CN103069010A

CN103069010A - 通过由分子梳检测基因组和感染性病毒dna的病毒感染的诊断

Info

Publication number: CN103069010A
Application number: CN2011800266090A
Authority: CN
Inventors: C·马耶特; F·萨尔维埃尔; E·康塞勒; S·巴拉多
Original assignee: Genomic Vision SA
Current assignee: Genomic Vision SA
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2011-04-19
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2031-04-19
Also published as: EP3000900B1; EP3000900A1; CN103069010B; US20110287423A1; WO2011132078A2; IL250727A0; US20230127554A1; BR112012027151A8; US20190345570A1; WO2011132078A3; ES2668802T3; JP2013524806A; MX346524B; US20160047006A1; MX2012012352A; CN105734170A; EP2561104A2; BR112012027151A2; JP2017184745A; IL222545A0

Abstract

本发明涉及与具有特定设计的探针，尤其核酸探针一起使用分子梳或其他核酸延伸方法体外检测感染的真核生物细胞、组织或生物学流体中DNA病毒的基因组或病毒来源的DNA的存在的方法。通过跟踪病毒-感染的细胞、组织或生物学流体中基因组病毒或病毒来源的DNA多核苷酸的存在体外监测抗-病毒治疗的效应的方法。使用分子梳和DNA杂交的感染性形式的病毒的检测。包含用来进行这些方法的探针的试剂盒和包含探针的组合物。

Description

通过由分子梳检测基因组和感染性病毒DNA的病毒感染的诊断

【技术领域】

本发明涉及使用分子梳和/或DNA延伸组合感染性病毒或病原性DNA序列的特别设计的探针容易，快速和精确地检测自受试者或患者获得的病毒宿主细胞、组织或生物学流体中感染性病毒DNA或其他感染性或病原性DNA序列的存在的方法。通过跟踪待测试为被病毒感染的患者的病毒-感染的细胞、组织或流体中基因组病毒多核苷酸的存在来体外监测抗-病毒治疗的效应的方法。基于DNA杂交的感染性病毒的检测。包含用来实施本发明的方法的探针的试剂盒和包含所述探针的组合物。

【背景技术】

【分子梳】

分子梳技术已公开于各种专利和科学出版物，例如在US6,303,296，WO9818959，WO0073503，US2006/257910，US2004/033510，US6,130,044，US6,225,055，US6,054,327，WO2008/028931，WO2010/035140，及Michalet,Ekong et al.1997,Herrick,Michalet et al.2000,Herrick,Stanislawski et al.2000,Gad,Aurias et al.2001,Gad,Caux-Moncoutier et al.2002,Gad,Klinger etal.2002,Herrick,Jun et al.2002,Pasero,Bensimon et al.2002,Gad,Bieche et al.2003,Lebofsky and Bensimon2003,Herrick,Conti et al.2005,Lebofsky and Bensimon2005,Lebofsky,Heilig et al.2006,Patel,Arcangioli et al.2006,Rao,Conti et al.2007和Schurra andBensimon2009（见以下引文）。描述于这些参考文献，特别属于或相关于分子梳的那些的技术，供给和设备通过引用以上引用的出版物在此合并。

Bensimon等人，US专利No.6,303,296，公开DNA延伸过程，Lebofsky等人，WO2008/028931公开基因组序列的检测，及Lebofsky等人，WO2010/035140A1，公开基于核酸延伸及分子梳的人第4和10染色体上的D4Z4串联重复阵列的分析方法。

分子梳是致使个体核酸分子的直接可视化的技术，且已成功地用于子宫颈癌细胞系中myc及特定人乳头瘤病毒属（Papillomavirus）（HPV）序列的定位，以及用于之前表征的MYC/乳头瘤病毒（HPV18）扩增子上和特别在其复制原点上复制动力学的研究（Herrick,et al.,Cancer Res.65(4):1174-11792005）。肿瘤细胞中的核酸重排和扩增与使用此技术的癌结果相关。Herrick等人用特异于N-myc和c-myc基因的探针和用于检测含有全长HPV-18和HPV-44的HPV核酸的（～7.8kb）探针探查了自培养的肿瘤细胞系IC1，IC2，IC4和IC5的被梳的核酸。Conti,et al.,Genes,Chromosomes & Cancer46:724-734（2007）研究了含有特定HPV18核酸序列的HPV/MYC扩增子的原点活化，及分析了由自IC1肿瘤细胞系的分子梳延伸的DNA上的原点活性及叉点移动。Conti聚焦于涉及HPV和MYC核酸序列的机理而将基因重排和扩增鉴定为癌细胞的标志。这两个研究使用了培养的肿瘤细胞，其中HPV核酸序列发挥癌基因的作用，但不发挥感染性基因组病毒核酸的作用。

通过被梳的DNA上的FISH表征从培养的Burkitt氏淋巴瘤细胞系获得的附加型及整合的爱泼斯坦-巴尔病毒DNA（Reisinger,et al.,Int.J.Cancer118:1603-1608（2006））。Reisinger的目的是研究病毒基因组的基因组组织及明白及尝试区别感染的真核生物细胞中附加型及整合的形式的EBV。由分子梳延伸来自培养的Burkitt氏淋巴瘤细胞系的DNA及用覆盖基因组序列，但不是末端重复子（TR）和内部重复1（IR1）序列之间的区的EBV-特异性DNA探针探查。

Reisinger等人和Herrick等人也不描述使用用可产生会允许鉴定病毒DNA的此特定区之内的重排的不同色彩-荧光阵列的不同半抗原标记的探针组检测病毒基因组的重排的方法。这2参考文献描述培养的细胞但不是组织或生物学流体中病毒DNA的检测。

相反，在本发明中，将标准提取过程修饰为允许自病毒粒子提取病毒DNA，以便由分子梳分析感染性粒子中病毒DNA的结构。而且，本发明开发了自固体组织诸如角膜提取高分子量DNA的方法，其与由分子梳的分析相容，及允许检测感染的角膜中感染性形式的HSVDNA的存在。这2方法从未在本发明之前被描述。

延伸核酸，尤其是病毒或基因组DNA提供线性和并行链的固定的核酸，及优选在适当的表面（例如表面-处理的玻璃载玻片）上用控制的延伸因子实施。在延伸之后，其可能杂交可例如由荧光显微镜检检测的序列-特异性探针（Lebofsky,Heilig et al.2006）。由此，特定序列可在单分子水平直接可视化。荧光信号的长度和/或它们的数，及它们在载玻片上的间隔提供探针尺寸和相对间隔的直接读取。但是，直到现在，也不显示此技术可用于检测感染的真核生物细胞中的感染性形式的病毒或病毒序列或感染细胞或组织或存在于哺乳动物流体中的衍生的突变的病毒序列的基因组。

【病毒结构和基因组】

将导致人疾病的病毒基于包膜的存在，壳体类型，基因组性质（DNA或RNA,双链或单链），尺寸和靶细胞分为7组（InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses,http://www.ictvonline.org;于2011年4月7日最后访问）。包裹的DNA病毒包括痘病毒，疱疹病毒和嗜肝DNA病毒。非包裹的组包括腺病毒，乳多空病毒和细小病毒。

可在病毒物种之中见大量种的基因组结构。的确，有百万种不同类型的病毒（Breitbart和Rohwer2005），尽管它们中的仅约5,000种已详细描述（Dimmock,Easton et al.2007）。病毒基因组是单链或双链。单链基因组由未配对的核酸组成，类似于从中间分裂的梯子的1/2。全部RNA病毒是单链，除了双链呼肠孤病毒之外。双链基因组由2个互补配对的核酸组成，类似于梯子。全部DNA病毒是双链，除了细小病毒之外，其具有单链DNA。一些病毒，诸如属于嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）的那些，含有是部分双链和部分单链的基因组（Collier和Oxford2006）。

病毒基因组是环状，如在多瘤病毒中，或线性，如在腺病毒中（Fields,Knipe et al.2007）。核酸类型不与基因组形状相关。在RNA病毒之中，基因组常常分为病毒粒子之内的分离部分，且被称为分段的。各段常常编码一种蛋白，且它们通常发现在一壳体中在一起。对于待感染性的总体病毒，每段未被要求在相同的病毒粒子中，如由雀麦花叶病毒展示（Collier和Oxford2006）。

对于具有RNA或单链DNA的病毒，链被称为正义（被称为正链）或负义（被称为负链），依赖于是否其与病毒信使RNA（mRNA）互补（Fields,Knipe et al.2007）。正义病毒RNA与病毒mRNA相同，由此可立即由宿主细胞翻译。负义病毒RNA是与mRNA互补，由此必需在翻译之前由RNA聚合酶转化为正义RNA。DNA命名法是类似于RNA命名法，其中，病毒mRNA的编码链是与其（-）互补，及非-编码链是其（+）的拷贝。一些被称为反转录病毒（其包括HIV）的单链RNA病毒在宿主细胞中自其RNA基因组经酶反转录酶复制而产生DNA。DNA然后由整合酶整合到宿主的基因组。病毒基因组，或原病毒，保持在感染的细胞的基因组中，然后作为宿主细胞的DNA的部分复制。

基因组尺寸在不同种类或物种的病毒中大大改变，自丁型肝炎病毒（HDV）的1.7kb到痘病毒的309kb。RNA病毒通常相比DNA病毒具有更小基因组尺寸，因为当复制时更高出错率，及具有最大尺寸上限。超过此限，当复制时基因组中的误差致使病毒无用或无竞争性。为了对此补偿，RNA病毒常常具有分段的基因组，其中基因组分裂成更小分子，由此减少出错机会。相反，DNA病毒通常具有更大基因组，因为它们的复制酶的高保真度（Pressing和Reanney1984）。

病毒可经历通过不同机理发生的遗传变化。第1过程被称为遗传漂移，其中DNA或RNA中的个体碱基突变成其他碱基。多数这些点突变是"沉默"含义，它们不变化基因编码的蛋白，但其他可赋予进化优势，诸如对抗病毒药物的抗性。当病毒的基因组中有主要变化时发生抗原位移（Pan,Li et al.2007）。此可为重组或再分配的结果。当此随流感病毒发生（Hampson和Mackenzie2006）时，可导致大流行病。RNA病毒常常作为相同的物种的病毒的准种或群存在，但有稍微不同的基因组核苷序列。该准种是天然选择的主要靶（Metzner2006）。其次，分段的基因组也赋予进化优势；具有分段的基因组的病毒的不同株可改组及组合基因及产生具有独特和新特征的后代病毒。此被称为再分配或病毒性交（Goudsmit1998）。最终，可出现DNA链断裂然后接合到不同DNA分子的端的过程的遗传重组。此可当病毒同时感染细胞时发生，和病毒进化的研究显示重组已在研究的物种中蔓延（Worobey和Holmes1999）。重组对于RNA和DNA病毒是常见的（Umene1999;Lukashev2005）。

HSV在直径约150nm～200nm的更大病毒之中。它们包封在松散地装配的含有糖蛋白刺突的包膜内（Wildy,Russell et al.1960）。如其他包裹的病毒，疱疹病毒倾向于被有机溶剂或去污剂灭活，且在宿主的身体之外不稳定。在一些病毒中，二十面体壳体笼住缠绕蛋白性纺锤体的双链DNA的核心。在1988年首次出版的HSV-1株17的基因组序列在各链含有152,261个残基（Genbank登录号No.：NC_001806.1;2011年4月7日最后访问）（McGeoch,Dalrymple et al.1988）。HSV基因组被认为由2个共价接合的段，长（L）和短（S）区组成（Roizman1979）。L区由由一对相对地定向的重复子元件侧接的独特序列（U_L）组成（称之为R_L,末端和内部拷贝特别称之为TR_L和IR_L）（Wadsworth,Jacob et al.1975）。S区类似地由IR_S，U_S和TR_S组成。R_L和R_S元件的序列不同，除了在基因组末端有400bp（bp）直接重复子之外，称之为序列，及其至少一个进一步拷贝以与末端拷贝相反的取向见于L和S区的连接（Roizman1979;Davison和Wilkie1981）。各末端具有一个悬伸残基，3’-羟基游离（Mocarski和Roizman1982）。HSV DNA制备物含有等摩尔量的4种序列-取向异构体，其中U_L和U_S各独立地以关于L和S序列之间的连接处的2种可能的取向之一放置（Hayward,Jacob et al.1975;Bataille和Epstein1997）。一种异构体定义为原型（Roizman1979）。HSV-1DNA具有68.3%G+C的碱基组成（McGeoch,Dalrymple et al.1988）。G+C含量贯穿基因组不是常数；6.6kbp R_S元件自平均值最显著地偏离，有79.5%的G+C含量（McGeoch,Dolan et al.1986）。HSV-2的基因组未完全测序，但其紧密模拟HSV-1的基因组，尽管有稍微更高G+C含量。

多种病毒的基因组多核苷酸序列为本领域技术人员所熟知及通过引用合并，参考文献有Fields,B.N.,D.M.Knipe,et al.(2007),Fields'Virology.Philadelphia,Wolters kluwer/Lippincott Williams &Wilkins及可通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genlist.cgi?taxid=10239&type= 5&name=Viruses访问的NCBI病毒基因组数据库（2011年4月7日最后访问）。

