CN112877366A - 用于检测来自dna或rna生物体的样品靶标的可掺入参照标准品 - Google Patents
用于检测来自dna或rna生物体的样品靶标的可掺入参照标准品 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112877366A CN112877366A CN202110263323.XA CN202110263323A CN112877366A CN 112877366 A CN112877366 A CN 112877366A CN 202110263323 A CN202110263323 A CN 202110263323A CN 112877366 A CN112877366 A CN 112877366A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- rna
- sample
- detection
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 150
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 34
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims abstract description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 197
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 103
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 88
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 80
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 78
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 74
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 69
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 69
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 63
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 63
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 51
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 44
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 31
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 30
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 27
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 24
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 claims description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 10
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 9
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims description 8
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims description 8
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 claims description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 8
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 claims description 8
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 claims description 7
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 7
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 claims description 7
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims description 6
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 4
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims description 2
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 claims description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 2
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 claims description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 claims description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 2
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 claims description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 claims description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 2
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 claims description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 2
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 claims description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 claims description 2
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 claims description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 2
- 241000725681 Swine influenza virus Species 0.000 claims description 2
- 241000609666 Tuber aestivum Species 0.000 claims description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001371 inclusion conjunctivitis Diseases 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 claims description 2
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010044325 trachoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 abstract description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 152
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 73
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 72
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 50
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 239000000047 product Substances 0.000 description 37
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 36
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 33
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 22
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 description 19
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 16
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 16
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 16
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 15
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 13
- 238000013461 design Methods 0.000 description 12
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 8
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 8
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 8
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 101000576320 Homo sapiens Max-binding protein MNT Proteins 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 7
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 6
- 101100532034 Drosophila melanogaster RTase gene Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 6
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 4
- 239000012162 RNA isolation reagent Substances 0.000 description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700023317 Coronavirus Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 2
- 239000013616 RNA primer Substances 0.000 description 2
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 208000021601 lentivirus infection Diseases 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 2
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- WHBHBVVOGNECLV-OBQKJFGGSA-N 11-deoxycortisol Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 WHBHBVVOGNECLV-OBQKJFGGSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 101150071673 E6 gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 description 1
- 241001534160 Escherichia virus Qbeta Species 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100281953 Homo sapiens GAPDH gene Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000701029 Murid betaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000748245 Villanova Species 0.000 description 1
- 101150054399 ace2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012372 quality testing Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
- C12N2740/15052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及用于定性和定量检测如新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)RNA的掺入(Spike‑in)采集样品的阳性参考品。
Description
技术领域
本发明属于诊断领域。具体地,本发明涉及用于定量检测样品中的核酸靶标的重组病毒颗粒及其应用。
背景技术
冠状病毒感染人体可导致肺炎,如COVID-19等。对冠状病毒的核酸快速检测已成为控制病毒扩散、病人诊断、治疗及预防的重要技术之一。自2019年12月由新型冠状病毒2019-nCoV(2020年2月12日国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为“SARS-CoV-2”),感染人体产生新型冠状病毒肺炎流行(世界卫生组织将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”),发现2019-nCoV携带者、易感人群、发病率、治病率和死亡率,已成为国内外政府和人们十分关注和敏感的问题。对2019-nCoV的核酸快速检测已成为控制病毒扩散、病人诊断、治疗及预防的重要技术之一。
目前,国内外已针对2019-nCoV研发试剂盒。3月6日,国家药品监督管理局共批准新冠病毒核酸检测试剂10个,抗体检测试剂5个(图1)。但由于缺乏可用于2019-nCoV核酸检测试剂盒及相关设备的与2019-nCoV相似的阳性对照品,不能对这些已推出使用的核酸检测试剂盒,及其相关设备获得的检测结果的精确性(阳性和阴性)作出很好的判断,即便出现假阴性,也并不可靠,更不能计算待测样本的单位体积病毒颗粒数量(如500病毒颗粒/ml)。2月12日,美国CDC表示,他们自研的检测试剂盒被证实存在缺陷,随后被紧急撤回。这批测试套件中的一个部件缺陷,导致全美众多公共卫生实验室无法使用。
鉴于此,迫切需要能准确反映检测准确性及定量2019-nCoV的参照标准品去确认假阳性,并从定性提升到定量,以便更好地观察冠状病毒RNA的动态分析,并用于对病人治疗标准的判断。
此外,能准确反映检测准确性及定量2019-nCoV的参照标准品也可用于新药实验,通过不同时期的病毒载量(viral load)(Zou,et al.2020,Kim,et al.2020,Pan,etal.2020)来评估药物的作用及其质量。
聚合酶链反应(PCR)自20世纪90年代初以来被广泛用作诊断工具。聚合酶链反应的使用通过在各种样品中提供快速、特异和灵敏的微生物核酸检测,彻底改变了微生物的诊断检测。最初,假阳性结果是以前产生的扩增子反应污染的结果,是使用这种新技术的人主要关心的问题。采取措施避免预扩增核酸的污染,并通过引入实时聚合酶链反应实现了实质性的改进。这是因为实时聚合酶链反应是一个封闭的管系统,不需要扩增子的聚合酶链反应后分析;当应用这项技术时,仍然被认为是污染和假阳性结果的主要来源。此外,人们越来越重视将假阴性结果的影响降至最低;即确保阴性结果真正代表聚合酶链反应诊断靶的缺失。这是因为假阴性结果可能由测试步骤之一(核酸提取、反转录反应、聚合酶链反应建立或扩增)的失败而产生。第一种控制假阴性结果的方法是在聚合酶链反应中加入与被检测靶标核酸序列不同的外源核酸,作为反应体系的掺入内标(Spike in Internalcontrols)通常是质粒DNA,在样品中存在任何PCR扩增抑制物质都会降低或完全抑制核酸的扩增。基于此原理,公开的文献已披露使用质粒的单个和多个内部质控品,用于几种病原体的诊断(et al.2003,Dingle et al.2004,Hymas et al.2005,Maaroufi etal.2006)。
然而,这种掺入内标方法仅可用于评估扩增步骤引起的假阴性。在检测病毒核酸的情况下,也有必要控制扩增前的各个步骤,例如从血浆中收集病毒颗粒和提取病毒核酸,使用咽拭子采集新冠病毒并保存在一定的储存液,在一定的时限内提取病毒RNA再进行RT-PCR核酸检测。需要使用新的方法克服这种局限性。最初,在核酸提取之前加入外源核酸,用来评估核酸提取的效率,但无法正确评估在样本采集过程中病毒颗粒的丢失。因此,理想的对照品(标准品)应该是能被保护的核酸,需要有在结构上和待检病毒颗粒有相似并存在与RT-PPCR病毒核酸检测的全过程。此外,受保护的DNA或RNA的构建将保护核酸在长期储存后免受核酸酶或水解的降解,如果病毒RNA作为对照品,这一点尤其重要。
病毒或假病毒颗粒,含有与待测核酸靶标相同种类的核酸(DNA或RNA),结构稳定,设计为与待测病原体同时经历相同的步骤,已用于病毒靶标的检测分析(Cleland etal.1999,Garson et al.2005,Clancy et al.2008)。出于人类和动物的安全性,科学家优先选择了非致病性病毒为基本骨架进行改造,并可掺入待测样本的内标(Dreier etal.2005,Gerriets et al.2008,Ninove et al.2011)。
在本发明前,实时荧光PCR反应分析中使用了两类外源性内标。竞争性掺入内标具有与待测样本靶标相同引物的序列,可以在同一PCR反应中使用和待测靶标相同的引物对,但使用掺入内标和待测靶标的探针序列不同。非竞争性内标碱基百分比组成和序列与待测样本靶标完全不同的检测序列。竞争性内标可以模拟靶序列的扩增动力学;然而,它会在低浓度待测靶标PCR反应体系中与待测靶序列竞争。完全与靶标序列不同的非竞争性掺入内标可以被设计和制备成适合使用于几个待测靶序列;非竞争性质控品的扩增通常不能反映待测靶序列的扩增动力学(Rosenstraus et al.1998,Hoorfar et al.2004,Sharma etal.2014)。因此,需要根据不同的检测需求选择竞争性和非竞争性内标。
已发表的相关文献中,利用牛腹泻病毒(Cleland et al.1999)、犬瘟热病毒(Clancy et al.2008)、鼠巨细胞病毒(Garson et al.2005)以及T4和MS2噬菌体(Dreieret al.2005,Rolfe et al.2007,Gerriets et al.2008,Ninove et al.2011),制备非竞争性内标并用于包括丙型肝炎病毒(HCV)在内的多种DNA和RNA病毒的检测。
以噬菌体λ和Q β为骨架基础研发的竞争性内标的模拟假病毒已用于多种病毒的检测(et al.2003,&Berg 2004,Villanova et al.2007,Meng etal.2009);针对待测靶标的竞争性假病毒内标包含病原体特异性靶标核酸序列和由噬菌体λ和病毒的外壳蛋白,例如基于MS2外壳蛋白制备的第一个被称为“装甲RNA”的商业化竞争内标(Pasloske et al.1998)。还有多种竞争性内标使用的报道(WalkerPeach etal.1999,Drosten et al.2001,Beld et al.2004,Cheng et al.2006,Zhao et al.2007,Wei et al.2008,Meng et al.2009,Zhan et al.2009,Felder&2014,Sharma etal.2014)。Zambenedetti等人报道了以MS2噬菌体为基础,构建了利用大肠杆菌为宿主制备的竞争性内标的模拟病毒,并经测试把各种竞争性内标的假病毒用于丙型肝炎病毒的诊断过程中的监控提取、反转录、扩增和检测等步骤。这种模拟病毒和待测病毒靶标序列的不同之处只限于荧光探针结合序列的21个碱基中的14个碱基排列的差别(Zambenedetti etal.2017)。此模拟病毒设计作为竞争性内标,并没有解决二十几年前Gibson报道的竞争性内标设计的(Gibson et al.1996)。在实时定量PCR或RT-PCR反应体系中,含有竞争性内标的模拟病毒颗粒数和待测样本靶标病毒颗粒数相差太多时,多者减少少者的扩增效率,甚至完全完全抑制少者的扩增,这种抑制机制是很复杂的,包括在PCR或RT-PCR过程中反应体系的dNTP、二价Mg2+、酶活性和磷酸化(PPi)的变化引起的动力学的变化。
本发明是为解决上述竞争性内标的缺点,利用含有掺入已精确定量的掺入内标使待测靶标的定性检测更准确,并且可根据掺入内标的模拟病毒拷贝数或由其衍生的DNA、RNA、cDNA掺入内标分子数(拷贝数),可以较精准的计算待测样本中待测靶标(病毒、DNA或RNA)的拷贝数。
参考文献:
Beld M,Minnaar R,Weel J,Sol C,Damen M,Van der Avoort H,et al.Highlysensitive assay for detection of enterovirus in clinical specimens by reversetranscription-PCR with an armored RNA internal control.J Clin Microbiol.2004;42(7):3059-64.
Cheng Y,Niu J,Zhang Y,Huang J,Li Q.Preparation of His-tagged armoredRNA phage particles as a control for real-time reverse transcription-PCRdetection of severe acute respiratory syndrome coronavirus.J ClinMicrobiol.2006;44(10):3557-61.
Clancy A,Crowley B,Niesters H,Herra C.The development of aqualitative real-time RT-PCR assay for the detection of hepatitis C virus.EurJ Clin Microbiol Infect Dis.2008;27(12):1177-82.
Cleland A,Nettleton P,Jarvis L,Simmonds P.Use of bovine viraldiarrhea virus as an internal control for amplification of hepatitis Cvirus.Vox Sang.1999;76(3):170-4.
Dingle KE,Crook D,Jeffery K.Stable and noncompetitive RNA internalcontrol for routine clinical diagnostic reverse transcription-PCR.J ClinMicrobiol.2004;42(3):1003-11.
Dreier J,M,Kleesiek K.Use of bacteriophage MS2 as an internalcontrol in viral reverse transcription-PCR assays.J Clin Microbiol.2005;43(9):4551-7.
Drosten C,Seifried E,Roth WK.TaqMan 5’-nuclease humanimmunodeficiency virus type 1 PCR assay with phage-packaged competitiveinternal control for high-throughput blood donor screening.J ClinMicrobiol.2001;39(12):4302-8.
Felder E,R.Development of a versatile and stable internalcontrol system for RT-qPCR assays.J Virol Methods.2014;208:33-40.
Garson JA,Grant PR,Ayliffe U,Ferns RB,Tedder RS.Real-time PCRquantitation of hepatitis B virus DNA using automated sample preparation andmurine cytomegalovirus internal control.J Virol Methods.2005;126(1-2):207-13.
Gerriets JE,Greiner TC,Gebhart CL.Implementation of a T4 extractioncontrol for molecular assays of cerebrospinal fluid and stool specimens.J MolDiagn.2008;10(1):28-32.
Hoorfar J,Malorny B,Abdulmawjood A,Cook N,Wagner M,Fach P.Practicalconsiderations in design of internal amplification controls for diagnosticPCR assays.J Clin Microbiol.2004;42(5):1863-8.
