CN102174568A

CN102174568A - 一种玉米成熟胚原位转基因的方法

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Publication number: CN102174568A
Application number: CN 201110051783
Authority: CN
Inventors: 季静; 王罡; 武卫党; 关春峰
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2011-03-04
Filing date: 2011-03-04
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2031-03-04
Also published as: CN102174568B

Abstract

本发明涉及一种玉米成熟胚原位转基因的方法。将获得玉米成熟胚原位转基因所需的成熟胚胚芽，处理胚芽使其露出生长点并使其稍微损伤，用浸染液在玉米生长点处进行原位转基因，对浸染过的生长点处细胞与根癌农杆菌共培养，使Bar基因通过根癌农杆菌的T-DNA整合在玉米染色体上并复壮；再除草剂筛选初步获得原位转基因抗除草剂植株并移栽；通过原位转基因玉米PCR阳性植株的自交授粉获转基因玉米种子。本发明的方法对玉米成熟胚胚芽的生长点进行转基因，通过向玉米叶片喷洒或涂抹除草剂的方法进行筛选转基因植株和分子检测进一步验证PCR阳性植株，方法简单高效，转化率可达4％，对玉米基因工程和遗传育种具有重大意义。

Description

一种玉米成熟胚原位转基因的方法

技术领域

本发明涉及基因工程中对植物进行转基因的方法，特别是涉及一种对玉米成熟胚进行转基因的方法，具体是一种玉米成熟胚原位转基因的方法。

背景技术

将外源基因或者经过修饰后的内源基因转入植物体内以改变植物某一特性，是改善作物品质的重要途径。自1983年首次培育出世界第一个转基因植物--转基因烟草以来，科学家试图不同的转基因方法，将外源基因或经体外修饰后的内源基因导入植物，改良植物的性状，并探索出了多种植物转基因方法。目前，玉米的基因导入方法主要有两大类：根癌农杆菌介导的遗传转化和DNA直接直接导入的转化法，后者主要包括基因枪法、花粉管通道法、子房注射法、PEG法、电击法、阳离子转化法等、超声波介导法。(LIJin-liang.YU Feng-li.，2008，Heilongiiang Agricultural Sciences.，1：114～116.)。

根癌农杆菌介导的遗传转化法是植物转基因技术中经常采用的一种手段。根癌农杆菌在双子叶植物上的遗传转化方法已经十分完善，然而由于单子叶植物不是根癌农杆菌的天然宿主，因此，在单子叶植物上的遗传转化研究落后于双子叶植物。玉米是一种非常重要的粮食作物，在植物分类上属于单子叶植物，因此要建立一套高效的玉米转基因方法以改善其品质意义十分重大。Grimsly等首次以玉米为材料，用根癌农杆菌将玉米条纹病毒(MSV)的cDNA导人玉米植株中，使植株表现了系统感染症状，从而有力地证明了根癌农杆菌能侵染玉米(Nigel Grimsley，Barbara Hohndeng等，Mol Gen Genet.，217：309～316)。这是玉米转基因育种的一个里程碑，它打破了根癌根癌农杆菌介导的转基因方法只能用于双子叶植物转化的定论，开创了根癌农杆菌应用于玉米转基因育种的新纪元。1990年Gould等报道了根癌农杆菌转化玉米茎尖分生组织获得成功(Gould J，Devey M等，1991，Plant Physiol.，95：426～434)；1996年Ishida等构建根癌农杆菌超级双元载体转化体系，使转化效率高达5％～30％，他们用根癌农杆菌浸染A188的幼胚，得到转Bar、GUS基因的植株，并且70％可育(Ishida Y.Saito H.等，1996，Nat.Biotechnol.14(6)：745～750)；1996年Escudero等用根癌农杆菌浸染玉米幼胚，发现不同时期，转化率不同，并得出20d的幼胚最高，而且认为T-DNA的转移受基因型的影响(Escudero J，Neuhaus G等，1996，Plant Journal.，10(2)：355～360.)。