【病毒发病机制】

识别了许多类型的病毒病原体。对于对病毒感染的新近回顾，可提到Fields等人（Fields,Knipe et al.2007）和该文的参考文献，其通过引用合并。当病毒通过如呼吸混杂病毒的空气，食混杂的食品的过程，或通过与感染病毒的人具有性接触而进入身体时发生病毒感染。病毒感染也可由昆虫叮咬导致。在病毒感染中，病毒侵袭身体的细胞内以便繁殖。病毒然后扩展到其他细胞，及重复该过程。病毒感染的此过程导致表征有变化的各种症状，且严重性依赖于病毒感染的类型和个体因素。病毒感染的常见的症状包括疲乏，流感-样症状和发热。

许多类型的病毒感染，诸如普通感冒，在通常健康人中是自限性的。此表示病毒感染导致病一定时间，然后其溶解及症状消失。但是，一些人处于发展病毒感染的严重的并发症的风险。此外，特定类型的病毒感染，诸如HIV/AIDS，不是自限性的及导致严重的并发症和/或可最终是致死的。作为严重的损伤的一例，一些形式的麻疹病毒感染导致脑的发炎，及因而永久脑损伤。

有导致广泛的病毒感染或病毒疾病的许多类型的病毒。例如，有超过200种不同的可导致感冒或上呼吸道感染的病毒。其他常见的病毒包括导致流感或流感的流感病毒。爱泼斯坦-巴尔病毒和巨细胞病毒导致感染性单核细胞增多症，水痘带状疱疹病毒（VZV）导致带状疱疹和鸡痘，及HIV导致AIDS。

病毒具有不同机理，由此它们在生物中产生疾病，其大大地依赖于病毒物种。在细胞水平的机理主要包括细胞裂解，破开及随后细胞死亡。在多细胞生物中，如果足够的细胞死亡，全生物会开始遭受效应。尽管病毒导致健康稳态的破坏，导致疾病，它们也可在生物内相对无害地存在。一例会包括导致冷疱的单纯疱疹病毒（HSV）在人身体之内保持休眠状态的能力。此被称为潜伏期（Margolis,Elfman et al.2007），且是全部疱疹病毒的特征，包括导致腺发热的EBV，及VZV。多数人已感染这些类型的HSV中的至少一种（Whitley和Roizman2001）。但是，这些潜伏病毒可有时是有益的，如病毒的存在可增加针对细菌病原体，诸如鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）的免疫（Barton,White et al.2007）。另一方面，潜伏鸡痘感染在随后生命中返回，如被称为带状疱疹的疾病。

一些病毒可导致终生或慢性感染，其中尽管宿主的防御机理，病毒在身体中持续复制（Bertoletti和Gehring2007）。此在乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染中是常见的。慢性地感染的人已知为载体，由于它们作为感染性病毒的携带者。在具有高比例的载体的群中，疾病被称为是地方性的（Rodrigues,Deshmukh et al.2001）。与急性裂解性病毒感染相反，此存留暗示与宿主生物的相容的相互作用。

HSV-1感染是病毒感染的一例。HSV以一些疱疹感染产生蔓延疹的趋势命名（Taylor,Brockman et al.2002）。其是大家族的俗名，其成员包括：单纯疱疹1和2，发热水疱和生殖感染的成因；VZV，鸡痘和带状疱疹的成因；巨细胞病毒（CMV），其影响唾液腺和其他内脏；EBV，与淋巴样组织的感染关联；及一些最近鉴定的病毒（HSV-6,-7和-8）。家族的显著的特征是其向病毒潜伏期和复发的感染的趋势。

HSV感染，常常通俗地被称为疱疹，通常靶向粘膜。病毒进入膜表面的裂缝或切口，然后在立即附近的基底和上皮细胞中倍增。此导致发炎，水肿，细胞裂解，及特征性薄-壁的囊泡的形成。HSV的主要疾病是面部疱疹（口腔,眼和咽），生殖疱疹，新生儿疱疹及播散的疾病。另外被称为发热水疱或冷疱的唇疱疹是最常见的复发的HSV-1感染。囊泡通常在唇的粘膜皮肤连接处或在相邻皮肤上长。疱疹角膜炎（也被称为眼疱疹）是眼的感染发炎，其中潜伏病毒进入三叉神经的眼支而非下颌支。初步症状是眼的砂样感觉，结膜炎，锐疼痛，及对光敏感。一些患者也发展特征分支的或不透明的角膜损伤。在25%～50%的情况中，角膜炎是复发的和慢性和可干扰视觉。

在多于90%的情况中，原发感染，无症状（Liesegang1989）在口腔粘膜中发生，作为与唾液的感染的粒子接触的结果。在感染之后不久，线性病毒基因组环化及DNA复制在原点起始（作为综述：Boehmer和Lehman1997）。DNA复制起初由θ机理进行，随后切换到σ或滚环模式，以产生长头-到-尾多连体。自同源重组出现的多DNA复制叉，序列-介导的基因组异构化，及其他事件，导致分支的DNA中间体的扩展的网络的形成。最终，这些结构溶解进单元-长度基因组，及包装进预组装的壳体。不过，较全长标准HSV-1病毒DNA短的DNA分子可在核壳体之内壳化，只要它们含有切割/包装信号（Vlazny,Kwong et al.1982）。但是，显著短于标准病毒基因组的含有HSV-1基因组的壳体不感染。

在上皮组织中复制之后，病毒在潜伏之前增长为神经元。1型HSV主要进入三叉，或第5颅，神经，其在口腔区中具有扩展的神经支配，而2型HSV通常在腰-骶脊柱神经干的神经节中潜伏。通过各种引发因素诸如发热，UV辐射，应激或机械损伤，病毒迁移到身体表面及产生局部皮肤或膜损伤，常常在与之前感染相同的位点。由于潜伏HSV-1的主位置是三叉神经节，负责脸的感觉神经支配，多数复发位于眼或唇。在一般群中HSV-1的血清流行为24.5%～67%，有30～70%的阳性受试者经历复发的唇疱疹（Liesegang2001）。的确，几乎每个人可潜在地呈现HSV-1感染事件，由于对死后组织的使用聚合酶链反应（PCR）的新近研究显示，几乎100%的至少60岁的人在三叉神经节中存在具有几种HSV-1基因组拷贝（Wang,Lau et al.2005）。眼，及特别角膜，是HSV-1感染的第2频繁的位置。疱疹角膜炎的流行率是149/100,000（Liesegang,Melton et al.1989），每年多于30个新事件/100,000居住者（Labetoulle,Auquier et al.2005）。一旦眼已被疱疹感染临床影响，跟踪2年内的复发速度是23%和5年内的复发速度是40%（Wilhelmus,Coster et al.1981;Liesegang1989）。视觉预后是差的，尤其在深度角膜感染中（间质角膜炎），达60%的影响的眼在跟踪5年后达到小于20/40的视敏度（Kabra,Lalitha et al.2006）。结果，在全世界HSV-1是失明的主导原因。在欠发达国家，HSV-1眼感染占护理角膜诊所的患者的约10%（Pramod,Rajendranet al.1999），且尽管在最近三十年使用局部或口腔抗病毒剂，单纯疱疹角膜炎也在世界的最发达地区保持为感染性角膜混浊的最频繁的成因（组1998），占约10%的患者经历角膜移植（Leger,Larroque et al.2001）。而且，在最近移植的角膜中HSV-1复活的天然的风险在手术后第1年是约25%（Lomholt,Baggesen et al.1995），及约33%的初次移植失败（无移植物清除）显示了相关于角膜中HSV-1基因组的存在（Cockerham,Bijwaard et al.2000）。这些数据解释为何HSV-1保持为角膜移植失败的主要原因，占全部情况的再移植的约22%。

潜伏期和复发的感染的临床并发症随着年龄的增长，癌化学治疗或缓和免疫防御的其他病情而变得更严重。HSV在其中最常见和在AIDS患者中严重的条件致病菌（Ramaswamy和Geretti2007）。几乎95%的此组会经历由这些病毒皮肤，粘膜，肠和眼疾病的反复发作。

人免疫缺陷病毒（HIV）是导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS）（Weiss1993;Douek,Roederer et al.2009），人中免疫系统开始失效，导致生命-威胁机会性感染的病情的慢病毒（反转录病毒家族的成员）。HIV感染由血，精液，阴道分泌物，前射精分泌物或母乳的转移发生。在这些体液之内，HIV作为游离的病毒粒子和感染的免疫细胞之内的病毒存在。4种主要传播途径是不安全的性交，污染的针，母乳和自感染的母向其出生的婴儿的传播（垂直传播）。在发达国家对血制品中HIV的筛选大大地消除了通过输血或感染的血制品的传播。

人中的HIV感染被世界健康组织（WHO）认为是流行病。自在1981其发现到2006，AIDS杀死多于两千五百万人。HIV感染约0.6%的世界人口。仅在2005年，AIDS索要了估计2.4～3.3百万生命，其中多于570,000是儿童。抗反转录病毒剂治疗减少HIV感染的死亡率和病态。

HIV主要感染人免疫系统中的活细胞，诸如辅助性T细胞（特定为,CD4⁺T细胞），巨噬细胞和树突细胞。HIV感染通过3种主要机理导致低水平的CD4⁺T细胞：第1，感染的细胞的直接病毒杀死；第2，感染的细胞中增加的凋亡速度；及第3，感染的CD4⁺T细胞被识别感染的细胞的CD8细胞毒性淋巴细胞杀死。当CD4⁺T细胞数降低到临界水平以下时，细胞-介导的免疫丧失，及身体渐进地变得更敏感于机会性感染。

未治疗的多数被HIV-1感染的人最终发展AIDS，和最终死于机会性感染或与免疫系统的进行性破坏关联的恶性（Lawn2004）。HIV以被病毒，宿主和环境因素影响的可变速度发展为AIDS；多数会在HIV感染10年之内发展为AIDS：一些会进展更快得多，及一些会耗更长得多的时间（Buchbinder,Katz et al.1994;2000）。用抗-反转录病毒药物的治疗增加被HIV感染的人的预期寿命，甚至在HIV进展为可诊断的AIDS之后，用抗反转录病毒治疗的平均存活时间如在2005年估计为大于5年（Schneider,Gange et al.2005）。不用抗反转录病毒治疗，某些患AIDS的人一般在一年内死亡（Morgan,Mahe etal.2002）。

【病毒感染的诊断及治疗】

病毒疾病由各种临床和实验室方法诊断。这些包括：症状的临床评定，细胞或动物培养物中的病毒分离，及对针对病毒的抗体的血清学测试。进行病毒感染的诊断始于取充分的个人及家族医疗历史，包括症状，及完成体检。诊断一些病毒感染，诸如季节性的流感，可基于历史和身体进行。血测试，诸如完全血计数可进行。完全血计数量度不同类型的血细胞，包括白细胞（WBC）数。不同类型的WBC数在感染性过程，诸如病毒感染期间以特征性方式增加。培养测试也可进行。此测试需要自怀疑被病毒感染的身体区取小样品，及在实验室生长样品，以测定导致病的微生物类型。常见的样品用培养物包括自喉，血和自肺的痰的那些测试。诊断测试也可包括腰部穿刺，也被称为脊椎穿刺，其涉及用针自脊柱抽取脑脊液（CSF）小样品。测试CSF样品的白细胞和可在脊柱或脑中其他病毒感染指标，诸如病毒脑膜炎。可实施X-射线，以辅助一些病毒感染的诊断。此可包括取怀疑的病毒肺炎的情况的胸X-射线。可进行另外的测试，以便排除或确认可伴随病毒感染或导致类似症状的其他疾病，诸如继发性细菌感染。

HSV感染由各种临床和实验室方法诊断，包括症状的临床评定，在细胞或动物培养物中分离，及针对HSV的抗体的血清学测试。口或生殖器的粘膜上的小，疼痛，囊泡化损伤，淋巴结病和渗出物是单纯疱疹的典型诊断症状。进一步诊断支持是通过检查自该用Giemsa，Wright（也被称为Tzanck制备），或Papanicolaou（Pap）方法染色的损伤的基部刮屑而可利用的。具多核的细胞，巨细胞和核内嗜酸性包含体的存在可辅助建立疱疹感染。但是，此方法会不区别HSV-1，HSV-2或其他疱疹病毒，其需要更特异性的亚分型。而且，实验室培养和特定测试对于诊断免疫抑制的及患严重的，播散的疱疹感染的新生儿患者是必要的。将组织或流体样本导入原代细胞系诸如猴肾或人胚胎肾组织培养物，然后观察在24～48小时之内的致细胞病变效应。对样本或细胞培养物使用荧光抗体的直接测试或使用特异性探针或由聚合酶链反应（PCR）扩增的DNA检测可区分HSV-1，HSV-2和紧密相关的HSV，但不是对于确认见于样品的所述病毒基因组是完整或感染性的有用的工具。虽然血清学分析对于原发感染是有用的，其对于复发的病是非结论性的，因为在感染复发后对HSV的抗体滴度通常不增加。

