CN110713971B - 一种无血清悬浮培养型293t细胞、其制备方法以及病毒的包装方法 - Google Patents

一种无血清悬浮培养型293t细胞、其制备方法以及病毒的包装方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无血清悬浮培养型293T细胞、其制备方法以及病毒的包装方法，涉及细胞培养技术领域。本发明公开的制备方法包括：驯化步骤和增殖培养步骤，增殖培养中采用添加有L‑谷氨酰胺的增殖培养基进行传代培养，以得到无血清悬浮培养型293T细胞，其中，增殖培养基不含有血清。本发明提供的制备方法可以制得无血清悬浮培养型293T细胞，该制备方法的步骤简单，所用驯化时间短，所得无血清悬浮培养型293T细胞的稳定性好，对病毒具有较高的包装效率，可进行大规模培养。

Description

一种无血清悬浮培养型293T细胞、其制备方法以及病毒的包 装方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术和慢病毒包装领域，具体而言，涉及一种无血清悬浮培养型293T细胞、其制备方法以及病毒的包装方法。
背景技术
截至2019年6月，全球共有2000多项CART细胞治疗临床试验，绝大部分CART细胞是通过慢病毒转染的方法制备得到的；而目前慢病毒主要是通过贴壁的293T细胞包装的，其培养基为DMEM培养基(Gibco)+10％FBS(Gibco动物源性血清)。这种包装方法有4个缺点：1)贴壁293T细胞包装慢病毒过程中细胞和质粒均处于一种静置状态，接触不充分，导致慢病毒包装效率低；2)贴壁的293T细胞是在细胞工厂中培养，不适合大规模培养；3)包装过程中，每一层细胞获得的营养、质粒不均匀，操作过程也较繁琐，导致包装出来的慢病毒批间差异大；4)培养基中含有动物源性的血清(FBS)，成本高，成分不确定，不利于下游慢病毒纯化，并且不适宜用于临床申报。因此，将293T细胞驯化成无血清并且悬浮培养的细胞既可以显著的提高慢病毒的包装效率，又能极大的降低慢病毒制备成本，并且包装过程操作简单，培养基成分明确，更适用于临床申报。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无血清悬浮培养型293T细胞、其制备方法以及病毒的包装方法。本发明提供制备方法可以制得无血清悬浮培养型293T细胞，该制备方法的步骤简单，所用时间少；本发明提供的慢病毒包装体系为悬浮包装体系，慢病毒包装效率高。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其包括驯化步骤和增殖培养步骤：
所述驯化步骤包括：
第一阶段传代培养：将贴壁培养型293T细胞进行第一阶段的传代培养；在该传代培养过程中，所用培养基中的血清含量依次递减，最后第一次传代培养所用培养基中的血清含量低于1.5％；
第二阶段传代培养：取经第一阶段传代培养后的细胞进行第二阶段的传代培养，以得到悬浮状态的293T细胞；在该传代培养过程中，所用培养基中的血清含量保持不变，且所用培养基中的血清含量为低于第一阶段传代培养中最后一次传代培养时所用培养基的血清含量；
所述增殖培养步骤包括：
将经第二阶段传代培养得到的悬浮状态的293T细胞接种于添加有L-Glutamine的增殖培养基中进行传代培养，以得到无血清悬浮培养型293T细胞，其中，所述增殖培养基不含有血清。
本发明提供的制备方法以贴壁培养型293T细胞作为驯化的初始原料，在驯化传代培养的步骤中，科学合理地控制各代次培养基中的血清含量，在增殖培养步骤控制增殖培养基不含血清而添加L-L-Glutamine，得到可以在无血清的培养基以悬浮状态生长的293T细胞，该制备方法所用的驯化时间短，操作简单，所得无血清悬浮培养型293T细胞可进行大规模培养，培养过程中无须添加成分不明确的血清(FBS)，大大降低了细胞培养成本和临床应用的风险。
在可选的实施方式中，所述增殖培养基为Dynamis培养基。
Dynamis培养基具有化学成分确定的，不含蛋白质，不含动物来源成分的特点，能够为悬浮培养的CHO细胞提供最高的分批和补料分批培养性能，并且有利于质粒转染和蛋白表达以及生产规模扩大。在可选的实施方式中，所述增殖培养基中的L-谷氨酰胺(L-Glutamine)浓度为2-6mM。
