CN103946377B

CN103946377B - 来自化脓性链球菌的内切糖苷酶及其使用方法

Info

Publication number: CN103946377B
Application number: CN201280044106.0A
Authority: CN
Inventors: 马提斯·考林; 玛利亚·奥宏; 乔纳森·斯约根
Original assignee: Genovis AB
Current assignee: Genovis AB
Priority date: 2011-09-13
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2016-10-05
Anticipated expiration: 2032-09-12
Also published as: PL2756077T3; EP2756077A1; CN103946377A; AU2012307461A1; IL231410A0; KR20140081813A; CA2848230C; GB201406321D0; AU2012307461B2; EA028490B8; NZ622172A; PT2756077T; ZA201401840B; EA201490447A1; ES2627334T3; JP2014531205A; SG11201400505YA; KR102001427B1; CA2848230A1; GB2509284A

Abstract

本发明提供一种内切糖苷酶，称为EndoS49，氨基酸序列为SEQ ID NO:1。EndoS49分离自化脓性链球菌NZ131菌株，是EndoS的同源物。EndoS49在天然IgG上具有特异的内切糖苷酶活性并比EndoS裂解更多种类的Fc聚糖。本发明制备了其一个突变体，其中SEQ ID NO:1第186位点的谷氨酸被取代，所述突变体缺乏内切糖苷酶活性但能够结合至IgG。本发明公开了使用EndoS49、其缺失体和所述突变体的方法，特别是用于评价IgG糖基化或分离IgG。

Description

来自化脓性链球菌的内切糖苷酶及其使用方法

技术领域

本发明涉及新的内切糖苷酶、其缺乏聚糖水解活性的突变体、以及其在水解糖蛋白的聚糖的方法中用途。

背景技术

内切糖苷酶S(EndoS)由化脓性链球菌的多种血清型菌株分泌，并且对天然IgG具有特异的内切糖苷酶活性，其水解连接至IgG的重链上的第297位天冬酰胺残基的保守多糖。Collin and Olsen, The EMBO Journal, 2001, 20 3046-3055. EndoS是第一个知道的对天然IgG有独特特异性的细菌酶。相反，其他已知的内切糖苷酶的活性需要糖蛋白底物的变性或其活性通过该变性而增强。

抗体(例如IgG)在基础研究和诊断及药物开发中有许多应用。在某些这些应用中，例如免疫组化、免疫分析、肿瘤检测、放疗、抗体结合位点的晶体研究以及免疫打靶，使用Fab片段比使用整个IgG分子更方便。使用Fab片段的一些优点在于，它们不会受细胞上的Fc受体或受沉淀抗原的影响，它们表现出降低的免疫原性并且对吞噬作用较不敏感，放射性标记的Fab片段比整个IgG分子更快速地从组织中清除。在另外的应用中，可能期望使用去糖基化的抗体或其他糖蛋白。

IgG分解为Fab和Fc片段通常使用蛋白水解酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)来进行。这些酶通常分解其他蛋白，因此分解反应通常必须对纯化的IgG组分进行。而且，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶通常在不止一个位点分解IgG。这意味着，所获得的片段通常不对应于整个Fab或Fc片段，并且即使分解不产生Fab和Fc片段，它们通常会进一步分解成较小的片段。Fc片段与Fab片段的分离通常使用蛋白质A或G亲和分离柱来进行，其使用了细菌蛋白质A和G的Fc-结合性质。

许多不同的糖蛋白在治疗应用中具有用途。分析这些蛋白的糖基化的方法在药物蛋白的研发中具有用途。也可能期望提供这些蛋白的不同的糖基化形式。

发明内容

发明人从血清型M49化脓链球菌中发现了新的内切糖苷酶，本文称EndoS49。EndoS49分离自NZ131菌株，它是血清型M49的致肾炎且高度可转化菌株。NZ131菌株是在新西兰从一例急性链球菌感染后肾小球肾炎的患者中临床分离得到的。在蛋白质水平，EndoS49与EndoS具有小于40%的一致性，并且是一个90kDa蛋白质，而EndoS是一个108kDa的蛋白质。EndoS49比EndoS具有对更广范围的蛋白质的去糖基化活性。

这种酶是90kDa的酶，具有家族18糖苷水解酶催化结构域。EndoS49水解人糖蛋白上的聚糖，特别是IgG1-4和α-1-微球蛋白。EndoS49可被用在人糖蛋白(包括IgG和α-1-微球蛋白)上的聚糖的水解中。因此，EndoS49可被用在糖基化概括分析(glycoprofilinganalysis)中，其中酶与糖蛋白接触，所产生的产物被分离以分析聚糖和蛋白。EndoS49也可被用来制备去糖基化的蛋白。该酶可被修饰以降低或去除内切糖苷酶活性。

缺乏内切糖苷酶活性的经修饰的EndoS49多肽可被用在分离糖基化的和/或功能上有活性的IgG的方法中。通过与其他能结合变性的和/或去糖基化的IgG的IgG结合试剂结合使用这种经修饰的EndoS49多肽，本发明的发明人还发现了一种评价含IgG样品的糖基化状态或功能质量的方法。

根据本发明，其提供一种多肽，包含：

(a) SEQ ID NO:1的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50%一致性且具有内切糖苷酶活性的变体；或

(c)它们的任一个的具有内切糖苷酶活性的片段。

本发明还提供了一种能够结合至IgG并且不具有内切糖苷酶活性的多肽，该多肽包含

(a) SEQ ID NO:2的氨基酸序列；

(b) 与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50%一致性的变体，其中相当于186位点处的谷氨酸的氨基酸被取代；或

(c)它们的任一个的片段。

本发明还提供编码或表达本发明的多肽的多核苷酸、表达载体和宿主细胞。本发明还涉及本发明的多肽在测定或分析蛋白质(特别是抗体，特别是IgG抗体)的糖基化状态的方法中的用途。

本发明还提供用于从含IgG样品中分离IgG的方法，该方法包括：

(a)将所述含IgG样品与缺乏IgG内切糖苷酶活性的经修饰的EndoS49多肽相接触，

(b)将所述EndoS49与被接触的样品分离；

从而获得分离的IgG。

另外，本发明提供评价含IgG样品的糖基化状态或功能质量的方法，该方法包括获取该含IgG样品的第一和第二子样品，其中对第一子样品实施根据以上方法的步骤(a)和(b)，并且对第二子样品实施以上步骤(a)和(b)，只是EndoS49多肽被能够结合变性的和/或去糖基化的IgG的另一种IgG结合试剂替代，该方法进一步包含：

(c)对结合至第一子样品中的EndoS49多肽的IgG的量，以及结合至第二子样品中的另一种IgG结合试剂的IgG的量，进行定量；和

(d)对比(c)中测定的被结合的IgG的两个量；

从而评价含IgG样品的糖基化状态或功能质量。

本发明的经修饰的酶也可被用在分离IgG的Fab或Fc片段的方法中。本发明的方法利用来自化脓性链球菌的高度特异性IgG裂解酶，IdeS(化脓性链球菌的免疫球蛋白G降解酶)，以及EndoS49多肽。

在本发明的一个方法中，含IgG的样品与IdeS和EndoS49多肽接触，其是经修饰的EndoS49多肽，如上所述，该多肽缺乏内切糖苷酶活性。

在本发明的方法中，通常IdeS将IgG裂解为Fab片段和Fc片段，EndoS49多肽结合至Fc片段。Fc片段随后与Fab片段分离。

该方法对于从包含纯化的IgG的样品中分离Fab或Fc片段特别有用。更具体而言，使用本发明的经修饰的EndoS49多肽来从包含纯化的IgG样品中分离Fab或Fc片段是有用的。但是，该方法也可适用于含有非纯化的IgG的样品，例如血清、细胞裂解物或细胞培养物。

本发明还提供了进行本发明的方法的试剂盒。

附图说明

图1. EndoS49和EndoS的ClustalW比对显示出两种不同的蛋白质。使用MacVector软件中的ClustalW来比对EndoS49和EndoS。GH18催化模体(D**D*D*E)存在于179-186位点，Glu186是催化残基。

图2. EndoS49对糖蛋白具有活性。A. 1 µg的EndoS49、其催化突变体和平截形式与3 µg人IgG在PBS中温育过夜(37℃)并在SDS-PAGE凝胶上分析，并进行LCA凝集素印迹。B.1 µg EndoS49和EndoS49(E186L)与3 µg的人IgG的亚类1-4温育，并进行如上分析。C. 1 µgEndoS49及其突变体与3 µg α-1-微球蛋白温育，并在10%SDS-PAGE凝胶上分析。

图3. EndoS49结合至IgG。4µg、2µg 和1 µg的EndoS49及其突变体被固定在PVDF膜上并与人IgG温育，随后与结合有HRP的蛋白质G一起温育。

图4. ndoS49和ndoS的基因组文本。在MacVector中进行GAS菌株NZ131(M49)和5005(M1)中的ndoS49和ndoS 周围的基因的对比。

图5. EndoS49和其他细菌内切糖苷酶的系统发生分析。

图6. 在用EndoS 或EndoS49消化、随后用IdeS消化，再测定阿伐斯汀(Avastin)和爱必妥(Erbitux)的SDS PAGE凝胶。

序列简述

SEQ ID NO:1是从化脓性链球菌M49血清型NZ131中分离的EndoS49多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2是衍生自SEQ ID NO:1的序列的经修饰EndoS49多肽(E186L)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是编码EndoS49多肽的核苷酸序列。

SEQ ID NO:4是分离自化脓性链球菌AP1的IdeS的氨基酸序列。

具体实施方式

一般多肽特性

本发明涉及新的多肽EndoS49。本发明还提供利用细菌蛋白质EndoS49和IdeS以及其他蛋白质的各种方法。术语蛋白质、肽和多肽在本发明中可互换使用。要理解的是，本发明的某些多肽和方法需要具有内切糖苷酶活性的EndoS49，而本发明的其他多肽和方法需要缺乏所述活性的经修饰EndoS49多肽。

以下部分设计本发明的所有多肽的一般特性，特别涉及包含在本发明的多肽内的氨基酸序列的变化、改变、修饰或衍生。要理解的是，如本文中所描述的多肽的这些变化、改变、修饰或衍生要满足的条件是这些多肽保留如可能在说明书的后续部分指出的任何进一步要求的活性或特征。

本发明的多肽变体可通过特定水平的氨基酸一致性来定义，这将在下文更详细地描述。氨基酸一致性可利用合适的算法来计算。例如，FILEUP和BLAST算法可被用来计算同源性或排列序列(例如识别等价或对应序列)(通常依赖它们的默认设置)。例如，如在Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) JMol Biol 215:403-10中所描述的。进行BLAST分析的软件可从NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取。该算法包括首先识别高分值序列对(HSP)，这通过在查询序列中识别长度为W的短单字来进行，当与数据库序列中的相同长度单字比对时，这些短单字匹配或满足一些正值阈值分值T。T被称为相邻单字分值阈值(见以上Altschul等)。这些最初的相邻单字命中结果用作启动搜索的种子，以寻找含有它们的HSP。单字命中结果然后沿每个序列的两个方向延伸，直到可以增加累计比对分值。单字命中沿两个方向的延伸在下列情况下停止：累计排列分值从所达到的最大值下降了X；由于一种或多种负分残基排列的累计作用，累计分值为零或以下；或者到达序列的终点。BLAST算法参数W、T和X确定比对的敏感性和速度。BLAST程序使用以下默认值：单字长度(W)为11，BLOSUM62计分矩阵(见Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，双链都进行比较。

BLAST算法在两个序列间进行相似度的统计学分析；参见例如Karlin andAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787。BLAST算法提供的相似度的一个量度是最小总和概率(P(N))，它预示两种核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的可能性。例如，如果在第一序列与第二序列的比较中，最小总和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，最优选地小于约0.001，那么认为该第一序列与第二序列是相似的。或者，UWGCG软件包提供了BESTFIT程序，该程序可被用来计算同源性(例如基于其默认设置使用)(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395)。

要理解的是，本发明的多肽变体也包括取代变体。取代变体优选地涉及一个或多个氨基酸被相同数目的氨基酸替换并形成保守氨基酸取代。例如，一个氨基酸可悲具有相似性质的另一氨基酸取代，例如另一碱性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一带电氨基酸、另一亲水性氨基酸、另一疏水性氨基酸、另一极性氨基酸、另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸。可被用来选择合适的取代的主要的20种氨基酸的一些性质如下所示。

Ala	脂肪族，疏水，中性	Met	疏水，中性
				Cys	极性，疏水，中性	Asn	极性，亲水，中性
Asp	极性，亲水，带电(-)	Pro	疏水，中性
				Glu	极性，亲水，带电(-)	Gln	极性，亲水，中性
Phe	芳族，疏水，中性	Arg	极性，亲水，带电(+)
				Gly	芳族，中性	Ser	极性，亲水，中性
His	芳族，极性，亲水，带电(+)	Thr	极性，亲水，中性
				Ile	芳族，疏水，中性	Val	脂肪族，疏水，中性
Lys	极性，亲水，带电(+)	Trp	脂肪族，疏水，中性
				Leu	脂肪族，疏水，中性	Tyr	芳族，极性，疏水

