CN117402817A - 一种无血清培养驯化贴壁293t细胞的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种无血清培养驯化贴壁293T细胞的方法及其应用。包括以下步骤：将DMEM完全培养基培养的293T细胞接种至混合培养基中进行培养，得到混合培养基培养的293T细胞；其中所述混合培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为4:1~1:3；将所述混合培养基培养的293T细胞接种至无血清培养基中进行培养，得到LS293T贴壁细胞，其中所述无血清培养基中包含贴附因子；所述贴附因子为重组人纤连蛋白。本发明得到的LS293T贴壁细胞在细胞活性、倍增时间方面与驯化前无差异。在慢病毒包装应用中，LS293T贴壁细胞兼具无血清培养和纯化压力小的优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种无血清培养驯化贴壁293T细胞的方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
293T细胞是慢病毒包装的常用细胞，是为提高病毒滴度，经过基因改造而得到的一种细胞。293T可表达SV40大T抗原，在相同实验条件下产生的慢病毒滴度是HEK293细胞的4倍。
目前科研和工业领域慢病毒包装应用较多的细胞系为293T细胞及其经过无血清驯化的悬浮细胞。这两种细胞在应用中均存在一定的缺陷，贴壁293T细胞培养过程中因需要添加FBS成分，限制了其应用；而经驯化的悬浮细胞，虽然可以利用无血清体系培养，但是慢病毒包装下游纯化深层过滤压力大、杂质残留多，因此其应用也存在一定的局限。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明公开了一种无血清培养驯化贴壁293T细胞的方法及其应用。本发明通过对293T细胞进行无血清驯化，并在细胞驯化培养过程添加贴附因子以维持细胞贴壁性，最终得到无血清培养的LS293T贴壁细胞系。驯化后的LS293T贴壁细胞在增殖能力、细胞活性均与293T贴壁细胞一致，且病毒滴度和产量方面优于驯化前细胞。在慢病毒包装应用中，LS293T细胞兼具无血清培养和下游纯化压力小的优势，可满足临床级慢病毒生产要求，具有良好的技术优势和应用前景。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
本发明的第一个方面，提供一种无血清培养驯化贴壁293T细胞的方法，所述方法包括：
将DMEM完全培养基培养的293T细胞接种至混合培养基中进行培养，得到混合培养基培养的293T细胞；其中所述混合培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为4:1~1:3；
将所述混合培养基培养的293T细胞接种至无血清培养基中进行培养，得到LS293T贴壁细胞，其中所述无血清培养基中包含贴附因子；所述贴附因子为重组人纤连蛋白。
具体地，所述无血清培养驯化贴壁293T细胞的方法，包括：
S1、将DMEM完全培养基培养的293T细胞接种至第一培养基中进行培养，得到第一培养基培养的293T细胞，其中所述第一培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为4:1；
S2、将所述第一培养基培养的293T细胞接种至第二培养基中进行培养，得到第二培养基培养的293T细胞，其中所述第二培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为2:1；
S3、将所述第二培养基培养的293T细胞接种至第三培养基中进行培养，得到第三培养基培养的293T细胞，其中所述第三培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为1:1；
S4、将所述第三培养基培养的293T细胞接种至第四培养基中进行培养，得到第四培养基培养的293T细胞，其中所述第四培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为1:3；
S5、将所述第四培养基培养的293T细胞接种至第五培养基中进行培养，得到LS293T贴壁细胞，其中所述第五培养基的组成为：无血清培养基和贴附因子；其中所述贴附因子为重组人纤连蛋白。
在一种具体的实施方式中，所述含血清培养基为DMEM完全培养基，优选地，所述DMEM完全培养基的组成为DMEM高糖培养基和胎牛血清，其中DMEM高糖培养基和胎牛血清的体积比为40~50：5。本申请的培养过程中对培养基不做具体限定，所述含血清培养基也可采用其他常规的细胞培养基。
在一种具体的实施方式中，所述无血清培养基为OptiPROSFM完全培养基，优选地，所述OptiPROSFM完全培养基的组成为OptiPROSFM培养基和谷丙氨酸二肽（GlutaMAX-I），其中OptiPROSFM培养基和谷丙氨酸二肽的体积比为48~50：1。本申请的培养过程中对培养基不做具体限定，所述无血清培养基也可采用其他常规的细胞培养基。
在一种具体的实施方式中，所述重组人纤连蛋白在无血清培养基中的浓度为15~25 μg/ml，优选为15、20、25 μg/ml，进一步优选为20 μg/ml。
在一种具体的实施方式中，将293T细胞在培养传代的过程中按照细胞代次1~5传代培养，进行无血清培养基替换比例控制为6次；细胞驯化总传代不超过20代。
在一种具体的实施方式中，所述将所述第四培养基培养的293T细胞接种至第五培养基中进行培养，得到LS293T贴壁细胞之后，还包括：将所述LS293T贴壁细胞使用无血清细胞冻存液进行冻存。
