-1和Mi-J等位基因附近的标记基因座多核苷酸序列的比较以及对阴影框内多核苷酸序列之间的20个单核苷酸多态性的鉴定。圆圈表明在碱基对603和754的多态性。

图3显示5个植物基因型的平均线虫抗性评分，包括在Mi基因座的不同等位基因组合。

发明详述

本发明提供一种番茄植物(普通番茄)，该植物是由重组事件产生的并且具有与Ty-1(该基因原先是来自智利番茄的渐渗)呈顺式排列的Mi-1(该基因原先是来自秘鲁番茄的渐渗)。

定义

植物学术语：林奈(Linnaeus)被认为是植物分类学之父。尽管他最初将现代番茄归类于茄属(Solanum)，但是它的科学名称多年来一直是普通番茄(Lycopersicon esculentum)。同样，现代番茄的野生近缘种一直归类于番茄属(Lycopersicon)，例如潘那利番茄(L.pennellii)、多毛番茄(L.hirsutum)、秘鲁番茄(L.peruvianum)、智利番茄(L.chilense)、小花番茄(L.parviflorum)、克梅留斯基番茄(L.chmielewskii)、奇士曼尼番茄(L.cheesmanii)、樱桃番茄(L.cerasiforme)和醋栗番茄(L.pimpinellifolium)。在过去几年里，番茄研究者和植物学家们一直在争论，是否重新划分这些物种名称。建议给予现代番茄的新科学名称是Solanum lycopersicum。同样，野生种的名称也可改变。潘那利番茄(L.pennellii)可改为Solanum pennellii，多毛番茄(L.hirsutum)可改为S.habrochaites，秘鲁番茄(L.peruviaraum)可分为S.′Nperuvianum’和S.‘Callejon de Huayles’、S. peruvianum和S.corneliomuelleri，小花番茄(L.parviflorum)可改为S.neorickii，克梅留斯基番茄(L.chmielewskii)可改为S.chmielewskii，智利番茄(L.chilense)可改为S.chilense，奇士曼尼番茄(L.cheesmaniae)可改为S.cheesmaniae或S.galapagense，醋栗番茄(L.pimpinellifolium)可改为S.pimpinellifolium(Solanacea Genome Network(2005)Spooner和Knapp；http://www.sgn.cornell.edu/help/about/solanum nomenclature.html)。

因此，尽管可以为了清楚的目的，改变番茄及其近缘种的名称，但是现代番茄及其野生近缘种用现有名称来定义，这全都落入番茄属(Lycopersicon)之内。

线虫：根结线虫(Meloidogyne spp.)在土壤中很常见，大多数具有广泛宿主范围，在许多一年生和多年生作物中造成麻烦。番茄是其中受影响最严重的，线虫在所有番茄种植区都造成麻烦。根结线虫难以鉴定，有50多种已鉴定，尽管少数种(例如爪哇根结线虫、南方根结线虫和花生根结线虫)给番茄种植者造成很多麻烦。

本文所用的术语“等位基因”是指在特定基因座上的基因的一个或多个替代形式，所有这些等位基因在一个特定基因座上涉及一个性状或特征。在生物体的双倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置即基因座上。一个等位基因存在于同源染色体对的每条染色体上。双倍体植物种在特定基因座上可包含大量不同的等位基因。

本文所用的术语“基因座”是指染色体上的特定位置或位点，其上可存在例如基因或遗传标记。“Mi基因座”在本文中是指番茄基因组上的位置，其中一个或多个等位基因位于其上，这些基因决定植物或植物组织的根结线虫抗性程度。术语“Ty基因座”在本文中是指番茄基因组上的位置，其中一个或多个等位基因位于其上，这些基因决定植物或植物组织的TYLCV抗性程度。

本文所用的术语“互引相(in the coupling phase)”和“顺式(in cis)”是指两个不同基因座的等位基因在一条(同源)染色体上发生连锁的遗传状态。例如，当等位基因Ty-1和Mi-1位于一条同源染色体上时，这些等位基因就呈“互引相”。相反，如果等位基因Ty-1和Mi-1位于同源对的不同同源染色体上，它们则称为“互斥相(in therepulsion phase)”，即“反式(in trans)”。

“重组”或“重组事件”在本文中是指植物具有因杂交和同源染色体独立分配(assortment)而导致的新遗传组合。

“TYLCV抗性等位基因”，是指当存在于基因组时赋予对番茄黄化曲叶病毒感染和/或损害的“抗性”或“中度抗性”的等位基因。当采用“TYLCV抗性测定”(参见下文)测得一种或多种植物的平均病害评分介于0和1之间或者等于0或1时，则这类植物被认为具有针对TYLCV的“抗性”。当采用TYLCV抗性测定测得一种或多种植物的平均病害评分约为2时，则这类植物被认为具有针对TYLCV的“中度”抗性。平均病害评分约为3以上的植物被认为是敏感型的。

“根结线虫抗性等位基因”，是指当存在于基因组时赋予对至少一种或多种选自以下线虫的抗性的等位基因：南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫。当采用“根结线虫抗性测定”(参见下文)测得一种或多种植物的平均病害评分小于约0.1时，则这类植物被认为具有针对至少一种所述根结线虫的“高度抗性(highlyresistant)”。例如Mi-1/Mi-1植物和Mi-1/+植物是高度抗性的。当一种或多种植物的平均病害评分约为0.1以上(但小于1.0)时(例如具有等位基因MiJ/MiJ的植物)，则这类植物被认为具有“中度抗性(intermediate resistance)”。平均病害评分为1.0以上(但小于2.0)的植物被认为具有“低度抗性(moderate resistance)”(例如具有等位基因MiJ/+的植物)，而平均病害评分为2.0以上的植物被认为是敏感型的(例如具有等位基因+/+的植物)。

“TYLCV抗性测定”是指如实施例所述，用0-4级量表，对于在发生自然TYLCV感染的田野上生长的多个植株，在感染后一个或多个时间点对其病害症状进行评分，并求出Ty基因座上具有特定等位基因组成(基因型)的多个植株的平均病害评分。

“线虫抗性测定”是指如实施例所述，用0-4级量表，对于在接种过南方根结线虫、爪哇根结线虫或花生根结线虫接种物的土壤中生长的多个植株，在约28天后对其根结进行评分，并求出在Mi基因座上具有特定等位基因组成(基因型)的多个植株的平均病害评分。

本文所用的术语“杂合”，是指当两个不同的等位基因存在于特定基因座上，但是各自位于二倍体生物细胞内相应的同源染色体对上的遗传状况(例如Mi-1/+)。相反，本文所用的术语“纯合”，是指当两个相同的等位基因存在于特定基因座上，但各自位于二倍体生物细胞内相应的同源染色体对上的遗传状况(例如Mi-1/Mi-1)。

本文所用的术语“植物”包括完整的植株(全植物)或其任何部分或衍生物，例如植物细胞、植物原生质体、植物细胞组织培养物(由此可再生出番茄植物)、植物愈伤组织、植物细胞团和作为完整植物或植物部分的植物细胞，例如胚胎、花粉、胚珠、果实(例如收获的番茄)、花、叶、种子、根、根尖等等。

“分子测定”(或试验)是指(直接或间接)表示Mi或Ty基因座上特定等位基因存在与否的(基于DNA的)测定。而且，它允许人们确定单个植株的Ty或Mi基因座上特定等位基因是纯合还是杂合的。例如，在一个实施方案中，使用PCR引物，扩增与Mi或Ty基因座连接的核酸，扩增产物用酶消化，然后根据扩增产物的电泳分离图，人们可确定单个植株中是存在Mi还是存在Ty等位基因以及Mi或Ty基因座上等位基因的合子性(zygosity)(即各基因座上的基因型)。实例是SCAR、CAPS和类似测定。