本发明的多肽以及用于本发明的多肽可为实质上分离的形式。要理解的是，多肽可与载体或稀释剂混合，而不会干扰该多肽的预期用途并且仍然被认为是实质上分离的。用于本发明的多肽也可为实质上纯化的形式，此时它通常将该多肽包含在制剂中，该制剂中的多于50 wt%(例如多于80%、90%、95%或99%)的多肽是本发明的多肽。

本发明的多肽的或用于本发明的多肽的氨基酸序列可经修饰而包括非天然的氨基酸或用来增加成分的稳定性。当多肽由合成手段生产时，这些氨基酸可在生产过程中被引入。多肽也可被在合成或重组生产后修饰。

本发明的多肽或用于本发明的多肽也可利用D-氨基酸来生产。在这种情况下，氨基酸将以C至N方向的相反顺序相连。这在生产这些多肽的领域是常规技术。

许多侧链修饰在本领域是已知的，并且可对这些多肽的侧链进行修饰，条件是这些多肽保留如可能在本文指出的任何进一步要求的活性或特性。

要理解的是，本发明的多肽或用于本发明的多肽可被化学修饰，例如在翻译后被修饰。例如，它们可被糖基化、磷酸化或包含经修饰的氨基酸残基。它们可通过添加促进插入到细胞膜的信号序列而被修饰。

本发明的多肽也可被衍生化或修饰以辅助它们的分离或纯化。因此，在本发明的一个实施方式中，用于本发明的多肽通过添加能够直接且特异性的结合至分离装置的配体而被衍生化或修饰。或者，多肽通过添加结合配对中的一个成员而被衍生化或修饰，并且该分离装置包含通过添加结合配对中的另一个成员而被衍生化或修饰的试剂。可使用任何适当的结合配对。在优选的实施方式中，当用于本发明的多肽通过添加结合配对中的一个成员而被衍生化或修饰时，该多肽优选是带有组氨酸或生物素标签的。通常，组氨酸或生物素标签的氨基酸编码序列被包括在基因水平，并且蛋白质在大肠杆菌中被重组表达。组氨酸或生物素标签通常存在于多肽的一端，或位于N末端，或位于C末端。通常，组氨酸标签由六个组氨酸残基组成，但它可以比这更长，通常至多7、8、9、10或20个氨基酸或更短，例如5、4、3、2或1个氨基酸。而且，组氨酸标签可含有一个或多个氨基酸取代，优选为上述的保守取代。

具有内切糖苷酶活性的EndoS49多肽

在这种情况下，EndoS49多肽优选是化脓性链球菌EndoS49，或化脓性链球菌EndoS49的保留内切糖苷酶活性的变体或片段。该变体可为来自另一种马链球菌、兽疫链球菌或优选地化脓性链球菌的EndoS49多肽。EndoS49多肽可包含：

(a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列；

(c)它们的任何一个的具有内切糖苷酶活性的片段。

优选地，该多肽包含SEQ ID NO:1的序列或由该序列组成。SEQ ID NO:1是来自化脓性链球菌的EndoS49的序列。本发明的EndoS49多肽可不额外地包含信号序列。

本部分所描述的多肽变体与SEQ ID NO:1中的氨基酸序列不同，但仍保留EndoS49的内切糖苷酶活性。这些变体可包括等位变体以及在蛋白质序列中的单个氨基酸的或氨基酸群组的缺失、变性或添加，只要该肽保持IgG内切糖苷酶活性。

变体序列通常不同点在于至少1、2、3、5、10、20、30、50、100或更多个突变(可为氨基酸取代、缺失或插入)。例如，可进行1至100个、2至50个、3至30个或5至20个氨基酸取代、缺失或插入，条件是经修饰的多肽保留作为IgG特异性内切糖苷酶的活性。

SEQ ID NO:1的氨基酸序列的变体优选含有SEQ ID NO:1的179至186残基，并且特别包括模体D**D*D*E。这些氨基酸构成家族18糖苷水解酶催化结构域。186位点处的谷氨酸对于酶促活性是必需的。因此，最优选地，SEQ ID NO:1的变体在与SEQ ID NO:1的位点186等价的位点含有谷氨酸。SEQ ID NO:1的变体可含有SEQ ID NO:1的179至186残基并具有一个或多个保守取代，条件是该变体在与SEQ ID NO:1的位点186等价的位点含有谷氨酸。

通常，显示出EndoS49的内切糖苷酶活性并与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有多于约50%、55%或65%一致性(优选至少70%、至少80%、至少90%、特别优选至少95%、至少97%或至少99%一致性)的多肽被认为是该蛋白质的变体。SEQ ID NO:1的变体的一致性可在SEQ IDNO:1所示序列的至少100个、至少250个、至少500个、至少750个、至少800个、至少810个、至少820个、至少930、至少940个或更多的连续氨基酸的区域内测定，或者更优选地，在SEQ IDNO:1的全长上测定。

用在本发明中的EndoS49多肽的片段通常具有至少400、500、600、700、750、800或825个氨基酸长度，只要它保留EndoS的IgG内切糖苷酶活性。优选地，用在本发明中的EndoS49多肽的片段包含SEQ ID NO:1的179至186残基。

用于本发明的多肽可从表达EndoS49多肽或EndoS49多肽变体的任何合适的生物体中分离。通常，EndoS49多肽分离自链球菌的合适的EndoS49表达菌株，优选为化脓性链球菌的菌株，特别是M49血清型的菌株。

从表达性化脓性链球菌培养物或从表达EndoS49的其他细胞培养物中分离和纯化EndoS49通常是基于内切糖苷酶活性进行的。优选地，纯化方法涉及硫酸铵沉淀步骤和离子交换色谱步骤。根据一种方法，培养基通过添加逐渐增加量的硫酸铵而被分离。硫酸铵的量可为10至80%。优选地，培养基通过50%硫酸铵被分离，所产生的上清液进一步以70%硫酸铵来沉淀。颗粒型多肽随后可经受离子交换色谱法，例如在Mono Q柱上进行FPLC。洗脱组分可被分析内切糖苷酶活性，并将峰值活性组分收集在一起。这些组分可进行SDS-PAGE分析。组分可保存在-80℃。

用于本发明的多肽还可制备成这种分离的多肽的片段形式。而且，EndoS49多肽也可通过合成或通过重组手段被制造。例如，重组EndoS49多肽可通过用表达载体转染培养液中的哺乳动物细胞、培养细胞、提取和纯化由细胞生产的EndoS49多肽来生产，该表达载体包含编码多肽的核苷酸序列，该多肽可操作地连接至合适的控制序列。

在该部分描述的本发明的EndoS49显示出内切糖苷酶活性。优选地，该多肽通过水解全长IgG重链多肽的所连接的聚糖而水解IgG或IgG Fc片段。优选地，本发明的EndoS49多肽也具有内切糖苷酶活性，并且能够水解α-1-微球蛋白的聚糖。

内切糖苷酶活性可由合适的分析手段来测定。例如，可将测试多肽与糖蛋白(如IgG或α-1-微球蛋白)在合适的温度(如37℃)一起温育。起始物质和反应产物随后可利用SDS PAGE分析。通常，如果测试多肽具有IgG内切糖苷酶活性，那么IgG重链的分子量被降低约3kDa至4kDa。测定测试多肽是否具有IgG内切糖苷酶活性的另一种试验是通过检测糖基化的IgG来实现的，这种检测利用小扁豆(Lens culinaris)凝集素(LCA)，任选地，利用辣根过氧化物酶和过氧化物底物。通常，如果测试多肽具有IgG内切糖苷酶活性，碳水化合物信号会降低。测定测试多肽是否具有内切糖苷酶活性的另一种试验是通过将测试多肽与纯化的IgG Fc片段一起温育，随后用10 mM二硫苏糖醇对样品进行还原，并进行质谱(MALDI-TOF)分析。还可在上述试验中利用α-1-微球蛋白来替代IgG来测定EndoS49多肽的内切糖苷酶活性。

多肽的内切糖苷酶活性可进一步通过抑制研究而被特征化。

EndoS49多肽能够水解存在于从对象获取的样品中的糖蛋白分子。因此，当对象是人时，EndoS49多肽能够水解对象的糖蛋白的聚糖，例如位于人IgG的重链上或α-1-微球蛋白上的聚糖。EndoS49能够水解所有四个亚类的人IgG(IgG_1-4)。在优选的实施方式中，EndoS49多肽具有水解人IgG和α-1-微球蛋白的能力。

缺乏内切糖苷酶活性的EndoS49多肽

在这种情况下，EndoS49多肽还可为经修饰的化脓性链球菌EndoS49，其被工程化而缺失内切糖苷酶活性，但具有IgG结合活性。这种修饰的EndoS49在本文所述的方法中特别有用。要理解的是，IgG结合活性是指修饰的EndoS49结合至IgG或其变体或片段，特别是其Fc片段(通常是糖基化了的)。要理解的是，“通常是糖基化了的”是指IgG分子或其变体或片段为一种包含至少IgG多肽重链(或其片段的变体)的糖蛋白，并且该重链如在天然IgG分子中的那样连接至至少一个碳水化合物基团。特别地，该至少一个碳水化合物基团是连接至对应于全长IgG重链多肽的297位点的天冬酰胺残基的聚糖。

该EndoS49多肽优选通过定点突变而被改造。要理解的是，IgG结合活性是指，本部分所描述的EndoS49多肽结合IgG亚类(IgG_1-4)中的至少一个，优选两个、三个或全部四个亚类。优选地，至少一个IgG亚类以高亲和性和/高特异性被结合。

高亲和性是指该经修饰的EndoS49与IgG亚类相互作用的结合亲和常数(K_D)大于0.05 μM，优选大于0.06 μM、0.07 μM或0.08 μM。

结合活性可通过合适的手段测定，结合亲和性可通过合适的手段评价。例如，表面等离子体共振相互作用分析、平衡透析分析或任何结合例如斯卡查德分析的标准生化方法。

如之前的部分所述，该变体可衍生自来自另一种生物体(例如另一种细菌)的EndoS49多肽，但是，在这种情况下的变体缺乏内切糖苷酶活性但具有IgG结合活性。该经修饰的EndoS49多肽可包含：

(a)SEQ ID NO:2的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少50%一致性且缺少内切糖苷酶活性的变体；或

(c)它们的任一个的缺乏内切糖苷酶活性的片段。

优选地，该多肽包含SEQ ID NO:2的序列，或由该序列组成。SEQ ID NO:2衍生自SEQ ID NO:1的序列，但通过在SEQ ID NO:1的186位点用亮氨酸(L)取代谷氨酸(E)被改造以缺失内切糖苷酶活性。这些多肽通常具有如上所述的IgG结合活性。

在本部分所述的多肽变体的氨基酸序列不同于SEQ ID NO:2，但缺少内切糖苷酶活性，而保留IgG结合活性。这些变体可包括等位变体以及在蛋白质序列中的单个氨基酸的或氨基酸群组的缺失、变性或添加，只要该肽保持上述特性。

变体序列通常不同点在于至少1、2、3、5、10、20、30、50、100或更多个突变(可为氨基酸取代、缺失或插入)。例如，可进行1至100个、2至50个、3至30个或5至20个氨基酸取代、缺失或插入，条件是经修饰的多肽缺乏内切糖苷酶活性但保留IgG结合活性。

通常，缺乏内切糖苷酶活性但保留IgG结合活性并与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有多于约50%、55%或65%一致性(优选至少70%、至少80%、至少90%、特别优选至少95%、至少97%或至少99%一致性)的多肽被认为是该蛋白质的变体。SEQ ID NO:2的变体的一致性可在SEQ ID NO:2所示序列的至少100个、至少250个、至少500个、至少750个、至少800个、至少820个、至少830个或更多的连续氨基酸的区域内测定，或者更优选地，在SEQ ID NO:2的全长上测定。

用在本发明中的EndoS49多肽的片段通常具有至少300、400、500、600、700、750、800或830个氨基酸长度，只要它缺乏内切糖苷酶活性但保留IgG结合活性。

在另一种方法中，具有所期望特性的EndoS49蛋白可通过改变编码EndoS49蛋白的核苷酸，随后在合适的系统中表达所述核苷酸而产生。合适的方法包括编码该蛋白的核苷酸的定点突变。该技术已广泛适用于蛋白质功能的研究。该技术通常基于寡核苷酸并涉及以下步骤：

(1)克隆编码感兴趣的蛋白质的DNA到质粒载体中。

(2)变性质粒DNA以产生单链。

(3)将变性的DNA接触与靶标序列互补但加入期望突变(点突变、缺失或插入)的一个合成寡核苷酸(或多个合成寡核苷酸)，从而该合成寡核苷酸退火至靶标区域。

(4)利用质粒DNA链作为模板通过DNA聚合酶延伸突变的链。

(5)通过在大肠杆菌中转化而扩增该异源双链(突变/非突变链)。

扩增后，约50%的所产生的异源双链是突变体，其他50%是“野生型”(无突变)。使用选择和富集方法来促进突变体的生产。例如，亲本非突变链可用仅消化甲基化的DNA的限制性酶(DpnI)来消化。这允许在大肠杆菌转化之前从反应中去除亲本链，因为新合成的链是未甲基化的，而亲本链(如果从正确的大肠杆菌背景中纯化而来)是甲基化的。