几种剂对于HSV感染治疗是可利用的。阿昔洛韦是至今开发的最有效治疗，其是非毒性和高度特异于HSV。泛昔洛韦和伐昔洛韦是替代药物。应用于生殖和口腔损伤的局部药物治疗切割感染的时长及减少病毒脱落。系统性治疗对于更严重的并发症诸如疱疹角膜炎及播散的疱疹是可利用的。新证据指示，口腔阿昔洛韦的每天剂量持续6个月～1年时期可在预防复发的生殖疱疹中有效。含有薄荷醇，樟脑和局部麻醉剂的非处方冷疱药物治疗减少疼痛和可保护免于继发性细菌感染，但它们很可能不影响病毒感染的发展。在抑制冷疱中的一些保护可由在复发的最早期经口取氨基酸赖氨酸而得到。但是，当前治疗不减少DNA基质的负荷，由此不能减少进一步病毒复活的风险。理想情况下，针对HSV-1感染的最后武器应是经久地存在于细胞中，避免灵敏度问题及，如果可能的，减少病毒基因组的负荷。旨在由内切核酸酶的作用消除病毒DNA的新抗病毒剂治疗在开发中。

已从自健康及患病的患者的泪（Fukuda,Deai et al.2008），角膜刮屑（El-Aal,El Sayed et al.2006）和角膜外植体钮（Crouse,Pflugfelder et al.1990）使用基于PCR的方法（Llorente,Hidalgo et al.1998;Gonzalez-Villasenor1999;Kessler,Muhlbauer et al.2000;O'Neill,Wyatt et al.2003;Kimura,Ihira et al.2005;Namvar,Olofsson et al.2005;Strick and Wald2006;Susloparov,Susloparov etal.2006;Engelmann,Petzold et al.2008;Sugita,Shimizu et al.2008;Tanaka,Kogawa et al.2009;Wada,Mizoguchi et al.2009;Yu,Shi etal.2009）或对感染的细胞的DNA/DNA杂交（Nago,Hayashi et al.1988;Kotronias和Kapranos1998）实施角膜中HSV的病毒DNA检测。但是，这些方法无一允许在单分析中在感染的细胞中感染性HSV基因组的检测和性质。

HSV是一种类型的病毒疾病，对此，用于诊断HSV感染的广泛的技术已公开于各种专利和出版物，例如EP0139416，EP0263025，WO0202131，WO2004036185及Matsumoto,Yamada et al.1992,Kotronias and Kapranos1998,Kessler,Muhlbauer et al.2000,Namvar,Olofsson et al.2005,Susloparov et al.2006,Sugita,Shimizuet al.2008,和Yu,Shi et al.2009。

诊断HSV感染性疾病的最可靠的方法是分离用于确定的病毒，但此方法需要培养细胞及需要几天以确定。也有免疫学方法，但它们通常是不可靠的，且难实施，尤其在潜伏期期间。已开发大量的基于PCR的方法用于相比由常规手段可能的增强的灵敏度和更快的到结果的时间，但这些方法不允许分析全HSV基因组，且不可预测含有病毒核苷酸序列的样品的感染性，因为所述的病毒的完全基因组未测试。已报道在原位杂交（Nago,Hayashi et al.1988;Kotronias和Kapranos1998）或点印迹DNA-DNA杂交（Matsumoto,Yamada et al.1992）中细胞中HSV基因组检测的直接方法，但这些方法不能测定HSV的类型。有HSV疾病的快速，敏感和特异性诊断是紧迫的实例。因此有对开发辅助HSV诊断的快速和敏感工具的临床需求。也保持有用于HSV感染的分型的工具的需求。病毒感染中涉及的特定病原的快速鉴定提供可用于在短时间之内确定适当的治疗的信息。

已由Gardella等人的凝胶电泳系统（Gardella,Medveczky et al.1984）进行裂解性或潜伏感染后HSV-1基因组的构型分析。在这些凝胶中，相比对应的线性形式，环状分子特征性地呈现更低运动性，及此允许了附加型形式的潜伏疱疹病毒基因组的检测。但是，此技术不区别感染的细胞或组织中HSV基因组的异构体。其他技术如脉冲场凝胶电泳（PFGE）已用于提供对HSV DNA复制的机理的洞察（Severini,Morgan et al.1994）。此测试家族是高度耗时的，且在全部情况中需要DNA印迹，暗示放射性操作，长迁移和/或曝光时间。

已报道多种检测和分析方法的另一病毒是人免疫缺陷病毒，或HIV，包括HIV-1和HIV-2。血浆中的HIV-1载量，如由HIV-1RNA的拷贝数测量，是在临床实践中广泛使用的主要实验室标记物。更高病毒载量直接关联于在HIV-1-感染的个体中更快速进展到AIDS。高度有活性的抗反转录病毒治疗（HAART）的有效性也通过测量血浆中HIV-1载量来评定。患者被认为由HAART成功地治疗，当血浆中的HIV-1载量停留在商业测定的检测限以下，其目前是50拷贝的HIV-1RNA/ml血浆。但是，尽管其临床成功，HAART不可根除病毒，主要由于各种病毒贮器包括潜在感染的静止CD4⁺细胞的存留（Hermankova,Siliciano et al.2003;Siliciano,Kajdas et al.2003）。新近研究展示，病毒复制和进化在一些患者中持续，甚至当血浆中的HIV-1RNA不是可检测的，和治疗另外认为是成功的（Frenkel,Wanget al.2003;Havlir,Strain et al.2003;Ramratnam,Ribeiro et al.2004;Chun,Nickle et al.2005;Tobin,Learn et al.2005）。作为耐药物的HIV-1株的开发的结果的HAART失败是常见的问题（del Rio2006）。由此，特定注意应给予通过研究外周血单核细胞（PBMC）中其分子标记物来表征HIV-1残留的复制。尤其是，应定量细胞-关联的HIV-1RNA和原病毒DNA的量。在这些中，原病毒DNA的量可反映潜在感染的细胞库的尺寸。但是，细胞HIV-1RNA/DNA水平和治疗结果之间的关系的系统性研究被在HAART下PBMC中极其低拷贝数的HIV-1RNA/DNA阻碍。因此，用于细胞形式的HIV-1RNA/DNA的定量的高度敏感方法的开发是必要的。

实时反转录-PCR（RT-PCR）是目前用于定量细胞中HIV-1RNA/DNA的优选的方法（Douek,Brenchley et al.2002;Fischer,Jooset al.2004）。但是，尽管它们的精确度和特异性，使用TaqMan检测化学的单-步骤实时RT-PCR方法不能在总细胞RNA/DNA的情景中每反应可靠地定量<100拷贝的HIV-1RNA/DNA靶（Espy,Uhl et al.2006）。此引发产生假-阴性结果的可能性，当在HAART下研究自患者的PBMC物质时，尤其当限制的量的临床物质是对于分析可利用的时。使用基于SYBR绿的检测化学以检测HIV-1RNA/DNA的方法可为更敏感（Espy,Uhl et al.2006），但倾向于假-阳性结果，因为DNA结合染料不以序列-特异性方式结合。随着每反应一个分子的理论检测限，套式PCR认为是相比实时PCR更敏感方法。但是，用此方法可产生仅半-定量数据。此外，其需要人力-密集和耗时实验过程。相反，如以下描述，发明人发现了分子梳允许检测独特事件，和可用作检测和定量患者的感染的细胞中的HIV原病毒DNA的高度敏感方法。

为了诊断病毒感染，抗原检测测定的使用在增加，尤其基于单克隆抗体的那些。使用针对DNA或RNA的特异性探针的快速核酸检测，或扩增方法是用于几种病毒的其他选项。这些具有优势，其如此敏感到它们可想得到地在单感染的细胞中检测病毒核酸。例如，允许由其他方法常常不可检测的微小量的DNA的酶促扩增的PCR技术已广泛用于检测几种病毒剂诸如HSV（Rowley,Whitley et al.1990），人免疫缺陷病毒（HIV）（Ou,Kwok et al.1988）和人乳头瘤病毒（HPV）（Shibata,Arnheim et al.1988）的基因组的部分。

PCR的显著限制是其不允许确认所检测的完全基因组的完整性，因而不可为测试的样品中发现的完全感染性病毒基因组的表征标准。PCR由此也缺乏测试针对感染性病毒粒子的抗病毒剂治疗的效率需要的特异性，因为其结果不指示是否检测的病毒多核苷酸是感染性的。血清学方法不直接检测感染性病毒多核苷酸，诸如染色体-整合的病毒基因组DNA，及需要受试者在检测之前产生针对病毒的免疫应答或足够的量的病毒抗原存在于样品中。

【病毒癌基因检测和由病毒的原-癌基因活化】

许多癌来源自病毒感染；此在动物诸如鸟，但也在人中尤其是真的。世界，WHO国际癌研究机构估计在2002年20%的人癌由感染导致，其中10～15%由7种不同病毒之一导致（Carrillo-Infante,Abbadessa et al.2007）。但是，仅小部分人或动物会在感染之后发展为癌。肿瘤病毒有各种形式：具有DNA基因组的病毒，诸如HPV（子宫颈癌），乙型肝炎病毒（肝癌），及EBV（一类淋巴瘤），及具有RNA基因组的病毒，如丙型肝炎病毒（HCV）可导致癌，如具有DNA和RNA基因组的反转录病毒可以（人T-亲淋巴性病毒和乙型肝炎病毒,其如混合的双及单链DNA病毒正常复制，但也具有反转录病毒复制组分）。

直接致癌病毒机理涉及将另外的病毒致癌基因插入宿主细胞（急性地-转化病毒）或增强基因组中已存在的致癌基因（原-癌基因）（缓慢-转化病毒）（作为综述，（Parsonnet1999））。在急性地-转化病毒中，病毒粒子携带编码过度活动癌基因的基因，其被称为病毒-癌基因（v-onc），且刚v-onc表达，就转化感染的细胞。相反，在缓慢-转化病毒中，插入病毒基因组，尤其由于病毒基因组插入是反转录病毒的专性部分，接近宿主基因组中的原-癌基因。病毒启动子或其他转录调节元件，进而，导致该原-癌基因的过表达，其进而诱导不受控的细胞增殖。因为病毒基因组插入不是特异于原-癌基因，且接近该原-癌基因的插入机会低，缓慢-转化病毒相比急性地-转化病毒具有非常长肿瘤潜伏期，其已携带病毒-癌基因。

当它们感染细胞及持续为环状附加体或质粒，与宿主细胞DNA独立地复制时，一些病毒是致瘤的（爱泼斯坦-巴尔病毒和卡波西肉瘤-关联的疱疹病毒）。也存在间接病毒致癌性及涉及感染超过十年发生的慢性非特异性发炎，如在HCV-诱导的肝癌的情况中。这2个机理在它们的生物学和流行病学上不同：直接肿瘤病毒必需在每表达至少一种蛋白或RNA的肿瘤细胞中具有至少一个病毒拷贝，其导致细胞成为癌性。外源病毒抗原在这些肿瘤中表达，因而免疫抑制诸如AIDS的人或移植患者处于更高这些类型的癌的风险。

【基于使用病毒载体的基因或细胞治疗】

基因治疗涉及将基因插入个体的细胞和组织，以治疗疾病，诸如遗传性疾病，其中基因的有害的突变等位基因被有功能的取代。尽管所述技术仍在其婴儿期，其已使用而有一些成功。病毒载体是科学上通常使用以将该遗传物质递送进组织（基因治疗）或细胞（细胞治疗）的工具。这些病毒载体主要来源自慢病毒，反转录病毒，腺病毒或疱疹病毒（作为综述，（Thoma,Ehrhardt et al.2003））。

慢病毒或反转录病毒中的遗传物质为RNA分子形式，而它们的宿主的遗传物质为DNA形式。这些类病毒的基因组可通过将待转移的目标基因序列插入感染的组织或细胞中来修饰。作为野生型病毒，重组病毒会与一些酶，即反转录酶和整合酶一起将其RNA导入细胞。此自重组病毒的RNA分子必需在其可整合到宿主细胞的遗传物质之前自其RNA分子产生DNA拷贝。在此DNA拷贝产生及在宿主细胞核中游离之后，其必需合入宿主细胞的基因组。即，其必需由病毒携带的另一酶（被称为整合酶）插入细胞中的染色体。如果此宿主细胞随后分裂，其后代会全部含有新基因。

可来自慢病毒或反转录病毒的使用的基因治疗的问题之一是整合酶可将病毒的遗传物质插入宿主基因组中的任何任意位置；其将遗传物质随机挤入染色体。如果遗传物质恰好插入宿主细胞的原基因之一中，此基因会破坏（插入诱变）。如果基因恰好为调控细胞分裂的基因，可发生不受控的细胞分裂（即,癌）。此问题最近开始通过利用单链寻靶内切核酸酶（Grizot,Smith et al.2009）或通过包括特定序列诸如用于将整合位点导入特定染色体位点的座位控制区（Zhou,Zhaoet al.2007）而被确定。

腺病毒是以双链DNA形式携带它们的遗传物质的病毒。它们导致人中的呼吸道，肠和眼感染（尤其普通感冒）。当这些病毒感染宿主细胞时，它们将它们的DNA分子导入宿主。腺病毒的遗传物质未合并到宿主细胞的遗传物质。DNA分子保持游离于宿主细胞核，且此额外DNA分子中的指令恰如任何其他基因转录。唯一差异是当细胞即将经历细胞分裂时这些额外基因不复制，由此该细胞的后代会不具有额外基因。自细小病毒家族的腺伴随病毒（AAV）是具有单链DNA基因组的小病毒。野生型AAV可在第19染色体上的特定位点以接近100%确定度插入遗传物质（Huser和Heilbronn2003）。但重组AAV，其不含有任何病毒基因和仅治疗性基因，不整合到基因组。结果，用腺病毒载体或AAV治疗会在生长的细胞群中需要再施用，尽管整合到宿主细胞的基因组的缺失应预防癌的发展（Douglas2007）。

