KR20170110153A - 시스테인 프로테아제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 나타내는 신규한 폴리펩티드, 및 그의 인 비보 및 엑스 비보에서 용도에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드의 용도는 IgG에 의해 매개된 질병 및 상태의 예방 또는 치료를 위한 방법, 및 IgG의 분석 방법을 포함한다.
Description
본 발명은 IgG 시스테인 프로테아제 (cysteine protease) 활성을 나타내는 신규한 폴리펩티드, 및 그의 인 비보 (in vivo ) 및 엑스 비보 (ex vivo)에서 용도에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드 (polypeptide)의 용도는 IgG에 의해 매개된 질병 및 상태의 예방 또는 치료 방법, 및 IgG의 분석 방법을 포함한다.
IdeS (Immunoglobulin G-degrading enzyme of S . pyogenes)는 인간 병원체인 에스. 피오게네스 (S. pyogenes)에 의해 생성되는 세포외 시스테인 프로테아제이다. IdeS는 원래 혈청형 (serotype) M1을 갖는 그룹 A 스트렙토코쿠스 (group A Streptococcus) 균주로부터 분리되었지만, 상기 ides 유전자가 모든 시험된 그룹 A 스트렙토코쿠스 균주에서 동정되었다. IdeS는 매우 높은 정도의 기질 특이성 (substrate specificity)을 가지며, 그 유일하게 확인된 기질은 IgG이다. IdeS는 인간 IgG의 모든 하위클래스 (subclasses)의 중쇄 (heavy chains)의 하부 힌지 영역 (the lower hinge region)에서 단일 단백질분해 절단 (proteolytic cleavage)을 촉매화한다. IdeS는 또한 다양한 동물에서 IgG의 일부 하위클래스의 중쇄의 균등 한 절단 (equivalent cleavage)을 촉매화한다. IdeS는 2단계 기작을 통해 IgG를 Fc 및 F(ab')2 단편으로 효율적으로 절단한다. 제1 단계에서, IgG의 하나의 (제1) 중쇄가 절단되어, Fc 분자가 비공유 결합된, 단일 절단된 IgG (single cleaved IgG: scIgG) 분자를 생성한다. 상기 scIgG 분자는 원 IgG 분자의 나머지 (제2) 중쇄를 보유하는 효과적인 중간 생성물이다. 상기 기작의 제2 단계에서, 상기 제2 중쇄가 IdeS에 의해 절단되어, F(ab')2 단편과 동종이량체 (homodimeric) Fc 단편이 방출된다. 이들은 생리학적 조건에서 일반적으로 관찰되는 생성물이다. 환원 조건 (reducing conditions)하에서, 상기 F(ab')2 단편은 2 개의 Fab 단편으로 해리될 수 있고, 상기 동종이량체 Fc는 그 구성 단량체로 해리될 수 있다.
상기 IdeS의 IgG 절단 능력이 예를 들면 Fab 및 Fc 단편의 제조 방법에서 엑스 비보에서 유용성을 갖는다는 것이 개시되었고, 이는 IgG의 분석에서 사용될 수 있다. 예를 들면, WO2003051914 및 WO2009033670을 참조한다. IdeS가 또한 치료제로서 인 비보에서 유용성을 갖는 것이 개시되었고, 이는 질병을 매개하거나 또는 그렇지 않다면 바람직하지 않은 IgG 분자의 인 비보에서 절단할 수 있기 때문이다. 예를 들면, WO2003051914, WO2006131347 및 WO2013110946을 참조한다. IdeS가 IgG에 의해서 전부 또는 일부 매개된 임의의 질병 또는 상태에 대한 치료제로 사용될 수 있다. 공여된 장기 (donated organs)의 급성 거부와 마찬가지로, 많은 자가면역 질병이 IgG에 의해서 전부 또는 일부 매개된다.
그러나, IdeS는 면역원성 단백질 (immunogenic protein)이다. 즉, IdeS가 치료제로 사용되는 경우, IdeS를 수용한 대상 (subject)의 면역계가 종종 그에 반응할 것이다. IdeS에 대한 면역계의 반응은 통상적으로 IdeS에 특이적인 항체의 생성에 관여할 것이다. 상기 항체를 본원에서 IdeS에 특이적인 항-약물 항체 (anti-drug antibodies: ADA) 또는 "IdeS-특이적 ADA"라고 할 수 있다. 일반적으로 IdeS에 대한 면역 반응, 및 특히 IdeS-특이적 ADA의 생성은 3가지 관련된 문제를 유발할 수 있다. 첫번째, IdeS의 효능이, 예컨대, ADA 결합에 의해서 감소될 수 있으므로, 잠재적으로 동일한 효과를 달성하기 위해서 더 높거나 또는 반복되는 투여를 필요로 한다. 이러한 효과를 갖는 ADA를 "중화 ADA (neutralising ADA)"라고 할 수 있다. 두번째, ADA 및 IdeS의 면역 복합체에 의해 유발된 고-염증 반응 (hyper-inflammatory response)과 같은 바람직하지 않거나 또는 심지어 유해한 합병증을 일으킬 수 있다. 고려된 대상에서 IdeS에 특이적인 ADA의 양이 더 많아지면, 상기 문제의 가능성이 더 높아진다. 환자에서 IdeS-특이적 ADA 분자의 존재 및 양은 임의의 적당한 방법, 예를 들어 작용제 특이적 CAP FEIA (ImmnnoCAP) 테스트 또는 상기 환자의 혈청 시료에서 수행된 적정 분석 (titre assay)에 의해서 결정될 수 있다. 임상의에 의해서 결정된 역치 (threshold) 이상에서, 상기 환자에서 IdeS-특이적 ADA 분자의 양은 IdeS의 투여를 배제할 수 있거나, 또는 더 높은 용량의 IdeS가 요구되는 것을 나타낼 수 있다. 이러한 더 높은 용량은 결과적으로 상기 환자에서 IdeS-특이적 ADA 분자의 증가된 양을 초래할 수 있으므로, 이로 인해 IdeS의 추가의 투여를 배제할 수 있다.
IdeS는 에스 . 피오게네스의 발병 인자 (virulence factor)이고, 편도염 (tonsillitis) 및 패혈성 인두염 (strep throat)과 같은 일반적인 감염의 원인이 된다. 따라서 대부분의 인간 대상은 이러한 맥락에서 IdeS를 만났고, 혈류에서 항-IdeS 항체를 가질 가능성이 있다. IdeS-특이적 ADA는, 수천 명의 공여자의 풀 (pooled) 혈청에서 추출된 IgG의 제재인, IVIg (Intravenous Immunoglobulin) 제재뿐만 아니라 무작위 인간 대상로부터 혈청 시료 (이전의 스트렙토코쿠스 감염 (streptococcal infection)으로 인한 것일 수 있음)에서 일상적으로 검출된다. IdeS를 처음 투여하기 전에 대상이 IdeS-특이적 ADA를 보유하지 않더라도, 상기 분자가 이후에 생성될 가능성이 있다. 그러므로, 임의의 고려된 대상에 대해, IdeS의 면역원성과 관련된 문제는 치료제로서 IdeS의 사용에 대한 장벽이 될 수 있다. 이러한 문제는, 특히 반복 투여가 필요한 경우, IdeS의 용량을 증가시킬 필요가 있고 및/또는 IdeS로의 치료를 완전히 배제시킬 수 있다. 이러한 유형의 문제에 대한 기존의 접근법은 예를 들어 면역원성을 감소시키기 위한 치료제의 페길화 (PEGylation) 또는 면역-억제제 (immune-suppressive agent)와 상기 치료제의 병용-투여 (co-administration)를 포함한다.
본 발명자들은 전혀 다른 접근법을 채택하였다. 본 발명자들은 IdeS의 서열을 분석하였고, 이를 단백질 IdeZ의 서열과 비교하였고, 이는 IdeS에 대해 대략 66% 동일하였다. IdeZ는 말에서 우세하게 발견되는 박테리아인 스트렙토코쿠스 이퀴 ssp . 주에피데미쿠스 (Streptococcus equi ssp . zooepidemicus)에 의해 생성된 IgG 시스테인 프로테아제이다. IdeZ는 인간의 병원체 (human pathogen)는 아니기 때문에, 인간 대상은 통상적으로 그 혈장에서 상기 단백질에 대한 항체를 갖지 않는다. 그러나, IdeZ는, IdeS 보다 상당히 더 낮은, 인간 IgG에 대한 IgG 시스테인 프로테아제 활성 수준을 갖는다. 본 발명자는 면역원성에서 상당한 증가를 초래하지 않고 인간 IgG에 대한 그 활성을 향상시키는 IdeZ의 서열에서 위치를 조사하였다. 상기 연구의 시작점으로서, 본 발명자들은 IdeZ의 서열과, 본 발명자들에 의해서 디자인된, IdeS와 81.7% 동일하고 IdeZ와 81% 동일한, 신규한 하이브리드 서열 (hybrid sequence) 모두를 사용하였다. 상기 하이브리드 서열은 본원에서 IdeS/Z이라 할 수 있다.
IdeS의 전체 서열이 NCBI 참조 서열 번호 WP_010922160.1로서 공개적으로 입수가능하며, 본원에서 서열번호: 1로 제공되었다. 상기 서열은 N 말단 메티오닌 다음에 28개의 아미노산 분비 신호 서열 (secretion signal sequence)을 포함한다. 상기 N 말단 메티오닌 및 신호 서열 (N 말단에서 전체 29개의 아미노산)이, 성숙한 IdeS 단백질을 형성하기 위해서, 통상적으로 제거되고, 상기 서열은 Genbank 수탁 번호 ADF13949.1로 공개적으로 입수가능하고, 본원에서 서열번호: 2로 제공된다.
IdeZ의 전체 서열이 NCBI 참조 서열 번호 WP_014622780.1로서 공개적으로 입수가능하며, 본원에서 서열번호: 3으로 제공되었다. 상기 서열은 N 말단 메티오닌 다음에 33개의 아미노산 분비 신호 서열을 포함한다. 상기 N 말단 메티오닌 및 신호 서열 (N 말단에서 전체 34개의 아미노산)이, 성숙한 IdeZ 단백질을 형성하기 위해서, 통상적으로 제거되고, 상기 서열은 본원에서 서열번호: 4로 제공된다.
본 발명자에 의해서 디자인된 IdeS/Z 하이브리드의 서열은 IdeZ에 기반한 N 말단 부분을 가지며, 이는 N 말단 메티오닌 및 신호 서열 (상기 N 말단에서 전체 34개의 아미노산)을 갖지 않는다. 상기 서열이 본원에서 서열번호: 5로 제공된다.
본 발명자들은, 본원에 개시된 바와 같이 변형될 때, IdeZ에 대해 인간 IgG에 대한 증가된 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 신규한 폴리펩티드를 유도하는, IdeZ 및 IdeS/Z 하이브리드의 서열 내의 위치를 확인할 수 있었다. 본 발명의 폴리펩티드의 인간 IgG에 대한 IgG 시스테인 프로테아제 활성은 바람직하게 IdeS의인간 IgG에 대한 IgG 시스테인 프로테아제 활성 만큼 적어도 높았다. 본 발명의 폴리펩티드는, 특히 상기 IgG가 IgG2 이소타입 (isotype)인 경우, IgG 분자의 제2 사슬보다 IgG 분자의 제1 사슬의 절단 시에 더 효과적일 수 있다 (도 18을 도를 참조). 본 발명의 폴리펩티드는 IgG2보다 IgG1의 절단 시에 더 효과적일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 통상적으로 IdeS보다 면역원성이 떨어지고, 바람직하게 IdeZ 또는 IdeS/Z 보다 면역원성이 크지 않을 수 있다.
달리 명시하지 않는 한, 본원에 개시된 폴리펩티드에서 아미노산 위치의 넘버링 (numbering)에 대한 모든 참조는, N 말단으로부터 시작하여, 서열번호: 3에서 해당하는 위치의 넘버링에 기반한다. 그러므로, 서열번호: 4 및 5는 서열번호: 3의 N 말단 메티오닌 및 33개의 아미노산 신호 서열이 부족하기 때문에, 서열번호: 4 및 5의 N 말단에서 아스파르트산 (D) 잔기는 서열번호: 3에서 해당하는 위치에 대해 위치 35로 나타낸다. 상기 넘버링 체계를 적용하여, IdeS의 IgG 시스테인 프로테아제 활성에 대해 가장 중요한 잔기는 위치 102 (서열번호: 4 및 5의 N 말단으로부터 68번째 잔기)에서 시스테인 (C) 이다. IgG 시스테인 프로테아제 활성에서 중요할 수 있는 다른 잔기는 서열번호: 3의 위치 92에서 리신 (K), 위치 272에서 히스티딘 (H) 및 위치 294 및 296에서 각각 아스파르트산 (D)이다. 이들은 각각 서열번호: 4의 N 말단으로부터 58, 238, 260 및 262번째 잔기 및 서열번호: 5의 N 말단으로부터 58, 236, 258 및 260번째 잔기이다.
본 발명에 따르면, IgG 시스테인 프로테아제 활성을 가지며, 또한 서열번호: 4 또는 5의 서열의 변이체 (variant)를 포함하는 폴리펩티드가 제공되며, 상기 변이체는:
(a) 서열번호: 4 또는 5에 대해 적어도 50% 동일하고;
(b) 서열번호: 3의 위치 102에 해당하는, 상기 변이체 서열의 위치에 시스테인 (C)을 가지며; 또한 선택적으로
(c) 서열번호: 3의 위치 92, 272, 294 및 296에 해당하는, 상기 변이체 서열의 위치에, 각각 리신 (K), 히스티딘 (H), 아스파르트산 (D) 및 아스파르트산 (D)을 가지며;
상기 폴리펩티드는 인간 IgG 절단 시에 IdeZ보다 더 효과적이고 및/또는 인간 IgG 절단 시에 적어도 IdeS 만큼 효과적이다.
바람직하게, 서열번호: 4 또는 5의 상기 변이체는:
(1) 서열번호: 3의 위치 138에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 양으로 대전된 아미노산을 가지며, 선택적으로 상기 양으로 대전된 아미노산은 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)이고; 및/또는
(2) 서열번호: 3의 위치 139에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 양으로 대전된 아미노산을 가지며, 선택적으로 상기 양으로 대전된 아미노산은 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)이고; 및/또는
(3) 연속된 서열 (contiguous sequence) DDYQRNATEA YAKEVPHQIT를 포함하지 않고; 및/또는
(4) 하기 변형들 중 적어도 하나를 갖는다:
i. 서열번호: 3의 위치 64 및 65에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 루신 (L) 및 트레오닌 (T) 잔기의 결실;
ii. 서열번호: 3의 위치 70에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 아르기닌 (R) 대신에 트레오닌 (T);
iii. 서열번호: 3의 위치 71에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 티로신 (Y)의 결실;
iv. 서열번호: 3의 위치 72에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 아스파라긴 (N) 대신에 글루타민 (Q);
v. 서열번호: 3의 위치 73에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 아스파라긴 (N) 대신에 글리신 (G);
vi. 서열번호: 3의 위치 67에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 글루탐산 (E) 대신에 알라닌 (A);
vii. 서열번호: 3의 위치 68에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 글루타민 (Q) 대신에 아스파라긴 (N).
상기 (4)의 적어도 하나의 변형이 통상적으로 상기 선택사항 i. 내지 vii.로부터 선택된다. 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호: 4 또는 5의 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있고, 상기 변이체는 선택사항 i. 내지 vii.의 변형들 중 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 모두의 변형을 갖는다.
본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드 (polynucleotide), 발현 벡터 (expression vector), 또는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩 (encoding) 또는 발현 (expressing)하는 숙주 세포 (host cell)를 제공한다.
본 발명은 또한 대상에서 IgG 항체에 의해 매개된 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드의 치료적 또는 예방적 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 통상적으로 상기 대상에게 상기 폴리펩티드의 다중 투여 (multiple administrations)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 환자로부터 채취된 혈액을 엑스 비보 처리하는 방법을 제공하고, 통상적으로 상기 환자는 IgG 항체에 의해 매개된 질병 또는 상태를 갖고 있으며, 상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드를 상기 혈액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 대상에 대한 치료법 또는 치료제의 혜택을 개선하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 본 발명의 폴리펩티드를 상기 대상에서 투여하는 단계; 및 (b) 이어서 상기 대상에게 상기 치료법 또는 상기 치료제를 투여하는 단계를 포함하고;
- 상기 치료법은 장기 이식 (organ transplant)이거나, 또는 상기 치료제는 항체, 유전체 치료법 가령 바이러스 벡터, 결함이 있는 내인성 인자 가령 효소의 대체, 성장 또는 응고 인자, 또는 세포 치료법이고;
- 투여되는 상기 폴리펩티드의 양은 상기 대상의 혈장 중에 존재하는 실질적으로 모든 IgG 분자를 절단하기에 충분하고;
- 단계 (a) 및 (b)는 상기 대상의 혈장 중에 존재하는 실질적으로 모든 IgG 분자를 절단하기에 충분한 시간 간격에 의해서 분리된다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드와 IgG를, 바람직하게 엑스 비보에서 접촉시키는 단계를 포함하는 IgG의 Fc, Fab 또는 F(ab')2 단편을 생성하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 키트 (kits)가 제공된다.
도 1 및 2는, 대조군과 비교하여, 본 발명의 폴리펩티드의 효력 (potency) (IgG의 절단시 효능 (efficacy))을 결정하기 위한 대표적인 분석법의 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IgG1의 인큐베이션 (incubation)에 의해 생성된 절단 산물 (cleavage products)을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE 겔의 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IVIg의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE 겔의 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명 또는 대조군의 부가의 폴리펩티드와 IgG1의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE 겔의 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IgG2의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE 겔의 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IVIg의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE 겔의 결과를 나타낸다.
도 8 및 9는, 대조군과 비교하여, IdeS-특이적 항체에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 인식 (recognition) 수준을 결정하기 위한 대표적인 경쟁 분석 (competition assays)의 결과를 나타낸다.
도 10 및 11은, 대조군과 비교하여, IdeS-특이적 항체에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 인식 수준을 결정하기 위한 대표적인 적정 분석 (titration assays)의 결과를 나타낸다.
도 12는 다른 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드에 의한 IgG1의 절단에 대한 대표적인 적정 곡선 (titration curves)을 나타낸다.
도 13은 다른 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드에 의한 IgG2의 절단에 대한 대표적인 적정 곡선을 나타낸다.
도 14는 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IgG의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다.
도 15는 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IgG의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다.
도 16은 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IVIg의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다.
도 17은 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IVIg의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다.
도 18은 본 발명의 폴리펩티드에 의한 면역글로불린 (immunoglobulins)의 절단을 나타내는 도이다.
도 19는 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와, ADA 결합 부위의 대표적인 경쟁율 (%) (% competition)의 결과를 나타낸다.
도 20은 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와, ADA 결합 부위의 부가의 대표적인 경쟁율 (%)의 결과를 나타낸다.
도 21은 인간 IgG 인 비보 절단하는데 본 발명의 폴리펩티드의 효능을 결정하는데 사용된 대표적인 효능 ELISA (efficacy ELISA)의 결과를 나타낸다.
도 22는 본 발명의 폴리펩티드에 의해 인 비보에서 생성된 IgG 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열번호: 1은 N 말단 메티오닌 및 신호 서열을 포함하는 IdeS의 전체 서열이다. 또한, NCBI 참조 서열 번호 WP_010922160.1로 개시되었다.
서열번호: 2는, N 말단 메티오닌 및 신호 서열이 없는, IdeS의 성숙한 서열이다. 또한, Genbank 수탁 번호 ADF13949.1로 개시되었다.
서열번호: 3은 N 말단 메티오닌 및 신호 서열을 포함하는 IdeZ의 전체 서열이다. 또한, NCBI 참조 서열 번호 WP_014622780.1로 개시되었다.
서열번호: 4는, N 말단 메티오닌 및 신호 서열이 없는, IdeZ의 성숙한 서열이다.
서열번호: 5는 본 발명자에 의해서 디자인된 하이브리드 IdeS/Z의 서열이다. 상기 N 말단은, N 말단 메티오닌 및 신호 서열이 없는, IdeZ에 기반한다.
서열번호: 6 내지 25는 본 발명의 예시되는 폴리펩티드의 서열이다.
서열번호: 26은 대조군으로서 본원에 사용된 IdeS 폴리펩티드의 서열이다. 이는 부가의 N 말단 메티오닌 및 히스티딘 태그 (tag) (내부 참조 pCART124)를 갖는 서열번호: 2의 서열을 포함한다.
서열번호: 27은 대조군으로서 본원에 사용된 IdeZ 폴리펩티드의 서열이다. 이는 부가의 N 말단 메티오닌 및 히스티딘 태그 (내부 참조 pCART144)를 갖는 서열번호: 4의 서열을 포함한다.
서열번호: 28은 대조군으로서 본원에 사용된 IdeS/Z 폴리펩티드의 서열이다. 이는 부가의 N 말단 메티오닌 및 히스티딘 태그 (내부 참조 pCART145)를 갖는 서열번호: 5의 서열을 포함한다.
서열번호: 29는, 서열번호: 3의 위치 63-73에 해당하는, 연속된 서열 PLTPEQFRYNN이다.
서열번호: 30은, 서열번호: 1의 위치 58-65에 해당하는, 연속된 서열 PPANFTQG이다.
서열번호: 31은, 서열번호: 3의 위치 35-54에 해당하는, 연속된 서열 DDYQRNATEAYAKEVPHQIT이다.
서열번호: 32는, 서열번호: 1의 위치 30-49에 해당하는, 연속된 서열 DSFSANQEIRYSEVTPYHVT이다.
서열번호: 33 내지 55는 본원에 개시된 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
도 3은 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IgG1의 인큐베이션 (incubation)에 의해 생성된 절단 산물 (cleavage products)을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE 겔의 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IVIg의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE 겔의 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명 또는 대조군의 부가의 폴리펩티드와 IgG1의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE 겔의 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IgG2의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE 겔의 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IVIg의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE 겔의 결과를 나타낸다.
도 8 및 9는, 대조군과 비교하여, IdeS-특이적 항체에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 인식 (recognition) 수준을 결정하기 위한 대표적인 경쟁 분석 (competition assays)의 결과를 나타낸다.
도 10 및 11은, 대조군과 비교하여, IdeS-특이적 항체에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 인식 수준을 결정하기 위한 대표적인 적정 분석 (titration assays)의 결과를 나타낸다.
도 12는 다른 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드에 의한 IgG1의 절단에 대한 대표적인 적정 곡선 (titration curves)을 나타낸다.
도 13은 다른 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드에 의한 IgG2의 절단에 대한 대표적인 적정 곡선을 나타낸다.
도 14는 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IgG의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다.
도 15는 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IgG의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다.
도 16은 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IVIg의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다.
도 17은 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와 IVIg의 인큐베이션에 의해 생성된 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다.
도 18은 본 발명의 폴리펩티드에 의한 면역글로불린 (immunoglobulins)의 절단을 나타내는 도이다.
도 19는 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와, ADA 결합 부위의 대표적인 경쟁율 (%) (% competition)의 결과를 나타낸다.
도 20은 본 발명 또는 대조군의 폴리펩티드와, ADA 결합 부위의 부가의 대표적인 경쟁율 (%)의 결과를 나타낸다.
도 21은 인간 IgG 인 비보 절단하는데 본 발명의 폴리펩티드의 효능을 결정하는데 사용된 대표적인 효능 ELISA (efficacy ELISA)의 결과를 나타낸다.
도 22는 본 발명의 폴리펩티드에 의해 인 비보에서 생성된 IgG 절단 산물을 가시화하기 위해 사용된 대표적인 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열번호: 1은 N 말단 메티오닌 및 신호 서열을 포함하는 IdeS의 전체 서열이다. 또한, NCBI 참조 서열 번호 WP_010922160.1로 개시되었다.
서열번호: 2는, N 말단 메티오닌 및 신호 서열이 없는, IdeS의 성숙한 서열이다. 또한, Genbank 수탁 번호 ADF13949.1로 개시되었다.
서열번호: 3은 N 말단 메티오닌 및 신호 서열을 포함하는 IdeZ의 전체 서열이다. 또한, NCBI 참조 서열 번호 WP_014622780.1로 개시되었다.
