CN115948472B - 诱导过表达的runx1在构建耗竭t细胞模型中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了诱导过表达的RUNX1在构建耗竭T细胞模型中的应用。本发明创造性地通过诱导RUNX1过表达构建了CD8+耗竭T细胞模型，RUNX1过表达诱导的耗竭模式具有多样性，且RUXN1表达量可控，为体外筛选靶向RUNX1调控T细胞功能的药物提供了细胞模型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及诱导过表达的RUNX1在构建耗竭T细胞模型中的应用。
背景技术
T细胞耗竭是指常见慢性感染和癌症患者体内T细胞功能丧失。由于长期暴露于持续性抗原和炎症，T细胞逐渐失去效应功能，记忆T细胞特征也开始缺失。不过这种耗竭是可以逆转的，至少部分逆转，这主要通过阻止PD-1之类的抑制性通路。现有技术主要通过动物模型和在体外诱导，存在时间长，操作复杂等问题。
CN108220243A公开了一种多能干细胞及其分化的T细胞和应用，所述多能干细胞包含有Runx1和Hoxa9串联共表达载体，通过将外源Runx1和Hoxa9共表达载体引入多能干细胞中，成功构建了诱导性共表达外源Runx1和Hoxa9的多能干细胞，所述多能干细胞定向分化为T谱系祖细胞，并将发育为T细胞，但此方法存在着表达载体量不可控，T细胞表型多样，并非耗竭表型等问题。
综上所述，目前构建CD8+T细胞耗竭模型存在时间长，操作复杂，表达载体量不可控等问题。提供一种操作简单，耗竭模式多样性的CD8+耗竭T细胞模型已成为是生物技术领域亟待解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供诱导过表达的RUNX1在构建耗竭T细胞模型中的应用，解决了目前动物模型和体外诱导构建CD8+T细胞耗竭模型存在的时间长，操作复杂，表达载体量不可控等问题，实现了便捷高效的构建CD8+耗竭T细胞模型，且诱导的耗竭模式具有多样性，载体表达量可控。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了诱导RUNX1过表达在构建CD8+T细胞耗竭模型中的应用。
本发明创造性地通过诱导RUNX1过表达构建了CD8+耗竭T细胞模型，RUNX1过表达诱导的耗竭模式具有多样性，且RUXN1表达量可控，为体外筛选靶向RUNX1调控T细胞功能的药物提供了细胞模型。
优选地，所述诱导RUNX1过表达的试剂包括含有编码RUNX1的核酸序列的表达载体。
第二方面，本发明提供了一种构建CD8+T细胞耗竭模型的方法，所述方法包括：
提高细胞内RUNX1水平，获得所述CD8+T细胞耗竭模型。
可以理解，本发明发现提高胞内RUNX1水平能够促进细胞耗竭，本领域提高细胞内蛋白水平的技术手段均适用于本发明，提高RUNX1水平可采用多种手段，如构建过表达载体、使用强启动子等等。
优选地，所述方法包括：
诱导表达型慢病毒表达载体构建，慢病毒包装，慢病毒感染，稳定表达细胞筛选和耗竭模型诱导。
第三方面，本发明提供了诱导RUNX1过表达的试剂在制备构建CD8+耗竭T细胞模型的产品中的应用。
第四方面，本发明提供了一种构建CD8+耗竭T细胞模型的产品，所述产品包括诱导RUNX1过表达的试剂。
优选地，所述诱导RUNX1过表达的试剂包括含有编码RUNX1的核酸序列的表达载体。
第五方面，本发明提供了根据第四方面所述的产品，所述产品还包括辅料助剂。
优选地，所述辅料助剂包括人IL-2、T细胞激活试剂、G418、胎牛血清和抗生素。
第六方面，本发明提供了一种CD8+耗竭T细胞模型，所述模型由第二方面所述的方法制备得到。
第七方面，本发明提供了根据第六方面所述的CD8+耗竭T细胞模型在制备免疫治疗产品中的应用。
优选地，所述免疫治疗产品包括预防和/或靶向治疗肿瘤的产品。
优选地，所述肿瘤包括髓系白血病和/或实体肿瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明创造性地通过诱导RUNX1过表达构建了CD8+耗竭T细胞模型，不同浓度的Dox诱导RUNX1表达量不同，RUXN1表达量可控，RUNX1过表达诱导的耗竭模式具有多样性，为体外筛选靶向RUNX1调控T细胞功能的药物提供了细胞模型。
附图说明
