CN101268372A

CN101268372A - 与fc受体结合的抗体药物的药效测定

Info

Publication number: CN101268372A
Application number: CNA200680034421XA
Authority: CN
Inventors: C·E·G·哈夫尼思; T·文克; P·范伯克尔; P·帕伦
Original assignee: Genmab AS
Current assignee: Genmab AS
Priority date: 2005-07-21
Filing date: 2006-07-21
Publication date: 2008-09-17
Also published as: ZA200801154B

Abstract

本发明涉及一种鉴定抗体的方法，该方法适于用作包含抗体的药物组合物批签发的药效测定法，尤其适用于所述药物组合物上市许可的申请。所提供的测定法是一种测定含有FcR结合肽药品药效的方法，其中药品FcR结合肽的至少一种作用机制是通过药品FcR结合肽与Fc受体的结合介导，其中上述方法包括测定药品FcR结合肽与Fc受体的结合。

Description

与FC受体结合的抗体药物的药效测定

发明领域

本发明涉及到一种鉴定抗体的方法，该方法适于用作包含抗体的药物组合物批签发的药效测定方法，尤其适用于申请上述药物的上市许可。

发明背景

当生产一种药物组合物时，仅把原料药制成药品是不够的，得到使用该药物组合物国家的药物监管机构的批准也很重要。美国的监管机构是美国食品药品监督管理局(FDA)(http://www.fda.gov/)。欧洲例如欧洲药品监管局(EMEA)(http://www.emea.eu.int/)。

评审过程受到严格控制，为了获得批准，监管机构要求药物研发人员递交大量药物相关信息。这可能包括关于药品药效及其测定方法的信息。

这些药效测定可以鉴定该药品、监测批次之间的均一性并且确保药物的稳定性，因此这些测定方法应该足够灵敏，可以检测出影响药品机制与功能的差异，并因此具有潜的临床重要性。另外，药效测定方法与公认的该药品生理/药理活性具有密切的关系。

一种适当的药效测定方法应该满足以下基本标准：

-能再产品规格内测定药效

-具有检测潜在临床重要性差异的高灵敏度

-与该产品公认的生理/药理活性的作用机制具有密切联系

根据以上基本标准选定的药效测定方法也要满足以下二级标准：

-体外和体内测定变异性足够低(达到所需精密度以保证药品规格)

-具有足够的稳定性(robustness)

-可应用于高通量分析

重组单克隆抗体制备技术的发展促进了大量针对疾病靶的单克隆抗体治疗用途的研究。全球已有数个单克隆抗体药物被批准投放市场或正在进行临床研究。一种抗体作为药物的疗效取决于该抗体结合抗原的能力，但常常抗体F_C介导的活性在作用机制中也起着重要作用。确实，尽管一些抗体药物只是通过该抗体结合抗原从而阻断配体与抗原的结合，但是某些抗体药物的作用可能还依赖于效应器功能，例如F_C受体的结合作用和/或补体激活的诱导作用。

扎木单抗(zanolimumab)(也称为HuMax-CD4)是一种完全人源单克隆抗体，它具有一条IgG1重链和一条靶向于人CD4(EP0854917)的kappa型(IgG1κ)的轻链。在哺乳细胞(CHO)中生产扎木单抗并经亲和、离子交换和分子排阻纯化。扎木单抗药品是将该药物以20mg/ml溶解在pH7.4磷酸盐缓冲盐水中制备而成。扎木单抗的作用机制之一是消除和/或灭活CD4⁺T细胞。这些可能通过(例如抗体)依赖的细胞介导细胞毒作用、下调T细胞表面的CD4表达和/或干扰CD4信号传导、T细胞激活和T细胞增殖完成。所有这些类型的作用机制均依赖于位于F_ab片段的扎木单抗抗原结合部分对CD4抗原的结合。另外，ADCC和CD4下调需要扎木单抗的F_C区域与F_C受体结合。ADCC诱导已被确认为扎木单抗一个重要的作用机制。

Zalutumumab(也称为HuMax-EGFr)是靶向于人EGFr的人源抗体，它有一条IgG1同型重链和一条kappa型(IgG1κ)(WO02/100348)轻链。目前Zalutumumab在哺乳细胞(CHO)悬浮培养物中生产，使用GS载体系统表达Zalutumumab并用亲和层析、离子交换(包括特异性病毒灭活和去除步骤)纯化制得。药品Zaltumumab(20mg/ml)是将该药物以25mg/ml Zaltumumab稀释在含有50mM磷酸钠、50mM氯化钠、3％(w/v)甘露醇、0.02％(w/v)聚山梨醇酯80和0.01％(w/v)EDTA的缓冲液中，并将pH调至6.0。在小鼠中少量HuMax-EGFr受体结合率也可观察到抗肿瘤效果，这很可能是由于免疫效应器机制尤其是ADCC的参与。所以，HuMax-EGFr的作用机制之一ADCC是通过F_C-F_CR相互作用发挥的。

Fc结合Fc受体的抗体药效起着重要作用，因为通常使用生物测定来判断该作用机制，其中被检测的作用取决于Fc-Fc受体的结合。这些测定包括ADCC，需要抗体交联的T细胞激活诱导或抑制，或对产生细胞因子例如白细胞介素2(IL-2)的诱导或抑制。然而，这些测定是相对繁琐的并且变异性高，这是由细胞培养物或原代细胞的预期变异造成的。尤其适原代细胞会引起变异性这是由供体的免疫状态、表达基因的多态性和细胞型纯度的差异引起的。因此这些生物测定法不是最优选的测定批签发的方法。因此我们需要一种快速、高效和灵敏的药效测定方法，该方法与该抗体药品的作用机制和公认的生理/药理活性密切相关，该抗体药品用于药物组合物生产尤其是包含抗体的药物成份并且其作用机制依赖于与Fc受体的结合。

发明概述

本发明提供一种包含FcR结合肽的药品的药效测定方法，其中，药品FcR结合肽至少有一种作用机制是通过药品FcR结合肽与Fc受体结合而介导，其中上述方法包括对药品FcR结合肽与Fc受体结合的测定。

附图简述

图1：扎木单抗批产品非还原SDS-PAGE。MEV001、MEV005、MRS-CD4-001、BN078和BO118是具有不同重链糖基化的扎木单抗批产品。UNG-MRS-CD4是一个脱糖基化扎木单抗批产品(缺乏结合于抗体Fc Asn297的糖类)，MOCK-MRS-CD4是一个伪脱糖基批产品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4为混合批产品，分别为90％重链糖基化和50％重链糖基化(脱糖基化和完全糖基化参比批产品的混合物)。

图2：扎木单抗批产品还原SDS-PAGE。MEV001、MEV004、MEV005、MRS-CD4-001、BN078和BO118是具有不同重链糖基化的扎木单抗批产品。UNG-MRS-CD4是一个脱糖基化扎木单抗批产品(缺乏结合于抗体Fc Asn297的糖类)，MOCK-MRS-CD4是一个伪脱糖基化批产品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4为混合批产品，分别为90％重链糖基化和50％重链糖基化(脱糖基化和完全糖基化参比批产品的混合物)。

图3：扎木单抗批产品诱导ADCC的能力。图3显示了相对于参比批产品MRS-CD4-001的相对活性(源于基线(botom)固定曲线的EC50值)和95％置信区间的几何均数。

图4：脱糖基化混合批产品诱导ADCC的能力。参比批产品MRS-CD4-001、伪脱糖基化批产品MOCK-MRS-CD4和混合批产品(脱糖基化和糖基化GMP#3批产品的混合物)M50-GMP#3-CD4(50％脱糖基化GMP#3)、M70-GMP#3-CD4(30％脱糖基化GMP#3)和M90-GMP#3-CD4(10％脱糖基化GMP#3)。3组实验(或见表格2)中一个代表性实验的结果显示了在一定浓度(部分)脱糖基化批产品(单一数据点)存在下CD4+T细胞的特异性溶解。图4A：将基线设定为一个固定值采用4参数对数拟合进行曲线拟合。图4B：限定基底水平、顶点水平和坡度，采用4参数对数拟合进行曲线拟合。GMP#3是专利批产品。

图5：扎木单抗批产品与板结合的FcγRIIIaECD176Vhis的结合。图5显示了相对于参比批产品MRS-CD4-001的相对药效和95％置信区间的几何均数。MEV001、MEV005、BN078和BO118是具有不同重链糖基化的扎木单抗批产品。MOCK-MRS-CD4是一个伪脱糖基化批产品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4为混合批产品(脱糖基化和完全糖基化参比批产品的混合物)，分别为90％重链糖基化和50％重链糖基化的。

图6：扎木单抗脱糖基化混合批产品与板结合的FcγRIIIaECD176Vhis的结合。参比批产品为MRS-CD4-001，MOCK-MRS-CD4是一个伪脱糖基化批产品，M50-GMP#3-CD4、M70-GMP#3-CD4和M90-GMP#3是混合批产品(脱糖基化和糖基化GMP#3批产品的混合物)。2组实验(也见表格3的数据)中一个代表性实验的结果显示了在一定浓度(部分)脱糖基化批产品(三重测定数据点)存在下与FcγRIIIaECD176V的结合情况。限定基底水平、顶点水平和坡度，采用4参数对数拟合进行曲线拟合。GMP#3是专利批产品。

图7：扎木单抗批产品的重链糖基化和与FcγRIIIaECD176VHis结合能力的关系。图6和表格3描述的批产品(从左到右)根据它们的重链糖基化含量分类。结果显示了相对于母体批产品GMP#3与FcγRIIIaECD176Vhis结合的相对药效(2组实验的平均值±SD)。

图8：扎木单抗批产品诱导ADCC能力与结合FcγRIIIaECD176VHis的关系。表2描述扎木单抗批产品诱导ADCC的相对药效。图6和表3显示了扎木单抗批产品结合FcγRIIIaECD176VHis的相对药效，以x-轴和y-轴绘制(相对于母体GMP#3的药效)。相关系数见曲线图。

图9：扎木单抗批产品与板结合的CD4的结合。图9显示了相对于参比批产品MRS-CD4-001的相对药效和95％置信区间的几何均数。MEV001、MEV005、BN078和BO118是具有不同重链糖基化的扎木单抗批产品，UNG-MRS-CD4是未糖基化的扎木单抗批产品，MOCK-MRS-CD4是一个伪脱糖基化批产品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4为混合批产品，分别为90％重链糖基化和50％重链糖基化(脱糖基化和完全糖基化参比批产品的混合物)。

图10：扎木单抗脱糖基化混合批产品与板结合的CD4的结合。参比批产品为MRS-CD4-001，MOCK-MRS-CD4是一个伪脱糖基化批产品，混合批产品(脱糖基化和糖基化GMP#3批产品的混合物)M50-GMP#3-CD4(50％脱糖基化GMP#3)，M70-GMP#3-CD4(30％脱糖基化GMP#3)和M90-GMP#3(10％脱糖基化GMP#3)。2组实验(也见表格3的数据)中一个代表性实验的结果显示了在一定浓度(部分)脱糖基化批产品(一式三份测定数据点)存在下与CD4的结合情况。限定基底水平、顶点水平和坡度，采用4参数对数拟合进行曲线拟合。GMP#3是专利批产品。

图11：扎木单抗抑制IL-2产生的能力。MEV001、MEV005、MRS-CD4-001、BN078和BO118是具有不同重链糖基化的扎木单抗批产品，MOCK-MRS-CD4是一个伪脱糖基化批产品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4为混合批产品，分别为90％重链糖基化和50％重链糖基化(脱糖基化和完全糖基化参比批产品的混合物)。

图12：通过基于AlphaScreenTM的测定进行对数个扎木单抗批产品FcγRIIIaECD176VHis结合和CD4结合的筛选。图12显示了相对于参比批产品MRS-CD4-001的相对药效和95％置信区间的几何均数。MEV005、BN078和BO118是具有不同重链糖基化的扎木单抗批产品，UNG-MRS-CD4是未糖基化的扎木单抗批产品，MOCK-MRS-CD4是一个伪脱糖基化批产品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4为混合批产品，分别为90％重链糖基化和50％重链糖基化(脱糖基化和完全糖基化参比批产品的混合物)。

图13：扎木单抗结合细胞结合型FcγRI的能力。图13显示了相对于参比批产品MRS-CD4-001的相对药效和95％置信区间的几何均数。MEV005、BN078和BO118是具有不同重链糖基化的扎木单抗批产品，UNG-MRS-CD4是未糖基化的扎木单抗批产品，MOCK-MRS-CD4是一个伪脱糖基化批产品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4为混合批产品，分别为90％重链糖基化和50％重链糖基化(脱糖基化和完全糖基化参比批产品的混合物)。

图14：扎木单抗与板结合的FcγRI的结合能力。图14显示了相对于参比批产品MRS-CD4-001的相对药效和95％置信区间的几何均数。MEV001、MEV005、BN078和BO118是具有不同重链糖基化的扎木单抗批产品，UNG-MRS-CD4是未糖基化的扎木单抗批产品，MOCK-MRS-CD4是一个伪脱糖基化批产品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4为混合批产品，分别为90％重链糖基化和50％重链糖基化(脱糖基化和完全糖基化参比批产品的混合物)。

图15：数个检测中扎木单抗批产品诱导ADCC的能力与相关药效的关系。将扎木单抗批产品根据重链糖基化水平和与数个所列检测结果的相关性进行分类。15A：ADCC测定(图3)。15B：CD4结合测定(图9)。15C：FcγRI结合测定(图13和14)。15D：FcγRIIIaECD176VHis结合(图5)。15E：sCD4和FcγRIIIaECD176VHis结合(图12)。

图16：在板结合的γRIIIaECD176VHis ELISA中比较两种FcγRIIIaECD176Vhis来源的CHO-K1SV Fc。将两种不同的FcγRIIIaECD176VHis批产品(646-005-EP和655-015-EP)包被到板上并比较这些批产品与HuMax-CD4的结合情况。

图17：如实施例18中描述的FcγRIIIaECD176VHis批产品646-005-EP和655-015-EP的非变性电泳。

图18：未处理和脱糖基化FcγRIIIa176V的还原4-10％NupageBis-Tris分析。泳道1：未处理FcγRIIIaECD176VHis批产品646-005-EP；泳道2：脱糖基化FcγRIIIaECD176VHis批产品646-005-EP；泳道3：未处理FcγRIIIaECD176VHis批产品655-015-EP；泳道4；脱糖基化FcγRIIIaECD176VHis批产品655-015-EP。Markers(kDa)的迁移情况显示在左边泳道。

图19：未处理和去唾液酸化FcγRIIIaECD176VHis的还原4-10％Nupage Bis-Tris分析。泳道1：未处理FcγRIIIaECD176VHis批产品655-015-EP；泳道2：去唾液酸化FcγRIIIaECD176VHis批产品403-041-EP。Markers(kDa)的迁移情况显示在左边泳道。

图20：未处理和去唾液酸化FcγRIIIaECD176FHis的非还原电泳。泳道1：去唾液酸化FcγRIIIaECD176VHis批产品655-015-EP；泳道2：未处理FcγRIIIaECD176VHis批产品403-041-EP。指示markers(kDa)的迁移情况显示在左边泳道。

图21：在板结合的FcγRIIIaECD176Vhis结合ELISA中比较去唾液酸化和未处理的FcγRIIIaECD176VHis。将相同浓度的去唾液酸化FcγRIIIaECD176VHis(批产品403-041-EP)和未处理FcγRIIIaECD176VHis(655-015-EP)包被到板上并比较扎木单抗与这些批产品的结合情况。

图22：比较去唾液酸化和未处理FcγRIIIa176V的包被效率。将去唾液酸化和未处理FcγRIIIa176V的系列稀释物包被到板上，用鼠-抗-CD16检测结合受体。

图23：图23显示了抗体HuMax-EGFr的两个批次产品与FcγRIIIaECD176VHis的结合曲线(数据以平均值±SD表示，n＝3)，用抗体直接(A)(上组)包被或经过his-捕获(抗-多聚组氨酸)抗体(B)(下组)包被FcγRIIIaECD176VHis。

图24：扎木单抗下调CD4+T细胞的CD4表达。A-CD4表达的剂量-反应图，该表达在与可溶性扎木单抗温育(在存在或缺乏单核细胞，使用或不使用IFNγ的情况下)18个小时的纯化的血CD4+T细胞中进行。B-CD4表达的剂量反应图，该表达在与可溶性扎木单抗、扎木单抗的F(ab’)2片段或对照抗体HuMab-KLH在THP-1细胞存在或缺乏的情况温育18h的CD4+CEM-NKr细胞中进行。用非竞争抗-CD4抗体MT-477测定CD4表达。

图25：序列表

序列列表简述

SEQ ID No：1-FcγRIaECDHis

SEQ ID No：2-FcγRIIIaECD176VHis

SEQ ID No：3-FcγRIIIaECD176FHis

SEQ ID No：4-引物P1

SEQ ID No：5-引物P2

SEQ ID No：6-引物P3

SEQ ID No：7-引物P4

SEQ ID No：8-引物P5

SEQ ID No：9-引物P6

SEQ ID No：10-引物P7

SEQ ID No：11-引物P8

缩写列表

ADCC 抗体依赖的细胞毒性作用

CHO 中国仓鼠卵巢细胞

ELISA 酶联免疫吸附测定

F(ab’)₂ 抗体可变结构域的二聚体

Fc 抗体恒定区

FcR Fc受体

FcγRIa 免疫球蛋白γFc受体I-A

FcγRIaECDHis 含有C末端His6标签的FcγRIa胞外结构域

FcγRIIIa 免疫球蛋白γFc区受体III-A

FcγRIIIa176V FcγRIIIa的176位是Val，从成熟、加工过的蛋白开始

编号，它也被称为FcγRIII158V

FcγRIIIaECD176FHis 具有C末端His6标签和176F多态性的FcγRIIIa细胞

外结构域

FcγRIIIaECD176VHis 具有C末端His6标签和176V多态性的FcγRIIIa细胞

外结构域

FcγRIII158V 见以上FcγRIIIa176V项下的内容

Fv 抗体可变结构域(抗原特异性)