Hymas W,Stevenson J,Taggart EW,Hillyard D.Use of lyophilizedstandards for the calibration of a newly developed real time PCR assay forhuman herpes type six(HHV6)variants A and B.J Virol Methods.2005;128(1-2):43-50.
Jin Yong Kim,Jae-Hoon Ko,Yeonjae Kim et al,.(2020)Viral Load Kineticsof SARS-CoV-2 Infection in First Two Patients in Korea.J Korean Med Sci,35(7):e86.
Lirong Zou,Feng Ruan,Mingxing Huang et al,.(2020)SARS-CoV-2 ViralLoad in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients.N ENGL JMED,1-3.
Maaroufi Y,de Bruyne JM,Duchateau V,Scheen R,Crokaert F.Developmentof a multiple internal control for clinical diagnostic real-timeamplification assays.FEMS Immunol Med Microbiol.2006;48(2):183-91.
Meng S,Zhan S,Li J.Nuclease-resistant double-stranded DNA controls orstandards for hepatitis B virus nucleic acid amplification assays.VirolJ.2009;6(226):1-7.
Miriam Ribas Zambenedetti,Daniela Parada Pavoni,Andreia CristineDallabona,Alejandro Correa Dominguez,Celina de Oliweira poersch,StenioPerdigao Fragoso,Marco Aurelio Krieger,ea al.Inernal control for real-timepolymerase chain reaction based on MS2 bacteriophage for RNA virusesdiagnostics.Mem inst Oswaldo Cruz.2017;112(5):339-347.
Ninove L,Nougairede A,Gazin C,Thirion L,Delogu I,Zandotti C,et al.RNAand DNA bacteriophages as molecular diagnosis controls in clinical virology:acomprehensive study of more than 45,000 routine PCR tests.PLoS ONE.2011;6(2):1-7.
Pasloske BL,Walkerpeach CR,Obermoeller RD,Winkler M,DuBois DB.ArmoredRNA technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controlsand standards.J Clin Microbiol.1998;36(12):3590-4.
Rolfe KJ,Parmar S,Mururi D,Wreghitt TG,Jalal H,Zhang H,et al.Aninternally controlled,one-step,real-time RT-PCR assay for norovirus detectionand genogrouping.J Clin Virol.2007;39(4):318-21.
Rosenstraus M,Wang Z,Chang SY,DeBonville D,Spadoro JP.An internalcontrol for routine diagnostic PCR:design,properties,and effect on clinicalperformance.J Clin Microbiol.1998;36(1):191-7.
Sharma N,Chand D,Shukla A,Singh M,Govil RK,Bihari B,et al.Internalcontrols for the quality assessment of polymerase chain reaction methods forthe diagnosis of infectious&autoimmune disease.Sch J App Med Sci.2014;2(1D):485-8.
M,Berg J.Internal control DNA for PCR assays introduced intolambda phage particles exhibits nuclease resistance.Clin Chem.2004;50(11):2163-6.
M,Leb V,Berg J.A convenient approach to the generation ofmultiple internal control DNA for a panel of real-time PCR assays.J VirolMethods.2003;108(1):1-8.
Ursula E.M,Gibson,Christian A.Heid,and P.Mickey Williams,et al.ANovel Method for Real Time Quantitative RT-PCR.Genome Res.1996;6:995-1001.
Villanova GV,Gardiol D,Taborda MA,Reggiardo V,Tanno H,Rivadeneira ED,et al.Strategic approach to produce low-cost,efficient,and stable competitiveinternal controls for detection of RNA viruses by use of reversetranscription-PCR.J Clin Microbiol.2007;45(11):3555-63.
WalkerPeach CR,Winkler M,DuBois DB,Pasloske BL.Ribonuclease-resistantRNA controls(Armored RNA)for reverse transcription-PCR,branched DNA,andgenotyping assays for hepatitis C virus.Clin Chem.1999;45(12):2079-85.
Wei Y,Yang C,Wei B,Huang J,Wang L,Meng S,et al.RNaseresistant virus-like particles containing long chimeric RNA sequences produced by two-plasmidcoexpression system.J Clin Microbiol.2008;46(5):1734-40.
Yang Pan,Daitao Zhang,Peng Yang.(2020)Viral load of SARS-CoV-2 inclinical samples.Lancet Infect Dis,https://doi.org/10.1016/S1473-3099(20)30113-4.
Zhan S,Li J,Xu R,Wang L,Zhang K,Zhang R.Armored long RNA controls orstandards for branched DNA assay for detection of human immunodeficiencyvirus type 1.J Clin Microbiol.2009;47(8):2571-6.
Zhao L,Ma Y,Zhao S,Yang N.Armored RNA as positive control andstandard for quantitative reverse transeription-polymerase chain reactionassay for rubella virus.Arch Virol.2007;152(1):219-24.
发明内容
本发明例如涉及用于定量检测样品中的核酸靶标的重组病毒颗粒。具体地,本发明涉及定性和定量检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA的掺入(Spike-in)采集样品的阳性参考品及其应用。
具体地,本发明涉及以下方面:
1.模拟病毒载体,其特征在于以病毒(优选慢病毒或腺病毒)骨架为载体,在慢病毒骨架中包含一个或多个定量检测核酸片段和用于示踪的荧光蛋白的编码基因,
所述定量检测核酸片段的长度与检测样品的核酸靶标序列长度相同,且与所述检测样品的核酸靶标序列含有相同百分比的碱基组成,其中定量检测核酸片段的5’端序列A和3’端序列B与检测样品的核酸靶标序列的相应5’端序列A’和3’端序列B’的序列相同或不相同,其中序列A由用于扩增检测样品的核酸靶标序列的5’端引物序列与其临近下游2个碱基组成,序列B由用于扩增检测样品的核酸靶标序列的3’端引物序列与其临近上游2个碱基组成,所述定量检测核酸片段的所述5’端序列A和所述3’端序列B之间的序列与所述检测样品的核酸靶标序列的所述5’端序列A’和所述3’端序列B’之间的序列的所有碱基排列顺序完全不同(优选不存在连续三个碱基以上,例如,连续4个、5个、6个、7个碱基以上相同的排列序列,优选8-30个碱基排序不同),
优选地,在所述1个或多个定量检测核酸片段与所述荧光蛋白之间彼此通过接头连接,更优选地,所述接头长度为6-800bp,优选20-800bp或6-200bp,优选地,所述接头含转录控制元件,包括但不限于如CMV(promoter)、IRES(核糖体结合位点)。
2.项目1所述的模拟病毒载体,其中所述检测样品的核酸靶标序列来自生物体,所述生物体选自病毒、细菌、真菌、植物、动物(包括低等动物和高等动物,优选地,低等动物包括但不限于线虫、果蝇,高等动物包括但不限于马哈鱼、斑马鱼和哺乳动物,更优选地,所述哺乳动物包括但不限于人、猩猩、猴子、鼠)。
3.项目2所述的模拟病毒载体,其中所述病毒选自DNA病毒(如单纯疱疹病毒,甲型肝炎病毒,乙型肝炎病毒,人乳头瘤病毒,腺病毒,HPV)或RNA病毒(如丙型肝炎病毒,人类免疫缺陷病毒,冠状病毒,流感病毒如禽流感病毒或猪流感病毒);所述细菌包括但不限于肺结核、淋病、炭疽病、梅毒、鼠疫、沙眼等,所述真菌选自但不限于霉菌、酵母、块菌以及其他人类所熟知的菌菇类;
优选所述冠状病毒选自SARS病毒,MERS病毒和SARS-CoV-2病毒。
4.项目3所述的模拟病毒载体,其特征在于,定量检测核酸片段的长度为80bp-60kb,优选80bp-19.5kb,80bp-17.5kb,80bp-1.5kb,80bp-1kb,80bp-500bp,更优选地80bp-200bp,并且所述定量检测核酸片段及定量检测核酸片段之间的接头序列的总长度不超过8.5kb,8kb或7kb。
5.项目1-4任一项所述模拟病毒载体,其中所述慢病毒载体为lentivirus病毒载体(优选pEZ-Lv201)或FIV病毒载体。
6.项目1-5任一项所述模拟病毒载体,其中所述慢病毒载体包括但不限于二代、三代慢病毒载体。
7.项目5或6所述的模拟病毒载体,其中当所述检测样品的核酸来自SARS-CoV-2时,所述检测样品的核酸靶标序列为选自下述编码基因的至少2种:Orflab编码基因全长或其片段、S蛋白编码基因全长或其片段、E蛋白编码基因全长或其片段、N蛋白编码基因全长或其片段。
8.项目7所述的模拟病毒载体,其中
所述定量检测核酸片段选自下述一种或多种:
检测靶向序列1(对应检测样品的Orf1ab编码基因片段)包括选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的序列或其组合或至少由选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的序列或其组合组成;
检测靶向序列2(对应检测样品的S蛋白编码基因片段)包括或至少由SEQ ID NO:3序列组成;
检测靶向序列3(对应检测样品的E蛋白编码基因片段)包括或至少由SEQ ID NO:4序列组成;
检测靶向序列4(对应检测样品的N蛋白编码基因片段)包括选自以下SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8的序列或其任意组合或至少由选自以下SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8的序列或其任意组合组成;
9.项目8所述的模拟病毒载体,其中所述模拟病毒的序列SEQ ID NO:9
10.利用项目1-9任一项的模拟病毒载体制备的模拟病毒颗粒,优选将所述模拟病毒载体转染到人293T细胞株中来制备所述模拟病毒颗粒。
11.项目1-9任一项所述的模拟病毒载体或项目10所述的模拟病毒颗粒在选自以下用途中的应用:
(1)定性和定量检测样品中的核酸靶标;例如作为检测样品中核酸靶标存在(例如来自COVID-19患者、SARS-CoV-2携带者、COVID-19疑似患者或样品中SARS-CoV-2)的参照标准品(定性:如阳性和阴性的判断)的应用,例如用于样本采集、样品保存和样品RNA提取过程中的质量分析和质量控制,或例如用于定量检测样品中SARS-CoV-2中的应用
(2)制备检测样品中核酸靶标的试剂或试剂盒中的应用;
(3)用于评价例如携带所述核酸靶标的患者治疗效果中的应用
(4)用于评价或筛选治疗所述生物体(例如细胞,病毒或真菌)导致的疾病的药物中的应用。
12.定性和定量参照标准品RNA,其通过提取项目10所述模拟病毒颗粒制备,其中所述生物体为RNA病毒。
13.项目12所述的定性和定量参照标准品RNA,其在检测RNA病毒如SARS-CoV-2的过程涉及的从RNA反转录为cDNA的过程中用作参照标准品,例如用于以RNA为样本的反转录反应体系中的质量分析和质量控制。
14.定性和定量参照标准品cDNA或DNA,其中定性或定量参照标准品cDNA通过反转录项目12所述的定性或定量参照标准品RNA制备,定量参照标准品DNA通过提取项目10的模拟病毒颗粒的DNA制备,其中所述生物体的遗传物质为DNA。