合适的L-Glutamine浓度有利于促进无血清悬浮培养型293T细胞的增殖，增强其稳定性。本发明的研究发现，L-Glutamine在2-6mM时，更有利于无血清悬浮培养型293T细胞的增殖和生长。
在可选的实施方式中，在第一阶段传代培养过程中，传代次数为2-4次，优选为4次，后一次传代培养所用培养基中的血清含量为前一次传代培养所用培养基中的血清的一半。
在可选的实施方式中，在第一阶段传代培养过程中，第1次传代培养所用培养基中的血清含量为9％-11％。
在可选的实施方式中，在第一阶段传代培养过程中，传代培养所用培养基中的血清均为FBS。
在可选的实施方式中，在第一阶段传代培养过程中，传代培养所用培养基均为DMEM培养基。
在可选的实施方式中，在第一阶段传代培养过程中，每次传代培养时，取(1-3)×106个细胞接种于9-1mL含血清的DMEM培养基上培养。
在可选的实施方式中，在第二阶段传代培养过程中，传代次数为2-3次，优选为3次，每次传代培养所用培养基的血清含量为0.8％-1.2％。
在可选的实施方式中，在第二阶段传代培养过程中，传代培养所用培养基均为DMEM培养基。
在可选的实施方式中，在第二阶段传代培养过程中，每次传代培养时，取(1-3)×106个细胞接种于10mL DMEM培养基上培养。
在可选的实施方式中，在第二阶段传代培养过程中，在最后一次传代培养时，待细胞密度达到95％以上时，即可收获所述悬浮状态的293T细胞。
在可选的实施方式中，在所述驯化步骤中，在每次接种细胞前，使用胰酶消化所接种的细胞。
在可选的实施方式中，所用胰酶的质量浓度为0.2％-0.3％。
在可选的实施方式中，所述驯化步骤中，每次传代培养的培养条件如下：4％-6％CO2、36-38℃条件下培养2-3天。
在可选的实施方式中，在所述增殖培养步骤中，传代培养的次数为2次；
在所述增殖培养步骤中，第1次传代培养包括：将经第二阶段传代培养得到的含有所述悬浮状态的293T细胞的上清液与所述增殖培养基混合进行培养。
在可选的实施方式中，所述上清液的体积与所述增殖培养基的体积比为3-5:1。
在可选的实施方式中，在所述增殖培养步骤中，第2次传代培养包括：待第1次传代培养的细胞浓度增长至(1-3)×106个细胞/mL时，按(1-3)×105个细胞/mL的浓度进行第2次传代培养，得到所述无血清悬浮培养型293T细胞。
在可选的实施方式中，在所述增殖培养步骤中，在第2次传代培养的培养基中添加有抗凝剂和/或使用细胞筛降低细胞结团。
抗凝剂的使用可以避免细胞团结，使细胞的具有悬浮培养特性得到加强，以更快的速度形成稳定的无血清悬浮培养型293T细胞并有效缩短整个制备方法的驯化时间。
在可选的实施方式中，所述抗凝剂以体积比为0.8-1.2:400的比例加入至第2次传代培养的培养基中。即每400ml培养基添加0.8-1.2ml抗凝剂。
在可选的实施方式中，细胞筛的孔径为38-42μm。
在可选的实施方式中，在所述增殖培养步骤中，每次传代培养的条件如下：125mL摇瓶、30mL培养基、150-300rpm、4％-6％CO2、36-38℃条件下培养2-3天。
在可选的实施方式中，所述制备方法还包括：单克隆挑选步骤；
所述单克隆挑选步骤包括：
步骤(a)：将所述增殖培养步骤得到的无血清悬浮培养型293T细胞稀释，控制稀释液的细胞终浓度为9-10个细胞/mL，再按90-110μL/孔的量将所述稀释液接种于细胞培养板中培养；
步骤(b)：在所述细胞培养板中，挑选出多个目标培养孔，再从多个所述目标培养孔中挑选出生长良好的细胞单株，将其转移至新的培养基中继续培养；其中，所述目标培养孔是指仅有1个细胞/孔的培养孔。
通过单克隆挑选步骤可以使在细胞性能(例如增殖速度、传代稳定性或对病毒的包装效率等)上有差异的细胞单株可以被分开，通过挑选，进而可以获得的生长速度快，传代稳定性好，对病毒的包装效率高的无血清悬浮培养型293T细胞。
第二方面，本发明实施例提供一种无血清悬浮培养型293T细胞，其由如前述实施方式所述的制备方法制得。
本发明所提供的无血清悬浮培养型293T细胞具有生长速度快，传代稳定性好，慢病毒包装效率高等特性，其可以适用于大规模培养，培养过程中无须添加成分不明确的血清(FBS)，大大降低了细胞培养成本和临床应用的风险。
第三方面，本发明实施例提供一种慢病毒包装方法，其包括：将慢病毒包装质粒转染如前述实施方式所述的无血清悬浮培养型293T细胞；
在可选的实施方式中，慢病毒包装所用的培养基包括：基础培养基和补料培养基；基础培养基为Dynamis，补料培养基为FeedTMC。