IgG1，κ 含有kappa轻链的免疫球蛋白G

IL 白细胞介素

NK 自然杀伤细胞

PBMC 外周血单核细胞

PBS 磷酸盐缓冲盐水

PBSC 含2％(v/v)鸡血清的PBS

PBST 含0.05％(v/v)Tween-20的PBS

PBSTC 含0.05％(v/v)Tween-20和2％(v/v)鸡血清PBS

PMN 多型核细胞

RT 室温

RZPD Deutsches Resourcenzentrum für Genomforschung

SDS-PAGE SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

TNF 肿瘤坏死因子

发明详述

本发明提供一种适于作为药物组合物批签发的药效测定的方法，其中该药物组合物包含可以结合Fc受体Fc结合区的肽。在本申请中这些小肽也可被称为“Fc受体结合肽”或“FcR结合肽”。

本发明提供了一种包含FcR结合肽的药品的药效测定方法，其中，药品FcR结合肽至少有一种作用机制是通过药品FcR结合肽与Fc受体结合介导，其中上述方法包括测定药品FcR结合肽与Fc受体的结合。

除非另外声明或与申请相矛盾，本发明中的肽包括任何合适的肽，它们可以作为多肽和蛋白的同义词，条件是读者意识到每种含有各自的氨基酸多聚体的分子之间存在显著差异，因此形成本发明的单个实施方案(例如，一个由多条多肽链组成的抗体多肽显著不同于单链抗体、小肽免疫粘合素或单链免疫肽)。因此，本发明中的肽应该被广泛地理解为能结合Fc受体的任何适当大小和组成的任何合适地肽(就蛋白质分子的氨基酸数量和相关支链的数目而言)。另外，除非另外声明或与申请相矛盾，这里所描述地发明方法中的肽可能包含非天然产生和/或非L型氨基酸残基。

除非另外声明或与申请相矛盾，专利中的肽(如果作为多肽和/或蛋白的单个实施例讨论)也包含衍生肽分子。简单地说，本发明中的衍生物为一个或多个氨基酸残基被化学修饰(例如烷化、酰化、酯化或酰胺形成物)或与一个或多个非氨基酸的有机和/或无机原子或分子取代基(例如聚乙二醇(PEG)基团)、亲脂取代基(通过间隔区残基选择性地与肽的氨基酸序列或基团例如β-丙氨酸，γ-氨基丁酸(GABA)，L/D-谷氨酸，琥珀酸等相连)、荧光基团、生物素、放射性核素结合的肽，例如见专利US4766106，US4179337，US4495285和US4609546。除非另外声明或与申请相矛盾，一个FcR结合肽也可能包括或替代性地包括非必需、非天然和/或非L型氨基酸残基。这些氨基酸残基的非限制实例包括例如2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、锁链(赖氨)素、2，2′-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟赖酸、别羟脯氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、锁链(赖氨)素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、戊氨酸、己氨酸、鸟氨酸和他汀类卤代氨基酸。

因此本申请的FcR结合肽也包括融合蛋白，它可包含任何合适的氨基酸序列或组合序列，该序列能结合Fc受体的Fc结合区并且至少具有一个非同源性和典型的具有足够非相性的氨基酸序列，其中该序列具有一种可检测生物功能并且/或是融合蛋白特有的，这一特性不仅仅属于Fc受体特异序列(例如可能是这里描述的抗体)，例如体内半衰期的延长、荧光强度的增加、附加表位标签、对某类型细胞的靶向性增强等等。这些融合蛋白的功能序列可被柔性链接肽分隔开。二级序列也可来自细胞毒素或凋亡小肽。二级序列也可具有诊断特性。这些序列的实例包括那些来源于易显色的酶的序列，例如辣根过氧化物酶。

FcR结合肽也包括能结合Fc受体的Fc结合部分的肽，该肽与治疗实体缀合。例如，这样的治疗实体包括细胞毒素、化疗药物、免疫、抑制剂或放射性同位素。治疗实体不必限定为传统化学治疗药物，但可能也包括具有所需生物活性的蛋白或多肽。这些蛋白可能包括，例如，具有酶活的毒素或它的活性片段，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物反应修饰剂例如淋巴因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其它生长因子和分离自线粒体的凋亡诱导蛋白。它也可能是细胞表面具有活性的药物，例如具有磷脂酶活性的磷脂酶C。

FcR结合肽也包括与下列物质缀合的FcR结合肽；例如放射性同位素、放射性核素、酶(例如用于检测的酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖过氧化物酶等)、酶的催化底物、辅因子、荧光标记(例如荧光素、荧光异硫氰酸盐、碱性蕊香红、丹磺酰氯、镧磷和类似的物质等，还有¹²⁵Eu标记等、异硫氰酸盐标记、藻红蛋白标记、藻青蛋白标记、邻苯二醛标记或荧光胺标记或等)、化学发光标记(例如苯巴比妥标记、异苯巴比妥、芳香吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、荧光素标记、荧光素酶标记、水母发光蛋白标记等)、肽标签(例如可被第二报告基因识别的预定多肽表位，例如亮氨酸拉链配对序列、融合抗体的结合位点、金属结合结构域、抗原决定表位标签等)、磁性珠、核酸或核酸相关分子(例如核糖核酸酶、反义核酸、抑制RNA分子(例如siRNA分子)、适体、核糖酶、三联分子、外部引导序列、免疫抑制核酸、表达肿瘤抑制基因的表达盒、抗癌疫苗、抗癌细胞因子、凋亡因子或一个或多个细胞毒性蛋白)、核酸酶、激素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光敏试剂、染料等。

FcR结合肽也包括含有一个或多个放射标记氨基酸或自旋标记分子的FcR结合肽。多肽放射性标记的非限制性实例包括³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹²⁵I、¹³¹I和¹⁸⁶Re。

FcR结合肽也包括交联FcR结合肽衍生物。例如，交联衍生物可由两个或多个抗体交联产生，至少其中一个能结合到Fc受体的Fc结合区(同一种类型或不同类型，例如产生双特异性抗体)。

如果肽类似物能结合Fc受体的Fc结合区，本发明方法也能用于药效测定。因此这些肽类似物也包括在FcR结合肽中。

药品是含有治疗作用药物的组合物，将该组合物给予需要药物治疗的病人。在一个实施方案中，所述药品是含有抗体的药品，例如重组生产的抗体药物。对于重组抗体药物而言，重组抗体药物最初在宿主细胞中产生，经过重组DNA技术的细胞融合、收获、纯化抗体并配制成抗体药物。本技术领域众所周知生产抗体细胞类型的选择、修饰酶(例如糖类转移酶)的共转染和培养和/或工艺条件的不同可能影响所获得抗体的药效。重组肽的生产也同样。重组抗体的收获、纯化和配方方法在工艺上是已知的，可能包含一步或更多步骤例如净化、浓缩、过滤和色谱层析(例如分子排阻和离子交换层析)。除了药物以外，药品还包含任何数量的其他例如在纯化过程中添加的成份，这些成份应当是药用上可接受的，例如载体、稀释剂、佐剂和辅料。药用载体或稀释剂还有任何其他已知佐剂和辅料的实例都是本领域已知的，例如Remington(The Science and Practice of Pharmacy，19thEdition，Gennaro，Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1995)中公开的物质。

本发明的抗体指的是免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子片段或它们的衍生物，它们能在特定的生理条件下特异性地与抗原结合显著较长的时间，例如半衰期至少达到约30min，至少约45min，至少约1h，至少约2h，至少约4h，至少约8h，至少约12h，约24h或更多，约48h或更多，约3，4，5，6，7或更多天等或任何其他相关功能-确定期(例如足够诱导、促进、增强和/或调节与抗体结合抗原相关的生理反应的时间)和与Fc受体结合的能力。

免疫球蛋白指一类结构相关的糖蛋白，它包含两对多肽链，一对低分子量轻链(L)和一对重链(H)，通常这四条链由二硫键联接。免疫球蛋白结构已经被清楚地阐述，例如见《基础免疫学》第7章(Paul，W.，ed.，第2版，Raven出版社，纽约(1989))。简单地说，通常每条重链由一个重链可变区(这里简称为V_H)和一个重链恒定区组成。重链恒定区通常由三个结构域C_H1、C_H2和C_H3组成。每条轻链特通常由一个轻链可变区(这里简称为V_L)和一个轻链恒定区组成。轻链恒定区通常由一个结构域C_L组成。V_H和V_L进一步细分为高度可变区(或者是在序列上高度可变和/或形成结构限定环的高度可变区)，也称为互补决定区(CDRs)，与更保守的框架区(FRs)交替排列。

每个V_H和V_L通常由三个CDRs和四个FRs组成，从氨基端到羧基端按下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(见Chothia和Lesk的J.Mol.Biol.196，901-917(1987))。通常这个区域的氨基酸残基的编号是按照以下文献中的方法进行：Kabat等，《免疫学相关关蛋白序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)》，第5版，公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991)(在Kabat中或根据Kabat例如“可变结构域残基的编号”这样的术语指重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统)。使用这种编号系统，与缩短或插入可变结构域FR或CDR相对应，一个肽的实际线性氨基酸序列可能包含更少或额外氨基酸。例如，重链可变结构域可能包括V_H CDR2第52位氨基酸残基之后插入的单个氨基酸(根据Kabat命名为残基52a)和在重链FR氨基酸残基82之后插入的氨基酸(例如根据Kabat命名为残基82a，82b和82c等)。可以使用“标准”Kabat编号序列通过对该抗体同源序列区域进行调整来确定某一抗体的Kabat残基编号。

在一个抗体中，免疫球蛋白分子的重链、轻链可变区包含一个与抗原相互作用(Fv片段)的结合结构域。抗体的恒定区(Abs)可能介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括通过Fc受体和经典补体系统的第一补体(Clq)作用的各种免疫系统细胞(例如效应器细胞)。

本发明使用的抗体可能是双特异性抗体或类似的分子。确实，双特异性抗体和其类似物除了与原始抗原的一部分结合之外还可能与任何适当的靶点结合，只要它们保留了能与Fc受体结合的部分力。

如上所述，除非另外说明或与本申请内容相矛盾，这里的抗体包括保留了特异性结合抗原和Fc受体能力的一种抗体的片段、衍生物、变异体(包含缺失变异体)。此外，虽然Fv片段的两个结构域V_L和V_H是由两个独立的基因编码，但可以通过重组方法使用可以将他们连接成单个蛋白链的合成连接肽将这两个结构域是融合，在该蛋白中V_L和V_H配对形成单价分子(称作单链抗体或单链Fv(scFv)，见Bird等，Science 242，423-426(1988)和Huston等，PNAS USA 85，5879-5883(1988))。除非另外说明或与本申请内容相矛盾，这样的单链抗体也属于抗体范畴。单链抗体的其它形式例如专利WO2005037989中描述的分子也属于抗体范畴，它们共同并且独立地成为本发明地独特之处，显示出不同的生物特性和效用。

应当理解地是抗体也广泛地包括多抗、单抗、例如嵌合抗体、人源化抗体、人源抗体和抗体样多肽。抗体可以指特异性同型抗体，重链恒定区基因编码的一类免疫球蛋白例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM。每个同型抗体具有独特的氨基酸序列和具有一套可将它们彼此区别开来地的同型抗原表位。

一种抗体的疗效是通过抗体的高度可变区结合与抗原结合和抗体Fc区与Fc受体结合实现地。治疗用肽可能也通过与Fc受体结合发挥治疗作用。

Fc受体属于免疫球蛋白恒定区具有某些特定氨基酸的受体家族。每个细胞的受体表达情况依赖于受体类型。所有种类的免疫球蛋白受体已经被阐明。它们被称为FcγR(IgG类)、FcαR(IgA类)和FcεR(IgE类)。根据与IgG结合的亲和力和与IgG同型结合的相对亲和力已经鉴定出多种FcγRs；更多FcγR受体方面的信息见van Sorge NM等，Tissue Antigens.61(3)，189-202(2003)。本发明使用的Fc受体可能是全长Fc受体或保留了与Fc区结合能力的片段，如胞外结构域。本发明使用的Fc受体也可能是任何同种型免疫球蛋白或其突变体的野生型Fc受体，其功能与Fc受体的功能相关，Fc受体结合肽在体内与其结合。本发明使用的Fc受体也可能是一种肽，它可能不是天然Fc受体(或片段或其衍生物)，这种肽可以与抗体Fc部分的Fc受体结合区域结合，其中FcR结合肽与Fc结合肽的结合内Fc受体的功能相关，在体内FcR结合肽与其结合。

本发明使用的Fc受体可能如实施例部分描述的由宿主细胞瞬时表达产生或由稳定转染细胞系或该技术领域任何其它的已知方法生产。他们也可能存在于细胞表面，例如一种真核细胞，例如用表达具有穿膜结构域Fc受体核酸转染的酵母细胞或哺乳动物细胞。这里的“宿主细胞”(或重组“宿主细胞”)意指转入重组表达载体的细胞。应当理解的是这一术语不仅仅指特定受体细胞，也指这些细胞的子代。由于突变或环境影响后代细胞可能发生某些变异，这样的子代细胞可能不与母细胞完全相同，但仍属于这里使用的“宿主细胞”范畴。重组宿主细胞包括转染哺乳细胞，例如CHO细胞、NS/0细胞和淋巴细胞。

如这里所示，含有肽(取决于其募集表达Fc受体细胞的作用机制)的药品与Fc受体结合的能力与当将该肽药品给予需要的病人时的疗效密切相关。

一种药品的药效时在一种特异性检测中活性的量度，该检测与疗效已被检测的该药品的参比标准的活性相关。对于肽，(例如抗体)，尤其是通过与Fc受体结合发挥作用，依据本发明的某种方法适于测定肽药品药效，因为肽与Fc受体的结合直接指明了该肽的作用机制。因此使用本发明提供的方法能在不使用繁琐的测定方法的条件下测定FcR结合肽的药效，例如在测定IL-2的产生或ADCC的诱导作用时，对药效的测定是根据基于细胞检测的FcR结合肽与Fc受体的结合效果而测定的，本发明使用的方法仅通过测定FcR结合肽与Fc受体的结合作用来测定药效。

本发明也提供了包含FcR结合肽的药品的一种药效测定方法，本方法包括

i)测定参比标准FcR结合肽与Fc受体的结合作用；

ii)测定药品FcR结合肽与上述Fc受体的结合作用；和

iii)比较步骤ii)中的FcR结合与步骤i中的)FcR结合，使用比较得到的信息来评价药品药效。

其中

a)步骤ii)的Fc受体结合与步骤i)的Fc受体结合的测定方法相同，

b)药品FcR结合肽的至少有一种作用机制是通过FcR结合肽与Fc受体结合来介导，

c)其中参比标准FcR结合肽和药品FcR结合肽是相同FcR结合分子的两种不同制剂。

本方法适于分析不同批次特定FcR结合肽的生产。比较药品FcR结合肽与Fc受体的结合与参考标准FcR结合肽和Fc受体的结合，药品FcR结合肽的治疗效果是通过其具有与参考标准FcR结合肽相同的或类似程度的与Fc受体的结合能力来评价的。参考标准FcR结合肽的药效也可能通过使用其它方法检测，例如用基于细胞的方法或对IL-2产生的抑制，以确定参比标准FcR结合肽确实具有期望的治疗效果。根据本专利，参比标准FcR结合肽的FcR结合曲线适于指示该参比标准FcR结合肽核任何表现出与参比标准FcR结合肽相同的或大致相似的FcR结合曲线的任何FcR结合肽。药品FcR结合肽的FcR结合曲线与参比标准FcR结合肽的FcR结合的相异程度可以在个案的基础上确定，例如与适当的监管机构合作确定。

为了FcR结合测定方法的可靠性和一致性，药品FcR结合肽和参比标准FcR结合肽的FcR结合应该在同一个测定中进行，例如本文其它地方描述的测定方法。参比标准FcR结合肽的结合测定一般是先建立一个之后的任何FcR结合肽批产品都可以与之比较的标准。然而，参比标准FcR结合肽的结合测定也可能与药品FcR结合肽的FcR结合测定同时进行或之后进行。

本发明也提供了一种生产包含FcR结合肽的药物组合物的方法，该方法包括

a)生产包含所述FcR结合肽的药品

b)用上述方法测定包含FcR结合肽的药品的药效；

c)使用步骤b)获得的信息作为评价药品是否可以作为药物组合物来使用的部分评价依据。

药品生产可以用任何方法，包括所需要的和/或适于药品和/或相关小肽的方法。然后用检测药品肽与Fc受体结合的方法测定药品。上述方法的测定结果应作为药品是否可以作为药物组合物来使用的一个指标，例如，当需要注射药品时，该药品是否达到这一国家监管机构设定可以注射给病人的标准。

本发明也提供上述方法，其中上述方法是作为将某种药品作为药物组分销售时进行上市许可申请中的一部分。

本发明也提供一种申请包含FcR结合肽的药品的上市许可的方法，该方法包括对上述测定药品FcR结合肽药效的方法进行描述。

在一个实施方案中，根据本发明对包含FcR结合肽的药品进行的药效测定用于批签发的药效测定。

对药品的连续生产可以得到不同批次的作为药品的产品。生产的一个关键特征是确保不同批次药品达到相同标准。通常这个标准一般与监管机构协作设定。一般对每批产品都进行检测并用足够数量的不同检测方法检验来确保该批产品质量足以被批准上市。这些检测方法之一可能是，而且经常是测定药品是否达到要求的药效药效测定。对于由重组肽组成的药品，例如重组抗体，它们的药效常依赖于重组生产肽的质量。对于通过与Fc受体结合介导其作用的抗体，该抗体在这方面的质量常依赖于抗体Fc部分的糖基化程度。然而，测定抗体Fc部分糖基化方法和其它已知的直接或间接的药效测定方法都非常繁琐或在生产过程中不能稳定地有效可信地利用，例如测定药品激发ADCC能力的方法或测定T细胞信号传导的方法(例如测定活化标记物的上调和/或自分泌因子的增殖和产生)。然而，如其它部分所述，本发明提供的方法适合用于测定抗体药品的药效，因此适合用于批签发的药效测定。

在一个实施方案中，FcR结合肽与Fc受体的结合用以下方法来测定

(i)使药品样品与Fc受体接触足够长时间使FcR结合肽与Fc受体结合

(ii)检测FcR结合肽与Fc受体结合的数量

在进一步的实施方案中，使用定向于FcR结合肽的检测抗体来检测，其中，检测抗体是标记抗体。

在一个实施方案中，用ELISA(酶联免疫吸附测定)检测FcR结合肽((例如抗体))与Fc受体的结合，见Margulies D.H.199.Induction of immune responses.In Current Protocols in Immunology(Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.，Margulies，D.H.，Shevach，E.M.，Strober，W.，eds.pp 2.1.2-2.1.20John Wiley & Sons，New York)。