서열번호: 4는, N 말단 메티오닌 및 신호 서열이 없는, IdeZ의 성숙한 서열이다.
서열번호: 5는 본 발명자에 의해서 디자인된 하이브리드 IdeS/Z의 서열이다. 상기 N 말단은, N 말단 메티오닌 및 신호 서열이 없는, IdeZ에 기반한다.
서열번호: 6 내지 25는 본 발명의 예시되는 폴리펩티드의 서열이다.
서열번호: 26은 대조군으로서 본원에 사용된 IdeS 폴리펩티드의 서열이다. 이는 부가의 N 말단 메티오닌 및 히스티딘 태그 (tag) (내부 참조 pCART124)를 갖는 서열번호: 2의 서열을 포함한다.
서열번호: 27은 대조군으로서 본원에 사용된 IdeZ 폴리펩티드의 서열이다. 이는 부가의 N 말단 메티오닌 및 히스티딘 태그 (내부 참조 pCART144)를 갖는 서열번호: 4의 서열을 포함한다.
서열번호: 28은 대조군으로서 본원에 사용된 IdeS/Z 폴리펩티드의 서열이다. 이는 부가의 N 말단 메티오닌 및 히스티딘 태그 (내부 참조 pCART145)를 갖는 서열번호: 5의 서열을 포함한다.
서열번호: 29는, 서열번호: 3의 위치 63-73에 해당하는, 연속된 서열 PLTPEQFRYNN이다.
서열번호: 30은, 서열번호: 1의 위치 58-65에 해당하는, 연속된 서열 PPANFTQG이다.
서열번호: 31은, 서열번호: 3의 위치 35-54에 해당하는, 연속된 서열 DDYQRNATEAYAKEVPHQIT이다.
서열번호: 32는, 서열번호: 1의 위치 30-49에 해당하는, 연속된 서열 DSFSANQEIRYSEVTPYHVT이다.
서열번호: 33 내지 55는 본원에 개시된 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
개시된 생성물 및 방법들의 다른 적용이 당업계에서 특정 요구에 맞도록 맞춤화될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어들은 발명의 특정 구현예를 서술하기 위한 목적일 뿐이며, 제한을 위한 것으로 사용된 것은 아니라는 점도 이해되어야 한다.
추가적으로, 본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an", 및 "the"는 문맥에서 분명히 달리 나타내지 않는 한 복수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "폴리펩티드 (a polypeptide)"는 "폴리펩티드들 (polypeptides)"을 포함한다.
"폴리펩티드 (polypeptide)"는 둘 이상의 서브유닛 (subunit) 아미노산, 아미노산 유사체 (analogs), 또는 다른 펩티도미메틱스 (peptidomimetics)의 화합물을 나타내는 광의로 본원에서 사용된다. 그러므로, 용어 "폴리펩티드 (polypeptide)"는 짧은 펩티드 서열 및 또한 더 긴 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는, 용어 "아미노산 (amino acid)"은, D 또는 L 광학 이성질체 (optical isomers)를 포함하는, 천연 (natural) 및/또는 비천연 (unnatural) 또는 합성 (synthetic) 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱스를 나타낸다.
용어 "환자 (patient)" 및 "대상 (subject)"은 상호교환가능하게 사용되며, 통상적으로 인간을 의미한다. IgG에 대한 언급은, 달리 명시하지 않는 한, 통상적으로 인간 IgG (human IgG)를 나타낸다.
본원에서 인용된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 전술 또는 후술되건 간에, 그 전체로서 참조에 의해서 여기에 통합된다.
폴리펩티드의 기능적 특성
본 발명은 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 신규한 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 폴리펩티드는 인간 IgG의 절단 시에 IdeZ보다 더 효과적이다. 본 발명의 폴리펩티드의 인간 IgG에 대한 IgG 시스테인 프로테아제 활성은 바람직하게 IdeS의 인간 IgG에 대한 IgG 시스테인 프로테아제 활성만큼 적어도 높다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 통상적으로 IdeS보다 면역원성이 떨어지고, 또한 바람직하게 IdeZ 또는 IdeS/Z 보다 면역원성이 높지 않을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 대조 (control) 또는 비교 (comparison)의 문맥에서, "IdeS", "IdeZ" 및 "IdeS/Z"은 각각 서열번호: 2, 4, 및 5의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 나타낸다. 대안으로 또는 부가적으로, "IdeS", "IdeZ" 및 "IdeS/Z"가 대조 또는 비교로서 사용되는 경우, 이들은 표준 박테리아 발현 시스템에서 발현 및 그로부터 분리를 돕기 위해서, N 말단에서 추가의 메티오닌 (M) 잔기 및/또는 C 말단에서 태그 (tag)를 갖는, 서열번호: 2, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 각각 나타낼 수 있다. 적합한 태그는 폴리펩티드의 C 말단에 직접적으로 결합될 수 있거나 또는 임의의 적당한 링커 서열 (linker sequence), 가령 3, 4 또는 5개의 글리신 잔기에 의해서 간접적으로 결합될 수 있는, 히스티딘 태그를 포함한다. 상기 히스티딘 태그는 통상적으로 6개의 히스티민 잔기로 구성되며, 이는 통상적으로 최대 7, 8, 9, 10 또는 20개의 아미노산으로, 이보다 더 길 수 있거나, 또는 예를 들면 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산으로, 이보다 더 짧을 수 있다. 본원에서 사용된 예시되는 IdeS 폴리펩티드의 서열이 서열번호: 22로 제공된다. 상기 폴리펩티드는 추가의 N 말단 메티오닌 및 히스티딘 태그를 갖는 서열번호: 2의 서열을 포함하고, 본원에서 pCART124라고 할 수 있다. 본원에서 사용된 예시되는 IdeZ 폴리펩티드의 서열이 서열번호: 23으로 제공된다. 상기 폴리펩티드는 추가의 N 말단 메티오닌 및 히스티딘 태그를 갖는 서열번호: 4의 서열을 포함하고, 본원에서 pCART144라고 할 수 있다. 본원에서 사용된 예시되는 IdeS/Z 폴리펩티드의 서열이 서열번호: 24로 제공된다. 상기 폴리펩티드는 추가의 N 말단 메티오닌 및 히스티딘 태그를 갖는 서열번호: 5의 서열을 포함하고, 본원에서 pCART145라고 할 수 있다.
IgG 시스테인 프로테아제 활성이 임의의 적당한 방법, 예를 들면 IgG를 함유하는 시료와 폴리펩티드를 인큐베이션하고, IgG 절단 산물의 존재를 결정하는 단계에 의해서 평가될 수 있다. 효능은 억제제 (inhibitor), 가령 중화 항체 (neutralising antibody)의 존재 또는 부재에서 평가될 수 있다. 그러나, 본원에서 효능 (efficacy)은, 달리 명시하지 않은 한, 통상적으로 상기 억제제의 부재 하에 평가되는 효능을 의미할 것이다. 적당한 방법은 실시예에서 개시된다. IgG 절단 시에 폴리펩티드의 효능은 본원에서 상기 폴리펩티드의 "효력 (potency)"으로 나타낼 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 효력은 동일한 분석으로 측정되는 IdeZ의 효력보다 바람직하게 적어도 2.0배 더 크다. 대안으로서, 본 발명의 폴리펩티드의 효력은 바람직하게 동일한 분석으로 측정되는 IdeS의 효력과 적어도 동일하다. 본 발명의 폴리펩티드의 효력은 동일한 분석으로 측정되는 IdeS의 효력보다 적어도 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 4.0배, 4.5배, 5.0배, 6.0배, 7.0배, 7.5배 또는 8.0배 더 클 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 효력은 동일한 분석으로 측정되는 IdeS의 효력보다 바람직하게 적어도 2.0배, 더 바람직하게 적어도 3.0배 또는 4.0배, 가장 바람직하게 적어도 8.0배 더 크다.
본 발명의 폴리펩티드는 통상적으로 IdeS보다 면역원성이 떨어지므로, IdeZ에 대해 증가된 효력 및/또는 IdeS에 동등한 효력은 인간 IgG에 대한 시스테인 프로테아제 활성에 대한 허용가능한 최소 기준이다. 그러나, IdeS에 대해 증가된 효력은 바람직한 개선이다. 이러한 증가된 효력은 통상적으로, 더 높은 용량의 IdeS와 동일한 치료적 효과를 위해서, 본 발명의 폴리펩티드의 용량을 더 적게 사용하게 할 것이다. 용량이 적어지면, IdeS에 대해 본 발명의 폴리펩티드의 반복 투여의 수를 더 증가시킬 수 있다. 이는 더 적은 용량의 사용으로 치료제의 면역원성과 관련된 문제를 감소시키기 때문이며, 이는 면역계가, 더 적은 농도로 존재하는 작용제에 대해, 덜 반응하거나 또는 덜 격렬하게 반응할 것이기 때문이다.
IgG의 절단 시에 폴리펩티드의 효능을 평가하기 위한 분석법, 즉 폴리펩티드의 효력을 평가하기 위한 분석법이 당분야에 잘 알려져 있으며, 임의의 적당한 분석법이 사용될 수 있다. 적당한 분석법으로는 ELISA-기반 분석법, 가령 실시예에서 개시되는 것을 포함한다. 이러한 분석법에서, 분석 플레이트 (assay plate)의 웰 (well)이 통상적으로 항체 표적 (antibody target), 가령 우혈청 알부민 (bovine serum albumin: BSA)으로 코팅될 것이다. 시험되는 폴리펩티드의 시료가 그 후 상기 웰로 첨가되고, 본 실시예에서 BSA에 대해 특이적인 항체인 표적-특이적 항체 (target-specific antibody)의 시료가 첨가된다. 상기 폴리펩티드 및 항체가 IgG 시스테인 프로테아제 활성에 대해 적합한 조건하에 반응되도록 한다. 적당한 간격 (interval) 후에, 상기 분석 플레이트가 세척될 것이고, 상기 표적-특이적 항체에 특이적으로 결합된 검출 항체 (detector antibody)가 상기 표적-특이적 항체에 결합하기에 적당한 조건하에 첨가될 것이다. 상기 검출 항체가, 각 웰에서 상기 표적에 결합되어진, 임의의 온전한 (intact) 표적-특이적 항체에 결합할 것이다. 세척한 후에, 웰에 존재하는 검출 항체의 양은 상기 웰에 결합된 표적-특이적 항체의 양에 비례할 것이다. 검출 항체는 표지 (label) 또는 다른 리포터 시스템 (reporter system) (가령 효소)에 직접 또는 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있고, 이는 각 웰에 남아 있는 검출 항체의 양이 결정될 수 있다. 웰에 존재했던 상기 시험된 폴리펩티드의 효력이 더 높아지면, 온전한 표적-특이적 항체가 덜 남아 있을 것이고, 그러므로 검출 항체가 더 적어질 것이다. 통상적으로, 주어진 분석 플레이트에서 적어도 하나의 웰은 시험되는 폴리펩티드 대신에 IdeS를 포함할 것이므로, 상기 시험된 폴리펩티드의 효력이 상기 IdeS의 효력과 직접 비교될 수 있다. IdeZ 및 IdeS/Z가 또한 비교를 위해 포함될 수 있다.
다른 분석법은, 시험된 폴리펩티드에 의한 IgG의 절단으로부터 기인되는 IgG의 단편을 직접 가시화 및/또는 정량화함으로써, 시험된 폴리펩티드의 효력을 결정할 수 있다. 상기 유형의 분석법이 또한 실시예에서 개시되었다. 이러한 분석법은 통상적으로 적정 시리즈 (titration series)에서 다른 농도의 시험 폴리펩티드 (또는 대조군으로 IdeS, IdeZ 및 IdeS/Z의 하나 이상)와 IgG의 시료를 인큐베이션할 것이다. 각 농도에서 인큐베이션으로부터 기인한 산물이 그 후 겔 전기영동 (gel electrophoresis), 예를 들면 SDS-PAGE를 사용하여 분리된다. 전체 IgG 및 IgG의 절단으로부터 기인한 단편이 그 후 크기로 확인될 수 있고, 적당한 염료에 의한 착색의 세기에 의해서 정량화될 수 있다. 절단 단편의 양이 더 많아지면, 주어진 농도에서 시험된 폴리펩티드의 효력이 더 커진다. 본 발명의 폴리펩티드는 통상적으로, 더 낮은 농도 (적정 시리즈에서 더 낮은 위치)에서 IdeZ 및/또는 IdeS보다 절단 단편의 검출가능한 양을 생산할 것이다. 상기 유형의 분석법은 또한 IgG 분자의 제1 또는 제2 중쇄의 절단 시에 더 효과적인 시험 폴리펩티드를 동정할 수 있게 하며, 이는 각 절단 이벤트로부터 기인하는 다른 단편의 양이 또한 결정될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는, 특히 IgG가 IgG2 이소타입인 경우, IgG 분자의 제2 사슬보다 IgG 분자의 제1 사슬을 절단하는데 더 효과적일 수 있다 (도 18 참조). 본 발명의 폴리펩티드는 IgG2보다 IgG1의 절단 시에 더 효과적일 수 있다.
상기 유형의 분석법은 IdeS-특이적 ADA의 존재가 본 발명의 폴리펩티드의 효력을 감소시킬 수 있는 정도를 결정하도록 또한 조정될 수 있다. 조정된 분석법에서, IgG의 시료가 시험 폴리펩티드 (또는 대조군으로 IdeS)와 인큐베이션되는 경우, IdeS-특이적 ADA를 함유하는 혈청 또는 IVIg 제재가 반응 배지 (reaction medium)에 포함된다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 효력은, 동일한 분석에서 IdeS의 효력보다, ADA의 존재에 영향을 받지 않거나, 또는 ADA의 존재에 의해서 덜 감소된다. 즉, 바람직하게 본 발명의 폴리펩티드에서 IdeS-특이적 ADA의 중화 효과 (neutralizing effect)는, 동일한 분석으로 측정하여, IdeS에서 IdeS-특이적 ADA의 중화 효과와 동일하거나 더 적다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 통상적으로 IdeS보다 면역원성이 떨어진다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는, 동일한 용량 또는 농도로 존재하고, 또한 동일한 분석으로 측정되는 경우, IdeS와 면역 반응이 동일하거나, 또는 바람직하게는 이보다 더 적은 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성은 통상적으로 동일한 분석으로 측정되는 IdeS의 면역원성의 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 또는 25% 이하이다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성은 동일한 분석으로 측정되는 IdeS의 면역원성의 25% 이하이다.
폴리펩티드의 면역원성을 평가하기 위한 분석법이 당분야에 잘 알려져 있고, 임의의 적당한 분석법이 사용될 수 있다. IdeS의 면역원성에 대한 폴리펩티드의 면역원성을 평가하기 위한 바람직한 분석법은, IdeS에 대해 특이적인 ADA가 또한 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 정도를 평가하는 단계를 포함한다. 이러한 유형의 분석법이 실시예에 개시되었다.
하나의 이러한 분석법은 IdeS-특이적 ADA에 결합하기 위한 시험 폴리펩티드와 IdeS 사이의 경쟁에 대한 테스트하는 단계를 포함한다. 통상적으로, 분석 플레이트의 웰이 IdeS로 코팅되고, 그 후 IdeS-특이적 ADA, 예컨대 IVIg 제재, 및 시험 폴리펩티드 (또는 대조군으로 IdeS)를 포함하는 용액의 사전-인큐베이션된 혼합물이 투여되었다. 상기 사전-인큐베이션이 IgG 시스테인 프로테아제 활성의 억제제, 예컨대 아이오도아세트산 (iodoacetic acid: IHAc)의 존재하에 실시되고, 그 결과 높은 염 농도 (salt concentration)에서 단백질과 ADA 사이의 높 친화도 결합 (affinity binding)이 허용되었다. 상기 사전-인큐베이션된 혼합물이 상기 IdeS 코팅된 웰과 상호작용하도록 했다. 시험 폴리펩티드에 결합되지 않은 임의의 IdeS-특이적 ADA는 상기 웰에서 상기 IdeS에 결합할 것이다. 적당한 간격 후에, 상기 분석 플레이트가 세척될 것이고, IgG에 특이적으로 결합하는 검출 항체가 결합에 적당한 조건 하에 첨가될 것이다. 상기 검출 항체가, 각 웰에서 상기 IdeS에 결합되어진 임의의 ADA에 결합될 것이다. 세척 후에, 웰에 존재하는 검출 항체의 양은 상기 시험 폴리펩티드에 결합되어진 ADA의 양에 반비례할 것이다. 상기 검출 항체가 표지 또는 다른 리포터 시스템 (가령 효소)에 직접 또는 간접적으로 콘쥬게이트될 것이고, 각 웰에 남아 있는 검출 항체의 양이 결정될 수 있다. 통상적으로 주어진 분석 플레이트에서 적어도 하나의 웰이, 시험되는 폴리펩티드 대신에, IVIg 및 IdeS의 사전-인큐베이션된 혼합물로 시험될 것이고, 그 결과 상기 시험된 폴리펩티드로 ADA의 결합이 IdeS로의 결합과 직접 비교될 수 있고, IdeZ 및/또는 IdeS/Z이 또한 부가의 대조군으로서 포함될 수 있다.
다른 적당한 분석법은, IdeS-특이적 ADA, 예컨대 IVIg 제재의 다른 농도의 적정 시리즈가 대조군으로서 IdeS 및/또는 IdeZ과 비교하여 시험 폴리펩티드에 결합하는 정도를 테스트하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는, IdeS로의 결합이 검출가능하기 위한 ADA의 농도와 비교하여, 결합이 검출가능하기 위한 ADA의 농도를 더 많이 필요로 할 것이다. 이러한 분석법이 실시예에 개시되었다. 상기 분석법은 통상적으로 분석 플레이트의 웰을 시험 폴리펩티드 또는 대조군으로 코팅하고, 그 후 적정 시리즈로부터 IdeS-특이적 ADA의 다른 농도를 갖는 각 웰을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 상기 인큐베이션이 IgG 시스테인 프로테아제 활성의 억제제, 예컨대 아이오도아세트산 (IHAc)의 존재 하에 실시되고, 높은 염 농도에서 단백질과 ADA 사이의 높은 친화도 결합이 허용된다. 적당한 간격 후에, 상기 분석 플레이트가 세척될 것이고, IgG F(ab')2 에 특이적으로 결합하는 검출 항체가 결합에 적합한 조건 하에 첨가될 것이다. 상기 검출 항체가 각 웰에서 시험 폴리펩티드 또는 IdeS에 결합되어진 임의의 ADA에 결합될 것이다. 세척 후에, 웰에 존재하는 검출 항체의 양은 시험 폴리펩티드 또는 대조군에 결합되어진 ADA의 양에 직접 비례할 것이다. 상기 검출 항체가 표지 또는 다른 리포터 시스템 (가령 효소)에 직접 또는 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있어서, 각 웰에 남아 있는 검출 항체의 양이 결정될 수 있다. 주어진 분석 플레이트에서 적어도 하나의 웰이 검정 (blank)으로 ADA가 없는 완충액과 인큐베이션되어서, 시험 웰에서 결합의 검출을 위한 역치 수준 (threshold level)을 수립할 것이다.
폴리펩티드의 구조적 특성
본 섹션은 본 발명의 폴리펩티드의 구조적 특성을 개시하고, 이는 이전 섹션에서 개관된 기능적 특성에 부가하여 적용된다.
본 발명의 폴리펩티드는 통상적으로 적어도 100, 150, 200, 250, 260, 270, 280, 290, 300 또는 310개의 아미노산 길이이다. 본 발명의 폴리펩티드는 통상적으로 400, 350, 340, 330, 320 또는 315개 이하의 아미노산 길이이다. 상기 열거된 하한들 중 어느 것이 본 발명의 폴리펩티드의 길이 범위를 제공하기 위해서 상기 열거된 상한들의 어느 것과 조합될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는 100 내지 400개의 아미노산 길이, 또는 250 내지 350개의 아미노산 길이일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 바람직하게 290 내지 320개의 아미노산 길이, 가장 바람직하게 300 내지 315개의 아미노산 길이이다.
본 발명의 폴리펩티드의 1차 구조 (아미노산 서열)가 IdeZ 또는 IdeS/Z의 1차 구조, 특히 각각 서열번호: 4 또는 5의 아미노산 서열에 기반한다. 본 발명의 폴리펩티드의 서열은, 서열번호: 4 또는 5의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 서열번호: 4 또는 5의 아미노산 서열의 변이체를 포함한다. 상기 변이체 서열은 서열번호: 4 또는 5의 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일할 수 있다. 상기 변이체는, 본원에서 확인된 특정 변형들의 하나 이상을 포함하는 것을 제외하고는 서열번호: 4 또는 5의 서열과 동일할 수 있다. 서열번호: 4 또는 5의 서열에 대한 동일성 (identity)이, 서열번호: 4 또는 5에 개시된 서열의 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300 이상의 연속된 아미노산의 영역에 대해, 또는 더 바람직하게 서열번호: 4 또는 5의 전체 길이에 대해 측정될 수 있다.
아미노산 동일성 (amino acid identity)이 임의의 적당한 알고리즘을 사용하여 산출될 수 있다. 예를 들면, PILEUP 및 BLAST 알고리즘이 동일성 또는 라인업 (line up) 서열을 산출하는데 사용될 수 있고 (가령 (통상적으로 그 디폴트 세팅에서) 균등 또는 해당하는 서열을 확인할 때), 예를 들면 Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10에 개시되었다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어가 the National Center for Biotechnology Information을 통해 공개적으로 이용가능하다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 상기 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드로 정렬될 때 일부 양의 값 역치 스코어 T와 부합하거나 또는 만족하는 질의 서열 (query sequence)에서 길이가 W인 짧은 워드를 식별함으로써 높은 스코어를 얻은 서열 쌍 (high scoring sequence pair: HSP)을 먼저 확인하는 단계를 포함한다. T는 인접 워드 스코어 역치 (neighbourhood word score threshold)라고 한다 (Altschul et al, supra). 이러한 초기 인접 워드 히트 (hits)는 이들을 포함하는 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하기 위한 시드 (seeds)로서 작용한다. 상기 워드 히트는, 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 각 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 누적 정렬 스코어가 그 최대 달성 값에서 양 X 만큼 떨어지고; 하나 이상의 음-스코어 잔류 정렬의 축적에 의해서, 상기 누적 스코어가 0 또는 그 아래로 향하거나; 또는 각 서열의 끝에 도달하는 경우, 각 방향에서 워드 히트에 대한 확장이 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 단어 길이 (W)가 11, BLOSUM62 스코어 매트릭스 (Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 10915-10919 참조) 정렬 (B) 50, 기대치 (E) 10, M = 5, N = 4 및 두 가닥의 비교가 디폴트 (defaults)로 사용된다.
BLAST 알고리즘은 두 서열 사이의 유사성 (similarity)의 통계 분석을 수행한다: 예컨대, Karlin and Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 5873-5787 참조. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 측정은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공하는 최소 합 확률 (smallest sum probability) (P(N))이다. 예를 들면, 제2 서열에 대한 제1 서열을 비교할 때 최소 합 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 서열은 다른 서열과 유사하다고 간주된다. 대안으로, UWGCG 패키지는 (예를 들면, 그 디폴트 세팅으로 사용된) 동일성을 산출하기 위해 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다 (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395).
본 발명의 폴리펩티드의 서열은, 아미노산 부가, 결실 또는 치환과 같은 변형이 서열번호: 4 또는 5의 서열에 대해 만들어진, 서열번호: 4 또는 5의 아미노산 서열의 변이체를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 상기 변형은 바람직하게 보존적 (conservative) 아미노산 치환이다. 보존적 치환은 아미노산을 유사한 화학적 구조, 유사한 화학적 특성, 또는 유사한 곁사슬 부피 (side-chain volume)의 다른 아미노산으로 대체시킨다. 도입된 아미노산은 이들이 대체되는 아미노산에 대해, 유사한 극성 (polarity), 친수성 (hydrophilicity), 소수성 (hydrophobicity), 염기성 (basicity), 산성 (acidity), 중성 (neutrality) 또는 전하 (charge)를 가질 수 있다. 대안으로, 상기 보존적 치환은 기존의 방향족 또는 지방족 아미노산 대신에 방향족 또는 지방족인 다른 아미노산을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 변화가 당 분야에 잘 알려져 있고, 하기 표 A1에 정의된 바와 같은 20개의 주요 아미노산들의 특성에 따라서 선택될 수 있다. 아미노산이 유사한 극성을 갖는 경우, 이는 표 A2에서 아미노산 곁사슬에 대한 소수성 등급(hydropathy scale)을 참고하여 결정될 수 있다.