在可选的实施方式中，补料培养基体积为基础培养基体积的1/20-1/5。
本发明将基础培养基Dynamis和补料培养基FeedTMC首次在慢病毒包装过程中应用，有效提高慢病毒包装效率。
本发明所提供的慢病毒包装体系以前述实施方式所述的无血清悬浮培养型293T细胞作为宿主细胞，可以极大的提高慢病毒的包装效率，降低慢病毒的制备成本，包装出来的病毒特性批间差异小。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实验例1中的无血清悬浮培养型293T细胞和贴壁培养型293T细胞在显微镜下的形态观察结果(图中：A为贴壁培养型293T细胞，B为无血清悬浮培养型293T细胞)。
图2为实验例1中的无血清悬浮培养型293T细胞和贴壁培养型293T细胞生长速率的检测结果。
图3为实验例2中采用不同代号的无血清悬浮培养型293T细胞株和贴壁培养型293T细胞包装慢病毒后的病毒原液滴度的检测结果。
图4为实验例3中的无血清悬浮培养型293T细胞株传代10代的生长速率检测结果。
图5为实验例3中的无血清悬浮培养型293T细胞株传代10代的细胞活率检测结果。
图6为实验例3中的无血清悬浮培养型293T细胞株传代10代进行病毒包装后的病毒滴度检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)复苏培养
取冻存的293T细胞P7(购自ATCC，货号：CRL-11268TM)记为P7代，细胞活率为98.0％，其为贴壁型293T细胞)，按2*10+E05个细胞/mL接种量，接种于含DMEM+10％FBS培养基的10CM培养皿中，置于5％CO2、37℃条件下培养48h。
(2)驯化培养
(a)第一阶段传代培养：
第1次传代培养：将步骤(1)培养后的细胞用0.25％胰酶消化后，计数，取2*10E+06(2×106)个细胞接种于新的含有DMEM+10％FBS培养基的10CM培养皿中，记为P8代，置于5％CO2、37℃条件下培养48h；
第2次传代培养：将上述步骤培养后的细胞用0.25％胰酶消化后，计数，取2*10E+06个细胞接种于新的含有DMEM+5％FBS培养基的10CM培养皿中，记为P9代，置于5％CO2、37℃条件下培养48h；
第3次传代培养：将上述步骤培养后的细胞用0.25％胰酶消化后，计数，取2*10E+06个细胞接种于新的含有DMEM+2.5％FBS培养基的10CM培养皿中，记为P10代，置于5％CO2、37℃条件下培养72h；
第4次传代培养：将上述步骤培养后的细胞用0.25％胰酶消化后，计数，取2*10E+06个细胞接种于新的含有DMEM+1.25％FBS培养基的10CM培养皿中，记为P11代，置于5％CO2、37℃条件下培养72h。
(b)第二阶段传代培养：
第1次传代培养：将经第一阶段传代培养的细胞用0.25％胰酶消化后，计数，取2*10E+06个细胞接种于新的含有DMEM+1％FBS培养基的10CM培养皿中，记为P12代，置于5％CO2、37℃条件下培养72h；
第2次传代培养：将上述步骤培养后的细胞用0.25％胰酶消化后，计数，取2*10E+06个细胞接种于新的含有DMEM+1％FBS培养基的10CM培养皿中，记为P13代，置于5％CO2、37℃条件下培养72h；
第3次传代培养：将上述步骤培养后的细胞用0.25％胰酶消化后，计数，取2*10E+06个细胞接种于新的含有DMEM+1％FBS培养基的10CM培养皿中，记为P14代，置于5％CO2、37℃条件下培养72h；待细胞在10CM培养皿中密度达到95％以上，轻轻摇晃培养皿，少量的293T细胞变成悬浮状态，得到悬浮状态的293T细胞。
(3)增殖培养
第1次传代培养：吸取第二阶段传代培养得到含有293T悬浮细胞的上清9.5mL，补充含有6mM L-Glutamine的Dynamis培养基至30mL,125mL摇瓶中，置于200rpm、5％CO2、37℃条件下培养，防止细胞结团沉淀；
第2次传代培养：当细胞浓度增长至2*10E+6个细胞/mL时，取6*10E+06个细胞，补充培养基至30mL(记为293T XF P0代)，所用培养基为含有6mM L-Glutamine的Dynamis培养基，置于200rpm、5％CO2、37℃条件下培养。此外，培养基添加有抗凝剂，按体积比为1:400的比例添加抗凝剂(购自GibcoTM，商品名称：Anti-Clumping Agent，货号：0010057AE)，并且配合使用40μm的细胞筛降低细胞结团率。