本文所用的术语“品种(variety)”或“栽培品种(cultivar)”是指已知最低级别的一种植物学分类单元内的植物集合，它可通过特征性表达而界定，是给定基因型或基因型组合的结果。

本文所用的术语“野生型”是指在普通番茄中发现的天然存在的等位基因。在线虫抗性基因座Mi和TYLCV基因座Ty上，这些来自普通番茄的野生型等位基因赋予对这些病原体的敏感性，并且在本文中被称为Mi+和Ty+，或者简称为“+”。

本文所用的术语“变异体”或“多态变异体”是指与给定核酸序列基本上相似的核酸序列。例如，术语“其变异体”或“任何SEQ ID NO：1-11的变异体”是指所述多核苷酸序列中具有一个或多个(例如2、3、4、5或更多个)核苷酸缺失的多核苷酸序列(缺失变异体)，或者所述多核苷酸序列的核苷酸被一个或多个其它核苷酸取代(取代变异体)或有一个或多个核苷酸插入到所述多核苷酸序列中(插入变异体)。

SEQ ID NO：1-11的变异体包括与任何SEQ ID NO：1-11“基本上相似”的任何核苷酸序列。与SEQ ID NO：1-11基本上相似的序列是包含与一个或多个SEQ ID NO：1-11序列具有至少约90％、更优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高核酸序列同一性的核酸序列，当优化比对时，使用例如Needleman和Wunsch算法，用例如GAP或BESTFIT程序，采用缺省参数。GAP缺省参数是空位产生罚分＝50(核苷酸)和空位延伸罚分＝3(核苷酸)。对于核苷酸，所用的缺省打分矩阵是nwsgapdna(Henikoff & Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。可以采用计算机程序确定序列比对和％序列同一性的分值，例如GCG威斯康星软件包，10.3版，得自AccelrysInc.，9685 Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752，USA，或者开放式源码的软件Emboss for Windows(现行版本2.7.1-07)。变异体也包括任何这些序列的片段或部分。

本发明的植物和植物部分

在一个实施方案中，本发明提供番茄植物(普通番茄)以及所述植物的植物细胞和组织、种子或果实，该植物在其基因组中包含与Ty-1(该基因原先是来自智利番茄的渐渗)呈顺式排列的Mi-1等位基因(该基因原先是来自秘鲁番茄的渐渗)。这些植物可用如下方法产生：可以通过将公众可得的商业化品种(各自包含(优选固定的)目标等位基因(在本文中是Mi-1或Ty-1))进行杂交，再从得自杂交的F2植物中、或者经F1进一步自交或杂交(例如F2或回交群体)而得到的任何更远的世代中，选择包含顺式Mi-1和Ty-1的重组植物。因为重组发生率极其低，所以需要大量事件，优选采用一种或多种Mi等位基因特异性分子测定或等位基因鉴别分子测定(例如SCAR或CAPS测定)，来进行选择。例如，如实施例所述，可以使用在本文中被称为“Ty基因座的SCAR测定”、“Mi基因座的1号SCAR测定”和“Mi基因座的2号SCAR测定”这三种SCAR测定中的一种或多种。在这些测定中，在PCR反应中使用3种引物对(SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6)，接着通过酶限制性消化，然后检测所得片段，测定PCR扩增产物间的多态性。

可以理解，常规实验可用于开发类似的测定方法。例如可使用任何引物序列的“变异体”、或与Mi和Ty基因座上或其附近的基因组的其它部分杂交的引物或探针。

包含呈顺式的Mi-1和Ty-1的植物可以是纯合或杂合的。这些植物可用于进一步杂交，以将等位基因作为一个单元转移到其它番茄植物，产生例如杂种或近交系。在一个优选的实施方案中，提供杂种植物，这些植物在同源染色体中包含呈互引相的Mi-1和Ty-1等位基因和敏感等位基因即Mi+和Ty+等位基因。这些植物具有的益处是：当这些等位基因以纯合状态存在时，具有明显降低的通常与Mi-1和Ty-1等位基因相关的遗传拖曳症状或者没有遗传拖曳症状。

遗传拖曳症状，是指与缺乏Mi-1和Ty-1等位基因的植物相比，一种或多种选自以下的症状：自我坏死、节间较长、果实较小、座果较少及园艺上低劣的结构。本领域技术人员知道，遗传拖曳的这类症状将会给种植者对近交或杂交植物系的商业可接受性带来负面影响。

一般而言，可通过一种或多种所述症状的存在，来确定遗传拖曳的不利水平的存在，进而确定植物品系成为商业上不可接受的程度。

本发明的番茄植物包括平均线虫抗性评分小于约0.25，优选小于约0.2，更优选小于约0.1或小于约0.05，例如0.03或0.02。另外，这些植物对TYLCV具有抗性，当用所述测定方法进行检测时，其平均TYLCV抗性评分小于或等于1.0。

包含其它线虫抗性等位基因和TYLCV抗性等位基因的植物

在另一个实施方案中，本发明提供产生和/或选择以上重组体的方法，以及产生和/或选择其它重组体的方法，所述其它重组体具有呈互引相(顺式)的至少一个Mi抗性等位基因和至少一个TYLCV抗性等位基因，优选普通番茄的6号染色体。所述植物的特征是：当用本文所述的抗性测定方法进行检测时，对花生根结线虫、南方根结线虫和/或爪哇根结线虫等线虫具有高度、中度或低度抗性，并且对TYLCV具有抗性或中度抗性。也提供用该方法造成的重组事件，以及这些植物的组织、细胞、种子和果实，并使用任何这些植物来产生包含呈顺式的Mi和Ty抗性等位基因的杂种或近交植物。然而，包含呈互引相的来自智利番茄的Mi-J等位基因和Ty-1等位基因的植物确实被排除在外，因为意外发现现有技术中已存在这样的植物(美国6,414,226)，尽管它们并不是按照本发明培育出来。在任何情况下，具有呈互引相的来自智利番茄的Mi-J等位基因和Ty-1等位基因的植物都没有显示出高水平的线虫抗性，也就是说，按本文的定义不是高度抗性的。因此，特别优选赋予TYLCV抗性和线虫高度抗性的植物。

在一个实施方案中，本发明涉及培育番茄植物，所述植物包含呈互引相的赋予TYLCV抗性的等位基因和赋予根结线虫抗性的等位基因。赋予TYLCV抗性的等位基因和编码根结线虫抗性的等位基因可首先来源于不同的种质资源(即不同种的番茄)，例如但不限于普通番茄、樱桃番茄、醋栗番茄、奇士曼尼番茄、小花番茄、克梅留斯基番茄、多毛番茄、潘那利番茄、秘鲁番茄、智利番茄或类番茄茄(Solanum lycopersicoides)。

因此，在一个实施方案中，提供培育普通番茄植物的方法，所述植物包含在两个基因座上呈互引相的至少一个TYLCV抗性等位基因和至少一个根结线虫抗性等位基因，其中所述方法包括以下步骤：(a)让包含TYLCV抗性等位基因的番茄植物与包含根结线虫抗性等位基因的番茄植物杂交，(b)采用一种或多种分子测定方法，分析所述杂交后代的这两个基因座是否各自存在抗性等位基因，和(c)选择一种或多种包含呈互引相的抗性等位基因的植物。

可任选在所述方法的任一阶段进行抗性测定。还任选进行步骤(d)，该步骤(d)包括让所得植物自交或者让所得植物与另一番茄植物杂交，以产生杂种植物。在一个优选的实施方案中，由此方法获得的植物具有TYLCV抗性和线虫高度抗性(如定义所述)。