定点突变的替代方法包括：

(1)使用特异突变引物的基于聚合酶链式反应(PCR)的方法，或易错PCR(伴随后续的期望突变或蛋白功能的丧失/获得的筛选)。

(2)将含有感兴趣基因的质粒引入到大肠杆菌突变株(DNA校对系统缺陷型)，后续筛选期望突变或蛋白功能的丧失/获得。

(3)化学合成部分或全长的包含期望突变的基因，随后引入合适的蛋白表达系统。

或者，具有期望特性的EndoS49蛋白可通过不依赖DNA的方法来生产，这包括具有期望突变的多肽的部分的化学合成。

用于本发明的多肽也可被制备成这种分离的多肽的片段形式。而且，EndoS49多肽也可通过合成或通过重组手段被制造。例如，重组EndoS49多肽可通过用表达载体转染培养液中的哺乳动物细胞、培养细胞、提取和纯化由细胞生产的EndoS49多肽来生产，该表达载体包含编码多肽的核苷酸序列，该多肽可操作地连接至合适的控制序列。

该EndoS49多肽能够结合至从对象获取的样品中存在的IgG分子。因此，当对象是人时，EndoS49多肽能够结合人IgG。EndoS49能够结合人IgG的所有四个亚类(IgG_1-4)。

多核苷酸、载体和宿主细胞

本发明还涉及编码上述多肽的多核苷酸及其医药用途。特别地，本发明涉及包含或由以下序列组成的多核苷酸(a)SEQ ID NO:3的编码序列或其互补序列；(b)在严格条件下与(a)中定义的序列杂交的序列；(c)由遗传密码造成的与(a)或(b)中所定义的序列简并的序列；(d)与(a)、(b)或(c)中定义的序列具有至少60%一致性的序列；和(e)上述序列的片段。

通常，多核苷酸是DNA。但是，本发明还包括RNA多核苷酸。多核苷酸可为单链或双链，并且可在其内包含合成或经修饰的核苷酸。

本发明的多核苷酸可以显著高于背景的水平杂交至SEQ ID NO:3的编码序列或该编码序列的互补体。背景杂交可因为例如DNA文库中存在其他DNA而发生。本发明的多核苷酸和SEQ ID NO:3的编码序列或该编码序列的互补体之间的相互作用所产生的信号水平通常是其他多核苷酸与SEQ ID NO:3的编码序列之间相互作用强度的至少10倍，优选至少100倍。相互作用的强度可通过例如用例如³²P来放射性标记探针而测得。选择性杂交通常可利用中度至高度严格性条件来实现。但是，这种杂交可在任何本领域已知的条件下进行(参见，Sambrook et al, 1989)。例如，如果需要高严格性，合适的条件包括在60℃至最高65℃的0.1至0.2 x SSC。如果需要低严格性，合适的条件包括在60℃的2 x SSC。

SEQ ID NO:3的编码序列可通过核苷酸取代而被修饰，例如1、2或3至10、25、50或100个取代。SEQ ID NO:3的多核苷酸可替代性地或额外地通过一个或多个插入和/缺失和/或通过在任一端或两端延伸而被修饰。也可包括额外的序列，例如信号序列。经修饰的多核苷酸通常编码具有内切糖苷酶活性的多肽。或者，多核苷酸编码EndoS49多肽的表位部分。可进行简并取代和/或进行导致产生保守氨基酸取代(当修饰序列被翻译时)的取代(如上表所示)。

能够选择性地杂交至SEQ ID NO:3的DNA编码序列的互补体的核苷酸序列通常在SEQ ID NO:3的至少20个、优选至少30个(例如至少40、至少60)、更优选至少100个连续核苷酸、或最优选全长上与SEQ ID NO:3的编码序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列一致性。计算序列一致性或相似性的方法已在以上关于本发明的多肽的部分详细描述。

上述序列一致性的程度和最小尺寸的任何组合可被用来定义本发明的多核苷酸，优选为更严格的组合，即在更长长度上的更高的序列一致性。因此，例如在25个核苷酸的长度上(优选在30个核苷酸的长度上)具有至少90%序列一致性的多核苷酸构成了本发明的一个方面，而在40个核苷酸的长度上具有至少95%的序列一致性的多核苷酸也构成了本发明的一个方面。

多核苷酸片段，例如使用用作探针或引物的多核苷酸片段，优选的长度为至少10个、优选至少15个或至少20个(例如至少25个、至少30个或至少40个)核苷酸。它们通常为至多40个、50个、60个、70个、100个或150个核苷酸长度。探针和片段的长度可长于150个核苷酸，例如至多200、300、400、500、600、700个核苷酸长度，甚至是比SEQ ID NO:3的编码序列段几个核苷酸(例如短五个或十个核苷酸)。

本发明的多核苷酸可通过重组、合成或本领域可用的任何手段来生产。它们也可通过标准技术被克隆。多核苷酸通常以分离和/或纯化的形式提供。

通常，引物通过合成手段来生产，涉及逐步制造期望的氨基酸序列，每次一个核苷酸。使用自动技术实现这种合成的技术在现有技术中易于得到。

较长的多核苷酸通常使用重组手段来生产，例如利用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。这涉及制造结合至ndoS49 基因期望被克隆的区域的引物对(例如约15-30个核苷酸)、将引物与从细菌细胞获得的DNA接触、在扩增期望区域的条件下进行聚合酶链式反应、分离所扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应产物)并回收扩增的DNA。引物可被设计成包含合适的限制性酶识别位点，从而所扩增的DNA可被克隆到合适的克隆载体。

虽然，通常本文所述的技术在本领域是已知的，但可参考特别是Sambrook et al,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989。

本发明的多核苷酸可用于生产本发明的多肽，这可在体外进行。本发明的多核苷酸可被用作引物(例如PCR引物、其他扩增反应的引物)或探针(例如通过常规手段使用放射活性或非放射活性标记物而被显示标记物标记，或者该多核苷酸可被克隆进载体中。

本发明的多核苷酸或引物可携带显示标记物。合适的标记物包括放射性同位素(例如³²P或³⁵S)、酶标记物或其他蛋白标记物(例如生物素)。这种标记物可被添加至本发明的多核苷酸或引物，且可利用已知技术来检测。

本发明的多核苷酸或引物或其片段(标记或未标记的)可由本领域技术人员用在基于核酸的测试中，从而检测或测序样品中的ndoS49。

这种检测测试通常包括将含有DNA或RNA的样品与包含本发明的多核苷酸或引物的探针在杂交条件下接触，并检测样品中的探针和核酸之间形成的任何双链。这种检测可利用例如PCR等技术来实现，或者通过将探针固定在固体载体上、移除样品中未杂交至探针的核酸、随后检测杂交至探针的核酸来实现。或者，样品核酸可被固定至固体载体上，从而可检测结合至载体的探针的量。

本发明的探针可方便地以测试试剂盒形式包装在合适的容器中。在这种试剂盒中，探针可被结合至固体载体，其中试验形式(assay formats)(试剂盒设计的目的)需要这种结合。试剂盒也可包含用于处理要被探测到的样品的适当试剂、将探针杂交至样品中核酸的实际、对照试剂、说明书等。

本发明的多核苷酸可被引入到重组可复制载体中。载体可被用来在相容的宿主细胞中复制核酸。因此，本发明的多核苷酸可通过将本发明的多核苷酸引入到可复制载体中、将载体引入相容性宿主细胞并在带来载体复制的条件下使宿主细胞生长而被制造。

优选地，载体是包含编码本发明的多肽的核酸序列的表达载体。这种表达载体是分子生物学领域按常规程序构建的，并且例如可涉及使用质粒DNA和适当的起始序列、启动子、增强子和其他元件，它们可能是需要的并且位于正确的方向，从而允许蛋白表达。其他合适的载体对于本领域技术人员来说是明显的。关于这点，进一步的例子可参考Sambrooket al. 1989。

本发明的多核苷酸也可以反义方向插入到上述载体中，从而生产反义RNA。反义RNA或其他反应多核苷酸或干扰RNA(iRNA)也可通过合成手段生产。这种反应多核苷酸或iRNA可在本发明的试验中用作测试成分，或者可用于治疗人体或动物体的方法中。

优选地，本发明的多核苷酸或用于本发明的载体中的多核苷酸可操作地连接至控制序列，该控制序列能够由宿主细胞表达编码序列，即载体是表达载体。术语“可操作地连接”是指并置，其中所描述的成分以允许它们以它们预期方式起作用的关系存在。 “可操作地连接”至编码序列的调节序列(例如启动子)的位置使得编码序列的表达在与调节序列相容的条件下实现。

载体可为例如质粒、病毒或噬菌体载体，具有复制起始位点，任选地具有所述多核苷酸表达的启动子，任选地具有启动子的调节元件。载体可含有一个或多个可选择标记基因，例如细菌质粒情况下的氨苄青霉素耐药基因或真菌载体时的耐药基因。

启动子和其他表达调节信号可被选择以与表达所在的宿主细胞相容。例如，酵母启动子包括化酒酵母GAL4和ADH启动子、裂殖酵母nmt1和adh启动子。哺乳动物启动子包括金属硫因启动子，其可被诱导以响应重金属(如镉)。也可使用病毒启动子，例如SV40大T抗原启动子或腺病毒启动子。所有这些启动子都可从现有技术容易得到。

可使用哺乳动物启动子，例如b-肌动蛋白启动子。特别优选组织特异性启动子。也可使用病毒启动子，例如Moloney小鼠白血病病毒长末端重复序列(MMLV LTR)、斯氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、人巨细胞病毒(CMV)IE启动子、腺病毒、HSV启动子(例如HSV IE启动子)或HPV启动子，特别是HPV上游调节区(URR)。病毒启动子容易从现有技术中得到。

表达载体可被转化到合适的宿主细胞以表达本发明的多肽或多肽片段。用上述表达载体转化或转染的宿主细胞在允许多肽或片段表达的条件下培养，并回收所表达的多肽或片段。可如上所述进行分离和纯化。宿主细胞可被选择以与载体相容，并且优选是细菌。宿主细胞也可为以本发明的多核苷酸转化的非人类动物的细胞或植物细胞。

IdeS

IdeS是由人病原体化脓性链球菌产生的细胞外半胱氨酸蛋白酶，其在WO 03/051914中有描述。IdeS最初分离自M1血清型A族链球菌菌株，但ides基因已在所有测试的A族链球菌菌株中发现。IdeS具有极高的底物特异性，其仅发现的底物为IgG。IdeS催化人IgG的下铰链区中的单个蛋白水解裂解。该蛋白水解降解促进了调理吞噬的抑制并干扰A族链球菌的杀灭。IdeS在多种动物中还裂解一些IgG亚类，并高效地将IgG转化为Fc和Fab片段。ides基因已被克隆并在大肠杆菌中作为GST融合蛋白表达。

用于本发明的方法中的IdeS多肽优选是化脓性链球菌IdeS，或化脓性链球菌IdeS的保留半胱氨酸蛋白酶活性的变体或片段。该变体可为来自另一种生物体(例如另一种细菌的IdeS多肽)。该细菌优选为链球菌。链球菌优选为A族链球菌、C族链球菌或G族链球菌。特别地，该变体可为来自C族链球菌(例如马链球菌或兽疫链球菌)的IdeS多肽。或者，该变体可来自恶臭假单胞菌。

IdeS多肽可包含：

(a)SEQ ID NO:4的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少50%一致性并具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性的变体；或

(c)它们的任何一个的具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性的片段。

优选地，IdeS多肽包含SEQ ID NO:4的序列或由SEQ ID NO:4的序列组成。SEQ IDNO:4是IdeS的成熟形式的序列，没有信号序列。

IdeS多肽变体是指氨基酸序列不同于SEQ ID NO:4但显示出与IdeS相同的IgG半胱氨酸蛋白酶活性的多肽。通常，与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有多于约50%、55%或65%一致性(优选至少70%、至少80%、至少90%，特别优选至少95%、至少97%或至少99%一致性)的多肽被认为是该蛋白的变体。这种变体可包括等位变体以及在蛋白序列中的单个氨基酸或氨基酸群组的缺失、修饰、添加，只要该肽维持IdeS的基本功能。SEQ ID NO:4的变体的一致性可在SEQ ID NO:4所示序列的至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少275个、至少300个或更多连续氨基酸的区域上测定，或者更优选地，在SEQ IDNO:4的全长上测定。

SEQ ID NO:4的氨基酸序列的变体优选含有SEQ ID NO:4的残基Lys-55 和/或Cys-65和/或His-233和/或Asp-255和/或Asp-257。最优选地，SEQ ID NO:4的变体含有SEQID NO:4的残基Lys-55、Cys-65、His-233、Asp-255和Asp-257中的每一个。

