CN114591889A - 一种hek293t细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用，为避免慢病毒生产细胞培养过程中使用成分不明的培养基组分和动物来源的生产物料，本悬浮驯化方法流程简便，驯化时间短，成本较低；采用无血清培养基成分明确，安全风险可控，减少了工艺杂质，质量控制相对简单；生产工艺易于放大，对人力耗费较低；经扩大培养驯化所得悬浮细胞建立悬浮细胞原始细胞库(PCB)、主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)，使用该悬浮系统工作细胞库(WCB)应用于慢病毒制备与生产，慢病毒粗毒液产量至少可达1‑10*107TU/mL。
Description
技术领域
本发明涉及慢病毒技术领域，特别涉及一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用。
背景技术
慢病毒的生产工艺流程中粗毒液的收获，通常以HEK293T为包装细胞，使用含血清的混合培养基，在培养瓶或细胞工厂中贴壁培养，通过质粒瞬时转染的方式进行病毒包装。该方法技术相对成熟，操作简单易行，为很多实验室采用。然而，使用动物来源的血清，增加了外源病毒因子污染的风险；血清成分复杂，组分不明确，不符合药品生产注册的监管精神；血清引入的牛血清白蛋白，增加了纯化工艺和质量控制的难度；使用贴壁细胞包装慢病毒，工艺难以放大，产量难以提升，成本难以下降，且对劳动力消耗巨大；消化贴壁细胞使用动物来源的胰蛋白酶，可能引入外源病毒因子，增加质控难度等等问题。
发明内容
本发明提供了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用，其目的是为了解决现有技术中上述问题。
为了达到上述目的，本发明的实施例提供了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用。
本发明的第一方面涉及了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法，其包含如下步骤：
步骤一：复苏一株HEK293T工作库细胞，用HEK293CD培养基重悬细胞，总体积15-30mL，添加谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，细胞密度1-10*10^4cells/mL，细胞总数为1-10*10^6个；T75或T175细胞培养瓶培养，于37℃，5％CO2培养箱静置20-30h；
步骤二：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，于37℃，5％CO2培养箱静置20-30h；
步骤三：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，添加7.5-15mL HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，于37℃，5％CO2培养箱静置20-30h；
步骤四：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，将细胞转入Y125或Y250摇瓶中，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养48-96h；
步骤五：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管收集细胞悬液离心弃上清添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，共20-40ml，使细胞成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-72h；
步骤六：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，转移细胞悬液至Y250ml或Y500培养瓶中，添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，共100-300ml，使细胞成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤七：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率：此时细胞应大部分成单个细胞，仅有少部分细胞小团，细胞密度应在1-3*10^6cells/mL，活率应在95％以上；收集细胞悬液分成两份：第一份细胞用终浓度5-10％DMSO冻存液，冻存初步驯化细胞；第二份细胞用于下一步骤的继续驯化，用HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM稀释至密度至1-10*10^5cells/ml，工作体积20-40mL，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤八：取继续驯化细胞观察并计数，记录细胞密度与活率，并用HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM稀释至密度至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤九：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，继续培养24-48h；
步骤十：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1:2混合SMM293TII培养基、OPM-293CD05、HEK293CD培养基配制驯化培养基，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤十一：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，继续培养24-72h；
步骤十二：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1混合SMM293TII培养基、OPM-293CD05配制驯化培养基并加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤十三：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1混合SMM293TII培养基、OPM-293CD05配制驯化培养基并加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤十四：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，用OPM-293CD05培养基加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤十五：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，此时细胞应无结团现象，细胞活率应在95％以上；用OPM-293CD05培养基加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤十六：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，此时细胞应无结团现象，细胞活率应在95％以上；收集细胞悬液离心弃去上清，按生产规模所需细胞密度，终浓度5-10％DMSO冻存液，冻存成功驯化细胞。此时为悬浮细胞原始细胞库(PCB)。
依据2020版《中国药典》及《药品生产质量管理规范(2010版)》的相关要求，复苏悬浮细胞原始细胞库(PCB)并扩大培养，建立符合生产规模需求的主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)。
本发明还提供了一种采用该悬浮系统工作细胞库(WCB)细胞进行慢病毒生产的应用，其包含如下步骤：
步骤一：复苏HEK293TS工作库细胞，使用OPM-293CD05培养基加入谷氨酰胺终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、120-200rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤二：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，保持培养直至生产工艺所需细胞总量，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养；
步骤三：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，使用OPM-293 CD05培养基加入谷氨酰胺终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、120-200rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h，或接种至细胞反应器；
