CN103866027B - 双重snp标记在番茄黄化曲叶病抗病基因检测中的应用 - Google Patents

双重snp标记在番茄黄化曲叶病抗病基因检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物分子标记技术领域，具体涉及一个与番茄黄化曲叶病毒病抗性相关的基因Ty-1的双重SNP标记，从报道的WO2012125025A1文献中得到抗病基因Ty-1和感病基因（即等位基因）ty-1的cDNA序列，及其在全基因组上的位置。通过序列对比，选取两个多元SNP位点GT/CG和GTG/ACA分别用来设计感病和抗病的特异引物NL2和NL3，将两对引物混合组成NL2-3双重SNP标记引物。通过NL2-3SNP标记通过一次PCR反应和凝胶电泳显示就可检测到Ty-1和ty-1的三种基因型。

Description

双重SNP标记在番茄黄化曲叶病抗病基因检测中的应用
技术领域
本发明属于植物分子标记制备技术领域，具体涉及一种双重SNP分子标记在番茄黄化曲叶病抗病基因Ty-1检测中的应用，本发明制备的简单适用的抗病基因标记可用于蔬菜特别是番茄抗病基因的标记辅助选择。
背景技术
番茄是世界上最重要的蔬菜作物之一，已经发展成为全球产量最高的30种农作物之一，在我国南北各地广泛种植。但是，随着保护地栽培面积的不断扩大，栽培时间的不断延长，许多病害呈现逐年加重的趋势，而且新的病害不断出现，给我国的番茄生产造成了严重损失。
近几年，番茄黄化曲叶病毒病已成为全世界番茄生产上危害最严重的病害之一，是一种毁灭性病害，病毒以烟粉虱作为传播媒介。该病发病的初期主要表现为：番茄的植株矮小，整体生长较缓慢，叶片变小变厚且向上卷曲变形，叶片的边缘表现出黄化。在后期则表现为：开花坐果困难，果实变小僵化或膨大速度极慢，有些果实甚至不能膨大，膨大后到了成熟期也不能正常转色，最终导致番茄生产的减产或绝收。当前该病已经成为限制番茄种植生产的重要因素之一。
另外，番茄黄化卷叶病毒病一旦发生则无药可治，因此培育抗病新品种是防治此病的根本途径。目前已经发现并确定的番茄黄化卷叶病毒抗病基因有5个：Ty-1、Ty-2、Ty-3，Ty-4和Ty-5，其中Ty-1和Ty-3为等位基因，且基因序列已被克隆，这为基因标记辅助育种奠定了基础。
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指群体基因组DNA序列中单个碱基的变化，包括单个碱基的插入、缺失和替换。根据已知基因序列，利用SNP位点可以开发出有效的基因标记，与其他分子标记相比，SNP基因标记具有以下优点：数量多，分布广；富有代表性；遗传稳定性高；便于检测。另外由于SNP标记是根据已知基因序列开发的标记，和连锁分子标记相比，其不会出现标记和目的基因分离的情况，大大提高了标记的准确性和稳定性。目前，开发SNP基因标记过程中应用最广泛的是等位基因特异PCR技术，主要是指巢式PCR和引物ARMS-PCR。
等位基因特异PCR技术(AS-PCR)的基本原理是根据一个SNP位点设计特异引物，其中一条引物链的3'末端与SNP位点一种碱基类型相同或互补，另一条引物链按照正常引物设计的方法即可。特异引物只在一种基因型中有扩增的产物，在另一种基因型中没有。因此用凝胶电泳显示扩增产物的有无，从而确定SNP基因型。另外，为了提高引物的特异性，很多研究者提出在3’端的第二或第三位引入错配碱基，该错配碱基与3’末端的错配碱基共同作用，大大降低了引物与其3’末端不互补模板之间的错误延伸，从而提高了AS-PCR的准确性。
巢式PCR是在Newton设计特异引物的基础上增加一条引物链，与普通引物链形成对照，用3个引物链形成的两对引物进行巢式PCR，提高了引物的特异性，减少了假阳性。用三个引物组成的两对引物各进行一次PCR，就可以实现SNP的分型和检测。
Ye等(2001)对巢式PCR做了进一步的改进，设计四条引物，针对SNP位点设计两条延伸方向相反的特异引物，引物的设计遵循AS-PCR错配碱基引入的设计方法，另外两条是外侧的普通链。如此，四条引物组成三对引物对，检测有三条带的是杂合型，有两条带的是纯合型，根据条带的大小可以判定是哪一种纯合型。只需要进行一次PCR反应和一次凝胶电泳就可以区分三种基因型。
至今，还没有关于Ty-1基因的SNP基因标记的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，寻找抗番茄黄化曲叶病毒病基因Ty-1的双重SNP分子标记，同时利用该双重SNP分子标记检测番茄黄化曲叶病抗病基因Ty-1抗或感病性，与已报道的现有连锁标记相比，本发明制备的分子标记能显著提高基因标记应用的准确性和稳定性，加快蔬菜抗病育种的速度。利用本发明所创建的基因标记具有选择精确度高，操作简单，无需酶切，只需一次PCR反应和一次凝胶电泳就可以区分三种SNP分型等优点。在分子标记辅助育种过程中节省了时间，节约了耗材，从而提高了育种效率。
