CN102511007B - 抗体中的a-岩藻糖基化检测 - Google Patents

抗体中的a-岩藻糖基化检测 Download PDF

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Abstract

本发明描述了新的分析方法，以测定抗体制剂内每一Fc的岩藻糖的数量和分布。

Description

抗体中的a-岩藻糖基化检测
本发明涉及用于检测糖基化抗体或其片段内存在或者不存在岩藻糖残基的方法。
发明背景
尽管抗体的Fab(抗原结合片段)结构域内的可变区负责抗原的识别，但Fc(可结晶片段)区代表抗体的恒定部分，其负责介导效应功能。在免疫球蛋白G(IgG)的情况下，这些效应功能包括补体的固定和与Fey受体(FcyR)的结合。同型二聚体Fc片段的CH2结构域内单个保守位点(Asn297)处N-连接寡糖的存在对于介导这这些效应功能是必须的。最近发现，所连接糖类的修饰也可以对FcγRIIIa和IgG之间的相互作用具有亲和力改进作用。负责这种作用的糖类修饰是不存在岩藻糖残基，所述岩藻糖残基通常与双触角(biantennary)复合物型IgG聚糖中的第一个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基连接(图1)。
体内和体外实验显示，此种增加的亲和力导致主要由自然杀伤(NK)细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的增强。因此，还认为，此种a-岩藻糖基化抗体在目的为清除受调理的细胞的处理中具有改进的效力。
a-岩藻糖基化抗体的产生代表重要的生物技术挑战，其可以通过几种方法实现。尽管完全缺失参与岩藻糖基化生物合成的酶的细胞系(例如通过基因敲除)可以产生定量的a-岩藻糖基化抗体，但大多数其他方法还不能。例如，siRNA处理或用几夫碱共培养抗体表达细胞(Zhou等人，Biotechnol Bioeng(2008)99，652-665)，以及通过N-乙酰葡糖胺转移酶Ⅲ(GnT-III)(其促进等分寡糖的形成，因此抑制岩藻糖基化反应)的糖修饰(Umana等人，Nat Biotech(1999)17，176-180)仅产生了部分a-岩藻糖基化的抗体。
在抗体库内，这些部分a-岩藻糖基化抗体主要表现出不均一的a-岩藻糖基化分布。例如，在发酵期间，岩藻糖基化速率可以不同。此外，岩藻糖基化事件可以是协同的，即在同型二聚体抗体上的第二岩藻糖基化可以相对于第一岩藻糖基化而言，以增加的(正协同)或降低的(负协同)速率发生。
FcγRIIIa/IgG复合物具有1∶1的化学计量，但IgG具有FcγRIIIa的两个结合位点。因此，在单a-岩藻糖基化抗体中，受体可以以高亲和力与由IgG的a-岩藻糖基化聚糖和蛋白质核心形成的结合位点结合或者以低亲和力与由岩藻糖基化的糖类和蛋白质核心组成的结合位点结合。因此可以推断，具有50％a-岩藻糖基化的抗体库可以由其中仅两个N-聚糖中的一个是岩藻糖基化的抗体的均一群体组成，或者由50％为其中两个N-聚糖都是岩藻糖基化的抗体而其余50％为N-聚糖都没有岩藻糖基化的抗体组成。显而易见，此种a-岩藻糖基化的差异分配影响了对FcγRIIIa的整体亲和力，并导致不同的生物学活性。因此，必须直接地通过应用生物学测试系统(生物测定法)或者间接地通过生物化学测量a-岩藻糖基化的速率和分布，来分析此种抗体制剂的生物学活性，这产生了更准确的结果。
当今技术水平的糖分析法(glycoanalytics)使用来自脑膜败血金黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)的N-糖苷酶F(PNGase F)切割N-连接的糖类，随后进行MALDI-MS(基质辅助激光解吸离子化质谱)分析(根据Papac等人，Glycobiology(1998)8，445-454)。然而，由于应用该方法，丢失了键合信息，并且也不可能测定抗体制剂内岩藻糖基化的分布。