在一个实施方案中，用AlphaScreen^TM测定FcR结合肽((例如抗体))与Fc受体的结合。简单地说，用受体珠固定FcR蛋白，用供体珠包被相关抗原(例如sCD4)。可以使用不同包被系统，受体珠和供体珠可以互换。受体珠和供体珠大小接近(约＜200nm)以使被检测抗体与Fc受体和抗原生物性结合。在680nm处激发时供体珠的光敏剂将环境氧(ambient oxygen)转换为单线态。单线态氧分子扩散出与受体珠上的二甲基噻吩衍生物反应形成化学发光。化学发光活化受体珠上的荧光基团，在520nm-620nm处产生光辐射。

(http://www.perkinelmer.co.jp/tech/tech_ls/protocol_collection/asc-0 01.pdf)。

在一个实施方案中，使用放射免疫测定FcR结合肽((例如抗体))与Fc受体的结合(Cooper，H.M.，and Paterson，Y.Determination of thespecific antibody titer.In Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G，Smith，J.A，and Struhl，K，eds.)pp11.17.1-11.17.13John Wiley & Sons，New York，1993)。

在一个实施方案中，使用BIAcore测定FcR结合肽((例如抗体))与Fc受体的结合。BIAcore的工作原理是表面等离子体共振(surfaceplasmon resonance，SPR)，它使得能够测定表面折光指数的变化。简单地说，将一种相互作用剂(配体例如Fc受体)固定于感受器芯片的表面。使含有潜在结合配偶体的溶液(药品抗体)通过固定化的表面，可以通过表面折光指数随时间的变化观查结合情况(反应单位(RU))(D.G.Myszka and R.L.Rich，Implementing surface plasmonresonance biosensors in drug discovery，Pharm.Sci.Technol.Today 3，310-317(2000)。在一个实施方案中，使用Akubio声学生物感受器测定FcR结合肽((例如抗体))与Fc受体的结合(更多信息见www.akubio.com/)。

在一个实施方案中，使用FMAT测定FcR结合肽((例如抗体))与Fc受体的结合，例如FLISA(荧光连接免疫吸附测定)。简单地说，用珠固定FcR蛋白(例如含有生物素化FcR的抗生物素蛋白链菌素珠)，再加入抗体，用Cy5缀合抗IgG检测，用FMAT读出数据。可以使用不同的包被和检测系统(Miraglia，S.et al，J Biomol Screen.4，193-204(1999)。

在一个实施方案中，用DELFIA测定FcR结合肽((例如抗体))与Fc受体的结合。简而言之，在DELFIA测定中，DELFIA也称作时间-分辨(time-resolved)荧光免疫测定，将抗体(例如使用抗人IgG)结合在微量滴定板上，通过加入生物素化FcR测定FcR结合，例如用Eu-(铕)标记地抗生物素蛋白链菌素检测。在用Delfia Fluorometer例如VICTOR仪器计数前用强化溶液进行强化。VICTOR仪器采用非常广泛的技术包括荧光、发光、时间-分辨荧光、荧光极化和UV吸收对蛋白进行直接定量。可以使用多种选择和组合。VICTOR3多标记微量板读数器用于定量测定细胞和微生物学测定、结合研究和DELFIA测定中的光发射或光吸收标记

(http://www.gmi-inc.com/BioTechLab/Wallac％20Delfia％201234％ 20Fluorometer.htm)。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽((例如抗体))的一种作用机制是诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。ADCC是一个免疫反应，其中FcR结合肽((例如抗体))通过包被靶细胞，使它们易于被包括但不限于NK细胞、PMN或单细胞/巨噬细胞的免疫细胞诱导裂解。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽((例如抗体))的一种作用机制是通过例如内化、脱落，加帽或其它形式的可以影响FcR交联地改变细胞表面上的受体重排诱导下调靶受体的表达。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽((例如抗体))的一种作用机制是通过募集自然杀伤细胞的介导来调节。自然杀伤细胞(NK细胞)是对抗反应和消灭另一种细胞的细胞，对该细胞没有预先致敏作用，在某些下可能不必识别特异抗原。然而，NK细胞可能也通过抗体Fc区被活化来诱导ADCC，Fc区的抗原结合结构域于细胞表面的抗体结合。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的作用机制是通过NK细胞诱导ADCC起作用的。

在本发明的一个实施方案中，至少有一个与药品FcR结合肽(例如抗体)结合的Fc受体在NK细胞上表达。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一个作用机制是通过募集多形核白细胞(PMN)介导。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一个作用机制是通过经PMNs诱导ADCC介导。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一个作用机制是通过PMN脱粒诱导调节的。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一个作用机制是通过经PMN诱导的吞噬作用介导。

在本发明的一个实施方案中，至少有一个在体内与药品FcR结合肽(例如抗体)结合的Fc受体在PMNs上表达。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的作用机制是诱导血小板的聚集。

在本发明的一个实施方案中，FcR结合肽的作用机制是通过募集血小板介导。

在本发明的一个实施方案中，至少有一个在体内与药品FcR结合肽(例如抗体)结合Fc的受体在血小板上表达。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是诱导细胞因子的产生。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的治疗活性是通过募集自然杀伤细胞和/或T细胞介导的。

在本发明的一个实施方案中，至少有一种在体内与药品FcR结合肽(例如抗体)结合Fc的受体在自然杀伤细胞和/或T细胞中表达。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是通过诱导免疫负荷物的清除。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是通过募集单核细胞或巨噬细胞来介导。

在本发明的一个实施方案中，至少有一种与药品FcR结合肽(例如抗体)在体内结合的Fc受体在单细胞或巨噬细胞上表达。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是诱导抗体应答的下调。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是通过募集B细胞介导。

在本发明的一个实施方案中，至少有一个与药品FcR结合肽(例如抗体)在体内体内结合的Fc受体在B细胞上表达。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是诱导单核细胞和巨噬细胞效应器功能的抑制。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是通过募集单核细胞和/或巨噬细胞调节的。

在本发明的一个实施方案中，至少有一种在体内与药品FcR结合肽(例如抗体)结合的Fc受体在单细胞或巨噬细胞上表达。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是通过诱导单核细胞或巨噬细胞的ADCC介导。

在本发明的一个实施方案中，至少有一种在体内与药品FcR结合肽(例如抗体)结合的Fc受体在单细胞和/或巨噬细胞上表达。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是诱导吞噬作用。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是通过募集多形核白细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞介导。

在本发明的一个实施方案中，至少有一个在体内与药品FcR结合肽(例如抗体)结合的Fc受体在多形核白细胞，巨噬细胞和/或树突状细胞上表达。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是通过单核细胞或巨噬细胞对吞噬作用的诱导来调节的。

在本发明的一个实施方案中，至少有一种在体内与药品FcR结合肽(例如抗体)结合的Fc受体在单核细胞或巨噬细胞上表达。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一个作用机制是诱导交联。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一个作用机制是通过细胞和/或抗体的交联作用来介导。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一个作用机制是诱导免疫受体基于酪氨酸的活化基序的正向信号传导。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一个作用机制是通过募集骨髓细胞、T细胞和/或血小板介导。

在本发明的一个实施方案中，至少有一种与药品FcR结合肽(例如抗体)在体内结合的Fc受体在骨髓细胞，T细胞和/或血小板上表达。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是诱导经普通γ，β，ζ链的正向信号传导。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是通过募集骨髓瘤细胞，多形核单细胞，自然杀伤细胞或T细胞介导。

在本发明的一个实施方案中，至少有一种在体内与药品FcR结合肽(例如抗体)结合的Fc受体在骨髓瘤细胞，多形核细胞，自然杀伤细胞或T细胞上表达。

在本发明的一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是诱导免疫受体基于酪氨酸的抑制基序的反向信号传导。

在一个实施方案中，药品FcR结合肽(例如抗体)的一种作用机制是通过募集B细胞、巨噬细胞和/或单核细胞介导。

在一个实施方案中，至少有一种与药品FcR结合肽(例如抗体)在体内结合的Fc受体在B细胞、巨噬细胞和/或单核细胞上表达。

在一个实施方案中，Fc受体是FcγRIa受体或及其保留与Fc区域

结合能力的片段，例如胞外结构域。网状内皮系统和单核巨噬细胞包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞组成性地表达FcγRIa受体，多形核中性白细胞能诱导FcγRIa受体的表达。

在一个实施方案中，Fc受体是FcγRIIa受体或及其保留与Fc区域结合能力的片段，如胞外结构域。FcγRIIa受体是数个已知的FcγRIIa受体的亚型之一，FcγRIIa是分布最广泛的同型受体，它几乎表达在所有骨髓瘤细胞上包括血小板。

在一个实施方案中，Fc受体是FcγRIIb受体或及其保留了与Fc区域结合能力的片段，例如胞外结构域。FcγRIIb受体的表达限制于巨噬细胞和B细胞上。

在一个实施方案中，Fc受体是FcγRIIc受体或及其保留了与Fc区域结合能力的片段，例如胞外结构域。FcγRIIc受体表达在NK细胞上。

在一个实施方案中，Fc受体是FcγRIIIa受体或及其保留了与Fc区域结合能力的片段，例如胞外结构域。在进一步的实施方案中，FcγRIII受体是一种FcγRIIIa176V受体或及其保留了与Fc区域结合能力的片段，例如胞外结构域。FcγRIIIa受体是两个已知的FcγRIII受体的亚型之一。FcγRIIIa存在于单核细胞、巨噬细胞、NK细胞和γ/δT细胞上。FcγRIIIa在176位存在遗传多态性(Phe或Val)。这种变异体FcγRIIIa176V(也称为FcγRIII158V，从成熟，加工蛋白的预期起点编号)见Koene HR等.，Blood 90，1109-1114(1997)和Wu J，等.，JClin Invest.100，1059-1070(1997)。

在一个实施方案中，Fc受体是FcγRIIIb NA1受体或及其保留了与Fc区域结合能力的片段例如胞外结构域。在一个实施方案中，Fc受体是FcγRIIIb NA2受体或及其保留了与Fc区域结合能力的片段例如胞外结构域。中性白细胞和嗜酸性粒细胞组成性地表达FcγRIIIb受体。

在一个实施方案中，Fc受体是FcγRn受体或及其保留了与Fc区域结合能力的片段例如胞外结构域。FcγRn受体广泛地分布表达在内皮细胞上。

在本发明的一个实施方案中，依据发明的方法中应用的Fc受体是由一种制备方法制备得到的，该制备方法中包括的制备步骤可以得到与不包含这一步骤的制备方法制备得到的类似Fc受体相比N连接糖基化上的唾液酸减少的Fc受体。

可用多种方法进行脱唾液酸化。例如该Fc受体可以由唾液酸化机制缺陷的宿主细胞重组表达制备。在这种唾液酸缺陷细胞进行多肽表达(一般具有一定程度唾液酸糖基化)可以得到比同种类型的非唾液酸化缺陷细胞(非缺陷唾液酸化机制细胞)产生的多肽N连接糖基化上唾液酸更少的多肽产品。唾液酸缺陷细胞实例包括例如唾液酸转移酶缺陷表达细胞(例如CHO Lec2细胞)、唾液酸化的受体单糖如半乳糖表达缺陷细胞(例如CHO Lec1和CHO Lec19细胞)或唾液酸合成酶例如UDP-GlcNAc-2差向异构酶表达缺陷的细胞(例如CHO Lec3细胞)。其它干扰技术例如RNAi也能用于产生与唾液酸合成相关酶表达缺陷(例如UDP-GlcNAc-2表异构酶)，唾液酸化本身缺陷(例如2，3-唾液酸转移酶或2，6-唾液酸转移酶)或含有唾液酸受体半乳糖(例如N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I)的复合型N连接多聚糖合成缺陷的细胞。这些技术已经用于多种细胞，包括SP2/0、CHO、BHK、HEK-293、NS0、JURKAT等。作为替代方法，细菌、酵母或真菌细胞也表达该蛋白，这些细胞不会在在N-连接多糖上添加入N-连接多糖(细菌)或唾液酸，例如真菌或酵母表达。

N-连接糖基化具有唾液酸的Fc受体，例如非唾液酸化缺陷细胞重组表达产生的，可以使用减少唾液酸含量的方法进行脱唾液酸化处理，例如是在使用上述方法前用唾液酸酶进行处理。这些唾液酸酶的实例例如来自Arhrobacter ureafaciens、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、Newcastle病病毒，Hitchner B1菌、肺炎链球菌或梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)的神经氨酸酶。这些酶可以从它们的内源性宿主菌或其它宿主例如大肠杆菌重组表达得到。受体在非唾液酸缺陷细胞中表达后例如在纯化前可以直接进行脱唾液酸处理。作为替代方法，可以在受体与用于纯化的树脂结合时或受体被纯化后进行脱唾液酸化处理。作为替代方法，含有唾液酸酶DNA序列的表达质粒可以与编码受体的表达质粒进行共转染，这种情况下转染细胞将分泌大量神经氨酸酶和受体，通过重组产生的唾液酸酶原位进行受体的脱唾液酸化。

非唾液酸化缺陷细胞重组表达的Fc受体也可以在纯化成含有唾液酸的流分和不含唾液酸的流分时被分离出来。分离过程可采用唾液酸特异性外源凝集素例如MAA(Maackia amurensis凝集素)和SNA(Sambucus nigra I agglutinin，接骨木花黑质凝集素)进行分离。分离中也可以采用阴离子交换色谱，例如DEAE琼脂糖、琼脂糖Q或Resource Q。

也可以通过培养表达受体的细胞和加入一种链烷酸例如专利WO 9639488中描述的丁酸钠到细胞培养物中进行Fc受体脱唾液酸化处理。

在本发明的一个实施方案中，FcR结合肽是一种抗体。

在本发明的一个实施方案中，FcR结合肽是一种单克隆抗体。

在本发明的一个实施方案中，抗体是一种双特异性二价抗体。

在本发明的一个实施方案中，抗体是至少含有一个Fc-结合部分的IgG-样分子。

这里使用的单克隆抗体指的是单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体组成显示特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”指的是表现出单一结合特异性的抗体，它们具有来自于人种系的免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单克隆抗体可以通过杂交瘤细胞产生，包括来自转基因或转染色体非人类动物例如转基因小鼠的B细胞，该细胞具有包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组并与无限增殖细胞融合。

在一个实施方案中，药品抗体是人源抗体。

这里使用的人源抗体意指包括具有来自于人种系免疫球蛋白序列可变区和恒定区的抗体。本发明的人源抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白基因序列编码的氨基酸残基(例如体外随机或定点突变或体内体细胞突变引入的突变)。然而，这里使用的术语“人源抗体”并不包括来自另一哺乳动物种系的CDR序列移植到人骨架序列的抗体。

如本专利所指，如果抗体来自使用人免疫球蛋白序列的体系，人源抗体就来自于特定的微生物种系序列，例如通过免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或通过筛选人免疫球蛋白基因库，其中所选择的人抗体的氨基酸序列至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％或至少99％与微生物V_L或V_H可变区域基因片段编码的氨基酸序列相同。通常来自于某种人种系的V_H或V_L可变区基因片段序列编码的氨基酸序列与微生物免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的差别不超过10个氨基酸，例如不超过5个，例如不超过4、3、2或1个氨基酸差异。

在一个实施方案中，药品抗体是人源化抗体。

人源化抗体是源自非人种的抗体，其中骨架区和重链轻链恒定区的某些氨基酸已被突变从而避免或消除人类的免疫反应。非人(例如鼠类)抗体的人源化形式含有源自非人免疫球蛋白的基本序列。人源化抗体大部分是人免疫球蛋白(接受抗体)，其中受体高变区氨基酸残基被替换成非人种系(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类的氨基酸残基，这些残基具有所需要的抗原结合特性例如特异性和亲和性。在一些例子中，人免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)氨基酸残基被替换成相应的非人源氨基酸残基。

另外，人源化抗体可能包括在受体抗体或供体抗体未种发现的氨基酸残基。这些修饰是为了进一步优化抗原结合能力。一般而言，人源化抗体总共含有至少一种，一般是两个可变结构域，其中所有的或几乎所有的高变环是非人源免疫球蛋白一致，所有或几乎所有的FR结构域是人免疫球蛋白序列。人源化抗体也可以至少含有已部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白上Fc区域。进一步的细节见Jones等.，Nature 321，522-525(1986)，Riechmann等.，Nature 332，323-329(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2，593-596(1992)。

人源化抗体也包括这样的抗体，其中采用CDR修复进行CDR移植，将非人类来源的CDRs移植到人FR上(Mark Dennis，Genentech，presented at the Twelvth International conference on Human Antibodiesand Hybridomas，10-12May 2006，San Diego，USA).