国内玉米根癌农杆菌的转化研究起步较晚。1999年黄璐等首次用根癌农杆菌介导法把NptII、GUS、Hpt基因转入玉米，其转化效率达到8.1％(黄路，卫志明，1999，实验生物学报，2(4)：381～387)；2001年张荣等用根癌农杆菌浸染玉米幼胚，初步建立了玉米幼胚转化体系，但未获得转化植株(张荣等，2001，农业生物技术学报，9(1)：45～48)；2002年张艳贞等利用根癌农杆菌浸染玉米幼胚及初始愈伤组织，将Bt基因导入玉米优良自交系，并获得了成功(张艳贞，魏松红等，沈阳农业大学学报，33(3)：195～199)；2004年权瑞党等利用根癌农杆菌浸染玉米胚性愈伤组织，将雪花莲凝聚素基因转入玉米骨干自交系齐319和掖515中成功获得转基因植株(权瑞党，尚梅等，2004，西北植物学报.，24(5)：761～767)；2004年张艳贞等利用根癌农杆菌将bar-Bt转入玉米自交系314和4112幼胚初始愈伤组织，抗性植株平均发生率最高可达11.21％，平均转化率为2.35％(张艳贞，王罡等，2004，上海交通大学学报(农业科学版)，第22卷第1期)。

由以上报道不难看出，玉米转基因所用材料，主要是玉米幼胚，通过玉米幼胚的组织培养使其形成愈伤组织，然后再以脱分化的玉米愈伤组织为靶材料，通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法或基因枪法将目的基因转入玉米。而以玉米成熟胚为材料即玉米成熟胚转基因，通过得到胚尖、芽点等对其进行转基因发的报到还很少。前者多受时间的限制，而且操作繁琐，需要以成熟的玉米再生体系为依托，因此成本高，周期长。后一种相对前者来说，操作简单，且受季节的影响不大，全年之中都可进行是一种较好的的玉米转基因方法，然而成熟配转基因方法也存在不足，如存在转化效率低，嵌合体较多，结实率也低的缺陷。本专利所发明的这种玉米原位转基因方法克服了以前方法的缺陷，优化了玉米转基因过程，简化了玉米转基因的操作，并探索出了玉米转基因高转化率和高结实率的新途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种玉米成熟胚原位转基因的方法，可以克服现有植物组织培养技术中的不足。本发明先将玉米种子在土壤中诱导产生胚芽，待其伸长至一定长度将该胚芽顶端剪除，露出生长点，并使生长点有轻微的的划伤，剩下的部分仍然留在土壤中，然后将含目的基因的根癌农杆菌浸染液直接涂抹在伤口处。接下来，不经过植物组织培养过程，在自然状态下将目的基因转入到玉米生长点细胞中，并经过一定的筛选方法得到玉米转基因阳性植株。本发明避免了玉米组织培养过程中植株再生的繁杂过程，简便快捷，转化的后代可直接成株，克服了现有技术中工作量大、耗时长的植物组织培养过程。原位转基因技术体系构建时间较现有技术显著缩短，转化效率也较高，不受季节影响，可应用于所有玉米自交系和杂交种，因此对玉米遗传育种具有重大意义。

本发明提供的一种玉米成熟胚原位转基因的方法包括如下步骤：

获得玉米成熟胚原位转基因所需胚芽，在玉米成熟胚原位转基因前两天用能够提供玉米生长发育的营养液A浇灌基质一次，将其浇透；挑取携带有质粒pCambia2300的根癌农杆菌EHA105单菌落接种于50ml培养基B中，水浴摇床28摄氏度、150转/分钟，12～16小时，培养至根癌农杆菌菌液OD600＝0.6～0.8时，取出备用；用浸染液C在玉米生长点处进行原位转基因，然后将涂抹过根癌农杆菌浸染液C的玉米生长点以下部分及根癌农杆菌共培养；将经过共培养的用原位转基因方法处理的玉米复壮；将复壮后玉米成熟胚原位转基因植株进行筛选；移栽原位转基因玉米植株；对原位转基因玉米植株做分子检测；原位转基因玉米阳性植株的自交授粉。