疱疹病毒目前用作基因转移载体，由于它们的盖过其他病毒载体的特定优势。在HSV来源的载体的独特特征之中也是病毒粒子的非常高转基因容量允许携带长外源DNA序列，病毒基因组的遗传复杂性，允许产生许多不同类型的具有溶癌活性的衰减的载体，及HSV载体侵袭自感觉神经节的神经元及在其中建立终生非-毒性潜伏感染的能力，在其中转基因可强烈和长期表达。3种不同类载体可源于HSV：有复制能力的衰减的载体，无复制能力的重组载体和被称为扩增子的缺陷辅助依赖型载体。复制缺陷型HSV载体由一个或更多立即-早期基因，例如ICP4的缺失制造，其然后由互补的细胞系以反式提供。溶癌HSV载体是癌的许诺治疗剂。该基于HSV的载体已在神经胶质瘤，黑色素瘤和卵巢癌患者中测试。

发明人意外地发现了与特别设计的探针或探针组组合的分子梳及延伸技术可用于利用分子梳和/或DNA延伸技术诊断，检测或监测携带感染性病毒DNA和其他病原性基因的受试者。这些诊断性应用在通常对容易自知道的培养的细胞系获得的DNA样品进行的分子梳的现有技术中未知。虽然分子梳已之前应用于染色体分析，其之前未认识到此方法或此方法的适用可有用地应用于诊断病毒感染或检测样品中的其他病原性多核苷酸。另一方面，发明人意外地发现了直接从自病毒-感染的受试者的生物学样品获得的DNA可由分子梳过程和这些样品中检测的有活性的，感染性病毒DNA评价。这些方法克服与现存病毒感染诊断方法关联的许多问题，及提供用于检测及监测病毒-感染的受试者或患者中感染性病毒多核苷酸的方便的，快速和精确的方法。

【发明概述】

本发明提供可靠的，简单，快和廉价方式以在自受试者或患者的样品中使用与能与至少5%，10%，25%，50%，75%的感染性或病原性多核苷酸序列结合的特异性探针，尤其是与80～100%的感染性或病原性多核苷酸序列结合的探针组组合的分子梳和/或DNA延伸技术检测感染性或病原性多核苷酸序列，包括病毒基因组序列。本发明的方法体外进行。

发明人发现了分子梳对于（i）检测及定量感染的哺乳动物细胞、组织或生物学流体中的病毒DNA或病毒来源-DNA，诸如感染的角膜中的感染性单纯疱疹病毒DNA，（ii）跟踪在感染的哺乳动物细胞组织或生物学流体中发生的病毒复制和病毒基因组重排，及（iii）鉴定存在于感染的细胞、组织或生物学流体中的感染性病毒多核苷酸或感染性病毒多核苷酸是有力的技术。

不像在感染的细胞或组织中检测病毒的现有技术，本发明的分子梳技术可同时进行，且不需要多耗时和昂贵的过程。本发明的方法作为检测细胞或组织中的病毒污染或感染的诊断工具是容易可应用的，对于通过定量或另外评价该治疗对在感染的哺乳动物细胞或组织中感染性病毒或感染性病毒多核苷酸或病毒复制的量的效应或功效来测定抗病毒剂治疗的功效有用。发明人发现了分子梳克服了与检测或诊断病毒感染的过去方法，包括基于PCR的方法关联的许多问题，及提供容易和快速方式。本发明的特定实施方式包括以下实施方式。

检测生物学样品中的病毒基因组或感染性病毒多核苷酸的方法，其包括自所述样品分离、提取或另外获得多核苷酸；分子梳所述多核苷酸以形成延伸的多核苷酸；使延伸的多核苷酸与一种或更多识别感染性病毒或基因组病毒多核苷酸序列的探针接触；检测探针与被梳的样品的杂交。多核苷酸可为感染性基因组病毒DNA或感染性非-基因组病毒DNA，癌基因或原癌基因，且可整合到受试者染色体或可为附加体或转基因DNA。整个病毒基因组或整个感染性病毒DNA的检测与感染重要地关联。例如，说到疱疹角膜炎的HSV成因物，其对于能显示细胞中完全感染性基因组的存在是必要的，其可然后在感染的细胞中部分或完全产生。

生物学样品通常直接自受试者或患者获得，且可构成组织，细胞样品，或血，CSF或滑液样品或其他流体生物学样品。用于延伸或分子梳的DNA分子或纤维可从生物学样品提取。样品可从活的或非-活的受试者得到。受试者包括敏感于病毒疾病的动物，包括人、非-人哺乳动物，诸如牛，牛，绵羊，山羊，马，猪，狗，猫和非-人灵长类动物；鸟，诸如鸡，火鸡，鸭，鹅，鸵鸟，鸸鹋或其他鸟；爬行动物，两栖动物和其他动物。

使延伸的或被梳的DNA分子与适合于鉴定感染性或有生物学活性的基因组，感染性病毒，癌基因或原癌基因DNA的一种或更多探针接触。为检测DNA病毒，采用覆盖病毒基因组的80～100%或任何中间子域或值的一种或更多探针，或优选一组探针。DNA病毒可为单或双链的。代表性的DNA病毒包括疱疹病毒，诸如单纯疱疹病毒（HSV）1和2型，乳头瘤病毒和肝炎病毒，诸如乙型肝炎病毒。也以类似方式选择与反转录病毒，诸如HIV，优选作为原病毒整合进宿主染色体的反转录病毒结合的探针，和优选采用覆盖原病毒基因组的80～100%的一组探针。

探针可对应于已知感染性的病毒株的基因组的至少5%和优选80～100%，或可设计为包括知道对于特定种病毒的复制，繁殖或致病性必要的基因的组合。

所述探针可对应于HSV-1(NC_001806.1)(SEQ ID NO:15)，HSV-2(NC_001798.1)(SEQ ID NO:16)，HIV1(NC_001802.1)(SEQ IDNO:17)，HIV2(NC_001722.1)(SEQ ID NO:18)，HBV(NC_003977.1)(SEQ ID NO:19)，HPV16(NC_001526.2)(SEQ ID NO:20)，HPV18(X05015.1)(SEQ ID NO:21)，HPV31(J04353.1)(SEQ IDNO:22)，HPV33(M12732.1)(SEQ ID NO:23)和HPV45(X74479.1)(SEQ ID NO:24)，其也通过引用它们的登录号合并。

一种或更多探针或探针组可包含2种，3种或更多不同的用不同标记物标记的探针亚组。优选地，该探针用于测定基因组或感染性病毒DNA的构型或鉴定病毒基因组或感染性病毒DNA分子或另一病原性DNA分子诸如癌基因或原癌基因的不同部分或段。

在另一实施方式中，本发明针对检测或鉴定哺乳动物细胞、组织或生物学流体中的感染性或基因组病毒多核苷酸序列的方法，其包括使用分子梳检测细胞、组织或生物学流体中感染性病毒多核苷酸或基因组病毒多核苷酸的存在或量。再一实施方式构成定量感染性或基因组病毒多核苷酸序列的方法，其包括使用分子梳检测细胞、组织或生物学流体相比在不同的时间点获得的未感染的对照样品或另外类似样品中的感染性病毒多核苷酸或基因组病毒多核苷酸的量。

也涵盖在生物学样品中检测病毒的存在或检测病毒复制的方法，以及尤其在哺乳动物细胞、组织或生物学流体中纵向地跟踪病毒复制或病毒基因组或感染性病毒DNA的重排的方法。该方法可通过分子梳自适当的样品或取特定时期的样品获得的DNA来进行，用于细胞或组织中潜伏或复制病毒DNA或重排列的病毒DNA的存在。

本发明也属于使用分子梳来评价抗-病毒治疗的功效以检测从受试者获得的样品中感染性或基因组病毒DNA的存在、排列或量，用抗-病毒剂治疗受试者或进行其他抗-病毒治疗，及监测或再评价在使用本文所述的分子梳技术处理之后感染性或基因组病毒DNA的存在、排列或量的方法。

实施分子梳的试剂盒，其含有分子梳设备和/或试剂，与感染性多核苷酸结合的一种或更多探针，及任选地一种或更多细胞、组织或生物学流体样品以及进行分子梳，DNA延伸或探针杂交的其他常规成分。在一些实施方式中，试剂盒会含有检测或鉴定被梳的DNA分子中的基因组病毒DNA的一组探针，其覆盖病毒基因组，感染性病毒核酸，癌基因或原-癌基因的至少5%，尤其80，85，90，95，99或100%。探针或探针组的最小长度是1kb。在一些实施方式中，试剂盒会还含有用于检测或分类感染性序列的软件，及在其他实施方式中，试剂盒可另外地包含用于根据本发明的方法检测病毒基因组或感染性病毒核酸的使用说明。

【附图说明】

图1．可根据本发明使用的HSV-1特异性探针的例。点图代表HSV-1基因组序列（水平轴）和HSV-1特异性探针（垂直轴）的比较，以彼此定位不同探针。一些HSV-1片段（HSV-S54,-B52及-S58）与倒置的重复的序列杂交，因而以2拷贝存在。表A中列的HSV-1片段可关联及以不同色彩显示，以检测HSV-1基因组。在此例中，41种探针（在可利用的63种探针上,表A）如下关联允许覆盖99%的HSV-1基因组。HSV-S54，-P4，-P5，-S4及-B4片段对应于明显的H121kb探针。明显的H256kb探针由19种重叠探针（HSV-B7,-B8,-S14,-B10,-S16,-B13,-S18,-B15,-S21,-B19,-S23，-B21，-B22，-S30，-S31，-S32，-B26，-P8及-B28片段）组成。45kb H3探针由HSV-B30，-S44，-S45，-B38，-B39，-B40，-S49，-B44，-B45，-B46，-B48及-S54片段组成。由于倒置的重复的序列的存在，H4（13kb）和H6（6.5kb）探针由HSV-B52及-S58片段组成；HSV-S59片段也存在于H4探针中。最终，3个重叠片段（HSV-S60,-B58及-B60）形成H57.5kb探针。形成特异于HSV-1基因组的特定区的标签的定位探针对于H1，H3和H5探针是红色（地高辛配基标记,黑框），及对于H2，H4和H6探针是绿色（生物素标记,灰框）。定位探针的尺寸（舍入为最近kb）在各框以下分别指示。

图2．自病毒粒子提取HSV-1DNA的2种方法的比较。（A）在硅烷化的表面上被梳的HSV-1DNA的例。在梳用标准苯酚氯仿（左图像）或修饰的提取流程自琼脂糖插塞-嵌入的HSV-1（右图像）提取的HSV-1DNA溶液之后，纤维用嵌入剂YOYO-1显示，及在装备照相机的落射荧光显微镜上观察。图显示是各提取方法的特征的2个图像。标尺以条指示。（B）直方图显示在自HSV-1粒子分离的基因组DNA上含有的给定长度间隔之内DNA纤维尺寸数的累积频度。间隔宽度是10μm。由此，例如，第3点代表在［30～40μm］间隔中的量度数。左图显示用标准苯酚:氯仿提取方法提取的DNA溶液中记录（654量度）的每HSV-1DNA纤维的长度。纤维的中位尺寸是18μm，即36kb。右图显示用替代性的方法获得的DNA纤维的长度分布（2322量度）。在该情况中，分布的中位尺寸是42μm，即84kb。

图3．自病毒粒子及感染的细胞提取的DNA溶液中HSV-1基因组的异构体的检测。（A）对被梳的HSV-1DNA的FISH的例。指示对应于HSV-1基因组的不同异构体的杂交模式的不同可能的组织的示意表示（地高辛配基标记的-H1,H3和H5探针以黑框表示;生物素-标记的-H2,H4和H6探针以灰框表示）。如在“HSV-1检测的信号的分析”部分定义的最小需求杂交模式是也指示恰在完全信号以上。显示HSV-1基因组的各完全异构体的4个代表性的线性杂交链（白色：德克萨斯红/Alexa594-荧光：H1,H3和H5;黑：绿Alexa488-荧光：H2,H4和H6）。在对应的图像以上显示各HSV-1基因组异构体的示意表示。（B）在Vero，COS7和Neuro2A细胞系中产生的病毒粒子中HSV-1KOS株的分布基因组异构体的直方图。如描述于“实施例”部分选择及分析杂交信号。在此例中，鉴定及分类了对各实验总405个杂交信号。各条代表HSV-1基因组的各异构体数。在此例中，HSV-1KOS株异构体的分布在自COS7细胞的病毒粒子中相当地分布，然而P和IS异构体是在自Neuro2A和Vero细胞系产生的病毒粒子中更频繁的异构体。此后来的分布统计学地不同于等摩尔分布（χ-2检验）。（C）不同感染的细胞（BSR,COS-7,Neuro2a和Vero细胞）中HSV-1株Sc16和KOS的基因组异构体的分布的直方图。如描述于“实施例”部分选择及分析杂交信号。在这些例中，选择及分类来自各产生的405个信号。BSR，COS-7，Neuro2a和Vero细胞中产生的HSV-1株Sc16及COS-7中产生的HSV-1株KOS的分布统计学地相当于等摩尔分布（χ-2检验）。在Neuro2a和Vero感染的细胞中，P和IS异构体比IL和ILS异构体更频繁。