15.项目14所述的定性和定量参照标准品cDNA或DNA,其用于检测RNA病毒(如SARS-CoV-2)的过程中或用于检测遗传物质为DNA的生物体的过程中涉及的DNA扩增过程中扩增效率和荧光信号的质量分子和质量控制。
16.定性和定量检测样品的核酸靶标序列的试剂盒,其包含
(1)项目10所述的模拟病毒颗粒、项目12或13的定性或定量参照标准品RNA或项目14或15的定性或定量参照标准品cDNA或DNA,
(2)用于扩增持家基因的引物和探针,
(3)用于扩增项目12或13的定性或定量参照标准品RNA或项目14或15的定性和定量参照标准品cDNA或DNA的引物和探针,
(4)用于扩增检测样品的核酸靶标的引物和探针,
其中(3)和(4)中的引物相同,(2)、(3)和(4)中的探针的标记彼此不同。
17.项目16所述的试剂盒,其中所述引物的长度为12-30bp,探针长度20-30bp,引物与探针的退火温度差值10℃左右。
18.项目16或17所述的试剂盒,其中(2)、(3)和(4)中的探针标记选自Cy5,Fam或Hex或AP593。
19.项目18所述的试剂盒,其中试剂盒中的引物和探针序列由持家基因的引物和探针以及检测靶向序列的引物和探针组成,具体如下:
(1)持家基因的引物和探针序列见SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:21;
(2)检测靶向序列1(对应检测样品的Orf1ab编码基因片段)的探针序列见SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23;
(3)检测靶向序列2(对应检测样品的N蛋白编码基因片段)的探针序列见SEQ IDNO:24至SEQ ID NO:27;
(4)检测靶向序列3(对应检测样品的S蛋白编码基因片段)的探针序列见SEQ IDNO:28;
(5)检测靶向序列4(对应检测样品的E蛋白编码基因片段)的探针序列见SEQ IDNO:29;
(6)扩增检测靶向序列1的引物见序列SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:33;
(7)扩增检测靶向序列2的引物见序列SEQ ID NO:34至SEQ ID NO:41;
(8)扩增检测靶向序列3的引物见序列SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43;
(9)扩增检测靶向序列4的引物见序列SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45;
20.定性和定量检测样品的核酸靶标序列的方法,包括使用项目16-19任一项所述的试剂盒。
21.项目20所述的方法,包括:
扩增步骤1:用项目19所述试剂盒中的扩增检测靶向序列1-4的至少2对引物扩增样品SARS-CoV-2的Orf1ab、S蛋白基因,E蛋白基因,N蛋白基因的至少2种,
扩增步骤2:扩增所述检测靶向序列1-4;
扩增步骤3:扩增持家基因。
22.项目2-21任一项所述的方法,其中扩增步骤1-扩增步骤3在相同或不同的反应体系中进行。
23.本发明的上述任一项项目可以用于任何DNA或RNA病毒,包括但不限于HBV,HCV,HPV,HIV。本发明的定量检测核酸片段的设计示意图参见图20(以及图28几种实例图)。以中国CDC推荐的新冠状病毒SARS-CoV-2的orf1ab基因和本发明选择的spike蛋白编码基因为例,定量检测核酸片段的设计示意图参见图21和图22。图24是用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测试剂盒的原料和试剂盒生产流程中质量分析和质量控制的“质控品”。图25是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测试剂盒(定量),显示了本发明的掺入阳性参考品添加到图24流程的采样管中。
为了更好解决竞争和非竞争的定量检测核酸片段(掺入内标)存在的问题,需要更好的确定对待测靶标检测的最低极限值和精确的计算待测样本中待测靶标的分子数。
对于一种特定生物体的待测靶标的核酸序列的竞争性和非竞争性的的定量检测核酸片段(掺入内标)的设计,按掺入内标扩增子区域的引物区域、探针区域及其之间的间隔区的序列和待测靶标序列扩增子区域的相对应的引物区域、探针区域和间隔区域的碱基序列排列的差异,可设计的掺入内标的种类很多,其设计基本原则见表A。
表A掺入待测样本或样本采集装置(管)掺入内标(DNA或RNA)序列示例性的设计基本原则
定义
为了促进对本发明的理解,下文给出术语的解释:
模拟病毒:又称假病毒(Pseudovirus)。
待测靶标:是指选自来源于已知DNA或RNA序列的生物体基因组的部分序列片段,例如待检测样品的核酸靶标序列,感染SARS-CoV-2病毒样本的SARS-CoV-2基因N靶标序列。
质控品(Reference standard,Referenee material):
是指含有和来自某种生物体待测靶标(DNA或RNA)序列相同的碱基百分比组成和相同排列序列的模拟病毒及其衍生的DNA、RNA或cDNA。
标准品(定性和定量参照标准品)(Reference standard,Reference material):是指含有和来自生物体待测靶标(DNA或RNA)碱基序列数目(bp)相同,碱基百分比组成也相同,但碱基排列序列可有8-25%,4-10%,2-5%相同的模拟病毒及其衍生的DNA、RNA或cDNA。
定量检测核酸片段:是指掺入内标(Internal controls,简写ICs),其掺入片段是与标准品一样的核酸序列片段,也是指可掺入待测样品或样品采集装置(管)的标准品。
例如,掺入内标设计标准包括:
(1)可监测诊断程序的所有步骤(采样、核酸提取、RT、PCR,或RT-PCR);
(2)可用于DNA或RNA待测靶标;
(3)生产模拟病毒(假病毒)载体的DNA残留拷贝数需要有最低量限制;
(4)可以是单一或多重的形式,用于一步或两步法RT-PCR反应。
如本文使用的术语“参照品”也有称“参照标准品(reference standard)”,是指具有一种或多种足够均匀并很好确定了含量、序列、活性、结构或分型等生物测量特性(量)值,用以校准仪器、评价生物测量方法或给材料赋值的物质。
在本发明中,“定量检测核酸片段的所述5’端序列A和所述3’端序列B之间的序列与所述检测样品的核酸靶标序列的所述5’端序列A’和所述3’端序列B’之间的序列的所有碱基排列顺序完全不同”是表示两者之间不存在连续三个碱基以上,例如,连续4个、5个、6个、7个碱基以上相同的排列序列,例如,优选8-30个碱基排序不同。
在本发明中,可以使用的慢病毒载体(lentivirus vector)和腺病毒载体(Adenovirus vector)为本领域中常规使用的载体,且已被证明无生物安全性问题,包括lentivirus病毒载体(Gene delivery by lentivirus vector,Cockrell,Adam S.,etal.,Molecular Biotechnology36(3),184-204;Lentiviral Vector System for GeneTransfer,Gilbert,James R.,et al.,2003,https://books.goole.com/books?)或FIV病毒载体(Feline Immunodeficiency Virus(FIV)as a Model for Study of LentvirusInfections:Parallels with HIV,John,H.Elder et al.,Curr HIV Res 2010,January,8(1):73-80;Efficient transduction of nondividing human cells by felineimmunodeficiency virus lentiviral vectors,Eric M.Poeschla et al.,NatureMedicine,volume 4,No.3,March 1998;FIV:from lentvirus to lentivector,DyanaT.Saenz et al.,J.Gene Med 2004,6,S95-S104)。在具体的实施方案中,所述慢病毒载体为pEZ-Lv201。
附图说明
图1是截至2020年3月6日,国家药品监督管理局应急审批通过的新冠病毒检测试剂清单。
图2是构建用于NGS、RT-PCR方法检测2019-nCov可掺入参照标准的“模拟病毒”载体骨架。
图3是合成片段电泳图。Lane 1:Marker 6000;Lane 2:PCR合成产物L(362bp)。
图4是菌落PCR检测结果电泳图。Lane 1:Marker 6000;Lane 2:菌落PCR产物(640bp);Lane 3:菌落PCR产物(640bp);Lane 4:菌落PCR产物(640bp);Lane 5:菌落PCR产物(640bp);Lane 6:菌落PCR产物(640bp);Lane7:菌落PCR产物(640bp)。
图5是orf1ab与G119753的blast结果图。
图6是重组慢病毒颗粒的制备流程示意图。
图7是梯度稀释的参考品log(起始拷贝数)对应Ct值的标准曲线图。图注:将所有梯度稀释的参照标准品进行qPCR反应,获得每一个样品的Ct值(扩增阈值循环数),以log(起始拷贝数)为横坐标X、Ct值为纵坐标Y,获得标准曲线,并获得曲线公式及相关系数R2。
图8是慢病毒感染H1299细胞后的荧光图。图注:将图中所有绿色荧光亮点计数,图中箭头表示其中一个荧光点。
图9是带eGFP荧光的细胞流式细胞仪分析的数据图图注:流式细胞仪测定带eGFP荧光的细胞,获得标记荧光的细胞所占百分比。纵坐标:SSC-A指相对颗粒度或内部复杂程度;横坐标:FITC-A指颗粒相对大小;P1-1,P1-2,P1-3:指不是带荧光的目标细胞;P1-4指分选出来的带荧光的目标细胞,阳性率为2.23%。
图10是梯度稀释cDNA样品中ORF1ab靶标(图a),N基因靶标(图b)和S基因靶标(图c)的ddPCR一维液滴分布图与拷贝数浓度定量曲线(图d-f)。
图11是ddPCR液滴一维图。蓝色液滴为阳性液滴,灰色液滴为阴性液滴,红色为基线。横坐标表示液滴数,纵坐标表示荧光强度。
图12是RNA扩增效率图。横坐标表示Log10Copies,其中Copies为200000、100000、10000、1000、100,纵坐标表示Ct。
图13是ddPCR原始液滴数据图,横坐标为液滴数,纵坐标为荧光强度。以ORF1ab为检测靶标,加入2ul模板进行反应,阳性液滴数为2360copies。
图14是cDNA Standard#2梯度qPCR标准曲线——ORF1ab,横坐标为Log10Copies,纵坐标为Ct值。
图15是cDNA Standard#2梯度qPCR标准曲线——S,横坐标为Log10Copies,纵坐标为Ct值。
图16是cDNA Standard#2梯度qPCR标准曲线---E,横坐标为Log10Copies,纵坐标为Ct值。
图17是cDNA Standard#2梯度qPCR标准曲线---N,横坐标为Log10Copies,纵坐标为Ct值。
图18是各基因扩增曲线。a,ORF1ab-FAM基因的扩增曲线,横坐标为循环数,纵坐标为△Rn(△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果);b,N-FAM基因的扩增曲线,横坐标为循环数,纵坐标为△Rn;c,S-FAM基因的扩增曲线,横坐标为循环数,纵坐标为△Rn;d,E-FAM基因的扩增曲线,横坐标为循环数,纵坐标为△Rn。
图19是根据Ct值与拷贝数的标准曲线计算“可掺入”模拟病毒N基因的拷贝数浓度。
图20是本发明的定量检测核酸片段的设计示意图。设计已知DNA或RNA序列的所有物种的可掺入待测样本或样本采集装置(管)的阳性标准品的方法。
图21是以中国CDC推荐的新冠状病毒SARS-CoV-2的offlab基因为例,示例性显示本发明的定量检测核酸片段的设计示意图,其中A表示野生型SARS-CoV-2的RNA序列(2019-nCoV RNA Sequence);B表示选择的用作检测样品的核酸靶标序列的SARS-CoV-2RNA序列(Amplicon for Virus target detection),其中下划线表示的是与探针互补的序列,两个箭头分别表示用于扩增检测样品的核酸靶标序列的上游引物和下游引物;C表示含有本发明的定量检测核酸片段的RNA序列(Selected amplicon for阳性参考品),其中下划线表示的是与探针互补的序列,从C中显示的序列可见,定量检测核酸片段的5’端和3’端与检测样品的核酸靶标序列的相应5’端和3’端的序列相同,序列相同的长度为用于扩增检测样品的核酸靶标序列的5’端引物和3’端引物的长度分别与5’端引物的下游2个碱基和3’端引物的上游两个碱基长度之和。
图22是以本发明选择的新冠状病毒SARS-CoV-2的spike蛋白编码基因为例,示例性显示本发明的定量检测核酸片段的设计示意图,
图23是“可掺入的模拟病毒“cDNA添加量对”模拟病毒“cDNA中新冠病毒靶标定量结果的影响。横坐标为“可掺入的模拟病毒”eDNA添加量的对数,纵坐标为”模拟病毒“cDNA中ORF1ab和S靶标的Ct值
图24是用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测试剂盒的原料和试剂盒生产流程中质量分析和质量控制的“质控品”。
图25是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测试剂盒(定量)。
图26是“模拟病毒”掺入标准品RNA中N基因,S基因(图b)的One-step RT-ddPCR一维液滴分布图(图a-b)与拷贝数浓度定量曲线(图c)。
图27标准品N基因浓度梯度标准曲线。
图28是设计已知DNA或RNA序列的所有物种的可掺入待测样本或样本采集装置(管)的阳性标准品的方法图,其中,a:阳性标准品方法设计概念图;b:一种插入SARS-CoV-2的“N”基因靶标的实例;c:一种插入HPV的E6基因靶标的实例;d:一种插入人类基因组ACE2基因靶标的实例。
图29是RNA扩增效率图,横坐标表示Log10Copies,其中Copies为10000、1000、100、10,纵坐标表示Ct。对系列点进行线性拟合,根据趋势线的斜率k来进行扩增效率E的计算:E=(10(-1/k)-1)×100%。
图30为掺入标准品RNA之后的质控品RNA定量标准曲线图,横坐标表示质控品RNA的拷贝数浓度,纵坐标表示平均Ct值。
图31为掺入质控品RNA之后的标准品RNA定量标准曲线图,横坐标表示标准品RNA的拷贝数浓度,纵坐标表示平均Ct值。
具体实施方式
虽然本发明已对其具体实施方式进行描述,然而某些修改和等同物对于本领域技术人员是显而易见的,并且旨在包括在本发明的范围之内。
