CN107630039B

CN107630039B - 缺氧条件下诱导hpv16 e6/e7基因表达的慢病毒表达载体

Info

Publication number: CN107630039B
Application number: CN201710892010.4A
Authority: CN
Inventors: 宋海鹏; 叶海波; 王庆东
Original assignee: Changchun Lite Biotechnique Co ltd
Current assignee: Changchun Lite Biotechnique Co ltd
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2037-09-27
Also published as: CN107630039A

Abstract

本发明公开了一种在缺氧条件下诱导HPV16E6/E7基因表达的慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体含有缺氧反应元件、CMV‑最小启动子和HPV16E6/E7基因，所述慢病毒表达载体能够在缺氧条件下诱导造血干细胞定向分化为永生化的红系祖细胞，永生化的红系祖细胞又可以在正常供氧条件下继续分化为成熟红细胞。使用本发明提供的载体所诱导出的红细胞具有与正常成熟红细胞接近的变形性和结合、释放氧气的能力，血红蛋白含氧量可达28±2mmHg，并且其在输注小鼠体内后的10分钟至24小时直径开始变小，在第24小时细胞就显示出了成熟红细胞的形态，在机体内显示出很好的生存适应性。

Description

缺氧条件下诱导HPV16 E6/E7基因表达的慢病毒表达载体

技术领域

本发明公开了一种缺氧诱导表达慢病毒表达载体，属于分子生物学技术领域。

背景技术

血液是存在于人体血管和各种组织之中的一种重要物质，其具有运输、调节人体温度、防御、调节人体渗透压和酸碱平衡的生理功能。红细胞主要功能是运进氧气运出二氧化碳，白细胞的主要功能是杀灭细菌，抵御炎症，参与体内免疫发生过程，血小板主要在体内发挥止血功能，血浆功能主要为营养，运输脂类，缓冲，形成渗透压，参与免疫，参与凝血和抗凝血功能。这其中红细胞的运输氧气的功能尤为重要，是维持基本生命活动的关键因素。一旦人体失血过多，或者造血机能出现障碍，基本生命活动就会受到威胁。在相关的临床治疗过程中，输血是重要的辅助治疗手段，红细胞是最常用的血液输注成分。国内的临床血液供应依赖无偿捐献，在需求量持续扩大的同时无偿献血增长量却相对落后，这使得全国许多城市出现血液紧缺，无论是全血还是红细胞等成分血的供应都存在缺口。

为了弥补无偿献血量的增长相对滞后所带来的红细胞供应不足，科研人员开展了红细胞替代品的研究。目前开发的主要红细胞替代品有氟碳类化合物和血红蛋白氧载体，但这两种替代物都有各自局限，氟碳类化合物的携氧能力不强，体内代谢较缓慢且制备过程对临床使用的安全性有影响；血红蛋白氧载体尽管避免了血红蛋白直接输注导致的不良反应，但稳定性差，同时游离血红蛋白所产生的毒副作用也对人体有直接的伤害，这些缺点都限制了其在临床上的应用。所以，寻觅更有效的红细胞替代物具有非常现实的意义。

干细胞研究的蓬勃开展以及相关的生物学技术应用作为生命科学的研究热点之一，为再生医学带来了希望。目前在干细胞的应用方面，造血干细胞应用时间最久且效果已得到广泛验证。造血干细胞能分化为红细胞、血小板、T淋巴细胞等血液成分、重建人体造血系统，所以从1950年代骨髓移植开始，造血干细胞便在世界范围内广泛应用于临床，作为重建患者造血体系、治疗血液系统疾病的重要方法。1989年Gluckman主持了世界第一例脐带血造血干细胞移植，从此脐带血造血干细胞便广泛用于临床治疗。脐带血造血干细胞采集过程简单、对供者无任何伤害、实物储存且细胞状态更为原始的优点，都是骨髓及外周血不具备的，是理想的造血干细胞来源。