所述的获得玉米成熟胚原位转基因所需胚芽是在盛有种子萌发的基质(如蛭石+珍珠岩+营养土，4∶1∶1-2)的育苗容器中放入玉米自交系种子，在室温的环境中正常管理，使玉米发芽，待玉米种芽伸长在1-15cm时，将育苗盘取出来。

所述的营养液A的组成为：825mg/L NH₄NO₃+950mg/LKNO₃+220mg/LCaCl₂·2H₂O+185mg/LMgSO₄·7H₂O+85mg/LKH₂PO₄+0.415mg/LKI+6.2mg/LH₃BO₃+11.15mg/LMnSO₄·4H₂O+4.3mg/L ZnSO₄·7H₂O+0.125mg/L Na₂MnO₄·2H₂O+0.0125mg/L CuSO₄·5H₂O+0.0125mg/LCoCl₂·6H₂O+13.9mg/LFeSO₄·7H₂O+18.65mg/LNa₂-EDTA·2H₂O+PH6.5～6.8。

所述的的质粒pCambia2300(商业化购买)为图2所示，其上的T-DNA区含有抗除草剂基因PPT乙酰转移酶基因(Bar)。

所述的根癌农杆菌为EHA105(为本实验室保藏菌株，其特征网上已经公布)

所述的单菌落为通过平板划线的方法在固体培养基B分离出来的生长最快的菌落。

所述的培养基B组成为：10g/L胰蛋白胨(Tryptone)+5g/L酵母提取物(Yeast extract)+10g/L氯化钠(NaCl)+PH5.4(高压灭菌处理冷却至50摄氏度后)+100mg/L硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate)。

所述的固体培养基B是指：10g/L胰蛋白胨(Tryptone)+5g/L酵母提取物(Yeast extract)+10g/L氯化钠(NaCl)+15g/L琼脂+PH5.4(高压灭菌处理冷却至50摄氏度后)+100mg/L硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate)。

所述的浸染液C是挑取携带有质粒pCambia2300的根癌农杆菌菌株EHA105单菌落接种于50ml培养基B中，水浴摇床28摄氏度、150转/分钟，12～16小时，培养至根癌农杆菌菌液OD600＝0.6～0.8时，取出后所得菌液在离心机上以4000rpm的转速，离心10min，然后加入50ul以下成分50mL/LMS大量+5mL/L MS微量+5mL/L B₅有机+5mL/L铁盐+1.5mg/L 2，4-D+500mg/L脯氨酸+250mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+36g/L葡萄糖+200μmol/LAS+5μM/LAgNO₃+PH5.4，并将菌体重悬后即为浸染液C。

所述的原位转基因是取伸长至1～10cm的玉米种芽在其生长点处，将其以上部分用眼科剪刀或其他锋利的剪切工具快速剪去，并迅速将浸染液C用涂抹工具将其涂抹在玉米种芽生长点切开处。

所述的玉米生长点是指位于芽轴的顶端的凸起部分，不断分裂和分化产生新的芽结构，使芽轴不断伸长，并分化出玉米其他组织和器官(如图6)。

所述的将涂抹过根癌农杆菌浸染液C的玉米生长点以下部分及根癌农杆菌共培养是在黑暗处、室温25～28摄氏度、空气湿度60％～80％的条件下培养3-10天；

所述的将经过共培养的用原位转基因方法处理的玉米复壮是将共培养过后的玉米植株移入温室培养一个月，光强6000lx、16h/d，20～28摄氏度，空气湿度60％～80％每周浇灌营养液A 1～2次。

所述的复壮后玉米成熟胚原位转基因植株的筛选是用浓度为300mg/l的草丁膦对生长至4～5片叶的玉米植株的叶片进行涂抹或喷洒，凡是能够正常生长的植株初步视为原位转基因成功植株。

所述的原位转基因玉米植株的移栽是将原位转基因成功植株移入大一些的花盆中培养，或将其移至隔离的试验田进行管理。

所述的对原位转基因玉米植株做分子检测是对原位转基因玉米植株进行基因组PCR检测，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