표 A1 - 아미노산의 화학적 특성
표 A2 - 소수성 등급
곁사슬
소수성
Ile
4.5
Val
4.2
Leu
3.8
Phe
2.8
Cys
2.5
Met
1.9
Ala
1.8
Gly
-0.4
Thr
-0.7
Ser
-0.8
Trp
-0.9
Tyr
-1.3
Pro
-1.6
His
-3.2
Glu
-3.5
Gln
-3.5
Asp
-3.5
Asn
-3.5
Lys
-3.9
Arg
-4.5
본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호: 4 또는 5의 아미노산 서열의 변이체를 포함한다. 그러나, 서열번호: 4 또는 5의 아미노산 서열에서 특정 잔기는 바람직하게 상기 변이체 서열 내에 보유된다. 예를 들면, 상기 변이체 서열은 통상적으로 IgG 시스테인 프로테아제 활성에 대해 요구되는 것이 알려져 있는 특정 잔기를 보유한다. 그러므로, 서열번호: 3의 위치 102에서 시스테인이 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 보유되어야 한다 (서열번호: 4 또는 5의 68번째 잔기). 선택적으로, 서열번호: 3의 위치 92에서 리신 (K), 위치 272에서 히스티딘 (H) 및 위치 294 및 296에서 각각 아스파르트산 (D)이 또한 보유된다. 이는 각각 서열번호: 4의 N 말단으로부터 58, 238, 260 및 262번째 잔기, 및 서열번호: 5의 N 말단으로부터 58, 236, 258 및 260번째이다. 그러므로, 본 발명의 폴리펩티드는 통상적으로 서열번호: 2의 아미노산 서열의 변이체를 포함하고, 이는 서열번호: 3의 위치 102에 해당하는 상기 변이체 서열의 위치에 시스테인 (C)을 갖고, 선택적으로 서열번호: 3의 위치 92, 272, 294 및 296에 해당하는 상기 변이체 서열의 위치에, 각각 리신 (K), 히스티딘 (H), 아스파르트산 (D) 및 아스파르트산 (D)을 갖는다.
상기 구조적 한계로부터 시작하여, 본 발명자는 IdeS의 3차원 모델을 평가함으로써 IdeS의 기능적 특성을 조정하는 변형에 대한 특정 위치를 확인하였다. 본 발명자는 하기를 확인하였다:
(1) 서열번호: 3의 위치 138에서 아스파라긴 (N)을 양으로 대전된 아미노산으로 치환하는 것은 상기 변화를 포함하는 폴리펩티드의 효력을 향상시킨다. 그러므로, 본 발명의 폴리펩티드는, 서열번호: 3의 위치 138에 해당하는 상기 변이체의 상기 위치에 양으로 대전된 아미노산을 갖는, 서열번호: 4 또는 5의 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 통상의 양으로 대전된 아미노산이 상기 표 A1에서 확인되었다. 상기 양으로 대전된 아미노산은 바람직하게 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)이다. 따라서, 상기 특정 변형이 본원에서 용어 "N138R/K"로 확인될 수 있다.
(2) 서열번호: 3의 위치 139에서 아스파라긴 (N)을 양으로 대전된 아미노산으로 치환하는 것은 상기 변화를 포함하는 폴리펩티드의 효력을 향상시킨다. 그러므로, 본 발명의 폴리펩티드는, 서열번호: 3의 위치 139에 해당하는 상기 변이체의 상기 위치에 양으로 대전된 아미노산을 갖는, 서열번호: 4 또는 5의 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 통상의 양으로 대전된 아미노산이 상기 표 A1에서 확인되었다. 상기 양으로 대전된 아미노산은 바람직하게 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)이다. 따라서, 상기 특정 변형이 본원에서 용어 "N139R/K"로 확인될 수 있다.
(3) 서열번호: 3의 N 말단에서 처음 20개의 잔기를 결실하는 것은 상기 변화를 포함하는 폴리펩티드의 효력을 향상시키고 및/또는 효력에 역효과 없이 면역원성을 감소시킬 수 있다. 서열번호: 3의 N 말단에서 처음 20개의 잔기는 연속된 서열 DDYQRNATEAYAKEVPHQIT로 구성된다. 그러므로, 본 발명의 폴리펩티드는, 연속된 서열 DDYQRNATEAYAKEVPHQIT을 포함하지 않는, 서열번호: 4 또는 5의 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 즉, 서열번호: 4 또는 5의 N 말단에서 처음 20개의 잔기가 서열번호: 4 또는 5의 상기 변이체로부터 부재할 수 있다. 서열번호: 4 및 5의 처음 20개의 잔기는 서열번호: 3의 위치 35-54에 해당한다. 따라서, 상기 특정 변형이 본원에서 용어 "D35_T54del"로 확인될 수 있다.
(4) 서열번호: 3의 위치 63-73에 해당하는 영역은 본 발명의 폴리펩티드의 IgG 시스테인 프로테아제 활성에 있어서 중요하다. 상기 영역에서 변형은 우선 제2 IgG 중쇄를 절단하는데 상기 폴리펩티드의 능력을 향상시키고, 이들은 제1 IgG 중쇄의 절단을 향상시킨다. 구체적으로, IdeS의 등가 영역에서 상응하는 잔기 (또는 상응하는 잔기와 유사한 특성을 갖는 아미노산)에 유리하게 상기 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시키는 것은 본 발명의 폴리펩티드의 효력을 증가시킨다. IdeS에서 등가 영역은 서열 번호 1의 위치 58-65에 해당한다. 하기 정렬은 서열 번호 1의 위치 58-65와 함께 서열 번호 3의 위치 63-73을 나타낸다.
63PLTPEQFRYNN73 (IdeZ의 영역, 서열번호: 3)
58P--PANFT-QG65 (IdeS의 영역, 서열번호: 1)
"-"는 잔기의 부재를 나타낸다.
그러므로, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호: 4 또는 5의 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있고, 변이체는 하기 변형의 적어도 하나를 가질 수 있다:
i. 서열번호: 3의 위치 64 및 65에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 루신 (L) 및 트레오닌 (T) 잔기의 결실;
ii. 서열번호: 3의 위치 70에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 아르기닌 (R) 대신에 트레오닌 (T);
iii. 서열번호: 3의 위치 71에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 티로신 (Y)의 결실;
iv. 서열번호: 3의 위치 72에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 아스파라긴 (N) 대신에 글루타민 (Q);
v. 서열번호: 3의 위치 73에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 아스파라긴 (N) 대신에 글리신 (G);
vi. 서열번호: 3의 위치 67에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 글루탐산 (E) 대신에 알라닌 (A);
vii. 서열번호: 3의 위치 68에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 글루타민 (Q) 대신에 아스파라긴 (N).
상기 선택사항 i. 내지 vii.로부터 적어도 하나의 변형이 통상적으로 상기 선택사항 i. 내지 v.로부터 선택된다. 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호: 4 또는 5의 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있고, 상기 변이체는 선택사항 i. 내지 v.의 변형들 중 적어도 2개, 3개, 4개, 또는 모두 5개의 변형을 갖는다. 바람직하게, 상기 변이체는 변형 ii. 내지 v. 중 적어도 1개, 2개, 3개 또는 모두 4개의 변형을 가지며, 선택적으로 변형 i.가 또한 존재한다. 특히 바람직하게 상기 변이체는 변형 i. 내지 v.의 모든 변형이 존재한다.
그러므로 요약하면, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호: 4 또는 5의 서열의 변이체를 포함하고, 상기 변이체는:
(a) 서열번호: 4 또는 5에 대해 적어도 50% 동일하고;
(b) 서열번호: 3의 위치 102에 해당하는, 상기 변이체 서열의 위치에 시스테인 (C)을 가지며; 또한 선택적으로
(c) 서열번호: 3의 위치 92, 272, 294 및 296에 해당하는, 상기 변이체 서열의 위치에, 각각 리신 (K), 히스티딘 (H), 아스파르트산 (D) 및 아스파르트산 (D)을 갖는다.
바람직하게, 서열번호: 4 또는 5의 상기 변이체는:
(1) 서열번호: 3의 위치 138에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 양으로 대전된 아미노산을 가지며, 선택적으로 상기 양으로 대전된 아미노산은 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)이고; 및/또는
(2) 서열번호: 3의 위치 139에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 양으로 대전된 아미노산을 가지며, 선택적으로 상기 양으로 대전된 아미노산은 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)이고; 및/또는
(3) 연속된 서열 DDYQRNATEA YAKEVPHQIT를 포함하지 않고; 및/또는
(4) 하기 변형들 중 적어도 하나를 갖는다:
i. 서열번호: 3의 위치 64 및 65에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 루신 (L) 및 트레오닌 (T) 잔기의 결실;
ii. 서열번호: 3의 위치 70에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 아르기닌 (R) 대신에 트레오닌 (T);
iii. 서열번호: 3의 위치 71에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 티로신 (Y)의 결실;
iv. 서열번호: 3의 위치 72에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 아스파라긴 (N) 대신에 글루타민 (Q);
v. 서열번호: 3의 위치 73에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 아스파라긴 (N) 대신에 글리신 (G);
vi. 서열번호: 3의 위치 67에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 글루탐산 (E) 대신에 알라닌 (A);
vii. 서열번호: 3의 위치 68에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 글루타민 (Q) 대신에 아스파라긴 (N).
상기 (4)의 적어도 하나의 변형이 통상적으로 상기 선택사항 i. 내지 v.로부터 선택되고, 바람직하게 상기 선택사항 ii. 내지 v.의 모두가 또한 선택적으로 선택사항 i.와 함께 존재한다.
본 발명의 폴리펩티드는 통상적으로 서열번호: 4 또는 5의 아미노산 서열의 변이체를 포함하고, 상기 변이체는 상기에 개시된 변형 (1) 내지 (4)의 적어도 1개, 2개, 3개, 또는 모두 4개의 변형을 포함한다. 상기 변이체는 상기 변형 (1) 내지 (4)의 2개 또는 3개의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 바람직한 변이체는 상기 변형 (3), 및 상기 변형 (1) 및 (2)의 적어도 하나를 포함한다. 대안으로서, 상기 변이체는 상기에 개시된 (1) 내지 (3)의 변형 어느 것도 포함하지 않을 수 있다.
전술한 변형의 임의의 조합에 대안 또는 부가로 적용될 수 있는 서열번호: 4 또는 5의 서열에 대한 다른 변형으로 본 발명의 폴리펩티드의 효력을 증가시킬 수 있고 및/또는 IdeS-특이적 ADA에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 인식을 감소시킬 수 있다는 것을 본 발명자들이 결정하였다. 그러므로, 전술한 변형에 대한 대안 또는 부가로, 본 발명의 폴리펩티드는 하기를 포함할 수 있다:
(A) 서열번호: 3의 위치 84, 93, 95, 97, 137, 140, 147, 150, 162, 165, 166, 171, 174, 205, 226, 237, 239, 243, 250, 251, 254, 255, 282, 288, 312, 315, 347, 349에 해당하는 위치들의 하나 이상에서 치환이 수행되고, 및/또는 서열번호: 3의 위치 36 내지 53에 해당하는 연속된 서열이 서열번호 2:의 위치 31 내지 48의 연속된 서열로 대체된, 서열번호: 4의 서열의 변이체 (상기 변화는 "D36_I53replacedS31_V48 of SEQ 2"로 나타낼 수 있음); 또는
(B) 위치 77, 93, 95, 99, 140, 141, 147, 150, 162, 171, 174, 175, 176, 177, 206, 224, 237, 241, 242, 245, 246, 249, 253, 267, 280, 286, 310, 311, 313, 344, 345, 346, 347에 해당하는 위치들의 하나 이상에서 치환이 수행되는, 서열번호: 5의 서열의 변이체.
상기 변이체 (A)는 상기 열거된 위치의 모두, 또는 상기 열거된 위치의 하나 이상의 임의의 조합에서 치환을 포함할 수 있지만, 그러나 통상적으로 상기 위치의 12, 11 또는 10 이하로 치환을 포함한다.
상기 변이체 (B)는 상기 열거된 위치의 모두, 또는 상기 열거된 위치의 하나 이상의 임의의 조합에서 치환을 포함할 수 있지만, 그러나 통상적으로 상기 위치의 30 이하로 치환을 포함한다.
상기 치환은 통상적으로 기존의 아미노산을 특성이 다른 또 다른 아미노산으로 대체시킨다. 예를 들면, 대전되지 않은 (uncharged) 아미노산이 대전된 아미노산으로 치환될 수 있고, 역도 가능하다. 상기 위치에서 바람직한 치환이 한문자 코드 (one letter code)를 사용하여 하기 표 B1 및 B2에서 개시하였다.
표 B1 -
변이체
A
표 B2 -
변이체
B
표 B1 및 B2에서 상기 각 치환은 각 행에 대해 좌측에서 우측으로 제1, 제2 및 제3 열로 전체를 조합함으로써 얻어진 용어를 사용하여 본원에서 지칭될 수 있다. 예를 들면, 상기 표 B1의 상기 제1 행에서 치환은 본원에서 "H84N"이라고 할 수 있고, 상기 제2 행에서 치환은 "A93T"라 할 수 있다. 상기 표 B1에서 특정 변형 "D226N" 및 상기 표 B2에서 "D224N"은, 서열번호: 3의 위치 224-226에서 연속된 RGD 서열인, IdeS 및 IdeS/Z의 서열에서 알려져 있는 세포 부착 모티프 (cell adhesion motif)를 방해하기 위한 것이다.
하기 표 C1 및 C2는 본 발명의 특정 예시되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 생성하도록 이루어진 변형을 요약하였다.
표 C1
표 C2
각 서열번호: 1 내지 5의 아미노산 서열이 하기에서 전체가 재현되고, 그 후 표 C1 및 C2에 개시된 본 발명의 각 예시되는 폴리펩티드의 아미노산 서열이 재현되었다.
본 발명의 폴리펩티드는 서열번호: 6 내지 25의 어느 하나의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 구성될 수 있다. 각 서열번호: 6 내지 25는 선택적으로 N 말단에서 추가의 메티오닌 및/또는 C 말단에서 히스티딘 태그를 포함할 수 있다. 상기 히스티딘 태그는 바람직하게 6개의 히스티딘 잔기로 구성된다. 상기 히스티딘 태그는 바람직하게 3x 글리신 또는 5x 글리신 잔기의 링커 (linker)에 의해서 C 말단에 연결된다.
폴리펩티드의 생성
본원에 개시된 폴리펩티드가 임의의 적당한 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드가 당분야에 알려져 있는 표준 기술, 가령 Fmoc 고상 화학 (solid phase chemistry), Boc 고상 화학, 또는 용액상 펩티드 합성 (solution phase peptide synthesis)을 사용하여 직접 합성될 수 있다. 대안으로서, 폴리펩티드가 세포, 통상적으로 박테리아 세포를 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자 또는 벡터에 의해 형질전환시킴으로써 생성될 수 있다. 박테리아 숙주 세포에서 발현에 의한 폴리펩티드의 생성이 하기에 개시되고, 또한 실시예에서 예시되었다. 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자 (nucleic acid molecules) 또는 벡터 (vectors)가 본 발명에서 제공된다. 본 발명은 또한 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포 (host cell)를 제공한다. 본원에 개시된 폴리펩티드를 인코딩하는 예시되는 폴리뉴클레오티드 분자가 서열번호: 33 내지 55으로 제공된다. 상기 각 서열은 3' 말단에 N 말단 메티오닌에 대한 코돈 (ATG)을 포함하고, 5' 말단에서 정지 코돈 (TAA) 이전에, 3x gly 링커 및 6x his 히스티딘 태그에 대한 코돈을 포함하고, 이는 선택적으로 배제될 수 있다.
용어 "핵산 분자 (nucleic acid molecule)" 및 "폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)"가 상호교환적으로 본원에서 사용되고, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태, 데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotides) 또는 리보뉴클레오티드 (ribonucleotides), 또는 그 유사체를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드의 비-제한된 예로는 유전자 (gene), 유전자 단편 (gene fragment), 메신저 RNA (messenger RNA: mRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드 (recombinant polynucleotides), 플라스미드 (plasmids), 벡터 (vectors), 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 (nucleic acid probes), 및 프라이머 (primers)를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 분리된 형태 또는 실질적으로 분리된 형태로 제공될 수 있다. 실질적으로 분리된 (substantially isolated)이라는 것은, 임의의 주변 배지로부터 폴리펩티드의, 전체는 아닌, 실질적 분리일 수 있다는 것을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드가 그 의도된 용도를 방해하지 않는 담체 (carriers) 또는 희석제 (diluents)와 혼합될 수 있고, 여전히 실질적으로 분리된 것으로 간주될 수 있다. 선택된 폴리펩티드를 "인코딩하는 (encodes)" 핵산 서열은 핵산 분자이고, 적절한 조절 서열의 조절 하에, 예를 들면 발현 벡터에 두었을 때, 인 비보에서 폴리펩티드로 전사 (DNA의 경우) 또는 번역 (mRNA의 경우)될 수 있다. 상기 코딩 서열 (coding sequence)의 경계가 5' (아미노) 말단에서 개시 코돈 및 3' (카르복시) 말단에서 번역 정지 코돈에 의해서 결정된다. 본 발명의 목적을 위해서, 상기 핵산 서열은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 바이러스, 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 바이러스 또는 원핵 DNA 또는 RNA로부터 게놈 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 전사 말단 서열이 상기 코딩 서열에 대해 3'에 위치할 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 당분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 합성될 수 있고, 이는 Sambrook et al (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)에서 예로서 개시되었다. 본 발명의 핵산 분자가 상기 삽입된 서열에 작동가능하게 연결된 대조 서열을 포함하는 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 제공될 수 있으므로, 본 발명의 폴리펩티드를 인 비보에서 발현시킨다. 상기 발현 카세트는 통상적으로 벡터 (예컨대, 플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터) 내에 제공된다. 상기 발현 카세트가 숙주 대상으로 직접 투여될 수 있다. 대안으로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 숙주 대상으로 투여될 수 있다. 바람직하게, 상기 폴리뉴클레오티드가 유전자 벡터를 사용하여 제조 및/또는 투여된다. 적당한 벡터는 충분한 양의 유전자 정보를 운반하고, 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 벡터일 수 있다.
그러므로, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 이러한 발현 벡터는 분자 생물학 분야에서 통상적으로 제조되고, 예를 들어, 본 발명의 펩티드를 발현시키기 위해서, 플라스미드 DNA 및 적절한 개시제, 프로모터, 인핸서 (enhancers) 및 다른 요소, 예를 들어, 필수적일 수 있고, 또한 정확한 방향으로 위치될 수 있는 폴리아데닐화 신호 (polyadenylation signals)를 포함할 수 있다. 다른 적당한 벡터가 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 수 있다. 이와 관련하여 부가의 예로서, Sambrook et al.을 참조한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 발현하도록 변형되어진 세포 (cells)를 포함한다. 이러한 세포는 통상적으로 원핵 세포, 가령 박테리아 세포, 예를 들면, 이. 콜리 (E. coli)를 포함한다. 이러한 세포가 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 통상의 방법을 사용하여 배양될 수 있다.
폴리펩티드가 그 제조, 분리 또는 정제를 돕도록 유도체화 (derivatised) 또는 변형될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드가 박테리아 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해서 생성되고, 상기 폴리펩티드의 서열은 발현을 향상시키기 위해서 N 말단에서 추가의 메티오닌 (M) 잔기를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 본 발명의 폴리펩티드가, 분리 수단에 직접 및 특이적으로 결합할 수 있는 리간드의 첨가에 의한 유도체화 또는 변형될 수 있다. 대안으로서, 상기 폴리펩티드가 결합 쌍 (binding pair)의 하나의 멤버의 첨가에 의해 유도체화 또는 변형될 수 있고, 상기 분리 수단은 결합 쌍의 다른 멤버의 첨가에 의해서 유도체화 또는 변형되는 시약 (reagent)을 포함한다. 임의의 적당한 결합 쌍이 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드가 결합 쌍의 하나의 멤버의 첨가에 의해 유도체화 또는 변형되는 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 바람직하게 히스티딘-태그되거나 또는 비오틴 (biotin)-태그된다. 통상적으로, 상기 히스티딘 또는 비오틴 태그의 아미노산 코딩 서열이 유전자 수준에서 포함되고, 상기 폴리펩티드가 이. 콜리에서 재조합으로 발현된다. 상기 히스티딘 또는 비오틴 태그는 통상적으로 상기 폴리펩티드의 각 단부, 바람직하게 C-말단에 존재한다. 상기 폴리펩티드에 직접적으로 결합될 수 있거나, 또는 임의의 적당한 링커 서열, 가령 3, 4 또는 5개의 글리신 잔기에 의해 간접적으로 결합될 수 있다. 상기 히스티딘 태그는 통상적으로 6개의 히스티딘 잔기로 구성되고, 이는 통상적으로 최대 7, 8, 9, 10 또는 20개의 아미노산으로, 상기보다 더 길 수 있거나, 또는 예를 들면 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산으로, 상기보다 더 짧을 수 있다.
폴리펩티드의 아미노산 서열이, 예를 들면 안정성을 증가시키기 위해, 비-천연 발생하는 (non-naturally occurring) 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있다. 상기 폴리펩티드가 합성 수단에 의해서 생성되는 경우, 이러한 아미노산이 생성 중에 도입될 수 있다. 상기 폴리펩티드가 또한 합성 또는 재조합 생성에 따라 변형될 수 있다. 폴리펩티드가 또한 D-아미노산을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 경우에, 상기 아미노산이 C에서 N 방향으로 역 서열로 연결될 것이다. 이는 이러한 폴리펩티드를 생성하는 당 분야에서 통상적이다.
다수의 곁사슬 변형이 당분야에 알려져 있으며, 상기 폴리펩티드가 본원에서 명시될 수 있는 임의의 부가의 요구되는 활성 또는 특성을 보유하도록, 상기 폴리펩티드의 곁사슬에 변형이 수행될 수 있다. 또한, 폴리펩티드가 화학적으로 변형, 예컨대, 후-번역으로 변형 (post-translationally modified) 될 수 있다. 예를 들면, 이들이 글리코실화 (glycosylated), 포스포릴화 (phosphorylated) 될 수 있거나, 또는 변형된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
상기 폴리펩티드가 페길화될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드가 실질적으로 분리된 형태로 존재할 수 있다. 이는 의도된 용도를 방해하지 않는 담체 또는 희석제 (하기에 토의됨)와 혼합될 수 있고, 실질적으로 분리된 것으로 간주될 수 있다. 또한, 실질적으로 정제된 형태일 수 있고, 이 경우에, 일반적으로 상기 제조에서 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 98% 또는 99%의 단백질을 포함할 것이다.
폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 제형
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드, 및 적어도 하나의 약학적 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 담체(들)는 상기 조성물의 다른 성분들과 상용성이 있지만, 상기 조성물이 투여되는 대상에게 유해하지 않다는 면에서 '허용가능 (acceptable)' 해야 한다. 통상적으로 담체 및 최종 조성물은 멸균 (sterile)되고, 발열성 인자 (pyrogen)를 포함하지 않는다.
적당한 조성물의 제형은 표준 약제학적 제형 화학 및 방법론을 사용하여 수행될 수 있으며, 이들 모두는 합리적으로 숙달된 기술자에게는 용이하게 입수가능한 것이다. 예를 들어, 상기 작용제는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 (excipient) 또는 비히클 (vehicle)과 조합될 수 있다. 습윤제 또는 에멀젼화제, pH 완충 물질, 환원제 등과 같은 보조 물질들이 상기 부형제 또는 비히클 중에 존재할 수도 있다. 적당한 환원제는 시스테인, 티오글리세롤, 티오레덕신 (thioreducin), 글루타티온 등을 포함한다. 부형제, 비히클 및 보조 물질들은 일반적으로 상기 조성물을 수용하는 개체 중에서 면역 반응을 유도하지 않고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 약학적 작용제이다. 약학적으로 허용가능한 부형제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 물, 식염수, 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산, 글리세롤, 티오글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 염, 예를 들어 히드로클로리드 (hydrochlorides), 히드로브로미드 (hydrobromide), 포스페이트, 술페이트 등과 같은 무기산 염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산의 염도 그 안에 포함될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제, 비히클 및 보조 물질에 대한 철저한 서술은 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)에서 입수가능하다.
