JP2021533824A - カリフラワーにおけるキサントモナス・カンペストリスｐｖ．カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（Ｘｃｃ）への抵抗性 - Google Patents
カリフラワーにおけるキサントモナス・カンペストリスｐｖ．カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（Ｘｃｃ）への抵抗性 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、カリフラワーにおけるキサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)への抵抗性に関する。本発明によれば、抵抗性は、白色カリフラワーのゲノム中の特定の遺伝子座に緑色カリフラワーから遺伝子移入されたDNA配列によって提供される。遺伝子移入された配列は、白色カリフラワーのゲノムにおいてホモ接合で又はヘテロ接合で存在し得、Xccへの抵抗性を付与する。本発明は、これらのカリフラワーの一部、種子、これらのカリフラワーの後代及びXccに抵抗性のカリフラワーを産生するための方法に更に関する。
Description
本発明は、カリフラワーにおけるキサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)への抵抗性に関する。本発明によれば、抵抗性は、白色カリフラワーのゲノム中の特定の遺伝子座に緑色カリフラワーから遺伝子移入されたDNA配列によって提供される。遺伝子移入された配列は、白色カリフラワーのゲノムにおいてホモ接合で又はヘテロ接合で存在し得、Xccへの抵抗性を付与する。本発明は、これらのカリフラワーの一部、種子、これらのカリフラワーの後代及びXccに抵抗性のカリフラワーを産生するための方法に更に関する。
キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)によって引き起こされる黒腐病(black rot)は、カリフラワー等のブラッシカ・オレラセア(Brassica oleracea)を冒す最も重要な種子伝染性細菌性の病害であり、カリフラワーの圃場生産の1年当たりおよそ15%の損失の原因である。Xccは、葉縁の排水組織を通じて、又は創傷組織を通じて葉に侵入し、維束管組織を通じて伝播し、導管を詰まらせ、V字形の萎黄病の損傷を生じる。これらの症状は、作物の品質及び収量の減少を生じる全身感染をもたらす。細菌は、雨によって、飛び散った水に、植物及び設備に分散され得、作物の残骸だけでなく種子においても長期間生存でき、それにより後代に重大な発生を生じる。結果として、種子処置、輪作又は農薬の使用等の農業慣行によってXccによる感染を予防することは困難である。
今日までに、同定されたXccの9個のレースにおいて、レース1及び4は、ブラッシカ・オレラセア作物、特にカリフラワーにおいて世界的に優勢である(Fargier and Manceau, 2007年, Plant Pathology, 56 (5):805〜818頁)。
カリフラワー(ブラッシカ・オレラセアL変種ボトリティス(Brassica oleracea L. var. botrytis))は、キャベツ、ブロッコリー、ケール及び芽キャベツ(Brussel sprout)等の多数の一般的な植物も含むアブラナ(Brassicaceae)科の植物である。カリフラワーは、野菜として食べられるその肥大化した多肉質の花芽分裂組織(floral meristem)(花蕾球(curd)とも名付けられている)のための作物として栽培される。白色カリフラワーの市場がこの種において最も重要である。特に花蕾球の白色は、重要な形質である。実際に、カリフラワー市場は、90%が白色カリフラワー、10%がロマネスコ、緑色、オレンジ色及びバイオレットカリフラワーである。更に、白色カリフラワーは、細菌Xccに最も感受性であり、病害は生産圃場において非常に高頻度である。Xcc病害に関する1年当たりの損失は、およそ15%である。
キサントモナス・カンペストリスに対するさまざまなレベルの抵抗性が、ブラッシカ・ラパ(Brassica rapa)、ブラッシカ・ニグラ(Brassica nigra)、ブラッシカ・カリナタ(Brassica carinata)、カラシナ(Brassica juncea)、セイヨウアブラナ(Brassica napus)及びブラッシカ・オレラセア等のアブラナ科において観察された。更に具体的には、B.オレラセアではXccへの抵抗性は、明らかにされていない供給源から生じるXccへの抵抗性に関与する6個の量的形質遺伝子座(QTL)の同定を述べているWO2010/089374に記載されている。しかし、カリフラワーにおける、更に具体的には白色カリフラワーにおける抵抗性の報告はない。
世界的な白色カリフラワー生産の重要性及び白色カリフラワーにおけるXcc病害に関する1年当たりの損失の観点から、したがって、Xccに抵抗性である白色カリフラワー植物を有することについて農業的及び経済的観点から大きな関心がある。したがって、白色カリフラワーに密接に連鎖している抵抗性の信頼できる供給源を同定することに当技術分野において重要な必要性がある。
したがって、本発明者らは、その組合せがXccへの抵抗性を付与するために必要である2つのQTLを第5及び第7染色体上に含有する、Xccへの抵抗性の供給源としての緑色カリフラワー植物を見出した。しかし、緑色カリフラワー植物由来の第5染色体上のQTLを白色カリフラワー植物に遺伝子移入することを試みた際に、緑色でない花蕾球を再生することの困難さに直面した。抵抗性を移行するための当初の単純な戻し交配育種プログラムから、本発明者らは、緑色でないカリフラワーを再生することの課題に直面した。本発明者らは、Xccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の第5染色体上の前記QTLが、花蕾球の緑色の原因である主要なQTLに連鎖していることを特定した。かかる連鎖を同定して、本発明者らは、緑色花蕾球を有さない、Xccに抵抗性のカリフラワー植物を産生するために、花蕾球の緑色の原因である主要なQTLを遺伝子移入することなくXccへの抵抗性を付与する第5及び第7染色体上のQTLを組み合わせることに初めて成功した。
Fargier and Manceau, 2007年, Plant Pathology, 56 (5):805〜818頁
the International Union for the Protection of new Variety of plants (UPOV)、日付2009年4月01日によって編集された文書TG/45/7の1頁
http://plants.ensembl.org/Brassica_oleracea/Info/Index/
http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/GCA_000695525.1, 2014年5月27日更新
International Union for the Protection of new Variety of plants (UPOV)、日付2009年4月01日によって編集されたTG/45/7文書(文書の13頁の特徴21)
the ISF (International Seed Federation) Vegetable and Ornamental Crops Section
Gao et al., Nature Biotechnology (2016), doi: 10.1038/nbt.3547
the Joint Research Center (JRC) Institute for Prospective Technological Studies of the European Commissionによって2011年に表題「New plant breeding techniques - State-of-the-art and prospects for commercial development」で作成されたレポート
"Plant Propagation by Tissue Culture, Handbook and Directory of Commercial Laboratories, eds. Edwin F George and Paul D Sherrington, Exegetics Ltd, 1984"
http://www.lgcgroup.com
https://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_topbot.pdf
本発明者らは、1つは第5染色体及び1つは第7染色体上の2つの顕性QTLの存在によって、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)への高レベルの抵抗性を示す緑色カリフラワーを同定した。本発明者らは、抵抗性を付与するQTLと花蕾球の緑色を付与するQTLとの間に6.1cMから4.3cMの間に含まれる遺伝的距離を有して、Xccへの抵抗性を付与する第5染色体上のQTLが、花蕾球の緑色、すなわち白色カリフラワーには不必要な形質を付与する主要なQTLと遺伝的に連鎖していることも同定した。本発明者らは、このリンケージドラッグ(linkage drag)を切断し、花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLを遺伝子移入することなく、白色カリフラワーバックグラウンドにキサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)への抵抗性を付与する第5及び第7染色体上の両方の顕性QTLを遺伝子移入することができ、それにより緑色花蕾球を有さないXccに抵抗性のカリフラワーを得ることができた。
したがって、第1の態様では、本発明は、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性であり、緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物であって、(i)キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)への抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含み、(ii)花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLをそのゲノム中に含まない、カリフラワー植物に関する。
一部の実施形態では、本発明によるカリフラワー植物は、緑色でない花蕾球、白色花蕾球、オレンジ色花蕾球又は紫色花蕾球を有する。好ましくは、本発明によるカリフラワー植物は、白色花蕾球を有する。
一部の実施形態では、緑色カリフラワー由来の前記遺伝子移入された配列は、第5染色体上に存在する1つの量的形質遺伝子座(QTL)及び第7染色体上に存在する1つのQTLである。
一部の実施形態では、第5染色体上に存在する前記QTLは、マーカーBN-0061002及びマーカーBO-0101641によって区切られている染色体領域内に位置付けられている。
一部の実施形態では、第7染色体上に存在する前記QTLは、マーカーBO-0002582及びマーカーBN-0010593によって区切られている染色体領域内に位置付けられている。
一部の実施形態では、前記遺伝子移入された配列は、NCIMB受託番号42693で寄託された種子の代表的な試料である株FLA1-116-02Sの植物、又はNCIMB受託番号43442で寄託された種子の代表的な試料である株RSF1-BC3-F3の植物のゲノムに存在する遺伝子移入された配列から選択される。
一部の実施形態では、Xccへの抵抗性を付与する前記遺伝子移入された配列は、NCIMB受託番号42693で寄託された種子の代表的な試料である植物FLA1-116-02Sのゲノムにおいて見出されている通り、又はNCIMB受託番号43442で寄託された種子の代表的な試料である植物RSF1-BC3-F3のゲノムにおいて見出されている通りである。
一部の実施形態では、前記遺伝子移入された配列は、Xccのすべてのレースへの抵抗性を付与する。好ましくは、前記遺伝子移入された配列は、Xccレース1及び/又は4への抵抗性を付与する。
一部の実施形態では、前記カリフラワー植物は、NCIMB受託番号42693で寄託された種子の代表的な試料である植物FLA1-116-02Sである、又は前記カリフラワー植物は、植物FLA1-116-02Sのすべての形態学的及び生理学的特徴を有する植物である。
一部の実施形態では、前記カリフラワー植物は、NCIMB受託番号43442で寄託された種子の代表的な試料である植物RSF1-BC3-F3である、又は前記カリフラワー植物は、植物RSF1-BC3-F3のすべての形態学的及び生理学的特徴を有する植物である。
本発明によるカリフラワー植物の単離された細胞も提供される。
本発明は、本発明によるカリフラワー植物から得られる植物部分も提供する。一部の実施形態では、前記植物部分は、種子、花蕾球(ヘッドとしても周知)、生殖物質、根、花、小房(floret)である。
同様に、成長した場合に本発明によるカリフラワー植物を生じる、カリフラワー植物の種子も提供される。
同様に、本発明によるカリフラワー植物によって産生される種子、すなわち本明細書以下に記載される通り、前記Xccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列を有し、花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLを有していない種子も提供される。
同様に、カリフラワー植物を本発明による抵抗性植物と交雑することによって得ることができる、Xccに抵抗性であり、緑色花蕾球を有さない、カリフラワー植物のハイブリッド植物も提供される。
同様に、本発明によるカリフラワー植物、植物部分、種子又はハイブリッド植物を含む容器も提供される。
更に、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性であり、緑色花蕾球を有さない、カリフラワー植物を産生するための方法であって、
(i)本発明によるカリフラワー植物又は、寄託された種子FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)を出芽させることによって得られるカリフラワーを別のカリフラワー植物と交雑する工程、
(ii)任意選択で、F2、F3又はさらなる自家受粉後代植物を得るために、生じたF1を1回又は複数回自家受粉する工程、
(iii)Xccに抵抗性を有し、緑色花蕾球を有していないカリフラワーを選択する工程、
(iv)任意選択で、自家受粉及び/又は交雑の1回又は複数回の追加的ラウンドを実施し、その後抵抗性を有し、緑色花蕾球を有していないカリフラワーを選択する工程
からなる工程を含む方法が提供される。
(i)本発明によるカリフラワー植物又は、寄託された種子FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)を出芽させることによって得られるカリフラワーを別のカリフラワー植物と交雑する工程、
(ii)任意選択で、F2、F3又はさらなる自家受粉後代植物を得るために、生じたF1を1回又は複数回自家受粉する工程、
(iii)Xccに抵抗性を有し、緑色花蕾球を有していないカリフラワーを選択する工程、
(iv)任意選択で、自家受粉及び/又は交雑の1回又は複数回の追加的ラウンドを実施し、その後抵抗性を有し、緑色花蕾球を有していないカリフラワーを選択する工程
からなる工程を含む方法が提供される。
本発明は、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性であり、緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物を検出及び/又は選択するための方法であって、
- マーカーBN-0061002及びマーカーBO-0101641によって区切られている染色体領域内に位置付けられている、第5染色体上のXccへの抵抗性を付与するQTL、
- マーカーBO-0002582及びマーカーBN-0010593によって区切られている染色体領域内に位置付けられている、第7染色体上のXccへの抵抗性を付与するQTL、並びに
- マーカーBO-0103554及びマーカーBO-0101638によって区切られている染色体領域内に位置付けられている第5染色体上の花蕾球の緑色を付与するQTL
の存在又は非存在を検出する工程を含み、
(i)第5染色体及び第7染色体上の、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLの存在、及び(ii)第5染色体上の、花蕾球の緑色を付与する前記QTLの非存在が、前記カリフラワー植物がキサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性であり、緑色花蕾球を有さないことを示す、方法も提供される。
- マーカーBN-0061002及びマーカーBO-0101641によって区切られている染色体領域内に位置付けられている、第5染色体上のXccへの抵抗性を付与するQTL、
- マーカーBO-0002582及びマーカーBN-0010593によって区切られている染色体領域内に位置付けられている、第7染色体上のXccへの抵抗性を付与するQTL、並びに
- マーカーBO-0103554及びマーカーBO-0101638によって区切られている染色体領域内に位置付けられている第5染色体上の花蕾球の緑色を付与するQTL
の存在又は非存在を検出する工程を含み、
(i)第5染色体及び第7染色体上の、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLの存在、及び(ii)第5染色体上の、花蕾球の緑色を付与する前記QTLの非存在が、前記カリフラワー植物がキサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性であり、緑色花蕾球を有さないことを示す、方法も提供される。
Xccに抵抗性であるカリフラワー植物を検出するための、
- 第5染色体上のマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及び/又はBO-0101641、並びに
- 第7染色体上のマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及び/又はBN-0010593
の使用が更に提供される。
- 第5染色体上のマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及び/又はBO-0101641、並びに
- 第7染色体上のマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及び/又はBN-0010593
の使用が更に提供される。
本発明は、かかる方法から得られたカリフラワー植物、特に、Xccへの抵抗性を付与するQTLが、第5染色体上のマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及び/又はBO-0101641並びに第7染色体上のマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及び/又はBN-0010593の使用によって検出された植物を更に提供する。
キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)が蔓延している環境においてカリフラワー植物の収量を改善するための方法であって、Xccに抵抗性で緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物を成長させる工程を含み、前記植物が、(i)キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)への抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含み、(ii)花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLをそのゲノム中に含まない、方法が更に提供される。
キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)が蔓延している環境においてカリフラワー植物の収量を改善するための方法であって、
a)(i)キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)への抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含み、(ii)花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLをそのゲノム中に含まない、Xccに抵抗性のカリフラワー植物を同定する工程、及び
b)前記蔓延している環境において前記抵抗性カリフラワー植物を成長させる工程
を含む、方法も提供される。
a)(i)キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)への抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含み、(ii)花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLをそのゲノム中に含まない、Xccに抵抗性のカリフラワー植物を同定する工程、及び
b)前記蔓延している環境において前記抵抗性カリフラワー植物を成長させる工程
を含む、方法も提供される。
(i)キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)への抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含み、(ii)花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLをそのゲノム中に含まない、Xccに抵抗性のカリフラワー植物を成長させる工程を含む、Xccの蔓延及び/又は伝播から圃場を保護するための方法も提供される。
(i)キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)への抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含み、(ii)花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLをそのゲノム中に含まない、Xccに抵抗性のカリフラワー植物を成長させる工程を含む、Xccが蔓延している環境において、収穫可能な又は生存可能なカリフラワー植物の数を増加させるための方法が更に提供される。
(i)キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)への抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含み、(ii)花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLをそのゲノム中に含まない、圃場におけるXccによる蔓延を管理するための、Xccに抵抗性のカリフラワー植物の使用。
(i)キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性のカリフラワーマイクロ小植物体を産生するために、本発明によるカリフラワー植物の単離された細胞又は組織をin vitroで培養する工程、及び
(ii)任意選択で、Xccに抵抗性のカリフラワー植物を発達させるためにカリフラワーマイクロ小植物体をin vivo培養フェーズに更に供する工程
を含む、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性のカリフラワー小植物体又は植物の産生のための方法が更に提供される。
(ii)任意選択で、Xccに抵抗性のカリフラワー植物を発達させるためにカリフラワーマイクロ小植物体をin vivo培養フェーズに更に供する工程
を含む、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性のカリフラワー小植物体又は植物の産生のための方法が更に提供される。
定義
本明細書において使用される場合、用語「カリフラワー」は、the International Union for the Protection of new Variety of plants (UPOV)、日付2009年4月01日によって編集された文書TG/45/7の1頁に定義される種ブラッシカ・オレラセアL.コンバー・ボトリティス(L.)アレフ変種ボトリティスL(Brassica oleracea L. convar botrytis (L.) Alef. var. botrytis L.)の植物を指す。
本明細書において使用される場合、用語「カリフラワー」は、the International Union for the Protection of new Variety of plants (UPOV)、日付2009年4月01日によって編集された文書TG/45/7の1頁に定義される種ブラッシカ・オレラセアL.コンバー・ボトリティス(L.)アレフ変種ボトリティスL(Brassica oleracea L. convar botrytis (L.) Alef. var. botrytis L.)の植物を指す。
本明細書において使用される場合、カリフラワーの染色体を参照することは、ブラッシカ・オレラセア・変種・オレラセア株TO1000ゲノムから行われる(http://plants.ensembl.org/Brassica_oleracea/Info/Index/又はhttp://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/GCA_000695525.1, 2014年5月27日更新)。
本明細書において使用される場合、用語「量的形質遺伝子座(QTL)」は、1つ又は複数の遺伝子又は制御配列を含み得るゲノム領域を指す。QTLは、その産生物が遺伝的抵抗性を付与する1つ又は複数の遺伝子を例えば含み得る。代替的にQTLは、その産生物が植物のゲノム中の他の遺伝子座上の遺伝子の発現に影響を与え、それにより抵抗性を付与する制御遺伝子又は配列を例えば含み得る。本発明のQTLは、1つ又は複数の分子ゲノムマーカーを使用して、それぞれの病原体抵抗性系統(pathogen-resistant accession)のゲノムでの遺伝的位置を示すことによって定義され得る。次に、1つ又は複数のマーカーは、特定の遺伝子座を示す。遺伝子座間の距離は、同じ染色体上の遺伝子座間の頻度又は乗換えによって通常測定される。2つが離れているほどそれらの間で乗換えが生じやすい。反対に2つの遺伝子座が互いに近い場合、それらの間で乗換えは生じにくい。概して、1センチモルガン(cM)は、遺伝子座(マーカー)間の1%の組換えに等しい。QTLが複数のマーカーによって示され得る場合、エンドポイントマーカー間の遺伝的距離は、QTLのサイズの指標である。
