DE69937299T2

DE69937299T2 - Neuartige, genetische materialien zur übertragung in den mais

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Publication number: DE69937299T2
Application number: DE69937299T
Authority: DE
Inventors: Mary Wilkes Durham Eubanks
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-08-05
Filing date: 1999-08-05
Publication date: 2008-07-10
Anticipated expiration: 2019-08-06
Also published as: DE69937299D1; AU777855B2; EP1100311A4; EP1100311A1; ATE375081T1; PT1100311E; WO2000007434A1; BR9912736A; NZ510274A; AU5337799A; EP1100311B1; CA2339578A1; US6617492B1; ES2294853T3

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Molekulargenetik und der Pflanzenzüchtung. Genauer gesagt betrifft sie ein Mittel zur Bewegung neuer, stabil vererbter varianter Formen von DNA in Mais (Zea mays L.), in den Vereinigten Staaten auch als Korn (Mais) bezeichnet. Diese neuen DNA-Sequenzen, abstammend von intergenerischer Hybridisierung zwischen östlichem Gamagras (Tripsacum dactyloides L.) und ausdauernder Teosinte (Zea diploperennis Iltis, Doebley und Guzmán) stellen einzigartige Marker zur Unterstützung der Selektion erwünschter Merkmale in Pflanzenzuchtprogrammen bereit, ebenfalls zum Nachweis von Ziel-DNA-Sequenzen bei genetischen Analysen und für die Identifizierung neuer Gene für die Mais-Verbesserung, die die Resistenz gegenüber Insekten-Ungeziefer und Erkrankungen erhöhen können, ebenfalls gegen Trockenperioden-Stresstoleranz, Kältetoleranz, Ausdauer, Kornertrag, Totipotenz, Apomyxis, verbesserten Wurzelsystemen, Toleranz gegenüber wasserbeladenen Erden, Toleranz von hohem Aluminiumgehalt und sauren Erden, verbesserter Kornqualität, erhöhter Nahrungsaufnahme-Qualität und Anpassungsfähigkeit an eine CO₂-angereicherte Atmosphäre.
Hintergrund der Erfindung
Molekulargenetik: Genetik ist die Studie von Genen und vererbbaren Merkmalen in biologischen Organismen. Bei der Pflanzenzüchtung ist das Ziel der Molekulargenetik die Identifizierung von Genen, die erwünschte Merkmale an Erntepflanzen verleihen könnten, und die Verwendung von Molekularmarkern (DNA-Signposts, die eng mit den spezifischen Genen assoziiert sind), um Individuen zu identifizieren, die das Gen oder die Gene von Interesse in Pflanzen tragen (Morris 1998), um die DNA-Sequenzen zu bestimmen und die Genexpression und Funktion zu charakterisieren. Ein genetischer Marker ist ein variantes Allel, das verwendet wird, um eine biologische Struktur oder einen Prozess während des Verlaufs eines Experiments zu markieren. Varianten von DNA und Proteinen werden als Marker in der Molekulargenetik verwendet. Genetische Analysen molekularer Varianten können ein bestimmtes Gen identifizieren, das für einen biologischen Prozess wichtig ist. Mutation ist der Prozess, durch den Nucleotidsequenzen und Gene sich von der allgemein als Wildtyp bezeichneten Referenzform zu einer unterschiedlichen Form verändern und Mutanten sind die Quelle von varianten Genotypen in der genetischen Analyse, die eine Selektion neuer Phänotypen ermöglichen (Griffiths et al. 1993). Mutationen treten auf dem Niveau einer spezifizierten Nucleotidsequenz auf, des Gens (d. h. der DNA-Sequenz) oder des Chromosoms (d. h. der vererbten Packung, in der Einheiten von DNA, die spezifische Nucleotidsequenzen und Gene enthalten, mit Proteinen als Supercoil vorliegen). In einer genetischen Mutation sind die Nucleotide, die das Wildtyp-Allel eines Gens umfassen (d. h. die Referenzform, die an einem bestimmten Lokus existiert) verändert. Bei Chromosomenmutationen verändern sich Segmente von Chromosomen, ganze Chromosomen oder ganze Chromosomensätze durch Inversion, Translokation, Fusionen und Deletionen.
Im Allgemeinen sind Mutationen sehr selten und die meisten neu gebildeten Mutationen sind schädlich. Daten hinsichtlich der Mutationsfrequenz für sieben Gene in Mais stellen eine Basislinie bereit, die die Seltenheit von Mutationen in Mais anzeigt (Stadler 1951). Die Mutationsfrequenz reicht von 0,000492% (d. h. 492 Mutanten aus einer Million Gameten) in dem Rotfarben-(R)-Gen; 0,000106% (d. h. 106 aus einer Million) für den Inhibitor eines R(I)-Gens; 0,000011% (d. h. 11 aus einer Million) für das lila Aleuron (Pr)-Gen; 0,0000024% (d. h. 2,4 aus einer Million) für das „Starchy"-(Su)-Gen; 0,0000022% (d. h. 2,2 aus einer Million) für ein Gelbfarben-(Y)-Gen; 0,0000012% (d. h. 1,2 aus einer Million) für das normale Kern-(Sh)-Gen und 0% (d. h. 0 aus einer Million) für das Wachsgen (Wx).
Da spontane Mutationen selten sind, verwenden Genetiker und Pflanzenzüchter üblicherweise Mutagene (d. h. Mittel, wie Chemikalien und Bestrahlung, um die Frequenz der Mutationsraten zu erhöhen), um variante Formen zu erhalten, die in der genetischen Analyse und Selektion von neuen Varietäten verwendet werden können. Ein anderes Verfahren zur Induktion einer Mutagenese bei Mais ist das Transposon-Tagging, wobei eine Maislinie mit einer Linie gekreuzt wird, die eins von drei Systemen transponierbarer Elemente enthält, die beim Mais angetroffen werden. Wenn ein transponierbares Element sich in ein Gen inseriert, erzeugt es eine Mutation. Die berichteten Mutationsfrequenzen für transponierbare Element-Mutator-Linien variieren von 1 in Tausend bis 1 in einer Million (Chomet 1994). Um eine Mutation unter Verwendung einer dieser mutagenen Linien zu finden, muss ein Züchter ein Minimum von 100.000 Nachkommen einem Screening unterwerfen.
Pflanzenzüchtung: Die konventionelle Pflanzenzüchtung ist die Wissenschaft, die Kreuzungen zwischen Individuen mit unterschiedlichen geneti schen Konstitutionen verwendet. Die resultierende Rekombination von Genen zwischen unterschiedlichen Linien, Familien, Arten oder Gattungen erzeugt neue Hybride, von denen erwünschte Merkmale selektiert werden. Die Pflanzenzüchtung wird durch Kontrolle der Reproduktion erreicht. Da Mais eine sich sexuell reproduzierende Pflanze ist, werden häufig Techniken für eine kontrollierte Bestäubung verwendet, um neue Hybride zu erhalten. Die Kontrolle der Reproduktion beim Mais involviert die kontinuierliche Wiederholung von zwei grundlegenden Verfahren: (1) Bewertung einer Reihe von Genotypen und (2) Selbstbestäubung oder Kreuzung unter den besonders überlegenen Pflanzen, um die nächste Generation von Genotypen oder Nachkommen zu erhalten. Kontrollierte Bestäubungen beim Mais verwenden zwei Verfahren: (1) „Detasseling" und (2) Handbestäubung.
Mais ist ein einhäusiges Gras, das getrennte männliche und weibliche Blüten an derselben Pflanze aufweist. Die männlichen oder Staminatblüten erzeugen Pollen im quastenartigen Aufbau (Tassel) am Apex des Maisstengels und die weiblichen oder Pistillatblüten, die das Korn erzeugen, wenn sie bestäubt werden, werden lateral in den Blattachseln tangentiell zum Stengel getragen. Die Bestäubung wird durch Transfer von Pollen von dem Tassel zu den Seidenfäden bewirkt, die sich von den axillären Pistillatähren erstrecken. Da der Mais durch Wind bestäubt wird, ist eine kontrollierte Bestäubung, wobei Pollen, gesammelt vom Tassel einer Pflanze und per Hand auf den Maisbart derselben oder einer anderen Pflanzen übertragen eine Technik, die bei der Maiszüchtung verwendet wird. Die Schritte, die bei der Herstellung von kontrollierten Kreuzungen und Selbstbestäubungen beim Mais beteiligt sind, sind Standardpraxis (Neuffer 1982) und die Folgenden: (1) die Ähre, die sich aus dem Blattschössling ergibt, wird mit einer Ährenschösslingtasche ein oder zwei Tage vor dem Austreten des Maisbarts bedeckt, um eine Kontamination durch herumfliegende Pollen zu verhindern; (2) vor der Herstellung der Durchführung der Bestäubung wird die Ährenschösslingtasche schnell entfernt und der Maisbart mit einem Messer geschnitten, um eine kurze Bürste zu bilden, dann wird die Tasche sofort wieder über die Ähre platziert; (3) ebenfalls vor der Durchführung der Bestäubung wird der Tassel mit einer Tasseltasche bedeckt, um Pollen zu sammeln; (3) an dem Tag, an dem die Kreuzungen durchgeführt werden, wird die Tasseltasche mit dem gewünschten Pollen zu der Pflanze für die Kreuzung getragen, die Ährenschösslingtasche wird entfernt und der Pollen auf die Maisbartbürste gestäubt, die Tasseltasche wird dann am Platz über dem bestäubten Schössling befestigt, um die sich entwickelnde Ähre zu schützen.
Zea diploperennis (hiernach bezeichnet als Diploperennis) ist eine diploide ausdauernde Teosinte und eine wilde Verwandte des Mais, endemisch für die Gebirge von Jalisco, Mexiko. Diploperennis gehört zur selben Gattung wie Mais, hat dieselbe Chromosomenzahl (2n=20) und kann natürlich damit hybridisieren.
Tripsacum ist ein polyploides, rhizomatöses ausdauerndes Gras, das eine entferntere wilde Verwandte von Mais ist und eine unterschiedliche Chromosomenzahl aufweist (x=18, 2n=36 oder 2n=72). Es ist nicht bekannt, das Tripsacum natürlich fertile Hybride mit Mais oder dem wilden Zeas bildet. Die Nachkommenschaft von (Mais X Tripsacum), die durch künstliche Verfahren erhalten wird, weist 10 Maischromosomen auf und entweder 18 oder 36 Tripsacumchromosomen und sie sind männlich steril. Die weibliche Fertilität kann teilweise unter Verwendung spezieller Techniken wieder hergestellt werden, die die meisten der Tripsacumchromosen eliminieren (Mangelsdorf 1974). Pflanzen, die durch Kreuzung von Tripsacum und Mais (Zea mays L.) erhalten werden, wobei Tripsacum als Pollendonor verwendet wird, haben nicht reduzierte Gameten mit einem kompletten Satz von Zeachromosomen und einen kompletten Satz von Tripsacumchromosomen. Es gibt einen Bericht über eine erfolgreiche reziproke Kreuzung, worin Tripsacum durch Mais bestäubt wurde, wobei Embryo-Kulturtechniken benötigt werden, um den Embryo zur Reife zu bringen und die Pflanzen steril waren (Farquharson 1957). Mais-Tripsacumhybride wurden mit Teosinte gekreuzt, um ein trigenomes Hybrid zu erzeugen, das eine Gesamtzahl von 38 Chromosomen aufweist; 10 von Mais, 18 von Tripsacum und 10 von Teosinte. Die resultierenden trigenomischen Pflanzen waren alle männlich steril und hatten einen hohen Grad einer weiblichen Infertilität (Mangelsdorf 1974; Galinat 1986).
Basierend auf bekannten Kreuzungsfähigkeitsbeziehungen zwischen Zea und Tripsacum und den Ergebnissen der vorherigen Kreuzungen zwischen ihnen konnten Erfolge von Kreuzungen zwischen Zea diploperennis und Tripsacum, die zu lebensfähigen, vollständig fertilen Pflanzen mit Chromosomenzahlen von 2n=20 führten (Eubanks 1995, 1997) nicht vorhergesehen werden.
Eine Reduktion der Chromosomenzahl bei interspezifischen Kreuzungen war basiernd auf dem Stand der Technik unerwartet. Die Fertilität der Pflanzen, die sich aus der Kreuzung auf beiden Wegen mit Tripsacum als Pollendonor und Pollenempfänger durchgeführt ergab, waren basiserend auf dem Stand der Technik ebenfalls unerwartet.
Obwohl die Basischromosomenzahlen von Tripsacum und Zea diploperennis unterschiedlich sind, x=10 bei Zea und x=18 bei Tripsacum, sind ihre jewei ligen Gesamtchromosomenlängen fast gleich. Die Gesamtlänge der 18 Tripsacum dactyloides-Chromosomen beträgt 492,5 μ (Chandravadana et al. 1971) und die Gesamtlänge der 10 Zea diploperennis-Chromosomen 501,64 μ (Pasupuleti und Galinat 1982). Es ist nicht einfach, eine Hybridpflanze zu erhalten, wenn Tripsacum und Diploperennis gekreuzt werden. Hunderte von Bestäubungen sind nötig, um eine lebensfähige Saat zu erhalten und ungefähr die Hälfte der Setzlinge, die keimen, sterben kurz nach der Keimbildung. Wie jedoch durch die Kreuzfertilität und Chromosomenzahl bewiesen, ermöglichen, wenn präzise Ausrichtungen zwischen homologen Regionen der Chromosomen von Tripsacum und Diploperennis auftreten und wo dadurch ein ausreichender Grad einer Paarung erreicht wird, diese gelegentlich den seltenen und erwarteten Erfolg dieser Kreuzung.
Die unerwartete Fertilität der Tripsacum-ausdauernden Teosintehybride und ihrer Kreuzfertilität mit Mais sind von großem Wert, da sie die Möglichkeit für eine direkte Kreuzung des rekombinierten intergenerischen Germplasmas mit Mais bereitstellen. Zusätzlich zur Bereitstellung einer genetischen Brücke für den Import von Tripsacumgenen in Mais stellen Tripsacum diploperennis-Hybriden einen Mechanismus zum Import irgendwelcher neuen Tripsacumgene bereit, die in Mais oder Wild-Zeas nicht angetroffen werden und von de-novo-genetischen Material, das sich von diesen breiten Spezieskreuzungen ergibt, in Mais unter Verwendung traditioneller Pflanzenzüchtungstechniken.
Das DNA-Fingerprinting hat ergeben, dass neue Tripsacum-Allele, die nicht in Mais oder dem wilden Zeas aufgefunden werden und de-novo-Sequenzen, die über die breite Kreuzung neu erzeugt wurden, stabil an die Nachkommenschaft von darauf folgenden Generationen vererbt werden und auf Mais durch Kreuzung von Mais mit Tripsacum-diploperennis, enthaltend die neuen Nucleotidsequenzen und Allele, die für Tripsacum einzigartig sind, übertragen werden können. Für die Zwecke der gegenwärtigen Anmeldung bezieht sich de novo-gentisches Material auf Regionen, wo neue allelische Formen von DNA-Sequenzen wiederholt und zuverlässig erzeugt werden, wann immer Kreuzungen zwischen Tripsacum und Zea diploperennis lebensfähige, fertile Pflanzen erzeugen.