变体序列通常区别在于至少1、2、5、10、20、30、50或更多个突变(可为氨基酸的取代、缺失或插入)。例如，可具有1至50、2至30、3至20或5至10个氨基酸取代、缺失或插入)。修饰的多肽仍保留作为IgG特异性半胱氨酸蛋白酶的活性。优选地，变体多肽包含半胱氨酸残基和组氨酸残基，它们之间的间隔与通常在半胱氨酸蛋白酶中发现的一样。例如，在SEQ IDNO:4中，这些残基的距离为约130个氨基酸，正如半胱氨酸蛋白酶中通常发现的一样。

用在本发明中的IdeS多肽的片段通常为至少10个(例如至少15、20、25、30、40、50或更多个)氨基酸长度，至多100、150、200、250或300个氨基酸长度，只要它保留IdeS的IgG半胱氨酸蛋白酶活性。优选地，用在本发明中的IdeS多肽的片段包含SEQ ID NO:4的残基Lys-55和/或Cys-65和/或His-233和/或Asp-255和/或Asp-257。最优选地，片段包含SEQ IDNO:4的残基Lys-55、Cys-65、His-233、Asp-255和Asp-257中的每一个。

用于本发明的IdeS多肽显示出免疫球蛋白半胱氨酸蛋白酶活性，特别是IgG半胱氨酸蛋白酶活性。优选地，该多肽在铰链区裂解IgG，更具体为重链的铰链区。裂解导致产生IgG的Fc片段和Fab片段。优选地，该活性对于IgG是特异的。半胱氨酸蛋白酶活性可通过合适的试验测定。例如，测试多肽可与IgG在合适的温度(如37℃)一起温育。随后使用SDSPAGE分析起始物质和反应产物，以确定是否存在期望的IgG裂解产物。通常，该裂解产物是31kDa片段。通常，在该第一次裂解后IgG没有进一步的降解。该降解产物可进行N末端测序以证实裂解发生在IgG的铰链区。优选地，N末端序列包含序列GPSVFLFP。

多肽的半胱氨酸蛋白酶活性可通过抑制研究进一步特征化。优选地，该活性通过肽衍生物Z-LVG-CHN₂和/或碘乙酸抑制，两者都是蛋白酶抑制剂。但是，该活性通常不会被E64抑制。

该多肽的半胱氨酸蛋白酶活性通常是IgG特异性的，表现在当与其他类的Ig(即IgM、IgA、IgD和IgE)在允许IgG裂解的条件下一起温育时，该多肽可不降解这些免疫球蛋白。IdeS多肽能够裂解人IgG。在优选的实施方式中，该多肽具有裂解人、兔、小鼠或羊IgG的能力。

用于本发明的IdeS多肽可分离自表达IdeS多肽的任何合适的生物体。通常，IdeS多肽分离自化脓性链球菌的合适的表达IdeS菌株。合适的生物体和菌株可通过许多技术来识别。例如，化脓性链球菌可首先测试是否存在ides基因。ides基因的存在可通过PCR使用引物来确认，或通过探针与化脓性链球菌菌株的基因组DNA的杂交来确认。

表达活性IdeS的化脓性链球菌菌株可通过分析培养物上清液中的IgG半胱氨酸蛋白酶活性来识别。优选地，抑制剂E64被添加至上清液中以抑制任何SpeB半胱氨酸蛋白酶活性。至少五种菌株表达活性IdeS：菌株AP1、AP12、AP55、KTL3和SF370。优选地，表达性菌株选自AP1、AP12和AP55。

从表达性化脓性链球菌培养物或从表达IdeS的其他细胞的培养物中分离和纯化IdeS通常是基于IgG半胱氨酸蛋白酶活性进行的。优选地，纯化方法涉及硫酸铵沉淀步骤和离子交换色谱步骤。根据一种方法，培养基通过添加逐渐增加量的硫酸铵而被分离。硫酸铵的量可为10至80%。优选地，培养基通过50%硫酸铵被分离，所产生的上清液进一步以70%硫酸铵来沉淀。颗粒型多肽随后可经受离子交换色谱法，例如在Mono Q柱上进行FPLC。洗脱组分可被分析内切糖苷酶活性，并将峰值活性组分收集在一起。这些组分可进行SDS-PAGE分析。例如，从SDS PAGE蛋白质条带获得N末端序列。组分可保存在-20℃。

使用EndoS49的内切糖苷酶活性的方法

如本文所述，EndoS49具有内切糖苷酶活性并且能够水解糖蛋白(包括IgG和α-1-微球蛋白)的聚糖。因此，本发明提供糖蛋白的去糖基化的方法，特别是水解来自糖蛋白(特别是IgG和α-1-微球蛋白)的聚糖的方法。通常，这种方法包括将含糖蛋白的样品与EndoS49在允许内切糖苷酶活性发挥的条件下温育。合适的条件包括以至少1μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、6 μg/ml、8 μg/ml、10 μg/ml、12 μg/ml、15 μg/ml或20 μg/ml、优选至少10 μg/ml的浓度使用EndoS49。合适的条件还包括将样品与EndoS49一起温育至少20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟或120分钟，优选至少60分钟。温育优选在室温下进行，更优选在约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，最优选在约37℃。

这些方法可被用来提供去糖基化的糖蛋白，其可被用于研究或治疗。这些方法也可被用来在糖绘图(glycomapping)或糖概况分析中特征化糖蛋白上的聚糖。这种糖绘图和糖概况分析对于抗体分子(例如IgG分子)特别有用，例如在单克隆IgG分子的分析中特别有用。通常，所述方法涉及将蛋白与EndoS49温育以水解蛋白的聚糖。随后，聚糖和蛋白或多肽被分离，例如使用任何合适的技术(如HPLC或凝胶色谱法)来分析。所分离的部分随后可利用合适的分析方法来分析，例如质谱、HPLC、凝胶色谱、凝胶电泳、光谱法、毛细管电泳和其他用于分析聚糖和/蛋白质的标准实验室技术。

根据本发明的其他方法，这些方法还可包括利用其他没(例如IdeS)，从而抗体的Fc部分上的聚糖可利用本文所述的方法和技术更详细地分析。

一个例子是分析免疫球蛋白的岩藻糖基化。IgG分子上的Fc聚糖上的岩藻糖基化的程度对于IgG药物候选物的医疗潜力很重要。岩藻糖基化的IgG分子增加治疗性IgG分子的ADCC(nn)作用。因此，本发明提供一种利用EndoS49分析IgG的Fc聚糖中的岩藻糖的量的方法。

通常，这种方法包括将糖蛋白(此时为免疫球蛋白)与EndoS49在允许EndoS49的内切糖苷酶活性发挥的条件下温育。合适的条件包括以至少1μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、6 μg/ml、8 μg/ml、10 μg/ml、12 μg/ml、15 μg/ml或20 μg/ml、优选至少10 μg/ml的浓度使用EndoS49。合适的条件还包括将样品与EndoS49一起温育至少20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟或120分钟，优选至少60分钟。温育优选在室温下进行，更优选在约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，最优选在约37℃。IdeS可在与EndoS49反应后添加，或添加在相同反应混合物中，以诱导蛋白水解，将免疫球蛋白分割成F(ab’)2和Fc。利用分离方法，在注射到质谱仪之前，将两个片段分离。聚糖裂解后，GlcNAc和核Fuc残基仍在共同的Fc/2糖基化位点连接至Asn。因为偏岩藻糖基化(afocusylated)的免疫球蛋白不是核岩藻糖基化的(core fucosylated)，某些Fc/2在消化后仅含有GlcNAc。由于岩藻糖的缺失的导致的特征化的质量变化(-146Da)可从去卷积(deconvoluted)质谱中容易得到。因此，使用EndoS49有利于直接估计IgG的核岩藻糖基化程度。

测定样品中是否存在IgG的方法或从含IgG样品中分离IgG的方法

IgG的分离和/或检测在本领域通常利用例如蛋白质G或蛋白质A的试剂来进行。这些细菌蛋白质与IgG很好地相互作用。但是蛋白质A不会结合至所有的四个IgG亚类(IgG_1-4)，并且蛋白质A和蛋白质G都不能将未糖基化的和/或变性的、无活性IgG与糖基化的和/或天然的功能上有活性的IgG区别开来。相反，本发明的发明人发现了缺乏IgG内切糖苷酶活性的EndoS49多肽通常以高亲和度结合所有四个IgG亚类，并且对于正常糖基化的IgG(即天然的、功能上有活性的形式的IgG)具有选择性。

因此，本发明提供确定样品中是否存在IgG的改进的方法，该方法包括将所述样品与缺乏IgG内切糖苷酶活性的EndoS49多肽接触、将所述EndoS49与所接触的样品分离，从而确定是否存在IgG，并且任选地当IgG存在时，获得分离的IgG。因此，本发明还提供从含IgG的样品中分离IgG的方法，该方法包括将所述样品与缺乏IgG内切糖苷酶活性的EndoS49多肽接触、将所述EndoS49与所接触的样品分离，从而获得分离的IgG。

上述样品在合适该多肽与该样品发生相互作用以及适合IgG结合活性出现(即允许形成IgG-EndoS49多肽复合物)的条件下与EndoS49多肽接触。合适的条件包括以至少1μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、6 μg/ml、8 μg/ml、10 μg/ml、12 μg/ml、15 μg/ml或20 μg/ml、优选至少10 μg/ml的浓度使用EndoS49。合适的条件还包括将样品与EndoS49一起温育至少20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟或120分钟，优选至少60分钟。温育优选在室温下进行，更优选在约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，最优选在约37℃。

这些方法中的EndoS49的一个特别的优点在于EndoS49特异性地结合至正常糖基化的IgG。其他IgG结合剂的IgG结合活性通常需要IgG糖蛋白的变性或该变性会增强其结合活性。这通常通过用酸处理含IgG样品来实现。这种处理可能损害或变性某些抗体(酸敏感性抗体)。因为本发明的方法不需要这样的处理，因此该方法特别适合于从样品中以天然形式分离酸敏感性IgG。

EndoS49可通过合适的方法与所接触的样品分离。优选的从样品中去除EndoS49的方法包括使用如上所述的衍生化的或修饰的EndoS49。

优选的修饰包含添加组氨酸标签。组氨酸标签的存在意味着多肽以高亲和性结合至表面上含有螯合基团的试剂或分离装置，该螯合基团携带镍、铜或锌离子。组氨酸标签牢固地结合至这些金属离子。因此，这样的试剂可被用来从样品中分离EndoS49。

另一种优选的修饰包括添加生物素标签。生物素标签的存在意味着该多肽以高亲和度结合至包含链亲和素的试剂或分离装置。生物素标签牢固地结合至链亲和素。因此，这样的试剂可被用来从样品中分离EndoS49。

优选的试剂或分离装置是能够结合至EndoS49多肽的磁性颗粒群。例如，当EndoS49多肽被衍生有组氨酸标签时，磁性颗粒在其表面具有携带镍、铜或锌离子的螯合基团。或者，当EndoS49多肽被衍生有生物素标签时，磁性颗粒在其表面含有链亲和素。

因此，从样品中除去EndoS49的优选的方法包括利用如上所述的磁性颗粒群以及在样品上进行磁场分离。磁性颗粒优选为磁性纳米颗粒，磁场分离优选为高梯度磁场分离。

要理解的是，可使用任何合适的分离手段。例如，替代性的手段在前面的部分已描述过。

被接触的样品的EndoS49可通过任何适合手段来评价是否存在结合的IgG。

例如，可分析EndoS49的分子量。结合至IgG 的EndoS49将具有比没有结合至IgG的EndoS49具有更高的分子量。因此，合适的方法包括任何能够通过重量区分蛋白质种类的方法，例如SDS-PAGE和Western印迹、质谱等。或者，上述Western印迹可直接被分析以通过使用IgG特异性抗体或对特定IgG亚类特异的抗体来分析是否存在IgG。以这种方式在印迹中检测蛋白是本领域广泛使用的技术。

用于检测是否存在结合至EndoS49的IgG的其他合适方法包括将EndoS49与抗IgG的抗体或连有酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)的IgG结合蛋白一起温育，随后添加荧光/显色底物。在这种情况下，颜色信号的显示代表存在IgG，IgG的量与信号强度成比例。以这种方法检测蛋白在本领域是广泛使用的技术。

用于检测是否存在结合至EndoS49的IgG的进一步合适的手段包括首先将结合的IgG与EndoS49分离，从而它可通过任何一种上述方法或任何合适的方法而独立于EndoS49被分析/检测。IgG可通过任何适当手段而与EndoS49分离。合适的手段包括通过将来自被接触样品的EndoS49与合适的洗脱缓冲液接触从而从EndoS49洗脱出IgG。洗脱缓冲液的选择通常取决于结合至EndoS49的IgG是否已知是或怀疑是酸敏感性的，即，因接触酸而变性/失活。

当抗体是非算敏感性的，通常可使用利用低pH洗脱缓冲液的洗脱方案。这种类型的洗脱方案在本领域是孰知的。这样的洗脱缓冲液的pH通常低于约pH3，最优选低于约pH2。优选的例子包括pH2的甘氨酸。此外，或任选地，这种洗脱缓冲液通常可包含至少一种以下物质：