另一方面，使用ESI-MS(电喷射离子质谱)分析完整抗体产生了复杂质量模式，其不允许定量解释，这是由于除岩藻糖基化外的多种修饰，如半乳糖基化、C-末端赖氨酸异质性、脱酰胺作用等，其可能在或不在同型二聚体IgG的两个亚基中都发生。
因此，还存对于消除上述不均一性但保留键合信息的新的分析方法的需求。
发明详述
本发明克服了上述缺点，其提供了用于检测糖基化抗体内存在或者不存在岩藻糖残基的方法。优选地，测定抗体或其片段内岩藻糖残基的量及其分布模式。分析抗体制剂中每一Fc分子的岩藻糖残基的分布也是本发明的一部分。此外，本发明可以用于测定发酵期间抗体制剂中协同的岩藻糖基化。因此，本发明提供了填补抗体分析学中空缺的方法。通过该新方法得到的抗体及其片段内岩藻糖基化模式的信息，目前可以更准确地预测Fc介导的潜能。
令人惊奇地，本发明的发明人发现，Endo S(具有内切糖苷酶活性的酶，最初在酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)中鉴定(Collin和Olsen，EMBO J(2001)20，3046-3055))从人IgG的Fc区中切割了复合型聚糖部分，仅留下可能与岩藻糖残基连接的第一个GlcNAc残基。由Endo S区分的(备用的(spared))该杂合型糖类可以在相同的位点受内切糖苷酶H(Endo H)定量切割。因此，两种酶的组合允许制备仅岩藻糖含量不同的均一糖基化蛋白质。分析此种经处理的Fc片段不仅允许测定分析的抗体库内岩藻糖残基的岩藻糖含量，还允许测定岩藻糖残基的分布。这些新发现填补了分析学空缺，并且根据所分析的抗体在ADCC诱导中的功效，允许所分析的抗体的潜能估计。
因此，本发明涉及用于检测糖基化的抗体或其片段内存在或者不存在岩藻糖残基的方法。
在一个实施方案中，本发明方法包括以下步骤：
a)从蛋白质中去除全部异质性糖残基，
b)从蛋白质中去除全部其他异质性残基，
c)随后分析该蛋白质。
在另一实施方案中，所述方法的步骤c)额外包括分析之前的纯化步骤。在特定的实施方案中，通过亲和层析或者大小排阻层析实现纯化。亲和层析可以使用例如A蛋白或G蛋白进行。
在一个实施方案中，通过本发明方法处理和分析的蛋白质是抗体或抗体片段。优选地，所述抗体是IgG型抗体。所述抗体片段优选地是Fc片段，特别是IgG型抗体的Fc片段。
在特定的实施方案中，步骤a)的去除通过特异切割复合型或杂合型N-连接糖类的一种或多种酶进行。优选地，这些酶包括Endo S和Endo H。
在另一特定的实施方案中，步骤b)的去除通过一种或多种酶进行。优选地，这些酶包括纤溶酶和/或羧肽酶B。
在另外的特定实施方案中，步骤c)的分析包括CE-SDS MW(毛细管电泳-十二烷基硫酸钠分子量)分析、ESI-MS分析或液相层析-质谱(LC-MS)或者它们的组合。
在优选的实施方案中，上述方法的步骤a)包括从蛋白质的糖结构中在所述糖结构的第一个GlcNAc残基后切割异质性糖类，从而留下与抗体核心连接的岩藻糖残基。该步骤可以用两种酶(例如Endo S和Endo H)进行，所述酶特异性切割通常在生物技术产生的抗体中存在的复合型或者杂合型N-连接的糖类。
在优选的实施方案中，上述方法的步骤b)包括定量去除抗体重链的C末端赖氨酸残基，优选地使用酶，所述酶优选地包括羧肽酶B。
在另一优选的实施方案中，上述方法的步骤b)包括在抗体的Fab和Fc片段之间切割。优选地，在Fab和Fc片段之间的切割后，在Fc片段内保留了重链的铰链肽内的共价链间二硫键。优选地，通过酶实现切割。优选地，此种酶包括纤溶酶。
在优选的实施方案中，上述方法的步骤c)包括在没有任一先前的纯化步骤的情况下，通过LC-MS分析所处理的抗体分子或Fc片段。该分析通常产生了仅三种质量，所述三种质量对应于具有两个岩藻糖基化聚糖的蛋白质、具有一个岩藻糖基化聚糖和一个a-岩藻糖基化聚糖的蛋白质，以及其中两个聚糖都a-岩藻糖基化的蛋白质。
