CN106987554B - 悬浮细胞株及其驯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种悬浮细胞株及其驯化方法。该悬浮细胞株的驯化方法包括如下步骤：将贴壁型细胞在含9.5‑10.5％血清的培养基中复苏后，接种于含4.5％‑5.5％血清的培养基的方瓶中传代培养1‑3次，再将其从方瓶中依次转移接种到血清含量依次为3.0％‑3.6％、1.8‑2.2％及0.8‑1.2％的培养基的摇瓶中进行摇瓶悬浮培养1‑4代后，再转移至无血清培养基的摇瓶中传代培养1‑3次，即得。相对传统驯化方法，本发明的悬浮细胞株驯化方法在降血清含量的同时进行悬浮驯化培养，每个血清梯度对应的细胞传代次数保持在1‑3次即可，整体上控制贴壁型细胞的驯化周期在一个月内完成，显著缩短驯化周期，节省驯化成本。本发明的悬浮细胞株的驯化方法获得的悬浮细胞株的分散性好、活率高、生长速率高。

Description

悬浮细胞株及其驯化方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，特别是涉及一种悬浮细胞株及其驯化方法。
背景技术
动物细胞培养，特别是大规模动物细胞培养技术已经广泛应用于包括单克隆抗体、疫苗、重组蛋白及基因工程药物等生物制品的生产。大量的生物药由于结构复杂，翻译后修饰度高，真核表达系统特别是动物细胞表达系统由于糖基化水平高，翻译后修饰程度最接近人类，已经成为工业化生产生物药的主要表达系统。由于大部分的动物细胞都具有贴壁培养特性，而工业化大规模生产过程中，广泛使用的生物反应器级联放大工艺要求细胞具有悬浮培养特性，以便于放大工艺的实现。因此，细胞的悬浮驯化变得不可或缺。
常规的细胞培养过程一般使用加血清的基础培养基对细胞进行培养。血清的主要作用在于给细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但由于血清中所含的成分复杂，不同产地、批次之间存在质量差异，给动物细胞大规模培养工艺造成了诸多不利影响。同时，通过细胞培养获得产物的过程，血清的存在是纯化的主要障碍，甚至使产物难以成为医药产品。而无血清培养基就是在基础培养基的基础上，引入成分完全明确的血清替代成分，使培养基能满足动物细胞培养的要求，又可有效的克服因使用血清所引发的问题。
目前，大规模动物细胞培养工艺的发展趋势是将动物细胞在无血清培养基中纯悬浮培养。采用化学成分明确的无血清培养基有利于产品的质量控制和稳定性，同时有利于下游的产物分离纯化工作。悬浮培养的方式使生物反应器级联放大变得更具有操作性。因此，对贴壁细胞进行无血清纯悬浮驯化是动物细胞大规模培养的基础。但是，目前大部分细胞系仍然无法完全适应无血清悬浮培养。目前已悬浮驯化成功的细胞系主要有CHO细胞、HEK293细胞、BHK21细胞和Vero细胞等，但整个驯化过程耗时较长，通常需要半年以上。
传统上针对细胞悬浮驯化多采用先断血清后悬浮驯化的方法，该方法是先将细胞在方瓶中逐渐完成至适应完全无血清培养的驯化过程后，再将已适应完全无血清培养基的细胞转移到摇瓶中进行完全无血清培养基的悬浮驯化过程。但是，往往在方瓶中将血清含量由5％降至0％时，逐渐出现细胞生长速率变慢的现象，导致此驯化过程进展缓慢，驯化周期一般在6个月以上。血清每降一个梯度细胞往往需要适应5代以上的时间；特别是当血清含量降至1％至0％时，细胞贴壁性能下降，代谢缓慢，极易出现细胞成团死亡的情况导致驯化失败。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种驯化周期较短的悬浮细胞株及其驯化方法。
实现上述目的的具体技术方案如下：
一种悬浮细胞株的驯化方法，包括如下步骤：
(1)复苏细胞，将贴壁型细胞接种于含9.5％-10.5％血清的完全培养基中传代培养1-3次；
(2)将步骤(1)获得的对数生长期的细胞接种于含有无血清培养基和含10％血清的完全培养基的第一混合液的方瓶中培养，所述第一混合液中的血清含量为4.5％-5.5％，传代1-3次；
(3)将步骤(2)获得的细胞转移至含有所述无血清培养基和所述含10％血清的完全培养基的第二混合液的摇瓶中悬浮驯化培养，所述第二混合液中的血清含量为3.0％-3.6％，传代1-3次；
(4)将步骤(3)获得的细胞转移至含有所述无血清培养基和所述含10％血清的完全培养基的第三混合液的摇瓶中悬浮驯化培养，所述第三混合液中的血清含量为1.8-2.2％，传代1-3次；