-钠盐或钾盐，优选浓度为约0.5M至约1M；

-结构类似于天然IgG上Asn-297相连的聚糖的单糖、二糖或多糖；

或它们的任何组合。

但是，如上所述，本发明的方法特别适合于检测/分离酸敏感性抗体。因此，当结合至EndoS49的IgG已知是或怀疑是酸敏感性的时候，优选使用不需要低pH的洗脱缓冲液和洗脱方案。这样的方法在本领域也是已知的，并且基于以下原则，即，提供一种包含与结合的IgG竞争结合EndoS49的分子的缓冲液，从而导致结合的IgG释放。因此，合适的竞争洗脱缓冲液通常包含一种或多种单糖、二糖或多糖，其结构类似于天然IgG上Asn-297相连的聚糖。特别优选的洗脱缓冲液包含约0.25M至约0.5M的蔗糖，pH优选为约5.3至约8.3。具体的优选洗脱缓冲液的例子包括，例如：PBS pH7.4中的蔗糖0.25M；PBS pH7.4中的蔗糖0.5M；PBSpH5.3中的蔗糖0.25M；PBS pH8.5中的蔗糖0.25M；和PBS pH7.4中的蔗糖0.25M、麦芽糖0.25M。

此外，或任选地，这种竞争洗脱缓冲液通常可包含钠盐或钾盐，优选浓度为约0.5M至约1M。

将结合的IgG与EndoS49分离的上述手段也可被用来获得分离的IgG。

评价含IgG样品的糖基化状态和/或功能质量的方法

本发明的EndoS49多肽在未修饰的形态时具有水解IgG的聚糖的能力。而且，如上所述，本发明的缺乏IgG内切糖苷酶活性但具有IgG结合活性的EndoS49多肽对于糖基化的和/或天然的、功能上有活性的IgG是特异的。因此，EndoS49多肽可被用来分析糖蛋白(特别是IgG抗体)的糖基化状态。

根据本发明的一个方面，将IgG抗体与本发明的具有内切糖苷酶活性的EndoS49多肽一起温育。所获得的产物通过任何合适的技术来分析，包括HPLC、质谱、凝胶色谱、凝胶电泳、分光光度计、毛细电泳。这些分析方法可在制备蛋白质的任何阶段进行，例如在候选药物筛选期间、在生物药物生产工艺研发期间以及在释放试验和生产期间的质量控制时。

经修饰而除去或降低内切糖苷酶活性但保留结合至天然形式IgG的能力的EndoS49多肽在糖绘图中也是有用的，特别是在糖蛋白(特别是IgG结构)分析中是有用的。

例如，通过使用所述EndoS49多肽(任选地结合使用另一种IgG结合试剂)，本发明提供一种评价含IgG样品的糖基化状态或功能质量的方法，该方法包含从该含IgG样品中获取第一和第二子样品，将第一子样品与之前部分所述的EndoS49多肽接触并将第二子样品与能够结合未糖基化和/或变性的、失活的IgG的另一种IgG结合试剂接触，随后定量结合至第一子样品中的EndoS49多肽的IgG的量，并且定量结合至第二子样品中的另一种IgG结合试剂的IgG的量。最后，通过比较在第一和第二子样品中确定的结合的IgG的量，可评价含IgG样品的糖基化状态或功能质量。

所述另一种IgG结合试剂通常为蛋白质A或蛋白质G，它们结合至所有形式的IgG(天然的或变性的)。因此，在这种情况下，结合至所述试剂的IgG的量代表第二子样品中存在的总IgG。EndoS49多肽仅结合至糖基化的和/或天然的、功能上有活性的IgG，因此结合至EndoS49的IgG的量仅代表第一子样品中存在的糖基化的和/或天然的、功能上有活性的IgG。通过比较第二子样品中的总IgG的浓度和第一子样品中的天然IgG的浓度，本领域技术人员将认识到，可以获得反映出原始样品中以其糖基化的和/或天然的、功能上有活性的形式存在的IgG的比例的比率。

在另一个实施方式中，该另一种IgG结合试剂可为对未糖基化的和/或变性的IgG特异的。例如，这种试剂可为抗体。因此，在该实施方式中，原始样品中以其糖基化的和/或天然的、功能上有活性的形式存在的IgG的比例可通过下式来评价：

第一子样品中的IgG的量/(第一子样品中的IgG的量+第二子样品中的IgG的量)

上述方法中的样品在适合多肽或试剂与样品之间的相互作用发生以及适合IgG结合活性出现的条件下与EndoS49多肽或另一种IgG结合试剂接触。何时的条件包括，例如，在之前部分阐述的那些条件。

从含IgG样品中分离IgG Fab或Fc片段的方法

本发明的方法可被用来从含IgG的样品中分离Fab片段。在一个实施方式中，本发明提供从含IgG的样品中分离IgG的Fab片段的方法，该方法包含：

(a)将所述含IgG的样品与IdeS和EndoS49多肽接触；

(b)从被接触的样品中分离所述IdeS和所述EndoS49多肽；

从而分离Fab片段。

优选的从样品中分离IdeS和EndoS49多肽的方法包括使用如上所述被衍生化或修饰的IdeS和/或EndoS49。可在每种IdeS和EndoS49多肽上实施相同或不同的修饰。

优选的修饰包括添加组氨酸标签。组氨酸标签的存在意味着该多肽以高亲和性结合至在表面含有携带镍、铜或锌离子的螯合基团的试剂或分离装置。组氨酸标签牢固地结合至这些金属离子。因此，这样的试剂可被用来从样品中分离IdeS和/或EndoS49多肽。

另一种优选的修饰包括添加生物素标签。生物素标签的存在意味着该多肽以高亲和性结合至包含链亲和素的试剂或分离装置。生物素标签牢固地结合至链亲和素。因此，这样的试剂可被用来从样品中分离IdeS和/或EndoS49多肽。

优选的试剂或分离装置是能够结合至EndoS49多肽的磁性颗粒群。例如，当IdeS和/或EndoS49多肽被衍生有组氨酸标签时，磁性颗粒在其表面具有携带镍、铜或锌离子的螯合基团。或者，当IdeS和/或EndoS49多肽被衍生有生物素标签时，磁性颗粒在其表面含有链亲和素。

因此，上述方法的步骤(a)优选额外地包括将样品与能够结合至IdeS和EndoS49多肽的磁性纳米颗粒群接触，其中步骤(b)包括在样品上进行磁场分离。

EndoS49多肽优选为缺乏内切糖苷酶活性的经修饰的EndoS49多肽。

在本发明的上述实施方式中，所述含IgG的样品通常包含纯化的或分离的IgG。“纯化的或分离的IgG”是指纯度为通常商业级别的IgG组分。IgG通常分离自例如血清的样品，或如果是重组IgG的情况，则分离自例如细胞裂解物。分离可根据任何适当的方法进行，优选根据上述关于使用缺乏内切糖苷酶活性的经修饰EndoS49多肽分离IgG所述的方法进行。因此，本发明的一个实施方式包括上述方法，该方法包括，在步骤(a)之前进行：

(i)将所述含IgG的样品与缺乏IgG内切糖苷酶活性的EndoS49多肽接触，从而允许形成IgG-EndoS49多肽复合物；

(ii)将所述IgG-EndoS49多肽复合物与所接触的样品分离；

(iii)从所述IgG-EndoS49多肽复合物洗脱IgG，从而获得含IgG的样品；

并且其中步骤(a)和(b)在步骤(iii)获得的含IgG的样品中进行。从样品中分离IgG-EndoS49多肽复合物优选根据以上部分中关于确定样品中是否存在IgG或从含IgG样品中分离IgG的方法所阐述的方法来进行。

在本发明的另一个实施方式中，所述方法适合用来从含IgG的样品中分离Fab片段，而不需要在进行该方法之前纯化IgG。这些方法可在含有未纯化的IgG(例如全血清、细胞裂解物或细胞培养基)的样品上进行。在本发明的这个实施方式中，该方法包括：

(a)将所述含IgG的样品与EndoS49多肽接触从而允许形成IgG-EndoS49多肽复合物；

(b)从所接触的样品中分离所述IgG-EndoS49多肽复合物；

(c)向步骤(b)获得的IgG-EndoS49多肽复合物添加IdeS；和

(d)从步骤(c)获得的混合物中分离所述IdeS和所述EndoS49多肽；

从而分离Fab片段。

从上述样品/混合物中分离IdeS和/或EndoS49多肽的方法优选包括使用如上所述的衍生化的或修饰了的IdeS和/或EndoS49多肽。可对每种IdeS和EndoS49多肽使用相同或不同的修饰方法。优选的试剂或分离装置是能够结合至IdeS 和/或EndoS49多肽的磁性颗粒群。例如，当IdeS和/或EndoS49多肽被衍生有组氨酸标签时，磁性颗粒在其表面具有携带镍、铜或锌离子的螯合基团。或者，当IdeS和/或EndoS49多肽被衍生有生物素标签时，磁性颗粒在其表面含有链亲和素。

因此，上述方法的步骤(a)优选额外地包括将样品与能够结合至IdeS和EndoS49多肽的磁性纳米颗粒群接触，步骤(c)额外地包括将步骤(b)获得的IgG-EndoS49多肽复合物与能够结合至IdeS和EndoS49多肽的磁性纳米颗粒群接触，并且步骤(b)和(d)包括分别在(a)的样品上和(c)获得的混合物上进行磁场分离。

要理解的是，可使用任何合适的分离装置。例如，在本部分关于分离基本不含结合至FcγR的IgG分子的细胞群的方法所描述的另一种手段可被改造以用于分离IdeS和/或EndoS49多肽。

在以上实施方式中的EndoS49多肽优选为缺乏内切糖苷酶活性的经修饰的EndoS49多肽。

本发明的上述方法也可被用于从含IgG的样品中分离Fc片段。在本发明的一个这样的实施方式中，该方法包括：

(a)将所述含IgG的样品与IdeS接触；

(b)将IdeS从步骤(a)中获得的混合物中分离，从而分离Fab和Fc片段；

(c)将所述Fab和Fc片段与EndoS49多肽接触从而允许形成Fc片段-EndoS49多肽复合物；

(d)从步骤(c)获得的混合物中分离出Fc片段-EndoS49多肽复合物；以及

(e)从步骤(d)获得的Fc片段-EndoS49多肽复合物中分离出Fc片段。

要理解的是，任何分离方法可被如上所述地使用，但是从样品/混合物中分离IdeS和/或EndoS49多肽的方法优选包括使用如上所述衍生化的或经修饰的IdeS和/或EndoS49多肽。

优选地，上述步骤(a)额外地包括将能够结合IdeS的磁性纳米颗粒群接触样品，步骤(c)额外地包括将步骤(b)获得的Fab和Fc片段与能够结合EndoS49多肽的磁性纳米颗粒群接触，其中步骤(b)和(d)分别包括在(a)的样品和(c)获得的混合物上进行磁场分离。该EndoS49多肽优选为缺乏内切糖苷酶活性的经修饰的EndoS49多肽。

在另一个实施方式中，Fc片段可通过以下方法分离自含IgG的样品，该方法包括：

(a)将含IgG的样品与IdeS和EndoS49多肽接触；

(b)从步骤(a)中获得的混合物中分离EndoS49，从而分离出Fc片段。

要理解的是，可使用如上所述的任何合适的分离方法。但是，优选地，上述步骤(a)额外地包含将样品与能够结合EndoS49多肽但不能结合IdeS的磁性纳米颗粒群接触，并且其中步骤(b)包括在步骤(a)所获得的混合物上进行磁场分离。优选地，所述IdeS和/或EndoS49多肽是如上所述的衍生化了的或经修饰了的，条件是对每个施加不同的修饰。例如，当IdeS通过添加组氨酸标签被修饰从而它结合至在其表面具有携带镍、铜或锌离子的螯合基团的磁性颗粒群时，EndoS49多肽可通过添加生物素标签而被修饰从而它结合至在其表面具有链亲和素的磁性颗粒群。EndoS49多肽优选为缺乏内切糖苷酶活性的经修饰的EndoS49多肽。

类似于分离Fab片段的方法，将意识到的是，在分离Fc片段的方法中，该含IgG的样品通常包含纯化的或分离的IgG。优选的分离IgG的方法已在以上步骤(i)至(iii)中阐述。