图4．自小鼠和兔角膜提取基因组DNA的方法。（A）在硅烷化的表面上被梳的基因组DNA的例。在用实施例部分中描述的流程自角膜提取之后，梳基因组DNA溶液及在装备照相机的落射荧光显微镜上观察之前用嵌入剂YOYO-1显示。左图像显示自健康小鼠角膜提取的被梳的DNA的代表性的图像，右图像是自健康兔角膜提取的被梳的DNA的代表性的图像。分子梳以低密度进行，以允许测量基因组DNA纤维的长度。标尺以条指示。（B）直方图显示自HSV粒子分离的基因组DNA上含有的给定长度间隔之内DNA纤维尺寸数的累积频度。间隔宽度是25kb。由此，例如，第5条代表［225～250kb］间隔中量度数。左图显示自小鼠角膜提取的DNA溶液中记录（10069量度）的每DNA纤维的长度。纤维的中位尺寸是204kb。在此样品中，约31%的基因组DNA纤维呈现200kb以上尺寸。右图显示自兔角膜获得的DNA纤维的长度分布（8336量度）的一例。在该情况中，分布的中位尺寸是196kb，长度200kb以上的纤维部分是27%。

图5．在感染的小鼠角膜中HSV-1基因组的异构体的分布的直方图。自HSV-1感染的小鼠角膜提取总DNA，梳及与HSV-1-特异性探针杂交。在此例中，鉴定及分类总18个杂交信号。各条代表HSV-1基因组的各异构体数。

图6．HSV-1感染的小鼠角膜中HSV-1的复制中间体的检测。图显示对应于复制多连体的复合HSV-1基因组DNA的2例（白信号：德克萨斯红/Alexa594-荧光：H1,H3和H5;黑信号：绿Alexa488-荧光：H2,H4和H6）。上图像描绘由至少2个由IS和P异构体组成的假想重叠HSV-1基因组组成的信号，而下图像显示由至少假想ILS和IL信号组成的HSV-1多连体。

图7．在HSV-1感染的小鼠角膜中非规范HSV-1基因组的检测。（A）自感染的小鼠角膜的非规范HSV-1的例。图显示不对应于HSV-1基因组的规范异构体之一的杂交模式的代表性的例（白色信号：德克萨斯红/Alexa594-荧光：H1,H3和H5;黑色信号：绿Alexa488-荧光：H2,H4和H6）。比例尺指示在HSV-1株Sc16-感染的Vero细胞的被梳的DNA提取物上获得的对应于ILS异构体的规范杂交模式（生物素-标记的H1,H2B和H3探针以灰框和信号表示;地高辛配基-标记的H2A和H5以白框和信号表示,及Alexa488-标记的H4和H6探针以黑框和信号表示）。此例显示标记以评价H4/H6区中非-规范结构的比例的HSV-1特异性探针H1～H6。（C）Vero细胞提取物中HSV-1株Sc16上的非规范H4/H6。第1杂交模式显示对应于H4/H6探针的各种尺寸的Alexa488荧光信号（黑色信号），和对应于片段H1，H2B或H3探针的Alexa594荧光（灰色信号），或对应于最大10kb的H2A或H5探针的部分的AMCA/Alexa350荧光信号（白色信号）的交替。第2例呈现各种尺寸的Alexa488荧光信号（黑色信号）和被Alexa594荧光信号（灰色信号）围绕的AMCA/Alexa350荧光信号（白色信号）之间的交替。第3例显示被Alexa594荧光信号（灰色信号）围绕的Alexa488荧光信号（黑色信号）的单一重复。指示比例尺。（D）HSV-1的H4/H6区中规范和非规范结构之间的分布的直方图。如描述于“实施例”部分选择及分析367个杂交信号。在此例中，80%的H4/H6探针对应于理论结构。

图8．ACH-2细胞培养物中原病毒HIV-1DNA的检测。全部直方图显示以一个FISH信号长度或在2个FISH信号之间的间隔尺寸（以kbp）的函数的给定长度间隔内信号数（0.644kb/类）。由此，例如，第1直方图的第2条代表以［7.86～8.50kb］间隔的量度数。（A）使用G248P87988G9和G248P86255A8F粘粒的位于染色体7p15的原病毒HIV-1DNA的例。指示对应于整合的原病毒HIV-1DNA的杂交模式的组织的示意表示（地高辛配基标记的-HIV-1探针以黑框和信号表示;生物素-标记的-F粘粒以白框和信号表示）。左和右直方图显示分别F粘粒G248P87988G9绿Alexa488-荧光信号和HIV-1德克萨斯红/Alexa594-荧光信号之间，及HIV-1德克萨斯红/Alexa594-荧光信号和F粘粒G248P86255A8绿Alexa488-荧光信号之间的间隔尺寸的分布。中直方图显示HIV-1德克萨斯红/Alexa594-荧光信号尺寸的分布。（B）7p15座位的正常等位基因的例。指示对应于正常等位基因的杂交模式的组织的示意表示（生物素-标记的-F粘粒以灰框和信号表示）。直方图显示F粘粒G248P87988G9绿Alexa488-荧光信号和G248P86255A8绿Alexa488-荧光信号之间的间隔尺寸的分布。（C）分离的原病毒HIV-1DNA。指示对应于分离的形式的HIV-1的杂交模式的组织的示意表示（地高辛配基标记的-HIV-1探针以黑框和信号表示）。直方图显示HIV-1德克萨斯红/Alexa594-荧光信号尺寸的分布。（D）使用G248P84833H9F粘粒的位于染色体7p15的原病毒HIV-1DNA的例。指示对应于整合的原病毒HIV-1DNA（地高辛配基标记的-HIV-1探针以黑框和信号表示）；及野生型座位（生物素-标记的-G248P84833H9F粘粒以白框和信号表示）的杂交模式的组织的示意表示。直方图显示HIV-1德克萨斯红/Alexa594-荧光信号尺寸的分布。

【发明详述】

本发明致使样品中感染性病毒多核苷酸或感染性病毒来源DNA的快速，特异性和敏感检测，其避免由扩增方法如PCR或血清学测试诸如ELISA强加的明显约束。

与现有技术方法相反，本发明的分子梳技术允许完全病毒基因组或病毒多核苷酸序列的感染性或强毒部分的成功的检测，导致急性或潜伏病毒感染的改善的诊断。

本发明的方法致使以时间有效的和成本有效的样式，及无操作放射性的约束地可靠地检测HSV的类型和其基因组的结构。而且，本发明的方法致使在抗病毒剂治疗，考虑无论任何类型的治疗之后跟踪病毒感染的存在。

本发明涉及方法用于体外检测真核生物细胞的感染的细胞中DNA病毒的基因组的存在，尤其是HSV基因组的检测。所述方法包括给定病毒的代表性的核酸与至少特异于HSV DNA的探针或一组探针的杂交步骤。

可根据本发明使用的分子梳技术被Bensimon等人，US专利No.6,303,296及由Lebofsky等人，WO2008/028931公开了，公开内容在此通过引用合并。发明人认识到，除了传统培养技术之外，尚无技术可检测感染性形式的病毒的完全或非-重排列的基因组的存在，由此寻求应用及适用这些技术，以检测感染性病毒DNA。梳的方法绝不作为检测该病毒DNA形式的有效工具测试，但考虑到明白特定遗传环境中该序列的遗传影响，仅对于插入到细胞基因组的DNA的长序列的位置。通过由发明人开发的修饰的方法检测感染性病毒（HSV）DNA的非限制性例示于下。

发明人修饰了标准提取流程，以自病毒粒子分离病毒基因组DNA。一般而言，代替标准流程中的0.1%肌氨酰，将0.1%SDS用于低-熔解琼脂糖插塞中病毒粒子的裂解。也开发方法，以自角膜提取基因组DNA，以为诊断目的研究感染的角膜中HSV DNA的存在。

本发明涉及检测在感染的细胞、组织或生物学流体的核酸中含有的病毒DNA，尤其是HSV DNA和HIV DNA的方法。所述方法包括所述病毒DNA的代表性的核酸与覆盖整个所述病毒DNA及允许鉴定所述病毒DNA的代表性的核酸之内的重排的特异性探针或探针组的杂交步骤。

本文所用的术语“核酸”和尤其是“病毒DNA的代表性的核酸”指定能附接于及延伸到本文定义的支持物，及更特别通过使用分子梳技术延伸的任何类型的核酸的一种或几种分子；核酸分子包括DNA（尤其是基因组DNA,尤其病毒DNA,或cDNA）和RNA（尤其是mRNA）。核酸分子可为单链或双链。

“所述病毒DNA的代表性的核酸”表示所述核酸含有遗传信息全体或关于本发明的目的必要的信息，其存在于所述病毒DNA上。此术语包括基因组病毒DNA，诸如整合到宿主染色体的病毒DNA，及其可产生可缺乏特定基因组元件但当尤其是在宿主细胞中表达时可为感染性的感染性病毒，感染性病毒DNA，及对宿主细胞发挥病原性效应的病毒基因，诸如病毒癌基因。

原-癌基因包括那些正常基因，其当由突变改变时可转变为导致细胞以未调节的方式生长或分裂的癌基因。原-癌基因具有多样的细胞功能，一些提供用于细胞分裂的信号，及其他可在凋亡中起到作用。癌基因的功能和结构特征，包括它们的核酸序列，为本领域熟知，且通过引用由J.Nicolas等人，Karger Publishers（2010），ISBN3805585764，9783805585767（244页）的Human Cancer Viruses:Principles ofTransformation and Pathogenesis合并，其通过引用合并。

癌基因包括缺陷形式的原-癌基因。单拷贝的癌基因可导致不受控的细胞生长。代表性的癌基因包括ras，myc，src，Her-2/neu，hTERT和Bcl-2。癌基因的功能和结构特征，包括它们的核酸序列，为本领域熟知，且通过引用由L.M.Surhone等人，Betascript Publishers（2010），ISBN6130361599，9786130361594（172页）的Oncogene:Gene,Mutation,Tumor,Apoptosis,Gene Expression,Protein,CellGrowth,Cellular Differentiation合并。癌基因的进一步描述和鉴定通过引用http://www.cancerquest.org/index.cfm?page=780（2011年4月11日最后访问）及引用Cooper G.Oncogenes.Jones and BartlettPublishers,1995and Vogelstein B,Kinzler KW;The Genetic Basis ofHuman Cancer.McGraw-Hill:1998合并，二者通过引用合并。原-癌基因向癌基因的活化过程可包括病毒转导或病毒整合，点突变，插入突变，基因扩增，染色体转位和/或蛋白-蛋白相互作用。可诱导原-癌基因活化的病毒包括HBV和HCV（肝细胞癌），HTLV（白血病），HPV（子宫颈,肛门和阴茎癌），HSV-8（卡波西的肉瘤），默克尔细胞多瘤病毒（默克尔细胞癌）及，EBV（Burkitt氏淋巴瘤,霍奇金淋巴瘤,移植后淋巴组织增生性疾病和鼻咽癌）。

在特定实施方式中，用于延伸的核酸样品是感染的细胞或组织的基因组DNA，尤其是总基因组DNA或更优选染色体基因组DNA（核基因组DNA），和/或其片段。术语“核酸”在本文所用尤其是指一个或几个染色体和/或一个或几个染色体片段的代表性的核酸。所述片段可为任何尺寸，最长分子达到几Mbp。所述片段通常包含10和2000kb之间，更优选20和500kb之间，且平均约300kb。

在本发明的方法中使用的核酸样品可从生物学流体或自生物学来源的组织得到，所述样品或组织例如自人，非人哺乳动物或鸟分离。

如本文定义，探针是具有与本文定义的病毒DNA的代表性的核酸，尤其是与RNA和DNA杂交的能力的多核苷酸，核酸/多肽杂交体或多肽。此术语包括RNA（尤其是mRNA）和DNA（尤其是病毒cDNA或病毒基因组DNA）分子，肽核酸（PNA），及蛋白结构域。所述多核苷酸或核酸杂交体通常包含至少100，300，500个核苷酸，优选至少700，800或900个核苷酸，及更优选至少1，2，3，4或5kb或由至少100，300，500个核苷酸，优选至少700，800或900个核苷酸，及更优选至少1，2，3，4或5kb组成。例如，可使用1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15kb或大于15kb，尤其是30，50，100或150kb的探针。该探针或一组探针可对应或覆盖病毒基因组的，尤其是感染性病毒基因组的5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，98，99或100%。核酸探针可为单或双链多核苷酸或修饰的多核苷酸。一组连续探针组会覆盖基因组的特定部分或整个基因组，或关于此部分彼此重叠。适合的探针可基于病毒多核苷酸序列，诸如本文公开的那些，及可由任何适当的方法鉴定或合成。探针可放射性，荧光或由本领域知道的其他手段标记或标记。