图1A为不同浓度的多西环素(Dox)处理诱导经过慢病毒感染构建好的RUNX1稳定表达的Jurkat细胞中RUNX1 mRNA q-PCR检测结果统计图；
图1B为不同浓度的多西环素(Dox)处理诱导经过慢病毒感染构建好的RUNX1稳定表达的Jurkat细胞中PD-1mRNA q-PCR检测结果统计图；
图2为RUNX1诱导表达的慢病毒表达载体质粒图谱；
图3A为5μg/mL多西环素(Dox)处理诱导经过慢病毒感染构建好的RUNX1稳定表达的Jurkat细胞和对照组Jurkat细胞中eGFP阳性细胞亚群中PD-1阳性细胞比例的流式细胞分析检测结果图；
图3B为5μg/mL多西环素(Dox)处理诱导经过慢病毒感染构建好的RUNX1稳定表达的Jurkat细胞和对照组Jurkat细胞中eGFP阳性细胞亚群中PD-1平均荧光强度的流式细胞分析检测结果统计图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例中在Jurkat细胞(可一定程度模拟人T细胞)中通过慢病毒转染和G418药物筛选的方式构建了RUNX1诱导表达的稳定细胞株。Jurkat细胞与慢病毒液共培养12小时后去除含慢病毒液的培养基，更换为新鲜培养基继续培养48小时后，更换为含有G418(工作浓度为300μg/mL)的培养基培养48小时后，更换为不含G418的新鲜培养基，培养24小时后，取5×10^5个细胞添加多西环素(Doxcycline，Dox，工作浓度为5μg/mL)培养24小时后，流式细胞检测含有绿色荧光(eGFP)细胞比例。确定转染成功后，分别给对照组(RUNX1 CK)和RUNX1过表达组(RUNX1 UP)添加工作浓度为1μg/mL和5μg/mL的多西环素(Doxcycline，Dox)培养24小时后，收集细胞进行q-PCR检测。
结果显示不同浓度的DOX处理诱导RUNX1表达后，RUNX1的mRNA水平有显著性差异(图1A)，同时PD-1的mRNA水平改变趋势(图1B)也与RUNX1一致。有相关研究报道，不同肿瘤病人的T细胞耗竭表型和程度不一样，且PD-1的表达也不一致，即PD-1这些T细胞耗竭标记物的表达量可反映T细胞耗竭表型和耗竭程度。本实施例中的这些结果表明通过改变加入的多西环素浓度可调节过表达RUNX1的量，进而影响PD-1的表达量，即通过改变RUNX1表达诱导剂的浓度，调控RUNX1的表达量，从而实现对PD-1的表达量的调控。
实施例2
本实施例中在Tet-on表达载体中构入RUNX1编码区基因序列和绿色荧光(eGFP)基因序列，形成RUNX1诱导表达的慢病毒表达载体(图2)。使用psPAX2和pMD2G慢病毒包装辅助质粒，在293T细胞中包装RUNX1过表达和对照组慢病毒。收集细胞培养上清，经过0.45μm的PVDF膜过滤后，10万g离心力，4℃离心2.5小时浓缩慢病毒。离心后去除上清，使用500μL的无血清1640培养基重悬慢病毒沉淀后，分装成5管，液氮速冻，-80℃保存备用。
选择增殖状态好的Jurakt细胞，去除培养基后，重悬成1×10^6细胞/mL的细胞悬液。取100μL细胞悬液(1X10^5细胞)，加入1管慢病毒液(100μL重悬慢病毒液)，补充含血清1640培养基至500μL培养体系，培养12小时后，去除含病毒的培养基，更换为新鲜含10％胎牛血清的1640培养基继续培养48小时后，更换为含有G418(工作浓度为300μg/mL)的培养基培养48小时后，更换为不含G418的新鲜培养基，培养24小时后，取5×10^5个细胞添加多西环素(Doxcycline，工作浓度为5μg/mL)培养24小时后，流式细胞检测含有绿色荧光(eGFP)细胞比例，确定细胞能否转染成功。
实施例3
本实施例中在Jurkat细胞(可一定程度模拟人T细胞)中通过慢病毒转染和G418药物筛选的方式构建了RUNX1诱导表达的稳定细胞株。Jurkat细胞与慢病毒液共培养12小时后去除含慢病毒液的培养基，更换为新鲜培养基继续培养48小时后，更换为含有G418(工作浓度为300μg/mL)的培养基培养48小时后，更换为不含G418的新鲜培养基，培养24小时后，5×10^5个细胞添加多西环素(Doxcycline，Dox，工作浓度为5μg/mL)培养24小时后，流式细胞检测含有绿色荧光(eGFP)细胞比例。确定转染成功后，分别给对照组(RUNX1CK)和RUNX1过表达组(RUNX1 UP)添加工作浓度为工作浓度为1μg/mL和5μg/mL的多西环素(Doxcycline，Dox)培养24小时后，收集细胞进行流式细胞分析检测。