在一种具体的实施方式中，所述将DMEM完全培养基培养的293T细胞接种至第一培养基中进行培养，得到第一培养基培养的293T细胞，包括：
消化DMEM完全培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至第一培养基，将所述第一培养基放入37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。
在一种具体的实施方式中，所述将所述第一培养基培养的293T细胞接种至第二培养基中进行培养，得到第二培养基培养的293T细胞，包括：
消化第一培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至第二培养基，将所述第二培养基放入37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。
在一种具体的实施方式中，所述将所述第二培养基培养的293T细胞接种至第三培养基中进行培养，得到第三培养基培养的293T细胞，包括：
消化第二培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至第三培养基，将所述第三培养基放入37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。
在一种具体的实施方式中，所述将所述第三培养基培养的293T细胞接种至第四培养基中进行培养，得到第四培养基培养的293T细胞，包括：
消化第三培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至第四培养基，将所述第四培养基放入37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。
在一种具体的实施方式中，所述将所述第四培养基培养的293T细胞接种至第五培养基中进行培养，得到第五培养基培养的293T细胞，包括：
消化第四培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至第五培养基，将所述第五培养基放入37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。
本发明中，细胞培养过程中操作要轻柔，避免剧烈晃动和吹洗，期间观察细胞贴壁情况及细胞增殖情况，至细胞完全适应该比例的培养基时，再进行下一比例培养基适应性培养。
本发明的第二个方面，提供上述无血清培养驯化贴壁293T细胞的方法培养得到的LS293T贴壁细胞。
本发明的第三个方面，提供上述无血清培养驯化贴壁293T细胞的方法和/或LS293T贴壁细胞在如下任意一种或多种中的应用：
a）培养扩增；
b）慢病毒包装。
需要说明的是，驯化后的LS293T贴壁细胞具有更佳的转染效率和更高的病毒滴度，从而更加有利于将其应用于慢病毒包装。
需要说明的是，培养扩增的应用中，LS293T贴壁细胞活性和扩增正常，慢病毒包装的应用中，LS293T贴壁细胞进行慢病毒包装，慢病毒感染滴度高，从而更加有利于将其应用于慢病毒载体生产。
本发明具有以下有益效果：
本发明中提供的无血清贴壁293T细胞的驯化培养方法，通过培养基逐级替换、添加贴附因子，获得无血清体系贴壁LS293T细胞，通过检测细胞活率和增殖倍数，发现LS293T细胞活率高增殖速度与293T细胞无差异；利用驯化得到的LS293T贴壁细胞进行慢病毒包装，质粒转染效率高，获得的慢病毒滴度效果良好。兼具无血清培养和下游纯化压力小的优势，具有良好的技术优势和应用前景。
本发明中的无血清培养驯化贴壁293T细胞的方法操作步骤简单，可操作性强，便于推广，同时效果极佳，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为293T细胞显微镜下细胞白光图（10×）。
图2为贴附因子对细胞脱落率的影响图。
图3为有血清培养基驯化293T细胞和无血清驯化293T细胞过程中增殖倍数对比图。
图4为有血清培养基驯化293T细胞和无血清驯化293T细胞过程中细胞活率对比图。
图5为实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞和对比例1培养得到的无血清293T细胞的细胞贴壁图（10×）。
图6为实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞和对比例1培养得到的无血清293T细胞传代培养的细胞增殖倍数对比图。
图7为实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞和对比例1培养得到的无血清293T细胞的细胞活率的对比图。
图8为对比例2培养得到的传代的293T细胞（含血清）质粒转染72 h白光和荧光图。
图9为实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞质粒转染72 h白光和荧光图。
图10为对比例1培养得到的无血清293T细胞质粒转染72 h白光和荧光图。
图11为对比例2培养得到的传代的293T细胞（含血清）、实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞和对比例1培养得到的无血清293T细胞的慢病毒产量图。
具体实施方式
本发明提供了通过无血清培养和驯化得到的一种无血清体系贴壁293T细胞株和培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但是本发明并不仅限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1