在另一实施方案中，上述方法的步骤c)包括使用标准方法纯化所处理的抗体分子或Fc片段，并通过ESI-MS分析分析它。该分析通常产生了仅三种质量，所述三种质量对应于具有两个岩藻糖基化聚糖的蛋白质、具有一个岩藻糖基化聚糖和一个a-岩藻糖基化聚糖的蛋白质，以及其中两个聚糖都是a-岩藻糖基化的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明方法包括以下步骤：提供抗体制剂，任选地分离该抗体制剂的Fc片段部分、用Endo H和Endo S从所述抗体或Fc片段中去除异质性糖残基、用羧肽酶B从所述抗体或Fc片段中去除C端赖氨酸残基，以及通过ESI-MS、LC-MS或CE-SDS MW分析，分析所处理的抗体或Fc片段。
在另一实施方案中，所述方法包括以下步骤：提供抗体制剂，任选地使用纤溶酶分离该抗体制剂的Fc片段部分、用Endo H和Endo S从所述抗体或Fc片段中去除异质性糖残基、用羧肽酶B从所述抗体或Fc片段中去除C端赖氨酸残基，以及通过ESI-MS、LC-MS或CE-SDS MW分析，纯化并分析所处理的抗体或Fc片段。
又在另一实施方案中，本发明涉及适合于进行测定法的试剂盒，所述测定法检测糖蛋白内岩藻糖残基的存在或者不存在。本发明试剂盒包括在上述方法中提及的全部组分(例如Endo H、Endo S、羧肽酶B、纤溶酶、合适的缓冲液)、描述上述方法中任意之一的步骤的说明，以及用于试剂盒的内含物的容器。
将Endo S用于切割糖蛋白，优选地糖基化抗体或者其片段的复合型N-连接寡糖的用途也是本发明的一部分。
定义
在本文中所用的术语通常同样地用于本领域中，除非在以下另外定义：
如本文中所用，术语“异质性糖”包括不与岩藻糖残基连接的糖基化抗体或者抗体片段的任一单糖部分。糖基化抗体或者抗体片段的异质性糖的非限制性实例是甘露糖、唾液酸、半乳糖、乙酰葡糖胺。通常，在本发明方法的步骤a)中去除的异质性糖是除第一个GlcNAc残基(即与蛋白质的天冬酰胺残基连接的GlcNAc残基)，以及与第一个GlcNAc残基连接的岩藻糖残基之外的全部糖。
如本文中所用，术语“异质性残基”意为糖基化抗体或者抗体片段的任一其他部分(除异质性糖外)，其可以干扰在所述抗体或者抗体片段内岩藻糖残基的检测。异质性残基的非限制性实例是除岩藻糖基化之外的糖基化抗体或者抗体片段的多种修饰，例如半乳糖基化、C端赖氨酸异质性和脱酰胺作用。术语“异质性残基”可以进一步包括未糖基化的抗体片段，例如Fab片段、scFv片段和其他片段。
如本文中所用，术语“抗体”意图包括整个抗体分子、抗体片段或者融合蛋白质，所述融合蛋白质包含与免疫球蛋白的Fc区等同的区域。
术语“复合型寡糖”和“杂合型寡糖”指抗体或者抗体片段的糖基化模式。“复合型寡糖”和“杂合型寡糖”的非限制性实例显示于图7中。本领域技术人员应当理解，富含等分(bisected)杂合型寡糖的糖蛋白通常由生产细胞系中GnT-III的过表达产生。等分杂合型寡糖的示例结构详述与图7-III中。富含等分的复合型寡糖的糖蛋白通常由生产细胞系中ManII和GnT-IⅡ的共表达产生。等分复合型寡糖的示例性结构详述于图7-Ⅳ中(Ferrara等人，Biotechnol Bioeng(2006)93，851-861)。
如本文中所用，糖残基“之后”切割，意为在该残基的末端切割，即切割连接该残基与朝向糖结构的外端的相邻残基的糖键。在N连接聚糖的“第一个GlcNAc残基之后”切割，意为在第一个(即与天冬酰胺残基连接的)和第二个(即与第一个连接的)GlcNAc残基之间切割寡糖的壳二糖核心。
抗体制剂内岩藻糖残基的“分布”指抗体或Fc分子的制剂内的存在，所述抗体或Fc分子在Fc区中与N-连接聚糖相关的岩藻糖残基的数目方面不同。例如，IgG分子在其Fc区具有两个N-连接的聚糖，其中每一个都可以具有与糖结构的第一个GlcNAc残基连接的岩藻糖残基。因此，在IgG制剂中，可能存在三种不同的分子种类：在Fc区中具有两个、一个或者没有与N-连接聚糖相关的岩藻糖残基的IgG。除测定总岩藻糖含量，即岩藻糖基化或者a-岩藻糖基化N-聚糖的级分外，可以通过本发明方法测定这些不同种类的比率(即每一Fc分子的岩藻糖残基的分布)。
以下实施例更详细地说明了本方法。给出的实施例能使本领域技术人员更清楚地理解并实施本发明。然而，本发明并不受限于示例性实施例的范围，所述示例性实施例仅旨在说明本发明的单个方面，并且功能性等同的方法也在本发明范围内。