(5)将步骤(4)获得的细胞转移至含有所述无血清培养基和所述含10％血清的完全培养基的第四混合液的摇瓶中悬浮驯化培养，所述第四混合液中的血清含量为0.8-1.2％，传代1-3次；
(6)将步骤(5)获得的细胞转移至所述无血清培养基的摇瓶中悬浮驯化培养，传代1-3次，即得所述悬浮细胞株。
在其中一些实施例中，在步骤(1)中，所述贴壁型细胞为CHO细胞。
在其中一个实施例中，在步骤(2)中，所述第一混合液中血清含量为4.9％-5.1％；
在步骤(3)中，所述第二混合液中血清含量为3.3％-3.5％；
在步骤(4)中，所述第三混合液中血清含量为1.9％-2.1％；
在步骤(5)中，所述第四混合液中血清含量为0.9％-1.1％
在其中一个实施例中，所述完全培养基为DMEM/F12培养基，所述无血清培养基为Ex-cell CD CHO无血清培养基。
在其中一个实施例中，在步骤(1)中，所述贴壁型细胞为HEK293细胞、BHK21细胞或Vero细胞。
在其中一个实施例中，所述完全培养基为DMEM基础培养基。
在其中一些实施例中，在步骤(1)中，所述贴壁型细胞的接种密度为1-5×105个/ml，接种体积为5±0.5ml，每两天传代1次。
在其中一个实施例中，在步骤(2)中，所述对数生长期的细胞消化处理后，其接种密度为1-5×105个/ml，接种体积为5±0.5ml，每两天传代1次。
在其中一个实施例中，在步骤(3)至(6)中，均采用半量换液的方法进行传代培养，其中，传代培养的细胞的接种密度为3-10×105个/ml，培养体积为20±1.0ml，转速为110-140rpm，每两天传代1次。
上述悬浮细胞株的驯化方法驯化获得的悬浮细胞株。
本发明具有以下有益效果：
本发明的悬浮细胞株的驯化方法，首先将贴壁型细胞9.5％-10.5％血清的完全培养基传代培养1-3次进行复苏，再将其接种于含4.5％-5.5％血清的培养基的方瓶中传代培养1-3次能够使其适应血清含量较低的培养环境及部分无血清培养基环境，再将其从方瓶中转移接种到血清含量依次为3.0％-3.6％、1.8％-2.2％和0.8％-1.2％的培养基的摇瓶中进行悬浮培养后，再转移至无血清培养基的摇瓶中传代培养1-4次，在摇瓶中的整个驯化培养过程中，由于培养基中溶解氧的改善及营养物质的流动性好可使细胞保持较强的代谢，迅速适应无血清培养基及悬浮培养环境，并使驯化获得的细胞不易聚团、死亡量小，使整个驯化过程顺畅。相对于传统驯化方法，本发明的悬浮细胞株的驯化方法在降血清含量的同时进行悬浮驯化培养，每个血清梯度对应的细胞传代次数保持在1-3次即可，整体上控制贴壁型细胞的驯化周期在一个月内完成，显著缩短驯化周期，节省驯化成本，可用于后续的工业化大规模生产。
本发明的悬浮细胞株的驯化方法获得的悬浮细胞株的分散性好、活率高。
附图说明
图1为实施例1的驯化前的贴壁型CHO-K1细胞株的显微图片；
图2为实施例1的驯化后的无血清悬浮型CHO-K1细胞株的显微图片；
图3为实施例1的CHO-K1细胞株的驯化前后的细胞生长曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明做进一步地阐述。
一实施方式的悬浮细胞株的驯化方法，包括如下步骤：
(1)复苏细胞，将贴壁型细胞接种于含9.5％-10.5％血清的完全培养基的T25方瓶中，于温度37±0.5℃、湿度100％及5％CO2的条件下，传代培养1-3次，以恢复冻存期间的细胞损伤以达到最佳生长状态。其中，优选地，贴壁型细胞的接种密度为1-5×105个/ml，接种体积为5±0.5ml，每两天传代1次，使细胞密度达1.2×106个/ml以上。
在本实施例方式中，具体地，贴壁型细胞可以为CHO、HEK293、BHK21及Vero等工业化常用的细胞。
(2)将步骤(1)获得的对数生长期的细胞消化处理后，接种含有无血清培养基和含10％血清的完全培养基的第一混合液的T25方瓶中，第一混合液中的血清含量为4.5％-5.5％，于温度37±0.5℃、湿度100％及5％CO2的条件下，传代培养1-3次。在该步骤中，优选地，接种密度为1-5×105个/ml，接种体积为5±0.5ml，每两天传代1次，使细胞密度达1.2×106个/ml以上。
该步骤可以使待驯化的贴壁型细胞适应血清含量较低的无血清培养环境，以利于后续的摇瓶驯化培养过程。
(3)将步骤(2)获得的细胞转移至含有无血清培养基和含10％血清的完全培养基的第二混合液的摇瓶中悬浮驯化培养，第二混合液中的血清含量为3.0％-3.6％，于温度37±0.5℃、湿度100％及5％CO2的条件下，采用半量换液的方法传代1-3次。
