CN113265425A - 基于悬浮细胞的car-cd19慢病毒制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于悬浮细胞的CAR‑CD19慢病毒制备工艺，其包括以下步骤：S1复苏HEK293细胞，在国产培养基中进行适应性驯化培养；S2驯化培养良好的HEK293细胞建立细胞库；S3将HEK293细胞扩增至所需的密度；S4在四质粒系统中，对HEK293细胞进行转染；S5将CAR‑CD19慢病毒质粒转染48 h后，收获细胞培养上清，即可获得细胞活率达90%以上、滴度5×106 TU/mL以上的慢病毒收获液。本发明的CAR‑CD19慢病毒制备工艺，培养的慢病毒细胞其活率达90%以上，所获上清的慢病毒滴度达5×106 TU/mL以上，能大大降低细胞死亡释放出的杂质，从而为下游纯化减轻压力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺。
背景技术
慢病毒常用于嵌合抗原受体-T细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)，其具有转导效率高、可整合T细胞基因组并持续表达目标蛋白等优势。现如今，CAR-T生产大多基于慢病毒载体介导的CAR基因转移。当前，用于生产慢病毒的工艺大多基于依赖胎牛血清(FBS)的贴壁细胞工艺（如HEK293T），其具有慢病毒表达滴度高、硬件投入少等优点。然而，其依赖胎牛血清(FBS)，这与当前的法规不相适宜，因此必须对FBS的生产商进行严格审计，此外还需对去除进行评估和检测。其次，胎牛血清(FBS)批次及产地差异也可能导致所表达的慢病毒存在批间差异。另一个关键问题是，目前使用贴壁细胞工艺多数为细胞工厂，因此较难进行放大生产。目前，基于细胞工厂的慢病毒生产通常为10层细胞工厂（CF-10）或40层细胞工厂（CF-40），一般10~20个，这对于操作和人力提出了较大挑战。使用贴壁细胞生产慢病毒的细胞系通常为HEK293T（病毒滴度高），由于其携带猴空泡病毒40大T抗原（SV40-T），因此还需对产品进行相关残留检测。
悬浮细胞可以在不依赖于胎牛血清(FBS)的化学成分明确的培养基(CD media)中高密度生长，利用细胞培养摇瓶可很方便放大至生物反应器中（如2 L、15 L、50L、200 L、2000L）进行生产，因此易于放大生产。此外，不带有猴空泡病毒40大T抗原（SV40-T）的HEK293细胞可不进行SV40-T残留检测，不仅可节省样品放行的时间，也可以节省相关费用。
目前，基于Thermo公司的LV-MAX慢病毒表达系统虽然可以达到高滴度的慢病毒，但其培养基和转染试剂昂贵，操作过程复杂，细胞收获时活率也较低(70%)从而导致细胞释放出大量杂质而对下游纯化造成较大压力。
发明内容
本发明的目的不仅解决了贴壁细胞具有依赖FBS和难以放大生产的缺点，也避免了慢病毒商业化表达系统成本高昂、操作复杂等缺点，提供一种能够解决前述问题的基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺，其特点是：其包括以下步骤：
S1复苏HEK293细胞，在国产培养基中进行适应性驯化培养；
S2驯化培养良好的HEK293细胞建立细胞库；
S3将HEK293细胞扩增至所需的密度；
S4在四质粒系统中，对HEK293细胞进行转染；
S5将CAR-CD19慢病毒质粒转染48 h后，收获细胞培养上清，即可获得细胞活率达90%以上、滴度5×106 TU/mL以上的慢病毒收获液。
上述的国产培养基可以选用上海澳普迈生物科技股份有限公司的OPM-CDTrans293培养基或者是上海多宁生物科技有限公司的Transpro CD01或Transpro CD02培养基。
作为上述基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺的改进，所述的HEK293细胞为Thermo公司的HEK293细胞。
作为上述基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺的改进，所述的细胞库为60支以上的细胞库。
作为上述基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺的改进，步骤S3中，HEK293细胞扩增至密度4×106/mL以上。
作为上述基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺的改进，步骤S4中，使用PEIpro进行转染，PEIpro:DNA按2：1进行转染。