附图简述
图1.图示与人IgGl-Fc的Asn-297连接的糖类部分。以粗体显示的糖定义了N-连接聚糖结构的戊糖核心；其他糖残基的添加是可变的。灰色显示了等分GlcNAc残基。
图2.通过CE-SDS监测的抗体A(野生型抗体)和C(糖基化改造抗体)的完整Fc片段的去糖基化。显示了酶处理之前和之后非还原Fc片段的电泳图谱。(A)没有酶处理(虚线)和用PNGase F(点线)或Endo S(实线)去糖基化的抗体C的Fc片段，(B)没有酶处理(虚线)和用PNGaseF去糖基化(点线)或Endo S(实线)去糖基化的抗体A的Fc片段。
图3.通过用Endo S和PNGase F或者用Endo S和Endo H连续处理，从抗体C的Fc片段中释放的N-连接的寡糖的阳离子MALDI-TOF质谱。(A)通过用Endo S处理释放的聚糖的谱图。(B)通过用PNGase F后续处理释放的Endo S抗性糖的谱图，产生了在m/z＝1663处分离的信号(如图示，其可能对应于杂合型或者复合型结构)。(C)通过用杂合型结构特异的酶Endo H后续处理释放的聚糖的谱图(图示了通过Endo H处理释放的对应于m/z＝1460的杂合型结构)。
图4.通过CE-SDS MW分析(A)和阳离子MALDI-TOF质谱(B)监测抗体C的Fc片段的去糖基化。(A)不用糖苷酶处理的(虚线)和用Endo S和Endo H的组合处理的(实线)非还原Fc片段的电泳图谱的叠加。(B)用Endo S和Endo H处理，从Fc片段中释放的N-连接寡糖的质谱。图示了通过Endo H释放的对应于m/z＝1460的杂合型结构。
图5.用Endo S和Endo H处理后Fc片段的ESI-MS谱。(A)抗体A的Fc片段，(B)抗体B的Fc片段，(C)抗体C的Fc片段。峰1：Fc-GlcNAc/GlcNAc  ，峰2：Fc-GlcNAc/GlcNAc+Fuc  ，峰3：Fc-GlcNAc+Fuc/GlcNAc+Fuc。
图6.通过CE-SDS(A)和阳离子MALDI-TOF质谱(B)监测的抗体C的去糖基化。(A)显示了酶处理之前和之后未还原的IgG的电泳图谱：不用酶处理的(虚线)和用PNGase F去糖基化的(点线)或用Endo S和EndoH组合处理的(实线)抗体C。(B)从用Endo S和Endo H处理的完整IgG中释放的N-连接寡糖的质谱。
图7.产生复合型或杂合型结构的N-连接寡糖生物合成途径。Ml：甘露糖苷酶I，G1：β1，2-N-乙酰葡糖胺转移酶I，G3：β1，4-N-乙酰葡糖胺转移酶Ⅲ，Gt：β1，4-半乳糖基转移酶。
图8.用Endo S和Endo H处理后，完整IgG的ESI-MS谱。(A)抗体A，(B)抗体D。峰1：Fc-GlcNAc/GlcNAc，峰2：Fc-GlcNAc/GlcNAc+Fuc，峰3：Fc-GlcNAc+Fuc/GlcNAc+Fuc。
图9.用Endo S和Endo H处理后，完整IgG的LC-MS谱。。(A)抗体A，(B)抗体D。峰1：Fc-GlcNAc/GlcNAc，峰2：Fc-GlcNAc/GlcNAc+Fuc，峰3：Fc-GlcNAc+Fuc/GlcNAc+Fuc。
实施例
实施例1：方法
从人IgG中产生Fc
将根据Papac等人，1998测定的具有不同a-岩藻糖基化聚糖含量(括号内的含量)的4种不同的人IgG用于分析a-岩藻糖基化分布：野生型抗体A(2.12％)、糖基化改造的抗体B(47.0％)，糖基化改造的抗体C(69.6％)，和糖基化改造的抗体D(85％)。
在25℃，在具有每毫克0.42U纤溶酶(Roche)的50mM Tris pH 8.0、150mM NaCl中温育蛋白质72小时。使用用缓冲液A(50mM Tris pH 8.0、100mM甘氨酸、150mM NaCl)平衡并洗涤(5个柱体积(CV))的A蛋白亲和柱(5ml HiTrapTMA蛋白HP柱，GE Healthcare)，分离已切割的Fc与Fab片段。收集含Fc的级分，并通过加入1∶40(v/v)的2M TrispH 8.0中和。使用超浓缩器(ultra concentrator)(Vivaspin 15RMWCO HY，Sartorius)，将样品浓缩至2.5ml的体积，并随后应用于用2mM MOPS pH 7.4、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaN3平衡的PD-10脱盐柱(GE Healthcare)。将纯化的蛋白质冷冻于液氮中，并储存于-80℃。
