CN108203737A

CN108203737A - 玉米穗行数相关基因grmzm2g098557的snp分子标记及应用

Info

Publication number: CN108203737A
Application number: CN201810316033.5A
Authority: CN
Inventors: 沈亚欧; 张晓祥; 管中荣; 李昭玲; 张严玲; 刘鹏; 刘敏; 谭小龙; 张银超
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-04-10
Filing date: 2018-04-10
Publication date: 2018-06-26
Anticipated expiration: 2038-04-10
Also published as: CN108203737B

Abstract

本发明提供了玉米穗行数相关基因GRMZM2G098557的SNP分子标记及应用，该SNP标记为2个，所述标记分别位于玉米基因组Chr4:199959357bp和Chr4:199959358bp的位置，侧翼序列如SEQ ID No.1所示。2个SNP分子标记与玉米穗行数相关基因显著相关，第一SNP位点基因型为A/A的玉米自交系材料的穗行数高于位点基因型为G/G的玉米自交系。第二SNP位点基因型为G/G的玉米自交系材料的穗行数高于位点基因型为A/A的玉米自交系。本发明的分子标记可用于玉米辅助育种，加速玉米高产创制与新品种选育进程。

Description

玉米穗行数相关基因GRMZM2G098557的SNP分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及与玉米穗行数性状相关的分子标记，具体涉及玉米第4号染色体上GRMZM2G098557基因的两个与玉米穗行数显著关联的SNP标记、扩增其的引物对以及该标记的应用。

背景技术

玉米是我国目前第一大粮食作物，也是重要的工业原料和能源作物。持续提高玉米产量是确保我国粮食安全、经济快速发展的重要保障。随着我国耕地面积不断减少，通过提高玉米单产从而提升玉米产量是目前生产上最有效的途径。玉米单产量主要由穗行数、行粒数和百粒重决定，因此提高玉米穗行数是提高玉米单产的主要途径之一。

研究和生产实践表明，穗行数是玉米重要的产量构成因素，与玉米产量呈显著正相关。在玉米的驯化和遗传改良过程中，穗行数受到强烈的选择。作为重要的数量性状，穗行数受到微效多基因位点的控制，同时穗行数的发育是玉米花序发育的重要环节，受花序发育相关基因的调控。在玉米产量的三个主要构成因子中，不同品种的行粒数和百粒重受外界环境条件的影响较大，而由于穗行数是在雌穗分化过程中决定的，因此，其遗传力较高且受外界环境条件影响较小，对保证玉米产量具有重要作用。尽管在玉米穗行数基因挖掘方面已取得了一些进展，但整体上仍相对缓慢，且目前已克隆的玉米穗行数相关基因大多来自突变体研究，而利用图位克隆方法获得、对育种实践具有较高利用价值的关键基因挖掘工作仍然很少。

全基因组关联分析(GWAS)是一种在自然群体中基于连锁不平衡(LD)鉴定表型性状与遗传标记之间关系的分析方法，是挖掘优良等位基因的有效途径。目前随着基因测序技术、生物信息学的高速发展，全基因组关联分析成为挖掘和剖析玉米穗行数性状相关基因及其遗传基础的最有效的方法之一。玉米遗传学家在全基因组水平上挖掘玉米穗行数相关基因、开发功能标记、加快高产玉米的定向遗传改良。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一组与玉米穗行数性状相关基因GRMZM2G098557的SNP分子标记，所述SNP标记与玉米穗行数显著相关。

本发明的第二个目的是提供扩增所述SNP分子标记的引物对。

本发明的第三个目的是提供所述SNP分子标记的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：收集了中国、美国、墨西哥等地的温带、热带、亚热带玉米自交系310份，作为本研究的关联群体，结合该关联群体的穗行数表行数据和SNP基因型数据，运用R语言中FarmCPU包来进行全基因组关联分析，结果发现，其位于玉米基因组Chr4:199959357bp(基因组版本为Maize B73RefGen_v3)的SNP分子标记与玉米穗行数显著相关，为第一SNP分子标记。并且从扩增测序发现位于玉米基因组Chr4:199959358bp(基因组版本为Maize B73RefGen_v3)的SNP分子标记与关联分析结果SNP标记紧密连锁，与玉米穗行数显著相关，为第二SNP分子标记。