可采用实施例所述的病理学试验，选择步骤(a)的起始植物。它们可以是野生或栽培植物，或是改良植物，例如诱变植物或转化植物。例如，可以使用TILLING(Targeting Induced Local LesionsIN Genomics；McCallum等，2000，Nat Biotech 18：455；McCallum等，2000，Plant Physiol.123，439-442)或ECOTILLING(Henikoff等，2004，Plant Physiology Preview，2004年5月21日)等方法，产生和/或选择具有改进的病原体抗性和/或Ty或Mi基因座的等位基因突变的植物。然后，这些植物可用作Ty和Mi抗性等位基因的来源。

然后，用本发明的一种或多种分子测定方法(如下所述)，分析杂交后代。所分析并从所述植物中选出的后代可以是后代的任何不同世代，例如F2代、F3代等，回交代(BC1、BC2等)等，这取决于所需的杂交/选择方案和所用植物中存在的等位基因。分子测定优选在F2植物上进行。另外，可采用病理学测定和/或一种或多种分子测定方法，重复测定不同世代的后代。几种分子测定方法可在同一代进行，或者一种或多种不同测定方法可在不同世代进行。因此，步骤(a)、(b)和/或(c)可重复若干次。其目的是鉴定包含呈互引相的所需Ty和Mi抗性等位基因的重组体(步骤c)。在该方法中，任何Ty抗性等位基因都可与任何Mi抗性等位基因组合(以互引相)。

可以采用分子测定方法，根据例如在Ty-基因座或其附近以及在Mi-基因座或其附近的核酸序列，将所述植物与其它植物区分开来。这样的分析允许待测的这两个基因座上的等位基因组合。例如，本发明的植物包含Mi基因座附近的SEQ ID NO：8或与其基本上相似的核酸序列(并在Mi基因座上表现出Mi抗性等位基因)、以及Ty基因座附近的SEQ ID NO：10或与其基本上相似的核酸序列(并在连锁Ty基因座上表现出Ty抗性等位基因)，其中这些区域以互引相连接。优选本文所述的一种或多种基于PCR的测定方法，用于区别Mi和Ty基因座的不同基因型并选择具有呈互引相的所需等位基因的重组植物。

采用分子生物学、植物病理学和传统育种技术，可以对包含呈互引相的Mi和Ty抗性等位基因的重组植物进行选择，并使这个单一孟德尔单元向其它植物渐渗。在一个优选的方法中，本发明使用分子生物学技术，以鉴别Ty和Mi基因座上的不同等位基因，以便将所需的TYLCV抗性和根结线虫抗性等位基因顺式结合到栽培番茄的基因组中。本发明有利于培育具有TYLCV和根结线虫多重抗性的番茄杂种，同时提高了植物育种者掩蔽遗传拖曳(该遗传拖曳通常与这些性状相关)的能力，同时保留了将Ty抗性和Mi抗性与粉孢属(Oidium)抗性基因、支孢属(Cladosporium)抗性基因或该基因簇上存在的有待发现的抗性基因相结合的自由。

以举例但非限制性方式来说，本发明提供对番茄种质的开发，所述番茄种质包含呈互引相的任何Ty抗性等位基因和任何Mi抗性等位基因，优选作为顺式共遗传单元位于6号染色体上。一旦鉴定了植物具有高水平抗性(例如与Ty-1和Mi-1所提供的抗性水平相比)，则可以对本文所公开的与Mi和Ti基因座紧密连锁的核酸区进行测序，其在连锁标记区的序列信息用于开发分子测定，用于这些植物中所发现的等位基因。鉴定不同种质中的Mi或Ty抗性等位基因也有替代方法，这对本领域技术人员来说是显而易见的。这些方法的更多细节如下。

如上所述，本发明采用分子生物学、植物病理学和传统育种技术。在一个实施方案中，所用的分子生物学技术包括使用例如核酸引物的标记测定，所述引物与连接Mi和/或Ty基因座的核酸区杂交(和扩增)，其更详细讨论如下。本发明不仅包括实施例中公开的具体测定方法(包括Ty-1和Mi-1等位基因)，而且包括任何可供开发并用于向番茄中渐渗呈互引相的任何编码TYLCV抗性的等位基因以及任何编码根结线虫抗性的等位基因的测定方法。例如，本发明包括向番茄中渐渗Ty和/或Mi基因座任何变异体(例如直向同源物或进化分歧的天然等位基因或经诱变产生的等位基因)及包含呈顺式的所述等位基因的植物世代。

本文还提供通过任何所述方法得到的植物，并且使用这些植物作为亲本与另一普通番茄植物进行杂交。要注意的是，本发明在技术上并不限于一种或多种具体的番茄品种，但是通常适用于番茄植物(包括自交系、杂种等)。

本发明的分子测定方法

本文提供许多分子测定方法，这些方法鉴别植物的Ty-基因座上Ty-1和Ty+的存在与否以及Mi基因座上Mi-1、Mi-J和/或Mi+的存在与否。这些测定方法中的一种或多种方法可用于标记辅助选择，即测定植物在Mi和Ty基因座上的等位基因组合并选择具有呈互引相的所需Mi和Ty抗性等位基因的植物。可使用常规分子生物学技术，开发用于任何Mi和Ty抗性等位基因的类似测定。例如，可以使用SEQ ID NO：7-9(或变异体核酸序列)或者SEQ ID NO：10或11(或其变异体)的任何10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26、30或更多个连续核苷酸片段，来设计PCR引物对或核酸杂交探针，并开发鉴别分子测定方法，该方法是基于用所述引物对所扩增区域以及所述探针所杂交的核酸序列的核酸信息。所开发的测定方法的具体类型并不重要，只要它可鉴别Mi和/或Ty基因座上的Mi抗性等位基因和Ty抗性等位基因以及纯合性/杂合性。在下文和实施例中给出不同类型的测定方法的实例。

为了进行本发明方法中的标记辅助选择，主题番茄植物或植物部分例如先进行DNA提取，该DNA提取技术是本领域已知的(参见Hnetkovsky等，Crop Sci.，36(2)：393-400(1996))。一旦完成提取，即可进行分子测定，包括但不限于经切割的扩增多态序列(cleavedamplified polymorphic sequence，CAPS)测定(参见Akopyanz等，NucleicAcid Research，20：6221-6225(1992)和Konieczny & Ausubel，The PlantJournal，4：403-410(1993))或SCAR测定。SCAR测定包括通过PCR扩增基因座(例如Ty基因座或Mi基因座附近的特定基因座)上的DNA，然后用限制酶消化。核酸序列间的多态性是例如通过得到不同大小的限制片段，来区别不同等位基因(例如但不限于Mi+、Mi-J和/或Mi-1等位基因)。

在这些测定中使用核酸引物和酶，以便鉴定番茄植物基因组内Ty和/或Mi基因座上存在哪些等位基因，而且，如果所述等位基因存在的话，这些等位基因是以纯合状态还是杂合状态存在。得自这两个基因座的信息用于鉴定在Ty和Mi基因座上具有呈互引相(即顺式)的特定等位基因组合的植物。

为了进行标记辅助选择试验，本领域技术人员一开始先比较供体来源(即含有抗病性性状的种质)的DNA序列与来自受体来源(即含有特定病原体的敏感‘+’等位基因的种质)的相应DNA序列。或者，可以在遗传上与目标性状紧密连锁的基因组的相应位置上，对供体DNA和受体DNA间进行序列比较。对于Ty和Mi基因座，邻近这些性状的多态性的鉴定是本领域已知的(参见Zamir等，Theor.Appl.Genet.88：141(1994)；Williamson等，Theor.Appl.Genet.87：757(1994))。对于Ty-1等位基因，Zamir等人发现限制性片段长度多态性(RFLP)TG97，它首先由Tanskley作图(Tanskley等，Genetics 132：1141(1992))到与Ty基因座紧密连锁。同样，Williamson等人发现REX-1基因座与Mi基因座紧密连锁。