所述的Bar基因CDS序列为SEQ ID NO.1所示的序列，Bar基因上游引物为SEQ IDNO.2所示的序列；Bar基因下游引物为SEQ ID NO.3所示的序列；

所述的玉米基因组PCR检测是

反应体系：

PCR程序：

所述的原位转基因玉米阳性植株的自交授粉是在原位转基因玉米PCR阳性植株雌花吐丝时，选择晴天上午9点至12点之间，用一个干净的纸袋收集同一植株的花粉，然后将花粉均匀散落在雌花花丝上将纸袋子倒扣于授过粉的雌花上进行隔离。并重复授粉3-6次。

本发明提供的一种玉米成熟胚原位转基因的方法避免了组织培养和植株再生的繁杂过程，简便快捷，转化的后代可直接成株，省掉现有技术中工作量大、耗时长的植物组织培养阶段。生产周期短，操作简单，便于管理和控制，且转化率高(4％左右)，成活率也高，是一种低成本、具有较大推广价值的转基因方法，能够应用于所有玉米自交系和杂交种。

附图说明

图1为用玉米原位转基因方法获得的转基因玉米植株；a温室中转化植株，b移入隔离的试验田里的转化植株。

图2为原位转基因玉米所用载体pCambia2300。

图3为玉米转bar基因后用除草剂草丁膦(300mg/l)筛选结果。a处理前，b处理后，c结实的转基因玉米。

图4为用玉米原位转基因方法转入Bar基因(500bp左右)后玉米基因组PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。(图中M：markerIII；水：空白对照；P：正对照；L1：负对照L2-L21为经原位转基因方法处理后玉米基因组PCR琼脂糖凝胶电泳结果图，图中500bp处条带为检测到的目的基因条带；L2、L7、L9、L13、L14、L15、L16、L17和L19是原位转基因玉米基因组PCR阳性植株。)

图5为用玉米成熟胚原位转基因法得到的转基因玉米的棒子。

图6为玉米生长点所在部位。

具体实施方式：

本发明参照实施例详细说明如下：

实施例1

1)用于玉米原位转基因方法的根癌农杆菌EHA105浸染液的获得

①载体pCambia2300-Bar的构建及转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞过程如下：

以Bar基因为模板，上下游引物两端分别引入Xho I酶切位点进行PCR扩增。然后，PCR产物与pCambia2300质粒分别经Xho I单酶切，将二者酶切产物连接：16℃，连接16h。连接产物转化TOP10 Competent Cell(购买于天根生化科技有限公司Cat#CB104，Lot#J8713)，涂布于含卡那霉素的LB平板。以目的基因为模板进行PCR得到552bp产物，用BamH I和Sal I酶切鉴定得到1576bp目的条带，最后测序验证结果表明载体构建正确。然后将构建好的质粒载体通过电激转化的方法转入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，设置电击转化参数为25μF，400olm，1500V，5ms。

②将携带质粒pCambia2300-Bar(如图2所示)土壤根癌根癌农杆菌EHA105复壮，挑取-80℃保存的菌种，取少许冰冻的菌块接种于10ml含硫酸卡那霉素100mg/L的培养基B上，28℃，150r/min，水浴摇床遥至菌液OD₆₀₀＝0.6～1.0。

培养基B：10g/L胰蛋白胨(Tryptone)+5g/L酵母提取物(Yeast extract)+10g/L氯化钠(NaCl)+100mg/L硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate)+PH5.4。

③平板划线分离生长状态优良的EHA105菌株

用接种环蘸取培养好的菌液在含有相应抗生素的培养基D上接种，放入28℃恒温培养箱，黑暗条件下培养三天后观察菌落生长情况。

培养基D：10g/L胰蛋白胨(Tryptone)+5g/L酵母提取物(Yeast extract)+10g/L氯化钠(NaCl)+15g/L琼脂(agar)+100mg/L硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate)+PH5.4。

④挑取最大且边缘光滑的一个农杆菌EHA105菌落接种在装有50ml的培养基B的玻璃三角瓶中，放在28℃、150转/分钟的水浴摇床培养12～16小时，待菌液达到最适浸染浓度OD₆₀₀＝0.6～0.8时取出备用。