Die Machbarkeit wurde bei Pflanzen demonstriert, die von der Kreuzung von Tripsacum-diploperennis mit Mais abstammten, die eine Resistenz gegenüber dem westlichen Maiswurzelbohrer (Diabrotica virgifera Le Conte) und dem Maisbohrer, eine Toleranz gegenüber Trockenheit und Eigenschaften von ausdauerndem Wachstum zeigten. Eine Untersuchung und Charakterisierung der Assoziation mit anderen Merkmalen, wie einer Reaktion auf hohen Niveaus von atmosphärischem CO₂ befinden sich in Untersuchung. Zitierte Referenzen

U.S. Patent-Dokumente
4,545,146	10/1985	Davis
4,627,192	12/1986	Fick
4,684,612	8/1989	Hemphill et al.
4,737,596	4/1988	Seifert et al.
4,837,152	6/1989	Hemphill und Warshaw
5,059,745	10/1991	Foley
PP 6,906	7/1989	Eubanks
PP 7,977	9/1992	Eubanks
5,330,547	7/1994	Eubanks
PP 9,640	9/1996	Eubanks
5,750,828	5/1998	Eubanks

Andere Veröffentlichungen

Chaganti, R. S. K. 1965. Cytogenetic studies of maize-Tripsacum hybrids and their derivatives. Harvard Univ. Bussey Inst., Cambridge, MA.
Chandravadana, P., W. C. Galinat and B. G. S. Rao. 1971. A cytological study of Tripsacum dactyloides. J. Hered. 62:280–284.
Chomet, P. S. 1994. Transposon tagging with Mutator. In M. Freelilng and V. Walbot (eds.), The Maize Handbook, Springer-Verlag, New York.
Cohen, J. I. and W. C. Galinat. 1984. Potential use of alien germplasm for maize improvement. Crop Sci. 24:1011–1015.
Curtis, H. and N. S. Barnes. 1989. Biology. Worth Publishers, Inc. New York, NY.
Eubanks, M. W. 1995. A cross between two maize relatives: Tripsacum dactyloides and Zea diploperennis (Poaceae). Econ. Bot. 49:172–182.
Eubanks, M. W. 1997. Molecular analysis of crosses between Tripsacum dactyloides and Zea diploperennis (Poaceae). Theor. Appl. Genet. 94:707–712.
Farquharson, L. I. 1957. Hybridization of Tripsacum and Zea. J. Heredity 48:295–299.
Galinat, W. C. 1974. Intergenomic mapping of maize, teosinte and Tripsacum. Evolution 27:644–655.
Galinat, W. C. 1977. The origin of corn. In G. F. Sprague (Hrsg.). Corn and Corn Improvement. Amer. Coc. Agronomy, Madison, WT.
Galinat, W. C. 1982. Maize breeding and its raw material. In W. L. Sheridan (Hrsg.) Maize for Biological Research. University Press, Grand Forks, North Dakota.
Galinat, W. C. 1986. The cytology of the trigenomic hybrid. Maize Genetics Newsletter 60:133.
Gardiner, J. E. H. Coe, S. Melia-Hancock, D. A. Hoisington and S. Chao. 1993. Development of a core RFLP map in maize using an immortalized F₂ population. Genetics 134:917–930.
Griffiths, A. J. F., J. H. Miller, D. T. Susuki, R. C. Lewin, and W. M. Gelbart. 1993. An Introduction to Genetic Analysis, 5^th edition. W. H. Freeman arid Co., New York.
Helentjaris, T., M. Slocum, S. Wright, A. Schaefer and J. Nienhuis. 1986. Construction of genetic linkage maps in maize and tomato using restriction fragment length polymorphisms. Theor. Appl. Genet. 72:761–769.
Jeffreys, A. J., N. J. Royle, W. Wilson and Z. Wong. 1988. Spontaneous mutation rates to new length alleles at tandem-repetitive hypervariable loci in human DNA. Nature 332:278–281.
Kindiger, B. and J. B. Beckett. 1990. Cytological evidence supporting a procedure for directing and enhancing pairing between maize and Tripsacum. Genome 33:495–500.
Kresovich, S., W.F. Lamboy, A. K. Szewc-McFadden, J. R. McFerson, and P.L. Forsline. 1993. Molecular diagnostics and plant genetic resources conservation. Agbiotech News and Information 5(7):255–258.
Lewin, B. 1997. Genes V. Oxford University Press, Oxford, UK.
Maguire, M.P. 1961. Divergence in Tripsacum and Zea chromosomes. Evolution 15:393–400.
Maguire, M. P. 1963. Chromatid interchange in allodiploid maize-Tripsacum hybrids. Can. J. Genet. Cytol. 5:414–420.
Mangelsdorf, P. C. 1974. Corn: Its origin, evolution and improvement. Harvard Univ. Press, Cambridge, MA.
Melchinger, A. E., M. M. Messmer, M. Lee, W. L. Woodman, and K. R. Lamkey. 1991. Diversity and relationships among U. S. maize inbreds revealed by restriction fragment length polymorphismus. Crop Science 31:669–678.
Messmer, M. M., A. E. Melchinger, R. Herrmann, and J. Boppenmaier. 1993. Relationships among early European maize inbreds: II. Comparison of pedigree and RFLP data. Crop Science 33:944–950.
Morris, M. L., Ed. 1998. Maize Seed Industries in Developing Countries. Lynne Rienner Publishers, Inc., Boulder, CO.
Neuffer, M. G. 1982. Growing maize for genetic purposes. In W.L. Sheridan (Hrsg.) Maize for Biological Research. University Press, Grand Forks, North Dakota.
Neuffer, M. G., E.H. Coe and S. R. Wessler, 1997. Mutants of Maize. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Pasupuleti, C. V. and W. C. Galinat. 1982. Zea diploperennis I. Its chromosomes and comparative cytology. Heredity 73:168–170.
Poehlman, J. M. 1986. Breeding Field Crops. 3^rd Ausg. AVI Publ. Co., Inc., Westport, CT.
Reeves, R. G. and A. J. Bockholt. 1964. Modification and improvement of a maize inbred by crossing it with Tripsacum. Crop Sci. 4:7–10.
Smith, O. S. and J. S. C. Smith. 1992. Measurement of genetic diversity among maize hybrids; a comparison of isozymic, RFLP, pedigree, and heterosis data. Maydica 37:53–60.
Stadler, L.J. 1951. Spontaneous mutation in maize. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 16:49–63.
Tantravahi, 1968. Cytology and crossability relationships of Tripsacum. Harvard Univ. Bussey Inst., Cambridge, MA.

Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Screening einer Pflanze bereitgestellt, zur Bestimmung, ob die Pflanze eine Kreuzung zwischen Tripsacum und ausdauernder Teosinte ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Kreuzung eines weiblichen Tripsacum-Elternteils mit einem ausdauernden Teosinte-Pollenelternteil zur Erzeugung von Samen oder Kreuzung eines weiblichen ausdauernden Teosinte-Elternteils mit einem Tripsacum-Pollendonor zur Erzeugung eines Samens; dann
(b) Ernte des in (a) erzeugten Samens; dann
(c) Züchten von Pflanzen aus dem in (b) geernteten Samen; dann
(d) Isolation der gesamten genomischen DNA von den Pflanzen in (c); dann
(e) Verdau der genomischen DNA mit ein bis vier der Restriktionsenzyme, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EcoRI, EcoRV, HindIII und BamHI; dann
(f) Durchsuchen der verdauten genomischen DNA mit ein oder mehr DNA-Markern als Sonden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den nukleären Mais-DNA-Sonden, Mitochondrien-Mais-DNA-Sonden und Tripsacum DNA-Sonden wie unten angegeben; und dann
(g) Bestimmung der Gegenwart von ein oder mehr der folgenden Restriktionsfragmente der folgenden Fragmentgrößen, wobei die Restriktionsfragmente durch die folgenden Molekularmarker-Restriktionsenzym-Assoziationen und die assoziierten Fragmentgrößen gekennzeichnet sind, die aus der Gruppe ausgewählt werden bestehend aus: BNL5.62, EcoRI, 10,3 kb; npi97, HindIII, 3,9 kb; UMC157, EcoRI, 6,5 kb und 3,3 kb; UMC157, HindIII, 5,5 kb; UMC157, BamHI, 14,0 kb, 8,6 kb und 4,5 kb; UMC11, BamHI, 7,0 kb; CSU3, BamHI, 10,0 kb, 7,6 kb und 3,5 kb; UMC67, EcoRI, 19,2 kb; UMC67, BamHI 13,4 kb und 1,6 kb; CSU92, BamHI, 13,3 kb und 7,5 kb; asg62, BamHI, 12,7 kb, 9,7 kb und 6,6 kb; UMC58, HindIII, 3,3 kb; CSU164, EcoRI, 9,0 kb und 7,0 kb; UMC128, HindIII, 6,0 kb; UMC107, EcoRI, 6,3 kb und 5,3 kb; UMC107, HindIII, 19,2 kb; UMC140, EcoRI, 5,0 kb; UMC140, HindIII, 6,5 kb; UMC107, EcoRI, 6,3 kb; adh1, HindIII, 9,4 kb; adh1, BamHI, 9,4 kb; UMC161, HindIII, 3,3 kb; BNL8.29, HindIII, 8,3 kb; UMC53, EcoRI, 9,4 kb, 3,8 kb und 3,0 kb; UMC53, EcoRV, 8,4 kb, 3,8 kb und 3,0 kb; UMC6, EcoRI, 3,8 kb; UMC6, HindIII, 9,4 kb; UMC6, BamHI, 13,2 kb, 12,7 kb und 7,0 kb; UMC61, HindIII, 3,4 kb und 2,8 kb; UMC34, EcoRI, 7,5 kb und 5,4 kb; UMC34, HindIII, 8,8 kb, 6,5 kb und 5,8 kb; UMC135, HindIII, 11,6 kb und 10,8 kb; UMC131, EcoRI, 10,6 kb, 5,8 kb und 4,3 kb; UMC55, EcoRI, 3,9 kb; UMC55, HindIII, 4,3 kb; UMC5, EcoRI, 5,4 kb; UMC5, HindIII, 6,5 kb; UMC49, BamHI, 8,2 kb, 6,0 kb, 4,2 kb und 3,2 kb; UMC36, BamHI, 4,2 kb; UMC32, HindIII, 6,7 kb; asg24, HindIII, 7,2 kb und 6,4 kb; UMC121, EcoRI, 3,7 kb und 3,2 kb; BNL8.35, HindIII, 9,9 kb und 8,7 kb; UMC50, BamHI, 7,8 kb, 6,8 kb, 5,8 kb und 3,8 kb; UMC42, Hin.dIII, 10,4 kb, 8,9 kb, 7,6 kb, 3,7 kb und 3,0 kb; npi247, EcoRI, 8,0 kb; npi247, HindIII, 3,0 kb; UMC10, HindIII, 5,9 kb und 3,0 kb; UMC10, EcoRI, 6,5 kb und 5,5 kb; UMC102, EcoRI, 2,7 kb; BNL6.06, EcoRI, 6,8 kb; BNL5.37, HindIII, 10,3 kb, 5,8 kb und 3,5 kb; npi296, EcoRI, 7,9 kb; UMC3, EcoRI, 2,5 kb und 2,0 kb; npi212, HindIII, 4,3 kb; npi212, BamHI, 5,4 kb; UMC39, EcoRI, 12,2 kb, 9,2 kb, 7,8 kb und 7,1 kb; UMC63, HindIII, 9,5 kb und 4,3 kb; UMC96, HindIII, 11,8 kb, 6,4 kb und 5,5 kb; UMC96, BamHI, 7,5 kb, UMC2, EcoRI, 11,8 kb, 10,4 kb und 8,0 kb; CSU25, HindIII, 4,5 kb und 4,3 kb; agrr115, EcoRI, 8,0 kb und 5,4 kb; agrr115, BamHI, 5,4 kb und 3,5 kb; phi20725, EcoRI, 10,3 kb, 9,7 kb und 7,2 kb; phi20725, HindIII, 1,5 kb; UMC31, EcoRI, 5,8 kb; UMC31, BamHI, 6,5 kb; BNL5.46, HindIII, 13,7 kb, 10,5 kb, 9,7 kb und 5,1 kb; npi386, HindIII, 12,6 kb, 9,3 kb und 8,2 kb; tda62, BamHI, 5,5 kb und 4,8 kb; BNL5.71, EcoRV, 11,3 kb, 6,8 kb und 5,7 kb; BNL5.71, BamHI, 11,3 kb, 6,8 kb und 5,7 kb; UMC156, HindIII, 3,0 kb; UMC66, EcoRI, 10,5 kb und 6,5 kb; UMC66, BamHI, 3,7 kb; UMC19, BamHI, 12,3 kb; UMC104, HindIII, 12,4 kb, 11,6 kb und 7,5 kb; UMC104, BamHI, 9,4 kb; UMC133, HindIII, 10,6 kb, 9,9 kb, 9,2 kb und 7,7 kb; UMC52, BamHI, 8,7 kb, 6,9 kb, 3,8 kb, 3,0 kb und 2,0 kb; BNL15.07, HindIII, 2,9 kb und 2,7 kb; npi409, EcoRI, 9,4 kb; npi409, HindIII, 10,4 kb, 9,0 kb und 3,9 kb; UMC147, HindIII, 16,3 kb, 3,8 kb und 2,4 kb; UMC90, HindIII, 7,8 kb, 2,8 kb und 2,5 kb; UMC90, BamHI, 9,0 kb; UMC27, HindIII, 8,3 kb und 4,5 kb; tda37, BamHI, 8,2 kb und 6,5 kb; UMC43, BamHI, 9,7 kb, 7,3 kb und 5,7 kb; UMC40, BamHI, 7,2 kb, 4,3 kb und 4,0 kb; BNL7.71, HindIII, 10,6 kb; tda62, BamHI, 5,5 kb; UMC68, HindIII, 6,0 kb; phi10017, BamHI, 15,1 kb und 9,5 kb; tda50, BamHI, 8,5 kb; npi373, HindIII, 6,5 kb, 5,6 kb und 3,0 kb; tda204, BamHI, 4,0 kb; npi393, EcoRI, 12,1 kb, 8,5 kb, 7,0 kb und 5,6 kb; UMC65, HindIII, 2,9 kb; UMC46, EcoRI, 6,5 kb und 5,6 kb; asg7, HindIII, 6,3 kb; UMC28, HindIII, 15,8 kb und 11,9 kb; UMC28, BamHI, 10,0 kb, 7,6 kb und 6,6 kb; UMC134, BamHI, 4,7 kb; UMC134, HindIII, 7,5 kb; asg8, HindIII, 10,8 kb, 8,7 kb und 8,4 kb; 02, EcoRI, 9,4 kb; BNL15.40, HindIII, 5,8 kb; UMC116, EcoRI, 9,5 kb; UMC110, BamHI, 10,6 kb, 4,9 kb und 3,9 kb; BNL8.32, HindIII, 8,9 kb, 7,4 kb und 7,1 kb; BNL14.07, EcoRI, 6,4 kb; UMC80, HindIII, 10,6 kb, 8,2 kb und 2,4 kb; BNL16.06, EcoRI, 6,8 kb und 1,9 kb; phi20020, HindIII, 7,8 kb und 6,6 kb; npi114, HindIII, 10,0 kb, 8,8 kb und 6,3 kb; BNL9.11, HindIII, 3,4 kb; UMC103, HindIII, 6,9 kb und 5,7 kb; UMC124, HindIII, 8,0 kb und 7,0 kb; UMC124, BamHI, 6,6 kb und 2,6 kb; UMC120, HindIII, 3,2 kb, 2,3 kb und 1,4 kb; UMC89, EcoRI, 7,3 kb; UMC89, HindIII, 7,3 kb; UMC89, BamHI, 9,5 kb, 6,0 kb, 5,2 kb und 4,5 kb; BNL12.30, EcoRI, 3,5 kb; UMC48, HindIII, 6,2 kb, 5,3 kb, 4,7 kb, 3,5 kb und 2,2 kb; npi268, BamHI, 6,4 kb; phi10005, EcoRI, 15,0 kb; UMC113, EcoRI, 5,9 kb und 5,4 kb; UMC113, BamHI, 12,8 kb, 11,8 kb und 10,5 kb; UMC192, HindIII, 11,4 kb und 6,4 kb; wx (waxy), HindIII, 21,0 kb; CSU147, HindIII, 5,9 kb; BNL5.10, HindIII, 6,1 kb und 4,4 kb; UMC114, BamHI, 12,6 kb, 11,5 kb, 10,0 kb, 8,8 kb, 7,5 kb und 6,5 kb; UMC95, EcoRI, 5,6 kb; UMC95, HindIII, 7,7 kb, 4,8 kb und 4,1 kb; UMC95, BamHI, 15,0 kb und 9,0 kb; CSU61, EcoRI, 8,1 kb und 4,8 kb; BNL7.57, EcoRI, 1,0 kb, BNL7.57, BamHI, 11,6 kb, 5,9 kb und 1,3 kb; CSU54, EcoRI, 14,7 kb und 12,6 kb; phi20075, EcoRI, 7,1 kb; npi285, EcoRI, 12,4 kb, 9,4 kb und 6,0 kb; KSU5, EcoRI, 9,8 kb, 7,6 kb, 6,1 kb, 3,8 kb und 3,5 kb; UMC130, EcoRI, 13,5 kb und 7,0 kb; UMC130, HindIII, 4,8 kb und 3,2 kb; UMC130, BamHI, 3,2 kb; UMC152, HindIII, 12,4 kb, 7,1 kb und 5,6 kb; UMC64, HindIII, 3,3 kb; phi06005, EcoRI, 12,8 kb; UMC163, HindIII, 7,0 kb, 4,8 kb und 2,6 kb; UMC44, HindIII, 9,8 kb, 8,7 kb, 7,2 kb, 5,5 kb und 4,0 kb; BNL10.13, HindIII, 10,8 kb; npi306, HindIII, 7,0 kb; pmt1, HindIII, 2,3 kb; mt2, HindIII, 8,0 kb, 4,2 kb, 2,8 kb und 2,1 kb; pmt5, HindIII, 12,3 kb, 8,1 kb, 3,6 kb, 3,2 kb und 2,5 kb; tda48, HindIII, 8,2 kb; tda53, HindIII, 3,8 kb und 2,2 kb; tda168, EcoRI, 3,6 kb; tda16, HindIII, 4,3 kb und tda17, HindIII, 7,0 kb.

Die Erfindung stellt auch bereit:
Verfahren zur Erzeugung von Hybridmaissamen, der ein oder mehr Restriktionsfragmente enthält, wie oben dargestellt, umfassend die Schritte:

(a) Kreuzung eines weiblichen Tripsacum-Elternteils mit einer Tripsacum-Pollendonorpflanze zur Erzeugung eines Hybridsamens;
(b) Züchten einer Hybridpflanze aus dem Samen bis zur Reife;
(c) Screening der Hybridpflanze zur Bestimmung, ob die Pflanze eine Kreuzung zwischen Tripsacum und ausdauernder Teosinte ist, wobei das obige Verfahren verwendet wird;
(d) Kreuzen der (Tripsacum X ausdauernder Teosinte) oder (ausdauernder Teosinte X Tripsacum) Hybridpflanze mit Mais zur Erzeugung eines Samens; und
(e) Ernten des in (d) erzeugten Samens; ein Verfahren zur Erzeugung einer Hybridmaispflanze, die ein oder mehr Restriktionsfragmente enthält, wie oben dargestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
(a) Erzeugung eines Hybridmaissamens unter Verwendung des obigen Verfahrens und
(b) Züchten des Hybridmaissamens zum Erhalt einer Hybridmaispflanze; und
– ein Verfahren zur Erzeugung eines Derivats, einer Variante, einer Mutante, einer Modifikation, einer zellulären Komponente, einer molekularen Komponente, eines Pollens oder einer Gewebekultur einer Hybridmaispflanze, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
(a) Erzeugung eines Hybridmaissamens unter Verwendung des obigen Verfahrens;
(b) Züchten des Hybridmaissamens zum Erhalt einer Hybridmaispflanze und
(c) Erhalt eines Derivats, einer Variante, einer Mutante, einer Modifikation, einer zellulären Komponente, einer molekularen Komponente, eines Pollens oder einer Gewebekultur aus der Hybridmaispflanze.