在一个实施方案中，所用的分子测定是SCAR测定，或实施例所述的几种SCAR测定。例如，SEQ ID NO：10提供来自智利番茄LA1969的Ty-1等位基因附近的多核苷酸序列。SEQ ID NO：11提供来自普通番茄TG97基因座的野生型Ty+等位基因附近的多核苷酸序列。图1显示了这些序列的比较，强调这两个序列间存在的几个单核苷酸多态性(SNP)。SNP可以是取代突变体、插入体或缺失体，这些通常称为INDELS。使用等位基因间的多态性，本领域技术人员将会知道，可以开发任何数量的标记辅助测定和引物(或探针)，用于SNP。所述测定可用于鉴别出抗性Ty-1等位基因与敏感Ty+等位基因。例如，引物对SEQ ID NO：1和2扩增约398bp的片段(用PCR扩增，用例如基因组番茄DNA作为模板)。随后将扩增产物与酶TaqI(该酶识别和限制序列T↓CGA)一起孵育，使得从包含Ty-1等位基因的植物扩增而来的398bp产物经限制切割为约95bp和约303bp的两个核酸片段。因此，Ty-1纯合植物产生这两个片段(可观察到例如凝胶上的条带或用其它方法来观察)，而Ty+等位基因纯合的植物将会产生约398bp的单一片段。杂合植物(Ty-1/Ty+)产生所有3个片段。

根据Williamson等(Theoretical and Applied Genetics 87：757-763(1994))所公开的数据，采用类似方式，测定普通番茄、秘鲁番茄和智利番茄靠近称为REX-1的Mi的基因座上的多核苷酸序列。这三个多核苷酸序列见SEQ ID NO：7(对于Mi+特异性的)、SEQ IDNO：8(Mi-1)和SEQ ID NO：9(Mi-J)。这些多核苷酸序列的比较见图2，该图揭示出这三个序列间的20个SNP。

可以理解，可以容易地修改本文所述的SCAR测定或用其它分子测定来替代，本文所述的SCAR测定也容易开发用于Ty-和/或Mi-基因座的任何等位基因。另外，该测定可根据并非SNP的其它多态性，例如两个或多个核苷酸的缺失、插入或取代。

如上所述，可以设计特异性引物或简并引物，与所有或部分SEQ ID NO：7-11或者其任何变异体的所有或部分或基因组侧翼区杂交并扩增。或者，可以设计引物，以直接扩增部分抗性等位基因或邻近Mi基因座和Ty基因座的其它核酸区。此外，需要时，可以修饰本发明的引物，用于其它标记辅助选择测定，例如但不限于

测定(Applied Biosystems，Foster City，CA)，使用本领域已知技术，包括但不限于美国专利第5,464,746号、第5,424,414号和第4,948,882号所介绍的技术。

为了设计新的分子试验，以鉴别新的Ty或Mi抗性等位基因，本领域技术人员知道，应该例如先测定在Mi或Ty基因座上或其附近的标记基因座的DNA序列(使用例如PCR扩增和本文所述的引物对并对扩增产物进行测序)，然后与其它标记序列(在Mi和Ty基因座的其它等位基因上或其附近)的相应DNA进行序列比较。有了该DNA比较后，本领域技术人员能够鉴别新序列多态性或者是否存在先前用其它对比未发现的多态性。使用这些数据，人们可以设计新的分子试验，或者使用现有试验，以便于选择在Ty和Mi基因座上呈顺式的任何等位基因组合。

上述方法的类似方法可用于选择和/或渐渗编码根结线虫抗性的等位基因。以举例但非限制性方式来说，将会介绍用于确定番茄植物基因组中存在Mi-1等位基因的测定方法。用于确定Mi-1等位基因存在的测定方法可以按照如上所述的鉴定Ty-1等位基因的类似方式来进行。然而，如果怀疑所研究的植物可能含有Mi-J等位基因时，则对植物基因组中存在Mi-1等位基因的鉴定可能涉及(但并非必要)采用两种分子测定方法，例如实施例所述的方法。在任何情况下，进行这些测定的顺序并不重要。

上述测定可单独和联合用于育种程序，以便于育种和/或选择含有呈互引相的Ty抗性等位基因和Mi抗性等位基因的番茄植物。

这些方法如何使用的一个非限制性实例描述如下，用于选择含有呈互引相的Mi-1和Ty-1的植物。第一种近交番茄系可与第二种近交番茄系杂交，产生杂种植物。用于该杂交的一种番茄植物含有Ty-1等位基因，而第二种植物则在其基因组中含有Mi-1等位基因。然后，让所得植物(F1杂种)自花授粉，受精和结籽(F2种子)。由F2种子生长出F2植物(或进一步自交或杂交，例如与亲本之一回交)。然后提取这些植物的DNA，该技术是本领域已知的(参见Hnetkovsky等，1996，Crop Sci.，36(2)：393-400)，并且对捣碎的组织样品直接进行PCR。

因此，上述测定可用于鉴定含有杂合态Ty-1等位基因和纯合态Mi-1等位基因的F2植物(或其它后代)。或者，人们可以鉴定含有纯合态Ty-1等位基因和杂合态Mi-1等位基因的F2植物。因此，采用一种或多种分子测定方法，例如所述SCAR测定，可以鉴定包含呈互引相的Ty-1和Mi-1的重组植物。

因为Ty和Mi基因座间的重组率低，所以发现F2代的重组体很罕见。本文所述的测定也可用于测定Ty-1和/或Mi-1等位基因是否以纯合态或杂合态存在于植物基因组中。根据该测定的结果，可能需要进一步进行育种和分子表征。例如，如果育种程序的目标是产生近交系，且对于所测定的特定番茄植物的上述一种或多种测定的结果表明，该植物在其基因组中含有纯合态的Mi-1等位基因和杂合态的Ty-1等位基因，那么可采用一种或多种本文所述的测定，对该植物进行进一步自花受精、育种和/或分子表征，直到确定所述植物及其后代在自交后，在其基因组中同时含有纯合态的Mi-1等位基因和Ty-1等位基因为止。一旦产生了呈互引相(即顺式)的Mi-1和Ty-1等位基因，它们将共同遗传。这样的多重抗性等位基因的遗传单元给植物育种者提供了产生新杂种的灵活性，同时也让植物育种者能够掩蔽野生种对第二种近交亲本渐渗的遗传拖曳效应。另外，与其它抗性基因(例如粉孢属和支孢属抗性基因)的组合也是可能的。

如上所述，本发明的方法可用于产生新的优良近交系。这些近交系随后可用于经育种产生赋予TYLCV抗性和根结线虫抗性并具有其它商业所需特征的杂种番茄植物。所述近交系可用于育种，因为这些品系允许Ty-1和Mi-1等位基因作为一个共遗传单元一起转移，便于快速育种。此外，上述方法也可用于证实近交系在其基因组中事实上含有纯合态的Ty-1等位基因和Mi-1等位基因并且保持其纯合性。一旦得到这样的证实，该近交系可用于与第二种近交系杂交，以将Ty-1等位基因和Mi-1等位基因作为一个共遗传单元一起转移到杂种番茄植物。第二种近交系可携带野生型等位基因Ty+和Mi+，以掩蔽遗传拖曳的效应。

本发明的试剂盒

在再一个实施方案中，提供了用于测定Mi和/或Ty基因座上等位基因组成的分子测定。所述测定包括从一种或多种番茄植物中提取DNA，采用至少一个PCR引物对来扩增与Mi和/或Ty基因座连接或在其上的DNA部分，任选用一种或多种限制酶消化扩增产物，然后观察DNA片段。

还提供了检测试剂盒，用于检测植物或植物组织的Mi基因座和Ty基因座的等位基因组成。所述试剂盒包括一个或多个引物对，例如SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4和/或SEQ ID NO：5和6或它们的变异体。此外，还包括使用说明书和任选的植物材料或DNA(例如对照组织)。