2)获得玉米原位转基因所需的玉米成熟胚胚芽

在盛有种子萌发的基质(蛭石+珍珠岩+营养土，4∶1∶1)的育苗容器中放入玉米自交系种子天塔五号(天津市科润种业有限公司惠赠)，然后用自来水将其浇透，在室温25摄氏度的环境中正常管理使玉米发芽，使玉米种芽长度在5cm左右。

3)在玉米生长点处进行原位转基因

原位转基因前先用营养液A将玉米栽培基质浇透，选取生长健壮的玉米成熟胚胚芽(长至5cm左右)，将其从生长点处倾斜切掉，露出生长点，并使其稍稍损伤；用软毛笔(直径0.5cm左右，用剪刀将笔尖剪平)蘸取制备好的根癌农杆菌浸染液C(见发明内容的玉米成熟胚原位转基因的方法步骤所述)，然后将其轻轻地涂抹在露出伤口的玉米成熟胚胚芽的生长点处。

4)根癌农杆菌与玉米的生长点处细胞共培养

将涂抹过根癌农杆菌液的玉米植株封上保鲜膜，并用牙签在保鲜膜上刺6～9个小洞，然后放在遮光的塑料棚中、28℃、空气湿度60％左右左右条件下共培养3天。

5)玉米原位转基因植株的复壮

共配养七天后将植株移出暗处，移入温室培养一个月左右，在光强6000lx、16h/d，25摄氏度左右条件下，每周浇灌营养液A一次，使浸染过的玉米植株叶片长出，并复壮变绿(如图1a)。

6)原位转基因玉米植株的除草剂筛选

用喷壶将浓度为300mg/L的草丁膦液，喷洒在玉米叶片上，然后在光强6000lx、16h/d，25摄氏度左右条件下，每周浇灌营养液A一次，经过一段时间的培养，能够正常生长的玉米植株可以初步认为是原位转基因玉米植株(如图3b所示)。

7)移栽

待上步中所得到的原位转基因植株长出4～5片叶时将其移入隔离的试验田(如图1b)。今天之前的一个月，隔离的试验田亩施腐熟的有机肥1000公斤，磷肥7.5公斤，钾肥5.5公斤做底肥。待玉米长出5片叶时，施肥一次(尿素，5kg/亩)并喷一次40％氧化乐果乳油2000-3000倍液，防治玉米蚜兼治灰飞虱；玉米在拔节期日均温度要保持在18℃以上，一月后的大喇叭口期，增施一次氮肥(尿素，10kg/亩)，用杀螟灵1号颗粒剂或1％1605颗粒剂、0.3％辛硫磷颗粒剂防治玉米螟，同时用40％乐果乳油1500倍液喷雾防治粘虫；抽雄时再施一次复合肥(N∶P∶K＝3∶1∶1或洋丰牌复合肥30kg/亩)。从抽雄到开花日均为26～27℃，灌浆和成熟需保持在20～24℃。

8)分子检测

一、CTAB法提取原位转基因玉米植株叶片基因组

①.取少量新鲜玉米叶片，剪成小块置于研钵中，用液氮磨至粉末状，转入1.5ml离心管中。

②加入2％CTAB提取液600μl，混匀。

③在65℃水浴中温浴1h。

④冷却到室温后，加入600μl的氯仿-异戊醇，充分振荡混匀。

⑤离心：室温，12000r/min，10min。

⑥取上清，重复步骤3，再次抽提。

⑦取上清，加等体积异丙醇或无水乙醇，室温沉淀10-30min，室温，12000r/min，离心10min。

⑧弃上清，用75％乙醇洗两次。

⑨烘干沉淀，溶于50-100μl ddH₂O中备用。

二、原位转基因玉米植株叶片基因组PCR

以玉米叶片基因组为模板进行PCR扩增

Bar基因引物：

Bar基因上游引物为SEQ ID NO.2所示的序列；Bar基因下游引物为SEQ ID NO.3所示的序列。

PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：

取5μL PCR产物进行凝胶电泳验证。

三、原位转基因玉米植株叶片基因组PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证

琼脂糖浓度 0.7％

电压 120V

电泳时间 25min

电泳结束后取出胶片，在凝胶成像系统中查看结果，并拍下照片，结果在500bp大小处出现特异的目的片段，可初步认为用原位转基因法将抗除草剂基因Bar成功转入玉米中(结果如图4所示)。