Die intergenerischen Hybride, die unter Verwendung der oben erwähnten Verfahren erhältlich sind, sind vollständig fertil und kreuz-fertil mit Mais. Die Hybridpflanzen werden durch ihre Verwendbarkeit als genetische Brücke zur Übertragung von neuen genetischen Materialien in Mais gekennzeichnet und durch ihre erwartete Chromosomenzahl von 2n=20 anstelle der erwarteten 2n=28 oder 2n=46, wenn ein volles, nicht modifiziertes Komplement von ausdauernden Teosinte-haploiden Chromosomen (n=10) und diploiden Tripsacum (n=18) oder tetraploiden Tripsacum (n=36)-Chromosomen auf die resultierende Hybridnachkommenschaft übertragen werden.
Eine intergenerische Hybridpflanze (Tripsacum X ausdauernde Teosinte) oder (ausdauernde Teosinte X Tripsacum) wird mit Mais durch kontrollierte Bestäubung gekreuzt. In der Kreuzung wird der Pollen von (Tripsacum X ausdauernde Teosinte) oder (ausdauernde Teosinte X Tripsacum) in den Maisbart übertragen oder Maispollen wird auf den Maisbart von (Tripsacum X ausdauernde Teosinte) oder (ausdauernde Teosinte X Tripsacum) übertragen.
Hybridsamen, Hybridpflanzen, erzeugt von dem Samen und/oder Gewebekulturen, Varianten, Mutanten, Modifikationen und zelluläre und molekulare Komponenten der Hybridpflanzen, die die neuen genetischen Materialien enthalten, die abstammen von (Tripsacum X ausdauernde Teosinte) oder (ausdauernde Teosinte X Tripsacum), können erhalten werden.
Bei dem Verfahren der Erfindung zur Erzeugung von Hybridmaissaat kann die trigenerische Hybridpflanze, erhalten aus der Kreuzung von (Tripsacum X ausdauernde Teosinte) oder (ausdauernde Teosinte X Tripsacum) mit Mais durch kontrollierte Bestäubung mit Mais oder (Tripsacum X ausdauernde Teosinte) oder (ausdauernde Teosinte X Tripsacum) rück-gekreuzt werden. In der Rückkreuzung wird der Pollen der trigenerischen Hybridpflanze auf den Maisbart von einem der ursprünglichen Elternteile (Tripsacum X ausdauernde Teosinte) oder (ausdauernde Teosinte X Tripsacum) oder Mais übertragen.
Die Erfindung ermöglicht so die Herstellung von Hybridsamen, Hybridpflanzen, erzeugt aus den Samen und/oder Gewebekultur, Varianten, Mutanten, Modifkationen und zelluläre und molekulare Komponenten der Hybridpflanzen, die neue genetische Materialien enthalten, abstammend von (Tripsacum X ausdauernde Teosinte) oder (ausdauernde Teosinte X Tripsacum).
Pflanzen und Pflanzengewebe, erzeugt durch das Verfahren der Kreuzung von Mais mit einem Tripsacum-Diploperennis-Hybrid enthalten neue genetische Materialien und zeigen günstige agronomische Merkmale. Beispielsweise können diese Pflanzen neue Gene für Merkmale, wie Ungeziefer- und Pathogenresistenz, Trockenperiodentoleranz, Kältetoleranz, wasserhaltige Erdentoleranz, verbesserte Kornqualität, verbesserte Nahrungsaufnahme-Qualität, Totipotenz, Ausdauer, Toleranz gegenüber sauren Erden, Toleranz gegenüber Erden mit hohem Aluminiumgehalt, erhöhte Anpassungsfähigkeit an eine mit Kohlendioxid angereicherte Umwelt aufweisen und können in den darauf folgenden Selektionszüchtungsprogrammen verwendet werden, um Hybridmais zu selektieren, der solche Merkmale zeigt.
Für die Zwecke dieser Erfindung werden die folgenden Bezeichnungen definiert, um eine klare und konsistente Beschreibung der Erfindung zu liefern.
Allel: Eines von unterschiedlichen Formen eines Gens, das in einem einzelnen Locus existieren kann.
Autoradiographie: Ein Verfahren, bei dem radioaktive Materialien in zelluläre Komponenten eingebaut werden, dann nah an einen Film oder eine fotographische Emulsion platziert werden, um Muster auf dem Film zu erzeugen, die zu der Stellung der radioaktiven Verbindungen innerhalb der Zelle korrespondieren.
Elektrophorese: Eine Technik zur Abtrennung der Komponenten aus einer Mischung von Molekülen (Proteine, DNAs oder RNAs) in einem elektrischen Feld innerhalb einer Gelmatrix.
Genetische Marker: Allele, die als experimentelle Sonden verwendet werden, um ein Individuum, ein Gewebe, eine Zelle, einen Kern, ein Chromosom oder ein Gen nachzuverfolgen.
Gen: Die fundamentale physikalische und funktionale Einheit der Vererbung, die die Information von einer Generation zur nächsten trägt. Das Pflanzengen ist „eine DNA-Sequenz, von der ein Segment regelmäßig oder konditionell zur gleichen Zeit in einer oder beiden Generationen der Pflanze transkribiert wurde. Es wird verstanden, dass die DNA nicht nur die Exons und Introns des Strukturgens beinhaltet, sondern auch die cis 5'- und 3'-Regionen, worin eine Sequenzänderung eine Genexpression bewirken kann" (Neuffer, Coe and Wessler 1997).
Genotyp: Die allelische Zusammensetzung einer Zelle – entweder der gesamten Zelle oder üblicher für ein bestimmtes Gen oder einen Satz von Genen eines Individuums.
Hybridpflanze: Eine individuelle Pflanze, erzeugt durch Kreuzung von zwei Elternpflanzen von unterschiedlichen Genotypen oder Keimplasmahintergründen.
Locus: Der Platz auf einem Chromosom, wo ein Gen lokalisiert ist.
Molekulargenetik: Die Untersuchung der molekluaren Prozesse, die der Genstruktur und Funktion zugrunde liegen.
Mutagen: Ein Mittel, das die Mutationsrate erhöhen kann.
Mutation: (1) Das Verfahren, das Nucleotidsequenzen, Gene, genetische Elemente oder Chromosomen erzeugt, die sich vom Wildtyp unterscheiden. (2) Die Nucleotidsequenzen, Gene, genetischen Elemente oder Chromosomen, die sich aus einem solchen Prozess ergeben.
Pflanzenzüchtung: Die Anwendung der genetischen Analyse auf die Entwicklung von Pflanzenlinien, die für menschliche Zwecke besser geeignet sind.
Sonde: Definiertes Nucleinsäuresegment, das verwendet werden kann, um spezifische Moleküle zu identifizieren, die die komplementäre DNA- oder RNA-Sequenz tragen, üblicherweise durch Autoradiographie.
Restriktionsenzym: Eine Endonuclease, die spezifische Zielnucleotidsequenzen in der DNA erkennen wird und die DNA an diesen Punkten schneidet; eine Vielzahl dieser Enzyme ist bekannt und sie werden extensiv bei der genetischen Manipulation verwendet.
RFLP: Bezieht sich auf Restriktionsfragmente-Längen-Polymorphismus, wobei es sich um eine spezifische DNA-Sequenz handelt, die sich als Bande einer bestimmten Molekulargewichtsgröße auf einem Southern Blot ergibt, gezeigt mit einer radioaktiv markierten RFLP-Sonde und die als ein Allel eines Gens betrachtet wird.
Southern Blot: Übertragung von elektrophoretisch getrennten Fragmenten der DNA von dem Gel auf eine absorbierende Oberfläche wie Papier oder eine Membran, die dann in eine Lösung eingetaucht wird, enthaltend eine markierte Sonde, die an homologe DNA-Sequenzen binden wird.
Totipotenz: Die Fähigkeit einer Zelle, durch alle Stufen der Entwicklung fortzuschreiten und so eine normale Erwachsenenzelle zu erzeugen.
Wildtyp: Bezieht sich auf eine Referenz und kann einen Organismus, einen Satz von Genen, ein Gen oder eine Nucleotidsequenz bedeuten. Für die Zwecke dieser Anmeldung bezieht sich Wildtyp auf die Eltern der Hybridnachkommenschaft.
Beschreibung der Zeichung
1 ist eine schematische Zeichnung der 10 Bindungsgruppen von Mais. Die offenen Kreise repräsentieren die ungefähre Position der Zentromere. Die markierten Linien zeigen Positionen, wobei die Sonden, die verwendet wurden, um Hybridpflanzen einem DNA-Fingerprinting zu unterziehen, abstammend von einer Kreuzung von Tripsacum dactyloides und Zea diploperennis, wie auch Maispflanzen, gekreuzt mit den Tripsacum-diploperennis-Brückenarten, auf den Maischromosomen lokalisiert sind. Molekulare Marker, die Loci zeigen, wo sich stabile, vererbbare de novo-Allele befinden, sind unterstrichen, und Loci, wo sich stabile, vererbbare neue Allele von Tripsacum befinden, die nicht in Mais oder in wilden Zeas angetroffen werden, sind kursiv dargestellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die zur Identifizierung von de novo-genetischem Material und neuen Tripsacum-Allelen verwendeten Prinzipien und Techniken nehmen eine Schlüsselstellung in der Molekulargenetik ein und werden üblicherweise verwendet, um Erntevarietäten einem Fingerprinting zu unterziehen (Kresovich et al. 1993). Zunächst wird DNA extrahiert und aus Pflanzenproben isoliert; dann wird die DNA in Fragmente geschnitten, wobei Restriktionsenzyme verwendet werden, die an präzisen Nucleotidsequenzen schneiden; die Fragmente werden nach Größe getrennt, d. h. dem Molekulargewicht, und zwar auf einem Agarosegel durch Elektrophorese; die DNA wird dann denaturiert, d. h. in Einzelstränge getrennt und auf einen Nitrozellulosefilter übertragen, der einzelsträngige, jedoch nicht doppelsträngige DNA bindet, ein Verfahren, das als Southern Blot bezeichnet wird. Die Restriktionsfragemente werden auf dem Filter in einem Muster immobilisiert, das ihre Positionen auf dem Agarosegel widerspiegelt. Die Membran wird dann in einer Lösung inkubiert, die multiple Kopien einer radioaktiv markierten Sonde für eine bestimmte DNA-Sequenz enthält, die auf einen bestimmten chromosomalen Locus oder Loci im Maisgenom kartiert wurde; die Sonde hybridisiert an homologe DNA-Sequenzen und die distinkten Bandenmuster, die durch eine bestimmte Restriktionsenzym/Sondenkombination in jeder individuellen Pflanze gebildet werden, können auf einem Autoradiogramm sichtbar gemacht werden. Die Bandenmuster, die einem Barcode ähneln, identifizieren den Genotyp der individuellen Pflanzen präzise. Die durch spezifische Restriktionsenzym/Sondenkombinationen gebildeten Muster werden als Restriktionsfragmentlängen-POlymorphismen (RFLPs) bezeichnet, und sie stellen ausreichende Informationen zur Unterscheidung zwischen Pflanzen bereit, deren genetische Zusammensetzung leicht unterschiedlich sein kann. Diese genetischen Fin gerprint-Techniken ermöglichen die unzweideutige Identifizierung von Genotypen (Melchinger et al. 1991; Messmer et al. 1993). Fingerprinting-Profile werden routinemäßig für eine genetische Identitätsanalyse zur Klassifikation eng verwandter Materialien verwendet, zur Schätzung genetischer Entfernungen zwischen diesen Materialien, zur Bestimmung der Elternschaft und zum Komplementieren konventioneller Pedigree-Aufzeichnungen bei der kommerziellen Hybridproduktion (Smith and Smith 1992).
Da Mais ein diploider Organismus ist, erbt die Nachkommenschaft von Maishybriden ein Allel für ein Merkmal von einem Elternteil und ein anderes Allel für dieses Merkmal vom anderen Elternteil. Beim DNA-Fingerprint eines einzelnen Gens wird dies nicht irgendwo anders auf dem Genom dupliziert, wenn die Nachkommenschaft dasselbe Allel für ein Merkmal von beiden Eltern erbt, es ist homozygot für dieses Merkmal und eine einzelne Bande wird auf dem DNA-Profil unter Verwendung einer molekularen Sonde vorliegen, die die spezifische Region des bestimmten Chromosoms kartiert, auf die das zu untersuchende Merkmal kartiert wurde. Wenn die Nachkommenschaft unterschiedliche Allele von jeder Elternpflanze erbt, wird sie heterozygot an diesem Locus sein und zwei Banden werden im Autoradiogramm nachgewiesen, eine Bande von einem Elternteil und eine unterschiedliche Bande vom anderen Elternteil. An komplexeren Loci, die Genduplikationen involvieren, können multiple Banden beobachtet werden. Im Allgemeinen kann die Nachkommenschaft von zwei Elternteilen durch Vergleich des Bandenmusterprofils identifiziert werden, da die Nachkommenschaft eine Kombination von Banden von beiden Elternteilen zeigt. Manchmal zeigt jedoch die Nachkommenschaft von bekannter Elternschaft eine Bande oder Banden, die in keinem der Elternteile angetroffen werden. Solche de-novo-Banden ergeben sich aus Mutations- oder Rekombinationsereignissen, die zu Veränderungen in den Nukleotidsequenzen führen, so dass sich das Bandenmuster von beiden Eltern unterscheidet (Griffiths et al. 1993). Solche mutierten oder neuen Umanordnungen im genetischen Material ergeben sich durch Vergleichsanalyse der Bandenmuster der Elternpflanzen und der Hybridnachkommenschaft. Banden, die bei der Nachkommenschaft vorliegen und bei keinem der Eltern angetroffen werden, zeigen Regionen des Genoms an, wo sich neues genetisches Material ergeben hat, d. h. Mutationen sind aufgetreten.
Wie oben erwähnt, sind Mutationen selten und sind in den meisten Fällen nachteilig. Allgemein gesprochen, variieren unter allen Organismen die Mutationsraten und sie reichen von 1 in 1.000 bis zu 1. in 1.000.000 Gameten pro Generation, abhängig von dem beteiligten Gen (Curtis and Barnes 1989). Beispielsweise wird erwartet, dass der Mensch mit ungefähr 100.000 Genen zwei mutierte Allele trägt. Die Tripsacum-ausdauernde Teosinte-Hybride sind darin ohne Präzedenzfall, dass ihre DNA-Fingerprints ergeben, dass sie eine extrem hohe Mutationsrate mit de novo-Allelen an 133 von 173 Loci aufweisen. Weiterhin sind die de novo-Allele stabil in darauf folgenden Generationen der Tripsacum-diploperennis-Nachkommenschaft und der Mais X Trisacum-diploperennis-Nachkommenschaft vererbbar. Zusätzlich zu der Seltenheit und den üblicherweise nachteiligen Wirkungen von Mutationen ist ein grundlegender biologischer Grundsatz, dass Mutationen statitisch oder zufällig auftreten (Lewin 1997). In einer Studie spontaner Mutationsraten zu neuen Längen Allelen in Tandem-Repeat-Loci in menschlicher DNA (Jeffreys et al. 1988) ergaben sich Mutationen sporadisch, und es gab keine Clusterbildung von Mutationen innerhalb einer Familie. Geschwister teilten sich nie ein gleiches mutiertes Allel. Daher ist es unerwartet, dass dieselben Mutationen unter Geschwistern oder auch Hybriden unterschiedlicher Eltern auftreten würden. Es ist so bemerkenswert und unerwartet, dass dieselben de novo-Allele wiederholt in der Hybridnachkommenschaft, abstammend von der Kreuzung unterschiedlicher Tripsacum und ausdauernde Teosinte-Elternpflanzen angetroffen werden, und dass diese selben de novo-Allele stabil bei Kreuzungen zwischen Tripsacum-ausdauernde Teosinte-Hybriden und Mais vererbt werden. Diese de novo-Allele stellen eine reiche neue Quelle von variiertem genetischem Material zur Selektion bei der Verbesserung von Mais bereit.
In molekularen Assays, die von Linkage Genetics, Salt Lake City, Utah und Biogenetics, Inc., Brookings, South Dakota, durchgeführt wurden, wurde DNA aus unterschiedlichen F₁-, F₂- und F₃-Hybriden zwischen Tripsacum dactyloides und Zea diploperennis isoliert, den Eltern dieser Hybride W64A und B73 Mais-Inzuchtlinien, wie auch von F₁-, F₂-, F₃- und F₄-Hybriden zwischen Mais und Tripsacum-diploperennis. Das Protokoll für die DNA-Isolierung, den Restriktionsenzym-Verdau, den Southern-Blot, die Sondenhybridisierung und die Analyse von Autoradiogrammen wurde von Helentjaris et al. (1986) beschrieben. Innere Standards bekannter Molekulargewichte und eine Leiter waren in den Gels beinhaltet, um die Genauigkeit der Beschreibung der Bandenmuster im Hinblick auf die Molekulargewichte der Allele zu erleichtern. Fünf unterschiedliche Tripsacum-diploperennis-Hybride wurden einem Fingerprinting unterzogen: (1) Sun Dance, Zea diploperennis 3-7 X Tripsacum dactyloides (2n=72); (2) Tripsacorn, Tripsacum dactyloides (2n=72) X Zea diploperennis 3-3; (3) Sun Star, Zea diploperennis 2-4 X Tripsacum dacty loides (2n=36); (4) Sun Devil, Tripsacum dactyloides (2n=72) X Zea diploperennis; (5) 20A self, Zea diploperennis 2-4 X Tripsacum dactyloides (2n=72). Die Mais-Inzuchtlinien W64A und B73 wurden mit einigen der oben stehenden Tripsacum-diploperennis-Hybride gekreuzt.