通过以下实施例对本发明进行阐述,以下实施例不以任何方式限制本发明。
实施例1:重组质粒的构建方法
1.实验材料
试剂:DNA Polymerase(Gencopoeia,C0103A);引物Oligo(Invitrogen);克隆载体pEZ-Lv201(Genecopoeia);Fast-FusionTM Cloning Kit(Gencopoeia,FFPC-C020);胶回收试剂盒(Omega);2T1感受态(Genecopoeia,U0104A);STBL3感受态(Genecopoeia,U0103A);限制性内切酶(Fermentas);DNA Ladder(Genecopoeia);E.Z.N.A.Gel Extraction Kit(OMEGA);UltraPFTM DNA Polymerase Kit(Genecopoeia,C0103A);E.Z.N.A.PlasmidMini Kit I(OMEGA);无内毒素质粒小/中提试剂盒(Omega)。
2.实验步骤
本实施例将冠状病毒核酸检测靶向序列和荧光蛋白基因序列插入慢病毒载体,具体步骤如下:
A.载体设计
1.载体骨架如图2所示
2.表达克隆信息
将SARS-CoV-2特异靶向orflab序列片段克隆至慢病毒克隆载体。SARS-CoV-2特异靶向orflab序列见SEQ ID NO:1
3.构建步骤
(1)SARS-CoV-2特异靶向orf1ab序列片段合成
根据插入序列设计并合成表1中片段合成引物
表1.插入片段合成引物
将表1中引物进行稀释至50pmol/μl,各取1μl混合均匀,备用;
插入序列进行合成PCR扩增:以表1中引物混合物为模板,以cCDC-orf1ab-PF1+cCDC-orf1ab-PF10为引物,采用表2的反应体系和表3的反应程序,扩增获得插入片段M,电泳检测结果见图3,得到产物L片段约362bp,随后用OMEGA的Cycle Pure Kit纯化PCR产物和合成片段。
合成用于可掺入的例如NGS、RT-PCR方法检测2019-nCov参照标准的“模拟病毒”的靶向序列插入片段M,其序列见SEQ ID NO:46;
表2.PCR反应体系
试剂名称 | 1×体积 |
5×UltraPF<sup>TM</sup>Buffer | 5μl |
dNTP(25mM) | 0.2ul |
Mg<sup>2+</sup>(50mM) | 0.75ul |
UltraPF<sup>TM</sup>DNA Polymerase(5U/μl) | 0.2μl |
表1引物混合物 | 1μl |
引物(5pmol/L) | 2μl |
ddH<sub>2</sub>O | 加至25μl |
表3.PCR反应程序
B.将合成插入片段M克隆至目的载体
1.载体的酶切
表4酶切体系
试剂 | 用量 |
pEZ-Lv201 | 3μg |
10×NEB buffer | 4μl |
EcoRl(NEB) | 0.4μl(10μ/μl) |
Xhol(NEB) | 0.4μl(10μ/μl) |
ddH<sub>2</sub>O | 加至40μl |
2.合成插入片段M和质粒载体的连接
用Fast-Fusion Cloning Kit进行In-fusion反应,反应结束后取5ul用于转化大肠杆菌感受态细胞2T1。
3.PCR法筛选基因重组克隆
每个PCR反应体系分装16μl ddH2O和1μl载体引物SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48(5pmol/μl,),PCR反应程序如表5;电泳检测PCR产物,检测结果见图4,对照Marker估计DNA片段的大小,选择出含目的DNA片段的阳性克隆。用OMEGA的E.Z.N.A.Plasmid Mini KitI提取质粒DNA,质粒送测序,通过图5中比对结果获知测序质粒G119753为预期正确克隆,其中表达出RNA序列从5’LTR到3’LTR序列(插入2019-nCov“模拟病毒”RNA序列)为片段N,见序列SEQ ID NO:49,质粒全序列(“模拟病毒”载体全序列)为片段W,见序列SEQ ID NO:9;
表5.PCR反应程序
实施例2:慢病毒制备
获得重组慢病毒载体后,可以制备重组慢病毒颗粒。流程检测图6。
1.实验材料试剂:培养基(CORNING,10-013-CV),胎牛血清(Excell Bio,FSP500),Lenti-PacTM HIV慢病毒包装试剂盒(GeneCopoeia,LT003)
2.实验步骤
慢病毒制备步骤如下:
1.293T(CRL-3216TM)细胞在10%胎牛血清的DMEM培养基中、在含5%CO2、37℃下培养,按照Lenti-PacTM HIV慢病毒包装试剂盒推荐流程使用实施例1制备的重组质粒和含有Gag-pol和Rev的辅助质粒共转染细胞);
2.转染12h后,更换含有新鲜培养基,继续培养24h;
3.收集培养细胞的上清液,上清液中含有慢病毒颗粒(命名为LPP-WH-Fragment3-Lv201)。
实施例3:慢病毒浓缩
1.实验材料
试剂:Lentivirus Concentration Solution(6X)(GeneCopoeia,LT007),PBS(GeneCopoeia,PE002)。
2.实验步骤
1).从工具细胞培养板或培养瓶收集上清液,上清液即含有慢病毒颗粒。上清液可通过4℃2000g离心10min去除细胞碎片。
2).浓缩试剂购买于GeneCopoeia公司(Lenti-PacTM慢病毒浓缩试剂,LT007)。按慢病毒液体积∶浓缩试剂体积=5∶1的比例混合慢病毒上清液和浓缩试剂(直接添加慢病毒浓缩试剂6X原液即可),在0~4℃温度下孵育2h或以上(也可孵育过夜)。在慢病毒的稳定保存期内,适当延长孵育时间可提高慢病毒的回收率。注意:慢病毒在0~4℃下可稳定保存约3天。
3).完成孵育后,混合液在4℃下3500g离心25min。
4).离心后,小心吸走、弃去上清液,留下沉淀物为慢病毒颗粒。
注意:请避免吸走离心沉淀物,该沉淀物为慢病毒颗粒(部分情况下,沉淀物不一定肉眼可见)。
5).根据步骤1收集并用于浓缩的慢病毒上清液体积,量取其1/10-1/100体积的DMEM或PBS,重新吹打悬起慢病毒沉淀(举例:如步骤1收集的上清液有10mL,则本步骤量取的DMEM或PBS为0.1mL-1mL)。
注意:重新悬浮慢病毒沉淀时,吹打操作要轻柔。
6).重悬的慢病毒液已完成浓缩操作,可分装后保存在-80℃,并同时取少量测定浓缩后的慢病毒检测滴度。
实施例4:慢病毒定量
1.实验材料
试剂:培养基(CORNING,10-013-CV),胎牛血清(Excell Bio,FSP500),PBS(GeneCopoeia,PE002),Trypsin(CORNING,25-053-CI),Lenti-PacTM慢病毒滴度检测试剂盒(GeneCopoeia,LT006),青霉素-链霉素双抗溶液(HyClone),RNaseLockTMRNase抑制剂。
2.实验步骤
我们可以采用四种方法测定慢病毒滴度:
方法i:使用实时荧光定量PCR仪检测慢病毒物理滴度。
方法ii:使用荧光显微镜细胞计数法测定慢病毒生物拷贝数(滴度)。
方法iii:使用流式细胞荧光计数法测定慢病毒生物滴度。
方法iv:ddPCR方法检测慢病毒RNA拷贝数。
表6.四种测定结果比较:
具体方法i:实时荧光定量PCR仪检测慢病毒物理滴度
1.RNA提取
按照分子克隆实验操作指南提取RNA。最后用50μL的TE缓冲液溶解RNA沉淀(此处TE缓冲液为DEPC处理过的水配制成100μM TE缓冲液,其在本发明中溶解RNA沉淀均使用此TE缓冲液)。
2.用DNase I处理(去除游离细胞基因组及质粒)
DNase I反应。用1.5mL管子,按表7进行以下反应(总体积25μL):
表7 DNase I反应体系
试剂 | 用量 |
DEPC水 | 1.5μl |
Lentiviral RNA | 20.0μL |
DNaseI buffer(10×) | 2.5μl |
DNaseI | 1.0μL |
总量 | 25.0μL |
孵育:1)37℃,30-60min;2)75℃,10min(使DNase I失活)
注意:如果遗漏了DNase I消化步骤,必须在qPCR反应步骤中加上以未反转录的RNA样品为模板的qPCR反应作为对照,该对照确定(未经过DNase I消化的)样品中所携带的质粒DNA拷贝数,用反转录产物作为模板进行的qPCR反应所确定的拷贝数减去该对照确定的质粒DNA拷贝数,即为样品中RNA拷贝数。
3.反转录
按表8制备RNA-Primer Mix,混匀RNA-Primer Mix,在70℃温育5min后,将离心管立即置于冰上至冷却。
表8 RNA和cDNA Synthesis Primer结合反应体系
试剂 | 用量 |
RNA(经过DNaseI消化过的) | 10.0μL |
cDNA Synthesis Primer(4.0μM) | 5.0μl(终浓度1.0μM) |
注意:试剂盒里的随机引物(在反转录反应液中的终浓度为10μM)可用于替代HIVcDNA Synthesis Primer。无需同时使用cDNA Synthesis Primer和随机引物。
1)按表9准备反转录反应体系,继续加入其它组分(总体积20μL),37℃温育60min。
表9反转录反应体系
试剂 | 用量 |
Reverse Transcription Buffer(10×) | 2.0μL |
25mM d NTP | 1.0μL |
RNaseLock<sup>TM</sup>RNase抑制剂 | 1.0μL |
Reverse Transcription Enzyme | 1.0μL |
总量 | 20.0μL |
2)90℃,10min。该产物作为待测样品可直接用于qPCR检测实验,或者保存于-20℃。
4.qPCR反应
1)准备制作标准曲线样品
稀释阳性参照标准品(来自试剂盒Lenti-PacTM慢病毒滴度检测试剂盒(GeneCopoeia,LT006),其拷贝数为1x109copies/μL)。
制作标准曲线(后续每个稀释梯度取2μL作为模板进行qPCR反应)。①起始拷贝数:1x108copies/μL(操作方法:5μL qPCR standard(DNA)+45μL ddH2O)
②起始拷贝数:1x107copies/μL(操作方法:5μL①+45μL ddH2O)
③起始拷贝数:1x106copies/μL(操作方法:5μL②+45μL ddH2O)
④起始拷贝数:1x105copies/μL(操作方法:5μL③+45μL ddH2O)
⑤起始拷贝数:1x104copies/μL(操作方法:5μL④+45μL ddH2O)
⑥起始拷贝数:ix103copies/μL(操作方法:5μL⑤+45μL ddH2O)
2)按表10进行准备qPCR反应体系(总体积20μL):
表10 qPCR反应体系
注意:
①将反应体系中的各个组分进行预混(除了阳性参照标准品和样品)后再进行分管。
②qPCR反应中要设置无模板(NTC)组。
③参考品取样,每个稀释管取2μL:
3)qPCR反应程序
按表11反应程序适用于Bio-Rad iQ5 real time PCR检测系统。溶解曲线程序见表12。本领域技术人员可以根据所使用的检测系统进行常规微调。
表11 qPCR反应程序
表12溶解曲线程序
4)数据分析
①qPCR反应后,读取每一个参考品的Ct值(扩增阈值循环数),以log(起始拷贝数)为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线,如图7(梯度稀释的参考品log(起始拷贝数)对应Ct值的标准曲线图),并获得曲线公式。标准曲线的相关系数应高于0.99。
图7备注:将所有梯度稀释的参考品进行qPCR反应,获得每一个样品的Ct值(扩增阈值循环数),以log(起始拷贝数)为横坐标X、Ct值为纵坐标Y,获得标准曲线,并获得曲线公式及相关系数R2。
②将读取待测样品的Ct值,代入①中(图7中所示)标准曲线的公式(y=-3.4363x+35.451),计算其对应的log(起始拷贝数)及其起始拷贝数。
③将上述起始拷贝数乘以稀释系数(以下为稀释倍数的计算公式),得到原始样本的拷贝数(copies/ml)。
注意:
(A)RNA体积:50μL(根据本实验流程)
(B)原始样品体积:用于RNA抽提的慢病毒颗粒溶液体积10μl
(C)DNase反应体积:25μL(根据本实验流程)
(D)DNase反应中的RNA体积:20μL(根据本实验流程)
(E)RT反应体积:20μL(根据本实验流程)
(F)RT反应中的RNA体积:10μL(根据本实验流程)
(G)PCR反应中的cDNA体积:2μL(根据本实验流程)
④由于每一个慢病毒颗粒含有2个单股正链的RNA基因组,因此,得到的慢病毒颗粒数应为拷贝数的1/2。故而,慢病毒颗粒数物理滴度(copies/ml)为原始样本拷贝数除以2。表13为慢病毒颗粒物理滴度计算过程数据表。
表13慢病毒颗粒物理滴度计算过程数据表
具体方法ii:使用荧光显微镜细胞计数法测定慢病毒生物拷贝数(滴度)
1.使用24孔培养板,每孔各加入细胞5×104、DMEM全培养基0.5mL(添加10%热灭活胎牛血清、青霉素-链霉素双抗),在5%CO2、37℃条件下培养过夜(约24h)。
第二天:感染H1299细胞
2.细胞培养24h后,去除细胞培养液,先加入250μl的DMEM培养基(添加10%热灭活胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液),再加入以下步骤3所示的稀释慢病毒。每种慢病毒分别对应细胞培养板的3个板孔。
3.慢病毒带有荧光标记可使用荧光显微镜细胞计数法测定检测滴度。先梯度接种慢病毒,每孔添加0.03μL、0.3μL、0.3μL慢病毒原液(各三个复孔)。各孔分别加入适当DMEM培养基(添加10%热灭活胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液)至终容量为每孔0.5mL。空白对照孔作为参照。
第三天:更换培养基
4.去除旧培养基,以DMEM培养基(添加5%热灭活胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液)培养24小时。
5.使用倒置荧光显微镜,以荧光显微镜细胞计数法测定慢病毒滴度
选取荧光细胞数量能在显微镜下计算的孔,在显微镜下随机挑选5个视野拍照,计算孔板里荧光数量。
在加入0.03μl病毒的孔中,荧光细胞数量适中能计算细胞数,孔里5个视野的荧光细胞平均数是X,按下面的公式计算:
慢病毒液滴度(TU/mL)=X(荧光细胞平均数)×63.3(24孔板的面积/显微镜观察视野的面积)/0.03μl(实际添加的慢病毒液体积)。
得到表14使用荧光显微镜细胞计数法测定的慢病毒生物滴度。
表14荧光显微镜细胞计数法测定的慢病毒生物滴度
备注:1TU/ml约等于100copies/ml
慢病毒感染H1299细胞后,通过倒置荧光显微镜,得到如图8的荧光图片。(用倒置荧光显微镜,100倍视野,用GFP荧光拍照计数,将图中所有荧光亮点计数,图中箭头表示其中一个荧光点)。图8注:将图中所有荧光亮点计数,图中箭头表示其中一个荧光点。