一种无血清培养驯化贴壁293T细胞的方法，具体操作步骤如下：
1、培养基配制
(1)含血清培养基（即DMEM完全培养基）的配制
DMEM完全培养基：DMEM高糖培养基45 ml加入胎牛血清5 ml，混匀，标记为DMEM完全培养基，2~8℃保存备用。
(2)无血清培养基（即OptiPROSFM完全培养基）的配制
OptiPROSFM（以下简称Opti）完全培养基：OptiPROSFM培养基49 ml加入1 ml谷丙氨酸二肽，终浓度为4 mmol/L，混匀，标记为Opti完全培养基，2~8℃保存备用。
2、293T细胞传代培养
(1)按照Opti完全培养基：DMEM完全培养基=1:4的比例，进行293T细胞培养，图1为293T细胞显微镜下的细胞白光图（10×）。消化DMEM完全培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至培养容器，根据细胞悬液体积及培养基比例计算Opti完全培养基和DMEM完全培养基的需要量，将细胞放入37℃、5%CO2培养箱中培养，得到已适应Opti：DMEM=1:4的比例培养基培养的293T细胞。
(2)按照Opti完全培养基：DMEM完全培养基=1:2的比例，进行293T细胞培养。消化已适应Opti：DMEM=1:4的比例培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至培养容器，根据细胞悬液体积及培养基比例计算Opti完全培养基和DMEM完全培养基的需要量，将细胞放入37℃、5% CO2培养箱中培养，得到已适应Opti：DMEM=1:2的比例培养基培养的293T细胞。
(3)按照Opti完全培养基：DMEM完全培养基=1:1的比例，进行293T细胞培养。消化已适应Opti：DMEM=1:2的比例培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至培养容器，根据细胞悬液体积及培养基比例计算Opti完全培养基和DMEM完全培养基的需要量，将细胞放入37℃、5% CO2培养箱中培养，得到已适应Opti：DMEM=1:1的比例培养基培养的293T细胞。
(4)按照Opti完全培养基：DMEM完全培养基=3:1的比例，进行293T细胞培养。消化已适应Opti：DMEM=1:1的比例培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至培养容器，根据细胞悬液体积及培养基比例计算Opti完全培养基和DMEM完全培养基的需要量，将细胞放入37℃、5% CO2培养箱中培养，得到已适应Opti：DMEM=3:1的比例培养基培养的293T细胞。
(5)按照100%Opti完全培养基进行293T细胞培养，其中Opti完全培养基中贴附因子重组人纤连蛋白的浓度为20 μg/ml。消化已适应Opti：DMEM=3:1的比例培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至培养容器，根据细胞悬液体积计算Opti完全培养基和贴附因子重组人纤连蛋白的需要量，将细胞放入37℃、5% CO2培养箱中培养，得到LS293T贴壁细胞。图2为贴附因子对细胞脱落率的影响图，从图中可以看出，贴附因子重组人纤连蛋白的浓度为20 μg/ml时细胞的脱落率最低。
(6)各比例培养基适应培养后需要冻存细胞留存，保留各阶段的细胞种子，细胞冻存使用无血清细胞冻存液。
其中，步骤(1)至(5)培养过程中操作要轻柔，避免剧烈晃动和吹洗，期间观察细胞贴壁情况及细胞增殖情况。至细胞完全适应该比例的培养基时，再进行下一比例培养基适应性培养。
图3为有血清培养基驯化293T细胞和无血清驯化293T细胞过程中增殖倍数对比图。图4为有血清培养基驯化293T细胞和无血清驯化293T细胞过程中细胞活率对比图。从图3和图4可以看出，有血清培养基驯化293T细胞和无血清驯化293T细胞过程中，细胞的增殖和活性都处于正常的状态。
实施例2
实施例2与实施例1的区别为步骤(5)中Opti完全培养基中重组人纤连蛋白的浓度为15 μg/ml。
实施例3
实施例2与实施例1的区别为步骤(5)中Opti完全培养基中重组人纤连蛋白的浓度为25 μg/ml。
对比例1
对比例1与实施例1的区别为步骤(5)中Opti完全培养基不含贴附引子重组人纤连蛋白：
对比例1的步骤(5)为：(5)按照100%Opti完全培养基进行293T细胞培养。消化已适应Opti：DMEM=3:1的比例培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至培养容器，根据细胞悬液体积计算Opti完全培养基的需要量，将细胞放入37℃、5% CO2培养箱中培养，得到100%Opti完全培养基培养的293T细胞，记为无血清293T细胞。
对比例2
(1)按照100%DMEM完全培养基进行293T细胞培养。消化DMEM完全培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至培养容器，根据细胞悬液体积及培养基比例计算DMEM完全培养基的需要量，将细胞放入37℃、5%CO2培养箱中培养，得到DMEM完全培养基培养的293T细胞。
(2)按照100%DMEM完全培养基进行293T细胞培养。消化步骤（1）得到的DMEM完全培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至培养容器，根据细胞悬液体积及培养基比例计算DMEM完全培养基的需要量，将细胞放入37℃、5% CO2培养箱中培养，得到DMEM完全培养基培养的293T细胞。