Gesamte genomische DNA von Individuen bei einigen der oben erwähnten Linien wurde mit von ein bis vier unterschiedlichen Restriktionsenzymen EcoRI, EcoRV, HindIII und BamI verdaut, auf Southern-Blots übertragen und mit 173 öffentlich zur Verfügung stehenden DNA-Markern einer Sondenbehandlung unterzogen, die eine Majorität von Mais-nukleären DNA-Sonden, kartiert auf die 10 Bindungsgruppen von Mais (Gardiner et al. 1993), sechs Mais-Mitochondrien-Sonden und einigen Tripsacum (tda)-Sonden beinhalten, für die die Loci noch nicht auf dem Maisgenom kartiert wurden. Die molekularen Marker der genetischen Bindungskarte von Mais wurden durch Rekombinationsanalysen, basierend auf dem Beweis der Identität eines Klons, kartiert. So repräsentiert jeder Locus ein Gen basierend auf einer Klon-Identifizierung (Neuffer, Coe und Wessler 1997). Die 173 molekularen Marker, die bei dem DNA-Fingerprinting der Elternspezies, der Tripsacum-diploperennis-Hybride und Mais X Tripsacum-diploperennis verwendet wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. 1 zeigt die Reihenfolge und die ungefähren Stellungen der kartierten Sonden auf den zehn Maischromosomen (vgl. Neuffer, Coe und Wessler 1997). Eine Großzahl der Sonden zeigt Banden, die in keinem der Elternteile einer bestimmten Nachkommenschaft vorlagen. Diese de novo-Banden signalisieren Loci, an denen Mutationen im Prozess der intergenerischen Hybridisierung aufgetreten sind. Ihre ungefähr kartierten Loci auf den 10 Chromosomen von Zea sind in 1 dargestellt, und sie sind in Tabelle 1 durch Unterstreichung angegeben. Es gibt auch Loci, wo Tripsacum-Allele in Tripsacum-diploperennis-Hybriden vorliegen, die in Mais oder dem wilden Zea nicht vorliegen. So sind dies neue Allele, die nun auf Mais über die Tripsacum-ausdauernde Teosinte genetische Brücke übertragen werden können. Diese sind in Tabelle 1 kursiv dargestellt und im Fettdruck in 1 hervorgehoben.
Tabelle 2 listet die ungefähre Größe, d. h. das Molekulargewicht von jeder de novo-Bande pro Restriktionsenzym/Sondenkombination auf, die sich als Ergebnis der mutagenen Wirkung der breiten Kreuzhybridisierung ergeben hat. Tabelle 3 listet die ungefähre Größe der neuen Tripsacum-Allele auf, die in Mais oder dem wilden Zeas nicht angetroffen werden, die nun auf Mais über die Tripsacum-diploperennis-Hybridlinien gemäß der Restriktionsenzym/Sondenkombination zugeführt werden können.
Tabelle 4 identifiziert die mutierten Nucleotidsequenzen und spezifiziert ihre Vererbung in Tripsacum-diploperennis-Hybriden und acht beispielhaften (Mais X Tripsacum-diploperennis)-Linien. Tabelle 5 identifiziert die Nucleotidsequenzen, die Allele von den Tripsacum-Eltern sind, die bei der Erzeugung der Tripsacum-diploperennis-Hybride verwendet wurden und spezifiziert ihre Vererbung in den Tripsacum-diploperennis-Hybriden und acht beispielhaften (Mais X Tripsacum-diploperennis)-Linien. Um zu bestimmen, welche Tripsacum-Allele in den Tripsacum-diploperennis-Hybriden vorlagen, die nicht in anderen Zeas vorlagen, wurden 5 bis 13 Individuen von Populationen von zwei modernen Mais-Inzuchtlinien, B73 und W64A, vier einheimische lateinamerikanische Maisrassen, Nal Tel (Yuc7), Chapalote (Sin), Polio (Col 35 ICA) und Pira (PI44512) und die sechs wilden Zeas, Z. mexicana (PI566683 und PI566688), Z. parviglumis (PI384061 und PI331785), Z. luxurians (PI306615), Z. huehuetenangensis (Ames21880), Z. diploperennis und Z. perennis (Ames 21875) einem DNA-Fingerprinting mit den Sonden in Tabelle 1 und 1 unterzogen. Die Nucleotidsequenzen werden durch Sonden/Restriktionsenzym/Sonden und Molekulargewicht identifiziert.
Die neuen genetischen Materialien, einschließlich der de novo-Allele und neuer Allele von Tripsacum, die in Mais oder dem wilden Zeas nicht angetroffen werden, haben sich als stabil vererbt über drei Generationen von Tripsacum-diploperennis-Hybriden und vier Generationen von Tripsacum-diploperennis-Hybriden, die mit Mais gekreuzt wurden erwiesen. Die neuen Tripsacum-Allele und mutierte Nucleotidsequenzen, ihre Vererbbarkeit in den darauf folgenden Generationen von Tripsacum-diploperennis-Hybriden und ihre Übertragbarkeit auf Mais ist ohne Präzedenzfall und konnte basierend auf dem Stand der Technik nicht erwartet werden. Diese neuen DNA-Sequenzen haben eine Verwendung für die genetische Analyse von Zea und eine Selektion neuer varianter Allele, die Merkmale wie Insekten- und Erkrankungsresistenz, Trocken-Perioden-Stresstoleranz, Kältetoleranz, Ausdauer, erhöhten Kornertrag, Totipotenz, Apomyxis, bessere Wurzelsysteme, Toleranz gegenüber wasserhaltigen Erden, Toleranz von hohem Aluminiumgehalt und sauren Erden, verbesserte Kornqualität und verbesserte Nahrungsaufnahme-Qualität verstärken können. Neue Merkmale, die von diesen Mutationen abstammen oder neue Tripsacum-Gene können erfolgreich bei darauf folgenden Selektions-Zuchtprogrammen für die Maisverbesserung verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch Kreuzung von Tripsacum dactyloides und Zea diploperennis durchgeführt. Die Kreuzungen werden unter Verwendung von Standardpflanzen-Zuchttechniken für kontrollierte Bestäubun gen, die auf dem Gebiet bekannt sind, durchgeführt. Einige Tripsacum-diploperennis-Hybridpflanzen, die ausdauernd sind, und die sich asexuell, wie auch durch Samen reproduzieren, wurden in den folgenden Pflanzenpatenten beschrieben: PP Nr. 9,640, erteilt am 3. September 1996; PP Nr. 7,977, erteilt am 15. September 1992 und PP Nr. 6,906, erteilt am 4. Juli 1989. U.S. Patent Nr. 5,330,547 , erteilt am 19. Juli 1994 und U.S. Patent Nr. 5,750,828 , erteilt am 12. Mai 1998, beschreiben ein Verfahren zur Verwendung von Tripsacum-diploperennis-Hybriden, um dem Mais eine Maiswurzelbohrer-Resistenz zu verleihen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Erhalt von neuen genetischen Materialien bereit, einschließlich de novo mutierter Nucleotidsequenzen und neuer Allele von Tripsacum, die in Mais oder dem wilden Zeas nicht angetroffen wurden, durch Erzeugung von Hybridpflanzensamen, umfassend die Schritte von (a) Bestäubung einer Tripsacumart (z. B. Tripsacum dactyloides), dem weiblichen Elternteil mit Pollen von einer ausdauernden Teosinteart (z. B. Zea diploperennis), dem männlichen Elternteil oder der Bestäubung einer ausdauernden Teosinteart (z. B. Zea diploperennis) als weiblichem Elternteil mit Pollen von einer Tripsacumart (Z. B. Tripsacum dactyloides) zur Erzeugung von Samen; dann (b) Ernte der erzeugten Saat.
Dieses Verfahren erzeugt eine Hybridsaat, wovon eine Hybridpflanze, enthaltend neue genetische Materialien, gezüchtet werden kann, und von Hybridpflanzen, enthaltend neue genetische Materialien, können Gewebekulturen hergestellt werden. Zusätzlich kann Pollen, erzeugt von der Hybridpflanze, enthaltend das neue genetische Material, gesammelt werden.
Die Bezeichnung „Pflanze", wie in dieser Anmeldung verwendet, bezieht sich auf die gesamte Pflanze wie auch ihre Bestandteile, z. B. Blüten, Wurzeln, Früchte, Stengel, Rhizomen, Pollen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Erzeugung von Hybridmais-Saat bereit, enthaltend neue genetische Materialien, umfassend die Schritte von (a) Kreuzung einer Tripsacum-Pollen-Empfängerpflanze mit einer ausdauernden Teosintepollendonorpflanze zur Erzeugung von (Tripsacum X ausdauernde Teosinte), einer ausdauernden Teosinte-Pollen-Empfängerpflanze mit einer Tripsacum-Pollen-Donorpflanze (ausdauernde Teosinte X Tripsacum) zur Erzeugung eines Hybridsamens; dann (b) Züchtung der (Tripsacum X ausdauende Teosinte) oder (ausdauernde Teosinte X Tripsacum) Hybridpflanze aus dem Samen zur Reife; dann (c) Kreuzung der (Tripsacum X ausdauernde Teosinte) oder (ausdauernde Teosinte X Tripsacum) Hybridpflanze mit entweder einem Mais-Pollenempfänger oder einer Mais-Pollen-Donorpflanze zur Erzeugung von Samen und (d) Ernte des erzeugten Samens.
Dieses Verfahren führt zur Produktion von Hybridmaissamen und Hybridmaispflanzen, enthaltend neue genetische Materialien, woraus Gewebekulturen hergestellt werden können. Pflanzenzuchttechniken und Gewebekulturtechniken, wie hier beschrieben, sind bekannt und können auf eine dem Fachmann auf dem Gebiet bekannte Weise durchgeführt werden. Siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 4,737,596 für Seifert et al., mit dem Titel „Hybrid Maize Plant and Seed"; U.S. Patent Nr. 5,059,745 für Foley, mit dem Titel „Hybrid Maize Line LH195"; U.S. Patent Nr. 4,545,146 für Davis, mit dem Titel „Route to Hybrid Soybean Production"; U.S. Patent Nr. 4,627,192 für Fick, mit dem Titel „Sunflower Products and Methods for their Production", und U.S. Patent Nr. 4,837,152 und 4,684,612 , mit dem Titel „Process for Regnerating Soybeans"; U.S. Patent Nr. 5,330,547 und 5,750,828 für Eubanks, mit dem Titel „Methods and Materials for Conferring Tripsacum Genes in Maize".
In Tripsacum-Blütenständen werden die Staminat-(d. h. männlichen) Blüten und Pistillat-(d. h. weiblichen) Blüten auf einer einzelnen Spitze (spike) erzeugt, wobei die männlichen Blüten von den weiblichen gestützt werden. Wenn Tripsacum den Blütenstand aussendet, werden die Staminatblüten abgebrochen und lassen nur die weiblichen Blüten auf der Spitze zurück, die dann von einer Bestäubungstasche bedeckt wird, d. h. der Standardähren-Schösslingtasche für Mais, um sie vor einer Kontamination durch unerwünschte Pollen zu beschützen. Die ausdauernden Teosinte männlichen und weiblichen Blüten treten in getrennten Teilen der Pflanze auf. Die Staminat-Blüten werden in dem Tassel getragen, die sich am Apex des Stängels ergibt; währenddessen treten die Pistillat-Blüten in einzelreihigen Spitzen auf, getragen auf lateralen Zweigen des Stängels. Wenn die ausdauernde Teosinte ihre Tassel erzeugt, werden diese mit einer Bestäubungstasche bedeckt. Wenn sie damit beginnen, die Pollen abzuwerfen, wird die Tasche entfernt und der Pollen entnommen, um die Tripsacumpflanzen zu bestäuben. Zu diesem Zeitpunkt werden die Taschen, die die Tripsacum-Pistillatblüten bedecken, entfernt und die ausdauernden Teosintepollen aus der Tasche auf den Maisbart geschüttelt. Der Tripsacum-Blütenstand wird wiederum mit einer Bestäubungstasche direkt nach der Bestäubung bedeckt, die Tasche wird so geschlossen, dass sie auf der Spitze verbleibt, bis die Saat gereift ist. Bei Reife, ungefähr 45 Tage später, wird die Saat geerntet. Sobald reife Saat von der Kreuzung erhalten wurde, wird sie gepflanzt und die Pflanzen von der Saat, die keimen, werden in einer Wachstumskammer, in einem Gewächshaus oder auf dem Feld gezüchtet. Kontrollierte Kreuzungen werden am Besten in einem Gewächshaus oder einer Wachstumskammer durchgeführt, wo Pflanzen isoliert gehalten werden, um eine Kreuzkontamination zu verhindern, und es gibt kein Problem damit, dass Taschen durch die Wetterbedingungen beschädigt werden.
Dieses Verfahren kann alternativ verwendet werden, um die Pflanzen mit ausdauernder Teosinte als weiblichem Elternteil zu kreuzen. Bei dieser Ausführungsform werden alle Tassel, d. h. männliche Blüten, von der ausdauernden Teosintepflanze entfernt, sobald sie auftreten und die Ähren, d. h. die weiblichen Blüten, werden mit Bestäubungstaschen bedeckt. Anstelle einer Entfernung der männlichen Tripsacumblüten werden die Spitzen intakt gelassen und mit einer Bestäubungstasche bedeckt, um Tripsacumpollen zu sammeln. Der Pollen wird auf die Diploperennis-Ähren aufgebracht, die dann direkt mit einer Bestäubungstasche bedeckt werden, die fest mit Klammern befestigt wird, um sicherzustellen, dass sie versiegelt bleibt, bis die Saat gereift ist, ungefähr 45 Tage nach der Bestäubung, zu welchem Zeitpunkt die Saat geerntet wird.
Als nächstes werden dieselben Schritte, wenn (Tripsacum X ausdauernde Teosinte) oder (ausdauernde Teosinte x Tripsacum) zu blühen beginnen, wie oben beschrieben verwendet, um das Hybrid mit Mais zu kreuzen. Um auf Mais zu kreuzen, werden, sobald die Maispflanzen Ähren zu produzieren beginnen und bevor der Maisbart auftritt, die Ähren mit einer Ährenschösslingtasche bedeckt. Pollen, der von (Tripsacum X ausdauernde Teosinte) oder (ausdauernde Teosinte X Tripsacum) gesammelt wurde, wird auf den Maisbart der Maisähren aufgebracht. Die Ähren werden dann wiederum mit einer Ährenschösslingtasche bedeckt und eine große Bestäubungstasche wird um den Stängel gewickelt und mit einer Klammer gesichert. Die Ähren bleiben bedeckt, bis sie die Reife erreichen, was etliche Wochen später ist, zu welchem Zeitpunkt die Ähren geerntet werden.
Um das (Tripsacum X ausdauernde Teosinte) oder (ausdauernde Teosinte X Tripsacum) Hybrid mit Maispollen zu bestäuben, wird der Tassel der Maispflanze mit einer großen Bestäubungstasche bedeckt, und zwar ein oder zwei Tage vor der Sammlung. Pistillat-Blüten von Tripsacum-diploperennis-Hybridpflanzen haben häufig Stamintatspitzen oberhalb der weiblichen Blüten, wie beschrieben für Tripsacum. Wann immer Tripsacum-ausdauernde Teosinte-Pflanzen durch eine andere Pflanze bestäubt werden sollen, werden alle Staminatspitzen entfernt, sobald die Ähren heraustreten, um die Möglichkeit der Selbstbestäubung zu verhindern. Die Pistillatblüten des Hybrids werden mit einer Ährenschösslingtasche bedeckt, sobald sie auf der Pflanze zu erscheinen beginnen, jedoch bevor der Maisbart auftritt. Pollen, der von Mais gesammelt wurde, wird auf diesen Maisbart der weiblichen Hybrid-Spitzen aufgebracht, die dann direkt mit einer Ähren-Schösslingtasche bedeckt werden, die zugeklammert wird. Die Ähren bleiben bedeckt, bis sie die Reife erreichen, was ungefähr 45 Tage später ist, und dann wird der Samen geerntet.
Pflanzen, die von allen oben beschriebenen Kreuzungen erhalten werden, sind männlich und weiblich fertil, sind miteinander kreuzfertil, sind kreuzfertil mit Mais und tragen neues genetisches Material, d. h. neue Allele von Tripsacum, die weder in Mais noch in wildem Zeas vorkommen und de novo-Allele, abstammend von Mutationen, die sich beim Prozess der intergenerischen Hybridisierung ergaben, identifiziert in DNA-Fingerprints unter Verwendung von 173 unterschiedlichen molekularen Sonden, verteilt über die zehn Bindungsgruppen von Mais.