从人Fc中释放N-连接的寡糖
将不同的酶用于水解人IgG的N-连接的聚糖。通过用0.005U重组PNGase F(QAbio，Vista Monte，美国)温育，从1mg的Fc中切割N-连接的寡糖。对于使用未标记的Endo S(Genovis)从Fc中释放糖类，将样品用1∶20摩尔比的单独的Endo S或者Endo S与0.1U/mg Endo H(QAbio)的组合温育。在37℃，在20mM Tris pH 8.0中温育所有反应物16小时。
对于分析由Endo S切除(spared)的糖类，如上所述，在Endo S处理后，通过使用A蛋白的亲和层析纯化Fc，并随后用PNGase F或Endo H消化。
从完全人IgG中释放N-连接的寡糖
使用不同酶释放人IgG的N-连接的聚糖。通过在37℃，在20mM TrispH 8.0中用0.005U的重组PNGase F(QAbio)温育16小时，从1mg的IgG中切割N-连接的寡糖。对于使用未标记的Endo S(Genovis)从IgG中释放糖类，将样品应用于用20mM Tris pH 8.0平衡的NAP-5脱盐柱(GEHealthcare)。使用超浓缩器(Amicon 5′O00MWCO，Millipore)，将洗脱的样品浓缩至4mg/ml的终浓度，并在37℃，用1∶7的Endo S与0.1U/mgEndo H(QAbio)的组合温育16小时。
羧肽酶B处理
为了去除由C端赖氨酸残基引起的异质性，在去糖基化后，将样品用羧肽酶B(Roche；1mg/ml)进一步温育。从而，将每50μg人Fc或完整抗体1μl的羧肽酶B加入到内切糖苷酶反应中，并在37℃再次温育1小时。
释放的寡糖的MALDI-TOF质谱分析
通过质谱(Auto flex，Bruker Daltonics GmbH)在阳离子模式中，分析人Fc或完整抗体的中性寡糖谱(Papac等人，1998)。
纯化去糖基化的人Fc或完整抗体
通过A蛋白亲和层析(Agilent Technologies)使用Agilent HPLC 1100系列分离Fc或完整IgG与酶和经切割的糖类。将样品应用于用缓冲液A(50mM Tris，100mM甘氨酸，150M NaCl，pH 8.0)平衡的包装在保护柱2×20mm  C-130B(Upchurch Scientific)中的A蛋白基质(Poros 20A；Applied Biosystems)。用5.5CV的缓冲液A洗涤后，使用8.3CV以上的缓冲液B(50mM Tris，100mM甘氨酸，150M NaCl，pH 3.0)通过pH-梯度洗脱人Fc或完整IgG。通过加入1∶40(v/v)的2M Tris pH 8.0中和含所述蛋白质的级分。
随后将纯化的蛋白质进一步用于用酶处理以分析未切割的糖类、CE-SDS分析或者ESI-MS。
CE-SDS MW分析
使用具有UV检测的Beckman PA800，通过CE-SDS-MW分析监测去糖基化。使用旋转浓缩器(5000MWCO，Millipore)将100μg每一A蛋白纯化的样品的缓冲液交换成20mM Tris pH 8.0。使用ProteomeLabSDS-MW分析试剂盒(Beckman Coulter)，如在SDS-MW Analyses Guide中所述，制备未还原的样品。最终蛋白质浓度为1mg/ml。将样品应用于预先调节的熔融硅毛细管(bare fused silica capillary)(50μm ID×30.2cm)。根据使用说明进行预调节和分离。
用于ESI-MS的样品制备