그러한 조성물은 볼루스 투여(bolus administration) 또는 연속적 투여(continuous administration)에 적당한 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 주사가능한 조성물은 앰플 (ampoules) 또는 보존제를 함유하는 멀티-용량 수용기 중에 단위 투여량 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트, 및 이식가능한 지속형-방출 또는 생분해가능한 제형을 포함한다. 그러한 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 현탁화, 안정화 또는 분산 작용제를 포함하는 하나 이상의 부가적인 성분들을 더 포함할 수도 있다. 비경구 투여를 위한 조성물의 일 구현예에서, 상기 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 이전에 적당한 비히클 (예를 들어, 멸균성 무발열원 수)과 재구성 (reconstitution)을 위해서 건조 (예를 들어, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다. 상기 조성물은 멸균성 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 이러한 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라서 제형화될 수 있으며, 상기 활성 성분에 더해서, 본원에 개시된 분산제, 습윤제, 또는 현탁화제와 같은 부가적인 성분들을 포함할 수도 있다. 그러한 멸균성 주사가능한 제형은, 예를 들어 물 또는 1,3-부탄 디올과 같은 비독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 다른 허용가능한 희석제 및 용매는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 링거액 (Ringer's solution), 등장성 소듐 클로리드 용액, 및 합성 모노- 또는 디-글리세리드와 같은 고정유 (fixed oils)를 포함한다.
유용한 다른 비경구적으로 투여가능한 조성물은 상기 활성 성분을 미세결정 형태 (microcrystalline form), 리포좀 제재 (liposomal preparation), 또는 생분해가능한 폴리머 시스템의 일 성분으로서 포함하는 것들을 포함한다. 지속성 방출 또는 이식을 위한 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 조금 녹는 폴리머 (sparingly soluble polymer), 또는 조금 녹는 염과 같은 약제학적으로 허용가능한 폴리머 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다. 상기 조성물이, 예를 들어, 피부내 (intradermal), 피하 (subcutaneous), 경피 (percutaneous), 근육내 (intramuscular), 동맥내 (intra-arterial), 복강내 (intraperitoneal), 관절내 (intraarticular), 골내 (intraosseous) 또는 다른 적당한 투여 경로를 포함하는 임의의 적당한 경로에 의해서 투여하기에 적당할 수 있다. 바람직한 조성물은 정맥내 인퓨젼 (intravenous infusion)에 의한 투여에 적당하다.
폴리펩티드의 사용 방법
본 발명은 다양한 방법으로 본 발명의 폴리펩티드의 사용을 제공한다. 예를 들면, 본 폴리펩티드는 생물공학을 위한 유용한 툴 (tool)을 제공할 수 있다. 상기 폴리펩티드가 IgG, 특히 인간 IgG의 특정 엑스 비보 절단을 위해 사용될 수 있다. 상기 방법에서, 상기 폴리펩티드가 특정 시스테인 프로테아제 활성이 발생될 수 있는 조건 하에 IgG를 포함하는 시료와 인큐베이션될 수 있다. 특정 절단이 확인될 수 있고, 상기 절단 산물이 임의의 적당한 방법, 가령 WO2003051914 및 WO2009033670에 개시된 것을 사용하여 분리되었다. 그러므로, 상기 방법이 특히 Fc 및 F(ab')2 단편을 생성하는데 사용될 수 있다. Fab 단편이 그 후, 본 발명의 폴리펩티드에 의한 IgG의 절단으로부터 기인되는 F(ab')2 단편에서 환원 단계 (예를 들면, 2-메르캅토에탄올아민 또는 시스테아민)를 수행함으로써 생성될 수 있다.
상기 방법은 시료에서 IgG를 검출 또는 분석하거나, 또는 시료로부터 IgG를 제거하는데 사용될 수 있다. 시료 중 IgG의 검출을 위한 방법은 통상적으로, IgG-특이적 결합 및 절단을 허용하는 조건 하에, 상기 시료와 상기 폴리펩티드를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. IgG의 존재가 특정 IgG 절단 산물의 검출에 의해 확인될 수 있고, 이후에 분석될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드가 또한 치료 또는 예방에서 사용될 수 있다. 치료적 적용에서, 폴리펩티드 또는 조성물이, 이미 질병 또는 상태에 있는 대상에게, 상기 상태 또는 그 증상들 중 하나 이상을 치료, 완화, 또는 부분적으로 중지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이러한 치료적 치료 (therapeutic treatment)로 질병 증상의 중증도의 감소, 또는 무증상 주기의 빈도 또는 기간의 증가를 유도할 수 있다. 이를 달성하기에 적당한 양을 "치료적 유효량 (therapeutically effective amount)"으로 정의한다. 예방적 적용에서, 폴리펩티드 또는 조성물이, 질병 또는 상태의 증상을 아직 나타내지 않는 대상에게, 증상의 발생을 방지 또는 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효량 (prophylactically effective amount)"으로 정의한다. 상기 대상이 임의의 적당한 수단에 의해 질병 또는 상태를 발생시킬 위험이 있는지가 확인될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 인간 또는 동물의 치료에 사용하기 위해 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다. 또한 대상에서 질병 또는 상태의 예방 또는 치료의 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 상기 대상에게 본 발명의 폴리펩티드를 예방적 또는 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 폴리펩티드가 면역-억제제와 병용-투여될 수 있다. 상기 폴리펩티드가 바람직하게, 정맥내 인퓨젼에 의해 투여되지만, 그러나 예를 들면 피부내, 피하, 경피, 근육내, 동맥내, 복강내, 관절내, 골내 또는 다른 적당한 투여 경로를 포함하는 임의의 적당한 경로에 의해서 투여될 수 있다. 투여되는 상기 폴리펩티드의 양은 0.01mg/kg BW 내지 2mg/kg BW, 0.04 내지 2mg/kg BW, 0.12mg/kg BW 내지 2mg/kg BW, 바람직하게 0.24mg/kg 내지 2mg/kg BW, 가장 바람직하게 1mg/kg 내지 2mg/kg BW일 수 있다. 상기 폴리펩티드에 결합할 수 있는 상기 대상의 혈청에서 ADA의 양이 임상의에 의해 결정된 역치를 초과하지 않는 한, 상기 폴리펩티드가 상기 동일한 대상에게 다수의 사례로 투여될 수 있다. 상기 폴리펩티드에 결합할 수 있는 상기 대상의 혈청에서 ADA의 양이 임의의 적당한 방법, 가령 작용제 특이적 CAP FEIA (ImmunoCAP) 테스트 또는 적정 분석에 의해서 결정될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 특히 병원성 IgG 항체에 의해 매개된 질병 또는 상태의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 병원성 IgG 항체에 의해 매개된 질병 또는 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 병원성 IgG 항체에 의해 매개된 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 폴리펩티드의 반복적 투여를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 병원성 IgG 항체에 의해 매개된 질병 또는 상태, 특히 병원성 IgG 항체에 의해 전체 또는 일부 매개된 자가면역 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제 (medicament)의 제조에 사용하기 위해 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다.
상기 병원성 항체는 통상적으로 항체에 의해 전부 또는 일부 매개된 자가면역 질병 또는 다른 상태에서 표적이 되는 항원에 대해 특이적일 수 있다. 표 D는 이러한 질병 및 관련된 항원의 목록이 개시되었다. 본 발명의 폴리펩티드가 상기 질병 또는 상태의 어느 것을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 병원성 IgG 항체에 의해 전부 또는 일부 매개된 자기면역 질병의 치료 또는 예방에 특히 효과적이다.
표 D
다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드가 대상에 대한 치료법 또는 치료제의 혜택을 개선하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 2단계를 포함하고, 이는 본원에서 단계 (a) 및 (b)로 나타낸다.
단계 (a)는 본 발명의 폴리펩티드를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 투여되는 폴리펩티드의 양은 바람직하게 상기 대상의 혈장에 존재하는 실질적으로 모든 IgG 분자를 절단하기에 충분하다. 단계 (b)는 이어서 상기 대상에게 상기 치료법 또는 상기 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 단계 (a) 및 (b)가 바람직하게 상기 대상의 혈장에 존재하는 실질적으로 모든 IgG 분자의 절단이 수행되기에 충분한 시간 간격으로 분리된다. 상기 간격은 통상적으로 적어도 30분이고 최대한 21일일 수 있다.
상기 혜택이 개선된 치료제는 통상적으로 암 또는 다른 질병의 치료를 위해 투여되는 항체이다. 상기 치료제는 IVIg일 수 있다. 상기 구현예의 문맥에서, 본 발명이 대상에서 암 또는 다른 질병의 치료를 위한 방법을 제공하는 것이 대안으로 개시되었고, 상기 방법은 (a) 본 발명의 폴리펩티드를 상기 대상에게 투여하는 단계; 및 (b) 이어서 상기 암 또는 상기 다른 질병에 대한 치료인 항체의 치료적 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하고;
- 투여되는 상기 폴리펩티드의 양은 상기 대상의 혈장에 존재하는 실질적으로 모든 IgG 분자를 절단하기에 충분하고; 또한
- 단계 (a) 및 (b)는 적어도 2시간 및 최대한 21일의 시간 간격으로 분리된다.
즉, 본 발명은 암 또는 다른 질병의 치료를 위한 방법에 사용하기 위한 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해서 암 또는 다른 질병의 치료를 위한 약제의 제조에 상기 작용제의 사용을 제공한다. 상기 암은 급성 림프모구 백혈병 (Acute lymphoblastic leukemia), 급성 골수성 백혈병 (Acute myeloid leukemia), 부신피질 암종 (Adrenocortical carcinoma), AIDS-관련 암 (AIDS-related cancers), AIDS-관련 림프종 (AIDS-related lymphoma), 항문암 (Anal cancer), 맹장암 (Appendix cancer), 성상세포종 (Astrocytoma), 유년기 소뇌 또는 뇌 기저세포 암 (childhood cerebellar or cerebral, Basal cell carcinoma), 담도암 (Bile duct cancer), 간장외 방광암 (extrahepatic, Bladder cancer), 골 암 (Bone cancer), 골육종 (Osteosarcoma)/악성 섬유 조직구종 (Malignant fibrous histiocytoma), 뇌간 신경교종 (Brainstem glioma), 뇌 암 (Brain cancer), 뇌 종양 (Brain tumor), 소뇌 성상세포종 (cerebellar astrocytoma), 뇌 종양, 뇌 성상세포종 (cerebral astrocytoma)/악성 신경교종 (malignant glioma), 뇌 종양, 상의세포종 (ependymoma), 뇌 종양, 수모세포종 (medulloblastoma), 뇌 종양, 천막상 원시 신경외배엽 종양 (supratentorial primitive neuroectodermal tumors), 뇌 종양, 시각 경로 및 시상하부 신경교종 (visual pathway and hypothalamic glioma), 유방암 (Breast cancer), 기관지 선종 (Bronchial adenomas)/암양종 (carcinoids), 버킷 림프종 (Burkitt lymphoma), 암양종 종양 (Carcinoid tumor), 암양종 종양 (Carcinoid tumor), 원발병소 불명의 위장관 암종 (gastrointestinal, Carcinoma of unknown primary), 중추 신경계 림프종 (Central nervous system lymphoma), 소뇌 성상세포종 (Cerebellar astrocytoma), 뇌 성상세포종 (Cerebral astrocytoma)/악성 신경교종 (Malignant glioma), 자궁경부 암 (Cervical cancer), 만성 림프성 백혈병 (Chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수성 백혈병 (Chronic myelogenous leukemia), 만성 골수증식성 질환 (Chronic myeloproliferative disorders), 대장 암 (Colon Cancer), 피부 T-세포 림프종 (Cutaneous T-cell lymphoma), 결합조직성 소원형 세포 종양 (Desmoplastic small round cell tumor), 자궁내막 암 (Endometrial cancer), 상의세포종 (Ependymoma), 식도 암 (Esophageal cancer), 종양의 유잉 계열 중 유잉 육종 (Ewing's sarcoma in the Ewing family of tumors), 두개외 종자 세포 종양 (Extracranial germ cell tumor), 유년기 생식샘외 종자 세포 종양 (Childhood, Extragonadal Germ cell tumor), 간장외 담도 암 (Extrahepatic bile duct cancer), 안 암 (Eye Cancer), 안내 흑색종 (Intraocular melanoma), 안 암, 망막아세포종 (Retinoblastoma), 담낭 암 (Gallbladder cancer), 위 암 (Gastric (Stomach) cancer), 위장 암양종 종양 (Gastrointestinal Carcinoid Tumor), 위장 기질 종양 (Gastrointestinal stromal tumor (GIST)), 종자 세포 종양 (Germ cell tumor): 두개외, 생식샘외 또는 난소, 융모상피성 종양 (Gestational trophoblastic tumor), 뇌줄기의 신경교종 (Glioma of the brain stem), 신경교종, 유년기 뇌 성상세포종 (Childhood Cerebral Astrocytoma), 신경교종, 유년기 시각 경로 및 시상하부 (Childhood Visual Pathway and Hypothalamic), 위 암양종 (Gastric carcinoid), 털 세포 백혈병 (Hairy cell leukemia), 머리 및 목 암 (Head and neck cancer), 심장 암 (Heart cancer), 간세포(간) 암 (Hepatocellular (liver) cancer), 호지킨 림프종 (Hodgkin lymphoma), 하인두암 (Hypopharyngeal cancer), 시상하부 및 시각 경로 신경교종 (Hypothalamic and visual pathway glioma), 안내 흑색종 (Intraocular Melanoma), 도세포 암종 (내분비 췌장) (Islet Cell Carcinoma (Endocrine Pancreas)), 카포시 육종 (kaposi sarcoma), 신장 암 (신장세포 암) (Kidney cancer (renal cell cancer)), 후두 암 (Laryngeal Cancer), 백혈병류, 백혈병, 급성 림프모구 (acute lymphoblastic) (급성 림프성 백혈병으로도 불리움), 백혈병, 급성 골수성 (급성 골수성 백혈병으로도 불리움), 백혈병, 만성 림프구성 (만성 림프구성 백혈병으로도 불리움), 백혈병, 만성 골수성 (만성 골수성 백혈병으로도 불리움), 백혈병, 털 세포, 구순 및 구강 암, 지방육종 (Liposarcoma), 간 암 (일차), 폐 암, 비소세포 폐 암, 소세포, 림프종류, 림프종, AIDS-관련, 림프종, 버킷, 림프종, 피부 T-세포, 림프종, 호지킨, 림프종, 비-호지킨 (호지킨을 제외한 모든 림프종에 대한 구분류), 림프종, 일차 중추 신경계, 마크로글로불린혈증 (Macroglobulinemia), 발덴스트륌 (Waldenstrom), 골/골육종의 악성 섬유성 조직구증 (Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone/Osteosarcoma), 수모세포종 (Medulloblastoma), 흑색종 (Melanoma), 흑색종, 안내(눈), 메르켈 세포 암종 (Merkel Cell Carcinoma), 중피종 (Mesothelioma), 성인 악성, 중피종, 잠복 원발의 전이성 편평 목 암 (Metastatic Squamous Neck Cancer with Occult Primary), 구강암 (Mouth Cancer), 다발성 내분비 종양 증후군 (Multiple Endocrine Neoplasia Syndrome), 다발성 골수종/형질세포 종양 (Multiple Myeloma/Plasma Cell Neoplasm), 균상식 육종 (Mycosis Fungoides), 골수형성이상 증후군 (Myelodysplastic Syndromes), 골수형성/척수증식성 질병 (Myelodysplastic/Myeloproliferative Diseases), 골수성 백혈병 (Myelogenous Leukemia), 만성, 골수성 백혈병 (Myeloid Leukemia), 성인 급성, 골수성 백혈병, 유년기 급성, 골수종 (Myeloma), 다발성 (골수의 암), 척수증식성 질병, 비강 및 부비동 암 (Nasal cavity and paranasal sinus cancer), 비인두 암 (Nasopharyngeal carcinoma), 신경아세포종 (Neuroblastoma), 비호지킨 림프종, 비소세포 폐 암, 구강암 (Oral Cancer), 구인두 암 (Oropharyngeal cancer), 골의 골육종/악성 섬유성 (osteosarcoma/malignant fibrous histiocytoma of bone), 난소 암 (Ovarian cancer), 난소 상피 암 (Ovarian epithelial cancer (표면 상피-기질 종양)), 난소 생식 세포 종양 (Ovarian germ cell tumor), 난소 저악성능 종양 (Ovarian low malignant potential tumor), 췌장암 (Pancreatic cancer), 췌장암, 도세포 (islet cell), 코 곁굴 및 비강 암 (Paranasal sinus and nasal cavity cancer), 부갑상샘 암 (Parathyroid cancer), 음경 암 (Penile cancer), 인두 암 (Pharyngeal cancer), 갈색세포종 (Pheochromocytoma), 음경 성상세포종 (Pineal astrocytoma), 음경 배아세포종 (Pineal germinoma), 송과체모세포종 (Pineoblastoma) 및 천막상 원시 신경외배엽 종양 (supratentorial primitive neuroectodermal tumors), 뇌하수체 선종 (Pituitary adenoma), 혈장 세포 종양형성 (Plasma cell neoplasia)/다발성 골수종 (Multiple myeloma), 흉막과 폐의 모세포종 (Pleuropulmonary blastoma), 일차 중추 신경계 림프종 (Primary central nervous system lymphoma), 전립선 암 (Prostate cancer), 직장 암 (Rectal cancer), 신장 암 (Renal cell carcinoma (kidney cancer)), 신우 및 요관, 전이 세포 암 (Renal pelvis and ureter, transitional cell cancer), 망막아세포종 (Retinoblastoma), 횡문근육종 (Rhabdomyosarcoma), 침샘암 (Salivary gland cancer), 육종, 종양의 유잉 패밀리, 카포시 육종, 육종, 연조직, 육종, 자궁, 세자리 증후군 (Sezary syndrome), 피부 암 (Skin cancer (비흑색종), 피부 암 (흑색종), 피부 암종 (Skin carcinoma), 메르켈 세포, 소세포 폐 암, 소장 암, 연조직 육종, 편평 세포 암종 (Squamous cell carcinoma), 일차, 전이성 편평 목 암 (Squamous neck cancer with occult primary, metastatic), 위 암 (Stomach cancer), 천막상 원시 신경외배엽 종양 (Supratentorial primitive neuroectodermal tumor), 피부의 T-세포 림프종 - 균상 식육종 및 세자리 증후군 참조, 고환암 (Testicular cancer), 인후 암 (Throat cancer), 흉선종 (Thymoma), 흉선종 및 흉선 암종 (Thymoma and Thymic carcinoma), 갑상선 암 (Thyroid cancer), 갑상선 암, 신우 및 요관의 전이 세포 암 (Transitional cell cancer of the renal pelvis and ureter), 영양막 종양 (Trophoblastic tumor), 요관 및 신우, 전이 세포 암 (transitional cell cancer), 요도 암 (Urethral cancer), 자궁 암 (Uterine cancer), 자궁 내막, 자궁 육종 (endometrial, Uterine sarcoma), 질 암 (Vaginal cancer), 시각 경로 및 시상하부 신경교종 (Visual pathway and hypothalamic glioma), 외음부 암 (Vulvar cancer), 발덴스트륌 마크로글로불린 혈증 (Waldenstrom macroglobulinemia) 및 윌름즈 종양 (Wilms tumor) (신장 암)일 수 있다.
상기 암은 바람직하게는 전립선 암, 유방 암, 방광 암, 대장 암, 직장 암, 췌장 암, 난소 암, 폐 암, 자궁경부 암, 자궁내막 암, 신장 (신장 세포) 암, 식도 암, 갑상선 암, 피부 암, 림프종, 흑색종 또는 백혈병이다.
단계 (b) 단계에서 투여되는 상기 항체는 바람직하게 하나 이상의 상기 암 유형과 관련된 종양 항원에 대해서 특이적이다. 상기 방법에서 사용되기 위한 항체에 대한 관심 표적은, CD2, CD3, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD32, CD33, CD40, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD80, CD86, CD105, CD138, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, MUC16, GPNMB, PSMA, Cripto, ED-B, TMEFF2, EphA2, EphB2, FAP, av 인테그린 (av integrin), 메소텔린 (Mesothelin), EGFR, TAG-72, GD2, CA1X, 5T4, α4β7 인테그린, Her2를 포함한다. 다른 표적은 인터루킨 IL-1 내지 IL-13, 종양 괴사 인자 α & β, 인터페론 α, β 및 γ, 종양 성장 인자 베타 (TGF-β), 집락 자극 인자 (colony stimulating factor (CSF)) 및 과립구 단핵구 집락 자극 인자 (granulocyte monocyte colony stimulating factor (GMCSF))와 같은 시토킨류 (cytokines)이다. Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research (Aggrawal et al. eds., Blackwell Scientific, Boston, MA 1991) 참조. 다른 표적은 호르몬, 효소, 및 아데닐 시클라아제, 구아닐 시클라아제, 및 포스포리파아제 C와 같은 세포내 및 세포간 메신저이다. 관심이 되는 다른 표적은 CD20 및 CD33과 같은 백혈구 항원이다. 약물이 또한 관심이 되는 표적일 수도 있다. 표적 분자는 인간, 포유류 또는 박테리아의 것일 수 있다. 다른 표적은 바이러스성 및 박테리아성 미생물 병원체, 및 종양으로부터의 단백질, 당단백질 및 탄수화물과 같은 항원이다. 또 다른 표적은 미국특허 U.S. 4,366,241에 서술되어 있다.
상기 항체가 세포독성 모이어티 (cytotoxic moiety) 또는 검출가능한 표지 (detectable label)에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 상기 항체는 당업계에 공지된 하나 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해서 투여될 수 있다. 투여의 상기 경로 및/또는 모드는 원하는 결과에 따라서 달라질 것이다. 항체에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피부내, 복강내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 여기에서 사용된 "비경구 투여 (parenteral administration)"라는 문구는 장관 (enteral) 또는 국부 (topical) 투여 이외의 투여 모드를 의미하며, 보통 주사에 의한 것이다. 대안적으로, 항체는 비-비경구 경로, 예를 들어 국부, 상피 또는 점막 투여 경로를 통해서 투여될 수 있다. 국소 (local) 투여 역시 바람직하며, 이는 종양둘레 (peritumoral), 종양곁 (juxtatumoral), 종양내 (intratumoral), 병변내 (intralesional), 병변둘레 (perilesional), 공동내 주입 (intra cavity infusion), 소포내 투여 (intravesicle administration), 및 흡입 (inhalation)을 포함한다.
본 발명의 항체의 적당한 투여량 (dosage)은 숙달된 의료인에 의해서 결정될 수 있다. 항체의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 없이, 특정 환자, 조성물, 및 투여의 모드에 대한 바람직한 치료 반응을 달성하기에 유효한 활성 성분의 양을 달성할 수 있도록 변화될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 특정 항체의 활성, 투여의 경로, 투여 시간, 항체의 분비 속도, 치료의 지속시간, 사용된 특정 조성물과 조합되어 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적 건강 및 이전 의료 병력 등 의료계에 잘 알려진 인자들을 포함하는 다양한 약물동력학적 인자들에 의존할 것이다.
항체의 적당한 투여량은, 예를 들어, 치료되는 환자의 체중 kg 당 약 0.1㎍ 내지 약 100mg일 수 있다. 예를 들어, 적당한 투여량은 1일 당 체중 kg 당 약 1㎍ 내지 약 10mg이거나, 또는 1일 당 체중 kg 당 약 10㎍ 내지 약 5 mg일 수 있다.