具体方法iii:流式细胞荧光计数法测定慢病毒生物滴度
步骤1~4,与方法ii中1-4步骤相同。
第四天:以流式细胞荧光计数法测定慢病毒滴度
5.以流式细胞荧光计数法测定慢病毒滴度(流式细胞仪型号:BD FACSMelody)
带上eGFP荧光的细胞可用FACS(流式细胞分析技术)进行计数。使用荧光显微镜可进行eGFP荧光观察。观察荧光状态后,细胞以胰酶消化,用DMEM完全培养基终止消化,再离心500g,10min,使用1ml PBS悬浮细胞,用血细胞计数器测定每孔细胞总数。然后上流式细胞仪进行分析,得出荧光细胞百分比,获得如下图9(带eGFP荧光的细胞流式细胞仪分析的数据图),按下面的公式计算:
慢病毒液滴度(TU/mL)=荧光细胞百分比×孔的细胞总数÷实际添加的慢病毒液体积(单位:mL)。慢病毒的生物滴度表见表15。
表15慢病毒的生物滴度表
备注:1TU/ml约等于100copies/ml
图9备注:流式细胞仪测定带eGFP荧光的细胞,获得标记荧光的细胞所占百分比。纵坐标:SSC-A指相对颗粒度或内部复杂程度;横坐标:FITC-A指颗粒相对大小;P1-1,P1-2,P1-3:指不是带荧光的目标细胞;P1-4指分选出来的带荧光的目标细胞,阳性率为2.23%。
具体方法iv:ddPCR方法检测慢病毒RNA拷贝数
(一)实验材料
试剂:Bio-Rad ddPCRTM Supermix for Probes(No dUTP)
设备:Bio-Rad QX200 droplet digital PCR System
(二)实验步骤
1.将逆转录慢病毒颗粒RNA得到的cDNA用ddH2O(DNase free)进行10倍梯度稀释,得到4个ddPCR待测样品;
2.将ddPCRTM Supermix for Probes(No dUTP)在室温下融解,上下颠倒混匀并进行短暂离心;
3.按表16配制ddPCR Reaction Mix(FAM/HEX双通道)
表16 ddPCR反应体系
4.配好的体系震荡混匀离心后,小心地将其转移到微滴发生卡中间一排的样品孔内,并在下排的孔中加入70μL微滴发生油,然后在微滴生成仪中生成微滴。
5.将生成好微滴的样品(40μL)从微滴发生卡的上排孔中转移到ddPCR专用96孔板中,盖上铝膜后用PX1热封仪对96孔板进行封膜。
6.封好膜之后应该在30min内进行PCR反应,或者放于4℃冰箱4h之内进行PCR,按表17进行PCR反应,升降温速度设置为2℃/sec。
表17 PCR反应
7.PCR结束后,将96孔板取出,在微滴读取仪上进行微滴读取。
8.微滴读取结束后,在Bio-rad QuantaSoft软件上分析数据结果,按图10计算“模拟病毒”cDNA中ORFlab和N基因的拷贝数浓度。图10.为梯度稀释cDNA样品中ORF1ab靶标(图a),N基因(图b)和S基因(图c)的ddPCR一维液滴分布图与拷贝数浓度定量曲线(图d-f)
实施例5:提取RNA
1.实验材料
试剂:GeneCopoeia RNAzolTM RT RNA Isolation Reagent,异丙醇,75%乙醇,ddH2O(RNase and DNase free)。
设备:漩涡震荡器。
2.实验步骤
1.样品处理
取约400μl病毒悬液加入装有1ml RNAzol RT的1.5~2ml离心管中,振荡混匀后室温静置约5min;
2.相分离
每1ml RNAzol RT加入400μl ddH2O(RNase and DNase free),或补充ddH2O(RNaseand DNase free)至1.4 ml,盖上盖子,振荡混匀约15sec,室温静置5~15min。10000rpm离心15min;
3.沉淀
转移上清至新的1.5~2ml离心管中,加入等体积的异丙醇,室温静置10min。10000g离心10min。
4.洗涤
弃上清,余下沉淀加入400μl 75%乙醇,混匀后7500g离心1~3min,此步重复一次。
5.溶解
弃上清,自然风干沉淀,加入50μl TE(RNase and DNase free)溶解,即为总RNA。
实施例6:cDNA制备
1.实验材料
试剂:GeneCopoeia SureScriptTM First-Strand cDNA Synthesis Kit,慢病毒RNA,DEPC水。
设备:普通PCR仪。
2.实验步骤
1).配制逆转录体系
按GeneCopoeiaTM SureScriptTM First-Strand cDNA Synthesis Kit说明书的表18配制逆转录体系:
表18 cDNA制备的逆转录体系
2).逆转录反应
在普通PCR仪上按19表进行逆转录程序。
表19 cDNA制备的逆转录程序
反应温度 | 时长 |
25℃ | 5min |
50℃ | 60min |
85℃ | 5min |
逆转录后的cDNA置于-20℃保存。
实施例7:
RNA制备方法和质控分析
1.实验材料
试剂:RNAzol RNA Isolattion reagent(GeneCopoeia)、MgCl2.6H2O(sigma)、DEPC(MBCHEM)、异丙醇(广州化学试剂厂)、Trizma Base(Sigma)、EDTA(Sigma)、RNaseLock(GeneCopoeia)、DNase I(NEB)、1-step Taqman qPCR Mix(GeneCopoeia)、2-step TaqmanqPCR Mix(GeneCopoeia)、BlazeTaq RTase Mix(GeneCopoeia)、ddPCR Supermix forProbes(No dUTP)(Bio-rad)、FAM标记探针(Invitrogen)、移液吸头(Axygen)、50ml离心管(BIOFIL)、1.5ml离心管(Axygen)。
2.实验步骤
1)准备80ml模拟病毒培养液,经PEG浓缩沉淀后,病毒保存于PBS缓冲液中,体积为10ml,并经过Benzonase处理2次,以去除质粒DNA的残留;
2)冰上操作:300μl模拟病毒+1ml RNAzol,混匀,静置5min,再加入100μl DEPC水,补齐至1.4ml体积;
3)10,000rpm,4℃离心10min后,集中所有的上清至50ml离心管中,加入等体积异丙醇;
4)混匀后,分装1.4ml/管,室温静置5min;
5)10000rpm,4℃离心15min,弃上清,沉淀加入400μl 75%乙醇(DEPC水配制),混匀,7500rpm,4℃离心2min,再重复洗涤一次;
6)弃上清,室温放置约5min自然风干沉淀后,加入50μl TE(含RNaseLock:0.02 U/μl)溶解,将所有RNA溶液混匀后分装,并保存于-80℃冰箱中;
7)采用DNase I处理RNA中残留质粒DNA,DNase I活性单位为7U/1.5μg RNA。各成分的用量为:RNA 58μl、Dnase I 14μl、10×Dnase I buffer 8μl,37℃15min或75℃10min;
8)采用qPCR检测DNA残留,相关引物如表20,各成分的加入量为:5×2-stepTaqman mix 4μl、primers and Probe Mix(10 uM)0.25μl、RNA 2μl、DEPC H2O to 20μl,反应体系如表21所示。
表20采用qPCR检测DNA残留的相关引物
表21 qPCR检测DNA残留的反应程序
9)采用ddPCR检测RNA拷贝数与DNA残留,各成分的加入量为2×ddPCR Supermix10μL、Primer mix 900nM、Probe 250 nM、RNA 2μL,DEPC H2O to 20μl,反应程序如表22所示。
表22采用ddPCR检测RNA拷贝数与DNA残留的反应程序
10)RT-qPCR检测RNA扩增效率,各成分的加入量为5×1-step Taqman mix 4μl、primers and Probe Mix(10μM)0.25 μl、RNA 2μl,DEPC H2O to 20μl,反应程序如表23所示。
表23.RT-qPCR检测RNA扩增效率的反应程序
3.实验结果
1)根据表24进行RNA标准品的DNA残留检测
表24.RNA标准品的DNA残留检测结果
检测基因 | ORF1ab-FAM | S-FAM |
qPCR(Ct) | 35.6 | 35.6 |
ddPCR(Copies) | 0 | 8 |
DNase I消化后质粒残留率相较于RNA在万分之一以下,对RNA参考标准品的定量分析无影响。
2)RNA拷贝数定量
选择ORFlab-FAM进行RNA拷贝数定量,如图11,混匀后分装的每份RNA靶标基因(1ab)的总拷贝数为1.75×107Copies。
图11.ddPCR液滴一维图。蓝色液滴为阳性液滴,灰色液滴为阴性液滴,红色为基线。横坐标表示液滴数,纵坐标表示荧光强度。
3)RNA扩增效率,如表25和图12所示。
表25 RNA扩增效率
图12.RNA扩增效率图。横坐标表示Log10Copies,其中Copies为200000、100000、10000、1000、100,纵坐标表示Ct。
实施例8:
cDNA制备和质量分析
1.实验材料
试剂:DNase I(NEB 2U/μl)、5×BlazeTaqTM Probe qPCR Master Mix(with ROX)(Genecopoeia,Cat.QP036)、5×FL SureScriptTM RT buffer(Genecopoeia)、10×RTaseMix(S+M)(Genecopoeia)、ddPCRTM Supermix for Probes(No dUTP)(Bio-rad)、DEPC水、PD-10 Desalting Columns(GE Healthcare Life Sciences)、FAM标记探针(Invitrogen)、移液吸头(Axygen)、50ml离心管(BIOFIL)、1.5ml离心管(AXYGEY)、200μl PCR管(SARSTEDT)、MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate(ABI)。
2.实验步骤
(1)将-80℃保存的模拟病毒RNA(100ng/μl,50μl/管)置于冰上溶解,涡旋震荡混匀,瞬时离心Dnase I消化RNA中的DNA,在通风橱中按下表26的消化体系配制,配置好的体系瞬时离心后水浴消化。DNase I消化程序如表27所示。涡旋震荡混匀消化后的体系,并瞬时离心待用。
表26 DNA消化体系表
成份 | 1×体积 |
10×Dnase I buffer | 8μl |
DNase I(2U/μl) | 14μl |
模拟病毒RNA(100ng/μl) | 50μl |
DEPC水 | 8μl |
表27 DNA消化程序表
反应温度 | 时长 |
37℃ | 15min |
75℃ | 15min |
(2)取出38个200μl PCR管(RNase and DNase-free),在通风橱中按下表28的逆转率体系配制,配置好的体系瞬时离心后普通PCR上机,按照表29程序进行逆转录。逆转录后涡旋震荡混匀逆转后的体系,并瞬时离心待用。
表28 RNA逆转录体系表
成份 | 1×体积 |
5×FL SureScript<sup>TM</sup> RT buffer | 4μl |
10×RTase Mix(S+M) | 2μl |
DNase I消化后的RNA | 2μl |
DEPC水 | 12μl |
总体积 | 20μl |
表29 RNA逆转录程序表
反应温度 | 时长 |
25℃ | 5min |
45℃ | 60min |
85℃ | 5min |
(3)在通风橱中将38管逆转录产物全部收集于1个1.5ml离心管(RNase andDNase-free),涡旋震荡混匀,瞬时离心。
(4)取500μl逆转录后的cDNA样品,在通风橱中进行P10柱子凝胶过滤层析法纯化,具体纯化步骤如下:
1)将P10柱子固定于试管架上,用已经酒精消毒的剪刀将柱子底部剪开;
2)往柱子中央加入1mL 1×TE Buffer平衡柱子,流出液废弃于废液缸中(重复5次);
3)往柱子中央加入1mL 1×Dillution Buffer,流出液废弃于废液缸中;
4)往柱子中央加入1mL 1×TE Buffer,流出液废弃于废液缸中(重复6次);
5)待柱子液体流完后,往柱子中央加入500μl cDNA样品;
6)向柱子周围缓慢加入500μl 1×TE Buffer,并同时用1.5mL离心管收集流出液,标记①号管;
7)向柱子周围缓慢加入500μl 1×TE Buffer,并同时用1.5mL离心管收集流出液,标记②号管;
9)将收集管⑤⑥⑦混为一管(标记为cDNA Mix),涡旋震荡混匀,瞬时离心。
(5)取50μl cDNA Mix,进行ddPCR检测拷贝数,ddPCR具体操作步骤如下:
1)将cDNA Mix进行100倍稀释:20μl cDNA Mix+180μl 1×TE buffer,涡旋混匀并进行短暂离心。
2)将ddPCRTM Supermix for Probes(No dUTP)在室温下融解,上下颠倒混匀并进行短暂离心。
3)配制ddPCR Reaction Mix(FAM/HEX双通道),体系配制如表30。
表30.ddPCR反应体系表
成份 | 1×体积 | 终浓度 |
2×Supermix for Probes(No dUTP) | 10μL | 1× |
ORF1ab Primer Mix(10μM) | 1.8μL | 0.9μM |
ORF1ab Taqman Probe(5μM) | 1μL | 0.25μM |
稀释后的cDNA | 2μL | |
ddH<sub>2</sub>O | 加至20μL | |
总体积 | 20μL |
4)配好的体系震荡混匀离心后,小心地将其转移到微滴发生卡中间一排的样品孔内,并在下排的孔中加入70μL微滴发生油,然后在微滴生成仪中生成微滴。
5)将生成好微滴的样品(40μL)从微滴发生卡的上排孔中转移到ddPCR专用96孔板中,盖上铝膜后用PX1热封仪对96孔板进行封膜。
6)封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应,或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR,PCR程序如表31,其中升降温速度设置为2℃/s。
表31 PCR反应程序
7)PCR结束后,将96孔板取出,在微滴读取仪上进行微滴读取。
8)微滴读取结束后,在Bio-rad QuantaSoft软件上分析数据结果。
9)以ddPCR结果为准,将cDNA Mix(1.18×105copies/μl)至于冰上解冻并混匀离心后,使用1×TE buffer稀释为cDNA Standard#1(cDNA浓度为1×105copies/μl):1000μlcDNAMix+180μl 1×TE buffer,上下颠倒混匀并进行短暂离心。再使用1×TE buffer将cDNA Standard#1进行梯度稀释。