9)散粉期进行自交授粉

待玉米雌穗吐丝1-2天时，选择天气晴朗上午9点至12点的时间段内，将花粉轻轻抖落在一个纸袋子或其他能够收集花粉的物件里，然后将其均匀散落在在同一植株的雌花的花丝上，然后将一干净的纸袋子(深15cm，直径6cm，一端开口，另一端封闭)扣在雌花上隔离，并重复授粉3～5次(尽可能增加授粉次数)。

授粉全部结束后，将授过粉的植株的雄花剪去，保持土壤湿润，土壤水分保持在田间持水量的75％～80％。期间要改善玉米群体的通风透光条件来防止发生青枯病、全蚀病和早衰。

10)适时收获

待转基因玉米生长至完熟期时，从外表看，植株子粒干硬，子粒基部出现黑色层，乳线消失，并呈现出品种固有的颜色和光泽，此时籽粒达到生理成熟，体积最大，干重最高，此时适时收获(如图5所示)。将转基因玉米种子阳光下自然晒干后-20℃条件下保藏备用。

Claims

1.一种玉米成熟胚原位转基因的方法，其特征在包括如下步骤：获得玉米成熟胚原位转基因所需胚芽，在玉米成熟胚原位转基因前两天用能够提供玉米生长发育的营养液浇灌基质一次，将其浇透；用浸染液在玉米成熟胚胚芽生长点处进行原位转基因，然后将涂抹过根癌农杆菌浸染液的玉米成熟胚胚芽生长点处细胞与根癌农杆菌共培养；将经过共培养的用原位转基因方法处理的玉米材料复壮；将复壮后玉米成熟胚原位转基因植株进行筛选；移栽原位转基因玉米植株；对原位转基因玉米植株做分子检测从而获得PCR阳性植株；通过原位转基因玉米PCR阳性植株的自交授粉获得转基因玉米种子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的玉米成熟胚原位转基因所需胚芽的获得是在盛有经过高温湿热灭均体积比为4∶1∶1-2的蛭石、珍珠岩和营养土基质的育苗容器中放入玉米自交系或杂交系种子，使玉米发芽，待玉米种芽长在1-10cm时的胚芽；所述的营养液是营养液A：825mg/L NH₄NO₃+950mg/LKNO₃+220mg/LCaCl₂·2H₂O+185mg/LMgSO₄·7H₂O+85mg/LKH₂PO₄+0.415mg/LKI+6.2mg/I H₃BO₃+11.15mg/LMnSO₄·4H₂O+4.3mg/L ZnSO₄·7H₂O+0.125mg/L Na₂MnO₄·2H₂O+0.0125mg/L CuSO₄·5H₂O+0.0125mg/LCoCl₂·6H₂O+13.9mg/LFeSO₄·7H₂O+18.65mg/L Na₂-EDTA·2H₂O+PH6.5～6.8。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的浸染液是挑取携带有质粒载体pCambia2300的根癌农杆菌菌株单菌落接种于50ml含100mg/L的LB液体培养基中，在水浴摇床上28摄氏度、150转/分钟，12～16小时，培养至根癌农杆菌菌液OD600＝0.6～0.8时，取出后所得菌液在离心机上以4000rpm的转速，离心10min，然后加入50ul以下成分：50mL/LMS大量+5mL/L MS微量+5mL/LB₅有机+5mL/L铁盐+1.5mg/L 2，4-D+500mg/L脯氨酸+250mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+36g/L葡萄糖+200μmol/L AS+5μM/L AgNO₃+PH5.4，并将菌体重悬后即为浸染液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的在玉米生长点处进行原位转基因是取生长至1～10cm的玉米成熟胚胚芽在其生长点处将其以上部分剪去，并使生长点处稍微划伤，然后将浸染液用涂抹工具将其涂抹在生长点处；所述的生长点是芽轴的顶端的凸起部分，能够不断分裂和分化产生新的芽结构，使芽轴不断伸长，并分化出玉米其他组织和器官；所述的将涂抹过根癌农杆菌浸染液的玉米成熟胚胚芽生长点处细胞与根癌农杆菌共培养是在黑暗处、室温25～28摄氏度、空气湿度60％～80％的条件下共培养3-10天。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的用原位转基因方法处理的玉米复壮是将共培养过后的玉米植株移入温室培养一个月，6000Lex左右光强、光周期16h/d，25摄氏度左右，空气湿度60％～80％，每周浇灌营养液一次。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的将复壮后玉米成熟胚原位转基因植株进行筛选是用浓度为300mg/L的草丁膦对生长至4～5片叶的玉米植株的叶片进行涂抹或喷洒，凡是能够正常生长的植株初步视为原位转基因抗性植株。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的对原位转基因玉米植株做分子检测是对原位转基因玉米植株进行基因组PCR，从原位转基因抗性植株的叶片中提取基因组DNA，以质粒载体pCambia2300为阳性对照，野生植株阴性对照，进行PCR检测，筛选PCR阳性植株：并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的通过原位转基因玉米PCR阳性植株的自交授粉是在原位转基因玉米PCR阳性植株雌花吐丝时，选择晴天上午9点至12点之间，用一个干净的纸袋收集同一植株的花粉，然后将花粉均匀散落在雌花花丝上将纸袋子倒扣于授过粉的雌花上进行隔离。并重复授粉3-6次。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的获得转基因玉米种子是授粉全部结束后，将授过粉的植株的雄花剪去，每周浇灌一次营养液A或者使一次氮肥，20kg/亩；保持土壤湿润，上壤水分保持在田间持水量的75％～80％；待转基因玉米生长至完熟期时，从外表看，植株子粒干硬，子粒基部出现黑色层，乳线消失，并呈现出品种固有的颜色和光泽，此时籽粒达到生理成熟，体积最大，干重最高，此时适时收获；将转基因玉米种子阳光下自然晒干后-20℃条件下保藏备用。