투여량 요법은 최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료적 반응)을 제공하기 위해서 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 또는 상기 방법의 단계 (b)가 시간에 걸쳐서 투여된 몇몇 분할된 용량들을 포함하거나, 또는, 단계 (a) 및 (b) 사이에 요구되는 간격이 초과되지 않는 전제 하에서, 상기 용량이 치료적 상황의 긴급성에 의해서 지시되는 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 편이 및 투여량의 균일성을 위해서 투여량 단위 형태 (dosage unit form)로 제형화하는 것에 특히 장점이 있다. 본원에서 사용된 투여량 단위 형태는 치료될 대상을 위해서 단일 투여량 (unitary dosages)으로서 적합한 물리적으로 분별되는 단위를 의미하며; 각각 단위는 요구되는 약제학적 담체와 연관되어 원하는 치료적 효과를 야기하도록 계산된 활성 화합물의 미리 정해진 양을 포함한다.
단계 (b)에서 상기 항체는 화학치료법 또는 방사능 치료법과 조합되어 투여될 수 있다. 상기 방법은 부가적인 항암 항체 또는 다른 치료제의 투여를 더 포함할 수도 있으며, 이는 단계 (b)의 항체와 함께 조합된 치료법의 부분으로서 단일 조성물로 또는 분리된 조성물로 투여될 수 있다. 예를 들어, 단계 (b)의 상기 항체는 다른 작용제의 이전, 이후 또는 이와 동시에 투여될 수 있다.
상기 항체는 아바고보맙 (Abagovomab), 압식시맙 (Abciximab), 악토주맙 (Actoxumab), 아달리무맙 (Adalimumab), 아데카투무맙 (Adecatumumab), 아펠리모맙 (Afelimomab), 아푸투주맙 (Afutuzumab), 알라시주맙 페골 (Alacizumab pegol), ALD518, 알렘투주맙 (Alemtuzumab), 알리로쿠맙 (Alirocumab), 알투모맙 펜테테이트 (Altumomab pentetate), 아마툭시맙 (Amatuximab), 아나투모맙 마페나톡스 (Anatumomab mafenatox), 안루킨주맙 (Anrukinzumab), 아폴리주맙 (Apolizumab), 아크리투모맙 (Arcitumomab), 아젤리주맙 (Aselizumab), 아티누맙 (Atinumab), 아틀리주맙 (Atlizumab) (= 토실리주맙 (tocilizumab)), 아토롤리무맙 (Atorolimumab), 바피네우주맙 (Bapineuzumab), 바실리지맙 (Basiliximab), 바비툭시맙 (Bavituximab), 벡투모맙 (Bectumomab), 벨리무맙 (Belimumab), 벤랄리주맙 (Benralizumab), 베르틸리무맙 (Bertilimumab), 베실레소맙 (Besilesomab), 베바시주맙 (Bevacizumab), 베즐로톡수맙 (Bezlotoxumab), 비시로맙 (Biciromab), 비마그루맙 (Bimagrumab), 비바투주맙 메르탄신 (Bivatuzumab mertansine), 블리나투모맙 (Blinatumomab), 블로소주맙 (Blosozumab), 브렌툭시맙 베도틴 (Brentuximab vedotin), 브리아키누맙 (Briakinumab), 브로달루맙 (Brodalumab), 카나키누맙 (Canakinumab), 칸투주맙 메르탄신 (Cantuzumab mertansine), 칸투주맙 라브탄신 (Cantuzumab ravtansine), 카플라시주맙 (Caplacizumab), 카프로맙 펜데타이드 (Capromab pendetide), 카를루맙 (Carlumab), 카투막소맙 (Catumaxomab), CC49, 세델리주맙 (Cedelizumab), 세르토리주맙 페골 (Certolizumab pegol), 세툭시맙 (Cetuximab), Ch.14.18, 시타투주맙 보가톡스 (Citatuzumab bogatox), 시주투무맙 (Cixutumumab), 클라자키주맙 (Clazakizumab), 클레놀릭시맙 (Clenoliximab), 클리바투주맙 테트라제탄 (Clivatuzumab tetraxetan), 코나투무맙 (Conatumumab), 콘시주맙 (Concizumab), 크레네주맙 (Crenezumab), CR6261, 다세투주맙 (Dacetuzumab), 다클리주맙 (Daclizumab), 달로투주맙 (Dalotuzumab), 다라투무맙 (Daratumumab), 뎀시주맙 (Demcizumab), 데노수맙 (Denosumab), 데투모맙 (Detumomab), 도를리모맙 아리톡스 (Dorlimomab aritox), 드로지투맙 (Drozitumab), 둘리고투맙 (Duligotumab), 두필루맙 (Dupilumab), 두시기투맙 (Dusigitumab), 에크로멕시맙 (Ecromeximab), 에쿨리주맙 (Eculizumab), 에도바코맙 (Edobacomab), 에드레콜로맙 (Edrecolomab), 에팔리주맙 (Efalizumab), 에풍구맙 (Efungumab), 엘로투주맙 (Elotuzumab), 엘실리모맙 (Elsilimomab), 에나바투주맙 (Enavatuzumab), 엔리모맙 페골 (Enlimomab pegol), 에노키주맙 (Enokizumab), 에노티쿠맙 (Enoticumab), 엔시툭시맙 (Ensituximab), 에피투모맙 시투제탄 (Epitumomab cituxetan), 에프라투주맙 (Epratuzumab), 에를리주맙 (Erlizumab), 에르투막소맙 (Ertumaxomab), 에타라시주맙 (Etaracizumab), 에트롤리주맙 (Etrolizumab), 에볼로쿠맙 (Evolocumab), 엑스비비루맙 (Exbivirumab), 파놀레소맙 (Fanolesomab), 파랄리모맙 (Faralimomab), 파를레투주맙 (Farletuzumab), 파시누맙 (Fasinumab), FBTA05, 펠비주맙 (Felvizumab), 페자키누맙 (Fezakinumab), 피클라투주맙 (Ficlatuzumab), 피기투무맙 (Figitumumab), 플란보투맙 (Flanvotumab), 폰톨리주맙 (Fontolizumab), 포랄루맙 (Foralumab), 포라비루맙 (Foravirumab), 프레솔리무맙 (Fresolimumab), 풀라누맙 (Fulranumab), 푸툭시맙 (Futuximab), 갈릭시맙 (Galiximab), 가니투맙 (Ganitumab), 간테네루맙 (Gantenerumab), 가빌리모맙 (Gavilimomab), 겜투주맙 오조가미신 (Gemtuzumab ozogamicin), 게보키주맙 (Gevokizumab), 기렌툭시맙 (Girentuximab), 글렘바투무맙 베보틴 (Glembatumumab vedotin), 골리무맙 (Golimumab), 고밀릭시맙 (Gomiliximab), GS6624, 이발리주맙 (Ibalizumab), 이브리투모맙 티우제탄 (Ibritumomab tiuxetan), 이크루쿠맙 (Icrucumab), 이고보맙 (Igovomab), 임시로맙 (Imciromab), 임가투주맙 (Imgatuzumab), 인클라쿠맙 (Inclacumab), 인다툭시맙 라브탄신 (Indatuximab ravtansine), 인플릭시맙 (Infliximab), 인테투무맙 (Intetumumab), 이놀리모맙 (Inolimomab), 이노투주맙 오조가미신 (Inotuzumab ozogamicin), 이플리무맙 (Ipilimumab), 이라투무맙 (Iratumumab), 이톨리주맙 (Itolizumab), 이제키주맙 (Ixekizumab), 켈릭시맙 (Keliximab), 라베투주맙 (Labetuzumab), 람팔리주맙 (Lampalizumab), 레브리키주맙 (Lebrikizumab), 레말레소맙 (Lemalesomab), 레르델리무맙 (Lerdelimumab), 렉사투무맙 (Lexatumumab), 리비비루맙 (Libivirumab), 리겔리주맙 (Ligelizumab), 린투주맙 (Lintuzumab), 리릴루맙 (Lirilumab), 로델시주맙 (Lodelcizumab), 로르보투주맙 메르탄신 (Lorvotuzumab mertansine), 루카투무맙 (Lucatumumab), 루밀릭시맙 (Lumiliximab), 마파투무맙 (Mapatumumab), 마슬리모맙 (Maslimomab), 마브릴리무맙 (Mavrilimumab), 마투주맙 (Matuzumab), 메폴리주맙 (Mepolizumab), 메텔리무맙 (Metelimumab), 밀라투주맙 (Milatuzumab), 민레투모맙 (Minretumomab), 미투모맙 (Mitumomab), 모가물리주맙 (Mogamulizumab), 모롤리무맙 (Morolimumab), 모타비주맙 (Motavizumab), 목세투모맙 파수도톡스 (Moxetumomab pasudotox), 무로모납-CD3 (Muromonab-CD3), 나콜로맙 타페나톡스 (Nacolomab tafenatox), 나밀루맙 (Namilumab), 나프투모맙 에스타페나톡스 (Naptumomab estafenatox), 나르나투맙 (Narnatumab), 나탈리주맙 (Natalizumab), 네바쿠맙 (Nebacumab), 네시투무맙 (Necitumumab), 네렐리모맙 (Nerelimomab), 네스바쿠맙 (Nesvacumab), 니모투주맙 (Nimotuzumab), 니볼루맙 (Nivolumab), 노페투모맙 메메르펜탄 (Nofetumomab merpentan), 오비누투주맙 (Obinutuzumab), 오카라투주맙 (Ocaratuzumab), 오크렐리주맙 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(Tositumomab), 트랄로키누맙 (Tralokinumab), 트라스투주맙 (Trastuzumab), TRBS07, 트레갈리주맙 (Tregalizumab), 트레멜리무맙 (Tremelimumab), 투코투주맙 셀모루킨 (Tucotuzumab celmoleukin), 투비루맙 (Tuvirumab), 우블리툭시맙 (Ublituximab), 우렐루맙 (Urelumab), 우르톡사주맙 (Urtoxazumab), 우스테키누맙 (Ustekinumab), 바팔릭시맙 (Vapaliximab), 바텔리주맙 (Vatelizumab), 베돌리주맙 (Vedolizumab), 벨투주맙 (Veltuzumab), 베팔리모맙 (Vepalimomab), 베센쿠맙 (Vesencumab), 비실리주맙 (Visilizumab), 볼로시지맙 (Volociximab), 보르세투주맙 마포도틴 (Vorsetuzumab mafodotin), 보투무맙 (Votumumab), 잘루투무맙 (Zalutumumab), 자놀리무맙 (Zanolimumab), 자툭시맙 (Zatuximab), 지랄리무맙 (Ziralimumab) 또는 졸리모맙 아리톡스 (Zolimomab aritox)일 수 있다.
바람직한 항체는 나탈리주맙 (Natalizumab), 베돌리주맙 (Vedolizumab), 벨리무맙 (Belimumab), 아타시셉트 (Atacicept), 알레파셉트 (Alefacept), 오텔릭시주맙 (Otelixizumab), 테플리주맙 (Teplizumab), 리툭시맙 (Rituximab), 오파투무맙 (Ofatumumab), 오크렐리주맙 (Ocrelizumab), 에프라투주맙 (Epratuzumab), 알렘투주맙 (Alemtuzumab), 아바타셉트 (Abatacept), 에쿨리자맙 (Eculizamab), 오말리주맙 (Omalizumab), 카나키누맙 (Canakinumab), 메플리주맙 (Meplizumab), 레슬리주맙 (Reslizumab), 토실리주맙 (Tocilizumab), 우스테키누맙 (Ustekinumab), 브리아키누맙 (Briakinumab), 에타네르셉트 (Etanercept), 인플릭시맙 (Inlfliximab), 아달리무맙 (Adalimumab), 세르톨리주맙 페골 (Certolizumab pegol), 골리무맙 (Golimumab), 트라스투주맙 (Trastuzumab), 겜투주맙 (Gemtuzumab), 오조가미신 (Ozogamicin), 이브리투모맙 (Ibritumomab), 티우제탄 (Tiuxetan), 토시투모맙 (Tostitumomab), 세툭시맙 (Cetuximab), 베바시주맙 (Bevacizumab), 파니투무맙 (Panitumumab), 데노수맙 (Denosumab), 이플리무맙 (Ipilimumab), 브렌툭시맙 (Brentuximab) 및 베도틴 (Vedotin)을 포함한다.
상기 혜택이 개선되는 치료법은 통상적으로 장기 이식(organ transplant)이다. 상기 장기는 신장, 간, 심장, 췌장, 폐, 또는 소장으로부터 선택될 수 있다. 치료될 대상은 바람직하게는 민감화되거나 (sensitised) 또는 고도로 민감화될 (highly sensitized) 수 있다. "민감화된"이란, 대상이 인간 주 조직적합성 (human major histocompatibility, MHC) 항원(인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigens, HLA)으로도 불리움)에 대한 항체를 발생시킨 것을 의미한다. 항-HLA 항체는 이종적으로 민감화된(allogenically sensitized) B-세포로부터 유래되며, 일반적으로 혈액 수혈(blood transfusion), 이전의 이식 또는 임신에 의해서 민감화된 환자에서 존재한다 (Jordan et al., 2003).
잠재적인 이식 수용체가 민감화되었는지 여부는 임의의 적당한 방법에 의해서 결정될 수 있다. 예를 들어, 수용체가 민감화되었는지 결정하기 위해서 패널 반응성 항체 (Panel Reactive Antibody: PRA) 테스트가 사용될 수 있다. PRA 점수가 >30%인 경우, 통상적으로 환자가 "고 면역적 위험" 또는 "민감화"된 것을 의미하는 것으로 여겨진다. 대안으로서, 교차 부합 테스트 (cross match test)가 수행될 수 있으며, 여기에서는 잠재적인 이식 공여체의 혈액의 시료가 의도된 수용체의 시료와 혼합된다. 포지티브 교차-부합 테스트는 수용체가 공여체 시료와 반응하는 항체를 가지고 있으며, 상기 수용체가 민감화되었고, 이식이 발생되어서는 아니된다는 것을 의미한다. 교차 부합 테스트는 통상적으로 이식 직전에 최종 점검으로서 수행된다.
잠재적 공여체의 MHC 항원에 대한 높은 적정 항체(즉, 공여체 특이적 항체 (donor specific antibodies: DSA))의 존재는 이식에 대한 직접적인 금기사항인데, 이는 급성 항체-매개 거부의 위험성 때문이다. 요약하면, 공여체 MHC 항원에 대한 민감화는 적당한 공여체의 확인을 방해한다. 포지티브 교차-부합 테스트는 이식에 대한 명확한 장벽이다. 신장 이식을 대기 중인 환자들 중 대략 3 분의 1은 민감화되어 있고, 15%는 고도로 민감화되어 있기 때문에, 이는 이식을 대기 중인 환자들이 적체되는 것을 야기한다. 미국에서, 2001-2002년에 신장 이식을 위한 대기 리스트 상 중간 시간은, 패널 반응성 항체 (PRA) 점수 0-9%인 환자들의 경우 1329일이고, PRA 10-79%인 환자들의 경우 1920일이며, PRA 80% 이상인 환자들의 경우 3649일 이었다 (OPTN-database, 2011).
DSA 장벽을 극복하기 위한 하나의 허용된 전략은, DSA의 수준을 이식이 고려될 수 있는 수준까지 낮추기 위해서, 종종 예를 들어 정맥내 감마 글로불린 (IVIG) 또는 리툭시맙과 함께 조합하여, 혈장 교환 또는 면역 흡착을 적용하는 것이다 (Jordan et al., 2004; Montgomery et al., 2000; Vo et al., 2008a; Vo et al., 2008b). 그러나, 혈장 교환, 면역 흡착 및 IVIG 처리는 비효율적이고, 그들이 장시간에 걸쳐서 반복된 처리를 포함하기 때문에 엄격한 계획을 필요로 한다는 단점을 갖는다. 고인의 공여자로부터의 장기가 이용가능한 경우, 이는 수 시간 내에 이식되어야 하는 바, 장시간의 냉 허혈 시간 (cold ischemia time)은 신장 이식에 있어서 지연된 이식 기능 및 동종 이식 손실(allograft loss)에 대한 가장 중요한 위험 인자들 중 하나이기 때문이다 (Ojo et al., 1997).
이와는 대조적으로, 본 발명의 방법은 잠재적인 이식 수용체에서 DSAs를 신속하고, 일시적이며, 안전하게 제거하는 것을 가능케 한다. 이식 바로 직전에 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 것은 고도로 민감화된 환자를 효과적으로 탈민감화시키는 능력을 가짐으로써, 이식을 가능하게 하고, 급성 항체-매개 거부를 회피한다. 이식 이전에 폴리펩티드의 단일 용량 투여는 공여체 특이적 IgG 항체를 갖는 수 천명의 환자들의 이식을 가능하게 한다.
본 구현예 중에서, 상기 방법은 대안으로서 대상에서 장기 부전 (organ failure)을 치료하기 위한 방법으로서 서술되며, 상기 방법은 (a) 상기 대상에서 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 단계; 및 (b) 이어서 상기 대상에게 대체 장기를 이식하는 단계를 포함하고:
- 투여되는 상기 폴리펩티드의 양은 상기 대상의 상기 혈청 중에 존재하는 실질적으로 모든 IgG 분자를 절단하기에 충분하고;
- 단계 (a) 및 (b)는 적어도 2 시간 내지 최대한 21 일의 시간 간격에 의해서 분리된다.
즉, 본 구현예는 대상에서 이식된 장기의 거부(rejection), 특히 급성 항체-매개 이식 거부를 방지하기 위한 방법으로서 서술될 수 있으며, 상기 방법은, 상기 장기의 이식 이전 최소 2 시간 내지 최대 21 일에, 상기 대상에서 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하며, 투여되는 상기 폴리펩티드의 양은 상기 대상의 상기 혈청 중에 존재하는 실질적으로 모든 IgG 분자를 절단하기에 충분하다. 본 발명은 또한 장기 부전을 치료하거나 또는 이식 거부, 특히 급성 항체-매개 이식 거부를 방지하기 위한 그러한 방법에서 본 발명의 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해서 장기 부전을 치료 또는 이식 거부를 방지하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 이러한 구현예에서, 본 발명의 방법은 이식 시에 또는 그 직전에 수행되는 단계를 부가적으로 포함할 수도 있으며, 상기 단계는 상기 환자에서 T 세포 및/또는 B 세포의 유도 억제를 포함한다. 상기 유도 억제는 통상적으로 T 세포를 사멸 또는 억제하는 작용제의 유효량을 투여 및/또는 B 세포를 사멸 또는 억제하는 작용제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. T 세포를 사멸 또는 억제하는 작용제는 무로모납 (Muromonab), 바실릭시맙 (Basiliximab), 다클리주맙 (Daclizumab), 항흉선세포 글로불린 (antithymocyte globulin: ATG) 항체 및 림프구 면역 글로불린, 항흉선세포 글로불린 조제 (ATGAM)를 포함한다. 리툭시맙(Rituximab)은 B 세포를 사멸 또는 억제하는 것으로 알려져 있다.
실시예
달리 지시하지 않는 한, 사용된 방법은 표준 생화학 및 분자 생물학 기술이다. 적당한 방법 교재의 예는 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley and Sons, Inc.를 포함한다.
실시예
1 - 폴리펩티드 디자인, 제조 및 정제
성숙한 IdeS 분자가 분석되었고, 돌연변이에 적합한 영역이 확인되었다. 몇가지 사례에서, 인 실리코 (in silico) 평가가 돌연변이의 가능한 결과를 평가하기 위해서 사용되었다. 각 폴리펩티드의 서열이 결정되고, 각 폴리펩티드를 인코딩하는 cDNA가 GeneCust, Luxembourg에서, 도입된 돌연변이의 수에 따라서, 개시 서열의 부위-지정 돌연변이 또는 합성에 의해서 생성되었다. cDNA가 서열화되었고, 또한, 짧은 글리신 링커 (3x Gly)에 의해서 C-말단에 결합되는, C-말단 6x His-tag를 갖는 프레임내 pET9a 발현 벡터 (Novagene)로 전달되었다. N 말단 메티오닌이 박테리아 발현을 향상시키기 위해서 첨가되었다. 상기 플라스미드가 이. 콜리 BL21(DE3) (Stratagene)로 형질전환되었고(열-충격), 30 ㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 아가로스 플레이트 상에 시딩되었다. 단일 콜로니가 선택되었고, 밤새 배양 (3 ml의 LB-배지)이 37 ℃, 250 rpm으로 개시되었다. 다음날, 글리세롤 원료가 준비되었고, 30 ㎍/ml의 카나마이신 및 발포방지제 (anti-foam)가 보충된 10 ml의 TB-배지가 밤새 배양으로 접종되었고, OD 0.6-0.8 (37℃, 300 rpm)에 이를 때까지 성장시켰다. 이 때, IPTG (1 mM)가 첨가되었고, 배양이 원심분리에 의해 박테리아를 수확하기 전에 1시간 동안 지속되었다. 상기 펠렛이 PBS로 세척되었고, -20℃에서 동결되었다. 박테리아 용균을 위한 동결-해동 프로토콜이 사용되었고 (각 1 ml의 PBS에서 3번의 동결/해동 사이클), 상기 단백질이 Ni-NTA 프리-팩 스핀-컬럼 (pre-packed spin-columns) (Pierce)을 사용하여 정제되었다. 정제 후에, 상기 용출된 단백질이 10 mM의 DTT로 활성화시킨 후에, 완충액을 교환하였다 (MWCO 9K Millipore cfg devises에서 3부피의 PBS). 각 단백질의 순도 및 안정성이 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoreses: SDS-PAGE) 스테인레스 (stainless) 12% Mini-PROTEAN®TGXTM precast 겔 (Biorad) SDS-PAGE를 사용하여 평가되었다.
하기의 표는, N 말단 메티오닌 및 his 태그를 포함하지 않는, 성숙한 IdeZ 또는 IdeS/Z에 대한 각 시험된 폴리펩티드에 대해 이루어진 변화를 요약하였다. 그러므로, 본원에 개시된 실험에서 사용된 각 폴리펩티드의 서열은 통상적으로 표에 개시된 서열번호의 서열과, 추가의 N 말단 메티오닌 및 짧은 글리신 링커에 의해 C 말단에 결합된 his 태그를 포함한다.
대조군으로서, IdeS, IdeZ 및 IdeS/Z의 버전이 전술한 바와 동일한 방법을 사용하여 생성되었다. 상기 버전들은 본원에서 각각 pCART124, pCART144 및 pCART145로 나타낸다.
pCART124는 서열번호: 2와, 부가의 N 말단 메티오닌 및 짧은 글리신 링커에 의해 C 말단에 결합된 his 태그를 포함한다.
pCART124의 서열이 하기에 제공되었다.
pCART144는 서열번호: 4와, 부가의 N 말단 메티오닌 및 짧은 글리신 링커에 의해 C 말단에 결합된 his 태그를 포함한다.
pCART144의 서열이 하기에 제공되었다.
pCART145는 서열번호: 5와, 부가의 N 말단 메티오닌 및 짧은 글리신 링커에 의해 C 말단에 결합된 his 태그를 포함한다.
pCART145의 서열이 하기에 제공되었다.
태그가 없는 IdeS가, 부가의 대조군으로 사용하기 위해서, 자동 다단계 크로마토그래피 정제 (automated multistep chromatographic purification)를 사용하여 GMP 표준으로 독립적으로 생성되었다. 상기 폴리펩티드는 본원에서 BX1001865라고 한다.
각 시험된 폴리펩티드 및 pCART124, pCART144 및 pCART145를 제조하기 위해 사용된 cDNA 서열이 하기에 제공된다. 각 cDNA 서열은 3' 말단에 N 말단 메티오닌에 대한 코돈 (ATG)을 포함하고, 5' 말단에서 정지 코돈 (TAA) 전에, 글리신 링커와 히스티딘 태그에 대한 코돈을 포함한다.
실시예
2 - 효력의 평가 (
IgG
절단 효능)
ELISA
효소 활성이 ELISA-기반 효력 분석을 사용하여 측정되었다. 상기 ELISA의 원리는 다중 적정 플레이트의 웰을 항체 표적 (BSA)으로 코팅한 다음, 상기 웰 중 항-BSA 항체와 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드 (시험군 또는 대조군)의 다른 농도들과 인큐베이션하여, 그 후 검출 항체를 사용하여 상기 웰에 결합된 항-BSA 항체의 양을 검출하였다. 웰에서 주어진 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드의 농도가 더 높아지면, 더 적은 온전한 항-BSA 폴리펩티드가 상기 웰에 결합되어서, 더 적은 신호를 제공할 것이다. 유사하게, 더 강력한 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드는 덜 강력한 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드보다 동일한 농도로 존재하는 경우 더 적은 신호를 제공할 것이다.