实施例

线虫抗性的功效评价

FDR16-2045品系是美国专利6,414,226的主题。它在Ty基因座上含有Ty-1等位基因；该等位基因的起源来自智利番茄(一种现代番茄即普通番茄(L.esculentum)的野生近缘种)的渐渗。Ty-1等位基因赋予对商业上重要的病原体番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的抗性。因为与该渐渗共遗传，FDR16-2045品系在附近Mi基因座上含有Mi-J等位基因。Mi-J等位基因赋予对根结线虫(另一类商业上重要的病原体)的抗性。

在育种和病理学实验中，Mi-J等位基因所赋予的根结线虫抗性水平不如Mi基因座上的替代等位基因Mi-1有效。当Mi-J等位基因呈现出与来自普通番茄的‘+’型敏感等位基因配对的杂合态时，这一点尤为明显。因此，本文所述的一系列病理学实验定量测定了使用Mi-1和Mi-J抗性等位基因的抗性水平。

实施例1：用于测定南方根结线虫抗性的病理学试验

使用活病原体测定，评价针对南方根结线虫(一种番茄根结线虫病的致病因子)的抗性。抗性评分根据瘿瘤形成范围和大小而定。表1提供了根结线虫抗性测定的评分系统。采用0-4的量表(表1)，以评定南方根结线虫病症状的分值。

表1

评分	症状的严重程度
		0	没有瘿瘤
1	1-2个小瘿瘤(＜1mm)
		2	一些瘿瘤(3-7个)，体型小(＜1mm)，分散
3	若干瘿瘤(＞7个)，体型大(＞1mm)，分散
		4	许多瘿瘤，呈链状，畸形根

将来自敏感番茄系的植物感染2个月，制备南方根结线虫接种物；此时，受感染植物的根部显示出来自病原体的成熟卵块。

为了制备接种物，收获根部，切成4-5厘米的小块。试验是在被感染接种物存在下使种子萌发。将种子播种到含有泥炭、蛭石和沙子(分别为4∶1∶1的比例)的土壤混合物的温室育苗台上。将来自某一个品系的种子成行播种，间距约4cm，行距4.5-5cm。在各行间以约12cm的间距打小洞，用于接种物。向这些洞内放入两三块制备好的接种物，用土覆盖。每行两侧接种物交错间隔，每粒种子距离接种物约6-7cm。幼苗在白昼温度范围为22-26℃的温室内萌发生长。播种后28天，将每棵植株拔出，检查根部瘿瘤的存在，进行评分。

用育种系、杂交系和对照系进行试验，一式两份。线虫抗性的病理学试验结果见表2。

表2

¹Super Red是适于中东的市售普通番茄品种，由本发明的受让人Seminis Vegetable Seeds，Inc销售。

²Sadiq是适于中东的市售普通番茄品种，由本发明的受让人Seminis Vegetable Seeds，Inc销售。

³Margo是适于中东的市售普通番茄品种，由本发明的受让人Seminis Vegetable Seeds，Inc销售。

⁴Marmande Verte是花青苷较少的品种，是公众已知品种Marmande的突变型，在Community Variety Catalogue of the EuropeanCommunity(Publication Journal of the EU，C167A)上列出。

左边一栏是被测品系名称。它们排列成包括育种系、杂交系和对照系在内的三个部分。旁边一栏列出Mi和Ty基因座上的基因型。这些基因型通过本文所述的分子标记试验测得。再旁边两个5栏包括在两种独立情况下进行试验所评定的分值。最后5栏汇总这两次试验的结果。

因为有14份在Ty和Mi基因座上具有不同基因型的样品，所以表2中的表现趋势难以识别。在14份样品中，仅有5个是在Mi基因座的基因型。一种基因型是纯合的，均来自普通番茄的敏感等位基因。这称为+/+。第二种基因型是杂合的，是Mi-J等位基因与敏感‘+’等位基因配对。第三种基因型具有纯合态Mi-J等位基因。第四、五种基因型含有Mi-1等位基因，分别以纯合子和与‘+’等位基因构成的杂合子形式存在。

当表2中的数据按照Mi基因座的基因型进行汇总和平均时，不同等位基因组合对线虫抗性的功效就变得清楚了(图3)。在图3中，提供了对表2中的基因型的平均病害评分。按照Mi基因座上的基因型分析表2中的品系。这些基因型种类见Y轴。X轴提供这5类基因型的平均病害评分。

图3显示最初来自秘鲁番茄渐渗的Mi-1等位基因，赋予对线虫的最强水平抗性。也很清楚，无论Mi-1以杂合子(含敏感‘+’等位基因)或以纯合子存在，抗性都很强。这证明Mi-1等位基因以显性方式赋予抗性。与其它基因型相比，基因型Mi-1/Mi-1和Mi-1/+对线虫抗性赋予高度抗性表型。按照本文所述的方法进行测定，这种

“高度抗性”类型定义为平均抗性分值小于0.1。

下一个最具抗性的种类是来自具有以纯合态存在的Mi-J等位基因的品系，该等位基因是来自智利番茄的渐渗。这类抗性定义为“中度抗性”，平均分值大于或等于0.1，但小于1.0。因此，近交系FDR16-2045具有中度水平的抗性。

第三类抗性定义为“低度抗性”，其实例是具有与敏感等位基因‘+’配对的杂合态Mi-J等位基因的品系。该类的平均抗性评分大于或等于1.0，但小于2.0。如果近交系FDR16-2045用作近交亲本以产生杂种栽培品种，并且如果第二亲本含有敏感‘+’等位基因，则该杂种将会仅表现出低度抗性。当比较Mi-J等位基因在中度抗性和低度抗性种类中的表现时，显而易见，该基因以半显性方式起作用。

最后一类定义为敏感型，包括那些具有纯合态的来自普通番茄的敏感等位基因的品系(即+/+)。该敏感类定义为平均病害评分大于2。

这些试验结果表明，使用来自秘鲁番茄(Mi-1)、智利番茄(Mi-J)和普通番茄(‘+’)的等位基因进行番茄育种时，可以达到不同水平的抗性。根据这些数据，番茄育种者可将在Ty基因座(Ty-1)含有抗性等位基因的近交系与在Mi基因座(Mi-1)含有最佳抗性等位基因的近交系杂交，产生杂种栽培品种。但是，该策略有两个关键性限制。首先，这使得育种者不能传递作图到6号染色体着丝粒区的病害簇的其它抗病性基因。已知作图到该区的其它抗病性基因的实例是支孢属小种2和小种5抗性基因和粉孢属抗性基因。其次，因为育种者将原先各自来自野生种的两个区进行渐渗(已知各自都能导致遗传拖曳)，这限制了他或她掩蔽因使用来自现代番茄(L.esculentum)基因而导致的遗传拖曳效应的能力。

在本文所述的番茄植物中以顺式存在的Ty-1和Mi-1提供了等位基因的新组合，这样的组合可克服这些限制，使得番茄育种者对产生具有多重抗病性的栽培品种具有更多选择性。

实施例2：番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)抗性测定方案

该实施例描述了测定番茄植物对TYLCV是具有抗性、中度抗性还是敏感型的方案。

让植物在大田生长，通过烟粉虱进行TYLCV自然感染。自然存在的大田感染是测定病毒流行区内抗性的优选方法，因为可以通过不同政府部门来控制病毒病原体的活动(对病害进行检疫)。例如，美国农业部通常不允许将TYLCV病原体带入通常不存在该病原体的美国大部分番茄种植区。在受控条件下进行病害筛选，是非常麻烦的，因为需要饲养昆虫(烟粉虱)用于病毒传播。