在一个实施方案中，药品抗体是嵌合抗体。

通常嵌合抗体指的是部分重链和/或轻链与来源于特定物种的抗体的对应序列相同或同源或属于某一类或某一亚类的抗体，而其它氨基酸与来源于另一种属的抗体的对应序列相同或同源或属于另一类或另一亚类的抗体，也可以是这些抗体的片段，只要它们表现出所需要的生物活性(见US4,816,567和Morrison et al.，PNAS USA 81，6851-6855(1984)。嵌合抗体可由本技术领域已知的重组方法生产(见Cabilly et al.，PNAS USA 81，3273-3277(1984)，Morrison et al.，PNAS USA 81，6851-6855(1984)，Boulianne et al.，Nature 312，643-646(1984)，EP125023，Neuberger et al.，Nature 314，268-270(1985)，EP171496，EP173494，WO86/01533，EP184187，Sahagan et al.，J.Immunol.137，1066-1074(1986)，WO87/02671，Liu et al.，PNAS USA84，3439-3443(1987)，Sun et al，PNAS USA 84，214-218(1987)，Betteret al.，Science 240，1041-1043(1988)和Harlow et al.，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，(1988)).。

在一个实施方案中，抗体包含单价或多价抗体形式。这个抗体形式可以是由H链与L链以二硫键桥连接而成的二聚体(HL)。一个普通抗体是由两个HL二聚体至少由一个二硫键连接形成的的二价四聚体(H₂L₂)。也可以产生多价抗体，例如使用CH区聚集(例如来自IgM的H链或μ链)。这样抗体可以是嵌合的或来自同一物种。

在一个实施方案中，抗体具有Fc区骨架的改变，这些改变是为了获得有益的特性，例如改变抗体的功能或药代特性。例如，骨架区或恒定区的替换或其它改变(插入、缺失、加入终止序列或任意组合)可能使突变抗体的半衰期比亲本抗体更长或与亲本抗体相比改变突变抗体的免疫原性，提供共价或非共价结合于另一分子的位点，或改变例如补体固定物这样的性质，例如减弱或增强Clq结合和CDC或FcγR结合和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。可以在重链恒定区的一个或多个氨基酸残基上例如234、235、236、237、297、318、320和322进行替换，因此与未修饰抗体相比改变了效应器功能但是保留了抗原结合能力，见专利US 5624821和US 5648260。更多信息可参考WO 94/29351，WO 99/54342，WO 00/42072，WO03/011878，WO 03/085119，WO 04/29207，WO 04/063351，WO04/065540，WO 04/99249，WO 05/018669，WO 05/044859，US 6121022和US 6737056。另外，Shields等.，J.Biol.Chem.276，6591-6604(2001)描述了提高FcγRIII结合能力的组合突变体，例如T256A/S298A，S298A/E333A，and S298A/E333A/K334A。

在一个实施方案中，所述抗体含有突变的Fc区，这一突变可以优化与Fc受体的以增强某些效应器的功能。

在一个实施方案中，抗体含有Fc糖基，它是由经过修饰的特定糖类转移酶缺乏或活力降低的(例如FUT-8)或额外或过表达糖类转移酶的细胞株产生的。

在本发明的一个实施方案中，抗体药品是一种IgG1抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG1，κ抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG1，λ抗体。

在本发明的一个实施方案中，所述肽是一种抗体，测定药品抗体与Fc受体的结合与测定药品抗体与其抗原结合的方法联合使用。

在一个实施方案中，使用下列方法测定所述药品抗体与抗原的结合：

(i)使药品样品与抗原接触一段足够长的时间使抗体结合抗原，

(ii)检测与抗原结合的抗体含量。

在进一步的实施方案中，通过使用针对药品抗体的检测抗体进行上述检测。在进一步的实施方案中，上述检测抗体是标记抗体。

在一个实施方案中，使用ELISA检测抗体与抗原的结合。在一个实施方案中检测抗体与Fc受体结合的ELISA也应用于检测该抗体与其抗原的结合。

在一个实施方案中，使用AlphaScreen^TM检测测定抗体与抗原的结合。在一个实施方案中，用于抗体与Fc受体结合测定的AlphaScreen^TM检测也应用于测定该抗体与其抗原的结合。

在一个实施方案中，使用放射免疫测定法测定抗体与抗原的结合。在一个实施方案中，用于抗体与Fc受体结合测定的放射免疫测定法也应用于测定该抗体与其抗原的结合，在进一步的实施方案中，放射免疫测定使用与Fc受体缀合的珠和可溶性贡献放射性的(radioiodonated)抗原。

如之前所述，依据本发明的方法所使用的抗体抗原特异性不影响抗体与Fc受体的结合能力。因此本发明方法适用于所有抗体(和其它FcR结合肽)，其中至少一种抗体作用机制是通过抗体与Fc受体的结合介导，与抗体的抗原特异性无关。然而，一些实施方案中使用特定抗原特异性的抗体。

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是与人CD4结合的抗体。在一个实施方案中，抗体是如WO9713852中描述的人与CD4结合的抗体。在一个实施方案中，抗体是如US5871732中描述的与人CD4结合的抗体。在一个实施方案中，抗体是如US6309880或WO9012868中描述的与人CD4结的合抗体。在一个实施方案中，抗体是溶液WO02102853中描述的与人CD4结合的抗体。在一个实施方案中，抗体是如US2001051709或WO9110722中描述的与人CD4结合的抗体。在一个实施方案中，抗体是如US6056956或US5670150中描述的与人CD4结合的抗体。在一个实施方案中，抗体是扎木单抗。在一个实施方案中，抗体是凯利昔单抗(IDEC-CE9.1，Biogen IDEC)。在一个实施方案中，抗体是克立昔单抗(IDEC-151，Biogen IDEC)。在一个实施方案中，抗体是TNX-355(Hu-5A8，Tanox/Biogen IDEC)。在一个实施方案中，抗体是TRX-1(TolerRx/Genentech)。在一个实施方案中，抗体是IOT4a(13B8.2，Immunotech)，priliximab(cM-T412，Centocor)。在一个实施方案中，抗体是4162W94(Glaxo Wellcome)。

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是与人EGFR结合的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是如WO9640210中描述的与人EGFR结合的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是如WO04056847或WO02100348中描述的与人EGFR结合的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是西妥昔单抗

在一个实施方案中，所述抗体是Zalutumumab(HuMax-EGFR)(Genmab A/S)。

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是与人CD20结合的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是如WO 94/11026中描述的与人CD20结合的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是如WO 04/035607中描述或在WO申请PCT/DK2005/00270中描述的与人CD20结合的抗体。在进一步的实施方案中，所述抗体是替伊莫单抗

在一个实施方案中，所述抗体是托西莫单抗

在一个实施方案中，所述抗体是HuMax-CD20(ofatumumab)(Genmab A/S)。

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是与人TAC(CD25)结合的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是如WO 04/045512中描述的与人TAC结合抗体。在一个实施方案中，所述抗体是HuMax-TAC(AB12)。

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是人CD3结合抗体。在一个实施方案中，抗体是莫罗单抗(Orthoclone

3)。

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是与人CD3结合的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是莫罗单抗(Orthoclone

3)。

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是与人GPIIb/IIIa结合的抗体。

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是与人CD25(IL-2R)结合的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是达克珠单抗

在一个实施方案中，所述抗体是巴利昔单抗

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是人TNF-α结合抗体。在一个实施方案中，所述抗体是英利昔单抗

在一个实施方案中，所述抗体是阿达木单抗

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是与人RSV结合的抗体。

在一个实施方案中，所述抗体是帕利珠单抗

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是与人HER-2/neu结合的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是曲司珠单抗

在一个实施方案中，所述抗体是培妥珠单抗(Omnitarg^TM)。

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是与人CD33结合的抗体。

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是与人CD52结合的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是阿仑珠单抗(Campath-

)。

在本发明的一个实施方案中，药品抗体是与人CTLA4结合的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是MDX-010(Medarex，Inc.)。

本发明也提供了应用于FcR结合肽与上述Fc受体结合的测定方法中的一种Fc受体的制备方法，其中上述Fc受体是用含有制备步骤的方法制备，与使用不包括本步骤的方法制备得到的类似Fc受体相比，所述步骤可产生N-连接糖基化唾液酸减少的Fc受体。

在一个实施方案中，使用以下方法测定FcR结合肽与Fc受体的结合：

(i)使FcR结合肽与Fc受体接触足够长时间使FcR结合肽与Fc受体结合

(ii)检测与Fc受体结合的FcR结合肽的量

在一个实施方案中，使用针对FcR结合肽的检测抗体进行检测。

在进一步的实施方案中，所述检测抗体是标记抗体。

在一个实施方案中，使用ELISAFcR结合肽与Fc受体的结合测定。

在一个实施方案中，使用AlphaScreen^TM检测测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

在一个实施方案中，使用放射免疫测定测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

在一个实施方案中，使用Biacore检测法测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

在一个实施方案中，使用FMAT测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

在一个实施方案中，使用FDELFIA测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

本发明也提供适于一种适于包被多肽分子的塑料部件，其中多肽分子与塑料部件的粘合至少部分是依赖于多肽分子与塑料部件表面之间的静电相互作用，其中塑料部件表面已经包被脱唾液酸化多肽。

在一个实施方案中，多肽分子是Fc受体。本专利其它内容描述了Fc受体的实例。

在一个实施方案中，塑料部件是微孔滴定板，例如96孔微孔滴定板或类似的板子，例如Greiner板，这些都是该技术领域人员熟知的。

在一个实施方案中，所述涂层塑料部件适用于依据本发明的一种测定FcR结合肽药品药效的方法。

以下是本发明选择列出的实施方案列表

实施方案1一种测定含有FcR结合肽药品药效的方法，其中药品FcR结合肽的至少有一个作用机制是通过药品FcR结合肽与Fc受体结合介导，其中所述方法包括测定药品FcR结合肽与Fc受体的结合。

实施方案2根据实施方案1用于测定含有FcR结合肽的药品药效的方法包括

i)测定参比标准FcR结合肽与Fc受体的结合

ii)测定药品FcR结合肽与上述Fc受体的结合

iii)比较步骤ii)FcR与步骤i)FcR的结合情况，使用比较所得信息评价药品的药效。

其中

a)步骤ii)中Fc受体结合的测定方法与步骤i)中Fc受体结合的测定方法相同。

b)药品FcR结合肽的至少一种作用机制是通过FcR结合肽与Fc受体结合介导。

c)其中所述参比标准FcR结合肽和药品FcR结合肽是同种FcR结合分子的两种制剂。

实施方案3一种生产包含FcR结合肽的药物组合物的方法，该方法包括

a)该药品含有所述FcR结合肽；

b)将实施方案1或实施方案2的方法应用于所述药品以测定含有FcR结合肽药品的药效；

c)使用步骤b)得到的信息作为该药品是否可以作为药物组合物来使用的部分评价依据。

实施方案4一种根据实施方案1-3中任一项的方法，其中该方法是所述药品作为药物组合物上市销售许可申请的一部分。

实施方案5一种申请含有FcR结合肽药品上市许可证的方法，该方法包括对根据实施方案1-4任一项用于测定药品FcR结合肽药效方法的描述。

实施方案6一种根据实施方案1-5中任一项的方法，其中用于测定含有FcR结合肽的药品药效的方法被用于批签发的药效测定。

实施方案7一种根据实施方案1-6中任一项的方法，其中用以下方法测定FcR结合肽与Fc受体的结合：

(i)将药品样本与Fc受体充分作用使FcR结合肽与Fc受体结合，

(ii)检测与Fc受体结合的FcR结合肽的量。

实施方案8一种根据实施方案7的方法，使用针对FcR结合肽的检测抗体进行检测。

实施方案9一种根据实施方案8的方法，其中检测抗体是标记抗体。

实施方案10一种根据实施方案1-9中任一项的方法，其中用ELISA测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

实施方案11一种根据实施方案1-6中任一项的方法，其中用AlphaScreen^TM检测法测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

实施方案12一种根据实施方案1-6中任一项的方法，其中用放射免疫测定法检测FcR结合肽与Fc受体的结合。

实施方案13一种根据实施方案1-6中任一项的方法，其中用Biacore测定法检测FcR结合肽与Fc受体的结合。

实施方案14一种根据实施方案1-6中任一项的方法，其中用FMAT测定法检测FcR结合肽与Fc受体的结合。

实施方案15一种根据实施方案1-6中任一项的方法，其中用DELFIA测定法检测FcR结合肽与Fc受体的结合。

实施方案16一种根据实施方案1-15中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导抗体依赖的细胞介导细胞毒作用(ADCC)，或下调靶受体的表达。

实施方案17一根据实施方案1-15中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过诱导ADCC介导。

实施方案18一种如根据实施方案1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过自然杀伤细胞的补充介导。

实施方案19一种根据实施方案1-18任中一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过自然杀伤细胞的补充介导。

实施方案20一种根据实施方案1-19任中一项的方法，其中FcR结合肽的至少一种体内结合Fc受体表达在自然杀伤细胞上。

实施方案21一种根据实施方案17-20中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIIa受体或及其保留Fc区结合能力的片段。

实施方案22一种根据实施方案21中任一项的方法，其中FcγRIII受体是一种FcγRIIIa176V受体或及其保留Fc区结合能力的片段，例如胞外结构域。

实施方案23一种根据实施方案1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集多形核白细胞介导。

实施方案24一种根据实施方案1-23中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过多形核白细胞对ADCC的诱导介导。

实施方案25一种根据实施方案1-24中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过诱导PMN脱颗粒介导。

实施方案26一种根据实施方案1-25中任一项的方法，FcR结合肽的一个作用机制是通过多形核白细胞的诱导吞噬作用介导。

实施方案27一种根据实施方案1-17或23-26中任一项的方法，其中其中至少由一个与FcR结合肽在体内结合的Fc受体在多形核白细胞上表达。

实施方案28一种根据实施方案23-27中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIa受体或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案29一种根据实施方案1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过诱导单核细胞或巨噬细胞的ADCC作用介导。

实施方案30一种根据实施方案1-17或29中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在单核细胞和/或巨噬细胞上表达。

实施方案31一种根据实施方案1-17、29或30中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIb或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案32一种根据实施方案1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导血小板聚集。

实施方案33一种根据实施方案1-17，或32中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集血小板介导。

实施方案34一种根据实施方案1-17、32或33中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在血小板上表达。

实施方案35一种如1-17或32-34中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案36一种根据实施方案1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导细胞因子的产生。

实施方案37一种根据实施方案1-17或36中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集自然杀伤细胞和/或T细胞介导。

实施方案38一种根据实施方案1-17、36或37中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在自然杀伤细胞和/或T细胞上表达。

实施方案39一种如1-17或36-38中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案40一种根据实施方案1-17或36-38中任一项的方法，其中Fc受体是FcγRIIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案41一种根据实施方案1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导清除免疫复合物。

实施方案42一种根据实施方案1-17或41中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集单核细胞或巨噬细胞介导。

实施方案43一种根据实施方案1-17，41或42中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在单核细胞或巨噬细胞上表达。

实施方案44一种根据实施方案1-17或41-43中任一项的方法，其中Fc受体是FcγRIII或及其保留Fc区结合能力的片段。

实施方案45一种根据实施方案1-17或41-43中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案46一种根据实施方案1-17或41-43中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIIb或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案47一种根据实施方案1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导抗体应答下调。

实施方案48一种根据实施方案1-17或47中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集B细胞介导。

实施方案49一种根据实施方案1-17，47或48中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在B细胞上表达。

实施方案50一种根据实施方案1-17或47-49中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIb或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案51一种根据实施方案1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导单核细胞和巨噬细胞效应器功能抑制作用。

实施方案52一种根据实施方案1-17或51中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过单核细胞和/或巨噬细胞的补充来调节。

实施方案53一种根据实施方案1-17，51或52中任一项的方法，其中FcR结合肽的至少一种体内结合Fc受体表达在单核细胞和/或巨噬细胞上。

实施方案54一种根据实施方案1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导吞噬作用。

实施方案55一种根据实施方案1-17或54中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过，募集多形核白细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞介导。

实施方案56一种根据实施方案1-17、54或55中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在多形核白细胞，巨噬细胞和/或树突状细胞上表达。

实施方案57一种根据实施方案1-17或54-56中任一项的方法，其中Fc受体是FcγRIIIb或及其保留Fc区结合能力的片段。

实施方案58一种根据实施方案1-17或54-56中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案59一种根据实施方案1-17或54中任一项的方法，其

中FcR结合肽的一个作用机制是通过诱导单核细胞或巨噬细胞的吞噬作用介导。

实施方案60一种根据实施方案1-17或59中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在单核细胞或巨噬细胞上表达。

实施方案61一种根据实施方案1-17、59或60中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIb或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案62一种根据实施方案1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导交联作用。

实施方案63一种根据实施方案1-17、或62中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过细胞和/或抗体的交联作用介导。

实施方案64一种根据实施方案1-17、54或63中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案65一种根据实施方案1-17，54或63中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRII或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案66一种如1-17、54或63中任一项的方法，其中Fc受体一种FcγRIII或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案67一种根据实施方案1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过一种免疫受体基于酪氨酸的活化基序来诱导正向信号传导。

实施方案68一种根据实施方案1-17，或67中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集骨髓细胞、T细胞和/或血小板介导。

实施方案69一种根据实施方案1-17或67或68中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合Fc受体在骨髓细胞，T细胞和/或血小板上表达。

实施方案70一种根据实施方案1-17、或67-69中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案71一种根据实施方案1-17、或67-69中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIc或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案72一种根据实施方案1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过普通γ，β，ζ链来诱导正向信号传导。

实施方案73一种根据实施方案1-17、或72中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集骨髓细胞、多形核白细胞、自然杀伤细胞或T细胞介导。

实施方案74一种根据实施方案1-17，72或73中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在骨髓细胞，多形核白细胞，自然杀伤细胞或T细胞上表达。

实施方案75一种根据实施方案1-17、或72-74中任一项的方法，其中Fc受体是FcγRIa或其保留Fc区结合能力的片段。

实施方案76一种根据实施方案1-17，或72-74中任一项的方法，其中Fc受体是FcγRIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案77一种根据实施方案1-17、或72-74中任一项的方法，其中Fc受体是FcγRIIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案78一种根据实施方案1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过免疫受体基于酪氨酸的抑制基序来诱导负向信号传导。

实施方案79一种根据实施方案1-17或78中任一项的方法，其中FcR结合肽的至少一种作用机制是通过B细胞，巨噬细胞和/或单核细胞的补充来调节。

实施方案80一种根据实施方案1-17、78或79中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在B细胞，巨噬细胞，和/或单核细胞上表达。

实施方案81一种根据实施方案1-17、或78-80中任一项的方法，其中Fc受体是FcγRIIb或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案82一种根据实施方案1-17中任一项的方法，其中Fc受体是FcγRn或其保留了Fc区结合能力的片段。

实施方案83一种根据实施方案1-82中任一项的方法，其中上述方法使用的Fc受体是用含有制备步骤的方法制备的，与使用不包括所述步骤的方法制备得到的相似Fc受体相比，所述步骤可产生N-连接糖基化上唾液酸数量减少的Fc受体。