通过上述步骤所得细胞即可作为无血清悬浮培养型293T细胞(293T XF P0代细胞)，在一些实施例方式中，可以进行后续的单克隆挑选步骤，从中选出更优异的无血清悬浮培养型293T细胞单株。
(4)挑选单克隆
(a)将上述(3)增殖培养步骤得到的293T XF P0代细胞用含有6mM L-Glutamine的Dynamis培养基稀释，得到细胞稀释液，该细胞稀释液的细胞密度：10个细胞/mL，体积：50mL；将细胞稀释液接种于5个平底96孔细胞培养板中，100μL/孔，培养基为：Dynamis+6mML-Glutamine，置于5％CO2，37℃条件下静置培养；
(b)培养24h后观察培养96孔中的细胞，挑选出50个只有1个细胞/孔的培养孔，分别标记为1-50，均记为P0；
(c)7天后补加Dynamis+6mM L-Glutamine培养基100μL/孔，14天后挑选1-50孔中细胞生长良好(细胞形态圆，镜下观察晶莹透亮，细胞数量多)的7株293T XF细胞株(代号分别是12、13、15、19、23、33、43)转移至6孔板中继续培养2-3天，培养基为Dynamis+6mM L-Glutamine，置于5％CO2，37℃条件下静置培养；
(d)将6孔板中7株293T XF细胞株转移至新的125mL摇瓶中，添加Dynamis+6mM L-Glutamine培养基至30mL，仍然记为P0，置于5％CO2，37℃条件下静置培养；
(e)培养3天后，将分别将这7株293T XF细胞株(P0)部分冻存，2*10E+7/mL/支。
本实施例的制备方法步骤简单，驯化时间短，该方法所得到的无血清悬浮培养型293T细胞生长速度快，其可以在不含血清的培养基中以悬浮状态增殖生长，经单克隆挑选后的无血清悬浮培养型293T细胞更是具有良好的传代稳定性，将其作为宿主细胞包装慢病毒时，可以提高慢病毒的包装效率。
实验例1
细胞形态的观察和生长速率的检测
(1)细胞形态观察：
方法：选取实施例1中步骤(3)增殖培养所得的无血清悬浮培养型293T细胞和贴壁培养型293T细胞，在正常培养条件下传代24h后同一条件下显微镜拍照，结果见图1所示。
图1中A为贴壁型293T细胞显微镜下拍照(100倍)，细胞形态正常，成梭型；图1中B为悬浮型293T细胞显微镜下拍照(100倍)，从图1中A可以看出，贴壁型293T细胞呈团聚状，分散不均匀，而本发明实施例1得到的无血清悬浮培养型293T细胞在显微镜下均匀分散，可以清晰地观察到单个细胞(见图1中B)，并且密度从4.05*10E+6个细胞/mL生长到9.5*10E+6个细胞/mL只需要24h，说明该细胞可以在悬浮状态下以高密度，高速率生长。
(2)生长速率的检测：
方法：选取实施例1中步骤(3)增殖培养所得的悬浮型293T细胞和正常培养的贴壁型293T细胞，每2天取细胞计数，计算当天细胞总数/48h前细胞总数，并开2次方根，从而计算出每天细胞的生长速率，取相同时间段的连续5次上述悬浮型293T细胞和正常培养的贴壁型293T细胞的生长速率取平均值，其中贴壁型293T细胞株为正常培养的293T细胞，悬浮型293T细胞株为实施例1中步骤(3)增殖培养所得的悬浮型293T细胞，结果见图2。
从图2可以看出，本发明实施例1提供的无血清悬浮培养型293T细胞的生长速率明显优于贴壁型293T细胞。
实验例2
在检测实施例1提供的无血清悬浮培养型293T细胞的慢病毒包装效率方法：
(1)将实施例1步骤(4)挑单克隆所得的7株293T XF细胞(P0)分别接种至7个新的125mL摇瓶，细胞密度：2*10E+06个细胞/mL，培养基：Dynamis+6mM L-Glutamine，体积：30mL；置于200rpm，5％CO2，37℃条件下培养24h。
另外，将贴壁型293T细胞接种于新的含DMEM+10％FBS培养基(10mL)的10cm培养皿中，置于5％CO2、37℃条件下培养24h。
(2)慢病毒包装：
慢病毒包装体系和步骤如下表所示，本包装体系下基础培养基为Dynamis+6mM L-Glutamine，补料培养基为FeedTMC，包装质粒和CAR质粒均由深圳市菲鹏治疗股份有限公司合成，并且该质粒序列均已公开并且可以查看：
Figure BDA0002261794020000111