具体稀释步骤如下:
1)cDNA Standard#2-1(5×104copies/μl):50μl cDNA Standard#1+50μl 1×TEbuffer;
2)cDNA Standard#2-2(5×103copies/μl):20μl cDNA Standard#2-1+180μl 1×TE buffer;
3)cDNA Standard#2-3(5×102copies/μl):20μl cDNA Standard#2-2+180μl 1×TE buffer;
4)cDNA Standard#2-4(5×10copies/μl):20μl cDNA Standard#2-3+180μl 1×TE buffer;
5)将cDNA Standard#2的样品进行qPCR检测扩增效率,按表32和表33的体系和程序进行配制和上机。
表32.qPCR反应体系表
成份 | 1×体积 |
5×BlazeTaq<sup>TM</sup> Probe qPCR Master Mix | 4μl |
ORF1ab/N/S/E primers and Probe(10μM) | 0.25μl |
各稀释梯度的cDNA样品 | 2μl |
ROX(30μM) | 0.1μl |
DEPC水 | 12μl |
表33.qPCR反应程序表
3.实验结果
(1)cDNA Mix的ddPCR结果
1)ddPCR原始液滴数据图13
图13.ddPCR原始液滴数据图,横坐标为液滴数,纵坐标为荧光强度。以ORF1ab为检测靶标,加入2ul模板进行反应,阳性液滴数为2360 copies。
2)结果计算:
表34以ddPCR数据计算cDNAMix浓度
样品 | 计算过程及最终浓度 |
cDNA Mix稀释100倍的浓度 | 2360÷2=1180copies/μl |
cDNA Mix原液浓度 | 1180×100=1.18×10<sup>5</sup>copies/μl |
注释:cDNA Mix为cDNA纯化⑤⑥⑦管的混合液
(2)cDNA Standard#2各梯度的qPCR检测扩增效率结果:
1)Ct值,计算过程表10
表35.cDNA Standard#2梯度qPCR Ct值
注释:E=10[(-1/斜率)-1]
cDNA Standard#2梯度qPCR标准曲线见图14-17。
图14.cDNA Standard#2梯度qPCR标准曲线---ORF1ab,横坐标为Log10Copies,纵坐标为Ct值
图15.cDNA Standard#2梯度qPCR标准曲线---S,横坐标为Log10Copies,纵坐标为Ct值
图16.cDNA Standard#2梯度qPCR标准曲线---E,横坐标为Log10Copies,纵坐标为Ct值
图17.cDNA Standard#2梯度qPCR标准曲线---N,横坐标为Log10Copies,纵坐标为Ct值
2)各基因扩增曲线见图18
图18.为各基因扩增曲线。a,ORF1ab-FAM基因的扩增曲线,横坐标为循环数,纵坐标为△Rn(△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果);b,N-FAM基因的扩增曲线,横坐标为循环数,纵坐标为△Rn;c,S-FAM基因的扩增曲线,横坐标为循环数,纵坐标为△Rn;d,E-FAM基因的扩增曲线,横坐标为循环数,纵坐标为△Rn。
实施例9:可掺入标准品的扩增效率
1.实验材料
试剂:GeneCopoeia BlazeTaq SYBR Green qPCR mix
设备:ABI ViiA 7 qPCR仪
2.实验步骤
1)按照“模拟病毒”cDNA和“可掺入的模拟病毒”cDNA的预实验结果,参考ddPCR定量数据,在生物安全柜中将两种cDNA进行10倍梯度稀释,得到得到105拷贝/uL-102拷贝/uL的待测样品
2)在生物安全柜中进行染料法qPCR反应的配制,待测的靶标分别ORF1ab,S,E,N;体系见表36
表36 qPCR反应体系
组分 | 体积 |
5×BlazeTaq SYBR Green qPCR mix | 4μL |
Primer Mix 2μM) | 2μL |
cDNA(10<sup>5</sup>~10<sup>2</sup>copies/μL) | 5μL |
ddH<sub>2</sub>O | 9μL |
总计 | 20μL |
3)体系配制完成后,在qPCR仪(ABI ViiA7)上进行qPCR定量检测与熔解曲线分析,qPCR反应程序和溶解曲线程序分别如表37和表38:
表37 qPCR反应程序
表38溶解曲线程序
温度 | 间隔温度 | 时长 |
95℃→60℃ | 1.6℃ | 1sec/each |
4)根据梯度稀释样品的Ct值,计算不同cDNA的不同靶标扩增效率,结果如表39
表39:“模拟病毒cDNA”与“可掺入的模拟病毒cDNA”中四个新冠病毒靶标的扩增效率计算
图19:根据Ct值与拷贝数的标准曲线计算“可掺入”模拟病毒N基因的拷贝数浓度。
图19注:以拷贝数的对数为横坐标,Ct值为纵坐标绘制X-Y散点图,对系列点进行线性拟合,根据趋势线的斜率k来进行扩增效率E的计算:
E=(10^(-1/k)-1)×100%
实施例10:“可掺入的模拟病毒“cDNA添加量对”模拟病毒“cDNA中新冠病毒靶标定量结果的影响
1.实验材料
试剂:GeneCopoeia BlazeTaq qPCR mix for Probes
2.实验步骤
1)根据染料法qPCR对“可掺入的模拟病毒”cDNA的靶标定量结果,估算ORF1ab和S两个靶标的拷贝数浓度
2)在生物安全柜中,往用于检测试剂盒原料和质控品的“模拟病毒”cDNA中添加不同浓度梯度(5×105拷贝-50拷贝)的“可掺入的模拟病毒”cDNA
3)在生物安全柜中进行探针法qPCR反应的配制,待测的靶标是ORF1ab和S;qPCR体系与探针法qPCR试剂盒说明书中的相同
3.实验结果,见图23。
图23“可掺入的模拟病毒“cDNA添加量对”模拟病毒“cDNA中新冠病毒靶标定量结果的影响。横坐标为“可掺入的模拟病毒”cDNA添加量的对数,纵坐标为”模拟病毒“cDNA中ORF1ab和S靶标的Ct值。
实施例11:慢病毒定量的具体方法v:一步法RT-ddPCR方法检测“模拟病毒”掺入标准品RNA中N基因和S基因拷贝数浓度
(一)实验材料
试剂:Bio-Rad One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes
设备:Bio-Rad QX200droplet digital PCR System
(二)实验步骤
1.将“模拟病毒”掺入标准品RNA用ddH2O(DNase-free)进行100倍稀释后,再10倍稀释两个梯度,得到3个RT-ddPCR待测样品;
2.将Bio-Rad One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes的所有组分在室温下融解,上下颠倒混匀并进行短暂离心;
3.按表40配制RT-ddPCR Reaction Mix
表40 RT-ddPCR反应体系
4.配好的体系震荡混匀离心后,小心地将其转移到微滴发生卡中间一排的样品孔内,并在下排的孔中加入70μL微滴发生油,然后在微滴生成仪中生成微滴。
5.将生成好微滴的样品(40μL)从微滴发生卡的上排孔中转移到ddPCR专用96孔板中,盖上铝膜后用PX1热封仪对96孔板进行封膜。
6.封好膜之后在30min内进行PCR反应,或者放于4℃冰箱4 h之内进行PCR,按表17进行PCR反应,升降温速度设置为2℃/sec。
表41 PCR反应
7.PCR结束后,将96孔板取出,在微滴读取仪上进行微滴读取。
8.微滴读取结束后,在Bio-rad QuantaSoft软件上分析数据结果,计算“模拟病毒”掺入标准品RNA中N基因和S基因的拷贝数浓度,参见图26。
实施例12:新型冠状病毒2019-nCoV核酸定性定量检测试剂盒(荧光PCR法)及可掺入阳性标准品及质控品RNA模型检测
本方法基于一步法RT-PCR技术(RNA逆转录反应以及聚合酶链式反应(PCR)结合Taqman技术),选取2019新型冠状病毒(2019-nCoV)N基因和S基因特异性保守序列作为扩增靶区域,设计特异性引物及荧光探针(N基因探针采用HEX标记,S基因探针采用FAM标记)用于标本中2019新型冠状病毒RNA的检测;同时包括内源性内标检测系统(内标基因H探针采用CY5标记,独有阳性标准品S基因和N基因探针采用AP593标),即3对引物,4个探针对目的基因进行定性定量分析。
标准品:核酸序列长度、碱基百分比、Tm值、引物与质控品(或待测靶标)相同,但序列片段排列不同。
1.实验材料
1.1.仪器
PCR仪器:ABI viia7
离心机:labnet,C1301
生物安全柜:苏州净化
1.2.耗材
96孔板:ABI,N8010560
1.3.试剂
DNase I:NEB,M0303L
引物:见表42
Taqman探针:见表43
表42:引物序列及相关信息
表43:探针序列及荧光标记信息
注:FL:广州复能基因有限公司,cCDC:中国疾病预防控制中心
2.实验步骤
2.1.RNA提取
参照RT RNA Isolation Reagent试剂盒说明书提取标准品RNA和质控品RNA,最后使用50μL的TE缓冲液溶解RNA沉淀(此处TE缓冲液为DEPC处理过的水配制成100μM TE缓冲液,其在本发明中溶解RNA沉淀均使用此TE缓冲液)。
2.2.DNase I消化RNA
两种RNA提取后使用DNase I处理,目的是去除RNA中的基因组DNA和质粒DNA残留。参照表44的反应体系进行DNase I处理RNA,加样完成后瞬时离心,37℃加热10min,72℃加热10分钟使DNase I失活,-80℃储存备用。
表44 DNase I反应体系
试剂 | 用量/μL |
DEPC水 | 10 |
RNA | 30 |
DNase I buffer(10×) | 5 |
DNase I | 5 |
总量 | 50 |
qPCR及RT-PCR检测基因组DNA和质粒DNA残留,待qPCR检测不到目的基因时说明消化干净,RNA可用于后续实验。以N基因靶点为例,qPCR反应体系见表45,RT-PCR反应体系1见表46,上机程序见表47。
表45.qPCR反应体系
成分 | 体积/μL |
(5×)two step qPCR Mix | 4 |
10μM CCDC-N primer | 0.25 |
10μM FL-N-AP593 | 0.25 |
ROX | 0.1 |
DEPC水 | 10.4 |
RNA | 5 |
表46 RT-PCR反应体系1
成分 | 体积/μL |
5×)Probe One Step RT-qPCR Mix | 4 |
10×RTase Mix | 2 |
10μM CCDC-N primer | 0.25 |
10μM FL-N-AP593 | 0.25 |
ROX | 0.1 |
DEPC水 | 8.4 |
RNA | 5 |
表47.qPCR及RT-PCR上机程序
2.3.样品稀释及标准曲线制备
将处理干净的RNA使用Biorad ddPCR定量,之后使用稀释液(TE缓冲液+0.25U/μLRNase Inhibitor+10pg/μL ttRNA)10梯度稀释进行标准曲线制备,此外稀释两个低浓度拷贝数标准品RNA进行后续实验,低浓度拷贝数选择100 copies/μL及12.5copies/μL。RNA稀释操作步骤详见表48。
表48.RNA稀释操作步骤
2.4.RT-PCR检测反应
将稀释好的标准品RNA进行标准曲线制定;同时,固定标准品拷贝数,进行质控品浓度梯度检测。RT-PCR反应体系配制详见表49,配置好PCR反应Mix(除质控品外的其他成分)后开始加样,加样时每个反应孔先加入15μL配制好的Mix,然后再加入5μL质控品或待测样本。
表49:RT-PCR反应体系2
2.5.仪器检测
加样完成后,在ABI ivva7上检测样品信号,其中上机程序同表47,其中FAM通道检测质控品或临床样本S基因,VIC(HEX)通道检测质控品或临床样本N基因,CY5通道检测内源人GAPDH基因,ROX(AP593)通道检测标准品中的S基因或N基因。
3.实验结果
3.1.标准品N基因浓度梯度标准曲线制定
对母液浓度为2.4×106的标准品N基因参照表48进行10倍梯度稀释6个梯度,然后进行了单通道信号检测,选择了ROX通道检测标准品N基因的信号强度,以拷贝数的对数为横坐标,Ct值为纵坐标,计算出了标准品N基因的浓度梯度标准曲线,结果如图27,公式为y=-3.284x+38.363,其中v代表一定拷贝数测得的Ct值,k为-3.284,可参照这个公式计算出相应拷贝数的对数,从而计算出拷贝,对病毒拷贝数进行准确的定量,而R2=0.9998,说明结果可信。
3.2.可掺入待测样本的阳性标准品和质控品参数模型测定
固定标准品N基因的拷贝数,对质控品RNA进行了梯度检测,3对引物4个探针,选择4色通道对可掺入待测样本的阳性标准品和质控品参数模型测定,比对质控品和标准品定量是否准确,同时检测质控品的检测灵敏度。选择标准品N基因拷贝数100copies/rxn和12.5copies/rxn进行质控品梯度检测,结果如表50和表51。
表50.可掺入待测样本的阳性标准品和质控品参数模型qPCR测定结果1
注:固定标准品N基因检测浓度为100copies/rxn;NA表示:未检测到Ct值。
表51可掺入待测样本的阳性标准品和质控品参数模型qPCR测定结果2
注:固定标准品N基因检测浓度为12.5copies/rxn;NA表示:未检测到Ct值。
结果发现,在标准品N基因拷贝数为100 copies/rxn,Ct值平均值为28.62,与质控品RNA100拷贝数时CCDC-N-HEX组的Ct值28.67接近,说明定量比较准确;在标准品N基因拷贝数为12.5copies/rxn,Ct值平均值为33.3,与质控品RNA12.5拷贝数时CCDC-N-HEX组的Ct值有2个Ct的差异。以上结果说明本方法所建立的参数模型较为准确,可用于人群对新型冠状病毒携带者的筛选;对检测人群中有体温升高的,入院后诊断新型冠状病毒肺炎的重要依据之一;用于新冠病毒肺炎药物筛选、治疗方案的确定以及疗效的评估;利用该模型对新型冠状病毒RNA载量(2019-nCoV,Sars-cov-2 RNA Load)的动态分布进行分析;还可以用于新型冠状病毒肺炎后期药物使用指导参考依据,是对甄别正在治疗的新冠肺炎患者是否可以出院,进入正常的生活社区的重要指标之一。
3.3.新冠病毒阳性样本实验数据:
使用与3.2相同的反应体系,将质控品RNA替换为临床样本进行检测。检测结果如表52,临床样本为用已获中国审批的试剂盒检测过的5份阳性和5份阴性样本。其中样本1-4为阳性临床样本,样本5-9为阴性临床样本,样本10为阴性对照。结果如表11所示,其中MixC#1为50分子阳性标准品;MixC#3为200分子阳性标准品,在选择四色通道检测临床样本时,所有样本中的S靶标均未检测到信号,即No Ct(N等同No Ct),所有样本均能检测到CY5和ROX,即能检测到人源RNA和掺入的标准品RNA,说明整个反应正常,结果可信。本公司产品结果为样本1/3/4/5为阳性,样本2/6/7/8/9/10为阴性,与中国审批试剂盒结果有差异,即2号阳性样本被鉴定为阴性样本。所以,本产品可与其他公司同时检测进行综合分析,杜绝病毒携带者流入社会。