流式细胞分析的结果显示，与对照组相比，RUNX1过表达组中PD-1阳性的细胞比例增加(图3A)，且PD-1的平均荧光强度显著升高(图3B)。这些结果表明RUNX1过表达可促进PD-1的表达，即过表达RUNX1可诱导T细胞表达T细胞耗竭相关标记物PD-1，呈耗竭表型。
综上所述，本发明创造性地通过诱导RUNX1过表达构建了CD8+耗竭T细胞模型，不同浓度的Dox诱导RUNX1表达量不同，RUXN1表达量可控，RUNX1过表达诱导的耗竭模式具有多样性，为体外筛选靶向RUNX1调控T细胞功能的药物提供了细胞模型。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (3)
1.多西环素诱导RUNX1过表达在构建CD8+ T细胞耗竭模型中的应用，其特征在于，所述CD8+ T细胞耗竭模型采用如下方法进行构建，所述方法包括以下步骤：
向表达载体中构入RUNX1编码区基因序列，形成诱导表达型慢病毒表达载体；
使用慢病毒进行包装，再用慢病毒感染Jurkat细胞；
使用多西环素诱导提高细胞内RUNX1水平，筛选稳定表达的细胞并得到CD8+ T细胞耗竭模型；
所述诱导表达型慢病毒表达载体的图谱如附图图2所示，所述多西环素诱导的多西环素工作浓度为1 μg/mL或5 μg/mL，所述多西环素诱导的诱导时间为24小时。
2.一种构建CD8+ T细胞耗竭模型的方法，其特征在于，所述方法包括：
向表达载体中构入RUNX1编码区基因序列，形成诱导表达型慢病毒表达载体；
使用慢病毒进行包装，再用慢病毒感染Jurkat细胞；
使用多西环素诱导提高细胞内RUNX1水平，筛选稳定表达的细胞并得到CD8+ T细胞耗竭模型；
所述诱导表达型慢病毒表达载体的图谱如附图图2所示，所述多西环素诱导的多西环素工作浓度为1 μg/mL或5 μg/mL，所述多西环素诱导的诱导时间为24小时。
3.权利要求2所述的构建CD8+ T细胞耗竭模型的方法在构建CD8+ T细胞耗竭模型中的应用。
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| CN114072166A (zh) * | 2019-05-14 | 2022-02-18 | 泰加生物工艺学公司 | 用于治疗t细胞耗竭的组合物和方法 |
| CN112877366A (zh) * | 2020-03-10 | 2021-06-01 | 广州复能基因有限公司 | 用于检测来自dna或rna生物体的样品靶标的可掺入参照标准品 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CD8+T细胞耗竭及靶向CD8+T细胞免疫治疗的研究进展;孙建军等;《免疫学杂志》;第32卷(第09期);第816-820页，摘要、第817页第1栏第1段及图1、第818页第1栏第2段第2栏倒数第2段、第819页第1栏第2段 * |
| Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade;Rohit R Jadhav等;《Proc Natl Acad Sci U S A》;第116卷(第28期);第14113-14118页 * |
| 孙建军等.CD8+T细胞耗竭及靶向CD8+T细胞免疫治疗的研究进展.《免疫学杂志》.2016,第32卷(第09期),第816-820页，摘要、第817页第1栏第1段及图1、第818页第1栏第2段第2栏倒数第2段、第819页第1栏第2段. * |
| 肿瘤免疫治疗相关PD-1分子表达的调节因素分析;贺庆;高华;王军志;;中国新药杂志;29(13);第1478-1484页 * |
| 贺庆 ; 高华 ; 王军志 ; .肿瘤免疫治疗相关PD-1分子表达的调节因素分析.中国新药杂志.2020,29(13),第1478-1484页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115948472A (zh) | 2023-04-11 |
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