实施方案84一种根据实施方案83的方法，其中所述Fc受体在唾液酸化机制缺陷的宿主细胞中表达。

实施方案85一种根据实施方案83的方法，其中所述Fc受体在用于上述方法前先用唾液酸酶进行处理。

实施方案86一种根据实施方案1-85中任一项的方法，其中FcR结合肽是一种抗体。

实施方案87一种根据实施方案86的方法，其中所述FcR结合肽是一种单克隆抗体。

实施方案88一种根据实施方案86或实施方案87的方法，其中所述FcR结合肽是一种人抗体。

实施方案89一种根据实施方案86或实施方案87的方法，其中所述FcR结合肽是一种人源化抗体。

实施方案90一种根据实施方案86或实施方案87的方法，其中所述FcR结合肽是一种嵌合抗体。

实施方案91一种根据实施方案86-90中任一项的方法，其中FcR结合肽是含有Fc结合部分的抗体片段。

实施方案92一种根据实施方案86-91中任一项的抗体，其中FcR结合肽是一种IgG1抗体。

实施方案93一种根据实施方案92的方法，其中FcR结合肽是IgG1，λ抗体。

实施方案94一种根据实施方案92的方法，其中FcR结合肽是一种IgG1，κ抗体。

实施方案95一种根据实施方案86-94中任一项的方法，其中抗体与Fc受体结合的测定与一种测定抗体抗原结合的方法联合使用。

实施方案96一种根据实施方案95的方法，其中使用以下方法测定抗体抗原的结合

(i)使抗体样品与抗原接触足够长时间以使抗体与抗原的结合，

(ii)检测结合抗原的抗体量。

实施方案97一种根据实施方案96的方法，其中用针对药品抗体的检测抗体来检测。

实施方案98一种根据实施方案97的方法，其中检测抗体是标记抗体。

实施方案99一种根据实施方案95-98的方法，其中使用ELISA测定抗体与抗原的结合。

实施方案100一种根据实施方案99的方法，其中上述ELISA也用于测定抗体与Fc受体的结合。

实施方案101一种根据实施方案95的方法，其中使用AlphaScreen^TM检测法测定抗体与Fc受体的结合。

实施方案102一种根据实施方案101的方法，其中也使用AlphaScreen^TM检测法测定抗体与Fc受体的结合。

实施方案103一种根据实施方案95的方法，其中使用放射免疫测定法测定抗体与抗原的结合。

实施方案104一种根据实施方案103的方法，其中也使用放射免疫测定法测定抗体与抗原的结合。

实施方案105一种根据实施方案104的方法，其中放射免疫测定法使用与Fc受体和贡献放射性的抗原缀合的珠。

实施方案106一种根据实施方案86-105中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人CD4结合的抗体。

实施方案107一种根据实施方案106的方法，其中FcR结合肽是扎木单抗。

实施方案108一种根据实施方案106的方法，其中FcR结合肽是凯利昔单抗。

实施方案109一种根据实施方案106的方法，其中FcR结合肽是克立昔单抗。

实施方案110一种根据实施方案106的方法，其中FcR结合肽是TNX 355。

实施方案111一种根据实施方案106的方法，其中FcR结合肽是TRX-1。

实施方案112一种根据实施方案106的方法，其中FcR结合肽是IOT4a。

实施方案113一种根据实施方案106的方法，其中FcR结合肽是4162W94。

实施方案114一种根据实施方案1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人EGFR结合的抗体。

实施方案115一种根据实施方案114的方法，其中FcR结合肽是西妥昔单抗。

实施方案116一种根据实施方案114的方法，其中FcR结合肽是HuMax-EGFR，zalutumumab。

实施方案117一种根据实施方案1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人CD20结合的抗体。

实施方案118一种根据实施方案117的方法，其中FcR结合肽是人利妥昔单抗。

实施方案119一种根据实施方案117的方法，其中FcR结合肽是替伊莫单抗。

实施方案120一种根据实施方案117的方法，其中FcR结合肽是托西莫单抗。

实施方案121一种根据实施方案117的方法，其中FcR结合肽是HuMax-CD20，ofatumumab。

实施方案122一种根据实施方案1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人TAC结合的抗体。

实施方案123一种根据实施方案122的方法，其中FcR结合肽是HuMax-TAC。

实施方案124一种根据实施方案1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人CD3结合的抗体。

实施方案125一种根据实施方案124的方法，其中FcR结合肽是莫罗单抗。

实施方案126一种根据实施方案1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人GPIIb/IIIa结合的抗体。

实施方案127一种根据实施方案1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人CD25结合的抗体。

实施方案128一种根据实施方案127的方法，其中FcR结合肽是达克珠单抗。

实施方案129一种根据实施方案127的方法，其中FcR结合肽是巴利昔单抗。

实施方案130一种根据实施方案1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人TNF-α结合的抗体。

实施方案131一种根据实施方案130的方法，其中FcR结合肽是英利昔单抗。

实施方案132一种根据实施方案130的方法，其中FcR结合肽是阿达木单抗。

实施方案133一种根据实施方案1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人RSV结合的抗体。

实施方案134一种根据实施方案133的方法，其中FcR结合肽是帕利珠单抗。

实施方案135一种根据实施方案1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是人HER-2/neu结合抗体。

实施方案136一种根据实施方案135的方法，其中FcR结合肽是曲司珠单抗。

实施方案137一种根据实施方案135的方法，其中FcR结合肽是培妥珠单抗。

实施方案138一种根据实施方案1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人CD33的结合的抗体。

实施方案139一种根据实施方案1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人CD52的结合的抗体。

实施方案140一种根据实施方案139的方法，其中FcR结合肽是阿仑珠单抗。

实施方案141一种根据实施方案1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是人VEGF的结合抗体。

实施方案142一种根据实施方案141的方法，其中FcR结合肽是贝伐珠单抗。

实施方案143一种根据实施方案1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是人CTLA4的结合抗体。

实施方案144一种根据实施方案143的方法，其中FcR结合肽是MDX-010。

实施方案145一种批准作为药物组合物使用的含有FcR结合肽的药品，其中根据实施方案1至144中任一项的一种方法适上市批准申请的一部分。

实施方案146一种用于测定FcR结合肽与上述Fc受体结合的Fc受体的制备方法，其中所述方法使用的Fc受体是用含有制备步骤的方法制备的，与用不包括所述步骤的方法制备得到的相似Fc受体相比，所述步骤可产生N-连接糖基化上唾液酸数量减少的Fc受体。

实施方案147一种根据实施方案146的方法，其中用以下方法测定FcR结合肽与上述Fc受体的结合：

(i)使FcR结合肽与Fc受体的接触足够长时间以使抗体与抗原的结合，

(ii)检测结合抗原的抗体量

实施方案148一种根据实施方案147的方法，其中使用针对FcR结合肽的检测抗体进行检测。

实施方案149一种根据实施方案148的方法，其中检测抗体是标记抗体。

实施方案150一种根据实施方案146-149中任一项的方法，其中使用ELISA测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

实施方案151一种根据实施方案146-149中任一项的方法，其中使用AlphaScreen^TM检测法测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

实施方案152一种根据实施方案146-149中任一项的方法，其中使用放射免疫检测法测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

实施方案153一种根据实施方案146-149中任一项的方法，其中使用Biacore检测法测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

实施方案154一种根据实施方案146-149中任一项的方法，其中使用FMAT测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

实施方案155一种根据实施方案146-149中任一项的方法，其中使用DELFIA测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

实施方案156一种根据本发明或实施方案1-155中任一项的方法，其中使用包被在ELISA板上的His捕获抗体来捕获his标记的FcR或FcR片段。

实施方案157一种适用于包被多肽分子的塑料部件，其中多肽分子与塑料部件的粘合至少部分依赖多肽分子与塑料部件表面之间的静电相互作用，其中塑料部件表面已经包被脱唾液酸化多肽。

实施方案158一种根据实施方案157的塑料部件，其中所住多肽分子是一种Fc受体。

实施方案159一种根据实施方案157或158的塑料部件，其中所述塑料部件是微量滴定板。

实施方案160一种根据实施方案157-159中任一项的塑料部件，其中塑料部件适用于根据权利要求1-144中任一项的方法。

实施方案161一种根据实施方案157-159中任一项的塑料部件，其中塑料部件用于根据权利要求1-144中任一项的方法。

通过以下实施例进一步阐述本发明，这些事实力并不会限制本发明。

实施例

实施例1

寡聚核苷酸引物和PCR扩增

将指定引物溶解在H₂O中使其浓度达到100pmol/μl并贮存于-20℃。对于PCR，按照厂商的使用说明使用

热启动DNA聚合酶(Stratagene，Amsterdam，The Netherlands；产品#600322)。每个反应混合物的总体积是20μl，含有200μM混合dNTPs(RocheDiagnostics，Almere，The Netherlands；产品#1814362)、6.7pmol正向和反向引物、约1ng模板DNA和1个单位

Hotstart DNA聚合酶，均溶解在PCR反应缓冲液(与聚合酶一起提供)中。PCR反应在TGradient Thermocycler 96(Whatman Biometra，Goettingen，Germany；产品#050-801)上进行，使用30个循环的程序：95℃变性2min；30个循环的95℃变性30s、45-65℃梯度(或使用另一特定的退火温度)退火30s和72℃延伸2min；最终72℃延伸10min。如果合适的话，可将PCR反应混合物贮存在4℃用于进一步分析或处理。

实施例2

PCR筛选细菌菌落

使用HotStarTaq Master混合试剂盒(Qiagen；产品#203445)和特定正向反向引物通过菌落PCR筛选含有预期序列载体的细菌菌落。用20μl吸管头轻触选出的菌落，并简单地接种于2ml LB中(Luriabroth)进行小量培养，然后重悬于PCR混合物中。PCR反应在仪器TGradient Thermocycler 96(Whatman Biometra，Goettingen，Germany；产品#050-801)上进行，使用具有35个循环地程序：95℃变性15min，35个循环的94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min；最终72℃延伸10min。如果合适的话，将PCR反应混合物贮存在4℃用于琼脂糖凝胶电泳分析。

实施例3

FcγRIaECDHis的生产

pEE13.4FcγRIaECDHis的构建

分离RZPD菌株IRATp970F1154D6(Deutsche Ressourcenzentrumfür Genomforschung(RZPD，柏林，德国)的质粒DNA并用作PCR中的模版，该PCR按照实施例1所描述的程序使用引物P1(SEQ ID No：4)和P2(SEQ ID No：5)，PCR扩增人FcγRIa的胞外编码结构域(氨基酸序列1-292)并引入适当的用于克隆到载体pEE13.4(LonzaBiologics，Slough，UK)的限制酶切位点、一个理想的Kozak序列(GCCGCCACC)和C末端His₆标签。用凝胶纯化PCR片段并克隆到pEE13.4。其中，用限制酶Pfl23II和XmaI消化PCR产物并纯化。用限制酶Pfl23II和XmaI消化pEE13.4载体并纯化载体片段。将FcγRIa片段和pEE13.4Pfl23II-XmaI载体连接并转化入感受态DH5α-T1^R细胞(Invitrogen)。根据实施例2所描述的程序，使用菌落PCR(使用引物P3(SEQ ID No：6)和P4(SEQ ID No：7))验证8个克隆，结果得到2个插入片段大小正确的克隆。将这两个阳性克隆在2ml培养基中培养。分离质粒DNA，对其中1个构建菌株的插入序列进行测序分析后发现是正确的。最后构建的重组载体命名为pEE13.4FcγRIaECDHis。

FcγRIaECDHis在Hek-293F细胞中的瞬时表达

Freestyle^TM 293-F(一种已适应悬浮生长和化学限定Freestyle培养基的HEK-293亚克隆，例如HEK-293F)细胞购自Invitrogen，并按照厂商的操作规程使用293fectin(Invitrogen)用pEE13.4FcγRIaECDVHis转染细胞。根据厂商的操作规程培养转染子，按照以下描述的方法取1升细胞培养上清进行纯化。

在BD TALONspin(0.5ml)Talon柱上进行FcγRIaECDVHis的纯化

BD TALONspin柱购自Clontech(Mountain View，CA，USA)。将珠从柱子中取出，用pH7.0的1x平衡/洗涤缓冲液(50mM磷酸钠和300mM NaCl)平衡珠。与1升细胞培养上清液于4℃孵育过夜。在洗脱FcyRIaECDVHis(用pH5.0的1x洗脱缓冲液(50mM磷酸钠、300mM NaCl和150mM咪唑)后，重新平衡树脂并加入前期纯化的流出物中。继续孵育过夜，再次洗脱FcyRIaECDVHis。收集第1和第2次的洗脱流分，收集的FcyRIaECDVHis在PD-10柱上脱盐，将缓冲液换成PBS。终产物的体积为3.7ml。通过280nm处的吸光度来测定浓度，结果为117μg/ml，得到433μg FcγRIaECDHis(SEQ ID No：1)。经SDS-PAGE判定终产物的纯度约为95％。

实施例4

FcγRIIIaECD176VHis的生产

pEE13.4FcγRIIIaECD176His的构建

分离RZPD菌株IRAKp961H1749Q2(Deutsche Ressourcenzentrumfür Genomforschung(RZPD，Berlin，Germany))的质粒DNA并用作PCR中的模版，该PCR按照实施例1所描述的程序使用引物P5(SEQID No：8)和P6(SEQ ID No：9)，PCR.扩增人FcγRIIIa的胞外编码结构域(氨基酸序列1-200)并引入适当的用于克隆到载体pEE13.4的限制酶切位点、一个理想的Kozak序列(GCCGCCACC)和C末端His₆标签。用凝胶纯化PCR片段并克隆到pEE13.4。其中，用限制酶EcoRI和XmaI消化PCR产物并纯化。用限制酶EcoRI和XmaI消化pEE13.4载体并纯化载体片段。将FcγRIa片段和pEE13.4EcoRI-XmaI载体连接并转化入感受态DH5α-T1^R细胞(Invitrogen)。根据实施例2所描述的程序，使用菌落PCR(使用引物P3和P4)验证4个克隆，结果得到2个插入片段大小正确的克隆。将这两个阳性克隆在2ml培养基中培养。分离质粒DNA，对其中1个构建菌株的插入序列进行测序分析后发现是正确的。插入片段为FcγRIIIa的176V同种异型体。最后构建的重组载体命名为pEE13.4FcγRIIIaECD176His。

FcγRIIIaECD176His在Hek-293F细胞中的瞬时表达

Freestyle^TM 293-F(一种已适应悬浮生长和化学限定Freestyle培养基的HEK-293亚克隆，例如HEK-293F)细胞购自Invitrogen，并按照厂商的操作规程使用293fectin(Invitrogen)用pEE13.4FcγRIIIaECD176VHis转染细胞。根据厂商的操作规程培养转染子，按照以下描述的方法取200ml细胞培养上清进行纯化。

在BD TALONspin(0.5ml)Talon柱上进行FcγRIIIaECD176VHis 的纯化

BD TALONspin柱购自Clontech(Mountain View，CA，USA)。将珠从柱子中取出，用pH7.0的1x平衡/洗涤缓冲液(50mM磷酸钠和300mM NaCl)平衡珠，与200ml细胞培养上清液孵育。用1x平衡/洗涤缓冲液洗涤珠以除去非特异性吸附蛋白，用pH5.0的1x洗脱缓冲液(50mM磷酸钠，300mM NaCl和150mM咪唑)洗脱His标记蛋白。在洗脱FcyRIIIaECD176VHis(用pH5.0的1x洗脱缓冲液(50mM磷酸钠、300mM NaCl和150mM咪唑)后，重新平衡树脂并加入前期纯化的流出物中。收集第1和第2次的洗脱流分。在PD-10柱上用PBS将收集的流分脱盐。通过测定280nm处的吸光度使用由FcγRIIIaECD176VHis(SEQ ID No：2)氨基酸序列计算得到的理论吸光系数测定纯化蛋白的产率。纯化之后的产率为2.5mg/200ml，浓度为771μg/ml。SDS-PAGE显示了一条很宽的蛋白迁移带(表明一种非常异质的糖基化蛋白)和两条更高分子量的小带。纯度估计约为90％。

实施例5

FcγRIIIaECD176FHis的生产

将pEE13.4FcγRIIIaECD176VHis进行突变构建 pEE13.4FcγRIIIaECD176FHis

使用定点突变使载体pEE13.4FcγRIIIaECD176VHis上编码FcγRIIIa176V的Val176的密码子突变为编码Phe的密码子。使用QuickChange II XL定点突变试剂盒(Stratagene，Amsterdam，TheNetherlands)根据厂商说明书进行定点突变。该方法包括引入一个silent extra Hpy188III位点筛选成功突变的突变子。简而言之，将5μl10x反应液、1.25μl寡聚核苷酸P7(100ng/μl)(SEQ ID No：10)、1.25μl寡聚核苷酸P8(125ng/μl)(SEQ ID No：11)、1μl dNTP混合物、3μl Quicksolution、1μl质粒pEE13.4FcγRIIIaECD176VHis(50ng/μl)和1μl PfuUltra HF DNA聚合酶混合至终体积50μl并在TGradientThermocycler 96(Whatman Biometra，Goettingen，Germany；产品#050-801)上进行PCR反应，使用18个循环的程序：95℃变性1min；18个循环的程序是95℃50s、60℃50s、68℃10min。将PCR混合物贮存在4℃用于进一步处理。然后，将PCR反应混合物与1μlDpnI在37℃温育60min以酶切载体，贮存于4℃用于进一步处理。根据厂商说明书(Invitrogen)将2μl反应混合物转化到One ShotDH5α-T1^R感受态大肠杆菌细胞中。

用菌落PCR和Hpy188III酶切(突变过程中引入silent extraHpy188III位点)筛选出16个克隆，其中15个克隆显示含有正确的核苷酸变化。将两个阳性克隆过夜培养，分离质粒DNA并测序以验证是否引入正确的突变。结果两个克隆都含有正确的序列，将其中一个进一步持续培养，并命名为pEE13.4FcγRIIIaECD176FHis。为了排除在突变过程中引入额外的突变，对pEE13.4FcγRIIIaECD176FHis的完整FcγRIIIa编码区基因进行重新测序，结果发现无额外突变。最终获得的重组载体命名为pEE13.4FcγRIIIaECD176FHis。

FcγRIIIaECD176FHis在Hek-293F细胞的瞬时表达

Freestyle^TM 293-F(一种已适应悬浮生长和化学限定Freestyle培养基的HEK-293亚克隆，例如HEK-293F)细胞购自Invitrogen，并使用293fectin(Invitrogen)按照厂商的操作规程用pEE13.4FcγRIIIaECD176FHis转染细胞。根据厂商的操作规程培养转染子，根据以下描述的方法取200ml细胞培养上清液进行纯化。

在BD TALONspin(0.5ml)Talon柱上进行FcγRIIIaECD176FHis 的纯化

BD TALONspin柱购自Clontech。将珠从柱子中取出，用pH7.0.的1x平衡/洗涤缓冲液(50mM磷酸钠和300mM NaCl)平衡，将珠与200ml细胞培养上清液孵育。用1x平衡/洗涤缓冲液洗涤珠以除去非特异性结合蛋白，用pH5.0.的1x洗脱缓冲液(50mM磷酸钠，300mMNaCl和150mM咪唑)洗脱His标记蛋白。在洗脱FcyRIIIaECD176FHis(用1x洗脱缓冲液)后，将树脂重新平衡并加入到前期纯化的流出物中。收集第1和第2次的洗脱流分。在PD-10柱上用PBS将收集的流分脱盐。通过测定280nm处的吸光度使用由FcγRIIIaECD176FHis(SEQ ID No：3)氨基酸序列计算得到的理论吸光系数测定纯化蛋白的产率。纯化后的产率为1.5mg/200ml浓度为613μg/ml。SDS-PAGE显示是一条宽带，表明它是它是单一、纯的糖基化蛋白。