表52.临床样本检测结果
注:N靶标是指待测靶标为N;GAPDH靶标,是指内标;RNA-S靶标,是指可掺入内标。
实施例13:人239细胞中新型冠状病毒受体ACE2的mRNA分子数的测定
1.实验步骤
采用qPCR&RT-PCR检测DNA残留,采用One-Step RT-ddPCR检测RNA拷贝数浓度,质粒构建及qPCR检测的相关引物及探针如表53。
带有掺入内标模拟病毒的制备(实施例2)、RNA提取(实施例4中具体方法i)和ddPCR定量方法(实施例4方法iv)已在上述章节中表述。
表53质粒构建及qPCR检测的相关引物及探针
质控品全长序列见SEQ ID NO:50
标准品(掺入内标)序列见SEQ ID NO:51
2.实验结果
1)参入内标
根据新冠实验方法进行RNA拷贝数浓度的RT-ddPCR定量,结果显示混匀后分装的每份质控品RNA(检测探针ACE2-HEX)的拷贝数浓度约为2×109Copies/μl,标准品参入内标RNA(检测探针ACE2-ROX)的拷贝数浓度约为1×109Copies/μl。
据我们已获得的资料信息,至今尚未有较好方法测定人体细胞中待测基因转录mRNA分子数,在新冠病毒受体ACE2的ORF稳转细胞株中,将我们设计的掺入内标用于测定其中受体ACE2 mRNA分子数。
2)标准品及质控品引物扩增效率检测
将体外转录制备的质控品RNA及标准品RNA浓度梯度稀释至10000/1000/100/10/0copies/rxn,检测引物扩增效率,确认标准品引物与质控品引物扩增效率一致。结果如表54、图29。
表54引物扩增效率
4)SL 221-293T RNA及293T RNA质量检测
使用表53中的引物及探针检测所提取的两种细胞RNA的质量,结果如表55、表56所示,参照NanoDrop ND-1000微量紫外分光光度计检测结果,本次提取的RNA质量较好,可用于后续检测。
表55 SL 221-293T RNA质量检测
表56 293TRNA质量检测
实施例14:可掺入的标准品对细胞内靶标ACE2 mRNA定量结果的影响
1.实验材料
试剂:
5×Probes One-Step RT-qPCR Mix(GeneCopoeia)
10×BlazeTaqTM RTase Mix(GeneCopoeia)
Primer(ACE2-1,ACE2-2,GAPDH)(金唯智)
Probe(ACE2-HEX,ACE2-ROX,GAPDH-CY5)(上海百力格)
SL 221-293T RNA/293T RNA(GeneCopoeia)
设备:ABI ViiA 7 qPCR仪
2.实验步骤
1)按照质控品RNA、可掺入标准品RNA及SL 221-293T RNA的预实验结果,参考ddPCR定量数据,在生物安全柜中将质控品RNA、标准品RNA、293T RNA分别进行梯度稀释,得到2000/200/20/2 copies/μl的质控品RNA、1000/100/50 copies/μl标准品RNA及1000/333/111/37/12/4/1/0pg/μl的SL 221-293T RNA/293T RNA。
2)在生物安全柜中进行RT-qPCR反应的配制,待测的靶标分别ACE2-HEX,ACE2-ROX;体系见表57,当检测质控品RNA和标准品RNA时,需要添加293T RNA模拟细胞检测情况;当检测细胞内ACE2表达情况时,不用添加293T RNA。
表57三重RT-qPCR反应体系
组分 | 体积 |
5×One-Step RT-qPCR Mix for Probes | 5μl |
10×BlazeTaq RTase Mix | 2.5ul |
ACE2-Primerl | 0.25ul |
ACE2-Primer2 | 0.25μl |
GAPDH-Primer | 0.25ul |
ACE2-HEX-Primerl | 0.25μl |
ACE2-ROX | 0.25ul |
GAPDH-CY5 | 0.25μl |
293T RNA | 1μl |
标准品RNA(1000/100/50copies/μl) | 1μl |
质控品RNA/SL 293T RNA | 5μl |
ddH2O | 10ul |
总计 | 25ul |
3)体系配制完成后,在qPCR仪(ABI ViiA7)上进行RT-PCR定量检测。
3.实验结果
1)标准品及质控品标准曲线制备
标准品及质控品标准曲线如图30、图31所示。
固定标准品掺入内标RNA拷贝数时,质控品RNA浓度梯度稀释,结果如表58所示;在固定质控品RNA拷贝数时,标准品掺入内标RNA浓度梯度稀释,结果如表59所示。
表58固定标准品RNA拷贝数,质控品RNA浓度梯度检测
表59固定质控品RNA拷贝数,标准品RNA浓度梯度检测
结果分析:在质控品RNA浓度为100copies/rxn时,检测ACE2-HEX的Ct值与标准品RNA100copies/rxn时ACE2-ROX的Ct值差异不大,△Ct为0.1,说明定量准确,反应体系良好。
2)细胞内ACE2表达情况检测
在固定标准品RNA拷贝数时,浓度梯度稀释SL 221-293T RNA,检测ACE2表达情况,结果如表60所示。
表60固定标准品掺入内标RNA拷贝数,SL 221-293T RNA浓度梯度检测
结果分析:参照质控品RNA检测结果,ACE2在细胞中转录的mRNA分子数为50copies/10pg RNA。因一个细胞提取的总RNA约为10pg,即10pg/cell。因此,ACE2在SL221-293T细胞中的表达情况约为50±5copies/cell。
我们的结果表明本发明的掺入内标不仅可以用于生物体如RNA(新冠2019-nCoV)病毒拷贝数、病毒RNA分子拷贝数的较精确测定。也可用于生物体细胞中内源基因,或用基因编辑方法整合到基因组中的外源基因,因在生理变化时和不同调节因素变化情况下,转录水平的评估和相关mRNA分子数较精确测定,有着广泛地应用价值。
Claims (23)
1.模拟病毒载体,其特征在于以病毒(优选慢病毒或腺病毒)骨架为载体,在慢病毒骨架中包含一个或多个定量检测核酸片段和用于示踪的荧光蛋白的编码基因,
所述定量检测核酸片段的长度与检测样品的核酸靶标序列长度相同,且与所述检测样品的核酸靶标序列含有相同百分比的碱基组成,其中定量检测核酸片段的5’端序列A和3’端序列B与检测样品的核酸靶标序列的相应5’端序列A’和3’端序列B’的序列相同或不相同,其中序列A由用于扩增检测样品的核酸靶标序列的5’端引物序列与其临近下游2个碱基组成,序列B由用于扩增检测样品的核酸靶标序列的3’端引物序列与其临近上游2个碱基组成,所述定量检测核酸片段的所述5’端序列A和所述3’端序列B之间的序列与所述检测样品的核酸靶标序列的所述5’端序列A’和所述3’端序列B’之间的序列的所有碱基排列顺序完全不同(优选不存在连续三个碱基以上,例如,连续4个、5个、6个、7个碱基以上相同的排列序列,优选8-30个碱基排序不同),
优选地,在所述1个或多个定量检测核酸片段与所述荧光蛋白之间彼此通过接头连接,更优选地,所述接头长度为6-800bp,优选20-800bp或6-200bp,优选地,所述接头含转录控制元件,包括但不限于如CMV(promoter)、IRES(核糖体结合位点)。
2.权利要求1所述的模拟病毒载体,其中所述检测样品的核酸靶标序列来自生物体,所述生物体选自病毒、细菌、真菌、植物、动物(包括低等动物和高等动物,优选地,低等动物包括但不限于线虫、果蝇,高等动物包括但不限于马哈鱼、斑马鱼和哺乳动物,更优选地,所述哺乳动物包括但不限于人、猩猩、猴子、鼠)。
3.权利要求2所述的模拟病毒载体,其中所述病毒选自DNA病毒(如单纯疱疹病毒,甲型肝炎病毒,乙型肝炎病毒,人乳头瘤病毒,腺病毒,HPV)或RNA病毒(如丙型肝炎病毒,人类免疫缺陷病毒,冠状病毒,流感病毒如禽流感病毒或猪流感病毒);所述细菌包括但不限于肺结核、淋病、炭疽病、梅毒、鼠疫、沙眼等,所述真菌选自但不限于霉菌、酵母、块菌以及其他人类所熟知的菌菇类;
优选所述冠状病毒选自SARS病毒,MERS病毒和SARS-CoV-2病毒。
4.权利要求3所述的模拟病毒载体,其特征在于,定量检测核酸片段的长度为80bp-60kb,优选80bp-19.5kb,80bp-17.5kb,80bp-1.5kb,80bp-1kb,80bp-500bp,更优选地80bp-200bp,并且所述定量检测核酸片段及定量检测核酸片段之间的接头序列的总长度不超过8.5kb,8kb或7kb。
5.权利要求1-4任一项所述模拟病毒载体,其中所述慢病毒载体为lentivirus病毒载体(优选pEZ-Lv201)或FIV病毒载体。
6.权利要求1-5任一项所述模拟病毒载体,其中所述慢病毒载体包括但不限于二代、三代慢病毒载体。
7.权利要求5或6所述的模拟病毒载体,其中当所述检测样品的核酸来自SARS-CoV-2时,所述检测样品的核酸靶标序列为选自下述编码基因的至少2种:Orf1ab编码基因全长或其片段、S蛋白编码基因全长或其片段、E蛋白编码基因全长或其片段、N蛋白编码基因全长或其片段。
8.权利要求7所述的模拟病毒载体,其中
所述定量检测核酸片段选自下述一种或多种:
检测靶向序列1(对应检测样品的Orf1ab编码基因片段)包括选自SEQ ID NO:1至SEQID NO:2的序列或其组合或至少由选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的序列或其组合组成;
检测靶向序列2(对应检测样品的S蛋白编码基因片段)包括或至少由SEQ ID NO:3序列组成;
检测靶向序列3(对应检测样品的E蛋白编码基因片段)包括或至少由SEQ ID NO:4序列组成;
检测靶向序列4(对应检测样品的N蛋白编码基因片段)包括选自以下SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8的序列或其任意组合或至少由选自以下SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8的序列或其任意组合组成。
9.权利要求8所述的模拟病毒载体,其中所述模拟病毒的序列SEQ ID NO:9。
10.利用权利要求1-9任一项的模拟病毒载体制备的模拟病毒颗粒,优选将所述模拟病毒载体转染到人293T细胞株中来制备所述模拟病毒颗粒。
11.权利要求1-9任一项所述的模拟病毒载体或权利要求10所述的模拟病毒颗粒在选自以下用途中的应用:
(1)定性和定量检测样品中的核酸靶标;例如作为检测样品中核酸靶标存在(例如来自COVID-19患者、SARS-CoV-2携带者、COVID-19疑似患者或样品中SARS-CoV-2)的参照标准品(定性:如阳性和阴性的判断)的应用,例如用于样本采集、样品保存和样品RNA提取过程中的质量分析和质量控制,或例如用于定量检测样品中SARS-CoV-2中的应用
(2)制备检测样品中核酸靶标的试剂或试剂盒中的应用;
(3)用于评价例如携带所述核酸靶标的患者治疗效果中的应用
(4)用于评价或筛选治疗所述生物体(例如细胞,病毒或真菌)导致的疾病的药物中的应用。
12.定性和定量参照标准品RNA,其通过提取权利要求10所述模拟病毒颗粒制备,其中所述生物体为RNA病毒。
13.权利要求12所述的定性和定量参照标准品RNA,其在检测RNA病毒如SARS-CoV-2的过程涉及的从RNA反转录为cDNA的过程中用作参照标准品,例如用于以RNA为样本的反转录反应体系中的质量分析和质量控制。
14.定性和定量参照标准品cDNA或DNA,其中定性或定量参照标准品cDNA通过反转录权利要求12所述的定性或定量参照标准品RNA制备,定量参照标准品DNA通过提取权利要求10的模拟病毒颗粒的DNA制备,其中所述生物体的遗传物质为DNA。
15.权利要求14所述的定性和定量参照标准品cDNA或DNA,其用于检测RNA病毒(如SARS-CoV-2)的过程中或用于检测遗传物质为DNA的生物体的过程中涉及的DNA扩增过程中扩增效率和荧光信号的质量分子和质量控制。
16.定性和定量检测样品的核酸靶标序列的试剂盒,其包含
(1)权利要求10所述的模拟病毒颗粒、权利要求12或13的定性或定量参照标准品RNA或权利要求14或15的定性或定量参照标准品cDNA或DNA,
(2)用于扩增持家基因的引物和探针,
(3)用于扩增权利要求12或13的定性或定量参照标准品RNA或权利要求14或15的定性和定量参照标准品cDNA或DNA的引物和探针,
(4)用于扩增检测样品的核酸靶标的引物和探针,
其中(3)和(4)中的引物相同,(2)、(3)和(4)中的探针的标记彼此不同。
17.权利要求16所述的试剂盒,其中所述引物的长度为12-30bp,探针长度20-30bp,引物与探针的退火温度差值10℃左右。
18.权利要求16或17所述的试剂盒,其中(2)、(3)和(4)中的探针标记选自Cy5,Fam或Hex或AP593。
19.权利要求18所述的试剂盒,其中试剂盒中的引物和探针序列由持家基因的引物和探针以及检测靶向序列的引物和探针组成,具体如下:
(1)持家基因的引物和探针序列见SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:21;
(2)检测靶向序列1(对应检测样品的Orf1ab编码基因片段)的探针序列见SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23;
(3)检测靶向序列2(对应检测样品的N蛋白编码基因片段)的探针序列见SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:27;
(4)检测靶向序列3(对应检测样品的S蛋白编码基因片段)的探针序列见SEQ ID NO:28;
(5)检测靶向序列4(对应检测样品的E蛋白编码基因片段)的探针序列见SEQ ID NO:29;
(6)扩增检测靶向序列1的引物见序列SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:33;
(7)扩增检测靶向序列2的引物见序列SEQ ID NO:34至SEQ ID NO:41;
(8)扩增检测靶向序列3的引物见序列SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43;
(9)扩增检测靶向序列4的引物见序列SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45。
20.定性和定量检测样品的核酸靶标序列的方法,包括使用权利要求16-19任一项所述的试剂盒。
21.权利要求20所述的方法,包括:
扩增步骤1:用权利要求19所述试剂盒中的扩增检测靶向序列1-4的至少2对引物扩增样品SARS-CoV-2的Orf1ab、S蛋白基因,E蛋白基因,N蛋白基因的至少2种,