本发明将是利用新型SNP分型技术开发的首个Ty-1的SNP基因标记，其在辅助育种和种质鉴定的过程中，得到了很好的应用。新型SNP分型技术是指选取两个SNP位点，分别设计一对引物，其中一对引物的特异引物链的3’末端与感病SNP位点匹配，另一对引物的特异引物链的3’末端与抗病SNP位点匹配，引物的设计遵循AS-PCR错配碱基引入的设计方法。为了避免四条引物之间的干扰，选取的两个SNP位点在全基因组上有一定的物理距离。如此，四条引物组成三对引物，但是由于两个SNP位点足够远，非特异的两条引物组成的引物对在有限的扩增时间内不能扩增出有效片段。只需一次PCR反应和一次凝胶电泳显示就可区分三种基因型，凝胶电泳检测有两条带的是杂合型，有一条带的是纯合型，根据带的大小可以判定是哪一种纯合型。另外，如果选取的两个理想的SNP位点在全基因组序列上的物理距离比较近，则可以考虑两个特异引物共用一个普通的反向或正向引物，即三条引物组成两对引物。
实现本发明的技术方案如下：
(1)根据番茄黄化曲叶病抗病基因Ty-1及感病基因ty-1设计2对特异引物对，这些引物对的DNA序列如下所示：
正向引物NL3-T-F TGTATGCGTCGTGTTAGAAGGTC，
反向引物NL3-T-R AATGGTGACAGAATCAAGATCCAC；
正向引物NL2-t-F AAACGCTCTTCTTCCCCTCG，
反向引物NL2-t-R AGTTAGATTCAGGCTCCTCGCA；
2)PCR条件及方法
PCR反应体系：总体积20μL。10×PCR缓冲液(Buffer)2.0μL,dNTP(10mmol/μL)0.4μL,NL2正反引物NL2-T-F和NL2-T-F(100μM/L)各0.4μL,NL3正反引物NL3-T-F和NL3-T-R(100μM/L)各0.2μL,DNA模板(300-500ng/μL)1.0μL,Taq酶(5U/μL)0.2μL，ddH2O补足20μL。
PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min45s，进行35个循环，72℃延伸10min，4℃保存10min。
3)对PCR产物进行多态性鉴定
分析结果表明：利用本发明制备的分子标记(或称引物组合)，番茄Ty-1纯合株系能检测出984bp的片断；ty-1纯合株系能检测到1434bp的片段；Ty-1/ty-1杂合株系能检测出984bp和1434bp的片段。
从文献及专利中查找得到TY-1和ty-1的cDNA序列并通过序列对比(见图1)选取两个多元SNP位点进行分别设计特异引物对NL2和NL3，其位于gDNA上的位置见图2和图3。特异引物对NL3扩增的片段序列见图4，NL2扩增的片段序列见图5。将NL2和NL3两对引物以2：1的比例混合组成双重PCR引物NL2-3，得到双重SNP标记NL2-3，用其检验的供试材料的SNP分型结果见图6。
更详细的技术方案如《具体实施方式》所述。
本发明的优点在于：
1、本发明开发的标记是基因标记，与现有的链锁标记相比具有更高的准确性和稳定性，在实际应用中提高了品种选育和种质资源鉴定的效率。
2、NL2-3双重SNP标记综合了四个引物PCR和多重PCR的技术要点，通过一次PCR反应和一次琼脂糖凝胶电泳显示就可以区分三种基因型，且不需要酶切。而现在广泛应用的AS-PCR分型技术则需要进行两次PCR反应和两次琼脂糖凝胶电泳显示。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1和2是本发明设计的分子标记组合(即引物组合1)的DNA序列。
序列表SEQ ID NO：3和4是本发明设计的另一个分子标记组合(即引物组合2)的DNA序列。
序列表SEQ ID NO：5是利用本发明的引物对NL3扩增产物的核苷酸序列，序列长度为984bp。
序列表SEQ ID NO：6是利用本发明的引物对NL2扩增产物的核苷酸序列，序列长度为1434bp。
图1：抗病基因Ty-1和感病基因ty-1的cDNA序列，序列长度为分别为3103bp和3091bp，标有阴影的碱基为SNP位点，两处标有字符边框的为本发明用来开发标记的多元SNP位点。
图2：本发明双重SNP基因标记开发原理的示意图。
图3：SNP标记(NL2-3)的四条引物在ty-1全基因组上的位置示意图。其中NL3-T-F位于540bp-559bp；NL3-T-R位于1952bp-1973bp；NL2-t-F位于9869bp-9991bp；NL2-t-R位于10829bp-10852bp。
图4：引物组合NL3扩增产物的核苷酸序列。
图5：引物组合NL2扩增产物的核苷酸序列。