使用旋转浓缩器(5000MWCO，Millipore)将A蛋白纯化的样品的缓冲液交换成2mM MOPS pH 7.4、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaN3。将蛋白质冷冻于液氮中，并储存在-80℃。
通过直接注入(离线检测)对人Fc和完整IgG的聚糖结构的ESI-MS分析
通过大小排阻层析脱盐
将20-50μg(高达90μl)用蛋白酶纤溶酶和羧肽酶B和用内切糖苷酶Endo S和Endo H处理抗体后的Fc或者用Endo S、Endo H和羧肽酶B处理后的完整IgG注射到用2％甲酸、40％乙腈以0.5ml/分钟的流速平衡30分钟的Sephadex G25自包装ECO SR柱(5×250mm；KronLab)上。用2％甲酸、40％乙腈以1ml/分钟的流速应用8分钟等度洗脱，对所注射的蛋白质样品脱盐。通过280nm处的UV记录脱盐蛋白质的洗脱，并将洗脱的样品(体积约200-300μl)收集在1.5ml反应管中。将脱盐样品的等分试样人工装入金属涂布的玻璃针头(Proxeon Biosystems NanoESI-needles，货号ES387)中，插入到质谱仪器的纳喷雾(nanospray)源中，并喷射到来自Waters的ESI-Q-TOF II质谱仪中或者来自AppliedBiosystems的Q-Star Elite质谱仪中。
直接注入的MS参数：
A)在Q-TOF II仪器(Waters)上，经纤溶酶处理样品(人Fc)的直接注入MS参数
使用1000V的毛细管电压、30V的锥孔电压，在1000-2000m/z的质量范围，使用80℃源温度以阳离子模式获取MS谱。去溶剂化温度为关闭。通过各个仪器软件获取MS数据大约2-3分钟。
B)在MaXis-ESI-MS仪器(Bruker)上，完整抗体的直接注入MS参数
使用NanoMate装置作为喷雾界面获取MS谱。将以MS仪器获取数据的值设定为，对于转移参数，400Vpp(funnel RF)、120eV(ISCID能量)和400Vpp(Multipol RF)，对于quadrupol参数，5.0eV(离子能量)和300m/z(低质量)，调整碰撞池(collision cell)为15eV(碰撞能量)和3000Vpp(碰撞RF)，以及对于转移时间800Vpp、160μs和离子冷却器20μs的前脉冲存储。以阳性离子模式在1000-4000m/z的质量范围记录数据。
使用内部开发的软件，从Fc片段或完整抗体种类的各个m/z模式中，测定含有由所应用的内切糖苷酶截短的聚糖结构的不同组合，即GlcNAc/GlcNAc、GlcNAc+Fuc/GlcNAc和GlcNAc+Fuc/GlcNAc+Fuc的二聚体Fc片段和完整抗体的摩尔质量。使用二聚体Fc片段或完整抗体的不同糖基化变体的m/z谱的峰面积总和，用相同的内部软件计算多种残留的糖基化二聚体Fc片段或完整抗体的相对比率。
通过LC-MS(在线检测)对完整IgG的聚糖结构的ESI-MS分析
在与Q-TOF II质谱仪(Waters)偶联的Dionex HPLC系统(DionexUltimate 3000)上进行LC-MS。在ACE C4柱(5μm颗粒大小，300A孔大小，1×30mm；Advanced Chromatography Technologies)上进行层析分离。洗脱液A为0.1％甲酸，洗脱液B为99.9％乙腈和0.1％甲酸。流速为100μl/分钟，在75℃进行分离，并使用2μg(10μl)的用Endo S和Endo H，但不用纤溶酶处理处理的完整抗体样品。
表1.LC-MS的参数
  时间(分钟)   ％B   备注
  0   25   废物
  3   25
  3.1   25
  3.5   25   转变成MS
  4.0   25
  9.0   50
  9.5   100
  12.5   100
  12.6   25
  14.9   25   转变成废物
  15.0   255   终止MS检测
使用2700V的毛细管电压、80V的锥孔电压，在1000-4000m/z的质量范围，使用100℃的源温度以阳离子模式获取MS谱。将去溶剂化温度设定为200℃。通过各自仪器软件获取MS数据大约11.4分钟(3.5至14.9分钟的梯度时间)。