多肽探针通常特异性结合至少6个核苷酸，及更优选至少10，15或20个核苷酸的序列。如本文所用，探针序列，当探针是多肽时，应理解为所述多肽特异性结合的序列。

“部分”特定区，其在本文意指所述特定区的序列的连续核苷酸。本发明的部分可包含至少15或20个连续核苷酸，优选至少100，200，300，500或700个连续核苷酸，及更优选至少1，2，3，4或5连续kb的所述特定区或由至少15或20个连续核苷酸，优选至少100，200，300，500或700个连续核苷酸，及更优选至少1，2，3，4或5连续kb的所述特定区组成。例如，部分可包含1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15连续kb的所述特定区或由1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15连续kb的所述特定区组成。

在特定实施方式中，使用的探针或使用的探针中的至少一种是与靶核酸的一条链的一部分显示100%的互补序列的探针的核苷酸变体。所述变体的序列可与靶核酸的一条链的部分的序列具有至少70，80，85，90或95%互补性。所述变体可尤其不同于探针，其是在原核苷酸序列中100%同一或互补由1～20，优选由1～10，核苷酸缺失，插入和/或更优选取代，尤其是由，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个核苷酸缺失，插入和/或更优选取代。在特定实施方式中，变体保持与核酸靶序列，类似地与100%同一或100%互补于核酸靶的序列的探针杂交，尤其是特异性杂交（尤其是在本文定义的杂交条件下）的能力。

术语"互补序列"在本发明的情景中是指"互补"和"反向"或"回文"序列，即会由Watson-Crick相互作用与具有所述的序列的DNA链结合的DNA链序列。

在本发明的特定实施方式中，将用来实施本发明的探针或一种或几种探针用一种或几种半抗原（例如生物素和地高辛配基）标记，及用针对这些半抗原的特异性抗体显示。对于给定探针或探针组的不同半抗原的使用会允许检测给定病毒DNA之内的重排。所述探针可如本文定义标记及如描述于专利申请WO2008/028931，其通过引用合并。

本文所用的一组探针包含至少2种探针。例如，所述探针组可由2～20种探针（2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12，13，14，15，16，17，18，19或20种探针）组成。组中的探针数通常不超过10，20，30，40，50，60，70，80，90或100种探针，依赖于需要的灵敏度及探针长度；一组探针优选最多由2，3，4，5，6，7，8，9或10种探针组成。

本发明的探针或探针组不仅允许检测整个全基因组病毒DNA，而且也鉴定可在基因组病毒DNA之内发生的重排。例如，实施例1中使用的用于HSV检测的探针组允许由围绕独特区U_L和U_S的倒转的重复的序列之间的同源重组产生的不同HSV基因组异构体的检测。而且，用于检测HSV的各探针组（H1～H6）由用不同的2种不同半抗原（用于由H1,H3和H5探针组成的片段的地高辛配基;用于由H2,H4和H6探针组成的片段的生物素）标记的几种探针（3～19种不同片段）组成。在给定探针组之内一种或几种片段的半抗原由其他半抗原（无论此半抗原的任何性质）的改变允许产生不同色彩-荧光阵列，其允许鉴定病毒DNA的此特定区之内的重排。

分子梳也可为对于发展由病毒感染导致的癌敏感的患者，例如，处于原-癌基因向癌基因转变的风险的那些的早期诊断有用的工具。的确，分子梳可区别整合的及附加型病毒基因组。在病毒DNA整合的情况中，通过使用特定探针组，分子梳会允许测定是否整合的病毒DNA含有完全病毒癌基因或是否其整合进细胞原-癌基因邻近。

本发明也可结合基因治疗使用。通过使用对各转基因和/或病毒载体的特定探针组，分子梳提供用于评估基于病毒载体的基因治疗的功效和安全性的有力的工具。的确，分子梳可区别整合的及附加型转基因。在转基因整合（慢病毒和反转录病毒基的载体）的情况中，通过使用特定探针组，分子梳会允许测定是否整合的病毒DNA整合进基因（插入诱变）或细胞原-癌基因邻近。在转基因是附加体（腺病毒载体,AAV或HSV载体）的情况中；分子梳会是对于在生长的细胞群中定量转基因有用的，和可辅助定义用于转基因再施用的正确时间。

本发明的特定实施方式包括以下方法和产品。用于检测生物学样品中的感染性病毒多核苷酸的方法，其包括：自所述样品分离、提取或另外获得多核苷酸，分子梳所述多核苷酸以形成延伸的多核苷酸，使所述延伸的多核苷酸与识别感染性多核苷酸序列的一种或更多探针接触，检测探针与被梳的样品的杂交。此方法可通过使用是从受试者获得的组织或细胞样品的生物学样品进行，例如，血，血浆，血清，CSF，滑液样品或一些自受试者的其他种生物学流体。此方法中使用的多核苷酸可从自受试者获得的组织或细胞样品或自生物学流体的组分提取。一般而言，样品会从活的受试者得到，但样品也可从死亡的受试者得到。样品可从人或其他哺乳动物诸如牛，牛，绵羊，山羊，马，猪，狗，猫和非-人灵长类动物，或自其他动物诸如禽物种诸如鸡，火鸡，鸭，鹅，鸵鸟，鸸鹋或其他鸟得到。方法可用多核苷酸实行，所述多核苷酸是DNA，其也可含有或包含感染性或非-感染性基因组病毒DNA或非-感染性非-基因组病毒多核苷酸诸如DNA或RNA。由此方法检测的或分析的多核苷酸可整合到受试者的DNA或可为附加型形式。待检测的多核苷酸可与结合DNA病毒，包括单链和双链DNA病毒的一种或更多探针接触。例如，多核苷酸可与结合疱疹病毒，诸如单纯疱疹病毒（HSV）的一种或更多探针接触。可使用的其他探针结合其他病毒如乳头瘤病毒，乙型肝炎病毒，或反转录病毒如HIV。在一些实施方式中，方法会使用结合病毒的至少80%，90%，95%或99%的基因组或感染性DNA的一组探针。在其他实施方式中，方法中使用的一种或更多探针会包含用不同标记物标记的至少2组探针，例如，以允许鉴定不同探针结合的病毒基因组的不同部分或段或允许鉴定病毒基因组中的重排。

本发明的其他特定实施方式包括：

检测，鉴定或可视化哺乳动物细胞、组织或生物学流体中的感染性或基因组病毒多核苷酸序列的方法，其包括使用分子梳检测细胞、组织或生物学流体中感染性病毒多核苷酸或基因组病毒多核苷酸的存在或量。

定量感染性或基因组病毒多核苷酸序列的方法，其包括使用分子梳检测细胞、组织或生物学流体相比在不同的时间点或自不同源或临床样品获得的未感染的对照样品或另外类似样品中的感染性病毒多核苷酸或基因组病毒多核苷酸的量。

检测或跟踪哺乳动物细胞中病毒存在或复制或病毒基因组重排的方法，其包括对于细胞、组织或生物学流体中潜伏或复制中的病毒DNA或重排列的病毒DNA的存在实施分子梳。

评价抗-病毒治疗的功效的方法，包括使用分子梳检测从受试者获得的样品中感染性或基因组病毒DNA的存在、排列或量，用抗-病毒剂治疗所述受试者，及使用分子梳再评价所述受试者中感染性病毒或基因组病毒DNA的存在、排列或量。

覆盖80～100%的HSV，HIV，HBV或HPV基因组的一组探针。

用于实施分子梳的试剂盒，其包含：分子梳设备和/或试剂，结合感染性多核苷酸的一种或更多探针，及任选地一种或更多细胞、组织或生物学流体样品。包含检测或鉴定被梳的DNA分子中的基因组病毒DNA的一组探针的试剂盒。试剂盒还包含用于检测或分类感染性序列的软件。

本发明也涉及以下生物材料，其已在2010年4月20日根据布达佩斯条约保藏在法国国立微生物保藏中心（Collection Nationale DeCultures De Microorganismes，CNCM），Institut Pasteur25Rue duDocteur Roux，75724Paris Cedex15：HSV-B4（CNCM I-4298），HSV-B19（CNCM I-4299），HSV-Sc54（CNCM I-4300），及HSV-P4（CNCM I-4301）。各生物材料含有对应于HSV检测的探针的多核苷酸片段。本发明因此涉及各这些多核苷酸片段及涉及它们的任何组合。

【实施例】

【实施例1：单纯疱疹病毒检测】

【自病毒粒子的嵌入的DNA插塞的制备】

从病毒粒子由标准苯酚:氯仿提取法（Ben-Zeev,Weinberg et al.1974）或由描述于Lebofsky等人的修饰的过程（Lebofsky，Heilig et al.2006）提取HSV-1DNA，二者通过引用合并。简言之，将HSV-1粒子以5×10⁶病毒粒子/mL的浓度重悬浮于1×PBS，及以1:1比与在PBS中制备的1.2%w/v低-熔点琼脂糖（Nusieve GTG,ref.50081,Cambrex）溶液，于50℃彻底混合。将90μL的病毒粒子/琼脂糖混合物投入插塞-形成孔（BioRad,ref.170-3713）和保持于4℃冷却至少30min。使嵌入的病毒粒子在0.1%SDS-0.5M EDTA（pH8.0）溶液中于50℃裂解30分钟。在0.5M EDTA（pH8.0）缓冲剂中于室温10分钟洗涤3次的步骤之后，将插塞由过夜温育于50℃用2mg/mL蛋白酶K（Eurobio code GEXPRK01,France）在250μL消化缓冲剂（0.5MEDTA,pH8.0）中消化。代替肌氨酰使用0.1%SDS是非常生产性的，及允许待收集的非常高质量的提取的病毒DNA。

【自感染的细胞的嵌入的DNA插塞的制备】

自感染的细胞培养物（BSR,COS-7,Neuro2A and Vero）的HSV-1DNA的提取如之前描述（Schurra和Bensimon2009）进行。简言之，由以5000g离心5分钟沉淀感染的细胞，以2×10⁶细胞/mL的浓度在1×PBS缓冲剂中重悬浮，及以1:1比与在1×PBS中制备的低-熔点琼脂糖（Nusieve GTG,ref.50081,Cambrex）的1.2%w/v溶液于50℃彻底混合。将90μL的细胞/琼脂糖混合物投入插塞-形成孔（BioRad,ref.170-3713），且保持于4℃冷却至少30min。

块中的细胞裂解如之前描述进行（Schurra和Bensimon2009）。简言之，琼脂糖插塞于50℃在250μL的0.5M EDTA（pH8），1%肌氨酰，250μg/mL蛋白酶K（Eurobio,code:GEXPRK01,France）溶液中温育过夜，然后在Tris10mM，EDTA1mM溶液中于室温洗涤30min两次。

【自感染的角膜的嵌入的DNA插塞的制备】

在感染末期收集HSV-1株Sc16感染的小鼠角膜，及保持在

（Eurobio code EYEMAX00,法国）培养基中。在于室温15分钟期间用1×PBS溶液漂洗3次之后，将整个角膜切成小块。在GIBCO^TM1×Hanks’Balanced盐溶液HBSS缓冲剂（Invitrogen,法国,编码14060040）中制备的0.3mg/mL胶原酶A型（Roche,编码10103578001），及0.8mg/mL GIBCO^TM分散酶（Invitrogen,法国,编码17105-041）中于37℃进行组织裂解达16h。裂解物通过以5000g离心10分钟来沉淀，在1×PBS缓冲剂中以1×10⁶～2×10⁶细胞/mL的浓度重悬浮，及以1:1比与1×PBS中制备的低-熔点琼脂糖（NusieveGTG,ref.50081,Cambrex）的1.2%w/v溶液于50℃彻底混合。90μL的细胞/琼脂糖混合物投入插塞-形成孔（BioRad,ref.170～3713），且保持于4℃冷却至少30min。

【DNA最终提取和分子梳】

处理自病毒粒子或角膜的嵌入的DNA的插塞用于如之前描述梳DNA（Schurra和Bensimon2009）。简言之，将插塞于68℃在MES0.5M（pH5.5）溶液中熔解20min，及添加1.5U的β-琼脂糖酶（NewEngland Biolabs,ref. M0392S,MA,USA）及于42℃保持温育达16h。DNA溶液然后投入特氟隆贮器和通过使用分子梳系统（GenomicVision S.A.,巴黎,法国）和分子梳盖玻片（20mm×20mm,GenomicVision S.A.,巴黎,法国）进行分子梳。使被梳的表面于60℃干燥4小时。

【HSV-1探针的合成及标记】

将相对于Genbank序列NC_001806.1的全部探针的坐标列于表A。探针尺寸在此例中跨1110～9325bp。

HSV-1特异性探针通过自CNRS（Prof.Marc Labetoulle,laboratoire de virology moléculaire et structurale,UMR CNRS2472-INRA1157,Gif-sur-Yvette,France）获得的HSV-1sc16株的SacI或BspEI（分别New England Biolabs Inc.,Beverly,MA,USA编码R0156L和R0156L）酶促消化或通过使用LR Taq DNA聚合酶(Roche,试剂盒代码：11681842001）使用列于表B的引物和使用来自HSV-1sc16的DNA作为模板DNA的远程PCR产生。将SacI和BspEI HSV-1片段分别连接进SacI和XmaI-消化的pNEB193质粒（New EnglandBiolabs Inc.,Beverly,MA,USA,编码N3051S）。将PCR产物使用