(3)48h后收集病毒原液，3000rpm、4℃离心15min，流式检测病毒原液感染滴度检测，检测方法如下：将收集的慢病毒原液梯度体积同样条件下感染293T细胞，48h后流式检测293T细胞GFP阳性率百分比，根据计算公式：原液滴度(TU/mL)＝1.5*(10E+05)*293T细胞GFP阳性率百分比/慢病毒原液体积*1000，计算慢病毒原液滴度，其中，慢病毒原液体积的单位为μL。
结果：
7株293T XF细胞和293T贴壁细胞包装慢病毒原液滴度检测结果如图3所示。
从图3可以看出，采用本发明实施例1提供的7株293T XF细胞(12 13 15 19 23 3343)进行病毒包装，所得病毒原液滴度均比较高，23号393T XF细胞株包装的慢病毒原液滴度达到1.48E+08TU/mL，13号393T XF细胞株包装的慢病毒原液滴度为4.07E+07TU/mL，293T贴壁细胞包装的慢病毒原液滴度为1.25E+07TU/mL，未挑单克隆的悬浮型293T细胞包装的慢病毒原液滴度为8.40*10E+07TU/mL，任意一株293T XF细胞包装的慢病毒原液滴度均明显高于293T贴壁细胞(图3中的293T)。由此可以充分说明，采用本发明实施例1的制备方法所制得的无血清悬浮培养型293T细胞进行病毒包装，可以提高病毒的包装效率。
实验例3
检测实施例1提供的无血清悬浮培养型293T细胞的传代稳定性和慢病毒包装滴度稳定性。
方法：
(1)挑选实施例1步骤(4)挑单克隆(c)步骤所得的23号细胞株293T XF细胞株(P0)传代至P10，接种密度2*10E+05个细胞/mL，72h后传代，125mL摇瓶，培养基：Dynamis+6mM L-Glutamine，体积：30mL；置于200rpm，5％CO2，37℃条件下培养培养基，每次传代检测其细胞生长速率和细胞活率；细胞生长速率检测方法见实验例1步骤(2)生长速率的检测中检测方法，细胞活率检测方法是用常规的苔盼蓝检测。
结果见图4和图5。
(2)实施例1步骤(4)挑选单克隆获得的23号悬浮型293T细胞株传代至P10后，采用实验例2的方法进行慢病毒包装，检测其原液慢病毒滴度，结果见图6。
图4结果显示：23号悬浮型293T细胞生长速率稳定维持在2.5-3倍/24h，即每24小时，细胞数量增长2.5-3倍；
图5结果显示：23号悬浮型293T细胞活率较高，稳定在98％以上；
图6结果显示：23号悬浮型293T细胞传至10代时包装慢病毒原液滴度依然维持在1.38*10E+08TU/mL。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，其包括驯化步骤和增殖培养步骤：
所述驯化步骤包括：
第一阶段传代培养：将贴壁培养型293T细胞进行第一阶段的传代培养；在该传代培养过程中，所用培养基为DMEM，每代培养中的血清含量依次递减，所述第一阶段传代培养过程中，第一次传代培养所用培养基中的血清含量为9-11%，后一次传代培养所用培养基中的血清含量为前一次传代培养所用培养基中的血清的一半，最后一次所述第一阶段传代培养所用培养基中的血清含量低于1.5%；
第二阶段传代培养：取经第一阶段传代培养后的细胞进行第二阶段的传代培养，以得到悬浮状态的293T细胞；在该传代培养过程中，所用培养基为DMEM，所用培养基中的血清含量保持不变，且所用培养基中的血清含量低于第一阶段传代培养中最后一次传代培养时所用培养基的血清含量；
其中所述第一阶段传代培养和第二阶段传代培养所用血清均为FBS；
所述增殖培养步骤包括：
将经第二阶段传代培养得到的悬浮状态的293T细胞接种于添加有2-6mM L-谷氨酰胺的增殖培养基中进行传代培养，以得到无血清悬浮培养型293T细胞，其中，所述增殖培养基为Dynamis培养基，且不含有血清。
2.根据权利要求1所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，在第一阶段传代培养过程中，每次传代培养时，取(1-3)×106个细胞接种于9-11mL含血清的DMEM培养基。
3.根据权利要求1所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，在第二阶段传代培养过程中，传代次数为2-3次，每次传代培养所用培养基的血清含量为0.8%-1.2%。
4.根据权利要求3所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，传代次数为3次。