本发明的基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺具有以下优点：1）本发明的基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺，避免了贴壁细胞依赖于胎牛血清(FBS)的缺点，培养的慢病毒细胞其活率达90%以上，所获上清的慢病毒滴度达5×106 TU/mL以上；2）本发明的基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺，易于放大，可通过生物反应器进行生产，既解决了慢病毒大规模生产的问题，也降低了生产成本和劳动力；3）本发明的基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺，可采用国产培养基进行细胞扩增，极大的节约成本；4）本发明的基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺，转染试剂采用PEIpro(法国Polyplus公司)法进行转染，且转染后无需补料；极大的节约了成本；5）本发明的基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺，48h后收上清其细胞活率达90%以上，大大降低细胞死亡释放出的杂质，从而为下游纯化减轻压力。
附图说明
图1为使用125 mL摇瓶、2L玻璃反应器(STR)和2L波浪反应器(WAVE)病毒收获时活细胞密度和细胞活率的数据图标，图中，VCD曲线为活细胞密度数据曲线，Viability曲线为细胞活率的数据曲线。
图2为使用125 mL摇瓶、2L玻璃反应器(STR)和2L波浪反应器(WAVE)病毒收获时物理滴度(P24,LP/mL)和感染滴度(QPCR,TU/mL)，图中，P24曲线代表物理滴度的数据曲线，QPCR柱形图代表感染滴度的柱形数据。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺，其包括以下步骤：
S1复苏Thermo公司的HEK293细胞，在国产培养基中进行适应性驯化培养；
S2驯化培养良好的HEK293细胞建立细胞库，细胞库为60支以上的细胞库；
S3将HEK293细胞扩增至密度4×106/mL以上；
S4在四质粒系统中，对HEK293细胞进行转染，转染时使用PEIpro进行转染，PEIpro:DNA按2：1进行转染；
S5将CAR-CD19慢病毒质粒转染48 h后，收获细胞培养上清，即可获得细胞活率达90%以上、滴度5×106 TU/mL以上的慢病毒收获液。
应用例
如图1所示，采用125 mL摇瓶、2L玻璃反应器(STR)和2L波浪反应器(WAVE)作为CAR-CD19慢病毒制备容器，按照上述的CAR-CD19慢病毒制备工艺，在病毒收获时，活细胞密度为6×106/mL以上，细胞活率都在90%以上。
如图2所示，采用125 mL摇瓶、2L玻璃反应器(STR)和2L波浪反应器(WAVE)作为CAR-CD19慢病毒制备容器，按照上述的CAR-CD19慢病毒制备工艺，在病毒收获时，病毒包装的物理滴度(P24,LP/mL)在2×109 LP/mL以上，感染滴度(QPCR,TU/mL) 在5×106 TU/mL以上。
通过应用例可以看出，采用本发明的CAR-CD19慢病毒制备工艺，能采用国产培养基进行驯化培养，能使CAR-CD19慢病毒的制备成本大幅度降低，操作简化，得到的收获液中，病毒包装的物理滴度和感染滴度高，感染滴度在5×106 TU/mL以上，细胞活率能提高到90%以上，与现有的70%的细胞活率相比，活细胞密度和细胞活率都显著提高，能大大降低细胞死亡释放出的杂质，从而为下游纯化减轻压力。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺，其特征在于：其包括以下步骤：
S1复苏HEK293细胞，在国产培养基中进行适应性驯化培养；
S2驯化培养良好的HEK293细胞建立细胞库；
S3将HEK293细胞扩增至所需的密度；
S4在四质粒系统中，对HEK293细胞进行转染；
S5将CAR-CD19慢病毒质粒转染48 h后，收获细胞培养上清，即可获得细胞活率达90%以上、滴度5×106 TU/mL以上的慢病毒收获液。
2.根据权利要求1所述的基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺，其特征在于：所述的HEK293细胞为Thermo公司的HEK293细胞。
3.根据权利要求1所述的基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺，其特征在于：所述的细胞库为60支以上的细胞库。
4.根据权利要求1所述的基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺，其特征在于：步骤S3中，HEK293细胞扩增至密度4×106/mL以上。
5.根据权利要求1所述的基于悬浮细胞的CAR-CD19慢病毒制备工艺，其特征在于：步骤S4中，使用PEIpro进行转染，PEIpro:DNA按2：1进行转染。
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