图6：琼脂糖凝胶电泳的跑胶图。图6为双重SNP标记NL2-3检测供试材料SNP分型图。图6a为NL2引物对单独检测结果，1434bp带型表示供试材料含有感病ty-1基因；图6b为NL3引物对单独检测结果，984bp带型表示供试材料含有抗病Ty-1基因；图6c为NL2-3混合引物检测结果，984bp带型代表纯合基因型Ty-1/Ty-1(TT),1434bp带型代表纯合基因型ty-1/ty-1(tt),984bp和1434bp两条带型代表杂合基因型Ty-1/ty-1(Tt)。
图中标记说明，Marker为DS 5000，最亮的带指示1000bp，泳道1为抗病纯合对照LA1969，泳道2为感病对照Moneymaker，泳道3为杂合抗病材料商品种F1代华番11号,泳道4-16为用于检测的种质资源。
具体实施方式
根据以下的描述，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1番茄Ty--1和ty--1的cDNA及ty--1的gDNA序列的获得双重SNP标记的建立
(1)参照公开号为WO2012125025A1(http://www.google.com.hk/patents/WO2012125025A1？cl＝en)找到Ty-1及其感病等位基因ty-1的cDNA序列(见图1)，参考文献(VerlaanMG et al.2013)得知感病基因ty-1的gDNA序列及其在全基因组上的位置(第6号染色体30850904-30879542，由Solyc06g051170,Solyc06g051180和Solyc06g051190构成)，并用于SNP标记的开发。
(2)通过MultAlin在线序列对比软件(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)对比抗感病的cDNA序列，发现54个SNP位点(图1加阴影的碱基)。其中，Ty-1和ty-1在313，314位上的碱基分别为GT和CG(命名为NL2)见图1a加边框碱基，在1159，1160，1161上的碱基分别为GTG和ACA(命名为NL3)见图1b加框碱基，两个连续的多碱基突变位点在全基因组上的物理距离为10271bp。
(3)引物设计：根据上述找到的两个多元碱基突变位点(NL2和NL3)设计特异引物，NL2的特异引物(NL2-t-F)3’端前两位碱基与感病基因ty-1的相同，NL3的特异引物(NL3-T-R)3’端的前3位碱基与抗病基因Ty-1的互补。非特异引物NL2-t-R和NL3-T-F则为ty-1和Ty-1的通用引物。另外，如果SNP位点为单碱基突变，不存在多元碱基突变，则需要在特异引物3’端的第二，三位引入错配碱基以提高引物的特异性。设计原理见图2和图3，所述引物组合的DNA序列如下所示：
NL3-T-F 5’TGTATGCGTCGTGTTAGAAGGTC3’；(非特异性引物)
NL3-T-R 5’AATGGTGACAGAATCAAGATCCAC 3’(特异性引物)；
扩增得到984bp的片段(见图4)；
NL2-t-F 5’AAACGCTCTTCTTCCCCTCG 3’(特异性引物)；
NL2-t-R 5’AGTTAGATTCAGGCTCCTCGCA 3’(非特异性引物)；
扩增得到1434bp的片段(见图5)。
(4)双重SNP体系的获得：将NL2和NL3两对特异引物以不同的比例混合以筛选得到最佳的引物组合，最终确定NL2的用量是NL3的两倍，且将混合引物命名为NL2-3。通过不断的调试将退火温度设定为最佳值为58℃。
(5)DNA的提取
在实验室取各供试材料番茄(为常规栽培品种)单株的幼叶，参考CTAB法(Roger&Bendich，1988)提取基因组DNA，用NanoDrop 2000测定OD值，并将其稀释至工作浓度300-500ng/μL。
(6)PCR扩增与电泳检测
PCR反应体系：总体积20μL。10×PCR缓冲液(Buffer)2.0μL,dNTP(10mmol/μL)0.4μL,NL2正反引物NL2-T-F和NL2-T-F(100μM/L)各0.4μL,NL3正反引物NL3-T-F和NL3-T-R(100μM/L)各0.2μL,DNA模板(300-500ng/μL)1.0μL,Taq酶(5U/μL)0.2μL，用ddH2O补足20μL(引物由华大基因科技服务有限公司合成，缓冲液(Buffer)，dNTP和Taq酶购自Transgene公司。
PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min45s，进行35个循环，72℃延伸10min，4℃保存10min。
凝胶电泳检测：PCR产物用用加有EB(溴化乙锭)的1％琼脂糖在100-120V电压条件下电泳30-40min，最终结果在凝胶成像系统上显示。番茄Ty-1纯合株系能检测出984bp的片断；ty-1纯合株系能检测到1434bp的片段；Ty-1/ty-1杂合株系能检测出984bp和1434bp的片段。