참조 IdeS BX1001865가 320 nM에서 0.16 nM까지 1:2 희석 단계의 적정 시리즈로서 제조되어서, 상기 분석을 위한 표준 검정 곡선이 플로팅되었다. 각 시험된 폴리펩티드의 다수의 알려져 있는 농도에 대한 분석에서 수득된 결과가, 동일한 효력을 수득하는 참조 IdeS의 농도를 결정하기 위해서 상기 검정 곡선의 선형 부분에 대해서 비교되었다. 상기 곡선으로부터 참조 IdeS의 결정된 균등한 농도로 각 폴리펩티드의 알려진 농도를 나눔으로써, 참조 IdeS BX1001865에 대해 효력에서 배수 변화 (fold change)인 점수가 생성되었다. 예를 들면, 5nM의 시험 폴리펩티드가 검정 곡선에서 10 nM의 참조 IdeS와 균등한 결과를 수득한다면, 상기 시험 폴리펩티드는 참조 IdeS BX1001865보다 2배 더 큰 효력을 갖는다. 참조 IdeS BX1001865에 대해 효력에서 배수 변화에 대한 평균 점수가, 상기 검정 곡선의 선형 부분내에 위치한다면, 각 시험된 폴리펩티드에 대한 상이한 농도들에서 수득된 모든 점수로부터 산출되었다. 상기 평균 점수는 그 후 pCART124 참조 IdeS에 대해 수득된 평균 점수와 비교되었고, 이는 플레이트들 사이의 비교를 실시하기 위해 각 플레이트에 포함되었다. pCART124에 대한 평균 점수가 시험 폴리펩티드에 대한 평균 점수로 나눠져서 "pCART124 비율"을 생성하고, 이는 각 폴리펩티드에 대해 IdeS에 대한 효력의 효과적인 배수 변화이다. 상기 pCART124 비율은 그 후 막대 다이아그램 (bar diagram)으로 가시화될 수 있다.
상기 실험 프로토콜의 간단한 요약: 다-적정 플레이트의 웰이 BSA (10 ㎍/ml)로 밤새 코팅되었고, 그 후 PBS-T로 세척되었고, 1시간 동안 PBS 중 2% 피쉬 스킨 젤라틴 (fish skin gelatine)으로 차단시켰다. IdeS BX1001865 폴리펩티드가 320 nM에서 0.16 nM까지 0.1% 젤라틴을 갖는 PBS 중 1:2 희석 단계로 적정 시리즈로서 제조되었다. 상기 시험 폴리펩티드 및 pCART124 대조군이 그 후에 0.1%의 젤라틴을 갖는 PBS 중 각 15, 7.5, 3.75, 및 1.9 nM로 제조되었다. 폴리펩티드의 50 ㎕의 시료가 기질로서 50 ㎕의 토끼 항-BSA (ACRIS, #R1048P, 10 nM)를 갖는 각 웰로 첨가되었다. 상기 플레이트가 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었고, 그 후에 PBS-T로 세척되었다. 비오티닐화 (Biotinylated) 염소 항-토끼 Fc-특이적 항체 (30 000x 희석)가 검출 항체로서 첨가되었고, 30분 동안 인큐베이션되었다. 상기 플레이트가 세척되었고, 40 000x 희석된 SA-겨자무 (Horseradish) 퍼옥시다제 (Horseradish Peroxidase: HRP; Pierce)가 첨가되고, 30분 동안 인큐베이션되었다. 상기 플레이트가 세척되었고, HRP에 대한 발색 기질로서 TMB One Component를 사용하여 7분 동안 발색시켰고, 0.5M의 H2SO4로 정지시켰다. 흡광도 (Absorbance) (OD)가 λ = 450 nm에서 측정되었다. BX1001865에 대한 효능의 배수 변화에 대한 평균 점수가 각 시험 폴리펩티드 및 pCART124에 대해 결정되었다. 각 시험 폴리펩티드에 대한 상기 "pCART124 비율"이 그 후 전술한 바와 같이 산출되었다.
pCART191, 192, 193, 194, 197, 198, 200 및 201에 대한 "pCART124 비율"이, pCART124에 대한 결과와 함께, 도 1에 개시되었다. 본원에 개시된 본 발명의 모든 예시되는 폴리펩티드는 IdeS 대조군 (pCART124)에 대해 적어도 동등한 효력을 달성하였다. pCART194, 197, 200 및 201 모두는 훨씬 더 높은 효력을 수득하였고, 심지어 pCART197 및 pCART201에 있어서 대조군보다 8.0배 더 향상되었다.
흥미롭게도, pCART200 및 201 모두는 N 말단에 변형을 포함한다. 또한, pCART194 및 197 각각은 N138R/K 변형을 갖는다. 서열번호: 3의 위치 139에 해당하는 위치의 포지티브 아미노산으로의 변화는 N138R/K 치환에 대해 유사한 결과를 생성할 것으로 기대된다. 위치 138 및 139가 서열번호: 3의 위치 134 내지 144에 걸쳐있는 베타 헤어핀 구조의 루프에 위치한다. 본원에서 수득된 결과에 기반하여, 위치 138 및 139 중 어느 하나 또는 둘 다에서 포지티브 아미노산으로의 변화는 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 증가시킬 것으로 기대된다.
pCART202, 203 및 204에 대한 결과가 도 2에 개시되었다. 특히 pCART203은 IdeS보다 약 3.5배 더 효력을 갖는다. pCART202는 IdeS보다 1배 내지 1.5배 더 효력을 갖는다. pCART204는 pCART144에 상응하는 효력을 갖는다.
IgG
절단 패턴의 가시화
다른 pCART 폴리펩티드의 효능이 다른 기질에서 각 폴리펩티드의 적정 시리즈에 의해 생성된 절단 산물을 SDS-PAGE 상에서 가시화시킴으로써 더 평가되었다. 순수한 IgG 기질에서 효능을 테스트하기 위해서, 아달리무맙 (Humira)이 IgG1에 대해 사용되었고, 데노수맙 (XGEVA)이 IgG2에 대해 사용되었다. 더 복잡한 생리학적 환경에서 효능을 시험하기 위해서, 일부의 폴리펩티드가 또한 IVIg (Octagam)에서 적정되었다. 이는 폴리펩티드 활성에서 중화 항-IdeS 항체의 효과를 평가하였다. 각 폴리펩티드의 절단 패턴이 동일한 기질에서 IdeS (BX1001865 및 pCART124)의 절단 패턴과 비교되었다. 상기 프로토콜이 하기와 같다:
순수한 IgG 테스트에 있어서, 각 시험 폴리펩티드 또는 대조군이 유지 단백질 (supporting protein)로서 0.05%의 BSA를 갖는 PBS에서 6.7 ㎍/ml에서 0.04 ng/ml까지 1:3 단계 적정 시리즈로 희석되었다. 각 농도의 25㎕가 다중 적정 플레이트로 전달되었고, 절단 반응이 25 ㎕의 Humira 또는 XGEVA (2 mg/ml)를 첨가함으로써 개시되었다. 그러므로, 폴리펩티드의 각 개시농도가 상기 웰에서 1:2로 희석되어서, 3.3 ㎍/ml에서 0.02 ng/ml까지의 적정 시리즈를 제공한다.
IVIg 테스트에 있어서, 각 시험 폴리펩티드 또는 대조군이 유지 단백질로서 0.05%의 BSA를 갖는 PBS에서 30 ㎍/ml에서 0.015 ng/ml까지의 1:2 단계 적정 시리즈로 희석되었다. 각 농도의 25 ㎕가 다중 적정 플레이트로 전달되었고, 절단 반응이 10 mg/ml IVIg의 25 ㎕를 첨가함으로써 개시되었다. 그러므로, 폴리펩티드의 각 개시농도가 상기 웰에서 1:2로 희석되었고, 15 ㎍/ml에서 0.0075 ng/ml까지의 적정 시리즈를 제공하였다.
상기 플레이트가 1.5시간 동안 37 ℃로 인큐베이션되었다. 상기 시료가 2X SDS 로딩 완충액에서 1:4로 혼합되었고, 5분 동안 92 ℃로 가열되었다. 10 ㎕가 폴리아크릴아미드 겔 (15-웰 4-20% Mini-PROTEAN®TGXTM precast gel (Biorad)) 상에 로딩되었고, 이는 표준 프로토콜에 따라 판독되었다.
도 3은 IdeS 대조군 (pCART124 및 BX1001865) 및 IdeZ (pCART144)와 비교하여 pCART202, 203 및 204에 대한 IgG1 기질로 생성된 절단 패턴을 나타내었다. 효소 농도가 1:3 단계 희석 시리즈로 3.33 ㎍/ml (레인 1)에서 0.02 ng/ml (레인 12)까지였다. 온전한 아달리무맙 (효소 없음)이 레인 13에 개시되었다. 우측 화살표는 IgG로부터 다른 절단 산물을 나타낸다. 화살표 1: 온전한 IgG; 화살표 2: scIgG (단일 절단된 IgG - 제1 IgG 중쇄의 절단으로부터 기인함); 화살표 3: F(ab')2 단편 (제2 IgG 중쇄의 절단으로부터 기인함). 온전한 IgG가 scIgG가 되는 (레인 6과 7 사이), 제1 IgG 중쇄 절단 및 scIgG가 F(ab')2 단편이 되는 (레인 2와 3 사이), 제2 IgG 중쇄 절단에서 비교를 용이하게 하기 위해서 수직선이 부가되었다.
상기 효소 IdeZ (pCART144)는 두 제1 및 제2 IgG 중쇄의 더 낮은 절단 효능을 갖는다. IdeS (BX1001865 및 pCART124)는 두 중쇄의 절단에서 pCART144보다 약 3배 더 효과적이다 (즉, 일 적정 단계). IdeS (BX1001865 및 pCART124)에 대한 1.5 ng/ml (레인 8)의 절단은 4.6 ng/ml의 pCART144 (IdeZ) 절단과 동일하다 (레인 7). BX1001865 및 pCART124는 4.6 ng/ml의 강한 scIGg 밴드 (화살표 2)를 보였고 (레인 7), 반면에 pCART144는 상기 농도에서 약한 scIgG 밴드 (화살표 2)만을 갖는다 (레인 7).
중요하게, pCART202 및 pCART203은 IdeZ (pCART144)와 비교하여 IgG의 절단에서 증가된 효력을 보였으므로 (레인 7 및 레인 3), 더 강한 scIgG 밴드 (화살표 2) 및 더 강한 F(ab')2 밴드 (화살표 3)를 유도하였다. 효소 pCART204에 대한 증가된 효능은 보이지 않았다. 상기 제2 중쇄를 절단 시에 pCART202의 효능이 IdeS (BX1001865 및 pCART124)에 대해 거의 동일한 것으로 보였다 (레인 3과 비교). pCART202는, 상기 제1 IgG 중쇄 절단에 대해, IdeS보다 덜 효과적이지만, pCART144보다 더 효과적이다 (레인 7 비교). 효소 pCART203은 우선적으로 상기 제2 중쇄의 절단 시에 IdeS보다 더 높은 효능을 포함하므로, 0.37 ㎍/ml에서 BX1001865 및 pCART124 (화살표 3 및 2)와 비교하여, 더 강한 F(ab')2 밴드 (화살표 3) 및 더 약한 scIgG 밴드 (화살표 2)를 유도하였다.
그러므로, 전체적으로 도 3은, 두 pCART202 및 pCART203에서 보이는 하기 변형 R70T, Y71del, N72Q, N73G로 IdeZ 서열을 변형시키는 것은 pCART144 (IdeZ)와 비교하여 상기 제2 IgG 중쇄의 절단의 효능을 증가시키는 것을 보였다. 부가의 L64_T65del 변형의 도입으로 pCART203에서 볼 수 있는 바와 같이 상기 제1 중쇄의 절단의 효능을 증가시켰다.
도 4는 두 IdeS 대조군 (pCART124 및 BX1001865) 및 IdeZ (pCART144)와 비교하여, pCART202, 203 및 204에 대한 IVIg 기질로 생성된 절단 패턴을 나타내었다. 효소 농도는 1:2 단계 희석 시리즈로 30 ㎍/ml (레인 1)에서 0.015 ng/ml (레인 12)까지였다. 온전한 IVIg (효소 없음)가 레인 13에 개시되었지만, 상기 레인에는 pCART203의 이미지는 없었다. 우측 화살표는 IgG로부터 다른 절단 산물을 나타낸다. 화살표 1: 온전한 IgG; 화살표 2: scIgG (단일 절단된 IgG - 제1 IgG 중쇄의 절단으로부터 기인함); 화살표 3: F(ab')2 단편 (제2 IgG 중쇄의 절단으로부터 기인함). 온전한 IgG가 scIgG가 되는 (레인 6과 7 사이), 제1 IgG 중쇄 절단 및 scIgG가 F(ab')2 단편이 되는 (레인 2와 3 사이), 제2 IgG 중쇄 절단에서 비교를 용이하게 하기 위해서 수직선이 부가되었다.
효소 pCART144 (IdeZ)는 IdeS (BX1001865 및 pCART124)와 비교하여 제1 IgG 중쇄 (레인 6)에서 더 효과적인 절단을 나타내어, 더 강한 scIgG 밴드 (화살표 2) 및 온전한 IgG의 약한 밴드 (화살표 1)를 유도하였다. 상기는 IdeS의 그 인식과 비교하여 pCART144 (IdeZ)에 중화 항-IdeS 항체에 의한 더 낮은 결합 수준에 기인할 수 있다. pCART202, pCART203 및 pCART204에서 볼 수 있는 바와 같이, 제1 중쇄 절단에서 증가된 효능은 모든 IdeZ 유래 효소에 대해 사실이다 (레인 6). pCART202, pCART203 및 pCART204에 대한 0.94 ng/ml (레인 6)의 농도는 scIgG (화살표 2)의 강한 밴드를 생성하고, 이는 대부분의 IgG가 단일 절단된 반면, 동일한 농도의 IdeS는 50% 미만의 scIgG (레인 6)를 유도하였다.
그러나, pCART144 (IdeZ)는 IdeS (BX1001865 및 pCART124)와 비교하여 상기 제2 중쇄의 절단에서 더 좋지 않았다. 이는 상기 절단이 다음 적정 단계 (레인 4, 3.75 μg/ml)에서 이미 F(ab')2 밴드 (화살표 3)로 계속 이어지는 IdeS와 비교하여 레인 5 (1.9 ng/ml의 효소) 및 레인 4 및 3에서 더 강한 scIgG 밴드 (화살표 2)를 유도하였다. 특히, pCART203은 제2 절단 부위 (레인 2, 3 및 4)에서 IdeS (BX1001865 및 pCART124)에 상응하는 능력 및 제1 절단 부위에서 IdeS 및 IdeZ (pCART144)보다 더 높은 절단 효능 (레인 7)을 나타내었다.
효소 pCART203은 0.5 ng/ml (레인 7)에서 IgG 절단을 입증하였고, 약 0.9 ng/ml에서 주로 scIgG (화살표 2)를 생성하였다 (레인 6). 이는 IdeS에 비해 2배 증가된 효능에 해당하고, 0.9 ng/ml (레인 6)에서 절단을 시작하고, 1.9 ng/ml (레인 5)에서 지배적인 scIgG 밴드를 갖는다. 전체적으로 도 4는 변경 L64_T65del, R70T, Y71del, N72Q 및 N73G에 의한 IdeZ의 변경으로 중화 ADA의 존재하에 조차도 인간 IgG의 절단 효능을 증가시키는 것을 나타내었다. 이는 IdeS와 비교하여 pCART203에서 명확하게 볼 수 있다.
도 5는, 두 IdeS 대조군 (pCART124 및 BX1001865) 및 IdeZ (pCART144)와 비교하여, pCART205, 206, 207, 208 및 210에 대한 IgG1 기질에 의해 생성된 절단 패턴을 나타내었다. 효소 농도는 1:3 단계 희석 시리즈에서 3.33 ㎍/ml (레인 1)에서 0.02 ng/ml (레인 12)까지였다. 우측 화살표는 IgG로부터 다른 절단 산물을 나타내었다. 화살표 1: 온전한 IgG; 화살표 2: scIgG (단일 절단된 IgG - 제1 IgG 중쇄의 절단으로부터 기인됨); 화살표 3: F(ab')2 단편 (제2 IgG 중쇄의 절단으로부터 기인됨). 온전한 IgG가 scIgG가 되는 (레인 6과 7 사이), 제1 IgG 중쇄 절단 및 scIgG가 F(ab')2 단편이 되는 (레인 2와 3 사이), 제2 IgG 중쇄 절단에서 비교를 용이하게 하기 위해서 수직선이 부가되었다.
효소 pCART205는 두 IgG 중쇄 (레인 6 및 3)의 절단에서 pCART144 (IdeZ)와 비교하여 증가된 능력을 나타내며, pCART144 (IdeZ) (레인 6 및 3)와 비교하여, 더 강한 scIgG 밴드 (화살표 2, 레인 6) 및 온전한 IgG의 매우 약한 밴드 (화살표 1, 레인 6) 및 더 강한 F(ab')2 밴드 (화살표 3, 레인 3)를 유도하였다. 그러나, 상기 실험에서 중화 ADA의 부재하에 (도 4에 개시된 것과는 대조적으로), 순수 IgG1에 대한 IdeS (pCART124) 절단 활성이 pCART205보다 높았다.
폴리펩티드 pCART207 및 pCART210은 모두 IdeS (pCART124) 및 IdeZ (pCART144) (제1 절단의 경우 레인 7, 제2 절단의 경우 레인 3)와 비교하여 증가 된 IgG 절단 효능을 나타내었다. 가장 강력한 효소인 pCART207은 IdeS (pCART124)와 비교하여 두 IgG 중쇄의 절단에서 약 3배의 증가된 효능을 보였다. pCART124에 대한 scIgG (화살표 2)로의 완전한 변환이 14 ng/ml (레인 6)에서 수득되었고, 반면에 pCART207에 대해 단일 scIgG 밴드 (화살표 2)가 4.6 ng/ml (레인 7)에서 이미 볼 수 있었다. pCART124와 비교하여 pCART207에 대한 효능에서 더 큰 증가는 상기 제2 중쇄의 절단에서 나타났다. 더 강한 F(ab')2 밴드 (화살표 3)는 pCART124가 0.37 μg/ml (레인 3)에서 보이는 것에 대해, pCART207은 41 ng/ml (레인 4)에서 볼 수 있었다.
pCART207 및 pCART210은 IdeZ 서열과 관련하여 하기의 변형: L64_T65del, R70T, Y71del, N72Q, N73G, N138R을 공유한다. 그러므로, 전체적으로 도 5는 이러한 변화가 인간 IgG1의 절단 효능을 증가시킨다는 것을 보여주었다.
도 6은 두 IdeS 대조군 (pCART124 및 BX1001865) 및 IdeZ (pCART144)와 비교하여, pCART203, 205, 206, 207, 208 및 210에 대한 IgG2 기질로 생성된 분해 패턴을 나타낸다. 효소 농도는 1:3 단계 희석 시리즈에서 3.33 ㎍/ml (레인 1)에서 0.02 ng/ml (레인 12)까지였다. 우측 화살표는 IgG로부터 다른 절단 산물을 나타낸다. 화살표 1: 온전한 IgG; 화살표 2: scIgG (단일 절단된 IgG - 제1 IgG 중쇄의 절단으로부터 기인됨); 화살표 3: F(ab')2 단편 (제2 IgG 중쇄의 절단으로부터 기인됨). 온전한 IgG가 scIgG가 되는 (레인 6과 7 사이), 제1 IgG 중쇄 절단 및 scIgG가 F(ab')2 단편이 되는 (레인 2와 3 사이), 제2 IgG 중쇄 절단에서 비교를 용이하게 하기 위해서 수직선이 부가되었다.
효소 pCART203 및 pCART207은 pCART144 (IdeZ)와 비교하여 약 3배 증가된 절단 효능을 보였다. pCART144는, 41 ng/ml의 더 낮은 농도 (레인 5)에서 pCART203 및 pCART207에 대해 우세한 scIgG 밴드 (화살표 2)와 비교하여, 0.12 ㎍/ml의 농도에서 단일한 강한 scIgG 밴드 (화살표 2)를 보였다. pCART203 및 pCART207은 상기 제1 및 제2 IgG 중쇄 (레인 6 및 레인 2) 모두의 절단 효능에서 IdeS (BX1001865 및 pCART124)와 비교될 수 있다. 그러나, 상기 실험에서 중화 ADA가 없는 경우 (도 4에 개시된 것과는 대조적으로), IdeS (pCART124) 절단 활성은 순수한 IgG2의 두 중쇄에 대해 pCART206, pCART208 및 pCART210 각각보다 높았다. 이는 pCART206 및 pCART208에 대해 효소 3.3 ㎍/ml (레인 1)의 최고 농도에서도 존재하는 단일의 강한 scIgG 밴드 (화살표 2)에서 볼 수 있었다. IdeS/Z 하이브리드 (pCART145)에서 유래된 pCART205는 순수한 인간 IgG2의 절단에서 (제1 절단 부위에 대해 레인 5, 제2 절단 부위에 대해 레인 2) IdeZ (pCART144)와 거의 동일한 효능을 가지며, 0.12 ㎍/ml (레인 4)에서 단일 scIgG 밴드 (화살표 2) 및 최대 농도 3.3 ㎍/ml (레인 1)에서 우세한 F(ab')2 밴드를 유도하였다.
전반적으로, 도 6은 IdeZ의 최선의 변형, 즉 IgG2 절단에서 가장 높은 효능 증가를 초래하는 것이 pCART203 및 pCART207에서 발견된 것임을 보여주었다. 이들 효소는 변형 L64_T65del, R70T, Y71del, N72Q, N73G를, N138R 변형을 추가적으로 포함하는 pCART207와 공유한다.
도 7은 IdeS 대조군 (BX1001865)과 비교하여, pCART207, 208 및 210에 대해 IVIg 기질로 생성된 절단 패턴을 보여주었다. 효소 농도는 1:2 단계 희석 시리즈에서 30㎍/㎖ (레인 1)에서 0.015ng/㎖ (레인 12)까지였다. 온전한 IVIg (효소없이)가 레인 13에 개시되었다. 우측의 화살표는 IgG로부터의 상이한 절단 산물을 나타내었다. 화살표 1: 온전한 IgG; 화살표 2: scIgG (단일 절단된 IgG - 제1 IgG 중쇄의 절단으로부터 기인됨); 화살표 3: F(ab')2 단편 (제2 IgG 중쇄의 절단으로부터 기인됨). 온전한 IgG가 scIgG가 되는 (레인 6과 7 사이) 상기 제1 IgG 중쇄 절단과, scIgG가 F(ab')2 단편이 되는 (레인 2와 3 사이) 상기 제2 IgG 중쇄 절단의 비교를 용이하게하기 위해 수직선이 부가되었다.
pCART207, pCART208 및 pCART210은 모두 제1 IgG 중쇄 (레인 6)의 절단에서 IdeS (BX1001865)와 비교하여 증가된 효능을 나타내었다. IdeS (BX1001865)는 1.9 ng/ml의 농도에서 주로 scIgG (화살표 2)를 생성하였다 (레인 5). pCART207 및 pCART210 모두에 대해 0.9 ng/ml (레인 6)에서, pCART208에 대해 단지 0.5 ng/ml (레인 7)에서 유사한 결과가 수득되었다. pCART208의 경우, 이는 제1 중쇄의 절단 효능에서 대략 4배 증가하였다. 제2 중쇄의 절단에서 pCART208은 향상된 절단 효능을 보였고, 1.9 ng/ml (레인 5)에서 우세한 F(ab')2 밴드 (화살표 3)를 유도하는 반면, IdeS (BX1001865)는 동일한 농도에서 scIgG (화살표 2) 만을 생성하였다.