步骤四：质粒转染。观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，此时细胞密度应在0.5-10*10^6cells/ml，细胞活率应在95％以上；采用四质粒包装系统及PEI转染试剂共孵育形成pDNA/PEI复合物，按生产工艺规模进行相应细胞数量的质粒转染；于37℃、120-200rpm、5％CO2震荡培养箱或细胞反应器培养48-72h；
步骤五：细胞补料；观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率；采用5-20％OPM-CHO PFF06补料培养基加入终度为1-10mM丁酸钠，进行细胞补料；
步骤六：粗毒液收获；
步骤七：下游层析纯化。
本发明还提供了一种采用该悬浮系统工作细胞库(YT293TS-WCB)细胞，在慢病毒生产中的应用。
本发明的上述方案有如下的有益效果：
(1)避免慢病毒生产细胞培养过程中使用成分不明的培养基组分和动物来源的生产物料；
(2)本悬浮驯化方法流程简便，驯化时间短，成本较低；采用无血清培养基成分明确，安全风险可控，减少了工艺杂质，质量控制相对简单，生产工艺易于放大，对人力耗费较低；
(3)经扩大培养驯化所得悬浮细胞建立悬浮细胞原始细胞库(PCB)、主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)，使用该悬浮系统工作细胞库(WCB)应用于慢病毒制备与生产，慢病毒粗毒液产量至少可达1-10*107TU/mL。
附图说明
图1是本发明的HEK293T细胞图片；
图2是本发明的驯化成功的YT293TS悬浮细胞；
图3是本发明的实例工作细胞库(YT293TS-WCB)细胞生长曲线图；
图4是本发明的实例工作细胞库(YT293TS-WCB)细胞传代活率图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
主要实验试剂
HEK293T细胞：ATCC，编号CRL-3216。
OPM-293 CD05 Medium：上海奥浦迈，货号81075-001。
OPM-CHO PFF06：上海奥浦迈，货号1265F05-001。
SMM293-TII Medium：义翘神州，货号M293-TII。
HEK293 CD Medium：中山康天晟合，货号A21001。
DMSO：Sigma，货号D2650-100mL。
PEI：Polysciences Inc，货号23966-1g。
丁酸钠：Sigma，货号303410-5G。
四质粒包装系统：湖南远泰生物技术有限公司
专有细胞名称命名
将悬浮细胞原始细胞库(PCB)，命名为远泰自主驯化293悬浮细胞原始细胞库，细胞代号(YT293TS-PCB)。
将悬浮细胞主细胞库(MCB)，命名为远泰自主驯化293悬浮细胞主细胞库，细胞代号(YT293TS-MCB)。
将悬浮细胞工作细胞库(WCB)，命名为远泰自主驯化293悬浮细胞工作细胞库，细胞代号(YT293TS-WCB)。
实施例1
一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法
包含如下步骤：
步骤一：复苏一株HEK293T工作库细胞，用HEK293CD培养基重悬细胞，总体积15-30mL，添加谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，细胞密度1-10*10^4cells/mL，细胞总数为1-10*10^6个；T75或T175细胞培养瓶培养，于37℃，5％CO2培养箱静置20-30h；
步骤二：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，于37℃，5％CO2培养箱静置20-30h；
步骤三：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，添加7.5-15mL HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，于37℃，5％CO2培养箱静置20-30h；
步骤四：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，将细胞转入Y125或Y250摇瓶中，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养48-96h；
步骤五：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管收集细胞悬液离心弃上清添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，共20-40ml，使细胞成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-72h；
步骤六：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，转移细胞悬液至Y250ml或Y500培养瓶中，添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，共100-300ml，使细胞成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤七：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率：此时细胞应大部分成单个细胞，仅有少部分细胞小团，细胞密度应在1-3*10^6cells/mL，活率应在95％以上；收集细胞悬液分成两份：第一份细胞用终浓度5-10％DMSO冻存液，冻存初步驯化细胞；第二份细胞用于下一步骤的继续驯化，用HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM稀释至密度至1-10*10^5cells/ml，工作体积20-40mL，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤八：取继续驯化细胞观察并计数，记录细胞密度与活率，并用HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM稀释至密度至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤九：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，继续培养24-48h；
步骤十：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1:2混合SMM293TII培养基、OPM-293CD05、HEK293CD培养基配制驯化培养基，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤十一：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，继续培养24-72h；
步骤十二：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1混合SMM293TII培养基、OPM-293CD05配制驯化培养基并加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤十三：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1混合SMM293TII培养基、OPM-293CD05配制驯化培养基并加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤十四：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，用OPM-293CD05培养基加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤十五：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，此时细胞应无结团现象，细胞活率应在95％以上；用OPM-293CD05培养基加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤十六：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，此时细胞应无结团现象，细胞活率应在95％以上；收集细胞悬液离心弃去上清，按生产规模所需细胞密度，终浓度5-10％DMSO冻存液，冻存成功驯化细胞。此时为悬浮细胞原始细胞库(PCB)。
依据2020版《中国药典》及《药品生产质量管理规范(2010版)》的相关要求，复苏悬浮细胞原始细胞库(PCB)并扩大培养，建立符合生产规模需求的主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)。
实施例2