世界范围内的科学家在对造血干细胞的持续研究中发现，在人体内，造血干细胞选择红系方向分化成红系祖细胞，再由红系祖细胞继续分化成熟为红细胞，该过程非常复杂；在体外进行该诱导分化过程同样存在许多有待克服的问题，尤其是红细胞的规模化制备和红细胞分化成熟的效率方面，都制约了体外造血干细胞直接分化为红细胞的实际效果，从而限制了造血干细胞体外分化为红细胞的临床应用潜力。在体外进行造血干细胞分化为永生化的红系祖细胞株，再由扩增后的红系祖细胞株继续分化成熟为红细胞，从而为临床治疗提供相应永不亏谢的血液成熟细胞是可行的，这是能够弥补无偿献血量不足的新研究方向。

红系祖细胞作为造血干细胞的重要分化方向，世界范围内已广泛开展研究。在体外，红系祖细胞的定向分化扩增普遍采用细胞因子诱导，通常使用EPO(红细胞生成素)、IL-3(白介素-3)、SCF(干细胞因子)、CSF(集落刺激因子)等因子的组合进行培养。对于单纯的细胞因子诱导，其扩增分化效率与临床需要有相当距离。如果采用生物反应器，红系祖细胞的生成量确实可以大幅提高，但随之而来大幅增加的成本同样制约着临床使用。所以，如何在提高造血干细胞向红系祖细胞诱导分化效果的同时降低成本负担，对实际应用有重大意义。

四环素诱导系统是当前诱导人脐带血CD34+细胞定向分化为永生化的红系祖细胞系的一种方法。用慢病毒载有四环素感应基因的诱导系统短暂诱导人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6/E7基因的表达以产生永生化的红系祖细胞系。当撤除四环素时，这种永生化的红系祖细胞系可以定向分化为成熟红细胞。四环素诱导的缺点在于：诱导系统本身需要四环素长期使用对细胞产生毒性，即使在不存在四环素诱导时仍然会有E6/E7的泄露表达，以及作为转录激活因子的融合蛋白四环素转录激活因子和Hepers Simplex Virus的活性因子VP16本身在宿主细胞中作为外源蛋白可引起免疫原性反应。

低氧诱导系统法是另一种使细胞获得永生化的方法，该方法通过将低氧诱导基因的诱导系统短暂诱导人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6/E7基因使细胞获得永生化。与四环素诱导系统方法相比，此方法克服了上述四环素诱导系统对细胞的毒害和潜在的免疫原性。

目前使细胞永生化的病毒基因较多，如，hTERT、SV40、HPV16 E6/E7等病毒基因，其中，HPV E6和E7病毒基因是来自于女性宫颈癌细胞表达的产物，能够使人上皮细胞永生化(TsaoSA,WangXH,LiuY,“Establishmen t of two immortalized nasopharyngealepithelial cell linesusing SV40large T and HPV16E6/E7viral oncogenes”.Biochimica et Biophysica Acta,2002(1590):150-158)。HPV E6和E7病毒基因分别使得人类上皮细胞永生化的两个重要信号通路pRb-p16INK4a和p53失活，从而使细胞分别绕过M1和M2期，最终使细胞具有无限增值的能力。目前只有HPV E6和E7能够在诱导造血干细胞定向分化为红系祖细胞的条件下让干细胞分化并变成永生化的红系祖细胞。

缺氧是调控基因表达的高效调节因子。该类型的基因调控是介导于转录复合物缺氧诱导因子－1(HIF-1)与其同源DNA低氧反应元件(HER)的相互作用的结果。低氧诱导是通过组合9个促红细胞生成素(EPO)编码基因的3’端增强子的低氧反应元件(HER)和CMV最小启动子对目的基因表达进行调控。在缺氧情况下，转录复合物缺氧诱导因子(HIF-1)大量表达。当HIF-1特异性地结合低氧反应元件(HER)时激发并增强了最小的CMV操纵子对下游目的基因表达的调控；另一方面，缺氧也可提高促红细胞生成素(EPO)的表达有利于干细胞向红系祖细胞分化。

基于现有技术存在的问题，本发明的目的就是提供一种能够在缺氧条件下诱导HPVE6和E7的表达，在造血干细胞定向分化为红系祖细胞的培养条件下，使得造血干细胞定向分化为永生化的红系祖细胞的慢病毒表达载体，以及含有所述载体的造血干细胞、永生化红系祖细胞和红细胞。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种在缺氧条件下诱导HPV16 E6/E7基因表达的慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体含有缺氧反应元件、CMV-最小启动子。