所述第一SNP标记的等位基因为A和G，在供试自交系中有A/A和G/G两种纯合基因型，第二SNP分子标记的等位基因为A和G，在供试自交系中有A/A和G/G两种纯合基因型，有共同侧翼序列如SEQ ID NO.1所示。

所述SNP标记与玉米穗行数显著相关，第一SNP位点基因型为A/A的玉米自交系材料的穗行数高于位点基因型为G/G的玉米自交系。第二SNP位点基因型为G/G的玉米自交系材料的穗行数高于位点基因型为A/A的玉米自交系。

筛选到所述显著关联的SNP后，基于该位点侧翼序列，本发明人设计了包含上述SNP位点的检测玉米穗行数相关基因GRMZM2G098557的特征引物对，序列如下：

上游(F)：5’-TGCTGCGGATCAATTCTGGT-3’(SEQ ID NO.2)

下游(R)：5’-TACAGACCCATACGCAAGCC-3’(SEQ ID NO.3)

本发明还提供用于检测所述SNP分子标记的试剂盒，包含上述引物对。

本发明还提供了所述SNP分子标记、引物对或试剂盒在鉴定玉米穗行数性状相关基因GRMZM2G098557中的应用；在筛选或鉴定玉米穗行数大小的种质资源中的应用；及在玉米高产改良中的应用。

本发明还提供了所述SNP分子标记、引物对或试剂盒在选育高产玉米中的应用。

本发明还提供一种检测玉米穗行数大小的方法，用上述引物对进行PCR扩增待检测玉米基因组DNA，根据PCR扩增产物，确定所述待测玉米材料的所述SNP的基因型，预测待测玉米的穗行数的大小。第一SNP位点基因型为A/A的玉米自交系材料的穗行数高于位点基因型为G/G的玉米自交系。第二SNP位点基因型为G/G的玉米自交系材料的穗行数高于位点基因型为A/A的玉米自交系。

PCR程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；59℃退火30s；68℃延伸6s；共35个循环；68℃再延伸10min。

发明人利用已构建的玉米IBM Syn 10DH(B73×Mo17)群体的240个家系为连锁群体，结合bin marker基因型数据和玉米穗行数的表型数据，进行QTL定位。结果发现上述SNP分子标记位于QTL定位的区段内，进一步验证了上述SNP分子标记与玉米穗行数性状的重要性。

为进一步验证所开发标记的有效性，发明人挑选连锁群体中的30份家系及两亲本(B73和Mo17)的DNA为模板，利用上述PCR扩增程序及引物对进行扩增并测序，对该位点进行验证，结果显示该SNP分子标记成功在32份玉米自交系进行分型(见图1)，并且，第一SNP位点基因型为A/A和第二SNP位点基因型为G/G的玉米自交系材料的穗行数高于第一SNP位点基因型为G/G和第二SNP位点基因型为A/A的玉米自交系材料(表2、表3)。

本发明利用全基因组关联分析和QTL定位相结合的策略，解释了该基因与玉米穗行数性状之间的内在联系，发觉其中显著地功能SNP位点，并作为遗传标记应用于分子育种，对加快玉米的高产育种进程具有重要意义。

本发明的有益效果在于：结合全基因组关联分析和QTL定位策略，快速精确地检测到与特定性状显著关联的SNP位点。玉米第4号染色体199959357bp位置的2个SNP位点(Maize B73RefGen_v3:Chr4:199959357,Maize B73RefGen_v3:Chr4:199959358)与玉米穗行数显著相关，该2个SNP位点可以作为遗传标记，用于分子育种，加速高产玉米育种进程，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为32份玉米自交系材料PCR扩增SNP位点的测序结果。其中方框标识出AG为穗行数高的玉米自交系材料的上述2个SNP位点基因型，而对应穗行数低的玉米自交系的位点基因型为GA。