实施例6

不同扎木单抗批产品的糖基化水平

重链糖基化水平

为了研究重链CH₂结构域N连接糖基化基团的存在，用SDS-PAGE和高pH阴离子交换剂脉冲电流计检测(HPAEC-PAD)对几批具有潜在重链糖基化差异的扎木单抗批产品(MEV001，MEV004，MEV005，MRS-CD4-001，BN078，BO118)进行分析。制备对照批产品进行比较：脱糖基化扎木单抗批产品UNG-MRS-CD4、伪脱糖基化扎木单抗批产品MOCK-MRS-CD4(直接来自MRS-CD4-001)和混合批产品(脱糖基化和完全糖基化参比批产品的混合物)M90-MRS-CD4[90％重链糖基化]和M50-MRS-CD4[50％重链糖基化]。

非还原SDS-PAGE(图1)检测显示所有批产品包括UNG-MRS-CD4是完整的。还原SDS-PAGE(图2)证实批产品UNG-MRS-CD4是完全脱糖基化的。

批产品MRS-CD4-001和BN078含有少量未糖基化重链(＜10％)，批产品BO118含有约10％未糖基化的重链。MEV001含有少量未糖基化重链。MEV004和MEV005含有未糖基化重链，其中MEV004的含量最高(约30％)，其次是MEV005(约15％)。

重链糖基化类型

为了研究重链糖基化类型，用HPAEC-PAD分析扎木单抗批产品(表1)。这些批产品都没有大量的带电多聚糖。几乎检测不到含有两个半乳糖(G2或G2F)的复合型多聚糖。

MRS-CD4-001(作为参比批产品)和MEV005具有相似数量的寡聚甘露糖-5型多聚糖(M5)，但MEV005比MRS-CD4-001具有更少的非核心岩藻糖基化多聚糖。在所有批产品中，MEV005无半乳糖的核心岩藻糖基化多聚糖(G0F)含量最高，比参考批产品MRS-CD4-001约高20％。

批产品BN078与参比批产品MRS-CD4-001具有可比性，它们的具有相似含量的G0F、含有一个半乳糖(G1F)的核心岩藻糖基化多聚糖和非核心岩藻糖基化多聚糖，尽管BN078含有更多的M5。BO118的特征是与MRS-CD4-001相比G0F含量增加，非核心岩藻糖基化多聚糖含量减少。

不出所料，MRS-CD4-001于MOCK-MRS-CD4具有高度可比性(MOCK-MRS-CD4直接来自参比批产品MRS-CD4-001)。批产品UNG-MRS-CD4被确认不含有多聚糖(数据未显示)。

表1

用HPAEC-PAD测定扎木单抗批产品多聚糖含量一览

实施例7

糖基化差异与ADCC活性的关系I

用流式细胞术研究数个扎木单抗批产品(见实施例6)对原代CD4+T细胞的由NK细胞介导的ADCC的诱导能力(图3)。

通过静脉穿刺收集健康志愿者(知情同意后)的外周人血并以暗黄层(Sanquin，Utrecht，The Netherlands)的形式提供。在人血中加入无菌PBS，采用淋巴细胞制备密度离心(淋巴细胞分离介质，BioWhittaker，via Cambrex Verviers，比利时；产品#17-829E)分离外周血单核细胞(PBMC)，800xg20min(制动0次)离心分离20min。除去梯度介面的PBMC并在重悬于RPMI前用PBS洗涤3次(400xg7min，制动3次)。根据厂商的操作规程使用

CD4+T细胞阴性分离试剂盒(Dynal Biotech GmbH，汉堡，Germany；产品#113.11)分离CD4+T细胞。根据厂商的操作规程使用

CD4+T细胞阴性分离试剂盒(Dynal Biotech GmbH，汉堡，Germany；产品#113.15)分离NK细胞。根据厂商的操作规程用荧光细胞膜标记PKH26(PKH26标记试剂盒，Sigma-Aldrich Chemie，Zwijndrecht，The Netherlands；产品#PKH26-GL)标记分离的CD4⁺T细胞。然后将PKH26标记的CD4+T细胞转移至96孔圆底板，2.5-5×10⁴个细胞/孔，每孔50μl(根据分离后NK细胞的产率，调整每孔的T细胞数量使效应器细胞：靶细胞达到10∶1)。然后，将稀释的扎木单抗批产品(稀释范围据图表所示)加到50μl中，于4℃温育10min。之后，将100μl NK细胞以2.5-5×10⁵个细胞/孔加入，使细胞旋转下沉，然后将沉降细胞在37℃温育4h。为了达到自发裂解，在无NK细胞的情况下将靶细胞于培养基温育。然后在进行分析前用TO-

-3对细胞染色(染色渗透细胞；分子探针，莱顿，荷兰；产品#T3605；最终稀释度为1∶100000)。使用流式细胞仪，用FACSCalibur^TM和具有适当补偿设置的Cell Quest Pro软件(Becton Dickinson)测定细胞相关荧光。用PKH26+细胞群中TO-

-3+细胞数除以PKH26+细胞总数计算细胞裂解百分率。

由于允许顶点水平可变的四参数对数分析显示并不是所有的曲线达到相似的顶点水平，所以用基线固定曲线的EC₅₀值来计算批产品的活性和相对活性(而不是药效)。

就ADCC诱导活性而言，BN078、BO118、MOCK-MRS-CD4和M90-MRS-CD4显示出与MRS-CD4-001(作为参考批产品)的可比性。MEV005和M50-MRS-CD4显示出比参比批产品MRS-CD4-001更低的NK细胞介导的ADCC的诱导效率。

对参比和对照批产品的研究结果显示重链糖基化水平和诱导ADCC能力存在明显联系。完全糖基化参比批产品显示出最大的ADCC活性，然而批产品M50-MRS-CD4(含有50％非糖基化的扎木单抗)显示出的ADCC诱导活性显著减少。批产品M90-MRS-CD4(含有10％非糖基化的扎木单抗)与参比批产品具有相似的诱导ADCC的能力。

对批产品的检测结果与以下内容符合：含有一定数量未糖基化重链的批产品MEV005和BO118显示出减弱的诱导ADCC能力。

对批产品MEV005和BO118分析显示这些批产品还具有增加的岩藻糖基化，这可能说明岩藻糖基化引起这些批产品的ADCC诱导能力减弱(Shields，R.L.et al.，J Biol Chem 277，26733(2002)，andOkazaki，A.et al.，J Mol Biol 336，1239(2004))。

实施例8

糖基化差别与ADCC活性的关系II

用流式细胞术研究数个脱糖基化混合批产品对原代CD4+T细胞的由NK细胞介导的ADCC的诱导能力(见实施例7)。3个实验中的一个代表性实验的结果(见图4的数据)以一定浓度范围(部分)脱糖基化批产品(单个数据点)存在下的CD4⁺T细胞的特异性裂解表示。将基线固定于一个共同值(common value)(图4A)，用4参数对数拟合进行曲线拟合。此外，在限制基线水平、顶点水平和坡度的情况下使用4参数对数拟合进行曲线拟合(图4B)。使用顶点、基线和坡度固定曲线的EC₅₀值计算相对于MRS-CD4-001的药效。此外，计算相对于母体GMP#3批产品(该批产品用于制备脱糖基化和混合批产品)的相对药效(表2)。与MRS-CD4-001相比，GMP#3批产品和MOCK-GMP#3-CD4，伪脱糖基化GMP#3的ADCC活性微弱增加。M50-GMP#3-CD4、M70-GMP#3-CD4和M90-GMP#3混合批产品(脱糖基化和未脱糖基化GMP#3批产品的混合物)分别具有50％、30％和10％的脱糖基化GMP#3，相对于GMP#3的药效为0.31、0.59和0.87，显示出ADCC活性随着重链糖基化的增加而减少。总之，重链糖基化水平和诱导ADCC能力存在着明显的关系。

表2

脱糖基化混合批产品诱导ADCC的能力

实施例9

FcγRIIIa176V结合ELISA和与ADCC的关系I

检测数个扎木单抗批产品(见实施例6)与FcγRIIIa176V的结合情况。

用100μl 2.5μg/ml FcγRIIIa176V(按照实施例4制备)包被Greiner板，于4℃温育过夜。用200μl PBST(含有0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich Chemie B.V.，Zwijndrecht，，NL；产品目录号63158)的PBS)和100μl系列稀释的扎木单抗样品(扎木单抗的浓度为300、75、18.75、4.69、0.29、1.17、0.07和0.02μg/ml)将板洗涤3次。将板置于RT振荡温育60min，然后用200μl PBST洗涤3次，再加入缀合物，即1∶4000稀释的与过氧化物酶偶联的亲和纯F(ab’)₂片段G-a-Hu-IgG，F(ab’)₂特异性片段((Jackson ImmunoResearch，Brunschwig Chemie B.V.，阿姆斯特丹，荷兰)。将板子再次置于RT振荡温育60min，然后用200μl PBST洗涤3次，加入100μl ABTS(Roche，cat nr 1112597)，将板子在振荡条件下温育30min。加入100μl2％草酸终止反应，在405nm处测定吸光值。结果如图5所示。

由于使顶点水平可变的四参数对数分析显示所有曲线达到相似的顶点水平，使用固定基线水平、顶点水平和坡度固定的曲线EC₅₀值计算批产品的药效合相对药效。

BN078和MOCK-MRS-CD4与参比批产品MRS-CD4-001相比具有相似的与板结合的FcγRIIIa176V结合的能力。批产品MEV001、MEV005、BO118、M50-MRS-CD4和M90-MRS-CD4显示出更低的与板结合的FcγRIIIa176V的结合药效。就与板结合的FcγRIIIa176V的结合而言，批产品MEV001、MEV005、、BO118和M50-MRS-CD4具有可比性，相对药效为0.4-0.5。M90-MRS-CD4与预期的不同，相对结合药效约0.7(预期值为0.9)。

对参比和对照批产品的研究发现重链糖基化水平与FcγRIIIa176V结合能力之间存在明显的关系。完全糖基化参比批产品显示出最大FcγRIIIa176V结合力，而M50-MRS-CD4的结合能力显著降低，M90-MRS-CD4显示了中等的结合能力。

检测批产品的结果与以下内容符合：具有30％和10％未糖基化重链的MEV005和BO118显示出显著降低的FcγRIIIa176V结合能力。出乎意料的是批产品MEV001也显示出显著降低的FcγIIIa176V结合能力，虽然SDS-PAGE并未检测出MEV001含有未糖基化重链。

从以上内容可以得出ADCC诱导(图3)和与纯化FcγRIIIa176V(图5)的结合力之间存在联系。

实施例10

FcγRIIIa176V结合ELISA和与ADCC的关系II

检测数个扎木单抗脱糖基化混合批产品(见实施例8)与FcγRIIIa176V的结合能力。

用100μl 2.5μg/ml FcγRIIIa176V(按照实施例4制备)包被Greiner板，于4℃温育过夜。用200μl PBST(含有0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich Chemie B.V.，Zwijndrecht，，NL；产品目录号63158)的PBS)和100μl系列稀释扎木单抗样品(扎木单抗的浓度是300，75，18.75，4.69，0.29，1.17，0.07和0.02μg/ml)将板洗涤3次。将板在RT上振荡温育60min，然后用200μl PBST洗涤3次，再加入缀合物，即1∶4000稀释的过氧化物酶偶联亲和纯F(ab’)₂片段G-a-Hu-IgG，F(ab’)₂特异性片段((Jackson ImmunoResearch，Brunschwig ChemieB.V.，阿姆斯特丹，荷兰)。将板又在振荡条件下温育60min，然后用200μl PBST洗涤3次，加入100μl ABTS(Roche，cat nr 1112597)，将板在振荡条件下温育30min。加入100μl 2％草酸终止反应，在405nm处测定吸光值。结果如图6所示。

限制基线水平、顶点水平和坡度，使用四参数对数拟合进行曲线拟合(图6)。使用固定顶点、基线水平和坡度的曲线的EC₅₀值计算相对于MRS-CD4-001的相对药效。此外，计算相对于母体GMP#3批产品(用于制备脱糖基批产品和混合批产品)的相对药效(表3)。

表3

扎木单抗批产品与板结合的FcγRIIIa176V的结合

与MRS-CD4-001批产品、GMP#3批产品和MOCK-GMP#3-CD4批产品相比，伪脱糖基化GMP#3批产品与FcγRIIIa176V的结合能力略有增加。M50-GMP#3-CD4、M70-GMP#3-CD4和M90-GMP#3混合批产品(脱糖基化和糖基化GMP#3批产品的混合物)分别含有50％、30％和10％脱糖基化GMP#3，相对于GMP#3的结合药效分别为0.49、0.71和0.93，显示出随着重链糖基化含量的减少与FcγRIIIa176V的结合能力也减弱。总之，重链糖基化水平和FcγRIIIa176V结合能力之间存在明显的关系(图7)。

又一次表明ADCC和FcγRIIIa176V结合之间确实存在明显的关系(图8)。

实施例11

与抗原结合I

用ELISA研究扎木单抗批产品与纯化的CD4蛋白的结合(图9)。通过4℃温育过夜将sCD4(《免疫诊断学(Immuno Diagnostics)》，Woburn，MA，USA，cat nr 7001-10)以PBS中0.5μg/ml(100μl/孔)的浓度包被平底96孔板(Greiner，Alphen a/d Rijn，NL，cat nr 655092。弃去板中溶液，用200μl/孔PBSC(含有2％(v/v)鸡血清的PBS(Invitrogen，Breda，NL，cat nr 16110-082))在RT振荡器1h封闭残余的非特异结合位点。制备扎木单抗批产品稀释物，在PBSTC(含有0.05％(v/v)Tween-20(Sigma-Aldrich Chemie B.V.，Zwijndrecht，NL；cat 63158的PBS)和2％(v/v)鸡血清)中进行系列4倍稀释，浓度范围从2000ng/ml到0.49ng/ml。弃去板中溶液，加入100μl稀释液到包被板中，在RT振荡温育2h。弃去板中溶液并用PBST 1x(200μl/孔)洗涤3次。将缀合物羊抗HuIgG F(ab’)₂特定HRP(JacksonImmunoResearch)在PBSTC 1x中按1∶10.000进行稀释，每孔加入100μl。将板在RT上振荡温育1h。弃去板中溶液并用PBST 1x(200μl/孔)洗涤3次。在吸水纸上拍板以除去所有残余液体。将一片ABTS底物(50mg罗氏诊断学NL，Almere，NL，cat nr 1122422)溶解在50mlABTS缓冲液中(罗氏，cat nr 1112597)，每孔加入100μl。用铝箔包裹板子在RT振荡温育30min。用100μl/孔2％草酸(Sigma-Aldrich Chemie B.V.)终止反应。用分光光度计在405nm处读取吸光度(ELISA-EL808，Beun de Ronde，Abcoude，NL)。

由于使顶点水平可变的四参数对数分析显示所有曲线达到相似的顶点水平，使用固定基线水平、顶点水平和坡度固定的曲线EC50值计算批产品的药效合相对药效。

与参考MRS-CD4-001相比，尽管所有其它批产品的糖基化程度明显不同，但是它们具有与板结合的sCD4相似的结合力。应该注意的是该测定方法具有相对较高的可变性。

实施例12

抗原结合II

用ELISA研究扎木单抗混合批产品(见实施例8)与纯化CD4蛋白的研究(图10)。

用100μl 2.0μg/ml sCD4(免疫诊断学((Immuno Diagnostics)，Woburn，MA，USA，产品#7001-10)包被Greiner板并于4℃温育过夜。用200μl PBST和100μl系列稀释的扎木单抗样品(扎木单抗的浓度为1000、250、62.5、15.62、3.9、0.98、0.24和0.06ng/ml)洗板3次。将板子于RT振荡温育60min，然后用200μl PBST洗涤3次，再加入以1∶20000稀释的过氧化物酶偶联亲和纯G-a-Hu-IgG，F(ab’)₂特异片段(Jackson ImmunoResearch，Brunschwig Chemie B.V.，阿姆斯特丹，荷兰)缀合物。再次将板子于RT振荡温育60min，然后用200μl PBST洗涤3次。加入100μl ABTS(罗氏，cat nr 1112597)，将板子振荡温育30min。用100μl 2％草酸终止反应，在405nm读取吸光值。

由于使顶点水平可变的四参数对数分析显示所有曲线达到相似的顶点水平，使用固定基线水平、顶点水平和坡度固定的曲线EC50值计算批产品的药效合相对药效(表4)。

表4

扎木单抗脱糖基化混合批产品与板结合的CD4的结合

与参比批产品MRS-CD4-001相比，尽管所有其它批产品的糖基化程度具有明显差异，但它们与板结合的sCD4具有相似的结合能力。

实施例13

IL-2生产的抑制

通过嵌套测定法(T细胞活化测定，然后进行IL-2ELISA)研究扎木单抗批产品(见实施例6)通过活化的PBMC抑制IL-2产生的能力，在嵌套测定法中按照厂商说明书使用来自U-CyTech(乌德勒支，荷兰；产品CT202)或来自BD生物科学(Alphen aan de Rijn，荷兰，产品#550611)的人IL-2细胞因子ELISA试剂盒。

在系列稀释(或所选系列)的参比抗体或检测样品存在下，用板结合的抗-CD3(100ng/ml)和可溶性抗-CD28(100ng/ml)在平底96孔板中激活PBMC(每孔105个细胞)。38-42h以后，收获细胞悬浮液，在稀释液中稀释并转移到96孔ELISA板中。使用含有IL-2标准品的人IL-2ELISA试剂盒通过ELISA测定pg/ml水平的IL-2浓度。

由于使顶点水平可变的四参数对数分析显示所有曲线达到相似的顶点水平，使用固定基线水平、顶点水平和坡度固定的曲线EC50值计算批产品的药效合相对药效；由于UNG-MRS-CD4没达到相同的基线水平，将该批产品排除此分析之外。使用两个MRS-CD4-001曲线的平均EC₅₀值计算相对药效。对每个板分别进行计算。