在一个优选的实施方案中，所述缺氧反应元件为1-9个拷贝串联位于CMV-最小启动子的5’端。

更为优选地，所述缺氧反应元件为9个拷贝串联。

尤为优选地，所述HPV16 E6/E7基因位于CMV-最小启动子的3’端。

再为优选地，在所述缺氧反应元件的5’端设有长末端重复序列，在所述HPV16 E6/E7基因的3’端设置有PolyA尾。

最为优选地，所述慢病毒表达载体为pFUGW。

其次，本发明还提供了一种含有上述任一表达载体的造血干细胞。

在一个优选的实施方案中，，所述造血干细胞为CD34⁺细胞。

又次，本发明还提供了一种含有上述任一表达载体的永生化红系祖细胞。

最后，本发明还提供了一种含有上述任一所述表达载体的红细胞。

本发明提供的缺氧条件下诱导HPV16 E6/E7基因表达的慢病毒表达载体，以及以该载体诱导造血干细胞定向分化为永生化的红系祖细胞的方法的优点有：1)使用本发明提供的载体进行诱导可以避免长期外源基因表达引起的免疫原性反应；2)低氧诱导增加促红细胞生成素(EPO)的表达可提高血液干细胞分化为红系祖细胞的效率。

使用本发明提供的载体诱导出的红细胞具有与正常成熟红细胞接近的变形性和结合、释放氧气的能力，血红蛋白含氧量可达28±2mmHg，并且其在输注小鼠体内后的10分钟至24小时直径开始变小，并且在第24小时细胞就显示出了成熟红细胞的形态，在机体内显示出很好的生存适应性。

附图说明

图1.pFUGW－H9-E6/E7线性结构示意图；

图2.pFUGW－H9-E6/E7质粒结构示意图；

图3.pFUGW－H9-E6/E7单个酶切位点示意图；

图4.pFUGW－H9-E6/E7质粒限制酶切电泳图谱；

图5.慢病毒转染血液干细胞GFP表达的细胞数目流式检测图；

图6.低氧条件下永生红系祖细胞的生成示意图；

图7.血液干细胞向红系细胞分化过程中的形态学图谱；

图8.分化过程中红系细胞标记物表达的流式分析图谱；

图9.应用本发明提供的载体诱导出的永生化红系祖细胞形态观察图；

图10.永生化红系祖细胞继续分化成的成熟红细胞形态观察图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1缺氧诱导CD34⁺造血祖细胞分化为永生化红系祖细胞

1.pFUGW-HRE-E6/E7载体构建

将9个拷贝的缺氧反应元件Epo HRE序列(CCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAG)与CMV最小启动子偶联，并与HPV16 E6/E7和SV40多腺苷酸化信号(polyA)连接。然后将含有9拷贝的HRE序列(H9)、CMV最小启动子、HPV16 E6/E7和SV40多腺苷酸化信号(polyA)的表达盒克隆入慢病毒载体pFUGW(Addgene)的2597-4160位点之间，产生pFUGW－H9-E6/E7载体，构建图谱见图1。图1中，HRE：缺氧反应元件，CMVminPro：巨细胞病毒最小启动子，人乳头瘤病毒E6/E7基因，Ubc为Ubiqutin启动子；EGFP为绿色荧光基因，WPRE为土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。图2为pFUGW－H9-E6/E7质粒结构示意图(H9-E6/E7表达盒在插入pFUGW的PacI的时候，因为是处理成平端插入，因此PacI位点被破坏)。BamHI的具体位置见图3；通过测序和限制性酶切电泳图谱对表达盒的序列进行鉴定。图4为限制酶切电泳图谱确认pFUGW－H9-E6/E7质粒。限制酶BamHI消化正向和反向H9-E6/E7插入pFUGW慢病毒载体的PacI平端处理位点上。1:正向质粒BamHI消化后产生4条带(8710，1504，813，477；2:反向质粒BamHI消化后产生4条带(8939，1275，813，520)。制作永生红系祖细胞用反向质粒以避免慢病毒原配CMV启动子驱动HPV－E6/E7的表达。