具体实施方式

下面结合具体实验方案和附图对本发明的技术方案及其产生的技术效果做进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所做的任何交换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。所用试剂如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1.玉米基因GRMZM2G098557与穗行数性状显著相关的SNP分子标记的获得。

获得方法如下：

1)收集310份来自中国、美国、墨西哥等地的温带、热带、亚热带玉米自交系，构建了作图所用的关联群体。该群体有着丰富的遗传多样性。

2)田间试验设计。分别于2016年云南西双版纳州(四川农业大学玉米所实验基地)、四川雅安(四川农业大学玉米所实验基地)和四川洪雅三个环境种植进行。田间实验设计方案采用随机区组实验设计，各设计两个重复，每个家系材料进行两行区种植，行长4米，行距0.8米，单行16株，种植密度约为5万株每公顷，施肥、浇水、除草等田间管理措施均按照当地正常水平进行管理。生理成熟后收获，每个自交系材料收获后的果穗作为表型鉴定样本。

3)关联群体表型鉴定。待晒干后，每个自交系材料挑选长势一致的10个玉米果穗进行表型测定。联合方差分析表明，穗行数在环境、基因型、环境与基因型互作效应间均表现为极显著性差异(表1)。

表1穗行数联合方差分析

4)全基因组关联分析。结合步骤3中玉米穗行数的表型数据和高密度SNP分子标记，运用R语言中FarmCPU包来进行全基因组关联分析，等位基因频率阈值设为0.05，在P＜1/N(N为SNP标记数)水平上，判定SNP标记与性状关联的显著性。结果检测到1个SNP位点与玉米穗行数显著相关，位置为Chr4:199959357bp、等位基因为A/G，在供试自交系中有A/A和G/G两种纯合基因型，且在测序结果中发现位于Chr4:199959358bp位置的一个SNP与该SNP紧密连锁，等位基因为G/A，在供试自交系中有G/G和A/A两种纯合基因型，其侧翼序列如SEQID NO.1所示。

5)QTL定位验证。试验材料：以B73和Mo17为亲本构建的玉米IBMSyn10DH群体，包含了280个家系，从美国爱荷华州立大学引进。经过前期田间试验调查，选取该群体中适应性较好的250份和2个亲本作为试验材料。

6)田间试验设计：分别于2015年云南西双版纳州(四川农业大学玉米所实验基地)、四川崇州(四川农业大学玉米所实验基地)和河南新乡(河南省农科院实验基地)三个环境下种植。采用随机区组实验设计，各设计两个重复，每个家系材料进行两行区种植，行长4米，行距0.8米，单行16株，种植密度约为5万株每公顷，施肥、浇水、除草等田间管理措施均按照当地正常水平进行管理。

7)表型鉴定：玉米IBMSyn10DH群体中每个家系采取开放性授粉，生理成熟后收获，每个家系收获后的果穗作为表型鉴定样本。待晒干后，每个家系挑选长势一致的10个玉米果穗进行表型测定。

8)QTL分析：利用软件QTL Cartographer Version 1.17f，结合表型数据及6618个bin marker基因型数据，进行QTL定位，其中在第4染色体Chr4：185.8～209.5Mb区段检测到一个QTL，贡献率为5.52％。步骤4检测到的SNP分子标记落在该QTL区段内，进一步证明了上述SNP标记与玉米穗行数性状的重要性。