如上所述测定扎木单抗批产品抑制IL-2产生的能力。结果显示了一式两份样品上清液中IL-2的浓度。用四块板子检测全组扎木单抗批产品，每个实验测定两次。图11显示两个实验中的其中一个。

如上所述测定扎木单抗批产品抑制IL-2产生的能力。表5显示了两组实验相对于参比批产品MRS-CD4-001(2条MRS-CD4-001曲线的平均EC₅₀值)的相对活性(由基线固定曲线的EC₅₀值计算得到)。

表5

扎木单抗抑制IL-2产生的能力

所有被检测的扎木单抗批产品，除了对照批产品UNG-MRS-CD4，都可抑制IL-2的产生。批产品MOCK-MRS-CD4、M90-MRS-CD4、BN078和MEV005与参比批产品MRS-CD4-001的抑制方式相似。BO118抑制程度更高，批产品M50-MRS-CD4和MEV001抑制程度较低。不同实验之间和实验中存在高度变异性。当用参比和对照批产品的结果进行研究时，重链糖基化水平显示出在一定程度上与通过活化T细胞抑制IL-2产生的能力相关。完全糖基化参比批产品显示出最大活性，然而M50-MRS-CD4抑制IL-2产生的能力显著降低。M90-MRS-CD4具有与参比物相似的抑制IL-2产生的能力。

含有30％未糖基化重链的被检测批产品MEV005抑制IL-2产生的能力降低。然而未显示含有未糖基化重链的批产品MEV001抑制IL-2产生的能力也降低，而含有10％未糖基化重链的批产品BO118可以很好地抑制IL-2的产生，即使略高于参比查品。

实施例14

通过基于AlphaScreen ^TM 的分析法筛选数个扎木单抗批产品的 FcR结合和CD4结合

使用单一基于AlphaScreen^TM 的分析法检测数个扎木单抗批产品(见实施例8)与FcγRIIIa176V和CD4的结合。

将His标记FcγRIIIa176V偶联到Ni受体珠上。洗涤珠除去未结合的His标记FcγRIIIa176V。将sCD4-生物素偶联到SA供体珠上。洗涤珠除去未结合的sCD4-生物素。制备参比批产品MRS-CD4-001和H-IgG的稀释样品(范围：90、30、3、1、0.3、0.03和0μg/ml)。将可变体积的His标记FcγRIIIa176V-Ni-受体珠加入384孔光学板(optiplate)的孔中，然后加入固定体积的扎木单抗或H-IgG和固定体积的sCD4-生物素-SA-供体珠。在暗处于室温温育1h后，用带有“α筛选标记”的EnVision^TM仪器分析珠/抗体混合物。

图12证明两个实验具有相似的相对结合能力趋势。根据预期值，M50-MRS-CD4的平均结合能力为参比批产品的53％。M90-MRS-CD4显示出约75％的结合能力，略低于预期值。批产品B0118和BN078显示相似的结合能力(88％和89％)。批产品MEV005和MOCK-MRS-CD4的结合能力略低(84％和81％)。

实施例15

与细胞结合的FcγRI的结合

检测数个扎木单抗批产品(见实施例8)与细胞结合的FcγRI的结合。

收获IIA1.6和IIA1.6-FcγRI细胞(由L.Bevaart女生(免疫治疗部门，乌德勒支医疗中心大学，乌德勒支，荷兰)惠赠)并用台盼蓝排除法计数。在RT中将细胞于500g旋转5min，弃去上清，将细胞以1×10⁶个/ml重悬于染色液(含有1％v/v BSA(罗氏，Almere，NL)的PBS)和0.01％v/v叠氮化合物(Sigma-Aldrich Chemie B.V.))并以100μl/孔转移至96孔V形底板(Greiner，Frickenhausen，Germany，cat#651101)。在染色液中以2倍系列稀释制备扎木单抗批产品稀释液，浓度范围从10000ng/ml到9.8ng/ml。向细胞加入100μl样品、阴性对照IgG2(结合位点，伯明翰，英国，cat#BP080)或染色液，于4℃温育30min。用150μl染色液/孔洗涤细胞3次，RT旋转500g 5min。向细胞沉淀物加入100μl/孔的F(ab’)₂抗人-IgG-F(ab’)₂-FITC(Jackson，宾夕法尼亚，美国，产品#109-096-097；1∶100染色液稀释)，于4℃温育30min。用150μl染色液洗涤细胞3次，RT旋转500g 5min。将细胞重悬于150μl染色缓冲液中并转移至1.3ml的试管中。用FACSCalibur^TM(BD)或FACScan^TM(BD)分析细胞。

与参比批产品MRS-CD4-001相比，大部分批产品与细胞结合FcγRI的结合数量略低，尽管批产品之间的糖基化存在差异。应该注意的是这种测定方法的变异相对较高。而且含有50％糖基化重链的批产品M50-MRS-CD4的结合力更低。批产品UNG-MRS-CD4很难与板结合的FcγRI结合(图13)。

实施例16

与板结合的FcγRI的结合

检测数个扎木单抗批产品(见实施例8)与板结合的FcγRI的结合。

用His标记的重组FcγRI (Genmab B.V.，trecht，NL，批产品#EX2005-0403-016-TVE)以1.5μg/ml(100μl)包被平底96孔板，在PBS中于4℃温育过夜。用PBS洗板3次，倒空并用200μl/孔的PBSC在RT封闭非特异性结合位点1h。制备扎木单抗批产品稀释液，用PBSTC进行2倍系列稀释，浓度范围从4000ng/ml到31.25ng/ml。加入100μl稀释样品，在RT温育2h。弃去板中溶液，用PBST 1x(200μl/孔)洗涤3次。用1x PBSTC以1∶10.000稀释的羊[F(ab’)₂片段]抗人IgG F(ab’)₂特异HRP缀合物(Jackson，cat nr 109-096-097)(在EX2005-0505-008-MVO中使用羊抗人IgG F(ab’)₂特异HRP Jacksoncat nr 109-035-097缀合物)，每孔加入100μl缀合物。将板子在RT温育1h。弃去板中溶液，用PBST 1x(200μl/孔)洗涤3次。在吸水纸上拍板除去残余液体。将一片ABTS底物(50mg(罗氏诊断学(RocheDiagnostics)NL，Almere，NL，cat nr 1122422))溶解在50ml ABTS溶液中(罗氏，cat nr 1112597)，每孔加入100μl。用铝箔包裹板子在RT温育30min。用100μl/孔2％草酸[Sigma-Aldrich Chemie B.V.]终止反应。用分光光度计在405nm处读取吸光值[ELISA-EL808，Beun deRonde，Abcoude，NL]。

与参比批产品MRS-CD4-001相比，大部分批产品与细胞结合FcγRI的结合能力略低，尽管批产品之间存在糖基化差异。应该注意的是这个测定方法的变异相对较高。而且仅含有50％糖基化重链的批产品M50-MRS-CD4底结合能力显著降低。UNG-MRS-CD4未显示与FcγRI包被板很强的结合能力(图14)。

实施例17

扎木单抗批产品诱导ADCC的能力和与CD4、FcγRI、 FcγRIIIa176V或CD4和FcγRIIIa176V联合结合中测定的相对药效的关系

检测数批扎木单抗(见实施例8)与板结合的FcγRI的结合。

根据重链糖基化水平和与数个测定方法的潜在联系将参比产品和扎木单抗混合批产品(不同重链糖基化)分类。

与参比批产品MRS-CD4-001相比，批产品UNG-MRS-CD4、M50-MRS-CD4和M90-MRS-CD4都与CD4的结合能力类似(图15B；也见图9)，然而与FcγRI(图15C；也见图13和14)和FcγRIIIa176V(图15D；也见图5)的结合能力不同，这与重链糖基化水平相关。在AlphaScreen^TM测定法(图15E；图12)和功能ADCC(图15A；也见图3)中也确实存在这种关系。

这些数据显示与FcγR的结合确实与抗体Fc介导的活性相关，该活性在作用机制发挥关键作用。

实施例18

FcγRIIIa176V脱唾液酸化可提高FcγRIIIa176V结合ELISA的性能

检测源自CHO-K1SV细胞的两个FcγRIIIa176V批产品是否适用于板结合的FcγRIIIa176V结合ELISA(如上所述)。用100μl 2.5μg/mlFcγRIIIa176V批产品646-005-EP或655-015-EP包被Greiner板，于4℃温育过夜。用200μl PBST(含有0.05％Tween-20的PBS)洗板3次，加入100μl系列稀释扎木单抗样品(扎木单抗的浓度为300、75、18.75、4.69、0.29、1.17、0.07和0.02μg/ml)。将板子在RT振荡温育60min，加入200μl PBST洗涤3次，再加入以1∶4000稀释的缀合物过氧化酶亲和纯F(ab’)₂片段G抗人IgG，F(ab’)₂特异性片段((Jackson ImmunoResearch，Brunschwig Chemie B.V.，阿姆斯特丹，荷兰)。再次将板子在RT振荡温育60min，然后用200μl PBST洗涤3次。加入100μl ABTS(罗氏，cat nr1112597)并将板子在振荡条件下温育30min。用100μl/孔2％草酸[Sigma-Aldrich Chemie B.V.]终止反应，测定405nm处的吸光值。结果如图16所示。

批产品646-005-EP表现出较好的剂量反应曲线，顶点值较高，然而批产品655-015-EP的曲线更加平缓，顶点值较低。先前已注意到非变性电泳显示这些批产品带有不同的负电荷，例如批产品655-015-EP比批产品646-005-EP含有更多的负电荷(图17)。此外，这两个批产品在还原SDS-PAGE上迁移行为不同，但在用酶脱糖基化后它们迁移到相同位置(图18)。这表明分子量差异是由N连接糖基化的差异造成的。将批产品655-015-EP去唾液酸，在FcγRIIIa176V结合ELISA中比较脱唾液酸受体与未处理受体。

为了除去唾液酸，将批产品655-015-EP(在磷酸盐缓冲液中)与产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶(罗氏，目录号10269611001；约1mg FcγRIIIa176V中含有80mU唾液酸酶)于37℃温育72h。温育后，用TALON^TM珠纯化脱唾液酸受体并使用实施例5描述的PD-10柱子将缓冲液交换成磷酸缓冲液，得到1.2ml浓度为0.45mg/ml(batch 403-041-EP)的纯化脱唾液酸FcγRIIIa176V。

然后用SDS-PAGE(图19)和非变性凝胶电泳(图20)分析未处理655-015-EP和脱唾液酸批产品403-041-EP。与未处理FcγRIIIa176V相比，脱唾液酸批产品的负电荷显著较少，分子量略小。这表明受体已被成功地脱唾液酸。

在板结合的FcγRIIIa176V结合ELISA中比较脱唾液酸和未处理FcγRIIIa176V。两种制备物都以2.5μg/ml包被到板上，按上述方法与扎木单抗结合。图21清楚地显示了受体脱唾液酸化显著提高了板结合测定的性能。

为了确定这是否由脱唾液酸FcγRIIIa176V与板结合能力提高引起的，将两倍系列稀释脱唾液酸FcγRIIIa176V(批产品403-041-EP)和未处理FcγRIIIa176V(655-015-EP)包被到板上。起始浓度为10μg/ml。用PBTS洗板，用羊-抗-CD16-FITC(BD生物科学，目录号555406)然后用羊-抗-FITC-HRP(罗氏，目录号11426356910)检测结合的FcγRIIIa176V。用ABTS显示反应结果。图22显示了与未处理FcγRIIIa176V相比，脱唾液酸FcγRIIIa176V与板的结合能力确实有所提高。

实施例19

用包被于ELISA板上的his捕获抗体捕获his标记FcγRIIIa176V可以提高ELISA的敏感性。

比较将his标记FcγRIIIaECD176VHis直接包被于ELISA板和用his捕获抗体捕获his标记FcγRIIIaECD176VHis。

用100μl 1μg/ml FcγRIIIa176V批产品#0646-005-EP或用抗多聚组氨酸mAb(羊-抗-多聚组氨酸IgG1mAb克隆AD1.1.10，R&D，产品#MAB050，0.5mg/ml PBS/5％海藻糖，批号#AEJ 175031)包被Greiner板，于4℃温育过夜。用200μl PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗板3次，用含有1％BSA的PBS封闭60min。将抗多聚组氨酸mAb包被板与100μl1μg/ml FcγRIIIa158V批产品进一步在RT振荡温育60min，然后用200μl PBST洗涤3次。将两种类型的包被板与100μl系列稀释的HuMax-EGFr样品(HuMax-EGFr的浓度是300、75、18.75、4.69、0.29、1.17、0.07和0.02μg/ml；批产品1#095-03-01F和批产品2#P247740)在RT振荡温育60min，然后用200μl PBST洗涤3次，再加入缀合物以1∶10,000稀释的过氧化物酶偶联亲和纯F(ab’)₂片段G抗人IgG，F(ab’)₂特异片段(Jackson ImmunoResearch，Brunschwig Chemie B.V.，阿姆斯特丹，荷兰)。将板子在RT振荡温育60min，用200μl PBST洗涤3次。加入100μlABTS并在振荡条件将板子温育20min。加入100μl 2％草酸终止反应，测定405nm处的吸光值。

图23显示了两批抗体HuMax-EGFr与FcγRIIIa 176V的结合曲线(数据以平均值±SD，n＝3显示)，直接包被(上组图)或使用his捕获mAb(下组图)。使用his捕获的包被可以使HuMax-EGFr-FcγRIIIa 176V相互作用的亲和力更高，约比直接包被FcγRIIIa176V的亲和力高4倍。由于解离得更慢，所以更高亲和力也是有利的。因此，使用his捕获抗体来捕获his标记FcγRIIIa176V的方法可以提高结合ELISA的敏感性。显著地，两个被检测HuMax-EGFr批产品的EC50比率对于两种ELISA形式都是相同的(平均约2)，这表明这个测定形式与测定相对药效相当。

实施例20

扎木单抗对CD4+T细胞CD4受体的Fc依赖性下调用源自PBMC的CD4+T细胞(纯化见实施例7)或SUP-T1细胞，在加入或不加入源自PBMC的单核细胞(根据

单核细胞阴性分离试剂盒进行分离)或TPH-1细胞的条件下研究效应器细胞存在时扎木单抗下调CD4的能力。将PBMC或SUP-T1细胞与一定浓度范围的扎木单抗、扎木单抗-F(ab’)2片段(SUP-T1)、扎木单抗-Fab(SUP-T1)或阴性对照HuMab-KLH温育。在适当的时候将效应器细胞以效应器细胞和靶细胞比率为10∶1、5∶1或4∶1加入。加入IFN-γ(浓度范围125-1000μg/ml)，将细胞温育过夜。然后，将细胞染色用荧光标记M-T477(来自BD的非竞争Ab)检测细胞CD4和靶细胞筛选标记(区分靶细胞和其它细胞)。用流式细胞仪评价细胞相联荧光强度。

图24显示了使用新鲜分离的CD4+T细胞或SUP-T1T细胞用带有非竞争CD4单克隆抗体的流式细胞仪检测的扎木单抗诱导CD4下调的能力。纯化的原代CD4+T细胞(图4A)或SUP-T1T细胞(图4B)中对CD4表达的扎木单抗剂量依赖型下调分别需要单核细胞或单核细胞的存在。结果显示18-24h后CD4表达水平减少了50-80％。由于不论在有无辅助细胞的情况下与F(ab’)2片段温育不会引起CD4表达减少(图4B)所以下调为Fc依赖性的。在高mAb浓度下，可溶扎木单抗不能下调CD4，可能由于单体结合导致交联减少。通过固定化扎木单抗交联或与与可溶性扎木单抗预温育结合的板结合的IgG交联也下调CD4(数据未显示)。

所有这里引用的参考文献，包括出版物、专利应用和专利都以参考文献的形式被完整引用，与每一篇参考文献被单独和特别指出以参考文献被引用的程度相同。

这里使用的所有标题和副标题仅仅是为了方便起见，不应该以任何形式限制本发明。

除非这里另外说明或与专利内容相互矛盾，以上所述内容的任何可能变体的任何组合都包括在本发明中。

除非这里另外说明或与专利内容相互矛盾，在描述本发明的内容中所使用的术语“一”、“该”和类似指示代词包括单数和复数形式。

除非这里另外说明，这里列举的数值范围仅为指出在这一范围内的每一个单独数值的简便方法，每个单独的数值都包含在规格中，就像它们在这里被单独引用。除非另有说明，这里提供的所有精确数值代表相应的近似数值(例如也可认为这里提供的与某一具体因素或测定相关的精确示例数值也提供了相应的近似测定，适当时用“约”来修饰)。

除非这里另外说明或与专利内容相互矛盾，这里描述的所有方法可以按任何合适的顺序进行。

这里提供的所有实施例或示例性语言(例如“例如”)仅仅是为了更好地阐明本专利，除非特别指出，不会限制本专利的范围。规格里的语言都不应该指明任何一个元素对于实施本发明是必须的。

这里对专利文件的引用仅仅是为了方便起见，不反应出任何对这些专利文件的有效性、可专利性和/或强制性的观点。

本发明使用的与一元素或许多元素相关的例如“组成”、“具有”、“包括”或“含有”这样的术语对任何实施方案的描述意在支持由这一元素或许多元素“组成的”“主要组成的”或“被包括在内的”本发明的相似实施方案。(例如，这里描述的包含某一元素的一种组合物应理解为描述了由该种元素组成的一种组合物，除非另外说明或与专利内容明显矛盾)。