试剂盒

本发明提供

-用于从含IgG的样品中分离IgG的试剂盒，该试剂盒包括：

(a)本发明的缺乏内切糖苷酶活性的EndoS49多肽；以及任选地包括

(b)从样品中分离所述EndoS49多肽的装置。

-用于确定样品中是否存在IgG的试剂盒，该试剂盒包括：

(b)从样品中分离所述EndoS49多肽的装置。

-用于评价含IgG的样品的糖基化状态和/或功能质量的试剂盒，该试剂盒包括：

(b)能够结合变性的和/或去糖基化的IgG的另一种IgG结合试剂；

(c)用于从样品中分离所述EndoS49多肽的装置；和

(d)用于从样品中分离所述另一种IgG结合试剂的装置。

该另一种IgG结合试剂包含蛋白质G和/或蛋白质A和/或蛋白质A/G。

本发明还提供：

-用于分离IgG的Fab或Fc片段的试剂盒，该试剂盒包含：

(a)IdeS；

(b)EndoS49多肽；和

(c)用于从样品中分离所述IdeS和所述EndoS49多肽的装置。

在优选的实施方式中，该试剂盒额外地包含根据本发明的缺乏内切糖苷酶活性和EndoS49多肽以及从样品中分离所述EndoS49的装置。该EndoS49多肽优选为根据本发明的缺乏内切糖苷酶活性的EndoS49多肽。

上述试剂盒的优选的实施方式进一步包括在本发明的方法中使用试剂盒的说明书。进一步优选的实施方式包括从样品中分离EndoS49多肽、另一种IgG结合试剂、IdeS多肽或EndoS49多肽的装置是磁性纳米颗粒群的那些实施方式，其中每个磁性纳米颗粒群能够结合至所述多肽/试剂/蛋白中的至少一种。在该实施方式中，该试剂盒通常还包括在样品上进行磁场分离的说明书。

在上述方法和试剂盒的优选实施方式中，所使用的多肽/蛋白质/试剂被衍生化有亲和标签，优选为组氨酸标签，从而辅助分离所述多肽。

以下实施例对本发明进行说明。

实施例1

材料和方法

细菌菌株和生长

血清型M49的GAS菌株NZ131的基因组已测序，因此，该菌株被选作本次研究的参考菌株(McShan et al., 2008) (Chaussee et al., 1999)。GAS菌株NZ131在血琼脂上繁殖，大肠杆菌菌株Top10(Invitrogen) 和BL21 pLysS (Invitrogen)在LB琼脂上繁殖。为在大肠杆菌Top10细胞中进行选择，使用100 µg/mL的羧苄青霉素，对大肠杆菌BL21 pLysS使用100 µg/mL羧苄青霉素和34 µg/mL氯霉素。大肠杆菌在37℃、通气条件下在LB中过夜培养。使用Puregene DNA 纯化试剂盒(Qiagen)进行GAS菌株NZ131的基因组DNA制备。使用热休克法在42℃热激30s来进行转化。使用Plasmid Miniprep Kit I (E.Z.N.A)进行大肠杆菌的质粒制备。本次研究中所用的所有引物见表2。

EndoS49的重组表达

EndoS49在大肠杆菌中的重组表达通过PCR扩增来自A族链球菌菌株NZ131(M49血清型)的ndoS49基因而建立的，该扩增使用引物ndoS49-F-BamHI,CTGTAAGGATCCAGGAGAAGACTG, 和ndoS49-R-XhoI, GAAACCTCGAGTCTTTGTAATCGTAGGACTT。ndoS49基因片段使用限制性酶BamHI and XhoI消化，并用DNA连接酶T4(Fermentas)连接至表达载体pGEX-5X-3 (Amersham Biosciences)，形成质粒pGEX-ndoS49。表达载体被转化到大肠杆菌Top10化学感受态细胞，并且重组细胞在100 µg/mL羧苄青霉素平板上生长，使用ndoS49-F-BamHI和ndoS49-R-XhoI引物通过PCR进行筛选。分离阳性克隆，并纯化pGEX-ndoS49质粒，如上所述将该质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21 pLysS。

一个重组克隆在37℃与抗生素一起过夜生长，并在LB培养基中以1:20稀释并与抗生素一起生长3小时。使用0.1 mM IPTG诱导表达EndoS49蛋白3小时。收集细胞并用BugBuster蛋白提取试剂(Novagen)裂解细胞。重组GST-EndoS49在具有GlutathioneSepharose 4B (GE Healthcare)的柱上纯化并用还原性还原型谷胱甘肽洗脱。

EndoS49的突变

使用QuickChange II定点突变试剂盒 (Stratagene)根据制造商说明书进行从谷氨酸186(Glu-186)到亮氨酸(E186L)的定点突变。所使用的突变引物是CTAGATATTGATATTCTTCACGAATTTACGAAC，并结合使用上述序列的反义序列以及质粒pGEX-ndoS49(突变下划线表示)。这产生质粒pGEX-ndoS49(E186L)，测序后，表达重组EndoS49(E186L)并如上所述关于EndoS49那样进行纯化。平截形式的EndoS49通过使用含有限制性位点BamHI和XhoI的引物ndoS49(trunc1-5)(表2)扩增来自GAS NZ131的ndoS49的部分基因来构建。片段被消化并连接到上述pGEX载体中，并转化到大肠杆菌Top10，随后转化到BL21pLysS并与抗生素一起生长。蛋白质按上述方法生产，并纯化得到蛋白质EndoS49(trunc1)80 kDa、EndoS49(trunc2) 70 kDa、EndoS49(trunc3) 60 kDa、EndoS49(trunc4) 50 kDa、EndoS49(trunc5) 42 kDa。

糖蛋白聚糖水解试验

1µg重组EndoS49及其突变体被与3 µg的每种糖蛋白在20 µL PBS、37℃温育过夜。在10% SDS-PAGE凝胶上分析聚糖水解物，随后按之前所述那样通过LCA凝集素印迹来分析(Collin and Olsén, 2001a)。

狭缝-印迹分析

EndoS49及其突变体被固定在甲醇活化的PVDF膜上，每个狭缝为在PBS中的4、2、1µg，使用Millipore狭缝印迹设备进行。膜以5%脱脂牛奶(Difco)在室温封闭1小时。在PBST中持续洗涤3x10分钟。膜在0.5%脱脂牛奶中与10 µg 人IgG (Sigma)一起温育1h(37℃)，随后被洗涤。连有蛋白质G(Invitrogen)的5 µg辣根过氧化物酶被添加至膜并在37℃温育1小时。洗涤后，使用Supersignal West Pico化学发光底物(Thermo Scientific)对膜进行显影。

生物信息学分析

基因ndoS49和ndoS被翻译成EndoS49和EndoS，并使用软件MacVector (MacVectorInc.)中的ClustalW算法进行对比。利用MacVector，使用来自NCBI PubMed具有以下登录号的蛋白质序列构建系统发生树：EndoS (AF296340), EndoE (AAR20477), EndoH (NP_631673), EndoC (ADC53484), EndoF2 (P36912), EndoF3 (P36913) (Collin and Olsén, 2001b) (Collin and Fischetti, 2004) (Tarentino and Plummer, 1974)(Tarentino et al., 1993)。

ndoS49的PCR筛选

设计出扩增来自GAS的ndoS49基因的引物并命名为ndoS49-F(AAAACGCGGACCACTATATGC)和ndoS49-R (AAACGTTGTCCGAGGATTTG)。42 GAS菌株被在血琼脂上繁殖并在37℃、5% CO₂的条件下过夜生长。获取单个菌落并在20 µL 99℃无菌水中裂解10分钟。使用这些裂解物作为严格PCR反应的模板以检测42 GAS菌株中的ndoS49。作为阳性对照，设计出扩增基因recA的引物，recA-F (AGCCCTTGATGATGCTTTG)和recA-R(AACAATTCTGGGTGATCGG)。作为阳性对照，两个PCR反应都使用来自GAS菌株NZ131 (M49)和AP1 (M1)的基因组DNA作为模板。

结论

ClustalW分析揭示出两种不同的酶：EndoS49和EndoS

基因ndoS49和ndoS在电脑中被翻译成蛋白质并使用ClustalW算法来比较。在基因水平，一致性为50%，在蛋白质水平，一致性为37%。ClustalW分析揭示出(几乎)相同的信号肽序列和保守的家族18糖苷水解催化结构域(DGLDIDIE)(图1)。EndoS的试验分析显示，色氨酸对于聚糖-水解活性至关重要(Allhorn et al., 2008)。这些色氨酸在EndoS49中也是保守的。

重组EndoS49显示出对人糖蛋白的聚糖水解活性

90kDa的EndoS49成功地在大肠杆菌BL21中重组表达，并利用GST-标签从可溶性组分中纯化。构建并以相同方式纯化了EndoS49(E186L)，它是一个催化突变体，其中GH18模体的谷氨酸(E186)被亮氨酸(L)取代。为了确定蛋白质的活性，构建了5个羧基封端的平截形式的酶，并命名为EndoS49(trunc1) 80 kDa, EndoS49(trunc2) 70 kDa, EndoS49(trunc3) 60 kDa, EndoS49(trunc4) 50 kDa and EndoS49(trunc5) 42 kDa。这些酶被用来分析EndoS49在人糖蛋白上的聚糖水解活性。首先，这些酶与人IgG温育过夜，并在SDS-PAGE凝胶上分析，再利用LCA凝集素印迹分析，以检测IgG的聚糖中的甘露糖结构。凝胶显示出用EndoS49处理的IgG重链的4 kDa的位移，LCA凝集素印迹确认了该位移是由于缺乏N连接的聚糖(图2A)导致的。EndoS49(E186L)没有显示出位移，并且聚糖成分没有变化，表明E186在EndoS49的催化活性中具有至关重要的作用。关于平截的酶，EndoS49(trunc1-4)显示出在IgG的聚糖上的活性，而EndoS49(trunc5)(最小的酶(42 kDa))没有显示出聚糖水解活性(图2A)。

EndoS49的IgG去糖基化的进一步分析通过将IgG_1-4与EndoS49和EndoS49(E186L)温育过夜来进行。按以上所述分析IgG亚类并且显示出EndoS49对所有四个IgG亚类具有活性，与之前结果一致，催化突变体没有显示出活性(图2B)。将这些酶与α-1-微球蛋白(一种重糖基化人血清蛋白)温育并在SDS-PAGE上分析显示出，EndoS49在该糖蛋白上的聚糖水解活性(图2C)。为进一步阐明EndoS49的特异性，由连接至发荧光的4-甲基伞形酮的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷构成的模型底物被与EndoS49温育1、2、3、4和16h并测定荧光。如果糖被降解，荧光将升高，但没有观察到强度增加(数据未示出)，表明EndoS49仅对糖蛋白底物具有活性。

EndoS49结合至IgG

EndoS49在IgG上的聚糖水解活性的发现使得我们相信该酶结合IgG。这利用狭缝印迹分析来评价，其中EndoS49及其催化突变体和平截形式被固定在PVDF膜上，并与IgG温育，利用结合有辣根过氧化物酶(HRP)的蛋白质G来检测所述结合。狭缝印迹显示催化突变体EndoS49(E186L)对IgG的结合增加(图3)。

基因ndoS49存在于GAS血清型M49

为阐明ndoS49是否存在于M49之外的任何其他血清型，使用严格PCR来在选择的GAS菌株中分析是否存在ndoS49。引物ndoS49-F和ndoS49-R被用在PCR中，该PCR在GAS菌落的裂解物上进行，阳性对照扩增在所有GAS菌株中都存在的recA基因。ndoS49基因在所有选择出的GAS M49血清型中以及血清型M60中被扩增，而其他血清型都没有产生PCR产物(表1)。

在GAS菌株(M49)和MGAS5005 (M1)的测序基因组中，比较ndoS49和ndoS周围的基因，发现这些基因位于相同的基因组环境(genomic context)并且周围基因都是高度保守的(图4)。全长EndoS49被与前述内切糖苷酶、EndoS、EndoC、EndoH、EndoE、EndoF2、EndoF3进行比较，并重建了系统发生树(图5)。这显示，EndoS和EndoC比EndoS 和EndoS49更紧密相关，并且来自链球菌的内切糖苷酶比来自其他细菌的酶更紧密相关。

表1. ndoS49存在于一些GAS血清型中

菌株	血清型	ndoS49	recA
				5448	M1	-	+
SF370	M1	-	+
				ACN1	M1	-	+
ACN2	M2	-	+
				ANC3	M3	-	+
20224	M3	-	+
				ACN4	M4	-	+
ACN5	M5	-	+
				Manfredo	M5	-	+
ACN6	M6	-	+
				AP6	M6	-	+
ACN9	M9	-	+
				ACN11	M11	-	+
ACN12	M12	-	+
				ACN18	M18	-	+
ACN19	M19	-	+
				ACN22	M22	-	+
ACN24	M24	-	+
				ACN28	M28	-	+
NZ131	M49	+	+
				3487-05	M49	+	+
AW1	M49	+	+
				AW2	M49	+	+
AW3	M49	+	+
				AW4	M49	+	+
AW6	M49	+	+
				AW7	M49	+	+
AW8	M49	+	+
				AW9	M49	+	+
AW10	M49	+	+
				AW11	M49	+	+
AW12	M49	+	+
				AW13	M49	+	+
ACN49	M49	+	+
				AP49	M49	+	+
CS101	M49	+	+
				AP53	M53	-	+
ALAB49	M53	-	+
				ACN55	M55	-	+
ACN57	M57	-	+
				ACN60	M60	+	+
AP74	M74	-	+