(4)将步骤(3)获得的细胞转移至含有无血清培养基和含10％血清的完全培养基的第三混合液的摇瓶中悬浮驯化培养，第三混合液中的血清含量为1.8％-2.2％，于温度37±0.5℃、湿度100％及5％CO2的条件下，采用半量换液的方法传代1-3次。
(5)将步骤(4)获得的细胞转移至含有无血清培养基和含10％血清的完全培养基的第四混合液的摇瓶中悬浮驯化培养，第四混合液中的血清含量为0.8-1.2％，于温度37±0.5℃、湿度100％及5％CO2的条件下，采用半量换液的方法传代1-3次。
(6)将步骤(5)获得的细胞转移至无血清培养基的摇瓶中悬浮驯化培养，于温度37±0.5℃、湿度100％及5％CO2的条件下，采用半量换液的方法传代1-3次，即得悬浮细胞株。
在本实施方式中，优选地，在步骤(3)至(6)中，传代培养的细胞的接种密度为3-10×105个/ml，培养体积为20±1.0ml，转速为110-140rpm，每两天传代1次。
相对传统驯化方法，本实施方式的悬浮细胞株的驯化方法在降血清含量适应无血清培养基环境的同时进行悬浮驯化培养，在悬浮培养的过程中，培养基中溶解氧含量较大且营养物质的流动性好，可使细胞保持较强的代谢，每个血清梯度对应的细胞传代1-3次即可，整体上控制贴壁型细胞的驯化周期在一个月内完成，显著缩短驯化周期，节省驯化成本，可用于后续的工业化大规模生产。
下面进一步结合具体实施例对本发明的悬浮细胞株的驯化方法做进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种CHO-K1细胞(购自ATCC，初始的CHO-K1细胞在含10％FBS的DMEM/F12培养基中贴壁培养)的悬浮细胞株的驯化方法，包括如下步骤：
(1)复苏细胞：将CHO-K1细胞以3×105个/ml(共5ml)的密度接种于含10％FBS的DMEM/F12培养基的T25方瓶中，于温度37±0.5℃、湿度100％及5％CO2的条件下，传代2次，以恢复冻存期间的细胞损伤，使细胞达到最佳生长状态，每2天传代1次，细胞密度在1.2×106个/ml以上。
(2)将步骤(1)中获得的对数生长期的细胞，采用胰酶消化分散成单个细胞，终止消化后，以3×105个/ml(共5ml)的密度接种至体积比为1:1的无血清培养基(购自Sigma公司生产的Ex-cell CD CHO无血清培养基)和含10％FBS的DMEM/F12培养基的方瓶中，于温度37±0.5℃、湿度100％及5％CO2的条件下，继续传代2次，每2天传代1次，细胞密度在1.2×106个/ml以上。
(3)将步骤(2)获得的对数生长期的细胞转移到体积比2:1的无血清培养基和含10％FBS的DMEM/F12培养基的摇瓶(125ml摇瓶，培养体积20ml)中进行悬浮培养，细胞接种密度为6×105个/ml，于温度37±0.5℃、湿度100％及5％CO2的条件下，125±5rpm，采用半量换液的方法传代3次，每2天传1代，进行悬浮驯化。当细胞出现极少量聚团时，每次传代时采用20G低速离心去除成团细胞。当细胞分散良好，活率高于90％时，冻存部分细胞。
(4)将步骤(3)获得的细胞转移到体积比4:1的无血清培养基和含10％FBS的DMEM/F12培养基的摇瓶(125ml摇瓶，培养体积20ml)中进行悬浮培养，细胞接种密度为6×105个/ml，于温度37℃、湿度100％及5％CO2的条件下，125±5rpm，采用半量换液的方法传代2次，每2天传1代，当细胞出现极少量聚团，每次传代时采用20G低速离心去除成团细胞。
(5)将步骤(4)获得的细胞转移到体积比9:1的无血清培养基和含10％FBS的DMEM/F12培养基的摇瓶(125ml摇瓶，培养体积20ml)中进行悬浮培养，细胞接种密度为6×105个/ml，125±5rpm，于温度37℃、湿度100％及5％CO2的条件下，采用半量换液的方法传代2次，每2天传1代，当细胞出现极少量聚团，每次传代时采用20G低速离心去除成团细胞。
(6)将步骤(5)获得的细胞转移到无血清培养基的摇瓶(125ml摇瓶，培养体积20ml)中进行悬浮培养，细胞接种密度为6×105个/ml，于温度37℃、湿度100％及5％CO2的条件下，125±5rpm，采用半量换液的方法传代3次，每2天传1代，当细胞出现极少量聚团，每次传代时采用20G低速离心去除成团细胞，即得无血清悬浮型CHO-K1细胞株。该无血清悬浮型CHO-K1细胞株可用于后续的工业化大规模生产。