2，转染

慢病毒在293T细胞中制备，病毒载体pFUGW-H9-E6/E7和病毒包装辅助载体psPAX2、pMD2G一起用标准氯化钙沉淀方转染进293T细胞中。病毒在转染48小时后收集，经22um滤膜，超速离心纯化后悬浮与100ul DMEM培养液。鉴定病毒滴度，用MOI＝20,在4ug/mlpolybrene共存下，侵染2×10⁵血液干细胞，48小时后用流式检测GFP表达的细胞数目。检测结果为可得28.5％的侵染率(见图5右图，左图为无感染阴性对照)。

3.缺氧条件下诱导红系祖细胞永生化

将冻存的3×10⁵个分离于骨髓的成年人CD34⁺造血祖细胞(购自Stemcell)在基础培养基IMDM中复苏(购自Biochrom)24小时，所述培养基中含有3％(v/v)的AB血清，10ug/ml胰岛素，3U/ml的肝素，2％(v/v)胎牛血清，3U/ml EPO，200ug/ml转铁蛋白，10ng/ml干细胞因子(SCF)，1ng/ml白细胞介素-3(IL-3)。

第2天，慢病毒载体pFUGW-HRE-E6/E7转染复苏后的造血干细胞，并在基础培养基中培养四天，第5天时，将其转移至扩展培养基StemSpan SFEM(购自Stem celltechnologies)，所述培养基中加有50ng/ml SCF,3U/ml Epo，10^-6M地塞米松，并在37℃，94％N₂,5％CO₂和1％O₂，细胞密度为1–3×10⁵的缺氧条件下诱导HPV16 E6/E7表达，每三天更换一次培养基，保持培养条件直至细胞浓度至1-3×10⁵个/ml。

永生化细胞的鉴定：通常情况下血液干细胞在诱导分化条件下分化成红系祖细胞，大约需要21天的时间，在分化的第十天细胞增值到最大量，接着细胞数目的增加频度不断减少到最后停止生长。永生的红系祖细胞在持续有HPV16 E6/E7的表达下细胞数目可以不断增加并可在培养190天后超过海佛列克极限(Hayflick limit,人源细胞具有的分裂极限，大约在40-60次)。在培养超过海佛列克极限后冻存仍可有效复苏。通过细胞形态学分析，永生化细胞显示前或早期的嗜碱性有核红细胞。

图6给出了低氧条件下永生红系祖细胞的生成示意图。培养一天的血液干细胞用慢病毒载入低氧诱导的HPV16E6/E7，在红细胞分化条件的培养下低氧诱导HPV16E6/E7的表达获得永生红系祖细胞(D，天数缩写)。下方方格内为各阶段培养因子及培养条件的使用。最下方格为培养基的使用。血液干细胞红系分化使用的各培养因子用量为：SCF(干细胞因子)10ng/ml，EPO 3U/ml,IL-3(白细胞介素-3)1ng/ml,Insulin(胰岛素)10ug/ml,Transferrrin(转铁蛋白)200ug/ml,Heparin(肝素)3U/ml.所述培养基中含有3％(v/v)的AB血清，2％(v/v)胎牛血清。永生化及培养条件，培养因子使用量为：SCF 50ng/ml，EPO3U/ml，Dexamethasone(地塞米松)1uM，及低氧(94％N₂，5％CO₂，1％O₂)。

实施例2.红系祖细胞永生化分化为成熟红细胞

缺氧条件下诱导的永生化红系祖细胞在培养100天后中止缺氧培养并转入使用红细胞终端分化培养条件进行培养。终端红细胞的获得速度与用干细胞直接分化为红细胞的速度基本接近。具体步骤如下：

将获得永生化的红系祖细胞转移至基础培养基，在37℃，94％N₂，5％CO₂和1％O₂的缺氧条件下培养8天。将基础培养基转变为分化培养基(基础培养基加入500ug/ml肝素，但是不含SCF和IL-3)。并且在正常供氧条件下(95％空气和5％CO₂)。第6天，细胞浓度维持在1-2×10⁵/ml时，加入新鲜培养基，将细胞浓度维持在1×10⁶/ml，培养至第18天。然后每天收集1×10⁵细胞，离心铺于玻片上用于吉姆萨染色(Sigma Ardrich)，以确定分化成熟的红细胞的形态，在第18天使用Coulter ACTdiff(Beckman coulter))评价标准的血液学参数：