使用0-4级量表(表3)，评定TYLCV病害症状：

表3

评分	症状的严重程度
		0	无症状
1	叶片轻微黄化
		2	叶片具有明显黄化症状并有叶片卷曲
3	植物矮化并具有严重的叶片黄化和卷曲叶片症状
		4	植物严重矮化并有小的黄化卷曲叶片

当植物品系或品种的平均评分为0-1时，则认为它赋予TYLCV抗性；当平均评分为约2时，则具有中度抗性；而当平均评分大于3时，则为敏感型。或者，也可采用本领域技术人员已知的测定TYLCV的方案。″Tomato Yellow Leaf Curl Virus from Sardinia is awhitefly-transmitted monopartite geminivirus(来自撒丁的番茄黄化曲叶病毒是粉虱传播的monopartite双生病毒)″；A.Keyyr-Pour，M.Bendahmane，V.Matzeit，G.P.Acotto，S.Crespi，B.Gronenborn；NucleicAcid Research，第19卷，第6763-6769页；Tomato Yellow Leaf CurlVirus：a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomiccomponent(番茄黄化曲叶病毒：粉虱传播的具有单一基因组组分的双生病毒)″，N.Navot，E.Pichersky，M.Zeidan，D.Zamir，H Czosnek.Virology，185，1991，第151-161页。

用于鉴别Mi和Ty基因座上的等位基因组成的分子试验

3种分子标记试验用于测定Mi和Ty基因座的基因型。在Ty基因座上，仅需要一个共显性分子标记试验来鉴别两种可能的等位基因Ty-1和‘+’。本领域技术人员将会知道，共显性测定定义为鉴别双等位基因基因座上所有3个等位基因可能性的试验。在这些基因座上，可以对3种基因型进行评分——分别为纯合型和杂合型。通常，标记测定，例如序列特征性扩增区域(sequenced characterizedamplified regions，即SCAR测定)、酶解扩增多态位点(cleaved amplifiedpolymorphic sites，即CAPS测定)和单核苷酸多态(single nucleotidepolymorphic，即SNP测定)通常都是共显性测定。相比之下，多态DNA随机扩增和扩增片段-长度多态性(AFLP)通常都是显性标记，所提供的信息不如共显性标记那么多。在Mi基因座上，需要两个试验来测定这三个等位基因(Mi-1、Mi-J和‘+’)间的可能组合。尽管并非限制性的，但是本文所述的标记测定全都是SCAR型测定。

与大多数其它分子标记试验一样，用聚合酶链式反应(即PCR)来进行SCAR测定，PCR可用极少量原料来扩增DNA约十亿倍。PCR的使用方法是本领域技术人员众所周知的，它使得研究人员仅需收获极少量植物样品，就可进行试验。需要小于1cm²的叶片材料、优选生长活跃的新生组织，来进行这些试验。这么少的样品使得这些标记试验通常是非破坏性的。之所以认为它们是非破坏性的，是因为采样不会以任何方式干扰植物的生长发育。因此，这么少的样品不会影响大量后续试验的结果，包括病理学试验、果实生化分析、收率试验或园艺学评价。除了是非破坏性的之外，SCAR测定在时间上也具有额外优势。通常，可在24小时之内确定目标基因座上的基因型。

所用的3种分子标记试验都需要分离基因组DNA。

实施例3：用于标记试验的番茄DNA的分离

以非限制性方式来说，以下方案可用于提取番茄DNA，用于后续分子标记试验。本领域技术人员知道，在现有技术中，有许多DNA提取方案是可行的。本方案所述的所有化学品可得自SigmaChemical Company，Saint Louis，Missouri。该方法包括以下步骤：

1.采集植物部分，大小约为96孔微量滴定板各孔的大小。优选使用种子样品或取自嫩叶的组织样品。

2.向样品中加入150μl提取缓冲液(200mM Tris-HCl，pH7.5；250mM NaCl；25mM EDTA；0.5％SDS)，浸泡组织。

3.将板于1900-xg、15℃离心15分钟。

4.将100μl上清液部分移至新的96孔板中，该板各孔装有100μl 2.5M乙酸钾(pH6.5)。以200rpm振摇混合2分钟。

5.将板于1900-xg、15℃离心15分钟。

6.将75μl上清液部分移至新的96孔板中，该板装有75μl异丙醇。混合后，以200rpm振摇2分钟。

7.将板于1900-xg、15℃离心15分钟。

8.取出上清液部分，将200μl 70％乙醇加入到沉淀部分。以200rpm振摇5分钟，然后在-20℃孵育过夜。

9.将板于1900-xg、15℃离心15分钟。

10.取出上清液部分。将200μl 70％乙醇加入到沉淀部分，使乙醇在室温下洗涤沉淀物达1小时。

11.将板于1900-xg、15℃离心15分钟。

12.弃去上清液部分，将沉淀部分在室温下干燥。这要花约1小时。

13.在37℃，将沉淀部分溶于100μl TE(10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，5μg/ml RNA酶A)中达15分钟。除非继续进行PCR步骤，否则，可将所得DNA贮存于4℃或-20℃。

实施例4：用于SCAR测定的通用PCR条件

3种SCAR标记测定都共享类似的设计和实施方法。每种测定都含有称为引物的一对特异性DNA寡核苷酸，因为它们将用于PCR反应，以引发DNA合成。这些引物的长度通常介于15-25个核苷酸；这些核苷酸的序列段是与有待扩增的标记基因座上的底物DNA序列相匹配的。设计这些引物，使得它们能促进通常介于100-1,000碱基对的扩增子的合成。本领域技术人员知道怎样设计这些引物，以产生SCAR型测定，并且通常还使用软件程序，例如公众可得的Primer3软件(Whitehead Institute，Cambridge，MA)，以辅助设计。可以采用本领域已知方法来合成引物，或者从许多委托合成寡核苷酸公司购买。用于这些测定的所有引物都购自Operon Company，Alameda，CA。PCR反应的其它试剂可购自许多商业供应商；在本文所述的测定中，我们从Pharmacia Company，Kalamazoo，MI购买了4种脱氧核糖核苷酸-5′三磷酸(dNTP)，从Applied Biosystems Company，Foster City，CA购买了PCR缓冲液和Taq聚合酶。本领域技术人员知道，在进行SCAR测定时可以有些灵活性，因为可以使用多种类型的PCR仪和测定条件。对于3种测定的每一种，采用得自AppliedBiosystems Company，Foster City，CA的9700型PCR仪，使用以下运行参数。起始变性步骤是94℃2分钟，接着是35次扩增循环。每次扩增循环具有以下3个步骤：92℃30秒、50℃30秒、72℃90秒。第35次循环后，将样品在72℃保持5分钟。尽管这已结束PCR扩增测定，但是PCR仪的程序是在25℃保持最终反应，直到研究人员干预。

本领域技术人员知道，PCR测定条件上有相当大的灵活性。PCR反应可在1μl DNA模板、各10皮摩尔的两种测定-特异性PCR引物、终体积各200μM的4种dNTP、2.5μl 10X PCR缓冲液和1.25单位Taq聚合酶中进行。用无菌水使反应终体积至25μl。

各SCAR测定在PCR反应完成之后怎样揭示多态性方面也具有共性。对于每次试验，PCR反应所得DNA扩增区可含有多态限制酶识别位点。替代等位基因可以具有或不具有该识别位点。当用特异性限制酶消化PCR产物时，扩增子可不被切割(因为不存在限制酶位点)，或者可被不对称消化成两个片段。基因座的基因型可测定如下：通过在琼脂糖凝胶上电泳分离这些片段、凝胶用溴化乙锭(这是一种与DNA结合的染色剂)染色，然后在紫外线下激发DNA并用肉眼观察这些片段。PCR反应片段大小是通过将其与在琼脂糖凝胶电泳的附近泳道上的已知大小标准进行比较而确定的。2种SCAR测定使用限制酶TaqI，以揭示多态性。对于这些测定，在PCR反应后，向反应物中加入3μl 10X限制酶缓冲液、0.25μl TaqI限制酶和1.75μl水，然后在65℃孵育约3小时。第3次测定使用限制酶NlaIII，以揭示基因型。在该试验中，在PCR反应后，向反应物中加入3.5μl 10X限制酶缓冲液、0.25μl NlaIII和6.25μl水，然后在37℃孵育约3小时。本领域技术人员知道，限制酶和缓冲液可购自许多商业卖主。我们使用来自New Englands Biolabs，Beverly，MA的试剂。在用限制酶消化后，按照本领域众所周知的方法(Current protocols in molecular biology(1994)F.Ausubel主编，John Wiley and Sons，New York)，将产物在1-2％(w/v)琼脂糖凝胶上进行电泳分离。