使用内部研发的软件，从抗体种类的各自m/z模式中，测定含有由所应用的内切糖苷酶截短的聚糖结构不同组合，即GlcNAc/GlcNAc、GlcNAc+Fuc/GlcNAc和GlcNAc+Fuc/GlcNAc+Fuc的完整抗体(由两个重链和两个轻链组成)的摩尔质量。使用完整抗体的不同糖基化变体的m/z谱的峰面积总和，用相同的内部软件计算多种残留的糖基化完整抗体的相对比率。
通过用TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐)还原经EndoS和EndoH处理的抗体，测定未岩藻糖基化的重链的比率，并使用相同的柱型和梯度设定(但部分修改了MS数据获取的参数)，如前所述进行LC-MS分析。MS参数与前述相同，但将锥孔电压设定为25V，并且质量范围为600-2000m/z。
实施例2：结果
Fc的去糖基化
N-糖苷酶F，也称为PNGase F，是高度特异的去糖苷酶，其在高级甘露糖型-、杂合型-和复合型N-连接寡糖的最内部N-乙酰葡糖胺和与该聚糖连接的糖蛋白的天冬酰胺残基之间切割(Tarentino等人，1985)。通过CE-SDS监测根据生产说明用PNGase处理的抗体A和C的Fc片段。在这些条件下，PNGase F定量地去除两种所分析的样品的聚糖部分，导致主峰从3.79×10-5至3.9×10-5的迁移率变动(图2)。
Endo S切割N-连接的寡糖的壳二糖核心，留下第一个N-乙酰葡糖胺残基-和在与蛋白质连接的岩藻糖基化糖类的情况下，a-岩藻糖残基。此种经消化的糖基化改造样品的CE分析显示，大约10％的蛋白质仍是未消化的(图2a，表2)，如由具有3.84×10-5的迁移率的峰所阐明。随后通过PNGase F处理的分析显示Endo S抗性糖类全部都是杂交结构，表明这种酶对复合糖类的特异性。通过野生型抗体A的定量Endo S消化(其产生了均一的去糖基化蛋白质)，证实了该结果(图2b)。
表2.通过CE-SDS评价的经酶处理的Fc片段的峰面积
为了证实该假设，通过亲和层析纯化抗体C的经Endo S处理的Fc，以去除酶和已切割的糖类，并随后用PNGase F温育，以去除全部聚糖部分。通过MALDI TOF MS进一步分析经水解的糖类。获得的谱显示，EndoS能区分(即sparing)复合型或者杂合型等分结构，其对应于m/z＝1663(图3b)。
进行了另外的实验以测定区分的糖是复合型还是杂合型等分结构。通过亲和层析纯化后，用PNGase F或内切糖苷酶H(Endo H)温育抗体C的经Endo S处理的Fc片段。Endo H是重组糖苷酶，其在糖蛋白的高甘露糖型和杂合型N-连接寡糖的壳二糖核心内切割。其不能在复合结构内切割。MALDI TOF MS谱显示，由Endo S区分的糖类经Endo H切割，产生了m/z＝1460的主峰(图3c)。这些数据清楚显示，Endo S不能从天冬酰胺连接的N-乙酰葡糖胺中释放杂合型等分糖类。
为了获得仅a-连接岩藻糖含量不同的均一性去糖基化物质，进行了用Endo S和Endo H组合处理抗体C的Fc片段，产生了如由CE-SDS观察到的在第一个GlcNAc残基后定量去糖基化的蛋白质(图4a)。MALDI-TOF MS分析显示，通过组合这两种酶，释放了杂交等分结构(m/z＝1460)(图4b)。为了证实不存在与具有或不具有a-连接岩藻糖残基的N-乙酰葡糖胺连接的其他糖类，用PNGase F温育抗体C的经Endo S和Endo H处理的Fc片段。该处理后没有获得MALDI TOF谱，表明没有剩下可以受Endo S或Endo H切割的其他糖类(数据未显示)。
在Fc制剂中测定岩藻糖分布
为了定量连接于与Fc连接的N-乙酰葡糖胺残基的岩藻糖的分布，进行ESI-MS分析。在用Endo S和Endo H温育之后，通过亲和层析分离之前，将抗体A、B和C的Fc区(由纤溶酶消化产生)用羧肽酶B处理，以去除由C端赖氨酸引入的异质性。