TA克隆试剂盒（Invitrogen,法国,编码K455040）连接进

载体。为验证目的，对各探针的两端进行测序。明显的H1（21kb），H2（56kb），H3（45kb），H4（13kb），H5（7.5kb）和H6（6.5kb）探针是列于表A的几种相邻或重叠探针的混合物。为了牵涉H4和H6探针的非规范结构的可视化，明显的H2探针分裂为2个探针H2A（31kb）和H2B（25kb）。

通过使用常规随机引发流程进行探针的标记。对于生物素-11-dCTP标记，根据生产商的使用说明使用

DNA试剂盒（Invitrogen,代码：18094-011,CA,USA），除了允许标记反应进行过夜之外。对于11-地高辛配基-dUTP和Alexa488-7-OBEA-dCTP，将自试剂盒的dNTP混合物用表C中特定的混合物取代。将200ng的各质粒在独立反应中标记。为异构体分类，将H1，H3，H5探针用11-地高辛配基-dUTP标记，而将H2，H4和H6探针用生物素-11-dCTP标记。为牵涉H4和H6探针的非规范结构的可视化，将H1，H2B和H3探针用生物素-11-dCTP标记，将H2A和H5探针用11-地高辛配基-dUTP标记，和将H4，H6用Alexa488-7-OBEA-dCTP标记。反应产物在琼脂糖凝胶上可视化，以确证DNA的合成。

【在被梳的病毒DNA上HSV-1探针的杂交和检测】

也基本上如之前描述于Schurra和Bensimon，2009（Schurra和Bensimon2009）进行随后步骤，其通过引用合并。简言之，将标记的探针的混合物（250ng的各探针,考虑探针合成及标记的细节见下）与10μg鲱精子DNA和2,5μg人Cot-1DNA(Invitrogen,ref.15279-011,CA,USA）一起乙醇沉淀，重悬浮于20μL的杂交缓冲剂（50%甲酰胺，2×SSC，0.5%SDS，0.5%肌氨酰，10mM NaCl，30%Block-aid（Invitrogen,ref.B-10710,CA,USA））。将探针溶液和探针在杂交仪（Dako,ref.S2451）上于90℃一起热-变性5min，并使杂交在杂交仪上于37℃保持进行过夜。将载玻片在50%甲酰胺，2×SSC中洗涤3次，和在2×SSC溶液中于室温洗涤5min经3次。检测抗体层和在Block-Aid中它们的相应稀释描述于表D和E。对于各层，将20μL的抗体溶液添加到载玻片，并用被梳的盖玻片覆盖，并将载玻片在湿气氛中于37℃温育20min。将载玻片在各层之间及在最后层之后在2×SSC，1%Tween20溶液中于室温洗涤3min经3次。为异构体分类，对于H1，H3和H5探针，使用1:25稀释的德克萨斯红偶联的小鼠抗地高辛配基（Jackson Immunoresearch,法国）抗体，及对于H2，H4和H6探针，使用1:25稀释的Alexa488-偶联的链霉亲和素抗体（Invitrogen,法国）作为第一抗体进行检测。作为第2层，使用1:25稀释的Alexa594-偶联的山羊抗小鼠（Invitrogen,法国）和1:50稀释的生物素化的山羊抗链霉亲和素（Vector Laboratories,UK）。为了扩增H2，H4和H6探针的Alexa488-荧光信号，另外的检测层通过使用相同的1:25稀释的用于第1层的Alexa488偶联的-链霉亲和素实现。为了牵涉H4和H6探针的非-规范结构的可视化，对于H2A和H5探针，使用1:25稀释的AMCA-偶联的小鼠抗-地高辛配基（JacksonImmunoresearch,法国）抗体，对于H1，H2B和H3，使用1:25稀释的Alexa594-偶联的链霉亲和素抗体（Invitrogen,法国），和1:25稀释的兔抗Alexa488作为第一抗体进行检测。作为第2层，使用1:25稀释的Alexa594-偶联的山羊抗小鼠（Invitrogen,法国），1:50稀释的生物素化的山羊抗-链霉亲和素（Vector Laboratories,UK）和1:25稀释的Alexa488-偶联的山羊抗-小鼠。为了扩增H1，H2B和H3探针的Alexa594-荧光信号和H2A和H5探针的AMCA/Alexa350信号，另外的检测层通过分别使用相同的1:25稀释的用于第1层的Alexa594偶联的-链霉亲和素和1:25稀释的Alexa350偶联的山羊抗大鼠实现。在最后洗涤步骤之后，全部玻璃盖玻片在乙醇中脱水和空气干燥。

【HSV-1检测的信号的分析】

为直接可视化被梳的HSV-1纤维，盖玻片用20μL的Prolong(Invitrogen，法国ref P36930)-YOYO-1碘化物（Molecular Probes,编码Y3601）混合物（1/1000v/v）封固及用装备40×物镜的倒置的自动化的落射荧光显微镜（ImageXpress Micro,Molecular Devices,USA）扫描。测量YOYO-1-染色的DNA纤维的长度及使用2kb/μm的延伸因素，用内部软件GVlab04.2.1（Genomic Vision S.A.,巴黎,法国）转变为kb（Schurra和Bensimon2009）。

为异构体分类，不用任何封固培养基使用装备40×物镜的倒置的自动化的落射荧光显微镜（ImageXpress Micro,Molecular Devices,USA）扫描来自病毒粒子或角膜制备物的杂交的-被梳的DNA，和信号可由内部软件（Gvlab0.4.2）视觉或自动检测。考虑由对于H1，H3，H5的德克萨斯红/Alexa594-荧光和对于H2，H4和H6的Alexa488-荧光的连续信号组成的FISH信号，及由对应于以下描述的模式之一的连续信号组成的信号：

（a）最小28kb长的德克萨斯红/Alexa594-荧光信号，之后直接是对应于H4的Alexa488-荧光信号和最小3kb长度的另一德克萨斯红/Alexa594-荧光信号。

（b）最小28kb长的德克萨斯红/Alexa594-荧光信号，之后直接是对应于H6的Alexa488-荧光信号和最小3kb长度的另一德克萨斯红/Alexa594-荧光信号。

（c）最小3kb Alexa488荧光信号，之后直接是对应于H1的德克萨斯红/Alexa594荧光信号，紧邻对应于H4的Alexa488-荧光信号和最小3kb长度的另一德克萨斯红/Alexa594-荧光信号。

（d）最小3kb Alexa488-荧光信号，之后直接是对应于H1的德克萨斯红/Alexa594-荧光信号，紧邻对应于H6的Alexa488-荧光信号和最小3kb长度的另一德克萨斯红/Alexa594-荧光信号。

选择的FISH信号然后依赖于分析的连续FISH信号的模式分类：

由H1/H2/H3/H4/H5/H6探针组成的探针阵列或模式（a）分类为原型（P）形式的HSV-1（Hayward,Jacob et al.1975）。

模式H1/H2/H3/H6/H5/H4或模式（b）分类为反向短（IS）基因组区形式的HSV-1（Hayward,Jacob et al.1975）。

模式H3/H2/H1/H4/H5/H6或模式（c）分类为HSV-1的回文长（IL）基因组区（Hayward,Jacob et al.1975）。

模式H3/H2/H1/H6/H5/H4或模式（d）分类为回文长和短（ILS）基因组区形式的HSV-1（Hayward,Jacob et al.1975）。

由χ方检验测试观察的分布显著不同于预期的分布的假说（对于4种异构体相当数的事件，（Bataille和Epstein1997）），及当观察的p-值在0.05以下时接受。

为了牵涉H4和H6探针的非规范结构的可视化，将自感染的细胞制备物的杂交的-被梳的DNA不用任何封固培养基，使用装备40×物镜的倒置的自动化的落射荧光显微镜（ImageXpress Micro,MolecularDevices,USA）扫描，并信号可在内部软件（Gvlab0.4.2）上视觉检测。选择由对于H4和H6的Alexa488-荧光的连续信号组成的全部信号。将对应于以下模式之一的信号分类为规范结构：

（e）由最小3kb的Alexa594-荧光信号组成的连续信号，之后是对应于H4探针的13kb的Alexa488-荧光信号，对应于H5探针的7.5kb的AMCA/Alexa350-荧光信号和对应于H6探针的7kb的Alexa488-荧光。

（f）由最小3kb的Alexa594-荧光信号组成的连续信号，之后是对应于H6探针的7kb的Alexa488-荧光信号，对应于H5探针的7.5kb的AMCA/Alexa350-荧光信号和对应于H4探针的13kb的Alexa488-荧光。

全部其他信号分类为非规范结构。比较规范和非规范结构的比例。

【自病毒粒子的HSV-1DNA的提取】

在样品制备期间，在随机位置剪切许多DNA分子，由于不受控的操作力导致制备的DNA尺寸的高变异性。已显示，高分子量DNA可由分子梳使用玻璃盖玻片延伸，当其在熔化的琼脂糖插塞中脱蛋白化时（Lebofsky和Bensimon2003）。由此，分析的DNA分子是可变的长度，平均约300kb，最长分子达到几Mbp。

由于HSV-1DNA从未用于分子梳，发明人首先评价了由2种不同方法：标准苯酚:氯仿提取和由（Lebofsky,Heilig et al.2006）描述的已如描述于“实施例”部分稍微修饰的方法提取的关于长度的DNA纤维的质量。

如显示于图2，无尺寸80μm以上的纤维检测到。此与HSV-1基因组的最大预期的尺寸（152kb）一致，其考虑2kb的恒定延伸因子。用两种方法，我们不检测仅152kb长DNA纤维，因为由于不可避免的机械操作仍有随机DNA剪切，及因为相比全长标准HSV-1病毒基因组更短的DNA分子可变得壳化进核壳体（Vlazny,Kwong et al.1982）。

但是，当已用标准苯酚:氯仿方法进行提取时，DNA纤维的中位尺寸是36kb，1.2%的纤维相比140kb更长。相反，当已实现使用我们的替代性的流程的自琼脂糖插塞-嵌入的病毒粒子的DNA提取时，HSV-1DNA纤维的中位尺寸是84kb，2.5%的纤维相比140kb更长。尽管长分子的比例低，有许多长的被梳的DNA分子可用于分析，由于在玻璃盖玻片上有几万个被梳的纤维。

这些结果指示，相比允许由分子梳分析的标准方法，由发明人开发的替代性的方法改善了自病毒粒子提取的被梳的DNA的质量。

【病毒粒子中HSV-1基因组的结构和其分布】

发明人应用分子梳以均匀延伸自病毒粒子及感染的细胞提取的HSV-1DNA，及使得到的被梳的HSV-1DNA与标记的相邻及重叠HSV-1-特异性DNA探针杂交（图1;H1,H3,H5：红德克萨斯红/Alexa594-荧光;H2,H4,H6：绿Alexa488-荧光），以测定HSV-1基因组的结构（图3A）。免疫荧光显微镜检（图3B）呈现了对于自COS7，Vero和Neuro2A细胞系产生的HSV-1KOS株病毒粒子的各产率的405多色线性模式，其满足评估标准（见“实施例”部分）。信号分级显示，HSV-1KOS株异构体的分布在自COS7细胞的病毒粒子中相当地分布，然而P和IS异构体在自Neuro2A和Vero细胞系产生的病毒粒子中是更频繁的异构体。

对杂交的被梳的HSV-1感染的细胞，在不同细胞系（BSR,COS7,Neuro2A和Vero）中产生的Sc16和KOS HSV-1株之间比较4种异构体的分布。分类对应于各产生及满足评估标准的405多色线性模式（见“实验过程”部分）。4种异构体之间的分布在HSV-1Sc16的全部产生中统计学地相当（χ2检验）（在BSR,Vero,Neuro2a和COS-7细胞中）。以相同的方式，发现分布对于COS-7细胞中产生的HSV-1株KOS相当。醒目地，首次，发明人发现了IS和P异构体是自Vero和Neuro2A细胞的主要形式的HSV-1DNA株KOS制备物，而IL异构体是较少存在的异构体。

发明人发现了本文所述的分子梳技术是在单个分子水平分析HSV-1基因组DNA的结构及定量生物学样品中其分布的有力的方法。

【自小鼠和兔角膜的基因组DNA的提取】

分子梳已用自分离的细胞包括培养的细胞（即,建立的细胞株,永生化的原代细胞）或生物学流体（即,外周血淋巴细胞,羊膜细胞）的DNA溶液成功地进行（Gad,Klinger et al.2002;C aburet,Conti etal.2005）。但是，人角膜是具有由以下5层组成的复合结构的固体组织：角膜上皮，富含胶原的Bowman氏膜，由沿着稀疏地分布的互连的角膜细胞规则-排列的胶原纤维组成的角膜间质，无细胞性Descemet氏膜及，角膜内皮。为了自角膜提取基因组DNA，发明人开发了在用标准过程进行之前分离角膜细胞的特定方法。测试包括角膜的机械分裂和酶促消化的不同方法。后者得出最佳结果，及通过使用不同浓度的不同类型的蛋白酶（即,胰蛋白酶,胶原酶A,分散酶）优化。图4A和B显示用0.3mg/ml胶原酶A和0.8mg/ml分散酶消化16h的小鼠和兔角膜获得的结果的一例。至于用于分子梳的标准提取，在随机位置断裂基因组DNA。由此，对于两种类型的角膜，分析的基因组DNA分子是可变的长度，具有平均约200kb，最长分子在1Mb（Mb）以上。自角膜提取的DNA纤维尺寸稍微小于可从分离的细胞得到的典型尺寸（平均约300kb，最长分子达到几Mbp）。