实施例5：Ty基因座上的SCAR试验

Zamir将Ty-1基因作图到称为TG97的限制性片段长度多态性(RFLP)标记附近((1994)Theoret.Appl.Genet.88：141-146)。因为RFLP测定较难进行，对植物造成破坏，成本高，实验进度慢，所以该RFLP转变成SCAR标记，即通过对RFLP基因座进行测序，使用‘+’等位基因和抗性等位基因Ty-1作为底物。对这些序列进行比较，能够发现多态限制位点。

如本文所述进行SCAR试验，使用以下特异性引物对。

SEQ ID 1：5′TAA TCC GTC GTT ACC TCT CCT T 3′，和

SEQ ID 2：5′CGG ATG ACT TCA ATA GCA ATG A 3′。

可以通过在PCR后用限制酶TaqI进行消化，揭示多态性。如果Ty-1等位基因以纯合子存在，398碱基对的PCR扩增子将会被消化成95和303碱基对片段，因为由该等位基因产生的扩增子含有TaqI限制性识别位点。如果‘+’型等位基因以纯合子存在，398碱基对PCR扩增子将不会被TaqI酶消化。对于杂合样品来说，约一半PCR反应物将会消化成95和303碱基对片段，而另一半PCR反应物则不会被消化。当用电泳分离时，杂合子将具有3种长度的片段即95、303和398碱基对。按照此方式，可以快速准确地测定Ty基因座的基因型。

实施例6：Mi基因座上的SCAR试验1(鉴别Mi-1或Mi-J等位基因及‘+’等位基因)

根据Williamson等(Theoretical and Applied Genetics 87：757-763(1994))所公布的数据，测定了普通番茄、秘鲁番茄和L.在邻近Mi基因座上的多核苷酸序列，称为REX-1。

如本文所述进行SCAR试验(也由Williamson等人描述)，使用以下特异性引物对。

SEQ ID 3：5′AAC CGT GGA CTT TGC TTT GAC T 3′，和

SEQ ID 4：5′TAA GAA CAG GGA CTC AGA GGA TGA 3′。

与本文所述的用于Ty基因座的SCAR测定类似，Mi基因座的SCAR测定#1也使用多态TaqI限制酶识别位点；可通过用限制酶TagI酶促消化PCR产物，揭示该多态性。如果Mi-1等位基因或Mi-J等位基因以纯合子存在，或者Mi-1等位基因和Mi-J等位基因以杂合子存在，则595碱基对的PCR扩增子将会被消化成145和450碱基对片段，因为这些等位基因含有TaqI限制性识别位点。如果‘+’型等位基因以纯合子存在，则595碱基对的PCR扩增子将不会被TaqI酶消化。对于杂合样品(Mi-1/+或Mi-J/+)来说，约一半PCR反应物将会消化成145和450碱基对片段，而另一半PCR反应物则不会被消化。当用电泳分离时，这些杂合子将具有3种长度的片段即145、450和595碱基对。按照此方式，可以测定抗性等位基因(Mi-1或Mi-J)是否存在，或者敏感等位基因(‘+’)是否存在，或者抗性等位基因(Mi-1或Mi-J)和敏感等位基因(‘+’)是否以杂合子形式存在。

实施例7：Mi基因座上的SCAR试验2(鉴别Mi-J与Mi-1或‘+’等位基因)

因为以上实施例5所述的SCAR试验不能鉴别Mi-1和Mi-J抗性等位基因，所以在REX-1标记上开发了另一种SCAR测定。该试验是通过对在该标记基因座的Mi-1、Mi-J和‘+’等位基因进行测序而开发的。遗憾的是，对于3个等位基因的每一个来说，没有具有不同多态性的单个核苷酸。发现单个碱基多态性在称为NlaIII的限制酶识别位点上。具体地讲，Mi-J等位基因含有该识别位点，而Mi-1和‘+’等位基因不含该识别位点。

根据该多态性，开发出第二种SCAR测定，可如本文所述进行该测定，使用以下特异性引物对：

SEQ ID 5：5′CTA CGG AGG ATG CAA ATA GAA

SEQ ID 6：5′AAT CAT TAT TGT CAC ACT TCC CC

可以按照本文所述的方法，进行PCR反应，通过用限制酶NlaIII消化反应物，揭示该多态性。如果Mi-J等位基因存在的话，282碱基对的扩增子将会被消化成124和158碱基对片段。如果Mi-1等位基因或者‘+’等位基因存在的话，扩增子则不会被NlaIII酶消化。杂合子(Mi-J/Mi-1或Mi-J/+)将具有所有3种片段(124、158和282碱基对)。使用Mi基因座(实施例5和6)上的SCAR测定，可以测定Mi基因座的基因型，无论这三个可能等位基因以哪种组合存在(Mi-1、Mi-J或‘+’)。

实施例8：在Mi和Ty基因座上结合最有效等位基因的育种方案

从两个亲本系(分别含有固定的紧密连锁的目标等位基因)开始，本领域技术人员将会知道一些遗传策略可达到将这些目标性状顺式结合在一起的目标。然而，所有这些策略都始于分别含有目标性状的亲本系的杂交，以产生F1杂种。优选亲本系应各自固定一个目标性状。F1植物可以自花授粉，以产生分离的F2群体，或者它可以与亲本之一回交。无论杂交策略如何，本领域技术人员都将会知道，可以产生新的目标重组体，因为F1植物通过减数分裂产生配子。

以非限制性方式来说，按照F2策略，顺式结合Mi-1和Ty-1等位基因。具体地讲，1997年秋季在法国尼姆(Nimes)进行了近交育种系FIR16-176和FDR16-2045间的杂交。这些育种系都来自本发明的受让人Seminis Vegetable Seeds，Inc.的番茄育种程序。近交系FIR16-176在Ty基因座含有敏感等位基因‘+’，在附近Mi基因座含有Mi-1等位基因。近交系FDR16-2045是美国专利6,414,226的主题，在Ty基因座含有Ty-1等位基因，在附近Mi基因座含有Mi-J等位基因。因此，称为#1652817的F1植物在Ty和Mi基因座含有一对顺式配对的等位基因，代表亲本基因型。这些配对的等位基因通常一起加下划线，下划线代表基因座是遗传连锁的。例如，F1植物具有顺式配对的‘+’Mi-1和Ty-1Mi-J。尽管当亲本经历了减数分裂时，可以发生重组，但是却没有发生有效重组，因为这些品系各自固定在Mi和Ty基因座上。

F1植物#1652817自花授粉，产生F2群体。因为F1植物通过减数分裂产生配子，所以大多数配子保留来自原有亲本的等位基因组合(‘+’Mi-1和Ty-1Mi-J)。Ty和Mi基因座间的遗传距离决定了产生重组配子(‘+’Mi-J和Ty-1Mi-1)的相对频率。因为Ty和Mi基因座位置靠近，许多研究人员已经表明，重组在6号染色体的该区内是被抑制的，本领域技术人员可以预计，与亲本配子相比，重组配子的数量将非常低。