ESI-MS谱显示，在EndoS/EndoH处理后，具有与残留的GlcNAc连接的两个、一个或没有岩藻糖的Fc片段仍与蛋白质连接(图5)。为研究的三种不同的IgG A、B和C总结了这三种岩藻糖种类的分布(计算为m/z谱中峰面积总和的相对比率)。这些结果与由MALDI-TOF MS测定的岩藻糖含量良好相关(表3)。
表3.通过质谱为抗体A、B和C的Fc片段测定的a-岩藻糖基化程度的比较
完整IgG的去糖基化
对于通过用Endo S和Endo H组合处理完整IgG的去糖基化，需要优化切割条件。用于去糖基化Fc片段的具有1∶20的Endo S与IgG的摩尔比率的去糖基化不足以去糖基化完整IgG。增加Endo S的浓度至1∶7的摩尔比率足以得到均一的去糖基化物质，所述均一的去糖基化物质仅在由CE-SDS观察到的a-连接的岩藻糖含量中不同(图6a)。MALDI-TOF分析显示，通过用Endo S和Endo H组合处理释放了糖类(图6b)。使用该方法，可以在不单独产生Fc片段的情况下，分析每一IgG的岩藻糖的分配。
测定完整IgG的岩藻糖分布
使用野生型抗体A(2.12％a-岩藻糖基化)和糖基化改造的抗体D(85.0％a-岩藻糖基化)，对与完整IgG的N-连接聚糖的最内部N-乙酰葡糖胺残基连接的岩藻糖的分布进行定量。用Endo S和Endo H组合处理后，将两种IgG都用羧肽酶B温育，以去除由C端赖氨酸引入的异质性。随后通过亲和层析纯化抗体。
使用两种不同的方法测定每一IgG的核心岩藻糖的分配。由ESI-MS离线检测获得的m/z谱的模式显示，EndoS/EndoH处理后，具有两个、一个或没有岩藻糖连接残留的GlcNAc的IgG种(图8)。为研究的两种不同的IgG A和D总结了这三种岩藻糖种类的分布(计算为m/z谱中峰面积总和的相对比率)(表4)。
还进行了LC-MS分析，以测定每一IgG岩藻糖的分配(图9)。对于两种IgG，如在ESI-MS离线检测中所观察，m/z谱显示出具有两个、一个或没有岩藻糖连接的种类的类似比率(表4)。低于5％的峰面积在用于完整IgG的方法的检测灵敏度中。未岩藻糖基化重链的比率显示于表4，列Non-fuc[％]中。
表4.通过抗体A和D的ESI-MS和LC-MS分析测定的a-岩藻糖基化程度和岩藻糖分配的比较

Claims (12)

1.用于检测糖基化抗体或其片段内存在或者不存在岩藻糖残基的方法，包括:
a)从蛋白质中酶促去除异质性糖残基,
b)从蛋白质中酶促去除其他异质性残基,
c)随后分析所述蛋白质，
所述步骤a)的去除通过Endo S和Endo H进行。
2.权利要求1的方法，其中步骤c)额外包括分析之前的纯化步骤。
3.权利要求1或2的方法，其中测定了抗体制剂内分子之间岩藻糖残基的数量及其分布模式。
4.权利要求1或2的方法，其中测定了抗体制剂中每一Fc分子的岩藻糖残基的分布。
5.权利要求1或2的方法，其中所述步骤b)的去除通过纤溶酶和/或羧肽酶B进行。
6.权利要求1或2的方法，其中所述步骤c)的分析包括LC-MS分析、CE-SDS MW分析或者ESI-MS分析。
7.用于检测糖基化抗体或其片段内存在或者不存在岩藻糖残基的方法，包括
a)提供抗体制剂，
b)用Endo H和Endo S从抗体或Fc片段中去除全部异质性糖残基，
c)用羧肽酶B从所述抗体或Fc片段中去除C端赖氨酸残基，
d)通过LC-MS分析、ESI-MS或者CE-SDS MW分析，分析所述抗体或者Fc片段。
8.权利要求7的方法，其还包括步骤a)和b)之间的步骤a1):分离该抗体制剂的Fc片段部分。
9.权利要求7或8的方法，其中步骤d)额外包括分析之前的纯化步骤。
10.权利要求1-9中任一项的方法的用途，用于测定在发酵期间在抗体制剂中协同的岩藻糖基化。
11.用于定性和定量检测肽内岩藻糖残基的试剂盒，其包含Endo S和Endo H、纤溶酶和/或羧肽酶B、给出根据权利要求1-9中任一项所述方法的步骤的说明，以及用于试剂盒的内含物的容器。
12.Endo S用于在根据权利要求1－9任一项的用于检测糖基化抗体或其片段内存在或者不存在岩藻糖残基的方法中从糖蛋白中切割复合型寡糖的用途。
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