一种采用该悬浮系统工作细胞库(WCB)细胞进行慢病毒生产的方法包含如下步骤：
步骤一：复苏HEK293TS工作库细胞，使用OPM-293CD05培养基加入谷氨酰胺终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、120-200rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
步骤二：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，保持培养直至生产工艺所需细胞总量，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养；
步骤三：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，使用OPM-293CD05培养基加入谷氨酰胺终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、120-200rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h，或接种至细胞反应器；
步骤四：质粒转染。观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，此时细胞密度应在0.5-10*10^6cells/ml，细胞活率应在95％以上；采用四质粒包装系统及PEI转染试剂共孵育形成pDNA/PEI复合物，按生产工艺规模进行相应细胞数量的质粒转染；于37℃、120-200rpm、5％CO2震荡培养箱或细胞反应器培养48-72h；
步骤五：细胞补料；观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率；采用5-20％OPM-CHO PFF06补料培养基加入终度为1-10mM丁酸钠，进行细胞补料；
步骤六：粗毒液收获；
步骤七：下游层析纯化。
实施例3
一种采用该悬浮系统工作细胞库(YT293TS-WCB)细胞，在慢病毒生产中的应用。
实例工作库(YT293TS-WCB)细胞扩增培养不同代次的病毒生产样本，粗毒液物理滴度及转导滴度测试结果。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：复苏一株HEK293T工作库细胞，用HEK293CD培养基重悬细胞，总体积15-30mL，添加谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，细胞密度1-10*10^4cells/mL，细胞总数为1-10*10^6个；T75或T175细胞培养瓶培养，于37℃，5％CO2培养箱静置20-30h；
S2：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，于37℃，5％CO2培养箱静置20-30h；
S3：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，添加7.5-15mL HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，于37℃，5％CO2培养箱静置20-30h；
S4：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，将细胞转入Y125或Y250摇瓶中，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养48-96h；
S5：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管收集细胞悬液离心弃上清添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，共20-40ml，使细胞成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-72h；
S6：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，转移细胞悬液至Y250ml或Y500培养瓶中，添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，共100-300ml，使细胞成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
S7：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率：此时细胞应大部分成单个细胞，仅有少部分细胞小团，细胞密度应在1-3*10^6cells/mL，活率应在95％以上；收集细胞悬液分成两份：第一份细胞用终浓度5-10％DMSO冻存液，冻存初步驯化细胞；第二份细胞用于下一步骤的继续驯化，用HEK293 CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM稀释至密度至1-10*10^5cells/ml，工作体积20-40mL，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
S8：取继续驯化细胞观察并计数，记录细胞密度与活率，并用HEK293 CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM稀释至密度至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
S9：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，继续培养24-48h；
S10：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1:2混合SMM293TII培养基、OPM-293CD05、HEK293CD培养基配制驯化培养基，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
S11：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，继续培养24-72h；
S12：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1混合SMM293TII培养基、OPM-293CD05配制驯化培养基并加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
S13：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1混合SMM293TII培养基、OPM-293CD05配制驯化培养基并加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
S14：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，用OPM-293CD05培养基加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
S15：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，此时细胞应无结团现象，细胞活率应在95％以上；用OPM-293CD05培养基加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
S16：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，此时细胞应无结团现象，细胞活率应在95％以上；收集细胞悬液离心弃去上清，按生产规模所需细胞密度，终浓度5-10％DMSO冻存液，冻存成功驯化细胞，此时为悬浮细胞原始细胞库(PCB)。
2.一种采用悬浮系统工作细胞库(WCB)细胞进行慢病毒生产的方法，其特征在于，包含如下步骤：
S1:复苏HEK293TS工作库细胞使用OPM-293CD05培养基加入谷氨酰胺终浓度为2-6mM，将细胞稀释，于37℃、120-200rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h；
S2:使用OPM-293CD05培养基加入谷氨酰胺终浓度为2-6mM，将细胞稀释，于37℃、120-200rpm、5％CO2震荡培养箱培养24-48h，或接种至细胞反应器；
S3:采用四质粒包装系统及PEI转染试剂共孵育形成pDNA/PEI复合物，进行相应细胞数量的质粒转染，于37℃、120-200rpm、5％CO2震荡培养箱或细胞反应器培养48-72h；
S4:采用5-20％OPM-CHO PFF06补料培养基加入终度为1-10mM丁酸钠，进行细胞补料；
S5:粗毒液收获；
S6:下游层析纯化。
3.一种采用该悬浮系统工作细胞库(YT293TS-WCB)细胞，在慢病毒生产中的应用。
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