MCV(mean cell volume，红细胞平均体积):138±4.2fL；

MCHC(mean corpuscular hemoglobin concentration，红细胞平均血红蛋白浓度)：25±0.5％；

MCH(mean cell hemoglobin平均细胞血红蛋白)：35±1.6pg/ml。

通过白细胞滤器(Leucolab LCG2,Macopharma)过滤纯化获得无核细胞群。

图7给出了实施例2中血液干细胞的无核红细胞的分化。细胞形态在血液干细胞向红系细胞分化的第9天，第16天和第22天。无核红细胞出现在细胞分化的第22天，标志着红细胞分化成熟，显示为成熟红细胞形态学特征。图8是使用流式分析红系细胞标记物的表达的图谱。祖系红细胞呈现CD235a和CD71共表达，成熟红细胞呈现CD235a高表达而CD71的表达有所下降。图8左图表示在第16天时细胞的抗原表达图谱，仍然呈祖系红细胞的抗原特征，右图为第22天时细胞的抗原表达图谱，CD235a高表达，CD71的表达量下降，显示为成熟红细胞抗原表达特征。图9为应用本发明提供的载体诱导出的永生化红系祖细胞，图10为所得到的永生化红系祖细胞继续分化成的成熟红细胞。

实施例3.诱导红细胞的功能性评价

使用Hemox Analyzer(TCS Scientific Corp)测量本发明诱导产生的红细胞的氧结合能力,将培养的血细胞在空气中充分氧化，继而在氮气箱完全脱氧，用Clark氧电极探头测量氧张力在有氧和无氧之间的变化程度，同时记入氧合血红蛋白在双波分光光度的波长值。以人外周全血作为对照。测量变形度利用ARCR(Automated Rheoscope and cellanalyzer)。

永生化细胞在有氧条件下终止永生化，在红细胞终端分化条件下分化为成熟无核红细胞－网织红细胞，其占细胞总体的大约42％。该类细胞含有86-88％的成人血红蛋白，14-12％胎儿血红蛋白。本发明诱导生产的红细胞的血红蛋白含氧量可达28±2mmHg，其结合与释放氧气的能力也与正常红细胞接近；红细胞变形程度可达11％－17％，与正常的成熟无核红细胞－网织红细胞接近。以上性能的获得是诱导红细胞未来作为治疗红细胞障碍疾病药物的应用的重要的质量保证。

实施例4.诱导红细胞的适应性评价

为评价本发明永生化细胞系分化出的红细胞在体内的存活情况，向成年NSG免疫缺陷小鼠静脉注射脂质体包裹的二氯亚甲基二膦酸杀死其体内的巨噬细胞，然后通过左侧尾静脉向小鼠体内输注数量级为1.7×10⁸标记CFSE的本发明诱导出的红细胞(简称诱导红细胞)，并以2×10⁸个成年小鼠供体红细胞作为平行对照。在输注后的10,20,40,60,120,240,480分钟从右侧尾静脉抽取外周血，之后每天抽取一次直至第9天。然后进行抗人血型糖蛋白A(CD235a)耦合APC(别藻蓝蛋白)染色，进行流式细胞和共聚焦显微镜分析。分析结果显示，在评价时间段内，诱导红细胞和供体红细胞在小鼠循环系统内的存活率没有显著差异。在输注后的10分钟和24小时之间诱导红细胞的开始直径变小，并且在第24小时细胞显示出了成熟红细胞的形态。

Claims

1.一种在缺氧条件下诱导HPV16 E6/E7基因表达的慢病毒表达载体pFUGW，其特征在于，所述慢病毒表达载体pFUGW含有位于5’端的9个拷贝串联的序列为CCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAG的缺氧反应元件Epo HRE、CMV-最小启动子，位于3’端的HPV16 E6/E7基因。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，在所述缺氧反应元件的5’端设有长末端重复序列，在所述HPV16 E6/E7基因的3’端设置有PolyA尾。

3.一种含有权利要求1或2所述表达载体的造血干细胞。

4.根据权利要求3所述的造血干细胞，其特征在于，所述造血干细胞为CD34⁺细胞。

5.一种含有权利要求1或2所述表达载体的永生化红系祖细胞。

6.一种含有权利要求1或2所述表达载体的红细胞。