Die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen illustrieren die Erfindung. Tabelle 1: Liste von molekularen Maissonden, die für einen Fingerprint von Hybrid- und Elternpflanzen von Tripsacum, Zea diploperennis, Tripsacumdiploperennis-Hybriden, Mais und Mais-Tripsacum-Diploperennis-Hybriden verwendet wurden.

Chromosom	1	2	3	4	5
Sonde	BNL5.62	UMC53	UMC32	agrr115	npi409
	npi97	UMC6	asg24	phi20725	UMC147
	UMC157	UMC61	UMC121	UMC87	UMC90
	UMC76	UMC34	BNL8.35	UMC31	UMC107
	UMC11	UMC135	UMC50	UMC55	UMC27
	asg45	UMC131	UMC42	BNL5.46	tda66
	CSU3		npi247	npi386	UMC43
	UMC167		UMC97	UMC42	tda37
	UMC67	UMC55	UMC10	tda62	UMC43
	CSU92		UMC102	BNL5.71	UMC40
	asg62	UMC5	BNL6.06	UMC156	BNL7.17
	UMC58		BNL5.37	UMC66	BNL5.71
	CSU164		npi296	UMC19	tda62
	UMC128	tda66	UMC60	UMC104	UMC54
	UMC129		UMC3	UMC133
	UMC107	UMC4	npi212	UMC15	UMC68
	UMC140	UMC49	UMC39	UMC52	UMC104
	adh1	UMC36	UMC15	BNL8.23	php10017
	UMC161		UMC63	BNL15.07
	BNL8.29		UMC96
	BNL6.32		UMC2
			CSU25
Chromosom	6	7	8	9	10
Sonde	UMC85	asg8	npi114	phi10005	phi20075
	tda50	O2	BNL9.11	UMC113	BNL3.04
	npi373	BNL15.40	UMC103	UMC192	npi285,
	tda204	UMC5	UMC124	wx	KSU5
	UMC59	UMC116	tda52	CSU147	UMC130
	npi393	tda37	tda164	BNL5.10	UMC64
	UMC65	UMC110	UMC32	UMC114	UMC152
	tda51	tda66	UMC120	UMC95	phi06005
	UMC21	NL8.32	UMC89	CSU61	tda205
	UMC46	BNL14.07	BNL12.30
	UMC132	UMC80	UMC30	NL7.57,	UMC163
	asg7	BNLX16.06	UMC48	BNL5.09	UMC44
	UMC28	phi20020	UMC53	CSU54	NL10.13
	UMC62		npi268		npi306
	UMC134		npi414	UMC94
			UMC7
			UMC3

Andere Sonden

von Mitochondrien abstammend	unbekannter Lokus
Probe	pmt1	tda16
	pmt2	tda17
	pmt3	tda48
	pmt4	tda53
	pmt5	tda80
	pmt6	tda168
		tda250

Tabelle 2: Ungefähre Größe der de novo-Restriktionslängen-Fragment-Polymorphismen pro Enzym/Sondenkombination.