表2.用于本研究中的引物

引物名	序列 (5’-3’)
		ndoS49-F-BamHI	CTGTAAGGATCCAGGAGAAGACTG
ndoS49-R-XhoI	GAAACCTCGAGTCTTTGTAATCGTAGGACTT
		ndoS49(E186L)-F	CTAGATATTGATATTCTTCACGAATTTACGAAC
ndoS49(E186L)-R	GTTCGTAAATTCGTGAAGAATATCAATATCTAG
		ndoS49(trunc1)-R-XhoI	ATTTCTCGAGCTGAAGACGTCCTTTAGCCACG
ndoS49(trunc2)-R-XhoI	TAAACTCGAGCCCCATCAGAAACATCTACTAAG
		ndoS49(trunc3)-R-XhoI	ATTTTCTCGAGGCATTATCAACATCATAATGACC
ndoS49(trunc4)-R-XhoI	TAAACTCGAGCCAGTCATGCCTACCATAACAAGCTCAGC
		ndoS49(trunc5)-R-XhoI	ATTTCTCGAGCTGTCCAACTTGTTGAATG
ndoS49-F	AAAACGCGGACCACTATATGC
		ndoS49-R	AAACGTTGTCCGAGGATTTG
recA-F	AGCCCTTGATGATGCTTTG
		recA-R	AACAATTCTGGGTGATCGG

EndoS49的蛋白质序列

NCBI参考序列

NZ131基因组: NC_011375.1

ndoS49基因序列: NC_011375.1

EndoS49蛋白质序列: YP_002286383.1

EndoS49蛋白序列:

MDKHLLVKRTLGCVCAATLMGAALATHHDSLNTVKAEEKTVQTG

KTDQQVGAKLVQEIREGKRGPLYAGYFRTWHDRASTGIDGKQQHPENTMAEVPKEVDI

LFVFHDHTASDSPFWSELKDSYVHKLHQQGTALVQTIGVNELNGRTGLSKDYPDTPEG

NKALAAAIVKAFVTDRGVDGLDIDIEHEFTNKRTPEEDARALNVFKEIAQLIGKNGSD

KSKLLIMDTTLSVENNPIFKGIAEDLDYLLRQYYGSQGGEAEVDTINSDWNQYQNYID

ASQFMIGFSFFEESASKGNLWFDVNEYDPNNPEKGKDIEGTRAKKYAEWQPSTGGLKA

GIFSYAIDRDGVAHVPSTYKNRTSTNLQRHEVDNISHTDYTVSRKLKTLMTEDKRYDV

IDQKDIPDPALREQIIQQVGQYKGDLERYNKTLVLTGDKIQNLKGLEKLSKLQKLELR

QLSNVKEITPELLPESMKKDAELVMVGMTGLEKLNLSGLNRQTLDGIDVNSITHLTSF

DISHNSLDLSEKSEDRKLLMTLMEQVSNHQKITVKNTAFENQKPKGYYPQTYDTKEGH

YDVDNAEHDILTDFVFGTVTKRNTFIGDEEAFAIYKEGAVDGRQYVSKDYTYEAFRKD

YKGYKVHLTASNLGETVTSKVTATTDETYLVDVSDGEKVVHHMKLNIGSGAIMMENLA

KGAKVIGTSGDFEQAKKIFDGEKSDRFFTWGQTNWIAFDLGEINLAKEWRLFNAETNT

EIKTDSSLNVAKGRLQILKDTTIDLEKMDIKNRKEYLSNDENWTDVAQMDDAKAIFNS

KLSNVLSRYWRFCVDGGASSYYPQYTELQILGQRLSNDVANTLKD

实施例2

单克隆Ig分子可显示出Fc聚糖的些微差别，因此Fc聚糖可作为Fc聚糖的非均质库出现。聚糖的绝大部分是相同的，但小部分可显示出变化的碳水化合物结构或组成。这种变化是由于Fc部分的来源(可为人、人源化的或来自其他物种)和生产细胞系和细胞培养条件的选择导致的。在本实施例中，两种孰知的基于IgG的药物(阿伐斯汀和爱必妥)被用EndoS和EndoS49去糖基化。如下表所示，样品与EndoS或EndoS49一起温育。

结果如图6所示。结果发现，EndoS49比EndoS具有裂解更大变化的Fc聚糖的潜力。即使温育过夜以使得酶切活性的潜在差别的影响最小化，EndoS酶仍不能完全对爱必妥Fc聚糖去糖基化。但是，EndoS49显示出完全的去糖基曲线图，因此当进行免疫球蛋白的聚糖概况分析时，EndoS49是更有利的酶。

序列表

<110> 季诺维斯公司

<120> 来自化脓性链球菌的内切糖苷酶及其使用方法

<130> N.114953A

<150> 1115841.7

<151> 2011-09-13

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 843

<212> PRT

<213> 化脓性链球菌

<400> 1

Met Asp Lys His Leu Leu Val Lys Arg Thr Leu Gly Cys Val Cys Ala

1 5 10 15

Ala Thr Leu Met Gly Ala Ala Leu Ala Thr His His Asp Ser Leu Asn

20 25 30

Thr Val Lys Ala Glu Glu Lys Thr Val Gln Thr Gly Lys Thr Asp Gln

35 40 45

Gln Val Gly Ala Lys Leu Val Gln Glu Ile Arg Glu Gly Lys Arg Gly

50 55 60

Pro Leu Tyr Ala Gly Tyr Phe Arg Thr Trp His Asp Arg Ala Ser Thr

65 70 75 80

Gly Ile Asp Gly Lys Gln Gln His Pro Glu Asn Thr Met Ala Glu Val

85 90 95

Pro Lys Glu Val Asp Ile Leu Phe Val Phe His Asp His Thr Ala Ser

100 105 110

Asp Ser Pro Phe Trp Ser Glu Leu Lys Asp Ser Tyr Val His Lys Leu

115 120 125

His Gln Gln Gly Thr Ala Leu Val Gln Thr Ile Gly Val Asn Glu Leu

130 135 140

Asn Gly Arg Thr Gly Leu Ser Lys Asp Tyr Pro Asp Thr Pro Glu Gly

145 150 155 160

Asn Lys Ala Leu Ala Ala Ala Ile Val Lys Ala Phe Val Thr Asp Arg

165 170 175

Gly Val Asp Gly Leu Asp Ile Asp Ile Glu His Glu Phe Thr Asn Lys

180 185 190

Arg Thr Pro Glu Glu Asp Ala Arg Ala Leu Asn Val Phe Lys Glu Ile

195 200 205

Ala Gln Leu Ile Gly Lys Asn Gly Ser Asp Lys Ser Lys Leu Leu Ile

210 215 220

Met Asp Thr Thr Leu Ser Val Glu Asn Asn Pro Ile Phe Lys Gly Ile

225 230 235 240

Ala Glu Asp Leu Asp Tyr Leu Leu Arg Gln Tyr Tyr Gly Ser Gln Gly

245 250 255

Gly Glu Ala Glu Val Asp Thr Ile Asn Ser Asp Trp Asn Gln Tyr Gln

260 265 270

Asn Tyr Ile Asp Ala Ser Gln Phe Met Ile Gly Phe Ser Phe Phe Glu

275 280 285

Glu Ser Ala Ser Lys Gly Asn Leu Trp Phe Asp Val Asn Glu Tyr Asp

290 295 300

Pro Asn Asn Pro Glu Lys Gly Lys Asp Ile Glu Gly Thr Arg Ala Lys

305 310 315 320

Lys Tyr Ala Glu Trp Gln Pro Ser Thr Gly Gly Leu Lys Ala Gly Ile

325 330 335

Phe Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Val Pro Ser Thr

340 345 350

Tyr Lys Asn Arg Thr Ser Thr Asn Leu Gln Arg His Glu Val Asp Asn

355 360 365

Ile Ser His Thr Asp Tyr Thr Val Ser Arg Lys Leu Lys Thr Leu Met

370 375 380

Thr Glu Asp Lys Arg Tyr Asp Val Ile Asp Gln Lys Asp Ile Pro Asp

385 390 395 400

Pro Ala Leu Arg Glu Gln Ile Ile Gln Gln Val Gly Gln Tyr Lys Gly

405 410 415

Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Thr Leu Val Leu Thr Gly Asp Lys Ile

420 425 430

Gln Asn Leu Lys Gly Leu Glu Lys Leu Ser Lys Leu Gln Lys Leu Glu

435 440 445

Leu Arg Gln Leu Ser Asn Val Lys Glu Ile Thr Pro Glu Leu Leu Pro

450 455 460

Glu Ser Met Lys Lys Asp Ala Glu Leu Val Met Val Gly Met Thr Gly

465 470 475 480

Leu Glu Lys Leu Asn Leu Ser Gly Leu Asn Arg Gln Thr Leu Asp Gly

485 490 495

Ile Asp Val Asn Ser Ile Thr His Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ser His

500 505 510

Asn Ser Leu Asp Leu Ser Glu Lys Ser Glu Asp Arg Lys Leu Leu Met

515 520 525

Thr Leu Met Glu Gln Val Ser Asn His Gln Lys Ile Thr Val Lys Asn

530 535 540

Thr Ala Phe Glu Asn Gln Lys Pro Lys Gly Tyr Tyr Pro Gln Thr Tyr

545 550 555 560

Asp Thr Lys Glu Gly His Tyr Asp Val Asp Asn Ala Glu His Asp Ile

565 570 575

Leu Thr Asp Phe Val Phe Gly Thr Val Thr Lys Arg Asn Thr Phe Ile

580 585 590

Gly Asp Glu Glu Ala Phe Ala Ile Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Gly

595 600 605

Arg Gln Tyr Val Ser Lys Asp Tyr Thr Tyr Glu Ala Phe Arg Lys Asp

610 615 620

Tyr Lys Gly Tyr Lys Val His Leu Thr Ala Ser Asn Leu Gly Glu Thr

625 630 635 640

Val Thr Ser Lys Val Thr Ala Thr Thr Asp Glu Thr Tyr Leu Val Asp

645 650 655

Val Ser Asp Gly Glu Lys Val Val His His Met Lys Leu Asn Ile Gly

660 665 670

Ser Gly Ala Ile Met Met Glu Asn Leu Ala Lys Gly Ala Lys Val Ile

675 680 685

Gly Thr Ser Gly Asp Phe Glu Gln Ala Lys Lys Ile Phe Asp Gly Glu

690 695 700

Lys Ser Asp Arg Phe Phe Thr Trp Gly Gln Thr Asn Trp Ile Ala Phe

705 710 715 720

Asp Leu Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Glu Trp Arg Leu Phe Asn Ala

725 730 735

Glu Thr Asn Thr Glu Ile Lys Thr Asp Ser Ser Leu Asn Val Ala Lys

740 745 750

Gly Arg Leu Gln Ile Leu Lys Asp Thr Thr Ile Asp Leu Glu Lys Met

755 760 765

Asp Ile Lys Asn Arg Lys Glu Tyr Leu Ser Asn Asp Glu Asn Trp Thr

770 775 780

Asp Val Ala Gln Met Asp Asp Ala Lys Ala Ile Phe Asn Ser Lys Leu

785 790 795 800

Ser Asn Val Leu Ser Arg Tyr Trp Arg Phe Cys Val Asp Gly Gly Ala

805 810 815

Ser Ser Tyr Tyr Pro Gln Tyr Thr Glu Leu Gln Ile Leu Gly Gln Arg

820 825 830

Leu Ser Asn Asp Val Ala Asn Thr Leu Lys Asp

835 840

<210> 2

<211> 843

<212> PRT

<213> 化脓性链球菌

<400> 2

Met Asp Lys His Leu Leu Val Lys Arg Thr Leu Gly Cys Val Cys Ala

1 5 10 15

Ala Thr Leu Met Gly Ala Ala Leu Ala Thr His His Asp Ser Leu Asn

20 25 30

Thr Val Lys Ala Glu Glu Lys Thr Val Gln Thr Gly Lys Thr Asp Gln

35 40 45

Gln Val Gly Ala Lys Leu Val Gln Glu Ile Arg Glu Gly Lys Arg Gly

50 55 60

Pro Leu Tyr Ala Gly Tyr Phe Arg Thr Trp His Asp Arg Ala Ser Thr

65 70 75 80

Gly Ile Asp Gly Lys Gln Gln His Pro Glu Asn Thr Met Ala Glu Val

85 90 95

Pro Lys Glu Val Asp Ile Leu Phe Val Phe His Asp His Thr Ala Ser

100 105 110

Asp Ser Pro Phe Trp Ser Glu Leu Lys Asp Ser Tyr Val His Lys Leu

115 120 125

His Gln Gln Gly Thr Ala Leu Val Gln Thr Ile Gly Val Asn Glu Leu

130 135 140

Asn Gly Arg Thr Gly Leu Ser Lys Asp Tyr Pro Asp Thr Pro Glu Gly

145 150 155 160

Asn Lys Ala Leu Ala Ala Ala Ile Val Lys Ala Phe Val Thr Asp Arg

165 170 175

Gly Val Asp Gly Leu Asp Ile Asp Ile Leu His Glu Phe Thr Asn Lys

180 185 190

Arg Thr Pro Glu Glu Asp Ala Arg Ala Leu Asn Val Phe Lys Glu Ile

195 200 205

Ala Gln Leu Ile Gly Lys Asn Gly Ser Asp Lys Ser Lys Leu Leu Ile

210 215 220

Met Asp Thr Thr Leu Ser Val Glu Asn Asn Pro Ile Phe Lys Gly Ile

225 230 235 240

Ala Glu Asp Leu Asp Tyr Leu Leu Arg Gln Tyr Tyr Gly Ser Gln Gly

245 250 255

Gly Glu Ala Glu Val Asp Thr Ile Asn Ser Asp Trp Asn Gln Tyr Gln

260 265 270

Asn Tyr Ile Asp Ala Ser Gln Phe Met Ile Gly Phe Ser Phe Phe Glu

275 280 285

Glu Ser Ala Ser Lys Gly Asn Leu Trp Phe Asp Val Asn Glu Tyr Asp

290 295 300

Pro Asn Asn Pro Glu Lys Gly Lys Asp Ile Glu Gly Thr Arg Ala Lys

305 310 315 320

Lys Tyr Ala Glu Trp Gln Pro Ser Thr Gly Gly Leu Lys Ala Gly Ile

325 330 335

Phe Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Val Pro Ser Thr

340 345 350

Tyr Lys Asn Arg Thr Ser Thr Asn Leu Gln Arg His Glu Val Asp Asn

355 360 365

Ile Ser His Thr Asp Tyr Thr Val Ser Arg Lys Leu Lys Thr Leu Met

370 375 380

Thr Glu Asp Lys Arg Tyr Asp Val Ile Asp Gln Lys Asp Ile Pro Asp

385 390 395 400

Pro Ala Leu Arg Glu Gln Ile Ile Gln Gln Val Gly Gln Tyr Lys Gly

405 410 415

Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Thr Leu Val Leu Thr Gly Asp Lys Ile