전반적으로, 도 7은 pCART207, pCART208 및 pCART210이, IdeS와 비교하여, 항-IdeS 중화 항체 (ADA)의 존재하에 인간 IgG의 절단 효능이 증가되었음을 보여주었다. 유사한 결과가 pCART206에 대해 수득되었다 (데이터가 개시되지 않음). pCART206, 207, 208 및 210은 모두 IdeZ 서열에 대해 하기의 변형: L64_T65del, R70T, Y71del, N72Q 및 N73G를 공유한다. 또한, pCART207, 208 및 210은 또한 N138R 변형을 공유한다. 그러므로, 도 7은 또한 이들 상이한 변형이 중화 ADA의 존재하에 인간 IgG의 절단 효능을 증가시킨다는 것을 확인하였다.
실시예
3 - 면역원성의 평가
경쟁적 항-
IdeS
항체 분석
본 분석은 항-IdeS 항체로의 결합에 대한 시험 폴리펩티드와 IdeS 사이의 경쟁에 기반한다. 시험 효소와 IVIg의 사전-인큐베이션은 상기 시험된 pCART 효소에 항-IdeS 항체가 결합하도록 할 것이다. 그 후, 상기 IVIg-효소-믹스가 IdeS-코팅된 플레이트로 첨가되고, 시험 폴리펩티드에 결합되지 않은 임의의 항-IdeS 항체는 대신에 상기 플레이트 상에 상기 IdeS에 결합할 것이다. 모든 결합 인큐베이션이 2 mM의 아이오도아세트산 (IHAc)의 존재하에 실시되어서 IgG 절단을 억제하고, 높은 염에서, 높은 친화도 결합이 발생되었다. 세척 후에, 비오티닐화 염소 항-인간 F(ab')2-특이적 F(ab')2 단편이 검출인자로 사용되었다. IVIg에서 항-IdeS 항체에 의한 시험 폴리펩티드의 불량한 인식은 상기 플레이트에 IVIg 중 항-IdeS 항체의 높은 결과를 유도하여, 높은 신호를 제공한다. IVIg에서 항-IdeS 항체에 의한 시험 폴리펩티드의 양호한 인식은 반대의 결과를 제공할 것이다. 상세한 프로토콜은 하기와 같다:
참조 IdeS (BX1001865)가 다중-적정 플레이트 상에 밤새 코팅되었고 (5 ㎍/ml), 그 후 PBS-T로 세척되었고, 2 mM IHAc 및 1 M NaCl이 보충된 PBS중 2% BSA로 1시간 동안 차단되었다. 상기 혼합 플레이트가 0.1% BSA, 2 mM IHAc 및 1 M NaCl로 보충된 PBS 중 20 ㎍/ml IVIg 및 시험 폴리펩티드의 단계적 희석물로 제조되었다. 상기 혼합 플레이트가 쉐이커 상에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 인큐베이션 후에, 상기 차단 용액이 IdeS-코팅된 플레이트로부터 폐기되었고, 상기 혼합 플레이트로부터 각 혼합물의 50 ㎕가 상기 코팅된 플레이트의 웰로 옮겼다. 쉐이커 상에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 후에, 상기 플레이트가 PBS-T 및 검출인자로 세척되었고, 비오티닐화 염소 항-인간 F(ab')2-특이적 F(ab')2 단편 (20 000x 희석)이 첨가되었다. 30분 동안 인큐베이션 후에, 상기 플레이트가 세척되었고, 40 000x 희석된 SA-HRP (Pierce)가 첨가되었고, 30분 동안 인큐베이션되었다. 상기 플레이트가 세척되었고, HRP에 대한 발색 기질로서 TMB One Component를 사용하여 7분 동안 발색시켰고, 0.5 M의 H2SO4로 정지되었다. 흡광도 (OD)가 λ = 450 nm에서 측정되었다. 상기 결과는 역의 값이고 (1/OD 값), 막대 다이아그램에서 가시화하기 위해서 pCART124과 비교된 비율로 (1/(시험 폴리펩티드/pCART124)) 나타내었다.
pCART191, 192, 193, 194, 197, 198, 200 및 201에 대한 결과가 도 8에 개시되었다. pCART202, 203 및 204에 대한 결과가 도 9에 개시되었다. 시험된 폴리펩티드 모두는 IdeS와 비교하여 항-IdeS 항체 인식에서 상당한 감소를 보였다. 최소한의 감소를 보이는 폴리펩티드 (pCART193)가 IdeS보다 대략 60% 더 낮은 수준에서 인식되었다. 남아있는 시험된 폴리펩티드는 IdeS보다 70% 또는 심지어 80% 더 낮았다.
항-
IdeS
적정 분석
본 분석은 IVIg 희석 적정을 비교하는 것에 기반한다. 상이한 시험 폴리펩티드 및 대조군 IdeS (BX10018865 및 pCART124)를 미세적정 플레이트 상에 코팅되었다. 시험 폴리펩티드 또는 대조군에 대한 항-IdeS 항체의 결합을 적정량의 IVIg (40에서 0.625 ㎍/ml까지의 1:2 단계 희석 시리즈, 즉 1:250에서 1:16000까지의 희석된 혈청에 해당하는 적정)를 상기 플레이트로 첨가함으로써 평가되었다. 희석 완충액은 높은 염 농도이므로 높은 친화도 결합만이 일어나고, IgG 절단을 억제하는 2mM IHAc를 포함하고, 높은 염에서 높은 친화도 결합 만이 일어난다. 컷오프 (cut off) OD 값은 각 실험에서 검정의 약 3배로 설정되었다. 시험된 각 폴리펩티드에 대한 문헌의 결과는 상기 컷오프보다 높은 최저 OD 값 (항-IdeS 항체의 최저 결합)을 나타내는 IVIg의 희석 적정이었다. 즉; 덜 희석된 IVIg는 항-IdeS 항체 (ADA)에 의한 인식이 낮은 폴리펩티드를 필요로 하며, ADA에 의해 고도로 인식되는 효소에 대해 더 희석된 IVIg를 필요로 한다. 간단히, 상기 프로토콜은 다음과 같다:
참조 IdeS 및 각 시험 효소가 다중 적정 플레이트 상에서 밤새 코팅되었고 (2 ㎍/ml), PBS-T로 세척되었고, 2 mM IHAc가 보충된 PBS 중의 2 % BSA로 1시간 동안 차단시켰다. 차단 용액을 버리고, IVIg (희석 완충액: PBS 1M NaCl + 0.1% BSA + 2mM IHAc)의 단계적 희석액의 50㎕가 첨가되었고, 쉐이커 상에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 상기 플레이트가 PBS-T로 세척되었고, 검출인자인, 비오티닐화 염소 항-인간 F(ab')2-특이적 F(ab')2 단편 (20,000x 희석)이 첨가되었고, 30분 동안 인큐베이션되었다. 상기 플레이트가 세척되었고, 40000배 희석된 SA-HRP (Pierce)가 첨가되었고, 30분 동안 인큐베이션되었다. 상기 플레이트가 세척되었고, HRP에 대한 발색 기질로서 TMB One Component를 사용하여 7분 동안 발색시켰고, 0.5 M H2SO4로 정지시켰다. 흡광도 (OD)는 λ = 450 nm에서 측정되었다.
pCART202, 203 및 204에 대한 결과가 도 10에 개시되었다. 모두 3개의 시험된 폴리펩티드는 항-IdeS 항체에 의한 인식을 위해 IdeS보다 낮은 3배 희석을 기록 하였다.
pCART205, 206, 207, 208 및 210의 결과가 도 11에 개시되었다. pCART206을 제외한 모든 것은 항-IdeS 항체에 의한 인식을 위해 IdeS보다 낮은 3배 희석을 기록했다. pCART206은 더 낮은 2배 희석을 기록했다. 전반적으로, 상기 시험된 폴리펩티드는 IdeS보다 분명하게 면역원성이 떨어진다.
요약
상기 시험된 폴리펩티드는 일반적으로 인간 IgG를 절단 시에 IdeZ보다 더 효과적이고 및/또는 인간 IgG를 절단 시에 적어도 IdeS 만큼 효과적이며, 또한 통상적으로 IdeS보다 면역원성이 떨어진다.
실시예
4 - 효력의 평가
효력 ELISA
인간 IgG1 및 IgG2의 절단 능력 (cleavage capacity)을 나타내기 위해서, 2개의 ELISA-기반된 효력 분석이 세팅되었다. 하나의 분석은 IgG1 절단을 측정하고, 다른 것은 IgG2 절단을 측정한다. EC50 (최대 효과적인 농도의 반) 값이 시험된 다른 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드에 대해 산출되었다. 상기 분석의 원리가 Fab 영역에 대해 특이성을 갖는 인간 IgG 항체에 대한 F(ab)2-단편으로 다중 적정 플레이트의 웰을 코팅시켰다. 그 후 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드 (시험군 또는 대조군)의 적정된 농도가 상기 웰에서 인간 IgG1 항체 (Humira) 또는 인간 IgG2 항체 (XGEVA)와 함께 인큐베이션되었다. 상기 웰에 결합된 온전하거나 또는 단일 절단된 인간 IgG (Humira 또는 XGEVA)의 양이 상기 항체의 Fc 부분에 대해 특이성을 갖는 인간 IgG에 대한 검출 항체를 사용하여 측정되었다. 웰에서 주어진 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드의 농도가 더 높아지면, 더 적은 온전한 인간 IgG 항체가 상기 웰에 결합되어서, 더 적은 신호를 제공할 것이다. 유사하게, 더 효능이 있는 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드는, 동일한 농도로 존재하는 더 적은 효능의 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드보다 더 적은 신호를 제공할 것이다. 적정 용량-반응 곡선 (Titration dose-response curves)이, IgG1 (humira) 및 IgG2 (XGEVA) 분석에서, IdeS 대조군 (pCART124) 및 모든 시험된 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드에 대해 제조되었다. EC50 값이 또한 각 시험된 변이체에 대해 산출되었고, 상기 IgG 분자의 제2 중쇄 절단에서 그 최대 효과의 50%가 관찰되는 폴리펩티드의 농도, 즉 IgG 분자의 반이 단일 절단되고, 또한 반이 완전히 절단되는 농도를 나타낸다. 더 적은 EC50 값은 더 효과적인 IgG 시스테인 프로테아제를 나타낸다. IgG에서 scIgG로, 처음 IgG 중쇄의 절단은 상기 분석에서 볼 수 없고, 이는 상기 IgG의 Fc-부분이 여전히 존재하고, Fc 특이적 검출 항체에 의해서 검출될 수 있다 (도 18).
상기 실험 프로토콜의 간단한 요약: 다중 적정 플레이트의 웰이 밤새 (+2-8 ℃) 염소-항-인간 Fab-특이적 F(ab)2-단편 (0.5 ㎍/ml) (Jackson #109-006-097)으로 코팅되었고, PBS+0.05% Tween 20 (PBS-T)으로 세척되었고, PBS-T (차단 완충액)에서 0.45% 피쉬 젤라틴에서 45-120분 동안 실온에서 차단되었다. 대조 IdeS (pCART124) 및 시험되는 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드가 개시 농도 80 ㎍/ml에 의한 차단 완충액에서 1:4의 희석 단계로 적정 시리즈로서 제조되었다. 0.5 ㎍/ml의 농도의 인간 IgG1 (Humira)의 동일한 부피 (25 ㎕) 및 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드의 적정된 양이 상기 웰로 첨가되었고, 37 ℃의 조절된 온도 환경에서 진탕하면서 2시간 동안 인큐베이션되었고, 그 후 PBS-T로 세척되었다. 비오티닐화 마우스 항-인간 IgG Fc-특이적 (m-a-hIgG Bio II, Lot: C0013-ZC43C, Southern Biotech) (600 ng/ml) 항체가 Strep-sulfo (200 ng/ml)와 혼합되었고, 다중 적정 플레이트로 첨가되었다. 상기 플레이트가 알루미늄 테이프로 밀봉되었고, 진탕하면서 1시간 동안 +25℃로 인큐베이션되었다. 상기 플레이트가 그 후 PBS-T로 세척되었고, 150 ㎕의 2x 희석된 Read 완충액 T (MSD read buffer T, Cat. no. R92TC-2)가 각 웰로 첨가되었다. 상기 플레이트가 즉시 Plate reader, MSD (Meso Scale Discovery) QuickPlex SQ 120 모델 1300에서 판독되었다.
겔에서 가시화된 효능 분석: IgG1 (Humira), IgG2 (XGEVA)의 절단 뿐만 아니라 인간 IgG, IVIg (Octagam)의 풀 (pool)의 절단에 대해 실시예 2에 개시된 바와 같이 분석이 수행되었다.
결과
효력 ELISA
효력 분석에서 시험된 IgG 시스테인 프로테아제에 대한 수득된 용량-반응 곡선이 도 12 (IgG1 절단) 및 도 13 (IgG2 절단)에 개시되었다. 본원에서 시험된 본 발명의 예시되는 폴리펩티드의 pCART207, 217, 219는, IdeS 대조군 pCART124 (표 1)와 비교하여, IgG1의 두 중쇄를 절단 시에 (도 12), 개선된 효력 (감소된 EC50 값)을 가지며, 이는 효력에서 배수 향상은 pCART129에 대해 1.4배, pCART217에 대해 3.2배 및 pCART207에 대해 4.0배 더 높았다. pCART226은, 0.6의 EC50에서 배수 차이를 갖는, IdeS (pCART124) 보다 다소 더 낮은 효력을 보였다 (표 1). IgG2의 절단에 있어서 (도 13), 상기 시험된 모든 폴리펩티드는 원 IdeS (pCART124)와 비교하여 더 낮은 효력을 보였고, 이는 상기 제2 IgG 중쇄의 절단에서, 더 높은 EC50 값 (표 1) 및 1 미만의 배수 차이를 갖는다. 그러나, 상기 시험된 모든 폴리펩티드는 pCART144 (서열번호: 27)보다 더 효력을 가지며 (데이터에 개시되지 않음), 이는 본 발명의 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드가 유래되는 서열이다.
겔에서
가시화된 효능 분석
겔에서 가시화된 IgG1 (도 14A) 및 IgG2 (도 14B)의 절단은 명백하게 제1 및 제2 중쇄 절단을 보였다 (도면에서 수직선은 BX1001865 및 pCART124 절단에 의한 제1 및 제2 IgG 중쇄 절단을 표시함). 도면에서 *는 대략 EC50 값을 나타내고, 즉, 상기 IgG의 50%가 단일 절단되고 (scIgG), 50%가 완전히 절단되는 (F(ab')2)농도를 나타낸다. 상기 겔로부터 데이터가 표 2 (IgG1 절단) 및 표 3 (IgG2 절단)에서 요약되었다. IgG1 (Humira)의 제1 중쇄의 절단은, IdeS (pCART124 및 BX1001865), pCART207 및 217에 대해 1.5 ng/ml로 거의 동일하지만, 그러나 우세한 scIgG 밴드를 수득하는데 다소 더 높은 농도가 필요하고, pCART219 및 226에 대해 약 4.6이다 (표 2). 그러나, IgG1의 제2 중쇄 절단에 있어서, pCART207, 217 및 219 모두는 IdeS (pCART124 및 BX1001864)보다 더 높은 효능이 입증되었고 (표 2), 절단에서 약 3x (일 적정 단계) 더 효과적이고, IdeS에 대해 약 370 ng/ml, pCART207, 217 및 219에 대해 약 120 ng/ml이었다. IgG2 (XGEVA)의 절단에서 (도 14B), 상기 제1 및 제2 중쇄의 절단에서 IdeS와 비교하여 (표 3), pCART207, 217, 219 모두는 더 낮은 효능의 일 적정 단계 (1:3)를 보였고, pCART226은 더 낮은 효능의 약 2번의 적정 단계 (1:6)을 갖는다. pCART229는 IgG1 (Humira)의 제1 (4.6 ng/ml) 및 제2 (370 ng/ml) IgG 중쇄의 절단에서 IdeS (BX1001865 및 pCART124)와 거의 동일한 효능을 보였고 (도 15A 및 표 4), 반면에 pCART229에 의한 IgG2 (XGEVA)의 절단은, 상기 제1 및 제2 IgG 중쇄의 절단에서 IdeS보다 약 일 적정 단계 (1:3)에서 덜 효과적이다 (도 15B 및 표 4).
상기 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드 pCART207, 217, 219 및 226은 또한, 대조군으로서 IdeS (BX1001865)로 인간 IgG 풀, IVIg (Octagam)에서 적정되었다 (도 16). 상기 모두는 IdeS와 비교하여, IVIg의 제1 IgG 중쇄의 절단에서 더 높은 효능을 보였다. scIgG를 생성하기 위해 IdeS (BX1001865)가 1.5 μg/ml를 필요로 하는 반면, pCART207, 217, 219 및 226 모두는 제1 절단을 달성하기 위해 0.75 μg/ml가 필요했다 (도 16 및 표 5). 제2 절단에서, pCART207 및 217은 주로 F(ab')2 단편을 생성하기 위해 3 μg/ml의 농도로 IdeS (BX1001865)보다 더 효율적이고, IdeS는 약 6 μg/ml가 필요하다 (도 16 및 표 5). pCART219 및 226 모두는 IgG 풀 IVIg의 제2 절단에서 IdeS와 비교하여 덜 효과적이다. pCART229에 의한 IVIg의 절단은 도 16의 시험된 폴리펩티드와 비교하여 30 μg/ml (도 17)로부터 1:2 희석액으로 더 넓은 적정 스펙트럼에서 분석되었다. 동일한 효능이, scIgG를 생성하기 위해 1.9 μg/ml 및 F(ab')2 단편을 수득하기 위해 7.5 μg/ml의 농도를 갖는 IdeS (BX1001865 및 pCART124) 및 pCART229 (도 17)에 대해 관찰되었다.
실시예
4에 대한 도면의 요약
도 12는 다른 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드에 의한 IgG1 (Humira)의 절단에 대한 적정 곡선을 나타낸다.
도 13은 다른 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드에 의한 IgG2 (XGEVA)의 절단에 대한 적정 곡선을 나타낸다.
도 14에서 IgG 절단은 동일한 절단 실험에서 대조군으로 BX1001865 및 pCART124 (원 IdeS)와, pCART207, 217, 219 및 226의 적정된 (3300 ng/ml로부터 1:3의 희석) 양을 사용하여 SDS-PAGE에 의해서 분석되었다. A: humira (IgG1)의 절단 및 B: XGEVA (IgG2)의 절단. 상기 제1 및 제2 IgG 중쇄 절단 (상기 절단된 산물의 양이 절단되지 않은 산물에 대해 우세한 경우)을 제공하기 위해 요구되는 IdeS (BX1001865 및 pCART124) 농도가 수직선으로 표시되었다. 도면에서 *는 상기 실험에서 대략 EC50을 나타낸다.
도 15에서 IgG 절단은 동일한 절단 실험에서 대조군으로 BX1001865 및 pCART124 (원 IdeS)와, pCART229의 적정된 (3300 ng/ml로부터 1:3의 희석) 양을 사용하여 SDS-PAGE에 의해서 분석되었다. A: humira (IgG1)의 절단 및 B: XGEVA (IgG2)의 절단. 상기 제1 및 제2 IgG 중쇄 절단 (상기 절단된 산물의 양이 상기 절단되지 않은 산물에 대해 우세한 경우)을 제공하기 위해 요구되는 IdeS (BX1001865 및 pCART124) 농도가 수직선으로 표시되었다.
도 16에서 IVIg 절단은 동일한 절단 실험에서 상기 시험된 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드 및 대조군으로 IdeS (BX1001865)의 적정된 (6 ㎍/ml로부터 1:2 희석) 양을 사용하여 SDS-PAGE에 의해서 분석되었다.
도 17에서 IVIg 절단은 동일한 절단 실험에서 대조군으로 BX1001865 및 pCART124 (원 IdeS)와 pCART229의 적정된 양 (30 ㎍/ml로부터 1:2 희석)을 사용하여 SDS-PAGE에 의해서 분석되었다.
도 18은 본 발명의 폴리펩티드에 의한 면역글로불린의 절단의 도이다. 상기 IgG의 효소적 절단이 2단계로 수행되었다. 첫번째, 온전한 IgG의 일 중쇄가 절단되고, 단일 절단된 IgG (scIgG)가 생성되었다. 두번째, 다음 중쇄가 절단되고, Fc-부분이 방출되었다. 상기 Fc-부분이 상기 scIgG 분자 중 Fab-부분에 부착되고, 상기 효력 ELISA 중 검출 항체가 IgG 분자의 Fc-부분을 인식하기 때문에, 상기 분석은 scIgG로부터 완전한 IgG를 구별하지 않을 것이다.
토의 및 결과
Humira 효력 ELISA에서 pCART207, 217 및 219에 대한 더 낮은 EC50 값은, pCART124 (원 IdeS)와 비교하여, IgG1의 제2 절단 (scIgG로부터 F(ab')2로)에서 개선된 효력을 입증하였다. IgG1의 절단에서 pCART226의 다소 더 적은 활성이 Humira 효력 ELISA 및 SDS-PAGE에 의해 분석된 Humira 효능 분석에서 개시되었다.
모든 시험된 폴리펩티드 pCART207, 217, 219 및 226은 IgG2의 두 IgG 중쇄의 절단에서 IdeS (pCART124)와 비교하여 더 낮은 효력을 갖는다는 것이 XGEVA 효력 ELISA에서 입증되었다. 그러나, 겔에서 절단을 가시화할 때, pCART207은, IdeS와 비교하여, 제1 IgG 중쇄 절단에서 IdeS (BX1001865 및 pCART124)와 거의 동일한 활성을 갖는 반면, 제2 절단에서 약 3배 더 적은 효과 (일 적정 단계)를 갖는 것이 분명하다. IgG1의 절단에서 높은 효능을 갖고, IdeS의 활성에 상응하지만, IgG2의 절단에 대한 효능이 보다 낮고, 주로 제2 IgG 중쇄를 절단하는, pCART229에 대해 동일한 패턴을 보였다. 겔에서의 IgG 절단을 분석하여 제1 중쇄의 절단 (IgG로부터 scIgG로의 절단)이 분명해지면, 상기 절단은 Fc-특이적 검출 항체를 사용하는 효력 ELISA에서 보이지 않았다. IgG의 대부분의 Fc-매개 작용은 단일 절단된 분자에서 이미 손실되었고 (데이터가 개시되지 않음), 이는 주요 초점이 병원성 IgG 분자를 무능력화 하는 임상적 상황에서 중심이다.
IVIg는 대략 65-70%의 IgG1, 35-30%의 IgG2 및 약 1%를 공유하는 IgG3/IgG4를 포함하는 인간 IgG의 풀이다. 인간 IVIg는 또한, 에스 . 피오게네스에 IgG 공여체의 조기 노출로부터, 항-IdeS 항체를 자연적으로 포함하고, 상기 항체의 일부가 중화될 것이고, 즉 IdeS에 대한 상기 IdeS 특이적 항체의 결합은 상기 IdeS IgG 프로테아제 활성을 감소시키거나 또는 완전히 파괴시킬 것이다. 다른 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드에 의한 IVIg 절단의 결과는 이로 인해 인간 혈청 뿐만 아니라 상기 중화 항-IdeS 항체의 존재에서, 그 정상 비율로 모두 4개의 인간 IgG 하위클래스의 전체 절단을 나타낸다.
일반적으로 시험된 모든 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드는 IgG1과 비교하여 IgG2 절단에서 더 낮은 효능을 갖는다. pCART207, 217 및 219는 IgG1 절단에서 IdeS보다 더 효과적이지만, IgG2의 제2 중쇄 절단에서 효과가 떨어진다. 도 16에서 pCART207, 217, 219 및 226의 최대 용량 (6 μg/ml) 및 도 17에서 pCART229에 대해 볼 수 있는 scIgG 밴드는 IgG 풀, IVIg에서 IgG2 분자를 나타내었다 (도 14A를 14B와 비교, 및 도 15A를 15B와 비교).
표 1. 효력 ELISA에 의해 측정된 EC50 (ng/ml) 및 원 IdeS (pCART124)와 비교된 효력의 배수 차이.
표 2. 겔에 개시된 IgG1 (Humira) 절단에 대한 데이터 (도 14A). 제1 및 제2 IgG 절단을 이루기 위해서 필요로 하는 폴리펩티드의 농도 (ng/ml), 여기서 상기 절단된 산물은 절단되지 않은 산물에 대해 양으로 나타냄. 대략 EC50 값 (도 14A에서 *).