「所与の遺伝子座の緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列若しくは区間」又は「所与の遺伝子座に存在する/見出される緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列若しくは区間」によって、この所与の遺伝子座で見出されるゲノム区間が、緑色カリフラワードナーにおいて、すなわち遺伝子移入パートナーにおいて同じ遺伝子座で見出される対応する区間と同じ配列、及び株FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)のカリフラワー植物において同じ遺伝子座で見出される対応するゲノム区間と同じ配列を有することが理解される。
「同じ配列」を有することは、比較される2つの配列が、後代へのゲノム区間の伝播の際に生じ得る潜在的点変異を除いて同一、すなわち、長さ1キロベースについて好ましくは少なくとも99%同一であることを意味する。検査下のゲノム区間がXccへの抵抗性も付与できる場合に、検査下のゲノム区間は、緑色カリフラワードナーにおいて同じ遺伝子座で見出される対応するゲノム区間と本発明の意味で同じ配列を有する、と推定され得る。
本明細書において使用される場合、用語「分子マーカー」又は「マーカー」は、核酸配列の特徴における差異を可視化するための方法において使用される指標を指す。かかる指標の例は、制限断片長多型(RFLP)マーカー、増幅断片長多型(AFLP)マーカー、一塩基多型(SNP)、挿入変異、マイクロサテライトマーカー(SSR)、配列特徴付け増幅領域(sequence-characterized amplified regions)(SCAR)、切断増幅多型配列(cleaved amplified polymorphic sequence)(CAPS)マーカー若しくはアイソザイムマーカー又は特定の遺伝的及び染色体上の位置を規定する本明細書に記載されるマーカーの組合せである。対立遺伝子の近傍の分子マーカーのマッピングは、一般的分子技術を使用して当業者により極めて簡単に実施され得る手順である。
この点において、実際に、前記マーカーの隣接配列がゲノム上にそれらを明確に位置付けるように規定される限り、染色体における特定の位置がSNP等のマーカーに関連して決定され得ることは注目される。本発明者らは、それらの隣接配列によって同定され、カリフラワーゲノム中に存在するSNPマーカーを、遺伝子移入された配列と内在的に存在する配列とを識別するため、並びにXcc抵抗性及び/又は花蕾球の緑色を付与する遺伝子移入された配列をカリフラワーゲノム中で見つけるために使用した。
本明細書において使用される場合、2つのマーカー(例えば、SNP)X及びYによって区切られる「染色体領域」又は「染色体区間」は、これら2つのマーカーの位置の間に位置しており、前記マーカーを含む染色体のセクションを指し、それによりこの染色体領域又は区間のヌクレオチド配列は、マーカーXに対応するヌクレオチドで始まり、マーカーYに対応するヌクレオチドで終わる、すなわちマーカーは、本発明の意味でそれらが区切る領域内又は区間に含まれる。
本明細書において使用される場合、用語「プライマー」は、DNAポリメラーゼが付着できるように増幅標的にアニーリングでき、それによりプライマー伸長産生物の合成が誘導される条件下に置かれた場合に、すなわちヌクレオチド及びDNAポリメラーゼ等の重合のための薬剤の存在下、好適な温度及びpHで、DNA合成の開始点として役立つオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅での最大効率のために好ましくは1本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための薬剤の存在下で伸長産生物の合成を準備するために十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度並びにプライマーの組成(A/T及びG/C含有量)を含む多数の要因に依存する。プライマーの対は、PCR増幅において等のDNA増幅の技術において一般に使用される通り、1つのフォワード及び1つのリバースプライマーからなる。
本明細書において使用される場合、用語「緑色花蕾球」は、the International Union for the Protection of new Variety of plants (UPOV)、日付2009年4月01日によって編集されたTG/45/7文書(文書の13頁の特徴21)の特徴の表に挙げられている見本変種(example variety)Alverda及びMinaretの緑色と同様の色を収穫熟度で有する花蕾球を指す。緑色カリフラワー変種の他の例は、Vitaverde、Susana及びFangioである。
本明細書において使用される場合、用語「緑色カリフラワー」は、本明細書上に定義される緑色花蕾球を有するカリフラワーを指す。
本明細書において使用される場合、用語「白色花蕾球」は、the International Union for the Protection of new Variety of plants (UPOV)、日付2009年4月01日によって編集されたTG/45/7文書(文書の13頁の特徴21)の特徴の表に挙げられている見本変種Astell及びIcebergの白色と同様の色を収穫熟度で有する花蕾球を指す。カリフラワー花蕾球の「白」色は、C2(白色)からC10(黄色)の範囲として白色を定義するCTIFLスケールを使用しても定義され得る。白色カリフラワー変種の他の例は、Aerospace、Aviron及びFreebellである。
本明細書において使用される場合、用語「白色カリフラワー」は、本明細書上に定義される白色花蕾球を有するカリフラワーを指す。
本明細書において使用される場合、表現「緑色花蕾球を有さない」又は「緑色花蕾球を有していない」又は「非緑色花蕾球」は、本明細書上に定義される緑色花蕾球ではない花蕾球を指す。非限定的例として、表現「緑色花蕾球を有さない」又は「緑色花蕾球を有していない」又は「非緑色花蕾球」は、白色、オレンジ色、紫色又は、本明細書上に定義される「緑色花蕾球」色と本明細書上に定義される「白色花蕾球」色との間の中間の色を収穫時に有する花蕾球を指す。
花蕾球の緑色が、本発明によるXccへの抵抗性を付与する第5染色体上のQTLに密接に連鎖している第5染色体上の1つの主要なQTL、並びに第1、第2、第4、第5、第6及び第8染色体上の9個の他のマイナーなQTLによって支配されていることが本発明者らによって同定された。更に正確には、3個のマイナーなQTLは第1染色体上に同定され、2個のマイナーなQTLは第2染色体上に同定され、1個のマイナーなQTLは第4染色体上に同定され、1個のマイナーなQTLは第5染色体上に同定され、1個のマイナーなQTLは第6染色体上に同定され、1個のマイナーなQTLは第8染色体上に同定された。本発明の目的のために、本発明によるXccへの抵抗性を付与する第5染色体上のQTLに密接に連鎖している第5染色体上の前記主要なQTLは、MAC5と名付けられ;第1染色体上の前記3個のマイナーなQTLはMiC1-1、MiC1-2及びMiC1-3と名付けられ;第2染色体上の前記2個のマイナーなQTLはMiC2-1、MiC2-2と名付けられ;第4染色体上の前記マイナーなQTLはMiC4と名付けられ、第5染色体上の前記マイナーなQTLはMiC5と名付けられ、第6染色体上の前記マイナーなQTLはMiC6と名付けられ、第8染色体上の前記マイナーなQTLはMiC8と名付けられる。
一部の実施形態では、前記QTL MAC5は、マーカーBO-0103554及びマーカーBO-0101638によって区切られている染色体領域内(又は、別の言い方では第5染色体上の33 420 357及び35 168 917位のヌクレオチドによって区切られている染色体領域内)に位置付けられている。一部の実施形態では、前記MAC5 QTLは、次のマーカー:BO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638のいずれか1つを増幅することによって同定され得る。別の言い方では、前記MAC5は、(i)次のヌクレオチド位置:33 420 357、33 493 322及び35 168 917のいずれか1つを包含する第5染色体上の領域、或いは(ii)配列番号28、配列番号29若しくは配列番号30の配列を含む第5染色体上の配列、或いは配列番号28の29位又は、配列番号29若しくは配列番号30(それぞれ)の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る;好ましくは29位のヌクレオチドを含む配列番号28の配列の前記断片又は61位のヌクレオチドを含む配列番号29若しくは配列番号30の前記断片は、配列番号28、配列番号29又は配列番号30(それぞれ)の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、前記QTL MiC1-1は、マーカーBN-0000623を包含する染色体領域内(又は、別の言い方では、5 724 437位のヌクレオチドを包含する第1染色体上の領域、又は配列番号16の61位のヌクレオチドを包含する第1染色体上の領域)に位置付けられている。一部の実施形態では、前記QTL MiC1-1は、マーカーBN-0000623から20cM未満、好ましくは10cM未満、好ましくは5cM未満、好ましくは1cM未満に位置付けられている。一部の実施形態では、前記QTL MiC1-1は、前記マーカーBN-0000623を増幅することによって同定され得る。別の言い方では、前記MiC1-1 QTLは、(i)5 724 437位のヌクレオチドを包含する第1染色体上の領域、又は(ii)配列番号16の配列を含む第1染色体上の配列若しくは配列番号16の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る;好ましくは、配列番号16の61位のヌクレオチドを含む配列番号16の配列の前記断片は、配列番号16の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、前記QTL MiC1-2は、マーカーBN-0003844及びマーカーBN-0004384によって区切られている染色体領域内(又は、別の言い方では第1染色体上の11 651 984及び13 217 962位のヌクレオチドによって区切られている染色体領域内)に位置付けられている。一部の実施形態では、前記QTL MiC1-2は、マーカーBN-0002453(すなわち、12 001 782位のヌクレオチドを包含する第1染色体上の領域、又は配列番号18の61位のヌクレオチドを包含する第1染色体上の領域)を包含する。一部の実施形態では、前記MiC1-2 QTLは、次のマーカー:BN-0003844、BN-0002453及びBN-0004384のいずれか1つを増幅することによって同定され得る。別の言い方では、前記MiC1-2 QTLは、(i)次のヌクレオチド位置: 11 651 984、12 001 782及び13 217 962のいずれか1つを包含する第1染色体上の領域、或いは(ii)配列番号17、配列番号18若しくは配列番号19の配列を含む第1染色体上の配列又は配列番号17;配列番号18若しくは配列番号19(それぞれ)の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る;好ましくは61位のヌクレオチドを含む配列番号17;配列番号18又は配列番号19の配列の前記断片は、配列番号17、配列番号18又は配列番号19(それぞれ)の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、前記QTL MiC1-3は、マーカーBN-0004278を包含する染色体領域内(又は、別の言い方では、29 102 012位のヌクレオチドを包含する第1染色体上の領域、又は配列番号20の61位のヌクレオチドを包含する第1染色体上の領域)に位置付けられている。一部の実施形態では、前記QTL MiC1-3は、マーカーBN-0004278から20cM未満、好ましくは10cM未満、好ましくは5cM未満、好ましくは1cM未満に位置付けられている。一部の実施形態では、前記QTL MiC1-3は、前記マーカーBN-0004278を増幅することによって同定され得る。別の言い方では、前記MiC1-3 QTLは、(i)29 102 012位のヌクレオチドを包含する第1染色体上の領域、又は(ii)配列番号20の配列を含む第1染色体上の配列若しくは配列番号20の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る;好ましくは、配列番号20の61位のヌクレオチドを含む配列番号20の配列の前記断片は、配列番号20の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、前記QTL MiC2-1は、マーカーBN-0010638及びマーカーBN-0010246によって区切られている染色体領域内(又は、別の言い方では第2染色体上の13 465 264及び13 465 901位のヌクレオチドによって区切られている染色体領域内)に位置付けられている。一部の実施形態では、前記MiC2-1 QTLは、次のマーカー:BN-0010638及びBN-0010246のいずれか1つを増幅することによって同定され得る。別の言い方では、前記MiC2-1 QTLは、(i)次のヌクレオチド位置:13 465 264及び13 465 901のいずれか1つを包含する第2染色体上の領域、或いは(ii)配列番号21若しくは配列番号22の配列を含む第2染色体上の配列又は配列番号21若しくは配列番号22(それぞれ)の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る;好ましくは61位のヌクレオチドを含む配列番号21又は配列番号22の配列の前記断片は、配列番号21又は配列番号22(それぞれ)の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、前記QTL MiC2-2は、マーカーBN-0009825を包含する染色体領域内(又は、別の言い方では、52 310 605位のヌクレオチドを包含する第2染色体上の領域、又は配列番号23の61位のヌクレオチドを包含する第2染色体上の領域)に位置付けられている。一部の実施形態では、前記QTL MiC2-2は、マーカーBN-0009825から20cM未満、好ましくは10cM未満、好ましくは5cM未満、好ましくは1cM未満に位置付けられている。一部の実施形態では、前記QTL MiC2-2は、前記マーカーBN-0009825を増幅することによって同定され得る。別の言い方では、前記MiC2-2 QTLは、(i)52 310 605位のヌクレオチドを包含する第2染色体上の領域、又は(ii)配列番号23の配列を含む第2染色体上の配列若しくは配列番号23の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る;好ましくは、配列番号23の61位のヌクレオチドを含む配列番号23の配列の前記断片は、配列番号23の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、前記QTL MiC4は、マーカーBN-0001304及びマーカーBN-0001306によって区切られている染色体領域内(又は、別の言い方では第4染色体上の13 807 283及び13 807 343位のヌクレオチドによって区切られている染色体領域内)に位置付けられている。一部の実施形態では、前記QTL MiC4は、マーカーBN-0001304及びマーカーBN-0001306のいずれか1つを増幅することによって同定され得る。別の言い方では、前記MiC4 QTLは、(i)次のヌクレオチド位置:13 807 283及び13 807 343のいずれか1つを包含する第4染色体上の領域、或いは(ii)配列番号24若しくは配列番号25の配列を含む第4染色体上の配列又は配列番号24若しくは配列番号25(それぞれ)の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る;好ましくは61位のヌクレオチドを含む配列番号24又は配列番号25の配列の前記断片は、配列番号24又は配列番号25(それぞれ)の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、前記QTL MiC5は、マーカーBN-0002268及びマーカーBN-0003875によって区切られている染色体領域内(又は、別の言い方では第5染色体上の6 124 994及び8 620 858位のヌクレオチドによって区切られている染色体領域内)に位置付けられている。一部の実施形態では、前記QTL MiC5は、マーカーBN-0002268及びマーカーBN-0003875のいずれか1つを増幅することによって同定され得る。別の言い方では、前記MiC5 QTLは、(i)次のヌクレオチド位置:6 124 994及び8 620 858のいずれか1つを包含する第5染色体上の領域、或いは(ii)配列番号26若しくは配列番号27の配列を含む第5染色体上の配列又は配列番号26若しくは配列番号27(それぞれ)の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る;好ましくは61位のヌクレオチドを含む配列番号26又は配列番号27の配列の前記断片は、配列番号26又は配列番号27(それぞれ)の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、前記QTL MiC6は、マーカーBN-0003896を包含する染色体領域内(又は、別の言い方では、25 481 494位のヌクレオチドを包含する第6染色体上の領域、又は配列番号31の61位のヌクレオチドを包含する第6染色体上の領域)に位置付けられている。一部の実施形態では、前記QTL MiC6は、マーカーBN-0003896から20cM未満、好ましくは10cM未満、好ましくは5cM未満、好ましくは1cM未満に位置付けられている。一部の実施形態では、前記QTL MiC6は、前記マーカーBN-0003896を増幅することによって同定され得る。別の言い方では、前記MiC6 QTLは、(i)25 481 494位のヌクレオチドを包含する第6染色体上の領域、又は(ii)配列番号31の配列を含む第6染色体上の配列若しくは配列番号31の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る;好ましくは、配列番号31の61位のヌクレオチドを含む配列番号31の配列の前記断片は、配列番号31の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、前記QTL MiC8は、マーカーBN-0002182及びマーカーBO-0003450によって区切られている染色体領域内(又は、別の言い方では第8染色体上の6 925 733及び7 236 995位のヌクレオチドによって区切られている染色体領域内)に位置付けられている。一部の実施形態では、前記QTL MiC8は、マーカーBN-0002182及びマーカーBO-0003450のいずれか1つを増幅することによって同定され得る。別の言い方では、前記MiC8 QTLは、(i)次のヌクレオチド位置:6 925 733及び7 236 995のいずれか1つを包含する第8染色体上の領域、或いは(ii)配列番号32若しくは配列番号33の配列を含む第8染色体上の配列又は配列番号32若しくは配列番号33(それぞれ)の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る;好ましくは61位のヌクレオチドを含む配列番号32若しくは配列番号33の配列の前記断片は、配列番号32若しくは配列番号33(それぞれ)の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
本明細書上に記載されるマーカーによって増幅される花蕾球の緑色を付与する対立遺伝子は、Table 1(表1)に記載される通りである。
本発明者らは、すべてのこれらのQTLの非存在が上に定義される白色花蕾球を得られるようにすることを発見した。更に本発明者らは、主要なQTL MAC5の非存在が、非緑色花蕾球を得るために必要かつ十分であることを明らかにした。
それにより、したがって一部の実施形態では、用語「緑色カリフラワー」は、ホモ接合状態又はヘテロ接合状態でQTL MAC5についての緑色対立遺伝子を少なくとも有するカリフラワー、すなわち、ホモ接合又はヘテロ接合状態で次の対立遺伝子:第5染色体上のマーカーBO-0103554についての対立遺伝子C、第5染色体上のマーカーBN-0004457についての対立遺伝子T及び第5染色体上のマーカーBO-0101638についての対立遺伝子Aを少なくとも有するカリフラワーも指す。
一部の実施形態では、緑色花蕾球を有するカリフラワーは、ホモ接合又はヘテロ接合状態でQTL MAC5についての緑色対立遺伝子を、ホモ接合又はヘテロ接合状態でMiC1-1、MiC1-2、MiC1-3、MiC2-1、MiC2-2、MiC4、MiC5、MiC6及びMiC8のいずれか1つについての緑色対立遺伝子との組合せで有するカリフラワーも指し得る。好ましくは、緑色花蕾球を有するカリフラワーは、ホモ接合又はヘテロ接合状態でQTL MAC5についての緑色対立遺伝子を、ホモ接合又はヘテロ接合状態でMiC1-1、MiC1-2、MiC1-3、MiC2-1、MiC2-2、MiC4、MiC5、MiC6及びMiC8のすべてについての緑色対立遺伝子との組合せで有するカリフラワー、すなわち、ホモ接合又はヘテロ接合状態で対立遺伝子の次の組合せ:第1染色体上のBN-0000623の対立遺伝子C、第1染色体上のBN-0003844の対立遺伝子T、第1染色体上のBN-0002453の対立遺伝子G、第1染色体上のBN-0004384の対立遺伝子A、第1染色体上のBN-0004278の対立遺伝子C、第2染色体上のBN-0010638の対立遺伝子A、第2染色体上のBN-0010246の対立遺伝子G、第2染色体上のBN-0009825の対立遺伝子G、第4染色体上のBN-0001304の対立遺伝子C、第4染色体上のBN-0001306の対立遺伝子C、第5染色体上のBN-0002268の対立遺伝子G、第5染色体上のBN-0003875の対立遺伝子T、第5染色体上のBO-0103554の対立遺伝子C、第5染色体上のBN-0004457の対立遺伝子T、第5染色体上のBO-0101638の対立遺伝子A、第6染色体上のBN-0003896の対立遺伝子G、第8染色体上のBN-0002182の対立遺伝子A及び第8染色体上のBO-0003450の対立遺伝子Tを有するカリフラワーも指し得る。
一部の実施形態では、用語「白色カリフラワー」は、ホモ接合状態で次の対立遺伝子:第1染色体上のBN-0000623の対立遺伝子T、第1染色体上のBN-0003844の対立遺伝子A、第1染色体上のBN-0002453の対立遺伝子C、第1染色体上のBN-0004384の対立遺伝子G、第1染色体上のBN-0004278の対立遺伝子T、第2染色体上のBN-0010638の対立遺伝子G、第2染色体上のBN-0010246の対立遺伝子A、第2染色体上のBN-0009825の対立遺伝子T、第4染色体上のBN-0001304の対立遺伝子T、第4染色体上のBN-0001306の対立遺伝子T、第5染色体上のBN-0002268の対立遺伝子T、第5染色体上のBN-0003875の対立遺伝子G、第5染色体上のBO-0103554の対立遺伝子G、第5染色体上のBN-0004457の対立遺伝子G、第5染色体上のBO-0101638の対立遺伝子G、第6染色体上のBN-0003896の対立遺伝子A、第8染色体上のBN-0002182の対立遺伝子C及び第8染色体上のBO-0003450の対立遺伝子Cを有するカリフラワーも指す。
一部の実施形態では、緑色花蕾球を有さないカリフラワーは、花蕾球の緑色を付与するQTL MAC5をそのゲノム中に含まないカリフラワーも指し得る。一部の実施形態では、緑色花蕾球を有さないカリフラワーは、ホモ接合状態でQTL MAC5についての白色対立遺伝子を少なくとも有するカリフラワー、すなわち、ホモ接合状態で次の対立遺伝子:第5染色体上のBO-0103554の対立遺伝子G、第5染色体上のBN-0004457の対立遺伝子G及び第5染色体上のBO-0101638の対立遺伝子Gを少なくとも有するカリフラワーも指し得る。一部の実施形態では、緑色花蕾球を有さないカリフラワーは、ホモ接合状態でQTL MAC5についての白色対立遺伝子をホモ接合状態でQTL MiC1-1、MiC1-2、MiC1-3、MiC2-1、MiC2-2、MiC4、MiC5、MiC6及びMiC8のいずれか1つについての白色対立遺伝子との組合せで有するカリフラワーも指し得る。
好ましくは、緑色花蕾球を有さないカリフラワーは、寄託された物質FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)に対応する植物のゲノムに存在するものと同じ対立遺伝子、すなわち:
- ホモ接合状態で次の対立遺伝子:第1染色体上のBN-0000623の対立遺伝子C、第1染色体上のBN-0003844の対立遺伝子T、第1染色体上のBN-0002453の対立遺伝子G、第1染色体上のBN-0004384の対立遺伝子A、第1染色体上のBN-0004278の対立遺伝子C、第2染色体上のBN-0010246の対立遺伝子G、第5染色体上のBN-0003875の対立遺伝子G、第5染色体上のBO-0103554の対立遺伝子G、第5染色体上のBN-0004457の対立遺伝子G、第5染色体上のBO-0101638の対立遺伝子G、第6染色体上のBN-0003896の対立遺伝子G、第8染色体上のBN-0002182の対立遺伝子A及び第8染色体上のBO-0003450の対立遺伝子T、並びに
- ホモ接合状態又はヘテロ接合状態で次の対立遺伝子:第2染色体上のBN-0010638の対立遺伝子G又はA、第4染色体上のBN-0001304の対立遺伝子T又はC、第4染色体上のBN-0001306の対立遺伝子T又はC及び第5染色体上のBN-0002268の対立遺伝子T又はG
をそのゲノム中に有するカリフラワーを指す。
- ホモ接合状態で次の対立遺伝子:第1染色体上のBN-0000623の対立遺伝子C、第1染色体上のBN-0003844の対立遺伝子T、第1染色体上のBN-0002453の対立遺伝子G、第1染色体上のBN-0004384の対立遺伝子A、第1染色体上のBN-0004278の対立遺伝子C、第2染色体上のBN-0010246の対立遺伝子G、第5染色体上のBN-0003875の対立遺伝子G、第5染色体上のBO-0103554の対立遺伝子G、第5染色体上のBN-0004457の対立遺伝子G、第5染色体上のBO-0101638の対立遺伝子G、第6染色体上のBN-0003896の対立遺伝子G、第8染色体上のBN-0002182の対立遺伝子A及び第8染色体上のBO-0003450の対立遺伝子T、並びに
- ホモ接合状態又はヘテロ接合状態で次の対立遺伝子:第2染色体上のBN-0010638の対立遺伝子G又はA、第4染色体上のBN-0001304の対立遺伝子T又はC、第4染色体上のBN-0001306の対立遺伝子T又はC及び第5染色体上のBN-0002268の対立遺伝子T又はG
をそのゲノム中に有するカリフラワーを指す。
一部の実施形態では、マーカー:
- 第1染色体上のBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384及びBN-0004278、
- 第2染色体上のBN-0010638、BN-0010246及びBN-0009825
- 第4染色体上のBN-0001304及びBN-0001306
- 第5染色体上のBN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638
- 第6染色体上のBN-0003896、並びに
- 第8染色体上のBN-0002182及びBO-0003450
の増幅は、前記マーカーの緑/白色対立遺伝子を増幅するために使用され得るプライマーを使用してPCRによって実施される。
- 第1染色体上のBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384及びBN-0004278、
- 第2染色体上のBN-0010638、BN-0010246及びBN-0009825
- 第4染色体上のBN-0001304及びBN-0001306
- 第5染色体上のBN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638
- 第6染色体上のBN-0003896、並びに
- 第8染色体上のBN-0002182及びBO-0003450
の増幅は、前記マーカーの緑/白色対立遺伝子を増幅するために使用され得るプライマーを使用してPCRによって実施される。
特に、マーカー:
- 第1染色体上のBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384及びBN-0004278
- 第2染色体上のBN-0010638、BN-0010246及びBN-0009825
- 第4染色体上のBN-0001304及びBN-0001306
- 第5染色体上のBN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638
- 第6染色体上のBN-0003896並びに
- 第8染色体上のBN-0002182及びBO-0003450
の緑色又は白色対立遺伝子を増幅するためのプローブは、Table 2(表2)に記載される配列を有し得る。
- 第1染色体上のBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384及びBN-0004278
- 第2染色体上のBN-0010638、BN-0010246及びBN-0009825
- 第4染色体上のBN-0001304及びBN-0001306
- 第5染色体上のBN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638
- 第6染色体上のBN-0003896並びに
- 第8染色体上のBN-0002182及びBO-0003450
の緑色又は白色対立遺伝子を増幅するためのプローブは、Table 2(表2)に記載される配列を有し得る。
本明細書において使用される場合、用語≪オレンジ色花蕾球≫は、the International Union for the Protection of new Variety of plants (UPOV)、日付2009年4月01日によって編集されたTG/45/7文書(文書の13頁の特徴21)の特徴の表に挙げられている見本変種Sunsetの白色と同様の色を収穫熟度で有する花蕾球を指す。
本明細書において使用される場合、用語≪紫色花蕾球≫は、the International Union for the Protection of new Variety of plants (UPOV)、日付2009年4月01日によって編集されたTG/45/7文書(文書の13頁の特徴21)の特徴の表に挙げられている見本変種Graffitiの白色と同様の色を収穫熟度で有する花蕾球を指す。
用語「抵抗性」は、有害生物又は病原体への植物の反応、及び野菜種子産業に対する非生物的ストレスを記載しているthe ISF (International Seed Federation) Vegetable and Ornamental Crops Sectionによって定義される通りである。
具体的には、抵抗性は、特定の有害生物若しくは病原体の成長及び発達並びに/又はそれらが引き起こす損傷を、同様の環境条件及び有害生物又は病原体圧の下での感受性の植物変種と比較して、制限する植物変種の能力を意味する。抵抗性変種は、重度の有害生物又は病原体圧の下ではいくらかの病害の症状又は損傷を示し得る。抵抗性の2つのレベルが定義されている:高/標準的抵抗性(HR)及び中程度/中間の抵抗性(IR)。高/標準的抵抗性(HR)は、通常の有害生物又は病原体圧の下で感受性変種と比較した場合の、特定の有害生物又は病原体の成長及び発達を高度に制限する植物変種の能力と定義される。しかし、これらの植物変種は、重度の有害生物又は病原体圧の下ではいくらかの症状又は損傷を示し得る。中程度/中間の抵抗性(IR)は、特定の有害生物又は病原体の成長及び発達を制限するが、高/標準的抵抗性変種と比較して広範な症状又は損傷を示す植物変種の能力と定義される。中程度/中間の抵抗性の植物変種は、同様の環境条件及び/又は有害生物若しくは病原体圧の下で成長した場合に感受性の植物変種よりも低い重症度の症状又は損傷を示す。本発明の枠組みにおいて、植物は、植物が圃場検査において9又は8にスコア化(実施例1.2に記載される通り)される場合に、Xccに高度に抵抗性(HR)と見なされ、植物が圃場検査において7にスコア化(実施例1.2に記載される通り)された場合に、Xccに中間の抵抗性と見なされる。
本明細書において使用される場合、用語「感受性」は、特定の有害生物又は病原体の成長及び発達を、制限できない植物を指す。本発明の枠組みにおいて、植物は、植物が圃場検査において5、3又は1にスコア化(実施例1.2に記載される通り)される場合に、Xccに感受性と見なされる。
本明細書において使用される場合、用語「子孫」又は「後代」は、1つ又は複数の親植物又はその子孫(descendant)から植物の又は有性の生殖由来の後代として生じた任意の植物を指す。例えば、子孫植物は、親植物のクローニング若しくは自家受粉によって、又は2つの親植物の交雑によって得ることができ、自家受粉及びF1若しくはF2又はそのさらなる世代を含む。F1は、その少なくとも1つが形質のドナーとして最初に使用される親から産生される第1世代の子孫であり、一方、第2世代(F2)又は続く世代(F3、F4等)の子孫は、F1'、F2等の自家受粉から産生される標本である。したがってF1は、2つの真の育種親(真の育種は、形質についてホモ接合である)間の交雑から生じるハイブリッド(通常)であり得、一方、F2は、前記F1ハイブリッドの自家受粉から生じる子孫で(通常は)あり得る。
本明細書において使用される場合、用語「交雑する」、「交雑」は、1つの植物上の1つの花の花粉が別の植物上の花の胚珠(柱頭)に(人工的に又は天然で)付くプロセスを指す。
本明細書において使用される場合、用語「ヘテロ接合体」は、少なくとも1つの遺伝子座に存在する異なる対立遺伝子(所与の遺伝子又は配列の形態)を有する二倍体又は倍数性の細胞又は植物を指す。
本明細書において使用される場合、用語「ヘテロ接合」は、特定の遺伝子座での異なる対立遺伝子(所与の遺伝子又は配列の形態)の存在を指す。
本明細書において使用される場合、用語「ホモ接合体」は、すべての相同性染色体上の1つ又は複数の遺伝子座に同じ対立遺伝子を有する個々の細胞又は植物を指す。
本明細書において使用される場合、用語「ホモ接合」は、相同性染色体セグメントにおける1つ又は複数の遺伝子座での同一の対立遺伝子の存在を指す。
本明細書において使用される場合、用語「近交系」又は「株」は、比較的純粋な(relatively true)育種株を指す。
本明細書において使用される場合、用語「ハイブリッド」は、1つ又は複数の遺伝子において異なっている親の間の交雑から生じる任意の個々の細胞、組織又は植物を指す。
本明細書において使用される場合、用語「表現型」は、個々の遺伝的構造(すなわち、遺伝子型)と環境との間の相互作用から生じる、個々の細胞、細胞培養物、生物(例えば、植物)又は生物の群の観察可能な特徴を指す。
本明細書において使用される場合、用語「遺伝子移入」、「遺伝子移入された」及び「遺伝子移入する」は、1つの種、変種又は栽培品種の遺伝子がこれらの種の交雑によって別の種、変種又は栽培品種のゲノムに移されるプロセスを指す。交雑は、天然又は人工的であってよい。プロセスは、任意選択であってよく、反復親への戻し交雑によって完了され得、その場合遺伝子移入は、その親の1つとの種間ハイブリッドの戻し交雑の繰り返しを通じた1つの種の遺伝子の別の遺伝子プールへの潜入を指す。遺伝子移入は、レシピエント植物のゲノムに安定に組み込まれた異種性遺伝子材料として記載される場合もある。
「関連」又は「遺伝的関連」及び更に具体的には遺伝連鎖は、マーカー(すなわち、SNPマーカーの特定の対立遺伝子)の遺伝的多型及び目的の表現型が、同時に、すなわち共に遺伝性であり、偶発的な出来事によって予測されるよりも頻繁に生じる、すなわち、同じ染色体上での近接さの結果として対立遺伝子と表現型の原因である遺伝的配列との無作為でない関連があることと理解される。
本明細書において使用される場合、用語「植物部分」は、これだけに限らないが、シュート(shoot)、根、茎、種子、花蕾球(ヘッドとしても周知)、托葉、葉、花弁、花、胚珠、苞葉、枝、葉柄、節間(internode)、軟毛(pubescence)、サイドシュート(side shoot)、花粉、雄しべ及び小房を含む、植物の任意の部分を指す。
「キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)」は、黒腐病を生じ得るキサントモナス(Xanthomonadaceae)科の植物損傷プロテオバクテリアを意味する。病害は、葉縁に沿ったV字形の黄色及び/又は茶色の病変並びに最終的な葉脈の黒化によって特徴付けられる。好ましくはXccは、レース1、2、3、4、5、6、7、8及び/又は9のXccである。更に好ましくはXccは、レース1及び/又は4のXccである。
≪商業用植物≫は、
- 植物栽培者に売却され得る苗畑において育てられる若い植物、又は
- 収穫される花蕾球がベーリング(veiling)を通じて又は直接消費者に売却されることになる植物栽培者によって産生される植物
を意味する。
- 植物栽培者に売却され得る苗畑において育てられる若い植物、又は
- 収穫される花蕾球がベーリング(veiling)を通じて又は直接消費者に売却されることになる植物栽培者によって産生される植物
を意味する。
配列表
配列番号1は、マーカーBN-0061002の隣接配列を示す。
配列番号1は、マーカーBN-0061002の隣接配列を示す。
配列番号2は、マーカーBN-0060999の隣接配列を示す。
配列番号3は、マーカーBN-0060988の隣接配列を示す。
配列番号4は、マーカーBO-0101676の隣接配列を示す。
配列番号5は、マーカーBN-0064638の隣接配列を示す。
配列番号6は、マーカーBO-0101706の隣接配列を示す。
配列番号7は、マーカーBO-0101641の隣接配列を示す。
配列番号8は、マーカーBO-0002582の隣接配列を示す。
配列番号9は、マーカーBN-0010479の隣接配列を示す。
配列番号10は、マーカーBO-0101656の隣接配列を示す。
配列番号11は、マーカーBO-0101655の隣接配列を示す。
配列番号12は、マーカーBO-0103553の隣接配列を示す。
配列番号13は、マーカーBO-0101639の隣接配列を示す。
配列番号14は、マーカーBO-0101640の隣接配列を示す。
配列番号15は、マーカーBN-0010593の隣接配列を示す。
配列番号16は、マーカーBN-0000623の隣接配列を示す。
配列番号17は、マーカーBN-0003844の隣接配列を示す。
配列番号18は、マーカーBN-0002453の隣接配列を示す。
配列番号19は、マーカーBN-0004384の隣接配列を示す。
配列番号20は、マーカーBN-0004278の隣接配列を示す。
配列番号21は、マーカーBN-0010638の隣接配列を示す。
配列番号22は、マーカーBN-0010246の隣接配列を示す。
配列番号23は、マーカーBN-0009825の隣接配列を示す。
配列番号24は、マーカーBN-0001304の隣接配列を示す。
配列番号25は、マーカーBN-0001306の隣接配列を示す。
配列番号26は、マーカーBN-0002268の隣接配列を示す。
配列番号27は、マーカーBN-0003875の隣接配列を示す。
配列番号28は、マーカーBO-0103554の隣接配列を示す。
配列番号29は、マーカーBN-0004457の隣接配列を示す。
配列番号30は、マーカーBO-0101638の隣接配列を示す。
配列番号31は、マーカーBN-0003896の隣接配列を示す。
配列番号32は、マーカーBN-0002182の隣接配列を示す。
配列番号33は、マーカーBO-0003450の隣接配列を示す。
配列番号34は、マーカーBN-0000623を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号35は、マーカーBN-0000623を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号36は、マーカーBN-0000623を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号37は、マーカーBN-0003844を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号38は、マーカーBN-0003844を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号39は、マーカーBN-0003844を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号40は、マーカーBN-0002453を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号41は、マーカーBN-0002453を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号42は、マーカーBN-0002453を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号43は、マーカーBN-0004384を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号44は、マーカーBN-0004384を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号45は、マーカーBN-0004384を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号46は、マーカーBN-0004278を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号47は、マーカーBN-0004278を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号48は、マーカーBN-0004278を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号49は、マーカーBN-0010638を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号50は、マーカーBN-0010638を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号51は、マーカーBN-0010638を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号52は、マーカーBN-0010246を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号53は、マーカーBN-0010246を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号54は、マーカーBN-0010246を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号55は、マーカーBN-0009825を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号56は、マーカーBN-0009825を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号57は、マーカーBN-0009825を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号58は、マーカーBN-0001304を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号59は、マーカーBN-0001304を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号60は、マーカーBN-0001304を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号61は、マーカーBN-0001306を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号62は、マーカーBN-0001306を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号63は、マーカーBN-0001306を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号64は、マーカーBN-0002268を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号65は、マーカーBN-0002268を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号66は、マーカーBN-0002268を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号67は、マーカーBN-0003875を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号68は、マーカーBN-0003875を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号69は、マーカーBN-0003875を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号70は、マーカーBO-0103554を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号71は、マーカーBO-0103554を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号72は、マーカーBO-0103554を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号73は、マーカーBN-0004457を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号74は、マーカーBN-0004457を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号75は、マーカーBN-0004457を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号76は、マーカーBO-0101638を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号77は、マーカーBO-0101638を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号78は、マーカーBO-0101638を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号79は、マーカーBN-0003896を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号80は、マーカーBN-0003896を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号81は、マーカーBN-0003896を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号82は、マーカーBN-0002182を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号83は、マーカーBN-0002182を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号84は、マーカーBN-0002182を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号85は、マーカーBO-0003450を増幅するための緑色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号86は、マーカーBO-0003450を増幅するための白色対立遺伝子特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号87は、マーカーBO-0003450を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号88は、マーカーBN-0061002についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号89は、マーカーBN-0061002についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号90は、マーカーBN-0061002を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号91は、マーカーBN-0060999についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号92は、マーカーBN-0060999についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号93は、マーカーBN-0060999を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号94は、マーカーBN-0060988についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号95は、マーカーBN-0060988についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号96は、マーカーBN-0060988を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号97は、マーカーBO-0101676についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号98は、マーカーBO-0101676についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号99は、マーカーBO-0101676を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号100は、マーカーBN-0064638についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号101は、マーカーBN-0064638についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号102は、マーカーBN-0064638を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号103は、マーカーBO-0101706についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号104は、マーカーBO-0101706についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号105は、マーカーBO-0101706を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号106は、マーカーBO-0101641についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号107は、マーカーBO-0101641についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号108は、マーカーBO-0101641を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号109は、マーカーBO-0002582についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号110は、マーカーBO-0002582についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号111は、マーカーBO-0002582を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号112は、マーカーBN-0010479についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号113は、マーカーBN-0010479についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号114は、マーカーBN-0010479を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号115は、マーカーBO-0101656についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号116は、マーカーBO-0101656についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号117は、マーカーBO-0101656を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号118は、マーカーBO-0101655についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号119は、マーカーBO-0101655についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号120は、マーカーBO-0101655を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号121は、マーカーBO-0103553についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号122は、マーカーBO-0103553についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号123は、マーカーBO-0103553を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号124は、マーカーBO-0101639についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号125は、マーカーBO-0101639についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号126は、マーカーBO-0101639を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号127は、マーカーBO-0101640についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号128は、マーカーBO-0101640についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号129は、マーカーBO-0101640を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
配列番号130は、マーカーBN-0010593についての抵抗性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号131は、マーカーBN-0010593についての感受性対立遺伝子を増幅するための特異的フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号132は、マーカーBN-0010593を増幅するための共通リバースプライマーの配列を示す。
本発明の詳細な説明
第1の実施形態によれば、本発明は、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性であり、緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物であって、(i)前記Xccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含み、(ii)花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLをそのゲノム中に含まない、カリフラワー植物を対象とする。
第1の実施形態によれば、本発明は、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性であり、緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物であって、(i)前記Xccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含み、(ii)花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLをそのゲノム中に含まない、カリフラワー植物を対象とする。
したがって、本発明による前記カリフラワー植物は、花蕾球の緑色を付与する主要なQTL MAC5に連鎖していない、Xccへの抵抗性を付与する第5染色体上の前記緑色カリフラワー由来の1つの遺伝子移入された配列、すなわち1つの量的形質遺伝子座(QTL)、及びXccへの抵抗性を付与する第7染色体上の前記緑色カリフラワー由来の1つの遺伝子移入された配列、すなわち1つの量的形質遺伝子座(QTL)を少なくとも含む。
一部の実施形態では、本発明によるカリフラワー植物は、白色花蕾球、オレンジ色花蕾球又は紫色花蕾球を有する。好ましくは、本発明によるカリフラワー植物は、白色花蕾球を有する。
第5染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記遺伝子移入された配列は、好ましくは長さ少なくとも1.02Mbである。好ましくは、第5染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記遺伝子移入された配列は、花蕾球の緑色等の緑色カリフラワー遺伝子型に関連する非商業的特性の遺伝子移入を回避するために長すぎない。したがって、第5染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する遺伝子移入された配列が、長さ6Mb未満、好ましくは長さ5.89Mb未満であることは、本発明によれば好ましい。更に好ましくは、第5染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記遺伝子移入された配列は、カリフラワーに緑色花蕾球表現型を付与する配列を含有しないように最小化される。
第5染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLは、カリフラワーゲノム中でホモ接合又はヘテロ接合で存在する場合に、カリフラワー植物又は種子に抵抗性を付与する。
一部の実施形態では、第5染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLは、マーカーBN-0061002及びマーカーBO-0101641によって区切られている染色体領域(又は、別の言い方では第5染色体上の38 928 177及び39 972 831位のヌクレオチドによって区切られている染色体領域内)に位置付けられている。好ましくは、第5染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLは、マーカーBN-0060988及びマーカーBO-0101641によって区切られている染色体領域(又は、別の言い方では第5染色体上の38 948 228及び39 972 831位のヌクレオチドによって区切られている染色体領域内)に位置付けられている。一部の実施形態では、第5染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLは、次のマーカー:BN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641;又はマーカーBN-0061002及びマーカーBO-0101641によって区切られている染色体領域内若しくはマーカーBN-0060988及びマーカーBO-0101641によって区切られている染色体領域内の任意の他のマーカー、の1つ又は複数を増幅することによって同定され得る。別の言い方では、第5染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLは、(i)次のヌクレオチド位置: 38 928 177、38 931 725、38 948 228、39 384 678、39 900 371、39 920 505及び39 972 831の1つ若しくは複数を包含する第5染色体上の領域、或いは(ii)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6若しくは配列番号7の配列を含む第5染色体上の配列、又は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6若しくは配列番号7(それぞれ)の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る;好ましくは、61位のヌクレオチドを含む、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6又は配列番号7の配列の前記断片は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6又は配列番号7(それぞれ)の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
好ましくは、第5染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLは、少なくともマーカーBO-0101676を増幅することによって、別の言い方では、少なくとも(i)39 384 678位のヌクレオチドを包含する第5染色体上の領域、又は(ii)配列番号4の配列を含む第5染色体上の配列、若しくは配列番号4の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る、好ましくは、61位のヌクレオチドを含む配列番号4の配列の前記断片は、配列番号4の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
本明細書上に述べられる第5染色体上のマーカーによって増幅されるXccへの抵抗性を付与する対立遺伝子は、Table 3(表3)に記載の通りである。
第7染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記遺伝子移入された配列は、好ましくは長さ少なくとも705kbである。本発明によれば、第7染色体上に存在する遺伝子移入された配列が、長さ3Mb未満、好ましくは長さ2,17Mb未満であることは好ましい。
第7染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLは、カリフラワーゲノム中でホモ接合又はヘテロ接合で存在する場合、カリフラワー植物又は種子に抵抗性を付与する。
一部の実施形態では、第7染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLは、マーカーBO-0002582及びマーカーBN-0010593によって区切られている染色体領域内(又は、別の言い方では、第7染色体上の36 520 957及び38 690 572位のヌクレオチドによって区切られている染色体領域内)に位置付けられている。好ましくは、第7染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLは、マーカーBO-0101656及びマーカーBO-0101639によって区切られている染色体領域内(又は、別の言い方では、第7染色体上の37 334 130及び38 038 738位のヌクレオチドによって区切られている染色体領域内)に位置付けられている。一部の実施形態では、第7染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLは、次のマーカー:BO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593;又はマーカーBO-0002582及びマーカーBN-0010593によって区切られている染色体領域内、又はマーカーBO-0101656及びマーカーBO-0101639によって区切られている染色体領域内の任意の他のマーカー、の1つ又は複数を増幅することによって同定され得る。別の言い方では、第7染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLは、(i)次のヌクレオチド位置:36 520 957、36 859 354、37 334 130、37 489 538、37 939 284、38 038 738、38 071 324又は38 690 572の1つ又は複数を包含する第7染色体上の領域、或いは(ii)配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14若しくは配列番号15の配列を含む第7染色体上の配列、又は配列番号8の24位のヌクレオチド、若しくは配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14若しくは配列番号15(それぞれ)の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る;好ましくは24位のヌクレオチドを含む配列番号8の配列の前記断片、又は61位のヌクレオチドを含む配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14若しくは配列番号15の前記断片は、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14又は配列番号15(それぞれ)の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
好ましくは、第7染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLは、少なくともマーカーBO-0103553を増幅することによって、別の言い方では、少なくとも(i)37 939 284位のヌクレオチドを包含する第7染色体上の領域、又は(ii)配列番号12の配列を含む第7染色体上の配列、若しくは配列番号12の61位のヌクレオチドを含むその断片を増幅することによって同定され得る;好ましくは、61位のヌクレオチドを含む配列番号12の配列の前記断片は、配列番号12の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の近接ヌクレオチドを含む。
本明細書上に述べられる第7染色体上のマーカーによって増幅される、Xccへの抵抗性を付与する対立遺伝子は、Table 4(表4)に記載される通りである。
一部の実施形態では、マーカー:
- 第5染色体上のBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641;並びに
- 第7染色体上のBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593、
の増幅は、前記マーカーの抵抗性/感受性対立遺伝子を増幅するために使用され得る特定のプライマーを使用してPCRによって実施される。
- 第5染色体上のBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641;並びに
- 第7染色体上のBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593、
の増幅は、前記マーカーの抵抗性/感受性対立遺伝子を増幅するために使用され得る特定のプライマーを使用してPCRによって実施される。
特に、マーカー:
- 第5染色体上のBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641;並びに
- 第7染色体上のBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593
の抵抗性及び感受性対立遺伝子を増幅するためのプローブは、Table 5(表5)に記載される配列を有し得る。
- 第5染色体上のBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641;並びに
- 第7染色体上のBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593
の抵抗性及び感受性対立遺伝子を増幅するためのプローブは、Table 5(表5)に記載される配列を有し得る。
Xccへの抵抗性を付与するQTLがTable 3(表3)及び4(表4)に記載される特定の対立遺伝子によって同定され得る限り、本発明の植物は、
- 第5染色体上の、Xccへの抵抗性を付与する対立遺伝子の次の組合せ:
(i)BN-0061002の対立遺伝子T、BN-0060999の対立遺伝子C、BN-0060988の対立遺伝子C、BO-0101676の対立遺伝子G、BN-0064638の対立遺伝子A、BO-0101706の対立遺伝子T及びBO-0101641の対立遺伝子C、
(ii)BN-0060988の対立遺伝子C、BO-0101676の対立遺伝子G、BN-0064638の対立遺伝子A、BO-0101706の対立遺伝子T及びBO-0101641の対立遺伝子C、又は
(iii)BO-0101676の対立遺伝子G、並びに
- 第7染色体上の、Xccへの抵抗性を付与する対立遺伝子の次の組合せ:
(a)BO-0002582の対立遺伝子T、BN-0010479の対立遺伝子C、BO-0101656の対立遺伝子C、BO-0101655の対立遺伝子A、BO-0103553の対立遺伝子A、BO-0101639の対立遺伝子T、BO-0101640の対立遺伝子G及びBN-0010593の対立遺伝子C、
(b)BO-0101656の対立遺伝子C、BO-0101655の対立遺伝子A、BO-0103553の対立遺伝子A、BO-0101639の対立遺伝子T、又は
(c)BO-0103553の対立遺伝子A
を含む。
- 第5染色体上の、Xccへの抵抗性を付与する対立遺伝子の次の組合せ:
(i)BN-0061002の対立遺伝子T、BN-0060999の対立遺伝子C、BN-0060988の対立遺伝子C、BO-0101676の対立遺伝子G、BN-0064638の対立遺伝子A、BO-0101706の対立遺伝子T及びBO-0101641の対立遺伝子C、
(ii)BN-0060988の対立遺伝子C、BO-0101676の対立遺伝子G、BN-0064638の対立遺伝子A、BO-0101706の対立遺伝子T及びBO-0101641の対立遺伝子C、又は
(iii)BO-0101676の対立遺伝子G、並びに
- 第7染色体上の、Xccへの抵抗性を付与する対立遺伝子の次の組合せ:
(a)BO-0002582の対立遺伝子T、BN-0010479の対立遺伝子C、BO-0101656の対立遺伝子C、BO-0101655の対立遺伝子A、BO-0103553の対立遺伝子A、BO-0101639の対立遺伝子T、BO-0101640の対立遺伝子G及びBN-0010593の対立遺伝子C、
(b)BO-0101656の対立遺伝子C、BO-0101655の対立遺伝子A、BO-0103553の対立遺伝子A、BO-0101639の対立遺伝子T、又は
(c)BO-0103553の対立遺伝子A
を含む。
例えば、本発明によるカリフラワー植物は、Xccへの抵抗性を付与する対立遺伝子の次の組合せ:
(1)本明細書上に定義される第5染色体上の対立遺伝子の組合せ(i)、(ii)若しくは(iii)、及び本明細書上に定義される第7染色体上の対立遺伝子の組合せ(a)、
(2)本明細書上に定義される第5染色体上の対立遺伝子の組合せ(i)、(ii)若しくは(iii)、及び本明細書上に定義される第7染色体上の対立遺伝子の組合せ(b)、又は
(3)本明細書上に定義される第5染色体上の対立遺伝子の組合せ(i)、(ii)若しくは(iii)、及び本明細書上に定義される第7染色体上の対立遺伝子の組合せ(c)
を含む。
(1)本明細書上に定義される第5染色体上の対立遺伝子の組合せ(i)、(ii)若しくは(iii)、及び本明細書上に定義される第7染色体上の対立遺伝子の組合せ(a)、
(2)本明細書上に定義される第5染色体上の対立遺伝子の組合せ(i)、(ii)若しくは(iii)、及び本明細書上に定義される第7染色体上の対立遺伝子の組合せ(b)、又は
(3)本明細書上に定義される第5染色体上の対立遺伝子の組合せ(i)、(ii)若しくは(iii)、及び本明細書上に定義される第7染色体上の対立遺伝子の組合せ(c)
を含む。
本発明の抵抗性植物は、ホモ接合状態又はヘテロ接合状態での前記対立遺伝子の組合せの存在によって特徴付けられ得る。
花蕾球の色を付与するQTLがTable 1(表1)に記載される特定の対立遺伝子によって同定され得る限り、本発明の植物は、花蕾球の白色を付与する対立遺伝子の次の組合せ:
A)BO-0103554の対立遺伝子G、BN-0004457の対立遺伝子G、及び/若しくはBO-0101638の対立遺伝子G(すなわち、MAC5 QTLについての白色対立遺伝子)、
B)BN-0000623の対立遺伝子C、BN-0003844の対立遺伝子T、BN-0002453の対立遺伝子G、BN-0004384の対立遺伝子A、BN-0004278の対立遺伝子C、BN-0010638の対立遺伝子G若しくはA、BN-0010246の対立遺伝子G、BN-0001304の対立遺伝子T若しくはC、BN-0001306の対立遺伝子T若しくはC、BN-0002268の対立遺伝子T若しくはG、BN-0003875の対立遺伝子G、BO-0103554の対立遺伝子G、BN-0004457の対立遺伝子G、BO-0101638の対立遺伝子G、BN-0003896の対立遺伝子G、BN-0002182の対立遺伝子A及びBO-0003450の対立遺伝子T(すなわち、寄託された材料FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)若しくはRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)に対応する植物のゲノムに存在するものと同じ対立遺伝子)、又は
C)BN-0000623の対立遺伝子T、BN-0003844の対立遺伝子A、BN-0002453の対立遺伝子C、BN-0004384の対立遺伝子G、BN-0004278の対立遺伝子T、BN-0010638の対立遺伝子G、BN-0010246の対立遺伝子A、BN-0009825の対立遺伝子T、BN-0001304の対立遺伝子T、BN-0001306の対立遺伝子T、BN-0002268の対立遺伝子T、BN-0003875の対立遺伝子G、BO-0103554の対立遺伝子G、BN-0004457の対立遺伝子G、BO-0101638の対立遺伝子G、BN-0003896の対立遺伝子A、BN-0002182の対立遺伝子C及びBO-0003450の対立遺伝子C
を含む。
A)BO-0103554の対立遺伝子G、BN-0004457の対立遺伝子G、及び/若しくはBO-0101638の対立遺伝子G(すなわち、MAC5 QTLについての白色対立遺伝子)、
B)BN-0000623の対立遺伝子C、BN-0003844の対立遺伝子T、BN-0002453の対立遺伝子G、BN-0004384の対立遺伝子A、BN-0004278の対立遺伝子C、BN-0010638の対立遺伝子G若しくはA、BN-0010246の対立遺伝子G、BN-0001304の対立遺伝子T若しくはC、BN-0001306の対立遺伝子T若しくはC、BN-0002268の対立遺伝子T若しくはG、BN-0003875の対立遺伝子G、BO-0103554の対立遺伝子G、BN-0004457の対立遺伝子G、BO-0101638の対立遺伝子G、BN-0003896の対立遺伝子G、BN-0002182の対立遺伝子A及びBO-0003450の対立遺伝子T(すなわち、寄託された材料FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)若しくはRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)に対応する植物のゲノムに存在するものと同じ対立遺伝子)、又は
C)BN-0000623の対立遺伝子T、BN-0003844の対立遺伝子A、BN-0002453の対立遺伝子C、BN-0004384の対立遺伝子G、BN-0004278の対立遺伝子T、BN-0010638の対立遺伝子G、BN-0010246の対立遺伝子A、BN-0009825の対立遺伝子T、BN-0001304の対立遺伝子T、BN-0001306の対立遺伝子T、BN-0002268の対立遺伝子T、BN-0003875の対立遺伝子G、BO-0103554の対立遺伝子G、BN-0004457の対立遺伝子G、BO-0101638の対立遺伝子G、BN-0003896の対立遺伝子A、BN-0002182の対立遺伝子C及びBO-0003450の対立遺伝子C
を含む。
例えば、本発明の植物は、
I)本明細書上に定義される第5及び第7染色体上の、Xccへの抵抗性を付与する対立遺伝子の組合せ(1)を、花蕾球の白色を付与する対立遺伝子の組合せA)、B)若しくはC)と共に
II)本明細書上に定義される第5及び第7染色体上の、Xccへの抵抗性を付与する対立遺伝子の組合せ(2)を、花蕾球の白色を付与する対立遺伝子の組合せA)、B)若しくはC)と共に、又は
III)本明細書上に定義される第5及び第7染色体上のXccへの抵抗性を付与する対立遺伝子の組合せ(3)を、花蕾球の白色を付与する対立遺伝子の組合せA)、B)若しくはC)と共に
含み得る。
I)本明細書上に定義される第5及び第7染色体上の、Xccへの抵抗性を付与する対立遺伝子の組合せ(1)を、花蕾球の白色を付与する対立遺伝子の組合せA)、B)若しくはC)と共に
II)本明細書上に定義される第5及び第7染色体上の、Xccへの抵抗性を付与する対立遺伝子の組合せ(2)を、花蕾球の白色を付与する対立遺伝子の組合せA)、B)若しくはC)と共に、又は
III)本明細書上に定義される第5及び第7染色体上のXccへの抵抗性を付与する対立遺伝子の組合せ(3)を、花蕾球の白色を付与する対立遺伝子の組合せA)、B)若しくはC)と共に
含み得る。
一部の実施形態では、Xccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の前記遺伝子移入された配列は、種子がNCIMB受託番号42693で寄託されている株FLA1-116-02Sの植物のゲノムに存在する配列から選択される。
一部の実施形態では、Xccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の前記遺伝子移入された配列は、寄託された材料FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)に対応する植物のゲノムにおいて見出される通りである。
寄託された種子及びそのカリフラワーは、緑色カリフラワー、すなわちXccへの抵抗性を示す遺伝子移入パートナーと、白色カリフラワーSOL5、反復感受性親との間の最初の交雑から得られた。それにより、寄託された種子は、第5染色体上の花蕾球の緑色を付与する主要なQTL MAC5を有さない、緑色カリフラワーから白色カリフラワーゲノムに遺伝子移入された配列のリザーバーになる。本発明によるXccへの抵抗性を付与する遺伝子移入された配列は、このリザ-バーから選択される。
一部の実施形態では、本発明によるカリフラワー植物は、株FLA1-116-02Sであり、その種子は、NCIMB受託番号42693で寄託されている。
一部の実施形態では、本発明によるカリフラワー植物は、株RSF1-BC3-F3であり、その種子は、NCIMB受託番号43442で寄託されている。
一部の実施形態では、本発明による植物は、受託番号42693でNCIMBに寄託されたFLA1-116-02S又はNCIMB受託番号43442で寄託されたRSF1-BC3-F3のカリフラワー株の寄託された種子から成長した植物の後代又は子孫であってよい。寄託された種子から成長した植物は、実際にXccにホモ接合で抵抗性であり、緑色花蕾球を有さず、それにより、本明細書上に定義される通りXccへの抵抗性を付与する第5及び第7染色体上のQTLをホモ接合状態でそのゲノム中に保有し、本明細書上に定義される花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTL MAC5をそのゲノム中にホモ接合状態で保有しない。それらは、交雑及び自家受粉並びに/又は戻し交雑によって別の遺伝的バックグラウンドに、本明細書上に定義される花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTL MAC5を移行することなく、本明細書上に定義されるXccへの抵抗性を付与する第5及び第7染色体上のこれらのQTLを移行するために使用され得る。寄託された種子から得られた植物の後代は、例えば、マーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706、BO-0101641、BO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640、BN-0010593、BN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及び/又はBO-0003450を使用することによって当業者によって同定され得る。
本発明による植物は、細胞質雄性不稔、例えばオグラ型ミトコンドリア不稔(Ogura mitochondrial sterility)を有する場合もある。
一部の実施形態では、前記緑色カリフラワー由来のXccへの前記抵抗性は、すべてのXccレースに抵抗性である。更に好ましくは、前記緑色カリフラワー由来の前記抵抗性は、Xccレース1及び/又は4に抵抗性である。
Xccへの抵抗性は、感受性の(商業用)株又はハイブリッド、例えばSpacestarとの比較によって有利に判定される。Xccへの抵抗性は、実施例の「Xcc検査」の段落に記載される病理学的検査に基づいて、すなわち葉の症状の量を判定することによって好ましくは判定される。好ましくは、この基準は、接種の数週間後に、好ましくは接種の1から1.5/2カ月後の間に判定される。抵抗性スコア化は、検査される植物の抵抗性を評価するために使用される。好ましくは、Xccへの抵抗性の評価のための抵抗性スコア化は、9(=高度に抵抗性)から1(=感受性)の範囲のスコア化システムである。更に正確には、9のスコアは、葉に症状がないことを示し;8のスコアは葉の1〜12%の症状を示し;7のスコアは葉の13〜25%の症状を示し;5のスコアは葉の26〜50%の症状を示し;3のスコアは葉の51〜75%を示し;及び1のスコアは葉の76%を超える症状を示す。かかるスコア化システムにおいて植物集団は、少なくとも50%の植物が9又は8のスコアを有する場合、Xccに高度に抵抗性である。一実施形態では植物集団は、少なくとも50%の植物が7のスコアを有する場合、Xccに中間の抵抗性である。一実施形態では植物集団は、少なくとも50%の植物が5、3又は1のスコアを有する場合、Xccに感受性である。
したがって、本発明による植物は、9から7の間に含まれるスコアを好ましくは示す。
第2の態様によれば、本発明は、本発明によるカリフラワー植物の部分を対象とする。
一部の実施形態では、植物の部分は、植物細胞である。したがって、本発明は、本発明によるカリフラワー植物の細胞、すなわち、Xccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含む細胞、すなわち、花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTL MAC5に連鎖していない、第5染色体上に存在し、Xccへの抵抗性を付与する量的形質遺伝子座(QTL)及び第7染色体上に存在し、Xccへの抵抗性を付与するQTLを少なくとも含む細胞を提供する。
Xccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列のさまざまな特性は、本発明の第1の態様との関連で定義されており、変更すべきことは変更して本発明の本態様に適用される。Xccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列は、したがって、寄託された材料FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)に対応するカリフラワー植物のゲノムに存在する配列から好ましくは選択される。一部の実施形態では、Xccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の前記遺伝子移入された配列は、寄託された材料FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)に対応する植物のゲノム中に見出される通りである。
一部の実施形態では、Xccへの抵抗性を付与する第5及び第7染色体上の前記QTLは、本発明の第1の態様に定義される通りである。
一部の実施形態では、Xccへの抵抗性を付与する対立遺伝子は、Table 3(表3)及び4(表4)に記載される通りである。
一部の実施形態では、花蕾球の色を付与する対立遺伝子は、Table 1(表1)に記載される通りである。
一部の実施形態では、本発明による植物部分は、本発明の第1の態様において定義されている対立遺伝子の組合せI)からIII)を含む。
一部の実施形態では、本明細書上に記載される対立遺伝子の組合せは、寄託された材料FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)に対応する植物のゲノムに存在するものから選択される。
一部の実施形態では、明細書上に定義される対立遺伝子の組合せは、寄託された材料FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)に対応する植物のゲノムに見出される通りである。
本発明の植物細胞は、商業的に許容される花蕾球品質を有する植物全体に再生される能力を有し得る。
代替的に、本発明は、再生可能でなく、そのため植物全体を生じさせることができない植物細胞も対象とする。
別の実施形態によれば、植物部分は、本発明によるカリフラワー植物の任意の他の部分であり、特に種子、生殖物質、根、花又は花蕾球であり得る。かかる部分は、上に定義される細胞、すなわち、本明細書上に記載されるXccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含み、本明細書上に記載される花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の、主要なQTLをそのゲノム中に含まない細胞を含む。
本発明は、更に具体的には、成長した場合にXccに抵抗性で、上に定義される緑色花蕾球を有していないカリフラワー植物を生じるカリフラワー植物の種子に関する。かかる種子は、「本発明のカリフラワー植物の種子」、すなわち本発明のカリフラワー植物を生じる種子である。しかし本発明は、本発明のカリフラワー植物由来の、すなわち自家受粉又は交雑後にかかるカリフラワー植物から得られた種子にも、前記種子から得られたカリフラワー植物が前記抵抗性を付与する上に定義される緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列によりXccに抵抗性であり、本明細書上に定義される花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTL MAC5の非存在により緑色花蕾球を有さない限り、関する。
本発明は、本発明に従って上に定義される植物の再生可能な細胞の組織培養も対象とし;好ましくは、再生可能な細胞は、本発明の胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、茎、葉柄、根、根端、果実、種子、花、子葉及び/又は胚軸由来であり、それにより、第5染色体上の、本明細書上に記載される花蕾球の緑色を付与する主要なQTLをそのゲノム中に含むことなく、本明細書上に記載されるXccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含む。
組織培養は、好ましくは、前述のカリフラワー植物の生理学的及び形態学的特徴を有する植物を再生でき、前述のカリフラワー植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生できる。本発明は、本発明の組織培養から再生されたカリフラワー植物も提供する。
本発明は、上に定義される植物の、又は上に定義される組織培養由来のプロトプラストも提供し、前記プロトプラストは、本明細書上に記載されるXccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含み、本明細書上に記載される花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLをそのゲノム中に含まない。
本発明の第1の態様と関連する先のセクションにおいて詳述されたすべての実施形態は、本発明の第2の態様による実施形態でもある。
第3の態様によれば、本発明は、Xccに抵抗性で、緑色花蕾球を有していない又は白色花蕾球を有するカリフラワー植物を得るための育種プログラムにおける育種パートナーとしての、本発明の第1の態様による、すなわちXccに抵抗性で、緑色花蕾球を有していないカリフラワー植物の使用も対象とする。実際に、本発明の第1の態様によるかかるカリフラワー植物は、前記抵抗性を付与する本明細書上に定義される緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列をそのゲノムに保有するが、本明細書上に定義される花蕾球の緑色を付与するQTLを含まない(すなわち、前記植物は、本明細書上に定義される花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTL MAC5を少なくとも含まない)。この植物を感受性又は低抵抗性カリフラワー植物と交雑することによって、所望の表現型を付与するこの遺伝子移入された配列を、後代に移行することが可能である。したがって、本発明によるカリフラワー植物は、花蕾球の緑色を付与するQTLをカリフラワー植物又は生殖質に遺伝子移入することなく(すなわち、本明細書上に定義される花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の少なくとも主要なQTL MAC5を遺伝子移入することなく)、Xccへの前記抵抗性を付与する本明細書上に定義される緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列を遺伝子移入するための育種パートナーとして使用され得る。本発明は、受託番号42693でNCIMBに寄託されたFLA1-116-02S又は受託番号43442でNCIMBに寄託されたRSF1-BC3-F3の植物又は種子を用いた同じ使用も対象とする。前記植物はカリフラワー植物又は生殖質に所望の表現型を付与することを目的とする育種プログラムにおける遺伝子移入パートナーとしても好適である。
かかる育種プログラムでは、所望の表現型を示す又は所望の表現型に連鎖している配列を保有する後代の選択は、本明細書上に開示されるマーカーの対立遺伝子に基づいて有利に実行され得る。後代は、本発明の第1の態様に定義される対立遺伝子の組合せI)からIII)の存在で好ましくは選択される。
所望の表現型を有する後代の選択は、実施例のXcc検査セクションにおいて特に開示される通り、病原体蔓延の条件下でも行われ得る。
本発明による、又は受託番号NCIMB 42693若しくはNCIMB 43442で寄託されたカリフラワー植物は、商業用カリフラワー株及びXccに抵抗性で、緑色花蕾球を有していない変種を得るためのマーカー支援選択プログラムにおいて特に有用である。
本発明の第1の及び第2の態様について記載された任意の実施形態は、本発明の第3の態様にも適用可能である。
本発明は、所望の表現型を付与する遺伝的配列を同定する、配列決定及び/又はクローニングすることを目的とするプログラムにおける前記植物の使用も対象とする。
本発明の前述の態様について記載された任意の具体的な実施形態は、特に、目的の表現型を付与するQTLの特性に関して、本発明の本態様にも適用可能である。
別の態様によれば、本発明は、Xccに抵抗性で、緑色花蕾球を有していないカリフラワー植物、特に商業用植物の産生のための方法にも関する。これらの特性を有するカリフラワー植物の産生のための方法又はプロセスは、次の工程:
a)所望の表現型が移入される又は改善される、本発明の第1の態様による植物と感受性又は低抵抗性カリフラワー植物とを交雑する工程、
b)得られた後代においてXccに抵抗性で、緑色花蕾球を有していないもの、又はXccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列を保有するが、花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLを保有しない1つの植物を選択する工程、
c)任意選択で、工程b)で得られた抵抗性植物を1回若しくは数回自家受粉させる工程、又は半数性単為生殖(haplodiploidization)プロセスを行う工程、及びXccに抵抗性で、これにより得られた後代において緑色花蕾球を有していないカリフラワー植物を選択する工程、
d)工程b)又はc)において選択された緑色花蕾球を有していない抵抗性植物を感受性カリフラワー植物(すなわち、Xccに感受性)と戻し交雑する工程、並びに
e)Xccに抵抗性で緑色花蕾球を有していない植物を選択する工程
を含む。
a)所望の表現型が移入される又は改善される、本発明の第1の態様による植物と感受性又は低抵抗性カリフラワー植物とを交雑する工程、
b)得られた後代においてXccに抵抗性で、緑色花蕾球を有していないもの、又はXccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列を保有するが、花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLを保有しない1つの植物を選択する工程、
c)任意選択で、工程b)で得られた抵抗性植物を1回若しくは数回自家受粉させる工程、又は半数性単為生殖(haplodiploidization)プロセスを行う工程、及びXccに抵抗性で、これにより得られた後代において緑色花蕾球を有していないカリフラワー植物を選択する工程、
d)工程b)又はc)において選択された緑色花蕾球を有していない抵抗性植物を感受性カリフラワー植物(すなわち、Xccに感受性)と戻し交雑する工程、並びに
e)Xccに抵抗性で緑色花蕾球を有していない植物を選択する工程
を含む。
代替的に、方法又はプロセスは、次の工程:
a1)所望の表現型が移入又は改善される、本発明の第1の態様による植物と感受性又は低抵抗性カリフラワー植物とを交雑する工程、すなわちF1集団を生成する工程、
a2)F2集団を創出するためにF1集団を自家受粉する工程、又は倍加半数体集団を創出するためにF1集団に半数性単為生殖プロセスを行う工程、
b)これにより得られた後代において緑色花蕾球を有していない抵抗性の個体を選択する工程、
c)任意選択で、工程b)で得られた緑色花蕾球を有していない抵抗性カリフラワー植物を1回若しくは数回自家受粉させる工程、又は半数性単為生殖プロセスを行う工程、及びこれにより得られた後代において緑色花蕾球を有していない抵抗性カリフラワー植物を選択する工程、
d)工程c)又はd)において選択された緑色花蕾球を有していない抵抗性カリフラワー植物を感受性カリフラワー植物(すなわち、Xccに感受性)と戻し交雑する工程、
e)Xccに抵抗性で緑色花蕾球を有していないカリフラワー植物を選択する工程
を含み得る。
a1)所望の表現型が移入又は改善される、本発明の第1の態様による植物と感受性又は低抵抗性カリフラワー植物とを交雑する工程、すなわちF1集団を生成する工程、
a2)F2集団を創出するためにF1集団を自家受粉する工程、又は倍加半数体集団を創出するためにF1集団に半数性単為生殖プロセスを行う工程、
b)これにより得られた後代において緑色花蕾球を有していない抵抗性の個体を選択する工程、
c)任意選択で、工程b)で得られた緑色花蕾球を有していない抵抗性カリフラワー植物を1回若しくは数回自家受粉させる工程、又は半数性単為生殖プロセスを行う工程、及びこれにより得られた後代において緑色花蕾球を有していない抵抗性カリフラワー植物を選択する工程、
d)工程c)又はd)において選択された緑色花蕾球を有していない抵抗性カリフラワー植物を感受性カリフラワー植物(すなわち、Xccに感受性)と戻し交雑する工程、
e)Xccに抵抗性で緑色花蕾球を有していないカリフラワー植物を選択する工程
を含み得る。
一部の実施形態では、Xccに抵抗性で、緑色花蕾球を有していないカリフラワー植物は、工程b)、c)及びe)で選択され得る。
工程e)で選択されるカリフラワー植物は、好ましくは商業用植物、特に、緑色花蕾球を有していない、又は白色花蕾球を有し、Xccに抵抗性の植物である。
好ましくは、工程d)及びe)は、必ずしも同じ感受性カリフラワー植物を用いずに少なくとも2回、好ましくは3回繰り返される。前記感受性カリフラワー植物は、好ましくは育種株である。
自家受粉、半数性単為生殖プロセス及び戻し交雑工程は、任意の順で実行されてよく、間に介在してもよく、例えば戻し交雑は、1回又は数回の自家受粉の前及び後に実行されてよく、自家受粉又は半数性単為生殖プロセスは、1回又は数回の戻し交雑の前及び後に想定され得る。
一部の実施形態では、かかる方法は、Xccに抵抗性で、緑色花蕾球を有していないカリフラワー植物を選択するための工程b)、c)及び/又はe)で実行される1回又は複数回の選択のための、本明細書上に記載されるマーカーを使用することによって有利に実行される。一部の実施形態では、Xccに抵抗性で、緑色花蕾球を有していないカリフラワー植物を選択するためのマーカーは、
- 第5染色体上のマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641の1つ若しくは複数、又は第5染色体上のマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641のすべて、又は第5染色体上のマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641の組合せ、
- 第7染色体上のマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の1つ若しくは複数、又は第7染色体上のマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593のすべて、又は第7染色体上のマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の組合せ、並びに
- 第5染色体上のマーカーBO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638の1つ若しくは複数、又は第5染色体上のマーカーBO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638のすべて、又は第5染色体上のマーカーBO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638の組合せ
である。
- 第5染色体上のマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641の1つ若しくは複数、又は第5染色体上のマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641のすべて、又は第5染色体上のマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641の組合せ、
- 第7染色体上のマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の1つ若しくは複数、又は第7染色体上のマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593のすべて、又は第7染色体上のマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の組合せ、並びに
- 第5染色体上のマーカーBO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638の1つ若しくは複数、又は第5染色体上のマーカーBO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638のすべて、又は第5染色体上のマーカーBO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638の組合せ
である。
一部の実施形態では、Xccに抵抗性で、緑色花蕾球を有していないカリフラワー植物の選択は、本明細書上に記載されるマーカーBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450の1つ若しくは複数、又は本明細書上に記載されるマーカーBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450のすべて、又は本明細書上に記載されるマーカーBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450の組合せの検出で更に行われ得る。
一部の実施形態では、工程b)、c)及び/又はe)のいずれか1つで選択される植物は、本発明の第1の態様に定義される対立遺伝子の組合せI)、II又はIII)の存在で選択される。
所望の表現型を有する後代の選択は、とりわけ実施例のXcc検査セクションに開示される通り、病原体蔓延の条件でも行われ得る。
対立遺伝子検出のために使用される方法は、特定の染色体上のマーカーの2つの異なる対立遺伝子間の識別を可能にする任意の技術に基づいていてよい。
本発明は、かかる方法によって得られた又は得ることができるカリフラワー植物にも関する。実際に、かかる植物は、Xccに抵抗性であり、本発明の第1の態様による緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物である。
さらなる態様によれば本発明は、本発明の第1の態様による抵抗性植物、例えば、NCIMB受託番号42693で寄託された種子の代表的試料である植物FLA1-116-02S、又はNCIMB受託番号43442で寄託された種子の代表的試料である植物RSF1-BC3-F3又は上に開示される方法によって得られる抵抗性植物を、カリフラワー植物、例えばXcc感染に感受性の植物、又はXcc感染への異なるレベルの抵抗性を有する植物と交雑することによって得ることができるハイブリッドカリフラワー植物も対象とする。特に好ましいハイブリッドカリフラワー植物は、農学的目的の任意の形質又は表現型を示す植物である。
本発明は、
- 寄託された種子FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)を出芽させることによって得られる植物、又は本発明の第1の態様による植物をカリフラワー植物、例えばXccに感受性のカリフラワー植物と戻し交雑する工程
- Xccに抵抗性で緑色花蕾球を有さない植物を選択する工程
を含む、Xccに抵抗性であり、緑色花蕾球を有さない商業用カリフラワー植物を得るための方法も対象とする。
- 寄託された種子FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)を出芽させることによって得られる植物、又は本発明の第1の態様による植物をカリフラワー植物、例えばXccに感受性のカリフラワー植物と戻し交雑する工程
- Xccに抵抗性で緑色花蕾球を有さない植物を選択する工程
を含む、Xccに抵抗性であり、緑色花蕾球を有さない商業用カリフラワー植物を得るための方法も対象とする。
第2の工程における選択は、本発明の他の方法について上に詳述された通り好ましくは実行される。前記選択は、株FLA1-116-02S又はRSF1-BC3-F3において見出される、本明細書上に記載されるマーカーの1つ又は複数の特定の対立遺伝子の存在について好ましくは実行される。
選択されたカリフラワー植物は、好ましくは商業用植物、特にXccへの抵抗性を有し、緑色花蕾球を有していない又は白色花蕾球を有する植物である。
カリフラワー植物種子を産生するための方法も提供される。一部の実施形態では、方法は、本発明によるカリフラワー植物をそれ自体と又は別のカリフラワー植物と交雑すること及び生じた種子を採取することを含む。
本発明の方法において詳述される通り、Xccへの抵抗性に関連する配列又はQTLの遺伝子移入に加えて、前記配列はXccに抵抗性の商業用カリフラワー植物を得るために遺伝子工学によってもカリフラワーバックグラウンドに導入され得る。所望の表現型を付与するカリフラワー由来の、とりわけ寄託物由来の遺伝子移入されたQTLの同定及びクローニングは、当業者に日常的である。
さらなる態様によれば、本発明は、上に記載される1つの方法によって得られる又は得ることができる植物を提供する。実際にかかる植物は、本発明の第1の態様による所望の表現型を有する、すなわちXccに抵抗性で緑色花蕾球を有していないカリフラワー植物である。
本発明の種子又は植物が、さまざまなプロセス、特にUV変異誘発等の技術的プロセス又は、ガイド組換え等の遺伝子工学によって得ることができ、本質的に生物学的プロセスの手段によって得られるとは限らないことが注目される。
かかる態様によれば、本発明は、そのゲノム中に1つ又は複数の変異を含み得、Xccに抵抗性の変異体植物を提供し、その変異が、例えば、代表的な試料が寄託番号NCIMB 42693又はNCIMB 43442でNCIMBに寄託された植物のゲノムに存在する、カリフラワー植物又は種子、好ましくは天然に存在しないカリフラワー植物又は種子に関する。
好ましくは、変異は、上に記載される通り、第5染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する量的形質遺伝子座(QTL)、及び第7染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与するQTLの、カリフラワー植物の相同性配列の置き換えでの組込みである。更により好ましくは、変異は、(i)カリフラワーゲノムの第5染色体上のマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641を含む配列又はその断片の、その代表的な試料が寄託番号NCIMB 42693でNCIMBに寄託されている、植物のゲノム中に存在する第5染色体上の相同性配列による置換、並びに(ii)カリフラワーゲノムの第7染色体上のマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593を含む配列又はその断片の、その代表的な試料が寄託番号NCIMB 42693又はNCIMB 43442でNCIMBに寄託されている植物のゲノム中に存在する第7染色体上の相同性配列による置換であって、配列又はその断片がXccへの抵抗性を付与する置換である。かかる変異は、本明細書上に定義される花蕾球の緑色を付与する、第5染色体上の少なくとも主要なQTL MAC5の欠失を更に含み得る。
一実施形態では、本発明は、そのゲノム中に1つ又は複数の変異を保有するカリフラワー植物又は種子を得るための方法であって、Xccへの抵抗性を有する植物を提供する方法に関する。かかる方法は、実施例3に例示されており、
a)M1種子を得るために改変されるカリフラワー植物のM0種子を変異誘発剤を用いて処置する工程;
b)M1植物を得るために、それにより得られたM1種子から植物を成長させる工程;
c)M1植物の自家受粉によってM2種子を産生する工程;及び
d)任意選択で、M2+n種子を得るために工程b)及びc)をn回繰り返す工程
を含み得る。
a)M1種子を得るために改変されるカリフラワー植物のM0種子を変異誘発剤を用いて処置する工程;
b)M1植物を得るために、それにより得られたM1種子から植物を成長させる工程;
c)M1植物の自家受粉によってM2種子を産生する工程;及び
d)任意選択で、M2+n種子を得るために工程b)及びc)をn回繰り返す工程
を含み得る。
M2+n種子は、植物に成長され、Xcc感染が行われる。生き残った植物又は、Xcc感染の軽度の症状を有するものは、Xccへのそれらの抵抗性について選択され続けて、1つ又は複数のさらなる世代に増殖される。
本方法では、工程a)のM1種子は、EMS変異誘発等の化学的変異誘発を介して得ることができる。他の化学的変異誘発剤として、これだけに限らないが、ジエチルスルフェート(diethyl sufate)(des)、エチレンイミン(ei)、プロパンスルトン、N-メチル-N-ニトロソウレタン(mnu)、N-ニトロソ-N-メチルウレア(NMU)、N-エチル-N-ニトロソウレア(enu)及びアジ化ナトリウムが挙げられる。
代替的に、変異は、例えばX線、高速中性子、UV照射から選択される照射の手段によって誘導される。
本発明の別の実施形態では、変異は、遺伝子工学の手段によって誘導される。かかる変異は、Xcc抵抗性を付与する配列の組込み及び、Xcc抵抗性を付与する代替配列による存在する配列の置換も含む。
使用され得る遺伝子工学手段は、遺伝的多様性、標的化変異誘発される目標、新たな遺伝子の標的化導入又は遺伝子サイレンシング(RdDM)を通じて植物において新たな特徴を創出するために開発及び/又は使用される種々の新規技術である新しい育種技術と呼ばれるすべてのかかる技術の使用を含む。かかる新しい育種技術の例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)技術(ZFN-1、ZFN-2及びZFN-3、その全体が参照により組み込まれる米国特許第9,145,565号を参照されたい)、オリゴヌクレオチド指定突然変異(ODM)、シスジェネシス及びイントラジェネシス(Cisgenesis and intragenesis)、RNA依存性DNAメチル化(RdDM、必ずしもヌクレオチド配列を変更しないが、配列の生物学的活性を変更し得る)、接木(GM台木への)、逆育種、アグロ浸潤(Agro-infiltration)(「厳密な」アグロ浸潤、アグロ接種(agro-inoculation)、フローラルディップ(floral dip))、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN、その全体が参照により組み込まれる米国特許第8,586,363号及び第9,181,535号を参照されたい)、CRISPR/Casシステム(すべて参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第8,697,359号;第8,771,945号;第8,795,965号;第8,865,406号;第8,871,445号;第8,889,356号;第8,895,308号;第8,906,616号;第8,932,814号;第8,945,839号;第8,993,233号;及び第8,999,641号を参照されたい)、操作されたメガヌクレアーゼ再操作ホーミングエンドヌクレアーゼ(engineered meganuclease re-engineered homing endonucleases)、DNAガイドゲノム編集(Gao et al., Nature Biotechnology (2016), doi: 10.1038/nbt.3547、その全体が参照により組み込まれる)、及び合成ゲノミクスの使用を通じて促進される標的化配列変更である。今日の標的化ゲノム編集、新しい育種技術についての別の名称、の主要部分は、改変が意図されるゲノム中の選択された位置にDNA二重鎖切断(DSB)を誘導するための適用である。DSBの方向付けられた修復は、標的化ゲノム編集を可能にする。かかる適用は、変異を生成するため(例えば、標的化変異又は正確な天然の遺伝子編集)並びに遺伝子(例えば、シスジーン、イントラジーン又は導入遺伝子)の正確な挿入に利用され得る。変異を生じる適用は、しばしばSDN1、SDN2及びSDN3等の部位特異的ヌクレアーゼ(SDN)技術とされる。SDN1について結果は、標的化、非特異的遺伝的欠失変異であり:DNA DSBの位置は、正確に選択されるが、宿主細胞によるDNA修復は無作為であり、小さなヌクレオチド欠失、付加又は置換を生じる。SDN2について、SDNは、標的化DSBを生成するために使用され、DNA修復鋳型(1つ又は数個のヌクレオチド変化を除いて標的化DSB DNA配列と同一の短いDNA配列)は、DSBを修復するために使用され:これは、標的化及び予め決定された点変異を目的の所望の遺伝子中に生じる。SDN3に関しては、SDNは、新たなDNA配列(例えば遺伝子)を含有するDNA修復鋳型と共に使用される。技術の結果は、植物ゲノムへのDNA配列の組み込みである。SDN3の使用を最も例示するであろう適用は、シスジェニック、イントラジェニック又はトランスジェニック発現カセットの選択されたゲノム位置での挿入である。これらの技術それぞれの完全な記述は、その全体が参照により組み込まれるthe Joint Research Center (JRC) Institute for Prospective Technological Studies of the European Commissionによって2011年に表題「New plant breeding techniques - State-of-the-art and prospects for commercial development」で作成されたレポートに見出すことができる。
本発明は、Xccに抵抗性であり、緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物を検出及び/又は選択するための方法であって、Xccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の遺伝子移入された配列の存在を検出する、及び第5染色体上の、花蕾球の緑色を付与する主要なQTLの非存在を検出する工程を含む方法も提供する。一部の実施形態では、前記方法は、マーカーBN-0061002及びマーカーBO-0101641によって区切られている染色体領域内に位置付けられている第5染色体上の1つのQTL、及びマーカーBO-0002582及びマーカーBN-0010593によって区切られている染色体領域内に位置付けられている第7染色体上の1つのQTLの存在を検出する工程、並びにマーカーBO-0103554及びマーカーBO-0101638によって区切られている染色体領域内に位置付けられている第5染色体上の主要なQTLの非存在を検出する工程を含む。
好ましくは、第5染色体上に存在する前記QTLは、マーカーBN-0060988及びマーカーBO-0101641によって区切られている染色体領域内に位置付けられている。一部の実施形態では、第5染色体上に存在する前記QTLは、次のマーカー:BN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641マーカーのいずれか1つを増幅することによって同定され得る。好ましくは、第5染色体上に存在する前記QTLは、少なくともマーカーBO-0101676を増幅することによって同定され得る。
好ましくは、第7染色体上に存在する前記QTLは、マーカーBO-0101656及びマーカーBO-0101639によって区切られている染色体領域内に位置付けられている。一部の実施形態では、第7染色体上に存在する前記QTLは、次のマーカー:BO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及び/又はBN-0010593のいずれか1つを増幅することによって同定され得る。好ましくは、第7染色体上に存在する前記QTLは、少なくともマーカーBO-0103553を増幅することによって同定され得る。
好ましくは、第5染色体上の、花蕾球の緑色を付与する前記主要なQTLは、次のマーカー:BO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638のいずれか1つを増幅することによって同定され得る。
好ましくは、植物は、少なくとも対立遺伝子の組合せ、本発明の第1の態様において定義される対立遺伝子の組合せI)が、選択される植物の遺伝子材料試料中に検出される場合に選択される。更に好ましくは、植物は、対立遺伝子の組合せ、本発明の第1の態様において定義される対立遺伝子の組合せII)又はIII)が、選択される植物の遺伝子材料試料中に検出される場合に選択される。
一部の実施形態では、マーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706、BO-0101641、BO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640、BN-0010593、BN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及び/又はBO-0003450の検出は、増幅によって、例えば、各マーカーについて、抵抗性対立遺伝子を増幅するために使用され得る1つのフォワードプライマー、感受性対立遺伝子を増幅するために使用され得る1つのフォワードプライマー及び1つの共通リバースプライマーを使用してPCRによって実施される。特に前記マーカーのそれぞれを増幅するためのプライマーは、Table 5(表5)に記載される配列を有し得る。
好ましい実施形態では、増幅は、実施例において記載される通りである。更に好ましい実施形態では、増幅は、伸長及びアニーリング工程が単一の工程に組み込まれている2工程タッチダウン法を使用して実施される。アニーリング段階で使用される温度は、反応の特異性、それによりDNA鋳型にアニールするプライマーの能力を決定する。タッチダウンPCRは、Taqポリメラーゼ活性化の第1の工程に続く、高いアニーリング温度及び各PCRサイクルで徐々に低下するアニーリング温度を含むタッチダウン工程と呼ばれる第2の工程並びにDNA増幅の第3の工程を含む。タッチダウンの早いサイクルでのより高いアニーリング温度は、非常に特異的な塩基対合だけがDNAとプライマーとの間に生じることを確実にする、このため増幅される第1の配列は、目的の配列である可能性が高い。アニーリング温度は、反応の効率を増加させるために徐々に低下される。高度に特異的な早期のタッチダウンサイクルの際に初めに増幅された領域は、更に増幅され、低い温度で生じる可能性がある非特異的増幅を負かす。
好ましい実施形態では、Taqポリメラーゼ活性化の第1の工程は、90℃から105℃の範囲の加熱条件下で10分間から20分間実施され得る。好ましくは、加熱条件は、92℃から102℃、より好ましくは93℃から98℃の範囲であり、更により好ましくは加熱条件は94℃である。好ましくはTaqポリメラーゼ活性化工程は、10分間から18分間、より好ましくは13分間から15分間実施され、更により好ましくは最初の変性工程は、15分間実施される。好ましい実施形態では、Taqポリメラーゼ活性化工程は、94℃で15分間実施される。
好ましい実施形態では、タッチダウン工程は、90℃から105℃の範囲の高アニーリング温度で、1秒から30秒に続いて、60℃から70℃の範囲のアニーリング温度、15秒から90秒で実施され得る。好ましくはタッチダウン工程は、高アニーリング温度94℃、20秒に続く、アニーリング温度65℃、60秒で実施され得る。タッチダウン工程は、5から25サイクル、好ましくは10サイクルで、35℃から67℃の範囲の最終的なアニーリング温度に至るようにアニーリング温度を1サイクル当たり0.5℃から1℃の間で徐々に低下させて繰り返され得る。好ましくはタッチダウン工程は、高アニーリング温度94℃、20秒に続く、アニーリング温度65℃、60秒で、最終的なアニーリング温度57℃に10サイクル後に至るようにアニーリング温度を1サイクル当たり0.8℃徐々に低下させて実施され得る。
好ましい実施形態では、DNA増幅の第3の工程は、90℃から105℃の範囲の温度、1秒から40秒での第1のラウンドに続く、50℃から70℃の範囲の温度、1秒から90秒での第2のラウンドを用いる2ラウンドで実施され得る。好ましくは第1のラウンドは、92℃から98℃の範囲の温度、15秒から30秒で実施され得る。好ましくは第2のラウンドは、55℃から65℃の範囲の温度、40秒から65秒で実施され得る。更に好ましくは、DNA増幅の第3の工程は、94℃の温度、20秒での第1のラウンドに続く、57℃の温度、60秒での第2のラウンドを用いる2ラウンドで実施され得る。DNA増幅の第3の工程は、20から45サイクル、好ましくは15から35サイクル繰り返され得る。更により好ましくは、DNA増幅第3の工程は、35サイクル繰り返される。
本発明は、本発明の第1の態様によるカリフラワー植物又は本明細書上に開示される方法によって得られる若しくは得ることができる抵抗性植物を、カリフラワー植物、例えばXccに感受性のカリフラワー植物又はXccへの異なるレベルの抵抗性を有するカリフラワー植物と交雑することによって、得られる又は得ることができるハイブリッドカリフラワー植物も対象とする。特に好ましいハイブリッドカリフラワー植物は、雄性不稔又は農学的に関心がある任意の他の形質若しくは表現型を示す植物である。
さらなる態様によれば、本発明は、第5染色体及び/又は第7染色体上の、Xccへの抵抗性を付与する本明細書上に定義されるQTLに連鎖している分子マーカーも提供する。
一部の実施形態では、第5染色体上の、Xccへの抵抗性を付与するQTLに連鎖している前記分子マーカーは、マーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641の1つ若しくは複数、又は本明細書上に記載されるマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641のすべて、又はマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641の組合せである。好ましくは、第5染色体上の、Xccへの抵抗性を付与するQTLに連鎖している前記分子マーカーは、少なくともマーカーBO-0101676である。
一部の実施形態では、第7染色体上の、Xccへの抵抗性を付与するQTLに連鎖している前記分子マーカーは、本明細書上に記載されるマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の1つ若しくは複数、又はマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593のすべて、又はマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の組合せである。好ましくは、第7染色体上の、Xccへの抵抗性を付与するQTLに連鎖している前記分子マーカーは、少なくともマーカーBO-0103553である。
上述のマーカーの配列は、Table 3(表3)及び4(表4)に記載されている。
上述のマーカーの配列は、Table 3(表3)及び4(表4)に記載されている。
Xccに抵抗性であるカリフラワー植物を検出するための、
- 分子マーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641の1つ若しくは複数、又は本明細書上に記載されるマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641のすべて、又はマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641の組合せ、並びに/又は
- 分子マーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の1つ若しくは複数、又はマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593のすべて、又はマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の組合せ
の使用が更に提供される。
- 分子マーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641の1つ若しくは複数、又は本明細書上に記載されるマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641のすべて、又はマーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641の組合せ、並びに/又は
- 分子マーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の1つ若しくは複数、又はマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593のすべて、又はマーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の組合せ
の使用が更に提供される。
好ましくは、前記1つ又は複数の分子マーカーは、マーカーBO-0101676及び/又はマーカーBO-0103553であってよい。
本発明は、第5染色体(表の1番目から7番目のSNP)及び第7染色体(表の8番目から15番目のSNP)上の、本発明によるXccへの抵抗性を付与するQTLと関連する、リストBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706、BO-0101641、BO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593のSNPマーカーの少なくとも1つの、前記QTLと関連する代替分子マーカーを同定するための使用も対象とし、ここで前記代替分子マーカーは、
- 第5染色体上の、マーカーBN-0061002及びマーカーBO-0101641によって、又はマーカーBN-0060988及びマーカーBO-0101641によって区切られている染色体領域中
- 第7染色体上のマーカーBO-0002582及びマーカーBN-0010593によって、又はマーカーBO-0101656及びマーカーBO-0101639によって区切られている染色体領域中
- 本発明の15個のSNPマーカー、すなわちBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706、BO-0101641、BO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の遺伝子座から2メガベース単位未満、
にある。
- 第5染色体上の、マーカーBN-0061002及びマーカーBO-0101641によって、又はマーカーBN-0060988及びマーカーBO-0101641によって区切られている染色体領域中
- 第7染色体上のマーカーBO-0002582及びマーカーBN-0010593によって、又はマーカーBO-0101656及びマーカーBO-0101639によって区切られている染色体領域中
- 本発明の15個のSNPマーカー、すなわちBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706、BO-0101641、BO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の遺伝子座から2メガベース単位未満、
にある。
代替分子マーカーは、前記QTLと0.05未満、好ましくは0.01未満のp値で好ましくは関連している。QTLは、寄託された種子NCIMB 42693又はNCIMB 43442において見出されるものである。
本発明は、ヘテロ接合で又はホモ接合で存在する場合:
- ○ 第5染色体上のマーカーBN-0061002及びマーカーBO-0101641によって、若しくはマーカーBN-0060988及びマーカーBO-0101641によって区切られている
○ 第7染色体上のマーカーBO-0002582及びマーカーBN-0010593によって、若しくはマーカーBO-0101656及びマーカーBO-0101639によって区切られている、又は
○ 本発明の15個のSNPマーカー、すなわちBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706、BO-0101641、BO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の遺伝子座から2メガベース単位未満の
染色体領域中の分子マーカーを同定する工程、並びに
- 前記抵抗性を示す植物から生じた分離集団において、前記分子マーカーがXccへの抵抗性と関連がある又は連鎖しているかどうかを決定する工程、
を含む、Xccへの抵抗性を付与するQTLと関連する分子マーカーを同定するための方法も対象とする。
- ○ 第5染色体上のマーカーBN-0061002及びマーカーBO-0101641によって、若しくはマーカーBN-0060988及びマーカーBO-0101641によって区切られている
○ 第7染色体上のマーカーBO-0002582及びマーカーBN-0010593によって、若しくはマーカーBO-0101656及びマーカーBO-0101639によって区切られている、又は
○ 本発明の15個のSNPマーカー、すなわちBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706、BO-0101641、BO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の遺伝子座から2メガベース単位未満の
染色体領域中の分子マーカーを同定する工程、並びに
- 前記抵抗性を示す植物から生じた分離集団において、前記分子マーカーがXccへの抵抗性と関連がある又は連鎖しているかどうかを決定する工程、
を含む、Xccへの抵抗性を付与するQTLと関連する分子マーカーを同定するための方法も対象とする。
集団は、本発明において記載の通りXccへの抵抗性を示す寄託された種子NCIMB 42693から又はその後代から成長した植物から好ましくは生じる。
本発明によるXccへの抵抗性を付与する、上に述べられる第5及び第7染色体上のQTLは、FLA1-116-02S(NCIMB 42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB 43442)に存在するQTLである。
遺伝的関連又は連鎖は、上に定義される通りであり;好ましくは関連又は連鎖は、好ましくは0.05未満、最も好ましくは0.01未満又はこれより低いp値を有する。
分子マーカー及び抵抗性表現型は、減数分裂の好ましくは90%を超えて、好ましくは95%を超えて一緒に遺伝される。
さらなる態様によれば、本発明は、本明細書上に定義される花蕾球の色を付与するQTLに連鎖している分子マーカーも提供する。
一部の実施形態では、花蕾球の色を付与するQTLに連鎖している前記分子マーカーは、本明細書上に記載されるマーカー:BN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450の1つ若しくは複数、又は本明細書上に記載されるマーカーBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450のすべて、又はマーカーBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450の任意の組合せである。好ましくは、花蕾球の色を付与する前記分子マーカーは、上に定義される第5染色体上の主要なQTLに連鎖しているマーカー、すなわち、マーカーBO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638のいずれか1つ、又はマーカーBO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638のすべてである。
上述のマーカーの配列は、Table 1(表1)に記載されている。
緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物を検出するための、
- 分子マーカーBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450の1つ若しくは複数、又は
- マーカーBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450のすべて、又は
- マーカーBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450の組合せ
の使用が更に提供される。
- 分子マーカーBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450の1つ若しくは複数、又は
- マーカーBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450のすべて、又は
- マーカーBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450の組合せ
の使用が更に提供される。
好ましくは、前記1つ又は複数の分子マーカーは、マーカーBO-0103554、BN-0004457及び/又はBO-0101638である。
本発明は、本発明による花蕾球の色を付与する第1染色体(表の1番目から5番目のマーカー)、第2染色体(表の6番目から8番目のマーカー)、第4染色体(表の9番目及び10番目のマーカー)、第5染色体(表の11番目及び15番目のマーカー)、第6染色体(表の16番目のマーカー)並びに第8染色体(表の17番目及び18番目のSNP)上のQTLと関連する、表BN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450のマーカーの少なくとも1つの、前記QTLと関連する代替分子マーカーを同定するための使用も対象とし、ここで、前記代替分子マーカーは、
- 第1染色体上のマーカーBN-0000623を包含する染色体領域中
- 第1染色体上のマーカーBN-0003844及びマーカーBN-0004384によって区切られている染色体領域中
- 第1染色体上のマーカーBN-0004278を包含する染色体領域中
- 第2染色体上のマーカーBN-0010638及びマーカーBN-0010246によって区切られている染色体領域中
- 第2染色体上のマーカーBN-0009825を包含する染色体領域中
- 第4染色体上のマーカーBN-0001304及びマーカーBN-0001306によって区切られている染色体領域中
- 第5染色体上のマーカーBO-0103554及びマーカーBO-0101638によって区切られている染色体領域中
- 第5染色体上のマーカーBN-0002268及びマーカーBN-0003875によって区切られている染色体領域中
- 第6染色体上のマーカーBN-0003896を包含する染色体領域中
- 第8染色体上のマーカーBN-0002182及びマーカーBO-0003450によって区切られている染色体領域中、並びに/又は
- 本発明の18個のSNPマーカー、すなわちBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450の遺伝子座から2メガベース単位未満
にある。
- 第1染色体上のマーカーBN-0000623を包含する染色体領域中
- 第1染色体上のマーカーBN-0003844及びマーカーBN-0004384によって区切られている染色体領域中
- 第1染色体上のマーカーBN-0004278を包含する染色体領域中
- 第2染色体上のマーカーBN-0010638及びマーカーBN-0010246によって区切られている染色体領域中
- 第2染色体上のマーカーBN-0009825を包含する染色体領域中
- 第4染色体上のマーカーBN-0001304及びマーカーBN-0001306によって区切られている染色体領域中
- 第5染色体上のマーカーBO-0103554及びマーカーBO-0101638によって区切られている染色体領域中
- 第5染色体上のマーカーBN-0002268及びマーカーBN-0003875によって区切られている染色体領域中
- 第6染色体上のマーカーBN-0003896を包含する染色体領域中
- 第8染色体上のマーカーBN-0002182及びマーカーBO-0003450によって区切られている染色体領域中、並びに/又は
- 本発明の18個のSNPマーカー、すなわちBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450の遺伝子座から2メガベース単位未満
にある。
代替分子マーカーは、0.05以下、好ましくは0.01未満のp値を有する前記QTLと好ましくは関連する。QTLは、寄託された種子NCIMB 42693又はNCIMB 43442において見出されるものである。
本発明は、ヘテロ接合で又はホモ接合で存在する場合:
- 染色体領域:
〇 第1染色体上のマーカーBN-0000623を包含する染色体領域中
〇 第1染色体上のマーカーBN-0003844及びマーカーBN-0004384によって区切られている染色体領域中
〇 第1染色体上のマーカーBN-0004278を包含する染色体領域中
〇 第2染色体上のマーカーBN-0010638及びマーカーBN-0010246によって区切られている染色体領域中
〇 第2染色体上のマーカーBN-0009825を包含する染色体領域中
〇 第4染色体上のマーカーBN-0001304及びマーカーBN-0001306によって区切られている染色体領域中
〇 第5染色体上のマーカーBO-0103554及びマーカーBO-0101638によって区切られている染色体領域中
〇 第5染色体上のマーカーBN-0002268及びマーカーBN-0003875によって区切られている染色体領域中
〇 第6染色体上のマーカーBN-0003896を包含する染色体領域中
〇 第8染色体上のマーカーBN-0002182及びマーカーBO-0003450によって区切られている染色体領域中
〇 本発明の18個のSNPマーカー、すなわちBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450、の遺伝子座から2メガベース単位未満
中の分子マーカーを同定する工程、並びに
- 前記抵抗性を示す植物から生じた分離集団において、前記分子マーカーが花蕾球の色と関連がある又は連鎖しているかどうかを決定する工程
を含む、花蕾球の色を付与するQTLと関連する分子マーカーを同定するための方法も対象とする。
- 染色体領域:
〇 第1染色体上のマーカーBN-0000623を包含する染色体領域中
〇 第1染色体上のマーカーBN-0003844及びマーカーBN-0004384によって区切られている染色体領域中
〇 第1染色体上のマーカーBN-0004278を包含する染色体領域中
〇 第2染色体上のマーカーBN-0010638及びマーカーBN-0010246によって区切られている染色体領域中
〇 第2染色体上のマーカーBN-0009825を包含する染色体領域中
〇 第4染色体上のマーカーBN-0001304及びマーカーBN-0001306によって区切られている染色体領域中
〇 第5染色体上のマーカーBO-0103554及びマーカーBO-0101638によって区切られている染色体領域中
〇 第5染色体上のマーカーBN-0002268及びマーカーBN-0003875によって区切られている染色体領域中
〇 第6染色体上のマーカーBN-0003896を包含する染色体領域中
〇 第8染色体上のマーカーBN-0002182及びマーカーBO-0003450によって区切られている染色体領域中
〇 本発明の18個のSNPマーカー、すなわちBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及びBO-0003450、の遺伝子座から2メガベース単位未満
中の分子マーカーを同定する工程、並びに
- 前記抵抗性を示す植物から生じた分離集団において、前記分子マーカーが花蕾球の色と関連がある又は連鎖しているかどうかを決定する工程
を含む、花蕾球の色を付与するQTLと関連する分子マーカーを同定するための方法も対象とする。
集団は、本発明に記載の通りの花蕾球の色を示す寄託された種子NCIMB 42693から又はその後代から成長した植物から好ましくは生じる。
本発明による花蕾球の色を付与する、上に述べられる第1、第2、第4、第5、第6及び第8染色体上のQTLは、FLA1-116-02S(NCIMB 42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB 43442)に存在するQTLである。
遺伝的関連又は連鎖は、上に定義される通りであり;好ましくは関連又は連鎖は、好ましくは0.05未満、最も好ましくは0.01未満又はこれより低いp値を有する。
分子マーカー及び色表現型は、減数分裂の好ましくは90%を超えて、好ましくは95%を超えて一緒に遺伝される。
本発明は、緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物を検出及び/又は選択するための方法であって、第5染色体上の、花蕾球の緑色を付与する主要なQTLの非存在を検出する工程を含む方法も提供する。一部の実施形態では、前記方法は、第5染色体上のマーカーBO-0103554及びマーカーBO-0101638によって区切られている染色体領域内に位置付けられている主要なQTLの非存在を検出する工程を含む。好ましくは、第5染色体上の、花蕾球の緑色を付与する前記主要なQTLは、次のマーカー:BO-0103554、BN-0004457及びBO-0101638のいずれか1つを増幅することによって同定され得る。
好ましくは、植物は、対立遺伝子の組合せ:
A)BO-0103554の対立遺伝子G、BN-0004457の対立遺伝子G及び/若しくはBO-0101638の対立遺伝子G(すなわち、MAC5 QTLの白色対立遺伝子)、
B)BN-0000623の対立遺伝子C、BN-0003844の対立遺伝子T、BN-0002453の対立遺伝子G、BN-0004384の対立遺伝子A、BN-0004278の対立遺伝子C、BN-0010638の対立遺伝子G若しくはA、BN-0010246の対立遺伝子G、BN-0001304の対立遺伝子T若しくはC、BN-0001306の対立遺伝子T又はC、BN-0002268の対立遺伝子T若しくはG、BN-0003875の対立遺伝子G、BO-0103554の対立遺伝子G、BN-0004457の対立遺伝子G、BO-0101638の対立遺伝子A、BN-0003896の対立遺伝子G、BN-0002182の対立遺伝子A及びBO-0003450の対立遺伝子T(すなわち寄託された材料FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)若しくはRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)に対応する植物のゲノムに存在するものと同じ対立遺伝子、又は
C)BN-0000623の対立遺伝子T、BN-0003844の対立遺伝子A、BN-0002453の対立遺伝子C、BN-0004384の対立遺伝子G、BN-0004278の対立遺伝子T、BN-0010638の対立遺伝子G、BN-0010246の対立遺伝子A、BN-0009825の対立遺伝子T、BN-0001304の対立遺伝子T、BN-0001306の対立遺伝子T、BN-0002268の対立遺伝子T、BN-0003875の対立遺伝子G、BO-0103554の対立遺伝子G、BN-0004457の対立遺伝子G、BO-0101638の対立遺伝子G、BN-0003896の対立遺伝子A、BN-0002182の対立遺伝子C及びBO-0003450の対立遺伝子C
が、選択される植物の遺伝子材料試料中に検出される場合に、選択される。
A)BO-0103554の対立遺伝子G、BN-0004457の対立遺伝子G及び/若しくはBO-0101638の対立遺伝子G(すなわち、MAC5 QTLの白色対立遺伝子)、
B)BN-0000623の対立遺伝子C、BN-0003844の対立遺伝子T、BN-0002453の対立遺伝子G、BN-0004384の対立遺伝子A、BN-0004278の対立遺伝子C、BN-0010638の対立遺伝子G若しくはA、BN-0010246の対立遺伝子G、BN-0001304の対立遺伝子T若しくはC、BN-0001306の対立遺伝子T又はC、BN-0002268の対立遺伝子T若しくはG、BN-0003875の対立遺伝子G、BO-0103554の対立遺伝子G、BN-0004457の対立遺伝子G、BO-0101638の対立遺伝子A、BN-0003896の対立遺伝子G、BN-0002182の対立遺伝子A及びBO-0003450の対立遺伝子T(すなわち寄託された材料FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)若しくはRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)に対応する植物のゲノムに存在するものと同じ対立遺伝子、又は
C)BN-0000623の対立遺伝子T、BN-0003844の対立遺伝子A、BN-0002453の対立遺伝子C、BN-0004384の対立遺伝子G、BN-0004278の対立遺伝子T、BN-0010638の対立遺伝子G、BN-0010246の対立遺伝子A、BN-0009825の対立遺伝子T、BN-0001304の対立遺伝子T、BN-0001306の対立遺伝子T、BN-0002268の対立遺伝子T、BN-0003875の対立遺伝子G、BO-0103554の対立遺伝子G、BN-0004457の対立遺伝子G、BO-0101638の対立遺伝子G、BN-0003896の対立遺伝子A、BN-0002182の対立遺伝子C及びBO-0003450の対立遺伝子C
が、選択される植物の遺伝子材料試料中に検出される場合に、選択される。
一部の実施形態では、マーカーBN-0000623、BN-0003844、BN-0002453、BN-0004384、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BO-0103554、BN-0004457、BO-0101638、BN-0003896、BN-0002182及び/又はBO-0003450の検出は、各マーカーについて、抵抗性対立遺伝子を増幅するために使用され得る1つのフォワードプライマー、感受性対立遺伝子を増幅するために使用され得る1つのフォワードプライマー及び1つの共通リバースプライマーを使用してPCRによって実施される。特に前記マーカーのそれぞれを増幅するためのプライマーは、Table 5(表5)に記載される配列を有し得る。
好ましい実施形態では、増幅は、実施例において記載される通りである。更に好ましい実施形態では、増幅は、伸長及びアニーリング工程が上に記載の通り単一工程に組み込まれている2工程タッチダウン法を使用して実施される。
さらなる態様では、本発明は、
(i)キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性のカリフラワーマイクロ小植物体を産生するために、本発明によるカリフラワー植物の単離された細胞又は組織をin vitroで培養する工程、及び
(ii)任意選択で、Xccに抵抗性のカリフラワー植物に発達させるためにカリフラワーマイクロ小植物体をin vivo培養フェーズに更に供する工程
を含む、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性のカリフラワー小植物体又は植物の産生のための方法に関する。
(i)キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性のカリフラワーマイクロ小植物体を産生するために、本発明によるカリフラワー植物の単離された細胞又は組織をin vitroで培養する工程、及び
(ii)任意選択で、Xccに抵抗性のカリフラワー植物に発達させるためにカリフラワーマイクロ小植物体をin vivo培養フェーズに更に供する工程
を含む、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性のカリフラワー小植物体又は植物の産生のための方法に関する。
マイクロ小植物体を産生するために使用される単離された細胞又は組織は、増殖される本発明のカリフラワー親植物から滅菌条件下で得られた外植片である。外植片は、例えば、子葉、胚軸、幹組織、葉、胚、成長点、節、芽、茎頂又はプロトプラストを含む、又はからなる。外植片は、マイクロプロパゲーション(micropropagation)のための培養培地に置かれる前に表面滅菌されてよい。
植物マイクロプロパゲーションにおいて好適に使用され得る条件及び培養培地は、植物栽培の当業者に十分周知であり、例えば、"Plant Propagation by Tissue Culture, Handbook and Directory of Commercial Laboratories, eds. Edwin F George and Paul D Sherrington, Exegetics Ltd, 1984"に記載されている。
マイクロプロパゲーションは、典型的には
(i)腋芽産生:腋芽増殖は、好ましくは最小限のカルス形成でシュートを産生するために、サイトカイニンをシュート培養培地に加えることによって誘導される;
(ii)不定芽産生:培地へのオーキシンの添加は、土壌に移行され得る小植物体を産生するための根の形成を誘導する。代替的に根の形成は、直接土壌に誘導され得る
を含む。
(i)腋芽産生:腋芽増殖は、好ましくは最小限のカルス形成でシュートを産生するために、サイトカイニンをシュート培養培地に加えることによって誘導される;
(ii)不定芽産生:培地へのオーキシンの添加は、土壌に移行され得る小植物体を産生するための根の形成を誘導する。代替的に根の形成は、直接土壌に誘導され得る
を含む。
小植物体は、Xccに抵抗性のカリフラワー植物に発達させるために、ラボ条件下での土壌での栽培、次いで自然の気候への順応に進むことによって、in vivo栽培フェーズに更に供され得る。
本出願を通じて、用語「含む」は、すべての具体的に述べられた特性及び任意選択、追加的な、明記されていないものも包含すると解釈される。本明細書において使用される場合、用語「含む」の使用は、具体的に述べられた特性以外の特性が存在しない(すなわち「からなる」)実施形態も開示する。
種子寄託
本発明によるカリフラワー植物由来の種子(すなわち、FLA1-116-02S植物由来の種子)の試料は、HM.Clause, S.A., Rue Louis Saillant, Z.I. La Motte, BP83, 26802 Portes-les-Valence Cedex, Franceによって、the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure(「ブダペスト条約」)と共にthe National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB), (NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Scotland)の必要事項に従い、満たして、2016年11月17日に受託番号42693で寄託された。
本発明によるカリフラワー植物由来の種子(すなわち、FLA1-116-02S植物由来の種子)の試料は、HM.Clause, S.A., Rue Louis Saillant, Z.I. La Motte, BP83, 26802 Portes-les-Valence Cedex, Franceによって、the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure(「ブダペスト条約」)と共にthe National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB), (NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Scotland)の必要事項に従い、満たして、2016年11月17日に受託番号42693で寄託された。
本発明によるカリフラワー植物由来の種子(すなわち、RSF1-BC3-F3植物由来の種子)の他の試料は、HM.Clause, S.A., Rue Louis Saillant, Z.I. La Motte, BP83, 26802 Portes-les-Valence Cedex, Franceによって、the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure(「ブダペスト条約」)と共にthe National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB), (NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Scotland)の必要事項に従い、満たして、2019年7月22日に受託番号43442で寄託された。
これらの種子の寄託は、HM.Clause, S.A., Rue Louis Saillant, Z.I. La Motte, BP83, 26802 Portes-les-Valence Cedex, Franceによって維持されている。
本発明は、続く図及び実施例によって更に例示される。
1.材料及び方法
1.1.カリフラワー株
緑色カリフラワー株FLAは、ブラッシカ・オレラセアL.変種ボトリティス種に属する。この株は、本発明者らによって、Xccレース1及び/又は4に抵抗性であり、the International Union for the Protection of new Variety of plants (UPOV)、日付2009年4月01日によって編集されたTG/45/7文書(文書の13頁の特徴21)の特徴の表に挙げられている見本変種Alverda及びMinaretの緑色と同様の緑色を収穫熟度で有する花蕾球を有すると同定された。
1.1.カリフラワー株
緑色カリフラワー株FLAは、ブラッシカ・オレラセアL.変種ボトリティス種に属する。この株は、本発明者らによって、Xccレース1及び/又は4に抵抗性であり、the International Union for the Protection of new Variety of plants (UPOV)、日付2009年4月01日によって編集されたTG/45/7文書(文書の13頁の特徴21)の特徴の表に挙げられている見本変種Alverda及びMinaretの緑色と同様の緑色を収穫熟度で有する花蕾球を有すると同定された。
白色カリフラワー株SOL5及びRSTは、ブラッシカ・オレラセアL.変種ボトリティス種に属する。これらの株は、本発明者らによって、Xccレース1及び/又は4に感受性であり、見本変種Aerospace、Aviron又はFreebellの白色と同様の色を収穫熟度で有すると同定された。
1.2.Xcc検査(圃場検査条件)
Xcc接種準備
レース1及び4のXcc株は-80℃で保存した。各株は、LPGA培地を含有するペトリ皿で48時間、26℃で最初に増殖させた。次いで各株を新たなLPGAアガープレートに移し、細菌マットを得るために48時間、26℃で増殖させた。接種準備のために、各株の細菌マットをプールし、細菌108個/mlの最終濃度に調整した。次いで、3滴/LのTween 20を接種物に加えた。
Xcc接種準備
レース1及び4のXcc株は-80℃で保存した。各株は、LPGA培地を含有するペトリ皿で48時間、26℃で最初に増殖させた。次いで各株を新たなLPGAアガープレートに移し、細菌マットを得るために48時間、26℃で増殖させた。接種準備のために、各株の細菌マットをプールし、細菌108個/mlの最終濃度に調整した。次いで、3滴/LのTween 20を接種物に加えた。
植物物質産生
葉8〜12枚が生じたら小植物体を圃場に移植する。各実験のために、感受性基準1つ及び抵抗性基準1つも圃場に移植し、接種する。
葉8〜12枚が生じたら小植物体を圃場に移植する。各実験のために、感受性基準1つ及び抵抗性基準1つも圃場に移植し、接種する。
実験手順及び評価
圃場への植物の移植の1カ月後に、各植物のすべての葉に接種物を噴霧することによって各接種物をそれらに接種した。植物を天然の圃場条件下で成長させ、植物をXcc感染について接種の1カ月から1.5/2カ月後に、次のスケールにより評価した:9=無症状、8=葉の1〜12%に症状、7 =葉の13〜25%に症状、5 =葉の26〜50%に症状、3=葉の51〜75%に症状及び1=葉の>76%に症状。このスコア化により植物は、スコアが9又は8である場合に高度に抵抗性(HR)であると見なされ、植物は、スコアが7である場合に中間の抵抗性(IR)であると見なされ、植物は、スコアが5、3又は1である場合に感受性であると見なされる。
圃場への植物の移植の1カ月後に、各植物のすべての葉に接種物を噴霧することによって各接種物をそれらに接種した。植物を天然の圃場条件下で成長させ、植物をXcc感染について接種の1カ月から1.5/2カ月後に、次のスケールにより評価した:9=無症状、8=葉の1〜12%に症状、7 =葉の13〜25%に症状、5 =葉の26〜50%に症状、3=葉の51〜75%に症状及び1=葉の>76%に症状。このスコア化により植物は、スコアが9又は8である場合に高度に抵抗性(HR)であると見なされ、植物は、スコアが7である場合に中間の抵抗性(IR)であると見なされ、植物は、スコアが5、3又は1である場合に感受性であると見なされる。
1.3. DNA抽出及び遺伝子型判定プロトコール
植物を試料採取し、DNAを磁気ビーズ(NucleoMag(登録商標) 96 Plant)を、ビーズ製造者、Macherey-Nagel社のプロトコールに従って使用して単離した。DNAを60μLのPCRグレード水中に溶出させた。
植物を試料採取し、DNAを磁気ビーズ(NucleoMag(登録商標) 96 Plant)を、ビーズ製造者、Macherey-Nagel社のプロトコールに従って使用して単離した。DNAを60μLのPCRグレード水中に溶出させた。
遺伝子型判定をKASPTM技術を使用して行った。KASP(商標)遺伝子型判定は、各マーカーに特異的であるKASP(商標)アッセイミックスを必要とし、KASP(商標) MasterミックスはLGC社(http://www.lgcgroup.com)で購入した。遺伝子型判定を1536ウエルプレートで実施したことから、KASP V4.0 1X Mastermix 1536 Masterミックスを使用した。