然后如本文所述，开发了一系列分子试验，以鉴定具有顺式Ty-1和Mi-1等位基因的重组体，因为如果没有多年、多世代筛选，想通过表型病理学筛选，对该顺式配对的表型进行鉴定是不可能的。本领域技术人员将会知道，对顺式配对的等位基因进行表型鉴定是可能的，但是显而易见，本文所述的分子鉴定方法，对于鉴定这些有用的等位基因组合来说，是更快速且有效得多的方法。

2000年1月，对来自F1杂种1652817自交的504株F2幼苗进行采样，用于DNA提取(实施例3)，然后采用本文所述的方法(实施例4和5)，对各样品测定Ty基因座上的基因型。127株植物是敏感‘+’等位基因纯合的；弃去这些植物。剩下377株植物是Ty-1等位基因杂合(Ty-1/‘+’)或者是Ty-1等位基因纯合(Ty-1/Ty-1)，采用本文所述的方法(实施例4、6、7)，对它们进行分析，测定附近Mi基因座的基因型。选择任何含有一个有利等位基因作为杂合子(Ty-1或Mi-1)和具有其它有利等位基因(Ty-1或Mi-1)固定作为纯合子的植物，作为具有顺式Ty-1和Mi-1等位基因。

没有预计到会有重组体，因为已有许多文件记载，在6号染色体的该区内重组是受抑制的。因此，没有预计到会发现8个这样的重组体。Kaloshian等人((1998)Mol.Gen.Genet.257：376-385)表明，当将秘鲁番茄和秘鲁番茄的杂交，与普通番茄和秘鲁番茄的杂交相比较时，该区的重组率高约8倍。甚至这一可能的解释用于相当高的重组体产生率，但是这仍然无法预计的，因为所进行的杂交在其基因组区中含有多毛番茄和秘鲁番茄DNA，而不是Kaloshian等(出处同上)的秘鲁番茄与秘鲁番茄的杂交。

Mi-1和Ty-1渐渗已知分别导致遗传拖曳。因此，因为发现的8个重组体中的每个都是独特重组事件，这是减少与这些性状的渐渗相关的拖曳的机会。进行了很多园艺上的评价，从这些评价中选出称为#20和#251的两株植物进行改进。这些植物都是Ty-1等位基因杂合(Ty-1/‘+’)和Mi-1等位基因纯合的。因此，这些植物都含有呈顺式的Ty-1和Mi等位基因，尽管该有利的顺式组合不是固定的。

在2000年春季，使F2植物#20和251自花授粉，产生F3群体。这些群体分别称为97.5281.M20和97.5281.M251。采用本文所述的方法(实施例3-7)，对于这两次事件，将Ty-1和Mi-1等位基因以纯合态固定。

为了确保分子试验精确预测抗性表型，按照本文所述的方法(实施例1)，对这些来自植物#20和#251(97.5281.M20.M.1.1、97.5281.M251.M.1.1、97.5281.M251.M.2.1)的固定品系进行试验，测定根结线虫抗性。表2显示这些具有独特的Ty-1和Mi-1等位基因顺式排列的品系对根结线虫都具有高度抗性。

采用本文所述的方法(实施例2)，在土耳其Antalya也测定了这些相同品系(97.5281.M20.M.1.1、97.5281.M251.M.1.1、97.5281.M251.M.2.1)的TYLCV。这些具有独特的Ty-1和Mi-1等位基因顺式排列的品系对TYLCV都具有抗性。

Ty-1和Mi-1有效抗性等位基因的这种顺式组合，使得番茄育种者能够产生番茄杂种，所述杂种对TYLCV具有抗性而且对线虫具有高度抗性，同时又保留具有第二近交亲本的自由性，以掩蔽遗传拖曳或传递额外的粉孢属抗性基因或支孢属抗性基因或传递在该病害簇上有待发现的抗性等位基因。该新方法为番茄种植者提供了控制大量病害病原体的机会，并且具有可接受的园艺品质，而不只是依赖于化学杀虫剂进行控制，或者也不依赖于转基因抗性策略。

Claims

1.一种普通番茄植物细胞，所述植物细胞在其基因组中包含至少一个番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)抗性等位基因和至少一个根结线虫抗性等位基因，其中所述至少一个TYLCV抗性等位基因是Ty-1，和所述至少一个根结线虫抗性等位基因以互引相存在于同一条染色体的不同基因座上，所述植物对TYLCV具有抗性，并且所述植物对至少一种选自花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)的根结线虫的根结线虫病害评分小于0.1，以及所述至少一个根结线虫抗性等位基因是Mi-1。

2.权利要求1的植物细胞，所述植物的根结线虫抗性评分小于0.05。

3.权利要求1的植物细胞，所述植物的根结线虫抗性评分小于0.04。

4.权利要求1的植物细胞，所述植物的根结线虫抗性评分小于0.03。

5.权利要求1的植物细胞，其中TYLCV抗性等位基因是称为Ty-1的等位基因，根结线虫抗性等位基因是称为Mi-1的等位基因，所述染色体是6号染色体。

6.权利要求1的植物细胞，其中所述TYLCV抗性等位基因和所述根结线虫抗性都是非转基因的。

7.权利要求1的植物细胞，其中所述TYLCV抗性等位基因和所述根结线虫抗性等位基因分别来自智利番茄(Lycopersicon chilense)和秘鲁番茄(Lycopersicon peruvianum)。

8.一种杂种普通番茄植物细胞，所述植物是通过将权利要求1的植物与缺乏所述TYLCV抗性等位基因和缺乏所述根结线虫抗性等位基因的近交植物进行杂交而产生的。

9.权利要求1的杂种普通番茄植物细胞，其中所述TYLCV抗性等位基因和所述根结线虫抗性等位基因都是杂合的。

10.权利要求9的植物细胞，其中所述TYLCV抗性等位基因和所述根结线虫抗性等位基因所在的基因座是在所述染色体的相同抗病性簇内。

11.权利要求10的植物细胞，所述植物包含所述簇内的至少一个额外的抗病性等位基因，其中所述额外的抗病性等位基因位于与具有所述TYLCV抗性等位基因和所述根结线虫抗性等位基因的所述染色体呈反式的染色体上。

12.权利要求11的植物细胞，其中所述额外的抗病性等位基因提供针对选自支孢属小种2(Cladosporium race 2)、支孢属小种5(Cladosporium race 5)和粉孢属(Oidium)的病害的抗性。

13.权利要求1的近交普通番茄植物细胞。

14.获自权利要求1中定义的植物细胞的果实，其中所述果实不是繁殖材料。

15.生产番茄植物的方法，所述方法包括：

将权利要求1的普通番茄细胞培育成第一普通番茄植物；和

使所述第一普通番茄植物与第二普通番茄植物杂交。

16.生产杂交的普通番茄植物的方法，所述方法包括

(a)获得在其基因组中包含至少一个番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)抗性等位基因Ty-1和至少一个根结线虫抗性等位基因Mi-1的第一普通番茄植物，其中所述抗性等位基因以互引相存在于同一条染色体的不同基因座上以及所述植物对TYLCV具有抗性，并且所述植物对至少一种选自花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)的根结线虫的根结线虫病害评分小于0.1；和

(b)使所述第一普通番茄植物与带有额外的抗性等位基因的第二番茄植物杂交；

其中所述杂交的普通番茄植物带有两个以互引相存在的抗性等位基因。

17.权利要求16的方法，其中所述两个以互引相存在的抗性等位基因位于染色体6。

18.权利要求16的方法，其中所述额外的抗性等位基因提供针对选自支孢属小种2(Cladosporium race 2)、支孢属小种5(Cladosporium race 5)和粉孢属(Oidium)的病害的抗性。

19.权利要求16的方法，其中以互引相存在的所述抗性等位基因与所述额外的抗性等位基因呈反式。