420 425 430

Gln Asn Leu Lys Gly Leu Glu Lys Leu Ser Lys Leu Gln Lys Leu Glu

435 440 445

Leu Arg Gln Leu Ser Asn Val Lys Glu Ile Thr Pro Glu Leu Leu Pro

450 455 460

Glu Ser Met Lys Lys Asp Ala Glu Leu Val Met Val Gly Met Thr Gly

465 470 475 480

Leu Glu Lys Leu Asn Leu Ser Gly Leu Asn Arg Gln Thr Leu Asp Gly

485 490 495

Ile Asp Val Asn Ser Ile Thr His Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ser His

500 505 510

Asn Ser Leu Asp Leu Ser Glu Lys Ser Glu Asp Arg Lys Leu Leu Met

515 520 525

Thr Leu Met Glu Gln Val Ser Asn His Gln Lys Ile Thr Val Lys Asn

530 535 540

Thr Ala Phe Glu Asn Gln Lys Pro Lys Gly Tyr Tyr Pro Gln Thr Tyr

545 550 555 560

Asp Thr Lys Glu Gly His Tyr Asp Val Asp Asn Ala Glu His Asp Ile

565 570 575

Leu Thr Asp Phe Val Phe Gly Thr Val Thr Lys Arg Asn Thr Phe Ile

580 585 590

Gly Asp Glu Glu Ala Phe Ala Ile Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Gly

595 600 605

Arg Gln Tyr Val Ser Lys Asp Tyr Thr Tyr Glu Ala Phe Arg Lys Asp

610 615 620

Tyr Lys Gly Tyr Lys Val His Leu Thr Ala Ser Asn Leu Gly Glu Thr

625 630 635 640

Val Thr Ser Lys Val Thr Ala Thr Thr Asp Glu Thr Tyr Leu Val Asp

645 650 655

Val Ser Asp Gly Glu Lys Val Val His His Met Lys Leu Asn Ile Gly

660 665 670

Ser Gly Ala Ile Met Met Glu Asn Leu Ala Lys Gly Ala Lys Val Ile

675 680 685

Gly Thr Ser Gly Asp Phe Glu Gln Ala Lys Lys Ile Phe Asp Gly Glu

690 695 700

Lys Ser Asp Arg Phe Phe Thr Trp Gly Gln Thr Asn Trp Ile Ala Phe

705 710 715 720

Asp Leu Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Glu Trp Arg Leu Phe Asn Ala

725 730 735

Glu Thr Asn Thr Glu Ile Lys Thr Asp Ser Ser Leu Asn Val Ala Lys

740 745 750

Gly Arg Leu Gln Ile Leu Lys Asp Thr Thr Ile Asp Leu Glu Lys Met

755 760 765

Asp Ile Lys Asn Arg Lys Glu Tyr Leu Ser Asn Asp Glu Asn Trp Thr

770 775 780

Asp Val Ala Gln Met Asp Asp Ala Lys Ala Ile Phe Asn Ser Lys Leu

785 790 795 800

Ser Asn Val Leu Ser Arg Tyr Trp Arg Phe Cys Val Asp Gly Gly Ala

805 810 815

Ser Ser Tyr Tyr Pro Gln Tyr Thr Glu Leu Gln Ile Leu Gly Gln Arg

820 825 830

Leu Ser Asn Asp Val Ala Asn Thr Leu Lys Asp

835 840

<210> 3

<211> 2532

<212> DNA

<213> 化脓性链球菌

<400> 3

atggataaac atttgttggt aaaaagaaca ctagggtgtg tttgtgctgc aacgttgatg 60

ggagctgcct tagcgaccca ccatgattca ctcaatactg taaaagcgga ggagaagact 120

gttcaaacag gaaagacaga tcagcaggtt ggtgctaaat tggtacagga aatccgtgaa 180

ggaaaacgcg gaccactata tgctggttat tttaggacat ggcatgatcg tgcttcaaca 240

ggaatagatg gtaaacagca acatccagaa aatactatgg ctgaggtccc aaaagaagtt 300

gatatcttat ttgtttttca tgaccataca gcttcagata gtccattttg gtctgaatta 360

aaggacagtt atgtccataa attacatcaa cagggaacgg cacttgttca gacaattggt 420

gttaacgaat taaatggacg tacaggttta tctaaagatt atcctgatac tcctgagggg 480

aacaaagctt tagcagcagc cattgtcaag gcatttgtaa ctgatcgtgg tgtcgatgga 540

ctagatattg atattgagca cgaatttacg aacaaaagaa cacctgaaga agatgctcgt 600

gctctaaatg tttttaaaga gattgcgcag ttaataggta aaaatggtag tgataaatct 660

aaattgctca tcatggacac taccctaagt gttgaaaata atccaatatt taaagggata 720

gcggaagatc ttgattatct tcttagacaa tattatggtt cacaaggtgg agaagctgaa 780

gtggatacta taaactctga ttggaaccaa tatcagaatt atattgatgc tagccagttc 840

atgattggat tctccttttt tgaagaatct gcgtccaaag ggaatttatg gtttgatgtt 900

aacgaatacg accctaacaa tcctgaaaaa gggaaagata ttgaaggaac acgtgctaaa 960

aaatatgcag agtggcaacc tagtacaggt ggtttaaaag caggtatatt ctcttatgct 1020

attgatcgtg atggagtggc tcatgttcct tcaacatata aaaataggac tagtacaaat 1080

ttacaacggc atgaagtcga taatatctca catactgact acaccgtatc tcgaaaatta 1140

aaaacattga tgaccgaaga caaacgctat gatgtcattg atcaaaaaga cattcctgac 1200

ccagcattaa gagaacaaat cattcaacaa gttggacagt ataaaggcga tttggaacgt 1260

tataacaaga cattggtgct tacaggagat aagattcaaa atcttaaagg actagaaaaa 1320

ttaagcaagt tacaaaaatt agagttgcgc cagctatcta acgttaaaga aattactcca 1380

gaacttttgc cggaaagcat gaaaaaagat gctgagcttg ttatggtagg catgactggt 1440

ttagaaaaac taaaccttag tggtctaaat cgtcaaactt tagacggtat agacgtgaat 1500

agtattacgc atttgacatc atttgatatt tcacataata gtttggactt gtcggaaaag 1560

agtgaagacc gtaaactatt aatgactttg atggagcagg tttcaaatca tcaaaaaata 1620

acggtgaaaa atacggcttt tgaaaatcaa aaaccgaaag gttattatcc tcagacgtat 1680

gataccaaag aaggtcatta tgatgttgat aatgcagaac atgatatttt aactgatttt 1740

gtttttggaa ctgttactaa acgtaatacc tttattggag acgaagaagc atttgctatc 1800

tataaagaag gagctgtcga tggtcgacaa tatgtgtcta aagactatac ttatgaagct 1860

tttcgtaaag actataaagg ttacaaggtt catttaactg cttctaacct aggagaaaca 1920

gttacttcta aggtaactgc tactactgat gaaacttact tagtagatgt ttctgatggg 1980

gaaaaagttg ttcaccacat gaaactcaat ataggatctg gtgccatcat gatggaaaat 2040

ctggcaaaag gggctaaagt gattggtaca tctggggact ttgagcaagc aaagaagatt 2100

ttcgatggtg aaaagtcaga tagattcttc acttggggac aaactaactg gatagctttt 2160

gatctaggag aaattaatct tgcgaaggaa tggcgtttat ttaatgcaga gacaaatact 2220

gaaataaaga cagatagtag cttaaacgtg gctaaaggac gtcttcagat tttaaaagat 2280

acaactattg atttagaaaa aatggacata aaaaatcgta aagagtatct gtcgaatgat 2340

gaaaattgga ctgatgttgc tcagatggat gatgcaaaag cgatatttaa tagtaaatta 2400

tccaatgttt tatctcggta ttggcggttt tgtgtagatg gtggagctag ctcttattac 2460

cctcaatata ccgaacttca aatcctcgga caacgtttat caaatgatgt cgctaatacg 2520

ctgaaggatt ga 2532

<210> 4

<211> 310

<212> PRT

<213> 化脓性链球菌

<400> 4

Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro

1 5 10 15

Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn

20 25 30

Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln

35 40 45

Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln

65 70 75 80

Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile

100 105 110

Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro

130 135 140

Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly

165 170 175

Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp

195 200 205

Leu Ile Lys Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His

210 215 220

Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala

225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser

245 250 255

Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn

260 265 270

Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn

275 280 285

Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp

290 295 300

Ser Trp Asn Gln Thr Asn

305 310

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 裂解产物

<400> 5

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

1 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

ctgtaaggat ccaggagaag actg 24

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

gaaacctcga gtctttgtaa tcgtaggact t 31

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

ctagatattg atattcttca cgaatttacg aac 33

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

gttcgtaaat tcgtgaagaa tatcaatatc tag 33

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

atttctcgag ctgaagacgt cctttagcca cg 32

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

taaactcgag ccccatcaga aacatctact aag 33

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

attttctcga ggcattatca acatcataat gacc 34

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

taaactcgag ccagtcatgc ctaccataac aagctcagc 39

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

atttctcgag ctgtccaact tgttgaatg 29

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

aaaacgcgga ccactatatg c 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

aaacgttgtc cgaggatttg 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

agcccttgat gatgctttg 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

aacaattctg ggtgatcgg 19

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 1的179至186残基的GH18催化模体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 指非保守氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa指非保守氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa指非保守氨基酸

<400> 19

Asp Xaa Xaa Asp Xaa Asp Xaa Glu

1 5

Claims

1.一种分离的多肽，选自

(a) SEQ ID NO:1的氨基酸序列；或

(b) 在SEQ ID NO:1的至少810个连续氨基酸上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有100%一致性、并且具有由SEQ ID NO:1的氨基酸序列构成的多肽的内切糖苷酶活性的变体。

2.一种水解糖蛋白的聚糖的方法，该方法包括将所述糖蛋白与权利要求1中定义的多肽一起温育。

3.根据权利要求2所述的方法，所述方法被执行以用来评价所述糖蛋白的糖基化状态，并且其中该方法包括分析由所述温育产生的产物的额外步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括：

(a) 将所述糖蛋白与权利要求1的多肽接触从而水解糖蛋白的聚糖；

(b) 将所述聚糖与去糖基化的蛋白质分离；

(c) 分析所产生的所述聚糖和/或去糖基化的蛋白质。

5.根据权利要求2至4的任一项所述的方法，其中所述糖蛋白包含IgG抗体、单克隆IgG抗体、IgG Fc片段、或α-1-微球蛋白。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述糖蛋白是IgG，并且其中在所述温育步骤之后添加IdeS，或在与所述温育步骤相同的反应混合物中添加IdeS，以诱导所述IgG的蛋白质水解。

7.根据权利要求3所述的方法，其中分析所述产物是否存在岩藻糖或岩藻糖基化的蛋白质。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述分析是通过质谱分析法、HPLC、凝胶色谱法、凝胶电泳法、光谱测定法、或毛细管电泳法来进行的。

9.根据权利要求4所述的方法，其中所述分离是通过HPLC或凝胶色谱法进行的。

10.用于分离IgG的Fab片段或Fc片段的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a) IdeS；

(b) 权利要求1中所定义的多肽；和

(c) 从样品中分离所述IdeS和所述多肽的装置。