5.根据权利要求1所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，在第二阶段传代培养过程中，每次传代培养时，取(1-3)×106个细胞接种于10cm培养皿，补加含血清的DMEM培养基至10 mL。
6.根据权利要求1所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，在第二阶段传代培养过程中，在最后一次传代培养时，待细胞密度达到95%以上时，即可收获所述悬浮状态的293T细胞。
7.根据权利要求3所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，在所述驯化步骤中，在每次接种细胞前，使用胰酶消化所接种的细胞。
8.根据权利要求7所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，所用胰酶的质量浓度为0.2%-0.3%。
9.根据权利要求7所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，所述驯化步骤中，每次传代培养的培养条件如下：4%-6%CO2、36-38℃条件下培养2-3天。
10.根据权利要求1所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，在所述增殖培养步骤中，传代培养的次数为2次；
在所述增殖培养步骤中，第1次传代培养包括：将经第二阶段传代培养得到的含有所述悬浮状态的293T细胞的上清液与所述增殖培养基混合进行培养。
11.根据权利要求10所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，所述上清液的体积与所述增殖培养基的体积比为3-5:1。
12.根据权利要求10所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，在所述增殖培养步骤中，第2次传代培养包括：待第1次传代培养的细胞浓度增长至(1-3)×106个细胞/mL时，按(1-3)×105个细胞/mL的浓度进行第2次传代培养，得到所述无血清悬浮培养型293T细胞。
13.根据权利要求12所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，在所述增殖培养步骤中，在第2次传代培养的培养基中添加有抗凝剂和/或使用细胞筛降低细胞结团。
14.根据权利要求13所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，所述抗凝剂以体积比为0.8-1.2:400的比例加入至第2次传代培养的培养基中。
15.根据权利要求13所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，细胞筛的孔径为38-42μm。
16.根据权利要求13所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，在所述增殖培养步骤中，每次传代培养的条件如下：150-300rpm、4%-6%CO2、36-38℃条件下培养2-3天。
17.根据权利要求1所述的无血清悬浮培养型293T细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：单克隆挑选步骤；
所述单克隆挑选步骤包括：
步骤（a）：将所述增殖培养步骤得到的无血清悬浮培养型293T细胞稀释，控制稀释液的细胞终浓度为9-10 个细胞/mL，再按90-110μL/孔的量将所述稀释液接种于细胞培养板中培养；
步骤（b）：在所述细胞培养板中，挑选出多个目标培养孔，再从多个所述目标培养孔中挑选出生长良好的细胞单株，将其转移至新的培养基中继续培养；其中，所述目标培养孔是指仅有1个细胞/孔的培养孔。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113265425A (zh) * 2021-05-08 2021-08-17 苏州博腾生物制药有限公司 基于悬浮细胞的car-cd19慢病毒制备工艺
CN113717927B (zh) * 2021-08-31 2022-11-18 宜明(北京)细胞生物科技有限公司 一种hek-293细胞无血清和悬浮培养的制备方法及其应用