由图1和图2可知，本实施例的CHO-K1细胞在驯化之前细胞贴壁生长，呈梭形。采用本实施例的驯化方法获得的无血清悬浮型CHO-K1细胞呈球形，分散性好，细胞透亮，且活率高于90％。进一步结合图3，本实施例获得的无血清悬浮型CHO-K1细胞株的生长速率比贴壁型CHO-K1细胞略高，适用于工业化大规模培养。
此外，本申请采用了与实施例1相同的驯化方法还对贴壁型的HEK293细胞株、BHK细胞株和Vero细胞株进行驯化，其中除采用的无血清培养基为市售的相应细胞的商品化无血清培养基及采用的含完全培养基为含10％FBS的DMEM培养基外，其余驯化条件均与实施例1相同，同样在1个月内驯化获得了无血清悬浮型HEK293细胞株、无血清悬浮型BHK21细胞株和无血清悬浮型Vero细胞株，且获得的对应的悬浮细胞株的细胞分散性良好且活率高于90％，细胞生长速率高，适用于后续的工业化大规模生产。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种悬浮细胞株的驯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)复苏细胞，将贴壁型细胞接种于含9.5％-10.5％血清的完全培养基中传代培养1-3次；
(2)将步骤(1)获得的对数生长期的细胞接种于含有无血清培养基和含10％血清的完全培养基的第一混合液的方瓶中培养，所述第一混合液中的血清含量为4.9％-5.1％，传代1-3次；
(3)将步骤(2)获得的细胞转移至含有所述无血清培养基和所述含10％血清的完全培养基的第二混合液的摇瓶中悬浮驯化培养，所述第二混合液中的血清含量为3.3％-3.5％，传代1-3次；
(4)将步骤(3)获得的细胞转移至含有所述无血清培养基和所述含10％血清的完全培养基的第三混合液的摇瓶中悬浮驯化培养，所述第三混合液中的血清含量为1.9％-2.1％，传代1-3次；
(5)将步骤(4)获得的细胞转移至含有所述无血清培养基和所述含10％血清的完全培养基的第四混合液的摇瓶中悬浮驯化培养，所述第四混合液中的血清含量为0.9％-1.1％，传代1-3次；
(6)将步骤(5)获得的细胞转移至所述无血清培养基的摇瓶中悬浮驯化培养，传代1-3次，即得所述悬浮细胞株；
所述贴壁型细胞为CHO细胞、HEK293细胞、BHK21细胞和Vero细胞中的至少一种；所述步骤(3)至(6)中，传代培养的细胞的接种密度为3-10×105个/ml。
2.根据权利要求1所述的悬浮细胞株的驯化方法，其特征在于，在步骤(2)中，第一混合液中血清含量为5.0％；
在步骤(3)中，所述第二混合液中血清含量为3.3％；
在步骤(4)中，所述第三混合液中血清含量为2.0％；
在步骤(5)中，所述第四混合液中血清含量为1.0％。
3.根据权利要求1或2所述的悬浮细胞株的驯化方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述贴壁型细胞为CHO细胞。
4.根据权利要求3所述的悬浮细胞株的驯化方法，其特征在于，所述完全培养基为DMEM/F12培养基，所述无血清培养基为Ex-cell CD CHO无血清培养基。
5.根据权利要求1或2所述的悬浮细胞株的驯化方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述贴壁型细胞为HEK293细胞、BHK21细胞或Vero细胞。
6.根据权利要求5所述的悬浮细胞株的驯化方法，其特征在于，所述完全培养基为DMEM基础培养基。
7.根据权利要求1或2所述的悬浮细胞株的驯化方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述贴壁型细胞的接种密度为1-5×105个/ml，接种体积为5±0.5ml，每两天传代1次。
8.根据权利要求1或2项所述的悬浮细胞株的驯化方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述对数生长期的细胞消化处理后，其接种密度为1-5×105个/ml，接种体积为5±0.5ml，每两天传代1次。
9.根据权利要求1或2项所述的悬浮细胞株的驯化方法，其特征在于，在步骤(3)至(6)中，均采用半量换液的方法进行传代培养，其中，传代培养的细胞的接种密度为3-10×105个/ml，培养体积为20±1.0ml，转速为110-140rpm，每两天传代1次。
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