(3)按照100%DMEM完全培养基进行293T细胞培养。消化步骤（2）得到的DMEM完全培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至培养容器，根据细胞悬液体积及培养基比例计算DMEM完全培养基的需要量，将细胞放入37℃、5% CO2培养箱中培养，得到DMEM完全培养基培养的293T细胞。
(4)按照100%DMEM完全培养基进行293T细胞培养。消化步骤（3）得到的DMEM完全培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至培养容器，根据细胞悬液体积及培养基比例计算DMEM完全培养基的需要量，将细胞放入37℃、5% CO2培养箱中培养，得到DMEM完全培养基培养的293T细胞。
(5)按照100%DMEM完全培养基进行293T细胞培养。消化步骤（4）得到的DMEM完全培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至培养容器，根据细胞悬液体积及培养基比例计算DMEM完全培养基的需要量，将细胞放入37℃、5% CO2培养箱中培养，得到DMEM完全培养基培养的293T细胞，记为传代的293T细胞（含血清）。
(6)各步骤培养基适应培养后需要冻存细胞留存，保留各阶段的细胞种子，细胞冻存使用无血清细胞冻存液。
实验例：
一、利用实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞和对比例1培养得到的无血清293T细胞进行贴壁对比
图5为实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞和对比例1培养得到的无血清293T细胞的细胞贴壁图，实施例1中步骤(5)的Opti完全培养基中没有添加贴附因子重组人纤连蛋白，对比例1中步骤(5)的Opti完全培养基中添加了贴附因子重组人纤连蛋白。从图5中可以看出，添加了贴附因子的实施例1中293T细胞贴壁效果较好，没有添加贴附因子的对比例1中293T细胞贴壁效果较差。
二、利用实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞和对比例1培养得到的无血清293T细胞进行病毒包装和病毒滴度对比
1、将实施例1和对比例1培养得到的细胞进行扩增培养
(1)对实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞和对比例1培养得到的无血清293T细胞进行传代培养，计算细胞增殖倍数，细胞增值倍数对比图如图6所示，图6为实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞和对比例1培养得到的无血清293T细胞传代培养的细胞增殖倍数对比图，从图6中可以看出，添加贴附因子的实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞的细胞增值倍数优于没有添加贴附因子的对比例1。
(2)对实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞和对比例1培养得到的无血清293T细胞进行传代培养，记录细胞活性，细胞活率对比图如图7所示，图7为实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞和对比例1培养得到的无血清293T细胞的细胞活率的对比图，从图7中可以看出，添加贴附因子的实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞的细胞活率优于没有添加贴附因子的对比例1。
2、利用实施例1、对比例1和对比例2培养得到的细胞进行慢病毒包装，检测病毒包装能力
(1)将对比例2培养得到的传代的293T细胞（含血清）、实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞和对比例1培养得到的无血清293T细胞这3组细胞分别接种至相应的培养容器内（以T75培养瓶为例，每组1瓶），标记好分组；
(2)取3支50 ml离心管，1支中加入2 ml DMEM完全培养基，2支分别加入2 ml OPti完全培养基，根据质粒用量在1支DMEM完全培养基和2支OPti完全培养基离心管中加入各质粒，室温孵育5min以上；
(3)制备PEI培养基混合物：PEI加入量=质粒总质量×3÷PEI溶液浓度，取3支50ml离心管，1支中加入2ml DMEM完全培养基，2支中加入2ml OPti完全培养基，根据计算结果加入PEI溶液，混匀，室温孵育5 min以上；
(4)制备质粒PEI混合物：将PEI培养基混合物转移至对应的质粒培养基混合物中，混匀，室温孵育20~60 min；
(5)取出提前接种好的3组细胞，随机标记好组别，将孵育好的质粒PEI混合物按照4 ml/瓶，加入对应组别的细胞培养瓶中，混匀，置于CO2培养箱中进行培养；
(6)5~6 h后换液，每瓶加入新鲜的DMEM完全培养基、OPti完全培养基、含贴附因子重组人纤连蛋白的OPti完全培养基，置于CO2培养箱中继续培养；
(7)收获前至少18 h向慢病毒培养上清加入核酸酶处理，轻轻混匀，细胞放入培养箱中继续培养。
3、慢病毒收获
(1)转染70 h左右，荧光显微镜观察转染情况拍照，图8为对比例2培养得到的传代的293T细胞（含血清）质粒转染72 h白光和荧光图。图9为实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞质粒转染72 h白光和荧光图。图10为对比例1培养得到的无血清293T细胞质粒转染72 h白光和荧光图。分组收集慢病毒粗毒至50 ml离心管中，1500 g离心5~10 min，收集上清至新的50 ml离心管中，离心上清用0.45 μm滤器进行澄清，澄清液收集至50 ml离心管中。