10.一种玉米成熟胚原位转基因方法，其特征在于它包括的步骤：

1)获得转基因材料：其特征在于所述的玉米成熟胚原位转基因所需胚芽的获得是在盛有灭过菌体积比为4∶1∶1-2的蛭石、珍珠岩和营养土基质的育苗容器中放入玉米自交系或杂交系种子，在室温的环境中正常管理，使玉米发芽，待玉米种芽长度在1-10cm之间；

2)玉米成熟胚胚芽的生长点的处理：取生长至1～10cm的玉米成熟胚胚芽在其生长点处，将其以上部分剪去，并使生长点处稍微划伤，然后将含有质粒pCambia2300的根癌农杆菌EHA105菌株的浸染液C用涂抹工具将其涂抹在生长点处；

3)玉米成熟胚胚芽生长点处细胞与根癌农杆菌共培养：将浸染过的材料在黑暗处、室温25～28摄氏度、空气湿度60％～80％的条件下共培养3-10天；

4)复壮：将共培养过后的玉米植株移入温室培养一个月，光强6000lx、光周期16h/d，25摄氏度左右，空气湿度60％～80％，每周浇灌营养液A一次；

5)筛选：是用浓度为300mg/l的草丁膦对生长至4～5片叶的玉米植株的叶片进行涂抹或喷洒，凡是能够正常生长的植株初步视为原位转基因抗性植株；

6)移栽：将原位转基因成功植株移入大一些的花盆中培养，或将其移植隔离的试验田进行管理，株距50cm，行距60cm；

7)分子检测：提取原位转基因抗性植株叶片基因组，进行PCR检测，筛选PCR阳性植株：

Bar基因PCR引物为：上引5’-3’atgagcccag aacgacgcc

下引5-3tcaaatctcg gtgacgggca g

并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析抗性植株的转基因成功与否。