扩增步骤2:扩增所述检测靶向序列1-4;
扩增步骤3:扩增持家基因。
22.权利要求2-21任一项所述的方法,其中扩增步骤1-扩增步骤3在相同或不同的反应体系中进行。
23.本发明的上述任一项权利要求可以用于任何DNA或RNA病毒,包括但不限于HBV,HCV,HPV,HIV。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2020101605384 | 2020-03-10 | ||
CN202010160538 | 2020-03-10 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112877366A true CN112877366A (zh) | 2021-06-01 |
Family
ID=76054234
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110263323.XA Pending CN112877366A (zh) | 2020-03-10 | 2021-03-10 | 用于检测来自dna或rna生物体的样品靶标的可掺入参照标准品 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20240117451A1 (zh) |
CN (1) | CN112877366A (zh) |
WO (1) | WO2021180139A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115948472A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-04-11 | 广州市天河诺亚生物工程有限公司 | 诱导过表达的runx1在构建耗竭t细胞模型中的应用 |
CN115992296A (zh) * | 2022-12-21 | 2023-04-21 | 苏州天隆生物科技有限公司 | 一种竞争性内标定量检测hcmv试剂盒 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114134217B (zh) * | 2021-11-10 | 2024-06-11 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 一种配制检出限样本和企业参考品的方法、系统及设备 |
CN114277048A (zh) * | 2022-01-17 | 2022-04-05 | 中国海关科学技术研究中心 | 一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质及其应用 |
CN115992293A (zh) * | 2022-06-24 | 2023-04-21 | 上海奥迪缇生物科技有限公司 | 用于rna病毒检测试剂盒的质控品及其制备方法和应用 |
CN116445546B (zh) * | 2022-07-19 | 2023-12-15 | 广州医科大学 | 一种质粒载体及通过质粒载体制备的新冠病毒核酸检测标准品和制备方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102559731A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-11 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种假病毒载体及其制备方法和应用 |
CN103069010A (zh) * | 2010-04-23 | 2013-04-24 | 基因组影像公司 | 通过由分子梳检测基因组和感染性病毒dna的病毒感染的诊断 |
CN103923887A (zh) * | 2014-04-16 | 2014-07-16 | 辽宁医学院 | 含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法 |
CN109402069A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-03-01 | 海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060057643A1 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-16 | Mccarthy Laurence R | Methods and compositions for detecting erythrovirus genotypes |
CN102199674A (zh) * | 2011-03-17 | 2011-09-28 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 一种有包膜rna病毒核酸检测参照品/标准品平台及其应用方法 |
CN103484565B (zh) * | 2013-09-02 | 2016-06-08 | 湖北朗德医疗科技有限公司 | 一种实时荧光rt-pcr检测冠状病毒的试剂盒及其应用 |
CN104845993A (zh) * | 2015-05-13 | 2015-08-19 | 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 | 一种含丙型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法 |
CN107557374A (zh) * | 2017-09-14 | 2018-01-09 | 温州美众医学检验所 | 人乳头瘤病毒亚型l1基因的重组质粒构建方法 |
CN110698546A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-01-17 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种猪瘟核酸病毒样颗粒的制备方法及应用 |
CN110819707B (zh) * | 2019-11-24 | 2023-07-18 | 中南大学湘雅医院 | 一种针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法 |
-
2021
- 2021-03-10 WO PCT/CN2021/080053 patent/WO2021180139A1/zh active Application Filing
- 2021-03-10 CN CN202110263323.XA patent/CN112877366A/zh active Pending
- 2021-03-10 US US17/998,467 patent/US20240117451A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103069010A (zh) * | 2010-04-23 | 2013-04-24 | 基因组影像公司 | 通过由分子梳检测基因组和感染性病毒dna的病毒感染的诊断 |
CN102559731A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-11 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种假病毒载体及其制备方法和应用 |
CN103923887A (zh) * | 2014-04-16 | 2014-07-16 | 辽宁医学院 | 含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法 |
CN109402069A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-03-01 | 海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
MIRIAM RIBAS ZAMBENEDETTI等: "Internal control for real-time polymerase chain reaction based on MS2 bacteriophage for RNA viruses diagnostics", 《MEM INST OSWALDO CRUZ》 * |
WEN JING LI等: "A novel fully automated system for quantification of Hepatitis B virus DNA using magnetic bead-based method combined with real-time PCR", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 * |
周冬根等: "用于MERS-CoV核酸检测的假病毒阳性对照品制备及鉴定", 《中国国境卫生检疫杂志》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115948472A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-04-11 | 广州市天河诺亚生物工程有限公司 | 诱导过表达的runx1在构建耗竭t细胞模型中的应用 |
CN115948472B (zh) * | 2022-12-06 | 2024-02-06 | 广州市天河诺亚生物工程有限公司 | 诱导过表达的runx1在构建耗竭t细胞模型中的应用 |
CN115992296A (zh) * | 2022-12-21 | 2023-04-21 | 苏州天隆生物科技有限公司 | 一种竞争性内标定量检测hcmv试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2021180139A1 (zh) | 2021-09-16 |
US20240117451A1 (en) | 2024-04-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112877366A (zh) | 用于检测来自dna或rna生物体的样品靶标的可掺入参照标准品 | |
CN111020064B (zh) | 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒 | |
Heim et al. | Rapid and quantitative detection of human adenovirus DNA by real‐time PCR | |
Bae et al. | Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay | |
Lovatt | Applications of quantitative PCR in the biosafety and genetic stability assessment of biotechnology products | |
Cinque et al. | Molecular analysis of cerebrospinal fluid in viral diseases of the central nervous system | |
WO2021175298A1 (zh) | 新冠病毒检测的试剂以及检测方法 | |
US8119338B2 (en) | Methods and compositions for detecting rhinoviruses | |
WO2010102460A1 (zh) | 定性定量检测病原微生物遗传物质的方法及其试剂盒 | |
CN112094944B (zh) | 一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒 | |
CN108676913A (zh) | 一种人副流感病毒核酸免提取基因分型检测试剂盒 | |
WO2021212523A1 (zh) | 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用 | |
CN109517927A (zh) | 一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用 | |
Peyrefitte et al. | Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR | |
Van Doornum et al. | Development and implementation of real‐time nucleic acid amplification for the detection of enterovirus infections in comparison to rapid culture of various clinical specimens | |
CN109196124A (zh) | 同时检测及定量分析四种血源性病毒的多重Taqman探针qPCR的试剂盒及方法 | |
CN113186226B (zh) | Rna病毒核酸检测参照标准品及其用途 | |
CN110343784A (zh) | 基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒 | |
TW201245452A (en) | Nucleic acid detection | |
CN101245394B (zh) | 西尼罗病毒的引物和探针及一步法实时rt-pcr检测试剂盒 | |
CN111334610A (zh) | 一种登革病毒通用型rt-raa-lfd扩增引物及检测方法 | |
WO2006132601A1 (en) | Diagnostic primers and method for detecting avian influenza virus subtype h5 and h5n1 | |
CN103215386B (zh) | 一种肠道病毒ev核酸恒温扩增方法 | |
KR102260264B1 (ko) | 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)의 SARS-CoV-2에 대한 실험실-안전 및 저비용 검출 프로토콜 | |
CN108411042A (zh) | 一种检测乙型脑炎病毒的荧光定量pcr引物及试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |