CN110628873A - 一种去除预处理污泥胞外核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种去除预处理污泥胞外核酸的方法，其特征在于，包括：对预处理污泥的样本采用Proteinase K和DNAse I两种酶进行酶处理，通过本方法可以将大部分的胞外核酸去除，处理技术简单，易操作，减少胞外核酸对测序结果的干扰，获得更加精确的预处理污泥微生物群落结构。
Description
技术领域
本发明涉及污泥处理技术领域，尤其涉及一种去除预处理污泥胞外核酸的方法。
背景技术
现阶段已经开发了大量的污泥预处理技术来破坏EPS基质和细胞壁，从而增强污泥的崩解和溶解，这些方法主要包括机械、热、化学和生物预处理或这些技术的组合。同时细胞结构被破坏的微生物的核酸也随之释放。现有的常规DNA提取方案无法区分细胞外DNA和细胞内DNA。此外，胞外核酸的持久性和完整性在研究中得到了证实。如果将预处理后的污泥直接用于DNA提取，高通量测序结果会存在对微生物组成和多样性估计的偏差。进料的精确微生物群落结构将为厌氧消化过程中微生物群的变化提供新的见解。因此，需要一种有效的方法来最小化预处理污泥的胞外核酸。虽然叠氮溴化丙锭 (Propidium Monoazide,PMA)经常被用于检测污泥中的活微生物，但对高温处理的样本和高浊度样本存在显著差异性并且缺乏效率。
因此，需要提供一种对于高温和高度混浊的污泥样本提高探测微生物群落的精度的方法。
发明内容
本发明提供了一种去除预处理污泥胞外核酸的方法，以解决现有技术中存在的缺陷。
为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案。
本发明提供了一种去除预处理污泥胞外核酸的方法，包括：
对预处理污泥的样本采用Proteinase K和DNAse I两种酶进行酶处理。
优选地，对预处理污泥的样本采用Proteinase K和DNAse I两种酶进行处理，包括：
采用浓度≥600mAnson U/ml的Proteinase K对预处理污泥的样本处理120 min，然后采用浓度≥5U/μl的DNAse I对Proteinase K处理后的污泥样本处理 30min。
优选地，Proteinase K的纯度为：与pBR322 DNA 37℃下反应6小时，DNA 的电泳带图像不发生变化；与RNA在37℃下反应2小时，RNA的电泳带图像不发生变化。
优选地，该方法还包括对酶处理之前的预处理污泥的样本进行离心步骤和洗涤步骤直至满足预定条件，对酶处理后的污泥样本进行再洗涤。
优选地，对酶处理之前的预处理污泥的样本进行离心步骤和重复洗涤步骤直至满足预定条件具体包括：
所述的离心步骤包括：取1mL样品，在10,000×g、4℃下离心10min后倒掉上清液，得到离心后的沉淀物；
所述的洗涤步骤包括：将所述沉淀物中加入无菌水，4000rpm下漩涡 2min，然后在14,000×g和4℃下离心15min，离心结束后分离上清液和沉淀，取上清液用0.22μm膜过滤，于nanodrop上测定核酸浓度；
所述的预定条件为：当上清液核酸浓度小于10ng/μL，将沉淀出的物质作为洗涤后的样本。
优选地，对预处理污泥的样本采用Proteinase K和DNAse I两种酶进行酶处理，具体包括：
将洗涤后的样本重悬于1mL pH为7.6的Tris-EDTA中，加入25μL Proteinase K，涡旋30S，将样本在摇床37℃、150rpm下培养120min，在10,000×g、4℃下离心10min，用1mL冷冻无菌水在10,000×g、4℃下离心15min，离心洗涤3 次得到Proteinase K酶处理后的样本；
将所述Proteinase K酶处理后的样本重悬浮于500μL无菌水中，加入10μL DNAseI，混匀，在37℃和150rpm的摇床下混合30min，再加入50μL Proteinase K，在50℃培养15min，然后在70℃培养10min。
优选地，对酶处理后的污泥样本进行再洗涤，包括：根据所述洗涤步骤对对酶处理后的污泥样本进行再洗涤，直至清液核酸浓度小于5ng/μL。
由上述本发明的去除预处理污泥胞外核酸的方法提供的技术方案可以看出，本发明的方法可以将预处理污泥中的大部分胞外核酸去除，流程简单，减少了胞外核酸对测序结果的干扰，获得更加精确的预处理污泥微生物群落结构。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方式，下面描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤和/或，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤和/或操作的组。应该理解，这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的任一单元和全部组合。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
为便于对本发明实施例的理解，下面以具体实施例为例做进一步的解释说明。
实施例
本实施例提供了一种去除预处理污泥胞外核酸的方法，包括：
预处理污泥的样本进行离心步骤和洗涤步骤直至满足预定条件；
对预处理污泥的样本采用Proteinase K和DNAse I两种酶进行酶处理；
对酶处理后的污泥样本进行再洗涤。
其中，采用浓度≥600mAnson U/ml的Proteinase K对预处理污泥的样本处理120min，然后采用浓度≥5U/μl的DNAse I对Proteinase K处理后的污泥样本处理30min。