本发明在法律允许的最大范围内包括这里的实施方案中引用的主题的所有变体和等价物。

这里引用的所有专利、待审批专利应用和其它出版物均以参考文献的形式被完整引用。

序列表

<110>Genmab A/S

<120>Potency assay for antibody drug substance binding to an FCreceptor

<130>P/24 WO

<160>11

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>298

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<220>

<221>MISC_PEATURE

<223>FcyRIaECDHis

<400>1

Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln

1 5 10 15

Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser

20 25 30

Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu

35 40 45

Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln

50 55 60

Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser

65 70 75 80

Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile

85 90 95

Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg

100 105 110

Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys

115 120 125

Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe

130 135 140

Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile

145 150 155 160

Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr

165 170 175

Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro

180 185 190

Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val

195 200 205

Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln

210 215 220

Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn

225 230 235 240

Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly

245 250 255

Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg

260 265 270

Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro

275 280 285

Val Trp Phe His His His His His His His

290 295

<210>2

<211>206

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>FcyRII

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>FcyRIIIaECD176VHis

<400>2

Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala

1 5 10 15

Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro

20 25 30

Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln

35 40 45

Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu

50 55 60

Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr

65 70 75 80

Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu

85 90 95

Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln

100 105 110

Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys

115 120 125

His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn

130 135 140

Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro

145 150 155 160

Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val

165 170 175

Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln

180 185 190

Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser His His His His His His

195 200 205

<210>3

<211>206

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>FcyRIIIaECD176FHjs

<400>3

Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala

1 5 10 15

Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro

20 25 30

Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln

35 40 45

Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phc His Asn Glu

50 55 60

Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr

65 70 75 80

Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu

85 90 95

Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln

100 105 110

Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys

115 120 125

His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn

130 135 140

Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro

145 150 155 160

Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe

165 170 175

Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln

180 185 190

Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser His His His His His His

195 200 205

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>4

gatcccgggg ccgccaccat gtggttcttg acaactctgc 40

<210>5

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>5

ccgtacgtta gtgatggtga tggtgatgat gaaaccagac aggagttgg 49

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>6

gaagacttaa ggcagcggca gaa 23

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>7

tcggacatct catgactttc ttt 23

<210>8

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>8

gatcccgggg ccgccaccat gtggcagctg ctcctcccaa 40

<210>9

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>9

cgaattctta gtgatggtga tggtgatgtg agatggttga cactgccaa 49

<210>10

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>10

tacttctgca gggggctttt cgggagtaaa aatgtgtct 39

<210>11

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>11

agacacattt ttac tcccga aaagccccct gcagaagta 39

Claims

1. 一种测定含有FcR结合肽药品药效的方法，其中药品FcR结合肽的至少一种作用机制是通过药品FcR结合肽与Fc受体结合介导，其中所述方法包括测定药品FcR结合肽与Fc受体结合的方法。

2. 一种根据权利要求1的用于测定含有FcR结合肽药品药效的方法，该方法包括

i)测定参比标准FcR结合肽与Fc受体的结合

ii)测定药品FcR结合肽与上述Fc受体的结合

iii)比较步骤ii)FcR与步骤i)FcR的结合情况，使用比较得到的信息评价药物的药效；

其中

a)步骤ii)中与Fc受体的结合与步骤i)中与Fc受体的结合以相同的方式测定，

b)药品FcR结合肽的至少一种作用机制是通过FcR结合肽与Fc受体结合介导，

c)其中参比标准FcR结合肽和药品FcR结合肽是同种FcR结合分子的两种不同制剂。

3. 一种生产含有FcR结合肽药物组合物的方法，该方法包括

a)生产含有上述FcR结合肽的药品；

b)将权利要求1或权利要求2中的方法应用于上述药品，测定含有FcR结合肽药品的药效；

4. 一种根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述方法是所述药品作为药物组合物销售的上市许可申请的一部分。

5. 一种申请含有FcR结合肽药品上市许可的方法，该方法包括对根据权利要求1-4任一项中用于测定药品FcR结合肽药效测定方法的描述。

6. 一种根据权利要求1-5任一项的方法，其中用于测定含有FcR结合肽药品药效的方法被用于批签发的药效测定。

7. 一种根据权利要求1-6任一项的方法，其中用以下方法测定FcR结合肽与Fc受体的结合

(i)使药品样品与Fc受体接触足够长的时间以使FcR结合肽与Fc受体结合，

(ii)检测与Fc受体结合的FcR结合肽的量。

8. 一种根据权利要求7的方法，其中用针对FcR结合肽的检测抗体进行检测。

9. 一种根据权利要求8的方法，其中检测抗体是标记抗体。

10. 一种根据权利要求1-9中任一项的方法，其中用ELISA测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

11. 一种根据权利要求1-6中任一项的方法，其中用AlphaScreen^TM测定法检测FcR结合肽与Fc受体的结合。

12. 一种根据权利要求1-6中任一项的方法，其中用放射免疫测定法检测FcR结合肽与Fc受体的结合。

13. 一种根据权利要求1-6中任一项的方法，其中用Biacore测定法检测FcR结合肽与Fc受体的结合。

14. 一种根据权利要求1-6中任一项的方法，其中用FMAT测定法检测FcR结合肽与Fc受体的结合。

15. 一种根据权利要求1-6中任一项的方法，其中用DELFIA测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

16. 一种根据权利要求1-15中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。

17. 一种根据权利要求1-15中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过诱导ADCC或靶受体的下调介导。

18. 一种根据权利要求1-17的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集自然杀伤细胞介导。

19. 一种根据权利要求1-18中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过诱导自然杀伤细胞的ADCC介导。

20. 一种根据权利要求1-19中任一项的方法，其中至少一种在体内结合FcR结合肽的Fc受体在自然杀伤细胞上表达。

21. 一种根据权利要求17-20中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIIa受体或其保留了Fc区结合能力的片段。

22. 一种根据权利要求21的方法，其中FcγRIII受体是一种FcγRIIIa176V受体或其保留了Fc区结合能力的片段，例如胞外结构域。

23. 一种根据权利要求1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集多形核白细胞介导。

24. 一种根据权利要求1-23中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过诱导多形核白细胞的ADCC介导。

25. 一种根据权利要求1-24中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过诱导PMN脱颗粒作用介导。

26. 一种根据权利要求1-25中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过诱导多形核白细胞的吞噬作用介导。

27. 一种根据权利要求1-17或23-26中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在多形核白细胞上表达。

28. 一种根据权利要求23-27中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIa受体或其保留了Fc区结合能力的片段。

29. 一种根据权利要求1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过诱导单核细胞或巨噬细胞的ADCC介导。

30. 一种根据权利要求1-17或29中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在单核细胞和/或巨噬细胞上表达。

31. 一种根据权利要求1-17、29或30中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIb或其保留了Fc区结合能力的片段。

32. 一种根据权利要求1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导血小板聚集。

33. 一种根据权利要求1-17或32中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集血小板介导。

34. 一种根据权利要求1-17、32或33中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在血小板上表达。

35. 一种根据权利要求1-17或32-34中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

36. 一种根据权利要求1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导细胞因子的产生。

37. 一种根据权利要求1-17或36中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集自然杀伤细胞和/或T细胞介导。

38. 一种根据权利要求1-17、36或37中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在自然杀伤细胞和/或T细胞上表达。

39. 一种根据权利要求1-17或36-38中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

40. 一种根据权利要求1-17或36-38中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

41. 一种根据权利要求1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导清除免疫复合物。

42. 一种根据权利要求1-17或41中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集单核细胞或巨噬细胞介导。

43. 一种根据权利要求1-17、41或42中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体表达在单核细胞或巨噬细胞上。

44. 一种根据权利要求1-17或41-43中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIII或其保留了Fc区结合能力的片段。

45. 一种根据权利要求1-17或41-43中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

46. 一种根据权利要求1-17或41-43中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIIb或其保留了Fc区结合能力的片段。

47. 一种根据权利要求1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导抗体应答下调。

48. 一种根据权利要求1-17或47中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集B细胞介导。

49. 一种根据权利要求1-17、47或48中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在B细胞上表达。

50. 一种根据权利要求1-17或47-49中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIb或其保留了Fc区结合能力的片段。

51. 一种根据权利要求1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导单核细胞和巨噬细胞效应器功能抑制作用。

52. 一种根据权利要求1-17或51的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集单核细胞和/或巨噬细胞介导。

53. 一种根据权利要求1-17、51或52中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在单核细胞和/或巨噬细胞上表达。

54. 一种根据权利要求1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导吞噬作用。

55. 一种根据权利要求1-17或54中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集多形核白细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞介导。

56. 一种根据权利要求1-17、54或55中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在多形核白细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞上表达。

57. 一种根据权利要求1-17或54-56中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIIb或其保留了Fc区结合能力的片段。

58. 一种根据权利要求1-17或54-56中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

59. 一种根据权利要求1-17或54中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过诱导单核细胞或巨噬细胞的吞噬作用介导。

60. 一种根据权利要求1-17或59中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在单核细胞或巨噬细胞上表达。

61. 一种根据权利要求1-17、59或60中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIb或其保留了Fc区结合能力的片段。

62. 一种根据权利要求1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是诱导交联作用。

63. 一种根据权利要求1-17或62中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过细胞和/或抗体的交联作用介导。

64. 一种根据权利要求1-17、权利要求54或权利要求63中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

65. 一种根据权利要求1-17、54或63中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRII或其保留了Fc区结合能力的片段。

66. 一种根据权利要求1-17、54或63中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIII或其保留了Fc区结合能力的片段。

67. 一种根据权利要求1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过免疫受体基于酪氨酸的活化基序来诱导正向信号传导。

68. 一种根据权利要求1-17或67中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集骨髓细胞、T细胞和/或血小板介导。

69. 一种根据权利要求1-17或67或68的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在骨髓细胞、T细胞和/或血小板上表达。

70. 一种根据权利要求1-17、或67-69中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

71. 一种根据权利要求1-17、或67-69中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIc或其保留了Fc区结合能力的片段。

72. 一种根据权利要求1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过普通γ、β、ζ链来诱导正向信号传导。

73. 一种根据权利要求1到17、或72中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过募集骨髓细胞、多形核白细胞、自然杀伤细胞或T细胞介导。

74. 一种根据权利要求1-17、72或73中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽的Fc受体在骨髓细胞，多形核白细胞，自然杀伤细胞或T细胞上表达。

75. 一种根据权利要求1-17或72-74中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

76. 一种根据权利要求1-17或72-74中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

77. 一种根据权利要求1-17或72-74中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIIa或其保留了Fc区结合能力的片段。

78. 一种根据权利要求1-17中任一项的方法，其中FcR结合肽的一个作用机制是通过免疫受体基于酪氨酸的抑制基序来诱导负向信号传导。

79. 一种根据权利要求1-17或78中任一项的方法，其中FcR结合肽的一种作用机制是通过募集B细胞、巨噬细胞和/或单核细胞介导。

80. 一种根据权利要求1-17、78或79中任一项的方法，其中至少一种在体内与FcR结合肽结合的Fc受体在B细胞、巨噬细胞和/或单核细胞上表达。

81. 一种根据权利要求1-17、或78-80中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRIIb或其保留了Fc区结合能力的片段。

82. 一种根据权利要求1-17中任一项的方法，其中Fc受体是一种FcγRn或其保留了Fc区结合能力的片段。

83. 一种根据权利要求1-82中任一项的方法，其中上述方法使用的Fc受体是用含有制备步骤的方法制备，与使用不包括所述步骤的方法制备得到的相似Fc受体相比，所述步骤可产生N-连接糖基化上唾液酸数量减少的Fc受体。

84. 一种根据权利要求83的方法，其中Fc受体在唾液酸化机制缺陷的宿主细胞中表达。

85. 一种根据权利要求83的方法，其中Fc受体在用于上述方法之前用唾液酸酶处理。

86. 一种根据权利要求1-85中任一项的方法，其中FcR结合肽是一种抗体。

87. 一种根据权利要求86的方法，其中FcR结合肽是一种单克隆抗体。

88. 一种根据权利要求86或87的方法，其中FcR结合肽是一种人抗体。

89. 一种根据权利要求86或87的方法，其中FcR结合肽是一种人源化抗体。

90. 一种根据权利要求86或87的方法，其中FcR结合肽是一种嵌合抗体。

91. 一种根据权利要求86-90中任一项的方法，其中FcR结合肽是含有Fc结合部分的抗体片段。

92. 一种根据权利要求86-91中任一项的抗体，其中FcR结合肽是一种IgG1抗体。

93. 一种根据权利要求92的方法，其中FcR结合肽是一种IgG1，λ抗体。

94. 一种根据权利要求92的方法，其中FcR结合肽是一种IgG1，κ抗体。

95. 一种根据权利要求86-94中任一项的方法，其中所述抗体与Fc受体的结合测定与测定抗体与其抗原结合的方法联合使用。

96. 一种根据权利要求95的方法，其中使用以下方法测定抗体与其抗原的结合

(i)使抗体样品与抗原接触足够长的时间以使抗体与抗原结合，

(ii)检测结合抗原的抗体量。

97. 一种根据权利要求96的方法，其中使用针对药品抗体的检测抗体进行检测。

98. 一种根据权利要求97的方法，其中所述检测抗体是一种标记抗体。

99. 一种根据权利要求95-98中任一项的方法，其中使用ELISA测定抗体与其抗原的结合。

100. 一种根据权利要求99的方法，其中上述ELISA也用于测定抗体与Fc受体的结合。

101. 一种根据权利要求95的方法，其中使用AlphaScreen^TM检测法测定抗体与其抗原的结合。

102. 一种根据权利要求101的方法，其中也使用AlphaScreen^TM检测法测定抗体与Fc受体的结合。

103. 一种根据权利要求95的方法，其中使用放射免疫检测法测定抗体与其抗原的结合。

104. 一种根据权利要求103的方法，其中也使用放射免疫检测法测定抗体与Fc受体的结合。

105. 一种根据权利要求104的方法，其中放射免疫测定法使用与Fc受体和贡献放射性的抗原缀合的珠。

106. 一种根据权利要求86-105中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人CD4结合的抗体。

107. 一种根据权利要求106的方法，其中FcR结合肽是扎木单抗。

108. 一种根据权利要求106的方法，其中FcR结合肽是凯利昔单抗。

109. 一种根据权利要求106的方法，其中FcR结合肽是克立昔单抗。

110. 一种根据权利要求106的方法，其中FcR结合肽是TNX355。

111. 一种根据权利要求106的方法，其中FcR结合肽是TRX-1。

112. 一种根据权利要求106的方法，其中FcR结合肽是IOT4a。

113. 一种根据权利要求106的方法，其中FcR结合肽是4162W94。

114. 一种根据权利要求1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人EGFR结合的抗体。

115. 一种根据权利要求114的方法，其中FcR结合肽是西妥昔单抗。

116. 一种根据权利要求114的方法，其中FcR结合肽是HuMax-EGFR。

117. 一种根据权利要求1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是与人CD20结合的抗体。

118. 一种根据权利要求117的方法，其中FcR结合肽是人利妥昔单抗。

119. 一种根据权利要求117的方法，其中FcR结合肽是替伊莫单抗。

120. 一种根据权利要求117的方法，其中FcR结合肽是托西莫单抗。

121. 一种根据权利要求117的方法，其中FcR结合肽是HuMax-CD20。

122. 一种根据权利要求1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是与一种人TAC结合的抗体。

123. 一种根据权利要求122的方法，其中FcR结合肽是HuMax-TAC。

124. 一种根据权利要求1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是一种与人CD3结合的抗体。

125. 一种根据权利要求124的方法，其中FcR结合肽是莫罗单抗。

126. 一种根据权利要求1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是一种与人GPIIb/IIIa结合的抗体。

127. 一种根据权利要求1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是一种与人CD25结合的抗体。

128. 一种根据权利要求127的方法，其中FcR结合肽是达克珠单抗。

129. 一种根据权利要求127的方法，其中FcR结合肽是巴利昔单抗。

130. 一种根据权利要求1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是一种与人TNF-α结合的抗体。

131. 一种根据权利要求130的方法，其中FcR结合肽是英利昔单抗。

132. 一种根据权利要求130的方法，其中FcR结合肽是阿达木单抗。

133. 一种根据权利要求1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是一种与人RSV结合的抗体。

134. 一种根据权利要求133的方法，其中FcR结合肽是帕利珠单抗。

135. 一种根据权利要求1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是一种与人HER-2/neu结合的抗体。

136. 一种根据权利要求135的方法，其中FcR结合肽是曲司珠单抗。

137. 一种根据权利要求135的方法，其中FcR结合肽是培妥珠单抗。

138. 一种根据权利要求1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是一种与人CD33的结合的抗体。

139. 一种根据权利要求1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是一种与人CD52结合的抗体。

140. 一种根据权利要求139的方法，其中FcR结合肽是阿仑珠单抗。

141. 一种根据权利要求1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是一种与人VEGF的结合的抗体。

142. 一种根据权利要求141的方法，其中FcR结合肽是贝伐珠单抗。

143. 一种根据权利要求1-94中任一项的方法，其中FcR结合肽是一种与人CTLA4结合的抗体。

144. 一种根据权利要求143的方法，其中FcR结合肽是MDX-010。

145. 一种被批准作为药物组合物使用的含有FcR结合肽的药品，其中一种根据权利要求1-144任一项的方法是上市许可申请中的一部分。

146. 一种在测定FcR结合肽与上述Fc受体结合的方法中使用的Fc受体的制备方法，其中上述Fc受体是用含有制备步骤的方法制备的，与使用不包括所述步骤的方法制备得到相似Fc受体相比，所述步骤可产生N-连接糖基化唾液酸数量减少的Fc受体。

147. 一种根据权利要求146的方法，其中用以下方法测定FcR结合肽与上述Fc受体的结合

(i)使FcR结合肽与Fc受体接触足够长的时间以使抗体与抗原结合，

(ii)检测与Fc受体结合的FcR结合肽的量。

148. 一种根据权利要求147的方法，其中使用针对FcR结合肽的检测抗体进行检测。

149. 一种根据权利要求148的方法，其中所述检测抗体是一种标记抗体。

150. 一种根据权利要求146-149中任一项的方法，其中使用ELISA测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

151. 一种根据权利要求146-149中任一项的方法，其中使用AlphaScreen^TM检测法测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

152. 一种根据权利要求146-149中任一项的方法，其中使用放射免疫检测法测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

153. 一种根据权利要求146-149中任一项的方法，其中使用Biacore检测法测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

154. 一种根据权利要求146-149中任一项的方法，其中使用FMAT测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

155. 一种根据权利要求146-149中任一项的方法，其中使用DELFIA测定FcR结合肽与Fc受体的结合。

156. 一种根据本发明或权利要求1-155中任一项的方法，其中使用包被在ELISA板上的His捕获抗体来捕获his标记的FcR或FcR片段。

157. 一种适用于用多肽分子包被的塑料部件，其中多肽分子与塑料部件的粘附至少部分依赖于多肽分子与塑料部件表面之间的静电相互作用，其中塑料部件表面已经包被脱唾液酸化多肽。

158. 一种根据权利要求157的塑料部件，其中所述多肽分子是一种Fc受体。

159. 一种根据权利要求157或158的塑料部件，其中所述塑料部件是微量滴定板。

160. 一种根据权利要求157-159中任一项的塑料部件，其中所述塑料部件适用于权利要求1-144中任一项的方法。

161. 一种根据权利要求157-159中任一项的塑料部件，其中所述塑料部件可用于权利要求1-144中任一项的方法。