【小鼠角膜中HSV-1感染的检测】

发明人因此对自HSV-1感染的小鼠角膜提取的DNA适用及应用了分子梳，及与上述HSV-1特异性探针杂交。如显示于图5，此致使检测小鼠感染的角膜中HSV-1基因组的全部类型的异构体。

除了检测成熟HSV-1基因组之外，本发明的分子梳过程允许检测多连体（图6），指示病毒在分析的样品的角膜中活跃地复制。

【感染的细胞和小鼠角膜中非-规范形式的检测】

发明人检测了HSV-1基因组的非-规范结构（图7A），其很可能在感染的小鼠角膜提取物及在感染的细胞提取物中病毒复制期间由重组出现。

标记的相邻及重叠HSV-1特异性探针在被梳的自HSV-1株Sc16感染的Vero细胞的DNA提取物上杂交（图7B;H1,H2A,H3：红Alexa594-荧光以灰色呈现;H2B,H5：蓝AMCA/Alexa350-荧光以白色呈现;H4,H6：绿Alexa488-荧光以黑色呈现），以评价H4/H6区中非-规范结构的比例。分类总367多色线性模式，20%（73）发现具有非-规范H4/H6结构。

分子梳致使非规范结构的可视化，及由它们的可能的条码的无限的组合，是分析它们的有力的方法。

表A

表B：

用于由远程PCR合成探针的引物序列。将自HSV-1株Sc16的DNA的提取物用作模板。

表C:

取代随机引发试剂盒的dNTP混合物使用的混合物，其用于用dig-dUTP和Alexa488-7-OBEA-dCTP标记。指示的浓度是标记反应中的终浓度。取代提供的dNTP混合物一起添加非-标记的dNTP和标记的dNTP，其旨在用生物素-11-dCTP-标记。

表D：

用于检测探针的抗体和其他半抗原-结合分子列表。

表E:

用于由荧光检测探针的2或3层的组成。对各检测剂的稀释以括弧指示。缩写参考表D。

【实施例2：人免疫缺陷病毒检测】

【自ACH-2细胞培养的嵌入的DNA插塞的制备】

根据作者的使用说明培养ACH-2细胞系（Clouse,Powell et al.1989）。如描述于（Schurra和Bensimon2009）提取DNA。简言之，细胞以10⁷细胞/mL的浓度重悬浮于1×PBS，以1:1比与1×PBS中制备的低-熔点琼脂糖（Nusieve GTG,ref.50081,Cambrex）的1.2%w/v溶液于50℃彻底混合。90μL的细胞/琼脂糖混合物投入插塞-形成孔（BioRad,ref.170～3713），且保持于4℃冷却至少30min。琼脂糖插塞于50℃在250μL的0.5M EDTA（pH8），1%肌氨酰，250μg/mL蛋白酶K（Eurobio,code:GEXPRK01,France）溶液中温育过夜，然后在Tris10mM，EDTA1mM溶液中于室温洗涤30min两次。

【DNA的最终提取和分子梳】

处理来自ACH-2细胞的嵌入的DNA的插塞用于如之前描述梳DNA（Schurra和Bensimon2009）。简言之，将插塞于68℃在MES0.5M（pH5.5）溶液中熔解20min，及添加1.5U的β-琼脂糖酶（NewEngland Biolabs,ref.M0392S,MA,USA）及于42℃保持温育达16h。DNA溶液然后投入特氟隆贮器和通过使用分子梳系统（GenomicVision S.A.,巴黎,法国）和分子梳盖玻片（20mm×20mm,GenomicVision S.A.,巴黎,法国）进行分子梳。使被梳的表面于60℃干燥4小时。

【HIV-1探针的合成及标记】

将相对于Genbank序列M19921.1的3种探针的坐标列于表F。在此例中探针尺寸跨2927～3749bp。

HIV特异性探针由远程PCR使用LR Taq DNA聚合酶（Roche,试剂盒代码：11681842001），使用列于表G的引物和自HIV pNL4-3的DNA作为模板DNA而产生。PCR产物使用TA克隆试剂盒（Invitrogen,法国,编码K455040）连接进

载体。为验证目的，对各探针的两端进行测序。

ACH-2细胞中侧接HIV-1的插入位点的2种F粘粒G248P87988G9和G248P86255A8或包括HIV-1原病毒插入位点的一种F粘粒G248P84833H9（Ishida,Hamano et al.2006），根据HumanMar.2006Assembly（NCBI Build36.1），并将HIV-1探针通过使用常规随机引发流程标记。对于生物素-11-dCTP标记，根据生产商的使用说明使用

DNA试剂盒（Invitrogen,代码：18094-011,CA,USA），除了允许标记反应进行过夜之外。对于地高辛配基-11-dUTP，将自试剂盒的dNTP混合物用表C中特定的混合物取代。在独立反应中标记200ng的各质粒/F粘粒。对于整个HIV-1检测，将HIV-1用地高辛配基-11-dUTP标记，而将F粘粒用生物素-11-dCTP标记。反应产物在琼脂糖凝胶上可视化，以确证DNA的合成。

【被梳的病毒DNA上HIV-1探针的杂交和检测】

也基本上如之前描述于Schurra和Bensimon，2009（Schurra和Bensimon2009）进行随后步骤。简言之，将标记的探针（250ng的各探针）的混合物与10μg鲱精子DNA和2,5μg人Cot-1DNA（Invitrogen,ref.15279-011,CA,USA）一起乙醇沉淀，重悬浮于20μL的杂交缓冲剂（50%甲酰胺，2×SSC，0.5%SDS，0.5%肌氨酰，10mM NaCl，30%Block-aid（Invitrogen,ref.B-10710,CA,USA））。将探针溶液和探针在杂交仪（Dako,ref.S2451）上于90℃一起热-变性5min，并使杂交在杂交仪上于37℃保持进行过夜。将载玻片在50%甲酰胺，2×SSC中洗涤3次，和在2×SSC溶液中于室温洗涤5min经3次。检测抗体层和在Block-Aid中它们的相应稀释描述于表D和E。对于各层，将20μL的抗体溶液添加到载玻片，并用被梳的盖玻片覆盖，并将载玻片在湿气氛中于37℃温育20min。将载玻片在各层之间及在最后层之后在2×SSC，1%Tween20溶液中于室温洗涤3min经3次。

对于HIV-1探针，使用1:25稀释的德克萨斯红偶联的小鼠抗-地高辛配基（Jackson Immunoresearch,法国）抗体，及对于F粘粒，使用1:25稀释的Alexa488-偶联的链霉亲和素抗体（Invitrogen,法国）作为第一抗体进行整个HIV-1的检测。作为第2层，使用1:25稀释的Alexa594-偶联的山羊抗小鼠（Invitrogen,法国）和1:50稀释的生物素化的山羊抗链霉亲和素（Vector Laboratories,UK）。为了扩增F粘粒的Alexa488-荧光信号，另外的检测层通过使用相同的用于第1层的1:25稀释的Alexa488偶联的-链霉亲和素实现。在最后之后洗涤步骤，全部玻璃盖玻片在乙醇中脱水和空气干燥。

【HIV-1检测的信号的分析】

将自ACH-2细胞制备物的杂交的-被梳的DNA，不用任何封固培养基，使用装备40×物镜的倒置的自动化的落射荧光显微镜（ImageXpress Micro,Molecular Devices,USA）扫描，且信号可由内部软件(Gvlab0.4.2)视觉或自动检测：

●使用侧接HIV-1的插入位点的2种F粘粒G248P87988G9和G248P86255A8，使用2kb/μm的延伸因子考虑及测量对应于如下模式之一的FISH信号(Schurra和Bensimon2009)：

■FISH信号由对于HIV-1的德克萨斯红/Alexa594-荧光的连续信号组成。测量对应分离的HIV原病毒DNA的整个信号

■FISH信号阵列由对于由2个间隔侧接的HIV-1的德克萨斯红/Alexa594-荧光的信号链，及对应于F粘粒序列的Alexa488-荧光的2个连续信号组成。测量整个德克萨斯红/Alexa594荧光信号和侧接此信号的间隔长度及对应于在7p15整合进第7染色体的HIV-1原病毒DNA（Ishida,Hamano et al.2006）。

■具有2个Alexa488-荧光信号的FISH信号阵列由间隔分离。进行对应于无HIV-1原病毒DNA整合的7p15座位的间隔长度的测量。

●使用F粘粒G248P84833H9包括HIV-1原病毒插入位点，使用2kb/μm的延伸因子考虑及测量对应于如下模式之一的FISH信号(Schurra和Bensimon2009)：

■FISH信号阵列由对于HIV-1的德克萨斯红/Alexa594-荧光的连续信号链组成，其由2个对应于F粘粒序列的Alexa488-荧光信号侧接。测量整个德克萨斯红/Alexa594荧光信号及对应于在7p15整合进第7染色体的HIV-1原病毒DNA（Ishida,Hamano et al.2006）。

■具有一个长Alexa488-荧光信号的FISH信号对应于无HIV-1原病毒DNA整合的7p15座位。

【ACH-2细胞培养物中HIV-1的检测】

发明人应用了分子梳，以在ACH-2细胞系中检测完全HIV-1整合的原病毒（Clouse,Powell et al.1989），其在其基因组中，在7p14.3上的NT5C3（细胞溶质5’-核苷酸酶III）基因中含有独特整合的形式的HIV-1（Ishida,Hamano et al.2006）。侧接插入位点的标记的F粘粒（G248P87988G9和G248P86255A8）相比标记的HIV-1探针，在被梳的ACH-2DNA上同时杂交。从由一种或两种F粘粒侧接的124HIV-1FISH信号的测量得到10.2kb+/-0.8kb的平均尺寸，对应于HIV-1的预期的尺寸（9,7kb）（图8A,HIV探针：红德克萨斯红/Alexa594-荧光,F粘粒：绿Alexa488-荧光）。检测NT5C3基因的正常等位基因，及F粘粒G248P87988G9和G248P86255A8FISH信号之间的间隔长度的测量导致32.8±1.8kb的平均尺寸，轻轻优于31kb的预期的尺寸，根据Human Mar.2006Assembly（NCBI Build36.1）。此结果显示，分子梳由其分辨率，可带来一些有关此座位的进一步信息（图8B）。此外，在此被梳的ACH-2DNA制备物中测量133个分离的HIV-1FISH信号，平均尺寸是10.05kb+/-0.79kb（图8C）。此与之前描述的预期的独特HIV-1插入位点成对比（Ishida,Hamano et al.2006），及提示其存在于ACH-2基因组，在HIV-1的另一或其他插入位点，或非整合的形式的HIV-1持续在ACH-2核中。当包括插入位点的标记的F粘粒（G248P84833H9）相比标记的HIV-1探针在被梳的ACH-2DNA上同时杂交时，进行类似观察（图8D）。从在F粘粒信号之内57HIV-1FISH信号的测量得到10.4kb+/-0.5kb的平均尺寸，对应于HIV-1原病毒的预期的尺寸（9,7kb）（HIV探针：红德克萨斯红/Alexa594-荧光,F粘粒：绿Alexa488-荧光）。此外，也在此被梳的ACH-2DNA制备物中检测及测量35个分离的HIV-1FISH信号，平均尺寸是10.03kb+/-0.82kb（未显示的）。

这些结果指示，分子梳是在单个分子水平及在任何生物学样品中分析HIV基因组DNA的结构及定量其在基因组DNA中整合的有力的方法。

表F：

名称	起始	结束	尺寸(bp)
				HIV-S1	1	3026	3026
HIV-S2	3018	5944	2927
				HIV-S3	5961	9709	3749

此例中使用的3种探针的坐标，相对于Genbank序列M19921.1

表G：

引物序列用于由远程PCR合成探针。将自HIV-1pNL-4的DNA提取物用作模板。

【实施例3：由分子梳检测癌基因】

以类似于在实施例1中检测HSV基因组DNA的方式，探针设计为检测病毒癌基因的存在。探针设计为与有活性的目的病毒癌基因80～100%互补，并进行分子梳。结果指示受试者中有活性的癌基因的存在，导致诊断和治疗性干预。

【实施例4：使用分子梳检测感染性病毒DNA的重排】

以类似于在实施例1中检测HSV基因组DNA的方式，探针设计为检测不同排列的感染性病毒DNA的存在。用被不同着色的荧光探针识别的不同半抗原标记的不同探针组设计为与有活性的目的病毒癌基因80～100%互补，和进行分子梳。受试者的细胞、组织或生物学流体中病毒基因的排列的变异用于诊断或预后与病毒基因组的重排关联的病毒疾病或疾病的进展的风险，诸如由原-癌基因向癌基因的转变的致瘤性质的风险或诱导。

【实施例5：由分子梳监测遗传治疗】

以类似于在实施例2中检测原病毒形式的HIV-1的方式，探针尤其设计为与整合的治疗性腺病毒载体或其携带的转基因序列80～100%互补。通过使用特别设计的探针进行分子梳，以检测整合进宿主染色体的转基因物质的存在，和是否其以可活跃地表达转基因的形式排列。纵向地跟踪受试者中转基因的量，和确定何时和是否再施用治疗性腺病毒载体。

【参考文献】

【专利文献】

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