Restriktionsenzym
Sonde	EcoRI	HindIII	BamHI	EcoRV
Chromosom 1				-
BNL5.62	10.3 Kb	-	-	-
npi97	-	3.9 Kb	-	-
UMC157	6.5 Kb	5.5 Kb	14.0 Kb	-
	3.3 Kb		8.6 Kb
			4.5 Kb
UMC11	-	-	7.0 Kb	-
CSU3	-	-	10.0 Kb	-
			7.6 Kb
			3.5 Kb
UMC67	19.2 Kb	23.1 Kb	13.4 Kb –	-
			11.0 Kb
			1.6 Kb
CSU92	-	-	13.3 Kb –	-
			7.5 Kb
asg62	-	-	12.7 Kb –	-
			9.7 Kb
			6.6 Kb
UMC58	15.3 Kb	3.3 Kb	-	-
CSU164	9.0 Kb	-	-	-
	7.0 Kb			-
UMC128	-	6.0 Kb	-	-
UMC107	6.3 Kb	19.2 Kb	-	-
	5.3 Kb			-
UMC140	23.0 Kb	6.5 Kb	-	-
	9.0 Kb			-
	5.0 Kb			-
adh1	-	9.4 Kb	9.4 Kb	-
UMC161	-	3.3 Kb	15.3 Kb	-
			8.0 Kb	-
BNL8.29	-	9.3 Kb	-	-
		8.3 Kb		-
Chromosom 2
UMC53	9.4 Kb	-	-	3.8 Kb
				3.0 Kb
UMC6	3.8 Kb	9.4 Kb	15.3 Kb	-
			13.2 Kb
			12.7 Kb
			10.0 Kb
			7.0 Kb
UMC61	-	3.4 Kb	-	-
		2.8 Kb
UMC34	7.5 Kb	8.8 Kb	9.4 Kb	-
	5.4 Kb	6.5 Kb
		5.8 Kb
UMC135	-	11.6 Kb	-	-
		10.8 Kb
UMC131	10.6 Kb	-	-	-
	5.8 Kb
	4.3 Kb
UMC55	3.9 Kb	4.3 Kb	-	-
UMC5	5.4 Kb	6.5 Kb	-	-
UMC49	-	-	8.2 Kb	-
			6.0 Kb
			4.2 Kb
			3.2 Kb
UMC36	-	-	4.2 Kb	-
Chromosom 3
UMC32	5.3 Kb	6.7 Kb	-	-
asg24	-	7.2 Kb	-	-
		6.4 Kb
UMC121	3.7 Kb	-	-	-
	3.2 Kb
BNL8.35	-	9.9 Kb	-	-
		8.7 Kb
UMC50	-	-	6.8 Kb	-
			3.8 Kb
UMC42	-	10.4 Kb	-	-
		8.9 Kb
		3.7 Kb
		3.0 Kb
npi247	8.0 Kb	3.0 Kb	-	-
UMC10	6.5 Kb	5.9 Kb	-	-
	5.5 Kb	3.0 Kb
UMC102	2.7 Kb	-	-	-
BML6.06	6.8 Kb	-	-	-
BNL5.37	-	10.3 Kb	-	-
		5.8 Kb
		3.5 Kb
npi296	7.9 Kb	-	-	-
UMC3	2.5 Kb	-	-	-
	2.0 Kb
npi212	-	4.3 Kb	5.4 Kb	-
UMC39	12.2 Kb	-	-	-
	9.2 Kb
	7.8 Kb
	7.1 Kb
UMC63	-	9.5 Kb	-	-
		4.3 Kb
UMC96	-	11.8 Kb	7.5 Kb	-
		6.4 Kb
		5.5 Kb
UMC2	11.8 Kb	-	-	-
	10.4 Kb
	8.0 Kb
CSU25	-	4.6 Kb	-	-
		4.3 Kb
Chromosom 4
agrr115	8.0 Kb	19.2 Kb	5.4 Kb	-
	5.4 Kb		3.5 Kb	-
phi20725	10.3 Kb	1.5 Kb	-	-
	7.2 Kb
UMC31	5.8 Kb	-	6.5 Kb	-
UMC55	3.9 Kb	4.3 Kb	-	-
HNL5.46	-	13.7 Kb	-	-
		10.5 Kb
		9.7 Kb
		5.1 Kb
npi386	-	9.3 Kb	-	-
		8.2 Kb
UMC42	-	19.2 Kb	-	-
		10.3 Kb
		8.9 Kb
		3.7 Kb
		3.0 Kb
tda62	-	-	5.5 Kb	-
BNL5.71	-	-	-	11.3 Kb
				6.8 Kb
				5.7 Kb
UMC156	-	3.0 Kb	-	-
UMC66	10.5 Kb	-	3.7 Kb	-
UMC19	-	-	12.3 Kb	-
UMC104	-	12.4 Kb	-	-
		11.6 Kb
		7.5 Kb
UMC133	-	10.6 Kb	-	-
		9.9 Kb
		9.2 Kb
		7.7 Kb
UMC52	-	-	8.7 Kb	-
			6.9 Kb
			3.8 Kb
			3.0 Kb
			2.0 Kb
SNL15.07	-	2.9 Kb	-	-
		2.7 Kb
Chromosom 5
npi409	9.4 Kb	10.4 Kb	19.2 Kb	-
		9.0 Kb
		3.9 Kb
		3.0 Kb
UMC147	-	16.3 Kb	-	-
		3.8 Kb
		2.4 Kb
UMC90	-	2.8 Kb	9.0 Kb	-
		2.5 Kb
		1.6
UMC107	6.3 Kb	-	-	-
UMC27	-	4.5 Kb	6.5 Kb	-
tda37	-	-	8.2 Kb	-
			6.5 Kb
UMC43	-	-	9.7 Kb	-
			7.3 Kb
			9.7 Kb
UMC40	-	-	7.2 Kb	-
			4.3 Kb
			4.0 Kb
BNL7.71	-	10.6 Kb	-	-
BNL5.71	-	-	-	11.3 Kb
				6.8 Kb
				5.7 Kb
tda62	-	-	5.5 Kb	-
UMC68	-	6.0 Kb	-	-
UMC104	-	12.4 Kb	9.4 Kb	-
		11.6 Kb
		7.5 Kb
phi10017	-	-	-	15.1 Kb
				9.5 Kb
Chromosom 6
tda50	-	-	8.5 Kb	-
npi373	-	6.5 Kb	-	-
		5.6 Kb
		3.0 Kb
tda204	-	-	4.0 Kb	-
npi393	12.1 Kb	-	-	-
	8.5 Kb
	5.6 Kb
UMC65	-	2.9 Kb	-	-
UMC21	5.7 Kb	-	-	-
UMC46	6.5 Kb	-	-	-
	5.6 Kb	-	-	-
asg7	-	6.3 Kb	-	-
UMC28	-	15.8 Kb	7.6 Kb	-
		11.9 Kb	6.6 Kb
UMC134	15.3 Kb	7.5 Kb	4.7 Kb	-
Chromosom 7
asg8	-	10.8 Kb	-	-
		8.4 Kb
O₂	9.4 Kb	-	-	-
BNL15.40	-	5.8 Kb	-	-
UMC116	9.5 Kb	15.3 Kb	-	-
UMC110	-	-	10.6 Kb	-
			4.9 Kb
BNL8.32	-	8.9 Kb	-	-
		7.4 Kb
		7.1 Kb
BNL14.07	6.4 Kb	-	-	-
UMC80	-	2.4 Kb	-	-
HNL16.06	6.8 Kb	-	-	-
phi20020	-	7.8 Kb	-	-
		6.6KB
Chromosom 8
npi114	-	10.0 Kb	-	-
		8.8 Kb
		6.3KB
BNL9.11	-	3.4 Kb	-	-
UMC103	-	6.9 Kb	-	-
		5.7 Kb
UMC124	-	8.0 Kb	21.0 Kb	-
		7.0 Kb	19.0 Kb
			6.6 Kb
			2.6 Kb
			1.6 Kb
UMC120	-	8.0 Kb	23.1 Kb	-
		3.2 Kb
		2.3 Kb
		1.4 Kb
UMC89	7.3 Kb	7.3 Kb	9.5 Kb	-
			6.0 Kb
			5.2 Kb
			4.5 Kb
BNL12.30	3.5 Kb	-	-	-
UMC48	-	4.7 Kb	-	-
		3.5 Kb
		2.2 Kb
UMC53	3.8 Kb	-	-	-
	3.0 Kb
npi268	-	-	6.4 Kb	-
UMC3	2.5 Kb	-	-	-
	2.0 Kb
Chromosom 9
phi10005	15.0 Kb	-	-	-
UMC113	5.9 Kb	-	12.8 Kb	-
	5.4 Kb		11.8 Kb
			10.5 Kb
UMC192	-	11.4 Kb	-	-
		6.4 Kb
wx (waxy)	-	21.0 Kb	-	-
CSU147	-	5.9 Kb	-	-
BNL5.10	-	6.1 Kb	-	-
		4.4 Kb
UMC114	-	-	15.0 Kb	-
			12.6 Kb
			11.5 Kb
			10.0 Kb
			8.8 Kb
			7.5 Kb
			6.5 Kb
UMC95	13.3 Kb	7.7 Kb	15.0 Kb	-
	5.6 Kb	4.8 Kb	9.0 Kb
		4.1 Kb
CSU61	8.1 Kb	-	-	-
	4.8 Kb
bn17.57	1.0 Kb	-	11.6 Kb	-
			5.9 Kb
			5.5 Kb
			1.3 Kb
CSU54	14.7 Kb	-	-	-
	12.6 Kb
Chromosom 10
phi20075	7.1 Kb	-	-	-
npi285	15.3 Kb	-	-	-
	12.4 Kb
	9.4 Kb
	6.0 Kb
KSU5	9.8 Kb	-	-	-
	7.6 Kb
	6.1 Kb
	3.8K
	3.5 Kb
UMC130	13.5 Kb	4.8 Kb	3.2 Kb	-
	7.0 Kb	3.2 Kb
UMC152	-	12.4 Kb	-	-
		7.1 Kb
		5.6 Kb
UMC64	-	3.3 Kb	-	-
phi06005	12.8 Kb	-	-	-
UMC163	-	12.0 Kb	-	-
		7.0 Kb
		4.8 Kb
UMC44	-	9.8 Kb	-	-
		8.7 Kb
		7.2 Kb
		5.5 Kb
		4.0 Kb
npi306	-	7.0 Kb	-	-
Mitochondrien
pmt1	-	2.3 Kb	-	-
pmt2	-	8.0 Kb	-	-
		9.2 Kb
		2.8 Kb
		2.1 Kb
pmt5	-	12.3 Kb	-	-
		8.1 Kb
		3.2 Kb
		2.5 Kb

Map Location	unbekannt
tda16	-	4.3 Kb	-	-
tda17	-	7.0 Kb	-	-
tda37	-	-	8.2 Kb	-
			6.5 Kb
tda8	-	8.2 Kb	-	-
tda53	-	3.8 Kb	-	-
		2.2 Kb

Tabelle 3: Ungefähre Größe der neuen Tripsacum-Restriktions-Längenfragment-Polymorphismen pro Enzym/Sondenkombination, die weder in Mais noch in wildem Zeas vorliegen.

Restriktionsenzym
Sonde	EcoRI	HindIII	BamHI	EcoRV
Chromosom 2
UMC53	-	-	-	8.4 Kb
Chromosom 3
UMC50	-	-	7.8 Kb	-
			5.8 Kb
UMC42	-	7.6 Kb	-	-
Chromosom 4
phi20725	9.7 Kb	-	-	-
npi386	-	12.6 Kb	-	-
UMC42	-	7.6 Kb	-	-
tda62	-	-	4.8 Kb	-
Chromosom 5
UMC90	-	7.8 Kb	-	-
UMC27	-	8.3 Kb	-	-
Chromosom 6
tda50	-	-	6.8 Kb	-
npi393	7.0 Kb	-	-	-
UMC28	-	-	10.0 Kb	-
Chromosom 7
asg8	-	8.7 Kb	-	-
UMC110	-	-	3.9 Kb	-
UMC80	-	10.6 Kb	-	-
		8.2 Kb
BNL16.06	-	1.9 Kb	-	-
Chromosom 8
UMC48	-	6.2 Kb	-	-
UMC53	-	-	-	8.4 Kb
Chromosom 10
UMC163	-	2.6 Kb	-	-
Mitochondrien
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Tabelle 4: De novo-Allele bei Tripsacum-diploperennis-Hybriden und (Mais X Tripsacum-diploperennis)

Tabelle 5: Neue Tripsacum-Allele bei Tripsacum-diploperennis-Hybriden und (Mais X Tripsacum-diploperennis)

Hinterlegung der Samen
Eine Probe, umfassend mindestens 2.500 Samen, abstammend von Kreuzungen zwischen Tripsacum dactyloides und Zea diploperennis, wie hier beschrieben, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, am 28. August 1992 hinterlegt. Die Hinterlegungs-Nr. ist ATCC75297.
Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Umfang nicht durch die hinterlegten Samen begrenzt, da die hinterlegten Ausführungsformen nur Illustrationen der Erfindung sein sollen und alle Samen, Zelllinien, Pflanzenteile, Pflanzen, abstammend von Gewebekultur oder Samen, die funktionell äquivalent sind, sich im Umfang dieser Erfindung befinden.

Claims

Screeningverfahren einer Pflanze zur Bestimmung, ob die Pflanze eine Kreuzung zwischen Tripsacum und ausdauernder Teosinte ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kreuzung eines weiblichen Tripsacum-Elternteils mit einem ausdauernden Teosinte-Pollenelternteil zur Erzeugung von Samen oder Kreuzung eines weiblichen ausdauernden Teosinte-Elternteils mit einem Tripsacum-Pollendonor zur Erzeugung eines Samens; dann (b) Ernte des in (a) erzeugten Samens; dann (c) Züchten von Pflanzen aus dem in (b) geernteten Samen; dann (d) Isolation der gesamten genomischen DNA von den Pflanzen in (c); dann (e) Verdau der genomischen DNA mit ein bis vier der Restriktionsenzyme, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EcoRI, EcoRV, HindIII und BamHI; dann (f) Durchsuchen der verdauten genomischen DNA mit ein oder mehr DNA-Markern als Sonden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den nukleären Mais-DNA-Sonden, Mitochondrien-Mais-DNA-Sonden und Tripsacum DNA-Sonden wie unten angegeben; und dann (g) Bestimmung der Gegenwart von ein oder mehr der folgenden Restriktionsfragmente der folgenden Fragmentgrößen, wobei die Restriktionsfragmente durch die folgenden Molekularmarker-Restriktionsenzym-Assoziationen und die assoziierten Fragmentgrößen gekennzeichnet sind, die aus der Gruppe ausgewählt werden bestehend aus: BNL5.62, EcoRI, 10,3 kb; npi97, HindIII, 3,9 kb; UMC157, EcoRI, 6,5 kb und 3,3 kb; UMC157, HindIII, 5,5 kb; UMC157, BamHI, 14,0 kb, 8,6 kb und 4,5 kb; UMC11, BamHI, 7,0 kb; CSU3, BamHI, 10,0 kb, 7,6 kb und 3,5 kb; UMC67, EcoRI, 19,2 kb; UMC67, BamHI 13,4 kb und 1,6 kb; CSU92, BamHI, 13,3 kb und 7,5 kb; asg62, BamHI, 12,7 kb, 9,7 kb und 6,6 kb; UMC58, HindIII, 3,3 kb; CSU164, EcoRI, 9,0 kb und 7,0 kb; UMC128, HindIII, 6,0 kb; UMC107, EcoRI, 6,3 kb und 5,3 kb; UMC107, HindIII, 19,2 kb; UMC140, EcoRI, 5,0 kb; UMC140, HindIII, 6,5 kb; UMC107, EcoRI, 6,3 kb; adh1, HindIII, 9,4 kb; adh1, BamHI, 9,4 kb; UMC161, HindIII, 3,3 kb; BNL8.29, HindIII, 8,3 kb; UMC53, EcoRI, 9,4 kb, 3,8 kb und 3,0 kb; UMC53, EcoRV, 8,4 kb, 3,8 kb und 3,0 kb; UMC6, EcoRI, 3,8 kb; UMC6, HindIII, 9,4 kb; UMC6, BamHI, 13,2 kb, 12,7 kb und 7,0 kb; UMC61, HindIII, 3,4 kb und 2,8 kb; UMC34, EcoRI, 7,5 kb und 5,4 kb; UMC34, HindIII, 8,8 kb, 6,5 kb und 5,8 kb; UMC135, HindIII, 11,6 kb und 10,8 kb; UMC131, EcoRI, 10,6 kb, 5,8 kb und 4,3 kb; UMC55, EcoRI, 3,9 kb; UMC55, HindIII, 4,3 kb; UMC5, EcoRI, 5,4 kb; UMC5, HindIII, 6,5 kb; UMC49, BamHI, 8,2 kb, 6,0 kb, 4,2 kb und 3,2 kb; UMC36, BamHI, 4,2 kb; UMC32, HindIII, 6,7 kb; asg24, HindIII, 7,2 kb und 6,4 kb; UMC121, EcoRI, 3,7 kb und 3,2 kb; BNL8.35, HindIII, 9,9 kb und 8,7 kb; UMC50, BamHI, 7,8 kb, 6,8 kb, 5,8 kb und 3,8 kb; UMC42, HindIII, 10,4 kb, 8,9 kb, 7,6 kb, 3,7 kb und 3,0 kb; npi247, EcoRI, 8,0 kb; npi247, HindIII, 3,0 kb; UMC10, HindIII, 5,9 kb und 3,0 kb; UMC10, EcoRI, 6,5 kb und 5,5 kb; UMC102, EcoRI, 2,7 kb; BNL6.06, EcoRI, 6,8 kb; BNL5.37, HindIII, 10,3 kb, 5,8 kb und 3,5 kb; npi296, EcoRI, 7,9 kb; UMC3, EcoRI, 2,5 kb und 2,0 kb; npi212, HindIII, 4,3 kb; npi212, BamHI, 5,4 kb; UMC39, EcoRI, 12,2 kb, 9,2 kb, 7,8 kb und 7,1 kb; UMC63, HindIII, 9,5 kb und 4,3 kb; UMC96, HindIII, 11,8 kb, 6,4 kb und 5,5 kb; UMC96, BamHI, 7,5 kb, UMC2, EcoRI, 11,8 kb, 10,4 kb und 8,0 kb; CSU25, HindIII, 4,5 kb und 4,3 kb; agrr115, EcoRI, 8,0 kb und 5,4 kb; agrr115, BamHI, 5,4 kb und 3,5 kb; phi20725, EcoRI, 10,3 kb, 9,7 kb und 7,2 kb; phi20725, HindIII, 1,5 kb; UMC31, EcoRI, 5,8 kb; UMC31, BamHI, 6,5 kb; BNL5.46, HindIII, 13,7 kb, 10,5 kb, 9,7 kb und 5,1 kb; npi386, HindIII, 12,6 kb, 9,3 kb und 8,2 kb; tda62, BamHI, 5,5 kb und 4,8 kb; BNL5.71, EcoRV, 11,3 kb, 6,8 kb und 5,7 kb; BNL5.71, BamHI, 11,3 kb, 6,8 kb und 5,7 kb; UMC156, HindIII, 3,0 kb; UMC66, EcoRI, 10,5 kb und 6,5 kb; UMC66, BamHI, 3,7 kb; UMC19, BamHI, 12,3 kb; UMC104, HindIII, 12,4 kb, 11,6 kb und 7,5 kb; UMC104, BamHI, 9,4 kb; UMC133, HindIII, 10,6 kb, 9,9 kb, 9,2 kb und 7,7 kb; UMC52, BamHI, 8,7 kb, 6,9 kb, 3,8 kb, 3,0 kb und 2,0 kb; BNL15.07, HindIII, 2,9 kb und 2,7 kb; npi409, EcoRI, 9,4 kb; npi409, HindIII, 10,4 kb, 9,0 kb und 3,9 kb; UMC147, HindIII, 16,3 kb, 3,8 kb und 2,4 kb; UMC90, HindIII, 7,8 kb, 2,8 kb und 2,5 kb; UMC90, BamHI, 9,0 kb; UMC27, HindIII, 8,3 kb und 4,5 kb; tda37, BamHI, 8,2 kb und 6,5 kb; UMC43, BamHI, 9,7 kb, 7,3 kb und 5,7 kb; UMC40, BamHI, 7,2 kb, 4,3 kb und 4,0 kb; BNL7.71, HindIII, 10,6 kb; tda62, BamHI, 5,5 kb; UMC68, HindIII, 6,0 kb; phi10017, BamHI, 15,1 kb und 9,5 kb; tda50, BamHI, 8,5 kb; npi373, HindIII, 6,5 kb, 5,6 kb und 3,0 kb; tda204, BamHI, 4,0 kb; npi393, EcoRI, 12,1 kb, 8,5 kb, 7,0 kb und 5,6 kb; UMC65, HindIII, 2,9 kb; UMC46, EcoRI, 6,5 kb und 5,6 kb; asg7, HindIII, 6,3 kb; UMC28, HindIII, 15,8 kb und 11,9 kb; UMC28, BamHI, 10,0 kb, 7,6 kb und 6,6 kb; UMC134, BamHI, 4,7 kb; UMC134, HindIII, 7,5 kb; asg8, HindIII, 10,8 kb, 8,7 kb und 8,4 kb; 02, EcoRI, 9,4 kb; BNL15.40, HindIII, 5,8 kb; UMC116, EcoRI, 9,5 kb; UMC110, BamHI, 10,6 kb, 4,9 kb und 3,9 kb; BNL8.32, HindIII, 8,9 kb, 7,4 kb und 7,1 kb; BNL14.07, EcoRI, 6,4 kb; UMC80, HindIII, 10,6 kb, 8,2 kb und 2,4 kb; BNL16.06, EcoRI, 6,8 kb und 1,9 kb; phi20020, HindIII, 7,8 kb und 6,6 kb; npi114, HindIII, 10,0 kb, 8,8 kb und 6,3 kb; BNL9.11, HindIII, 3,4 kb; UMC103, HindIII, 6,9 kb und 5,7 kb; UMC124, HindIII, 8,0 kb und 7,0 kb; UMC124, BamHI, 6,6 kb und 2,6 kb; UMC120, HindIII, 3,2 kb, 2,3 kb und 1,4 kb; UMC89, EcoRI, 7,3 kb; UMC89, HindIII, 7,3 kb; UMC89, BamHI, 9,5 kb, 6,0 kb, 5,2 kb und 4,5 kb; BNL12.30, EcoRI, 3,5 kb; UMC48, HindIII, 6,2 kb, 5,3 kb, 4,7 kb, 3,5 kb und 2,2 kb; npi268, BamHI, 6,4 kb; phi10005, EcoRI, 15,0 kb; UMC113, EcoRI, 5,9 kb und 5,4 kb; UMC113, BamHI, 12,8 kb, 11,8 kb und 10,5 kb; UMC192, HindIII, 11,4 kb und 6,4 kb; wx (waxy), HindIII, 21,0 kb; CSU147, HindIII, 5,9 kb; BNL5.10, HindIII, 6,1 kb und 4,4 kb; UMC114, BamHI, 12,6 kb, 11,5 kb, 10,0 kb, 8,8 kb, 7,5 kb und 6,5 kb; UMC95, EcoRI, 5,6 kb; UMC95, HindIII, 7,7 kb, 4,8 kb und 4,1 kb; UMC95, BamHI, 15,0 kb und 9,0 kb; CSU61, EcoRI, 8,1 kb und 4,8 kb; BNL7.57, EcoRI, 1,0 kb, BNL7.57, BamHI, 11,6 kb, 5,9 kb und 1,3 kb; CSU54, EcoRI, 14,7 kb und 12,6 kb; phi20075, EcoRI, 7,1 kb; npi285, EcoRI, 12,4 kb, 9,4 kb und 6,0 kb; KSU5, EcoRI, 9,8 kb, 7,6 kb, 6,1 kb, 3,8 kb und 3,5 kb; UMC130, EcoRI, 13,5 kb und 7,0 kb; UMC130, HindIII, 4,8 kb und 3,2 kb; UMC130, BamHI, 3,2 kb; UMC152, HindIII, 12,4 kb, 7,1 kb und 5,6 kb; UMC64, HindIII, 3,3 kb; phi06005, EcoRI, 12,8 kb; UMC163, HindIII, 7,0 kb, 4,8 kb und 2,6 kb; UMC44, HindIII, 9,8 kb, 8,7 kb, 7,2 kb, 5,5 kb und 4,0 kb; BNL10.13, HindIII, 10,8 kb; npi306, HindIII, 7,0 kb; pmt1, HindIII, 2,3 kb; pmt2, HindIII, 8,0 kb, 4,2 kb, 2,8 kb und 2,1 kb; pmt5, HindIII, 12,3 kb, 8,1 kb, 3,6 kb, 3,2 kb und 2,5 kb; tda48, HindIII, 8,2 kb; tda53, HindIII, 3,8 kb und 2,2 kb; tda168, EcoRI, 3,6 kb; tda16, HindIII, 4,3 kb und tda17, HindIII, 7,0 kb.
Verfahren zur Erzeugung von Hybridmaissamen, der ein oder mehr Restriktionsfragmente enthält, gemäß Anspruch 1, umfassend die Schritte: (a) Kreuzung eines weiblichen Tripsacum-Elternteils mit einem männlichen ausdauernden Teosinte-Elternteil zur Erzeugung von (Tripsacum X ausdauernder Teosinte) Hybridsamen oder eines weiblichen ausdauernden Teosinte-Elternteils mit einer Tripsacum-Pollendonorpflanze zur Erzeugung eines Hybridsamens; (b) Züchten einer Hybridpflanze aus dem Samen bis zur Reife; (c) Screening der Hybridpflanze zur Bestimmung, ob die Pflanze eine Kreuzung zwischen Tripsacum und ausdauernder Teosinte ist, wobei das Verfahren gemäß Anspruch 1 verwendet wird; (d) Kreuzen der (Tripsacum X ausdauernder Teosinte) oder (ausdauernder Teosinte X Tripsacum) Hybridpflanze mit Mais zur Erzeugung eines Samens; und (e) Ernten des in (d) erzeugten Samens.
Verfahren zur Erzeugung einer Hybridmaispflanze, die ein oder mehr Restriktionsfragmente enthält, gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Erzeugung eines Hybridmaissamens unter Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 2 und (b) Züchten des Hybridmaissamens zum Erhalt einer Hybridmaispflanze.
Verfahren zur Erzeugung eines Derivats, einer Variante, einer Mutante, einer Modifikation, einer zellulären Komponente, einer molekularen Komponente, eines Pollens oder einer Gewebekultur einer Hybridmaispflanze, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Erzeugung eines Hybridmaissamens unter Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 2; (b) Züchten des Hybridmaissamens zum Erhalt einer Hybridmaispflanze und (c) Erhalt eines Derivats, einer Variante, einer Mutante, einer Modifikation, einer zellulären Komponente, einer molekularen Komponente, eines Pollens oder einer Gewebekultur aus der Hybridmaispflanze.