Proteinase K的纯度为：与pBR322 DNA 37℃下反应6小时，DNA的电泳带图像不发生变化；与RNA在37℃下反应2小时，RNA的电泳带图像不发生变化。
细菌基因组是具有动态结构特性的拟核，被拟核结合蛋白压缩成多个环。当细菌细胞被预处理破裂时，iDNA连同拟核结合蛋白被释放。使用 Proteinase K和DnaseⅠ来最小化由于预处理导致细胞裂解产生的胞外核酸。具体而言，Proteinase K用于消化胞外核酸周围的拟核结合蛋白，DNAse Ⅰ负责消化胞外核酸。从而消除胞外核酸对检测预处理污泥的微生物群落结构的干扰。
具体的的处理过程如下：
1)离心：取1mL预处理污泥样本于2mL的离心管中，在10,000×g、4℃下离心10min，小心地倒掉上清液，得到离心后的样本。
2)洗涤：将离心后的样本中加入1mL无菌水，漩涡2min，保证沉淀充分重悬；然后在14,000×g、4℃下离心15min，离心结束后小心地分离上清液和沉淀；取上清液用0.22μm膜过滤，并于nanodrop上测定核酸浓度；
不断重复上述洗涤步骤，至上清液核酸浓度小于10ng/μL，得到沉淀物作为洗涤后的样本。
3)酶处理：将洗涤后的样本重悬于1mL的pH为7.6的Tris-EDTA中，加入 25μL的Proteinase K(Takara)，中挡位涡旋30S，将样本在摇床37℃、150rpm 下混合培养120min，消化拟核连接蛋白使胞外DNA裸露；培养结束后，将样本在10,000×g、4℃下离心10min，用1mL冷冻无菌水在10,000×g、4℃下离心15min，重复离心洗涤3次得到沉淀作为ProteinaseK酶处理后的样本；将 Proteinase K酶处理后的样本重悬浮于500μL无菌水中，加入10μL的DNAse I (Takara)，用手上下颠倒离心管，充分混匀，将样品在摇床37℃、150rpm 下30min，以除去胞外核酸，再加入50μL蛋白酶K在50℃培养15min，以去除 DNAse I，然后在70℃培养10min，以灭活蛋白酶K。
4)洗涤：按步骤2)的洗涤步骤对酶处理后的样本进行洗涤，直至上清液核酸浓度小于5ng/μL，可进行后续DNA提取。
本领域技术人员应能理解，上述所举的去除预处理污泥胞外核酸的方法实施例仅为更好地说明本发明实施例的技术方案，而非对本发明实施例作出的限定。任何采用Proteinase K和DNAse I两种酶进行酶处理的方法，均包含在本发明实施例的范围内。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种去除预处理污泥胞外核酸的方法，其特征在于，包括：
对预处理污泥的样本采用Proteinase K和DNAse I两种酶进行酶处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的对预处理污泥的样本采用Proteinase K和DNAse I两种酶进行处理，包括：
采用浓度≥600mAnson U/ml的Proteinase K对预处理污泥的样本处理120min，然后采用浓度≥5U/μl的DNAse I对Proteinase K处理后的污泥样本处理30min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Proteinase K的纯度为：与pBR322DNA 37℃下反应6小时，DNA的电泳带图像不发生变化；与RNA在37℃下反应2小时，RNA的电泳带图像不发生变化。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括对酶处理之前的预处理污泥的样本进行离心步骤和洗涤步骤直至满足预定条件，对酶处理后的污泥样本进行再洗涤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的对酶处理之前的预处理污泥的样本进行离心步骤和重复洗涤步骤直至满足预定条件具体包括：
所述的离心步骤包括：取1mL样品，在10,000×g、4℃下离心10min后倒掉上清液，得到离心后的沉淀物；
所述的洗涤步骤包括：将所述沉淀物中加入无菌水，4000rpm下漩涡2min，然后在14,000×g和4℃下离心15min，离心结束后分离上清液和沉淀，取上清液用0.22μm膜过滤，于nanodrop上测定核酸浓度；
所述的预定条件为：当上清液核酸浓度小于10ng/μL，将沉淀出的物质作为洗涤后的样本。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的对预处理污泥的样本采用Proteinase K和DNAse I两种酶进行酶处理，具体包括：
将洗涤后的样本重悬于1mL pH为7.6的Tris-EDTA中，加入25μL Proteinase K，涡旋30S，将样本在摇床37℃、150rpm下培养120min，在10,000×g、4℃下离心10min，用1mL冷冻无菌水在10,000×g、4℃下离心15min，离心洗涤3次得到Proteinase K酶处理后的样本；
将所述Proteinase K酶处理后的样本重悬浮于500μL无菌水中，加入10μL DNAse I，混匀，在37℃和150rpm的摇床下混合30min，再加入50μL Proteinase K，在50℃培养15min，然后在70℃培养10min。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的对酶处理后的污泥样本进行再洗涤，包括：根据所述洗涤步骤对对酶处理后的污泥样本进行再洗涤，直至清液核酸浓度小于5ng/μL。
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