实施例2利用NL2-3双重SNP标记检验供试材料的基因分型与田间接种验证
(1)NL2-3检验供试材料的基因分型
供试的用于检验基因型分型的(不是用于遗传育种的目的)番茄材料来自华中农业大学番茄课题组收集得到的常用番茄材料，SNP分子标记鉴定结果见图6(其中Marker为DS 5000,泳道1.为已知抗病纯合材料LA1969，2.为已知感病材料Moneymaker(依据Verlaan M G等2013发表的文章)，3.为已知杂合抗病材料商品种F1代华番11号，4.泳道3—19为供试检验材料)。筛选结果为，泳道4，9，15为纯合抗病基因型Ty-1/Ty-1，2，5，6，8，10，12，13，14，16，17，18，19为杂合抗病基因型Ty-1/ty-1，7，11为感病基因型ty-1/ty-1。(2)番茄黄化曲叶病苗期接种鉴定
田间播种鉴定是依靠烟粉風传播使材料获得病毒而表现症状,毒源为浙江大学所保存的带毒烟粉風。在含有大量带毒烟粉虱的防虫温室内将供试材料的种子播种于营养钵中。发病期间不喷施任何杀虫剂，任其自然发病。接种后定期观察发病情况，30天左右，待对照品种完全发病时，统计供试材料的发病情况。
TYLCV病害严重度评价标准(依据Griffiths&Scott，2001发表的文献):
0级：无任何感病症状；
1级：近看轻微的感病症状，主要是顶部叶片黄化，叶片边缘向上卷曲；
2级：植株一半区域感病，一半区域健康；
3级：整个植株感病，基本没有健康组织；
4级：症状非常严重，植株矮化，基本停止生长；
为了统计准确，选0.5、1.5、2.5、3.5作为中间值
TYLCV病情统计：与抗病对照LA1969和华番11号症状一致的记为抗病‘R’，与感病对照Moneymaker症状一致的记为感病‘S’。结果见表1所示。
表1番茄抗黄化曲叶病毒种质资源调查结果
对表1中涉及用于表1检验用的番茄材料(媒介材料)来源的说明：
番茄LA1969和Moneymaker，来源于美国加利福尼亚，University of California,Davis One ShieldsAvenue Davis,CA 95616的Jennifer Petersen教授惠赠(该材料只是用于检测的材料，试验中不限于该材料)。
华番11号，来源于华中农业大学园艺林学学院(该材料只是用于检测的材料，试验中不限于该材料)。
番茄GH86-1、GH204-1、GH204-2、GHG2、GH1-10，GH26-1、GH1-14，来源于广西大学惠赠(这些材料只是用于检测的材料，试验中不限于这些材料)。
番茄11-19，来源于北京市农林科学院蔬菜研究中心(该材料只是用于检测的材料，试验中不限于该材料)。
参考文献
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Claims (1)

1.一种双重SNP分子标记在番茄黄化曲叶病抗病基因检测中的应用，其特征在于下列步骤：
1)根据番茄黄化曲叶病抗病基因Ty-1及它的等位基因即感病基因ty-1，设计2个特异引物组合，所述的引物组合的DNA序列如下所示：
正向引物NL3-T-F TGTATGCGTCGTGTTAGAAGGTC，
反向引物NL3-T-R AATGGTGACAGAATCAAGATCCAC；
正向引物NL2-t-F AAACGCTCTTCTTCCCCTCG，
反向引物NL2-t-R AGTTAGATTCAGGCTCCTCGCA；
2)PCR条件及方法：
PCR反应体系：反应总体积为20μL，其中10×PCR缓冲液2.0μL，10mmol/μL的dNTP0.4μL，NL2正反引物NL2-t-F和NL2-t-R各0.4μL，NL3正反引物NL3-T-F和NL3-T-R各0.2μL，各引物链的浓度为100μM/L，300-500ng/μL的DNA模板1.0μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，ddH2O 15.2μL；
PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min45s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存10min；
3)对PCR产物进行多态性鉴定：
利用加溴化乙锭即EB的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的产物，根据电泳图谱中出现条带的长度判定结果，出现984bp的带判定为Ty-1纯合株系；出现1434bp的带判定为ty-1纯合株系；出现984bp和1434bp的带判定为Ty-1/ty-1杂合株系。
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