(2)将澄清液转移至已高压灭菌的超速离心管中，25000 rpm、4℃离心2 h。
(3)离心结束，弃上清，慢病毒沉淀用慢病毒保存液回溶重悬，0.5~1 ml/管，2~8℃回溶。
(4)回溶结束，收集慢病毒悬液，取样检测TU，图11为对比例2培养得到的传代的293T细胞（含血清）、实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞和对比例1培养得到的无血清293T细胞的慢病毒产量图。剩余慢病毒分装于冻存管中，标签标注慢病毒名称、分装规格、分装日期等信息，置于-80℃冰箱保存。
从图11可以看出，对比例2培养得到的传代的293T细胞（含血清）得到的病毒滴度最高，实施例1培养得到的LS293T贴壁细胞得到的病毒滴度与对比例2培养得到的传代的293T细胞（含血清）得到的病毒滴度相差不大，对比例1培养得到的无血清293T细胞得到的病毒滴度较低。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种无血清培养驯化贴壁293T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将DMEM完全培养基培养的293T细胞接种至混合培养基中进行培养，得到混合培养基培养的293T细胞；其中所述混合培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为4:1~1:3；
将所述混合培养基培养的293T细胞接种至无血清培养基中进行培养，得到LS293T贴壁细胞，其中所述无血清培养基中包含贴附因子；所述贴附因子为重组人纤连蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
S1、将DMEM完全培养基培养的293T细胞接种至第一培养基中进行培养，得到第一培养基培养的293T细胞，其中所述第一培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为4:1；
S2、将所述第一培养基培养的293T细胞接种至第二培养基中进行培养，得到第二培养基培养的293T细胞，其中所述第二培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为2:1；
S3、将所述第二培养基培养的293T细胞接种至第三培养基中进行培养，得到第三培养基培养的293T细胞，其中所述第三培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为1:1；
S4、将所述第三培养基培养的293T细胞接种至第四培养基中进行培养，得到第四培养基培养的293T细胞，其中所述第四培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为1:3；
S5、将所述第四培养基培养的293T细胞接种至第五培养基中进行培养，得到LS293T贴壁细胞，其中所述第五培养基的组成为：无血清培养基和贴附因子；其中所述贴附因子为重组人纤连蛋白。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含血清培养基为DMEM完全培养基，所述无血清培养基为OptiPROSFM完全培养基。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述DMEM完全培养基的组成为DMEM高糖培养基和胎牛血清，其中DMEM高糖培养基和胎牛血清的体积比为40~50：5。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述OptiPROSFM完全培养基为的组成为OptiPROSFM培养基和谷丙氨酸二肽，其中OptiPROSFM培养基和谷丙氨酸二肽的体积比为48~50：1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组人纤连蛋白在无血清培养基中的浓度为15~20 μg/ml。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述将DMEM完全培养基培养的293T细胞接种至第一培养基中进行培养，得到第一培养基培养的293T细胞，包括：
消化DMEM完全培养基培养的293T细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293T细胞接种至第一培养基，将所述第一培养基放入37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。
8.如权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于，所述将所述第四培养基培养的293T细胞接种至第五培养基中进行培养，得到LS293T贴壁细胞之后，还包括：将所述LS293T贴壁细胞使用无血清细胞冻存液进行冻存。
9.一种权利要求1至7任一项所述的无血清培养驯化贴壁293T细胞的方法培养得到的LS293T贴壁细胞。
10.权利要求1至7任一项所述的无血清培养驯化贴壁293T细胞的方法和/或权利要求9所述的LS293T贴壁细胞在如下任意一种或多种中的应用：
a）培养扩增；
b）慢病毒包装。
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