KASP(商標)アッセイミックスは、各マーカーに特異的であり、2つの競合的、対立遺伝子-特異的プライマー及び1つの共通プライマーからなる(Table 2(表2)及び5(表5)を参照されたい)。各対立遺伝子特異的プライマーは、KASP(商標) 1536 Master Mixに存在する2つのユニバーサルFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)カセットの1つに対応する追加的テール配列を組み込んでいる。DNA鎖及び対立遺伝子名付け及び方向付けは、Illumina社(https://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_topbot.pdf)によって開発されたTOP/BOT法に従って行う。
各マーカー及び試料について、1.5μlの1:10希釈DNAを1536ウエルプレートにLGC repliKator(商標) robotを使用してアリコートした。次にDNAを一晩室温で乾燥させた。遺伝子型判定反応をDNA試料当たり0.986μlのアッセイミックス及び0.014μlのKASP(商標) 1536 Master Mixを分注することによって調製した。分注は、LGC Meridian robotを使用して実施した。反応プレートをLGC Fusion3(商標) laser welding systemを使用して更に封をした。
サーマルサイクリングをLGC Hydrocycler(商標)ウォーターバスベースサーマルサイクラーで、次のサーマルサイクリングタッチダウンプログラム:ステージ1(ホットスタートTaq活性化):94℃、15分間、ステージ2(タッチダウン):94℃、20秒間及び65〜57℃、60秒間を10サイクル(65℃を57℃の最終アニーリング/伸長温度に達するように1サイクル当たり0.8℃低下させた)、並びにステージ3(増幅):94℃、20秒間及び57℃、60秒間を35サイクルを使用して実施した。
蛍光測定のためのプレート読み取りをBMG PHERAstarプレートリーダーによって達成した。蛍光データをLGC KlusterCaller(商標)ソフトウェアによって更に分析した。
2.Xccへの抵抗性の緑色カリフラワーから白色カリフラワーへの遺伝子移入
A)Xccに抵抗性の緑色カリフラワーの遺伝的決定論
緑色カリフラワーFLAを白色感受性カリフラワーSOL5と交雑した。得られたF1種子を発芽させ、発芽させた種子から植物を成長させ、生じた植物を、さらなる選択及び育種のためにF2種子/植物を産生するように自家受粉させた。F2植物にXccへの抵抗性についての圃場での病理学的検査を行った。F2集団の各植物を個々にスコア化し、F2集団での形質の分離比は、1つの一遺伝子性顕性遺伝子に対応した。
A)Xccに抵抗性の緑色カリフラワーの遺伝的決定論
緑色カリフラワーFLAを白色感受性カリフラワーSOL5と交雑した。得られたF1種子を発芽させ、発芽させた種子から植物を成長させ、生じた植物を、さらなる選択及び育種のためにF2種子/植物を産生するように自家受粉させた。F2植物にXccへの抵抗性についての圃場での病理学的検査を行った。F2集団の各植物を個々にスコア化し、F2集団での形質の分離比は、1つの一遺伝子性顕性遺伝子に対応した。
次いで、バルク分離分析を、抵抗性バルク対感受性のもので、全ゲノムにわたる384個のSNPを使用して実行した。抵抗性と感受性とを識別する24個のSNPをさらなる分析のために維持した。これら24個のSNPの内、1つは第5染色体上に位置付けられ、8個は第7染色体上に位置付けられた。Xccへの抵抗性との関連についての検査をこれらのSNPに対して実施し、1つの主要なQTLは第7染色体上に位置付けられたが、2個目は第5染色体上に位置付けられたことが確認できた。
F3ファミリーを無作為に選択した200個の新たなF2植物から産生させた。
200個から、153個のF3ファミリーをXcc抵抗性レース1及び4について圃場で評価した。親株FLA及びSOL5は、この検査に含まれていた。FLAは、スコア7を有して中間のレベルの抵抗性を有し、SOL5は、スコア5を有して感受性であった。F3ファミリーは、3から9の間に含まれる抵抗性のスコアを有した。
分離比は、1つの主要な顕性遺伝子の仮説に更に従った。
この集団の遺伝子型判定分析をこの仮説を検証するために更に実行した。
したがって、200個のF2の内の142個のF2植物の遺伝子型判定は、第7染色体上に位置付けられた4個のマーカー(以前同定された8個の内)及び第5染色体上に位置付けられた3個を用いて実施した。これは、これら2つの領域がXccに抵抗性のQTLをそれぞれ保有することを確認できるようにした。マーカーの物理的位置がゲノム中で周知であることから、本発明者らは、9,354,311から42,875,489位の間に含まれる第5染色体上の3,521,178bp幅の領域、及び34,714,403から38,690,572位の間に含まれる第7染色体上の2,773,439bp幅の領域に抵抗性領域を特定できた。
第5染色体上の明確にされた抵抗性領域に位置付けられた8個の追加的マーカーを更に同定し、142個のF2植物の遺伝子型を同定するために使用した。マーカー遺伝子型と表現型との間の関連検査をクラスカル・ワルス統計検定を使用して実施した。各マーカーについて、LODスコアを検査のp値からLOD=-log(p値)として算出し、第5染色体上のマーカーの物理的位置に対してプロットした(図1)。それにより、抵抗性領域を38,928,177bpから39,972,831bp位の間の1,044,654bp幅の領域に精密化した。
第7染色体上の明確にされた抵抗性領域に位置付けられている7個の追加的マーカー(すなわち、BO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640)を更に同定し、142個のF2植物の遺伝子型を同定するために使用した。マーカー遺伝子型と表現型との間の関連検査をクラスカル・ワルス統計検定を使用して実施した。各マーカーについて、LODスコアを検査のp値からLOD=-log(p値)として算出した。それにより、抵抗性領域を36,520,957bpから38,690,572bp位の間の1,550,367bp幅の領域に精密化した。
B)緑色花蕾球色の遺伝的決定
229個のカリフラワー株をゲノムにわたって十分に広がる384個のSNPマーカーを用いて遺伝子型を同定した。これら229個の近交系株の花蕾球色をバイナリー形質:白色又は緑色としてコード化した。関連研究を、緑色花蕾球色形質に連鎖しているマーカーを同定するためにこれらのデータセットについて実施した。
229個のカリフラワー株をゲノムにわたって十分に広がる384個のSNPマーカーを用いて遺伝子型を同定した。これら229個の近交系株の花蕾球色をバイナリー形質:白色又は緑色としてコード化した。関連研究を、緑色花蕾球色形質に連鎖しているマーカーを同定するためにこれらのデータセットについて実施した。
12個の興味深いマーカー(すなわちBN-0003844、BN-0002453、BN-0004278、BN-0010638、BN-0010246、BN-0009825、BN-0001304、BN-0001306、BN-0002268、BN-0003875、BN-0004457、BN-0003896、これらのマーカーの配列についてTable 1(表1)を参照されたい)をさらなる分析のために維持した。これらの12個のマーカーは、緑色花蕾球色の表現型に最も密に連鎖したものであった。マッピング位置情報のおかげで、12個のマーカーが8個の異なるQTLに対応したことが見出され、2個のQTLは第1染色体上に位置付けられ(1個のQTLは、本発明の目的のためにMiC1-2と名付けられ、マーカーBN-0003844及びBN-0002453を包含しており、2個目は、本発明の目的のためにMiC1-3と名付けられ、マーカーBN-0004278を包含している)、2個のQTLは第2染色体上に位置付けられ(1個のQTLは、本発明の目的のためにMiC2-1と名付けられ、マーカーBN-0010638及びBN-0010246を包含しており、2個目は、本発明の目的のためにMiC2-2と名付けられ、マーカーBN-0009825を包含している)、1個のQTLは、本発明の目的のためにMiC4と名付けられ、第4染色体上に位置付けられ、マーカーBN-0001304及びBN-0001306を包含している、2個のQTLは第5染色体上に位置付けられ(1個の主要なQTLは、本発明の目的のためにMAC5と名付けられ、マーカーBN-0004457を包含しており、1個のマイナーなQTLは、本発明の目的のためにMiC5と名付けられ、マーカーBN-0002268及びBN-0003875を包含している)並びに1個のQTLは、本発明の目的のためにMiC6と名付けられ、第6染色体上に位置付けられ、マーカーBN-0003896を包含している。
12個のマーカーの内のこれら5個の最も関連しているマーカーの予測を検証するために、関連研究のためにそれまで使用されていない2個の緑色カリフラワーハイブリッド及び5個の緑色カリフラワー育種株を使用した。5個のマーカーに対応する5個の対立遺伝子は、花蕾球の緑色を予測できるようにするハプロタイプを明確にする。
カリフラワーにおける緑色花蕾球色を予測するために同定したハプロタイプを更に検証するために、数個のFLA x SOL5 DH植物でのバルク分離分析を実施した。各DH植物は、以前、花蕾球色について1から9スケール(1 = SOL5と同様の白色、9=FLAと同様の緑色)で表現型を決定した(目視スコア化)。白色花蕾球DH植物1バルク及び緑色花蕾球DH植物1バルクを384個のSNPを用いて検査した。緑色バルクを白色バルクから識別する5個のSNPを同定し(すなわち、マーカーBN-0004384、BN-0004457、BN-0000623、BN-0002182及びBO-0003450)、さらなる分析のために維持した。これらの5個のSNPは、
- 第1染色体(すなわち、マーカーBN-0003844及びBN-0002453と同じ領域中に位置付けられているマーカーBN-0004384を含むMiC1-2 QTL)及び第5染色体(すなわち、マーカーBO-0101638と同じ領域中に位置付けられているマーカーBN-0004457を含むMAC5 QTL)上の以前強調された領域、
- 本発明の目的のためにMiC1-1と名付けられ、マーカーBN-0000623を包含する第1染色体上の新たな領域、並びに
- 本発明の目的のためにMiC8と名付けられ、マーカーBN-0002182及びBO-0003450によって区切られている第8染色体上の新たな領域
に位置付けられている。
- 第1染色体(すなわち、マーカーBN-0003844及びBN-0002453と同じ領域中に位置付けられているマーカーBN-0004384を含むMiC1-2 QTL)及び第5染色体(すなわち、マーカーBO-0101638と同じ領域中に位置付けられているマーカーBN-0004457を含むMAC5 QTL)上の以前強調された領域、
- 本発明の目的のためにMiC1-1と名付けられ、マーカーBN-0000623を包含する第1染色体上の新たな領域、並びに
- 本発明の目的のためにMiC8と名付けられ、マーカーBN-0002182及びBO-0003450によって区切られている第8染色体上の新たな領域
に位置付けられている。
第8染色体上に同定されたQTLは、最初の関連研究において見出されなかったことから、FLAに特異的であると仮定する。第1及び第5染色体がカリフラワーにおいて緑色花蕾球形質に関与することも確認された。第5染色体では、FLA及びSOL5の間の追加的SNPマーカー多型をDH集団を遺伝子型するために使用した。さらなる分析は、MAC5 QTLに位置付けられたマーカーBO-0103554を花蕾球色に密に連鎖しているとして同定できた。
これらの結果及びXccへの抵抗性について得られたものに関して、第5染色体上で「Xccへの抵抗性」と「花蕾球の緑色」との間に6.1cM>x>4.3cMの遺伝的距離を有する連鎖があることが最終的に見出された。
第5染色体上の主要な≪緑色≫QTL MAC5及びXcc抵抗性≫QTL位置が同定され、両方のQTLの元のF2(実施例1、セクションA)集団における出現率を分析した。密な連鎖により、第5染色体上の両方のQTL(それぞれ、白色及び抵抗性)においてホモ接合状態で正しい対立遺伝子を保有している植物は見出すことはできなかった。
F2集団では、第5染色体上のXcc抵抗性QTLについてヘテロ接合だが、第5染色体上の≪緑色≫QTL MAC5での白色対立遺伝子(SOL5由来)についてホモ接合の1つの植物(FLA-116)が同定された。この植物は、第5染色体上の「緑」色QTL MAC5と第5染色体上の「Xcc抵抗性」QTLとの間の連鎖を切断するための良好な出発点を示した。この植物を自家受粉させ、F3種子を産生した。
95個のF3種子を組換えを選択するためのマーカーを用いて検査した。第5染色体及び第7染色体上の、Xcc QTLに対してホモ接合抵抗性であり、第5染色体上の緑色QTL MAC5についてホモ接合白色である5個の植物を同定し(FLA1-116-02、FLA1-116-38、FLA1-116-51、FLA1-116-62、FLA1-116-81)、自家受粉させた。それによりリンケージドラッグをF3植物において破壊した。これらの選択されたF3植物を種子セットを増加させるために自家受粉させた。F4種子を得て、FLA1-116-02植物の自家受粉から得られたF4種子(すなわち、FLA1-116-02S種子)をNCIMB番号42693で寄託した。それにより本発明者らは、(i)第5染色体及び第7染色体上のXcc抵抗性QTLについてホモ接合状態の抵抗性対立遺伝子、並びに(ii) MAC5 QTLについてホモ接合状態の白色対立遺伝子の存在により、緑色花蕾球を有していないXcc抵抗性植物を得るために管理した。
C)Xcc抵抗性の選ばれた白色遺伝子型への遺伝子移入
並行して、緑色との連鎖を切断することによって、ドナーFLA植物の抵抗性の2つのQTLをRSTと称する選ばれた反復白色株に遺伝子移入するために戻し交雑法を使用した。
並行して、緑色との連鎖を切断することによって、ドナーFLA植物の抵抗性の2つのQTLをRSTと称する選ばれた反復白色株に遺伝子移入するために戻し交雑法を使用した。
緑色カリフラワーFLAを白色感受性カリフラワーRSTと交雑した。生じたF1種子(コードRSF1)を発芽させ、植物を発芽させた種子から成長させ、得られた植物を第1の戻し交雑種子(RSF1 Bc1)を産生するためにRSTと戻し交雑した。37個のBC1植物にマーカー支援戻し交雑(MABC)を行った。2個の植物を選択し(RSF1 Bc1 A及びRSF Bc1 C)、第5染色体及び第7染色体上のXcc QTLに対してヘテロ接合抵抗性/感受性;第5染色体上の緑色QTL MAC5に対するホモ接合白色を同定し;反復バックグラウンドそれぞれ79,41%及び73,53%を有した。これら2つの選択されたBC1植物を、第2の戻し交雑種子(RSF1 Bc2 A及びRSF1 Bc2 C)を産生するために反復RSTを用いて戻し交雑した。RSF1 Bc2 A種子由来の88個の植物及びRSF1 Bc2 C由来の93個の植物をMABCを用いて検査した。RSF1 Bc2 C由来の植物は選択しなかった。しかし、RSF1 Bc2 A種子由来の2個の植物を選択した(RSF1 Bc2 A1、RSF1 Bc2 A2)。これらの2個の植物は、第5及び第7染色体上のXcc QTLについてヘテロ接合であり、白色カリフラワーハプロタイプを有し、95,42%及び94,51%同源(isogeny)であった。これら2個の選択されたBC2植物を第3の戻し交雑した種子(RSF1 Bc3 A1及びRSF1 Bc3 A2)を産生するために反復RSTと戻し交雑し、Bc2F2種子を生じるように自家受粉させた。2個のBc3及びBc2F2の集団は、レース1及び4のXcc抵抗性について圃場で評価した。親株FLA及びRSTをこの検査に含めた。FLAはスコア8で高レベルの抵抗性を有し、RSTは、スコア5で感受性であった。Bc3集団は、5から7の間に含まれる抵抗性のスコアを有した。Bc2F2集団は、7から8の間に含まれる抵抗性のスコアを有した。並行して、RSF1 Bc3 A1由来の101個の植物及びRSF1 Bc3 A2種子由来の81個の植物をマーカー支援選択を用いて検査した。2個の植物を白色カリフラワーハプロタイプ及び2個のFLA Xcc QTLヘテロ接合(RSF1 Bc3 A1A及びRSF1 Bc3 A2A)を用いて選択した。これら2つの選択されたBc3植物をBc3F2種子を産生するために自家受粉させた。2つのBc3F2集団を植物ごとにXcc抵抗性レース1及び4について野外試験で評価した。親株FLA及びRSTをこの検査に含めた。FLAはスコア8で高レベルの抵抗性を有し、RSTは、スコア5で感受性であった。Bc3F2植物は、5から8の間に含まれる抵抗性のスコアを有した。並行して、Bc3自家受粉RSF1 Bc3 A1A由来の91個の植物及びBC3自家受粉RSF1 Bc3 A2A由来の90個の植物をMASを用いて検査した。第5染色体及び第7染色体上のXcc QTLに対してホモ接合抵抗性であり、白色カリフラワーハプロタイプを有する各集団の1個の植物を同定した(RSF1 Bc3 A1A1及びRSF1 Bc3 A2A1)。これら2個の選択されたBc3F2植物を、第5染色体及び第7染色体上のXcc QTLに対して全体にホモ接合抵抗性、並びに白色カリフラワーハプロタイプを有する、Bc3F3種子(RSF1 Bc3 A1A1A及びRSF1 Bc3 A2A1A)を産生するために自家受粉させた。RSF1 Bc3 A1A1A(RSF1-BC3-F3と改名された)種子をNCIMB番号43442で寄託した。
3.エチルメタンスルホネート(EMS)によるカリフラワー種子の遺伝的改変
カリフラワー植物の種子を、種子およそ2000個を0.5%(w/v)又は0.7%のいずれかのEMSの通気した溶液中に24時間、室温での浸漬によってEMSを用いて処置する。
カリフラワー植物の種子を、種子およそ2000個を0.5%(w/v)又は0.7%のいずれかのEMSの通気した溶液中に24時間、室温での浸漬によってEMSを用いて処置する。
1回のEMS当たりおよそ1500個の処置種子を発芽させ、生じた植物を種子を産生するように好ましくは温室で、例えば3月から9月に成長させる。
成熟に続いて、M2種子を採取し、処置ごと変種ごとに1つのプールにバルク化する。M2種子の得られたプールをXccに抵抗性の個々のM2種子及び植物を同定するための出発物質として使用する。
Claims (22)
- キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性であり、緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物であって、(i)Xccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー植物由来の遺伝子移入された配列をそのゲノム中に含み、(ii)花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の主要なQTLをそのゲノム中に含まない、カリフラワー植物。
- 白色花蕾球を有する、請求項1に記載のカリフラワー植物。
- Xccへの前記抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の前記遺伝子移入された配列が、第5染色体上に存在する1つの量的形質遺伝子座(QTL)及び第7染色体上に存在する1つのQTLである、請求項1又は2に記載のカリフラワー植物。
- -第5染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLが、マーカーBN-0061002及びマーカーBO-0101641によって区切られている染色体領域内に位置付けられ、
-第7染色体上に存在する、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLが、マーカーBO-0002582及びマーカーBN-0010593によって区切られている染色体領域内に位置付けられている、請求項3に記載のカリフラワー植物。 - 花蕾球の緑色を付与する第5染色体上の前記主要なQTLが、マーカーBO-0103554及びマーカーBO-0101638によって区切られている染色体領域内に位置付けられている、請求項1から4のいずれか一項に記載のカリフラワー植物。
- Xccへの抵抗性を付与する緑色カリフラワー由来の前記遺伝子移入された配列が、NCIMB受託番号42693で寄託された種子の代表的な試料である株FLA1-116-02S、又は受託番号43442で寄託された種子の代表的な試料であるRSF1-BC3-F3のゲノムに存在する遺伝子移入された配列から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載のカリフラワー植物。
- 前記カリフラワー植物が、植物株FLA1-116-02S(NCIMB受託番号42693)又はRSF1-BC3-F3(NCIMB受託番号43442)の後代である、請求項1から6のいずれか一項に記載のカリフラワー植物。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のカリフラワー植物の単離された細胞。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のカリフラワー植物から得られた植物部分。
- 種子、花蕾球、小房、生殖物質、根、花である、請求項9に記載の植物部分。
- 成長した場合に請求項1から7のいずれか一項に記載のカリフラワー植物を生じる、カリフラワー植物の種子。
- カリフラワー植物を本発明による抵抗性カリフラワー植物と交雑することによって得ることができる、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性であり、緑色花蕾球を有さない、カリフラワー植物のハイブリッド植物。
- キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性であり、緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物を検出及び/又は選択するための方法であって、
- マーカーBN-0061002及びマーカーBO-0101641によって区切られている染色体領域内に位置付けられている、第5染色体上のXccへの抵抗性を付与するQTL、
- マーカーBO-0002582及びマーカーBN-0010593によって区切られている染色体領域内に位置付けられている、第7染色体上のXccへの抵抗性を付与するQTL、並びに
- マーカーBO-0103554及びマーカーBO-0101638によって区切られている染色体領域内に位置付けられている、第5染色体上の花蕾球の緑色を付与するQTL
の存在又は非存在を検出する工程を含み、
(i)第5染色体及び第7染色体上の、Xccへの抵抗性を付与する前記QTLの存在、及び(ii)第5染色体上の、花蕾球の緑色を付与する前記QTLの非存在が、前記カリフラワー植物がキサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性であり、緑色花蕾球を有さないことを示す、方法。 - 緑色花蕾球を有さない、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性のカリフラワー植物を得るための育種プログラムにおける育種パートナーとしての、請求項1から7のいずれか一項に記載の植物の使用。
- - マーカーBN-0061002、BN-0060999、BN-0060988、BO-0101676、BN-0064638、BO-0101706及びBO-0101641の1つ若しくは複数、並びに/又は
- マーカーBO-0002582、BN-0010479、BO-0101656、BO-0101655、BO-0103553、BO-0101639、BO-0101640及びBN-0010593の1つ若しくは複数
である、Xccへの抵抗性を付与する、第5染色体上及び/又は第7染色体上のQTLに連鎖している分子マーカー。 - 請求項1から7のいずれか一項に記載のXccに抵抗性で緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物を成長させる工程を含む、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)が蔓延している環境においてカリフラワー植物の収量を改善するための方法。
- キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)が蔓延している環境においてカリフラワー植物の収量を改善するための方法であって、
a)請求項1から6のいずれか一項に記載のXccに抵抗性で緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物を同定する工程、及び
b)前記抵抗性カリフラワー植物を前記蔓延している環境において成長させる工程
を含む、方法。 - 請求項1から7のいずれか一項に記載のXccに抵抗性で緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物を成長させる工程を含む、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)の蔓延及び/又は伝播から圃場を保護するための方法。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のXccに抵抗性で緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物を成長させる工程を含む、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)が蔓延している環境において、収穫可能な又は生存可能なカリフラワー植物の数を増加させるための方法。
- 圃場におけるXccによる蔓延を管理するための、請求項1から7のいずれか一項に記載のキサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性で緑色花蕾球を有さないカリフラワー植物の使用。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のカリフラワー植物、請求項8若しくは9に記載の植物部分、請求項11に記載の種子、又は請求項12に記載のハイブリッド植物を含む容器。
- (i)キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性のカリフラワーマイクロ小植物体を産生するために、請求項1から6のいずれか一項に記載のカリフラワー植物の単離された細胞又は組織をin vitro培養する工程、及び
(ii)任意選択で、Xccに抵抗性のカリフラワー植物に発達させるためにカリフラワーマイクロ小植物をin vivo培養フェーズに更に供する工程
を含む、キサントモナス・カンペストリスpv.カンペストリス(Xcc)に抵抗性のカリフラワー小植物体又は植物の産生のための方法。
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