实施例2.本发明的SNP标记在玉米穗行数上的应用试验。

在连锁群体中挑选30份表型差异的家系材料和两亲本B73及Mo17(关联物体包含有B73和Mo17，且B73在两个SNP位点的基因型为A/A和G/G，Mo17的基因型为G/G和A/A)，以其基因组DNA为模板，利用SNP分子标记位点侧翼序列设计特异性引物，引物序列如SEQ IDNO.2、3所示，采用KOD FX Neo高保真聚合酶(东洋纺(上海)生物科技有限公司)进行PCR扩增，程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；59℃退火30s；68℃延伸6s；共35个循环；68℃再延伸10min。将特异性的目的条带用胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek)回收纯化，连接平末端克隆载体Peasy-Blunt Cloning Vector(北京全式金生物技术有限公司)测序。利用SnapGene2.3.2软件对测序结果进行比对(见图1)。结果显示该SNP位点成功于挑选的32份玉米待鉴定材料进行基因分型，其中16份穗行数高的玉米材料在两个SNP位点处的基因型全为A/A和G/G，另外16份穗行数低的玉米材料在该位点处的基因型全为G/G和A/A。并且，基因型A/A和基因型G/G的表型数据存在显著性差异(表2、表3)

表2待检测玉米材料的表型数据

表3t测验

本实验进一步证明了全基因组关联分析和QTL定位的准确性。因此，上述SNP为与玉米穗行数紧密连锁的位点。本发明进一步证实了该SNP位点能够作为有效的遗传标记应用于分子标记辅助选择，提高玉米的穗行数。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 玉米穗行数相关基因GRMZM2G098557的SNP分子标记及应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<220>

<221> SNP分子标记位点侧翼序列

<222> (51)..(51)

<223> n=a or g

<220>

<221> SNP分子标记位点侧翼序列

<222> (52)..(52)

<223> n=g or a

<400> 1

atgtcagatg ttaaatactg gtaccgaagg tggatgagct tgagcagagc nngcacatct 60

gatggagatg ttttagacgt aatcacagcc cggggggata 100

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgctgcggat caattctggt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacagaccca tacgcaagcc 20

Claims

1.一组玉米穗行数性状相关基因GRMZM2G098557的SNP分子标记，其特征是，包含：

第一SNP标记，所述第一SNP标记位于玉米基因组Chr4:199959357bp；

第二SNP标记，所述第二SNP标记位于玉米基因组Chr4:199959358bp；

所述第一、第二SNP标记，其等位基因为A和G。

2.如权利要求1所述的SNP分子标记，其特征是，所述等位基因的侧翼序列如SEQ IDNo.1所示。

3.如权利要求1或2所述的SNP分子标记，其特征是，所述SNP分子标记与玉米穗行数显著相关，第一SNP位点基因型为A/A的玉米自交系材料的穗行数高于位点基因型为G/G的玉米自交系；第二SNP位点基因型为G/G的玉米自交系材料的穗行数高于位点基因型为A/A的玉米自交系。

4.用于检测权利要求1-3任一项所述的一组SNP标记的引物对，其特征在于，所述引物对具有SEQ ID No.2-3所示的核苷酸序列。

5.用于检测权利要求1-3任一项所述的一组SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，包含：权利要求4所述的引物对。

6.权利要求1-3任一项所述的一组SNP分子标记、权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒在鉴定玉米穗行数性状相关基因GRMZM2G098557中的应用。

7.权利要求1-3任一项所述的一组SNP分子标记、权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒在筛选或鉴定玉米穗行数大小的种质资源中的应用。

8.权利要求1-3任一项所述的一组SNP分子标记、权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒在在玉米高产改良中的应用。

9.一种检测玉米穗行数大小的方法，其特征是，用权利要求4所述的引物对，PCR扩增待检测玉米材料基因组DNA，根据PCR扩增产物，确定所述待测玉米的所述一组SNP标记中每一种的基因型；以及基于所述待测玉米的所述一组SNP标记中每一种的基因型，预测所述待测玉米的穗行数大小。

10.如权利要求9所述的方法，其特征是，所述PCR程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；59℃退火30s；68℃延伸6s；共35个循环；68℃再延伸10min。