WO2023072178A1 (en) * 2021-10-27 2023-05-04 Porton Advanced Solutions Ltd. Methods for developing a cell line for producing virus in suspension cell culture
CN113981007B (zh) * 2021-10-27 2024-04-09 苏州博腾生物制药有限公司 基于hek293t克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法
CN115505559A (zh) * 2022-09-30 2022-12-23 苏州博腾生物制药有限公司 用于病毒载体生产的hek293悬浮细胞系的开发方法
CN114350595A (zh) * 2022-01-17 2022-04-15 苏州博腾生物制药有限公司 一种hek293ts悬浮细胞的慢病毒滴度检测方法
CN114591885B (zh) * 2022-03-05 2024-02-23 河南普华基因科技有限公司 一种适应无血清悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞驯化方法和应用
CN114591889A (zh) * 2022-04-06 2022-06-07 湖南远泰生物技术有限公司 一种hek293t细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102604889A (zh) * 2012-03-19 2012-07-25 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 适应无血清培养的hek293细胞系及其应用
CN103205396A (zh) * 2013-03-27 2013-07-17 中山康方生物医药有限公司 一种hek-293t细胞的悬浮驯化和无血清驯化方法
CN103468638A (zh) * 2013-09-23 2013-12-25 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种293细胞的大规模悬浮培养方法
CN109280636A (zh) * 2017-07-21 2019-01-29 上海恒润达生生物科技有限公司 一种悬浮驯化293t细胞的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106987554B (zh) * 2017-04-17 2020-05-05 广东顺德工业设计研究院(广东顺德创新设计研究院) 悬浮细胞株及其驯化方法
CN108570454A (zh) * 2017-11-09 2018-09-25 甘肃健顺生物科技有限公司 Mdbk驯化悬浮方法和二阶病毒生产工艺

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102604889A (zh) * 2012-03-19 2012-07-25 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 适应无血清培养的hek293细胞系及其应用
CN103205396A (zh) * 2013-03-27 2013-07-17 中山康方生物医药有限公司 一种hek-293t细胞的悬浮驯化和无血清驯化方法
CN103468638A (zh) * 2013-09-23 2013-12-25 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种293细胞的大规模悬浮培养方法
CN109280636A (zh) * 2017-07-21 2019-01-29 上海恒润达生生物科技有限公司 一种悬浮驯化293t细胞的方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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无血清培养基悬浮培养 BHK21 细胞驯化的研究;井莲娜;《草食家畜》;20130531;全文 *

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