표 3. 겔에 개시된 IgG2 (XGEVA) 절단에 대한 데이터 (도 14B). 제1 및 제2 IgG 절단을 이루기 위해서 필요로 하는 폴리펩티드의 농도 (ng/ml), 여기서 상기 절단된 산물은 절단되지 않은 산물에 대해 양으로 나타냄. 대략 EC50 값 (도 14B에서 *).
표 4. 겔에 개시된 pCART229에 의한 IgG1 (Humira) 절단 및 IgG2 (XGEVA) 절단에 대한 데이터 (도 15). 제1 및 제2 IgG 절단을 이루기 위해서 필요로 하는 폴리펩티드의 농도 (ng/ml) (여기서 상기 절단된 산물은 절단되지 않은 산물에 대해 양으로 나타냄).
표 5. 겔에 개시된 pCART207, 217, 219 및 226에 의한 IVIg 절단에 대한 데이터 (도 16). 제1 및 제2 IgG 절단을 이루기 위해서 필요로 하는 폴리펩티드의 농도 (ng/ml), 여기서 상기 절단된 산물은 절단되지 않은 산물에 대해 양으로 나타냄.
표 6. 겔에 개시된 pCART229에 의한 IVIg 절단에 대한 데이터 (도 17). 제1 및 제2 IgG 절단을 이루기 위해서 필요로 하는 폴리펩티드의 농도 (ng/ml), 여기서 상기 절단된 산물은 절단되지 않은 산물에 대해 양으로 나타냄.
실시예
5 - ADA ELISA, ADA-
IdeS
결합 부위에 대한 경쟁적 ELISA.
IdeS에 대한 항-약물 항체 (ADA) 결합 부위가 본 발명의 "ADA" 변형된 폴리펩티드 (pCART207, 217, 219 및 226)에 대해서, ELISA, MSD (Meso Scale Discovery)에 기반한 분석을 사용하여 측정되었다. 상기 ELISA의 원리는 다중 적정 플레이트의 웰을 원 his-태그된-IdeS (pCART124)로 코팅되었다. 대부분의 인간은 에스 . 피오게네스의 조기 감염에 의해 그 혈청 중에 IdeS에 대한 항체를 갖는다. 여기서, 2개의 다른 임상적 인간 혈청 풀이 ADA의 검출에 대한 표준으로 사용되었다. 제1 풀 (pool)은 100명의 개체의 혈청 풀로부터 정상의 인간 혈청으로, 인간 혈청 풀 (Human serum pool) 1191807로 불리고, 제2 풀은 임상 II 연구 13-HMedIdeS-02의 환자로부터 혈청의 풀로, 임상 II 풀-2 (Phase II pool-2)로 불린다. 상기 환자에게 0.24-0.5 mg/kg 체중의 용량-범위로 IdeS가 한번 투여됨으로써, 그 혈청에서 항-IdeS ADA의 유도된 수준 (대략 50배)을 갖는다.
상기 경쟁적 ADA ELISA의 개요는, IdeS (pCART124)가 미세 적정 플레이트의 바닥에서 코팅되었다는 것이다. 인간 혈청 풀이 ADA 인식 부위에 대해 시험되는 폴리펩티드와 함께, 또는 양성 대조군 IdeS (pCART124)와, 상기 시험된 폴리펩티드의 100x 과량의 1:100의 몰 비율 (molar ration)로 사전-인큐베이션되었다. 사전-인큐베이션을 위해 사용된 2개의 다른 혈청 풀의 농도가 표준 곡선으로부터 예측되어서, 원 IdeS에 대한 대략 80% 결합을 제공한다. 상기 ADA 결합 부위가 시험된 폴리펩티드에서 파괴되었다면, 상기 폴리펩티드는 웰의 바닥에서 원 IdeS에 ADA가 결합하는 것과 경쟁할 수 없었고, 즉, 낮은 신호는 원 IdeS (pCART124)에 대해 강한 ADA-유사성 (resemblance)을 나타내고, 높은 신호는 원 IdeS에 대해 약한 ADA-유사성을 나타낸다.
표준 곡선의 선형 구간에서 대략 80% 결합을 달성하는 두 표준의 농도는 약 200 ng ADA (IdeS)/ml이었다. 경쟁적 사전-인큐베이션에서, 두 표준의 이러한 농도가 개별적으로 사용되었고, 상기 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드의 농도가 ADA 농도의 100 배의 비율로 사용되었고, 150kDa의 항체와 대략 35 kDa의 IdeZ 사이의 몰 중량 차이, 4.2 배를 포함하고, 4.2로 100 배 200 ng/ml을 나눠서, 대략 5 ㎍/ml의 시험된 폴리펩티드를 제공한다. 200 ng/ml의 ADA 및 IdeS (pCART124) 또는 시험된 폴리펩티드를 함유하는 표준 혈청을 실온 (RT)에서 1 시간 동안 함께 사전-인큐베이션되었다. 최대 ADA 결합에 대한 대조군으로서, 표준의 동일한 농도를 IdeS (pCART124) 또는 임의의 다른 IgG 시스테인 프로테아제 없이 사전-인큐베이션되었고, 80 % 결합 최대 값으로 사용하였다. 표준 곡선의 최저 수준은 경쟁 계산 범위에 대한 하한값으로 사용되었다. IdeS (pCART124) 또는 시험된 폴리펩티드로 사전-인큐베이션된 표준에 대한 평균 점수를 80% 표준 결합 값에서 하한 값을 뺀 것으로 80 % 표준 결합 값을 나눠서 % 경쟁 값 (% competition value)을 제공한다. 최저 % 경쟁을 갖는 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드는, 대부분의 ADA 결합 에피토프가 원 IdeS (pCART124)와 비교하여 파괴되었다는 것을 의미한다.
상기 실험 프로토콜의 간단한 요약: 다중 적정 플레이트의 웰이 pCART124 (1 ㎍/ml)로 밤새 코팅되었고, PBS-T로 3번 세척되었고, PBS 중 0.45%의 피쉬 스킨 젤라틴 및 2 mM의 시스테인 프로테아제 억제제 아이오도아세트산 (IHAc)으로 차단되었다.
두 표준이 PBS에서 0.45% 피쉬 스킨 젤라틴 및 2 mM의 IHAc 중 1:3의 희석 단계로 적정 시리즈로, 5000 ng ADA (IdeS)/ml에서 2.5 ng ADA (IdeS)/ml까지 제조되어서, 상기 분석을 위한 표준 검정 곡선을 플로팅하고, 이는 선형 부분과 상기 표준 곡선의 최대 및 최소 부분에서 측정을 갖는다. 상기 플레이트의 차단과 동시에, 상기 표준 및 IdeS (pCART124) 또는 시험된 폴리펩티드가, 즉 경쟁 단계에서 시료가 200 ng/ml ADA (표준) 및 5 ㎍/ml IdeS 대조군 (pCART124) 또는 시험되는 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드를 사용하여, RT에서 1시간 동안 함께 사전-인큐베이션되었다. pCART124가 코팅된 플레이트가 3번 세척되었고, 그 후 50 ㎕의 사전-인큐베이션된 시료 또는 50 ㎕의 표준이 다중 적정 플레이트의 각 웰로 첨가되었다.
상기 플레이트가 2시간 동안 RT로 인큐베이션되었고, PBS-T로 세척되었다. 염소-항-인간 F(ab) 특이적 F(ab)2 단편-바이오 (Jackson #109-066-097, 0.65 mg/ml), (1000x 희석됨)가 검출 항체로서 첨가되었고, 차단 완충액 중 스트렙타비딘-술포 (Streptavidin-Sulfo) (MSD Cat. No: R32AD-1 또는 R32AD-5) (2000x 희석됨)가 어두운 곳에서 1시간 동안 RT에서 인큐베이션되었다. 상기 플레이트를 3번 세척하고, 4x 희석된 Read 완충액 T (MSD Read 완충액 T (4x))가 첨가되었고, 상기 플레이트가 Plate 판독기, MSD (Meso Scale Discovery) QuickPlex SQ 120 Model 1300에서 직접 분석되었다.
결과 및 토의
pCART207, 217, 219 및 226에 대한 IdeS-ADA 결합 부위의 차단율 (%) (Percentage (%) blocking)이 도 19 및 20에 개시되었고, 원 IdeS pCART124가 100% 유사도에 대한 포지티브 대조군으로 사용된다. 시험된 모든 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드, pCART207, 217, 219 및 226은 원 IdeS (pCART124)와 비교하여 인간 혈청에서 ADA 결합 부위를 더 적게 점유한다. 한 번 IdeS로 치료되어진 환자 (임상 II 풀-2)는 IdeS 특이적 ADA가 더 많이 생성되었고, 건강한 지원자의 혈청 풀 (인간 혈청 풀 1191807)과 비교하여 (도 19), pCART207, 217 및 219에서 최소로 인식되었다 (도 20).
실시예
6 -
옥타감
(인간
IVIg
) 마우스 모델에서
인 비보
효능의 평가
본 연구에서, BALB/c 마우스에게 인간 IVIg (Octagam)가 복강내 (i.p.)로 주사되었다. 인간 IVIg의 농도가, 인간 IgG 혈장 농도 (10 mg/ml)와 상관 관계가 있는, 900 mg/kg의 용량으로 투여되었다 (10 mg/ml). 인간 IVIg가 i.p.로 0일에 주사되었다. 인간 IVIg, PBS, IdeS 대조군 (BX1001865 및 pCART124) 또는 시험되는 IgG 프로테아제, pCART207, pCART217, pCART219 및 pCART226을 주사하고 24 시간 (1일) 후에, 1 mg/kg의 용량으로 정맥내 (i.v.)로 투여되었다. 2시간 후에 혈청 시료가 수집되었고, 마우스가 희생되었다.
효능 ELISA
상기 분석의 원리는 다중 적정 플레이트의 웰을 상기 Fab 영역에 특이성을 갖는 인간 IgG 항체에 관련된 F(ab')2-단편으로 코팅하는 것이다. 그 후 IVIg 및 IdeS 대조군 (BX1001865 및 pCART124) 또는 상기 시험된 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드로 처리된 마우스로부터의 혈청이 첨가되었다. 상기 웰에 결합된 온전하거나 또는 단일 절단된 인간 IgG (IVIg)의 양이 상기 항체의 Fc 부분에 대해 특이성을 갖는 인간 IgG (IVIg)에 대한 검출 항체를 사용하여 측정되었다. 온전한 인간 IgG 항체 (IVIg)의 검출된 농도가 더 적으면, 상기 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드가 더 효과적일 것으로 기대된다.
상기 실험 프로토콜의 간단한 요약: 다중 적정 플레이트의 웰이 염소-항-인간 Fab-특이적 F(ab)2-단편 (0.5 ㎍/ml) (Jackson #109-006-097)으로 밤새 (+2-8 ℃) 코팅되었고, 그 후 PBS+0.05% Tween 20 (PBS-T)으로 세척되었고, PBS-T 중 2% BSA (차단 완충액)으로 45-120분 동안 RT (실온)에서 차단되었다. 인간 혈청 단백질 칼리브레이터 (Human Serum Protein Calibrator) (DAKO #X0908)가 표준으로 사용되었고, 0.5-300 ng/ml의 범위로 첨가되었다. IVIg 및 상이한 IgG 시스테인 프로테아제 폴리펩티드로 처리된 마우스로부터 채취된 혈청 시료가 해동되었고, 분석 다중 적정 플레이트로 첨가되기 전에, 차단 완충액에서 100,000배로 희석되었다. 상기 플레이트가 RT에서 진탕하면서 2시간 동안 인큐베이션되었고, 그 후에 PBS-T로 세척되었다. 비오티닐화 마우스 항-인간 IgG Fc-특이적 (600 ng/ml) (Jackson #109-066-098) 항체가 스트렙-술포 (200 ng/ml) (MSD #R32AD-1)와 혼합되었고, 상기 다중 적정 플레이트로 첨가되었다. 상기 플레이트가 알루미늄 테이프로 밀봉되었고, 진탕하면서 RT에서 1시간동안 인큐베이션되었다. 상기 플레이트가 그 후 PBS-T로 세척되었고, 150 ㎕의 2x 희석된 판독 완충액 (Read buffer) T (MSD #R92TC-2)가 각 웰로 첨가되었다. 상기 플레이트가 플레이트 판독기, MSD (Meso Scale Discovery) QuickPlex SQ 120 Model 1300에서 즉시 분석되었다.
겔에서
가시화된 효능
마우스에서 인 비보에서 인간 IgG 절단을 가시화하기 위해서, 10 ㎕의 혈청이 90 ㎕의 PBS에서 1:10으로 희석되었다. 그 후에, 10 ㎕의 희석된 혈청이 30 ㎕의 4x SDS-PAGE 로딩 완충액과 혼합되었다. 5 ㎕의 IgG 인-하우스 마커 (in-house marker)가 상이한 IgG 단편 (IgG, scIgG 및 F(ab')2)을 보여주기 위해서 사용되었다. 시료가 92℃에서 3분 동안 가열되었고 (Thermo mixer compact, eppendorf), 4-20% Mini-Protean® TGX, Stain-freeTM 겔 (Cat. #456-8096, Biorad) 상에 10 ㎕를 로딩하기 전에 간단하게 원심분리시켰다. 겔이 40분 동안 200V에서 수행되었다.
결과 및 결론
IdeS (BX1001865 및 pCART124) 및 pCART207, 217, 219 및 226에 의한 인간 IVIg (Octagam)의 인 비보 절단이 효능 ELISA에 의한 혈청에서 인간 IgG의 수준을 연구하고, SDS-PAGE에 의한 IgG의 퇴화를 분석함으로써 비교되었다.
IVIg-마우스에서 IdeS (BX1001865 및 pCART124) 및 다른 IgG 시스테인 프로테아제 pCART207, pCART217, pCART219 및 pCART226에 의한 치료로 상기 마우스 모델에서 인 비보에서 인간 IgG의 절단에 있어서 명확한 효과를 보였다 (표 7 및 도 21).
완전 절단이 IdeS 대조군 (BX1001865), pCART207 및 pCART217에 대해 개시되었고, 상기 겔에서 scIgG 밴드는 보이지 않았고, 중요한 F(ab')2 밴드는 없었다 (도 22). pCART219 및 pCART226은 2시간 후에 상기 마우스 혈청에 존재하는 scIgG 분자를 갖는 상기 마우스 모델에서 더 낮은 효능을 보였다 (도 22C). 그러나, 겔에서 온전한 IVIg는 검출될 수 없었으며, 이는 도 21에서 pCART219 및 pCART226에 대한 검출 항체에 의한 IgG-Fc의 더 높은 농도가 (더 높은 막대) scIgG로부터 왔고, 온전한 IgG로부터 온 것은 아니라는 것을 의미한다. pCART207 그룹에서 마우스 번호: 2 및 pCART219 그룹에서 마우스 번호: 4는 IVIg 주사를 하지 않았고 (도 22B 및 C), 그러므로 IgG 절단 단편이 상기 동물로부터의 겔에서 보이지 않았다. 상기 단백질 밴드 패턴은 BALB/c 마우스 혈청에서 배경 단백질로 나타낼 것이다. 이는 본 발명의 폴리펩티드가 인 비보 모델에서 IgG를 절단하는 것을 보였다.
표 7. 효능 ELISA (평균 ± Stdev)에 의한 IdeS (BX1001865 및 pCART124)/상기 시험된 IgG 시스테인 프로테아제로 치료된 마우스로부터의 혈청 중 인간 IgG의 인 비보 절단의 분석.
SEQUENCE LISTING
<110> HANSA MEDICAL AB
<120> CYSTEINE PROTEASE
<130> N404881WO
<160> 55
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 339
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 1
Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val
1 5 10 15
Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe
20 25 30
Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val
35 40 45
Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln
50 55 60
Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala
85 90 95
Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp
100 105 110
Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn
115 120 125
Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys
130 135 140
Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala
145 150 155 160
Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly
180 185 190
Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe
195 200 205
Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg
210 215 220
His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys
225 230 235 240
Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala
245 250 255
Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp
260 265 270
Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn
275 280 285
Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly
290 295 300
Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala
305 310 315 320
Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn
325 330 335
Gln Thr Asn
<210> 2
<211> 310
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 2
Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro
1 5 10 15
Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn
20 25 30
Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln
35 40 45
Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu
50 55 60
Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln
65 70 75 80
Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln
85 90 95
Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile
100 105 110
Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys
115 120 125
Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro
130 135 140
Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr
145 150 155 160
Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly
165 170 175
Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu
180 185 190
Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp
195 200 205
Leu Ile Lys Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His
210 215 220
Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala
225 230 235 240
Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser
245 250 255
Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn
260 265 270
Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn
275 280 285
Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp
290 295 300
Ser Trp Asn Gln Thr Asn
305 310
<210> 3
<211> 349
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 3
Met Lys Thr Ile Ala Tyr Pro Asn Lys Pro His Ser Leu Ser Ala Gly
1 5 10 15
Leu Leu Thr Ala Ile Ala Ile Phe Ser Leu Ala Ser Ser Asn Ile Thr
20 25 30
Tyr Ala Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu
35 40 45
Val Pro His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu
50 55 60
Thr Pro Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro
65 70 75 80
Tyr Leu Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly
85 90 95
Lys Asp Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His
100 105 110
Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys
115 120 125
His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp
130 135 140
Leu Lys Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu
145 150 155 160
Phe Asn Tyr Phe Arg Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln
165 170 175
Leu Gly Val Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr
180 185 190
Tyr Leu Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr
195 200 205
Gln Asp Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg
210 215 220
Gly Asp Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys
225 230 235 240
Gly Leu Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly
245 250 255
Arg Ala Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His
260 265 270
Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu
275 280 285
Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys
290 295 300
Lys Tyr Phe Val Gly Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala
305 310 315 320
Lys Lys Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe
325 330 335
Thr Leu Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser
340 345
<210> 4
<211> 315
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 4
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro
20 25 30
Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu
35 40 45
Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp
50 55 60
Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp
65 70 75 80
Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro
85 90 95
Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys
100 105 110
Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn
115 120 125
Tyr Phe Arg Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly
130 135 140
Val Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu
145 150 155 160
Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp
165 170 175
Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp
180 185 190
Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala
210 215 220
Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile
225 230 235 240
Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile
245 250 255
Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr
260 265 270
Phe Val Gly Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys
275 280 285
Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu
290 295 300
Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser
305 310 315
<210> 5
<211> 313
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 5
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro
20 25 30
Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val
35 40 45
Ala Asn Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp
50 55 60
Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp
65 70 75 80
Phe Asp Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro
85 90 95
Glu Lys Gln Lys Ile Asn Phe Asn Gly Asp Asn Met Phe Asp Val Lys
100 105 110
Lys Ala Ile Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Asn
115 120 125
Tyr Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Gly Leu Ser Ala Arg Arg Ile Gly
130 135 140
Val Phe Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu
145 150 155 160
Ser Leu Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp
165 170 175
Pro Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser
180 185 190
Lys Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Asn Lys Asn Leu Asn Asp
195 200 205
Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly
210 215 220
Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Asn His Val Ile Asn Leu
225 230 235 240
Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val
245 250 255
Thr Asp Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val
260 265 270
Gly Val Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu
275 280 285
Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr
290 295 300
Gly Gln Asp Ser Trp Gln Lys Leu Ser
305 310
<210> 6
<211> 315
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 6
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro
20 25 30
Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu
35 40 45
Ala Asn Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp
50 55 60
Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp
65 70 75 80
Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro
85 90 95
Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Arg Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys
100 105 110
Glu Ala Ile Arg Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Glu
115 120 125
Tyr Phe Arg Asp Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly
130 135 140
Val Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu
145 150 155 160
Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Lys Arg Pro Tyr Gln Asp
165 170 175
Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn
180 185 190
Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Glu Glu Leu Thr Lys Gly Arg Ala
210 215 220
Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile
225 230 235 240
Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile
245 250 255
Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr
260 265 270
Phe Val Gly Ile Asn Lys His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys
275 280 285
Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu
290 295 300
Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Asn
305 310 315
<210> 7
<211> 315
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 7
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro
20 25 30
Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu
35 40 45
Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp
50 55 60
Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp
65 70 75 80
Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro
85 90 95
Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Glu Glu Leu Phe Asp Leu Lys
100 105 110
Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn
115 120 125
Tyr Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Thr Arg Gln Leu Gly
130 135 140
Val Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu
145 150 155 160
Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp
165 170 175
Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn
180 185 190
Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Gly Leu
195 200 205
Lys Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala
210 215 220
Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile
225 230 235 240
Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp Ala Glu Gly Asn Leu Lys Ala Ile
245 250 255
Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr
260 265 270
Phe Val Gly Ile Asn Ala His Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys
275 280 285
Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu
290 295 300
Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Gln Leu Ser
305 310 315
<210> 8
<211> 315
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 8
Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro
1 5 10 15
Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro
20 25 30
Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu
35 40 45
Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp
50 55 60
Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp
65 70 75 80
Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro
85 90 95
Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys
100 105 110
Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn
115 120 125
Tyr Phe Arg Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly
130 135 140
Val Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu
145 150 155 160
Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp
165 170 175
Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp
180 185 190
Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala
210 215 220
Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile
225 230 235 240
Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile
245 250 255
Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr
260 265 270
Phe Val Gly Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys
275 280 285
Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu
290 295 300
Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser
305 310 315
<210> 9
<211> 295
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 9
Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro Glu Gln Phe Arg
1 5 10 15
Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln Gly
20 25 30
Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu Cys
35 40 45
Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn
50 55 60
Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln Lys
65 70 75 80
Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile Asp
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Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg Asp
100 105 110
Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro Asp
115 120 125
Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe Lys
130 135 140
Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys Arg
145 150 155 160
Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Thr Thr Leu
165 170 175
Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile Ser
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu Ser
195 200 205
His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp Gly
210 215 220
Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr Asp
225 230 235 240
Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Ile
245 250 255
Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly Glu
260 265 270
Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly Lys
275 280 285
Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser
290 295
<210> 10
<211> 314
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 10
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro
20 25 30
Glu Gln Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala
35 40 45
His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn
50 55 60
Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe
65 70 75 80
Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu
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Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala
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Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn
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195 200 205
Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu
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Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn
225 230 235 240
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245 250 255
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Val Gly Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile
275 280 285
Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser
290 295 300
Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser
305 310
<210> 11
<211> 312
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 11
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln
20 25 30
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Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg
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Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro
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Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe
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Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile
195 200 205
Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu
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Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp
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Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly
290 295 300
Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser
305 310
<210> 12
<211> 313
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 12
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala
100 105 110
Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe
115 120 125
Arg Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met
130 135 140
Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val
145 150 155 160
Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp
165 170 175
Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Thr
180 185 190
Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp
195 200 205
Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala
210 215 220
Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu
225 230 235 240
Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val
245 250 255
Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val
260 265 270
Gly Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu
275 280 285
Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser
290 295 300
Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser
305 310
<210> 13
<211> 312
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 13
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln
20 25 30
Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln
35 40 45
Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu
50 55 60
Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln
65 70 75 80
Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln
85 90 95
Lys Ile Ile Ile Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile
100 105 110
Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg
115 120 125
Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro
130 135 140
Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe
145 150 155 160
Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys
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Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Thr Thr
180 185 190
Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile
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Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp
225 230 235 240
Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr
245 250 255
Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly
260 265 270
Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly
275 280 285
Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly
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Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser
305 310
<210> 14
<211> 312
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 14
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln
20 25 30
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65 70 75 80
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Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr
245 250 255
Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly
260 265 270
Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly
275 280 285
Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly
290 295 300
Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser
305 310
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<211> 312
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 15
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Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr
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305 310
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<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 16
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
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<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 17
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<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 18
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305 310
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<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 19
Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln Phe Thr Gln Gly
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Gln Lys Leu Ser
290
<210> 20
<211> 312
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 20
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln
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Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr
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Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly
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Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser
305 310
<210> 21
<211> 312
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 21
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
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His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro
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Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Ala Lys His Leu Gly Val
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Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Asn Lys Asn Leu Asn Asp Ile
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Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly Leu
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Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp
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Gln Asp Ser Trp Gln Lys Leu Ser
305 310
<210> 22
<211> 312
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 22
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro
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Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys
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Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Asn Lys Asn Leu Asn Asp Ile
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275 280 285
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Gln Asp Ser Trp Gln Lys Leu Asn
305 310
<210> 23
<211> 312
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 23
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro
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Glu Gln Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala
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Asn Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp
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65 70 75 80
Asp Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu
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Lys Gln Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu
100 105 110
Ala Ile Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr
115 120 125
Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val
130 135 140
Phe Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser
145 150 155 160
Leu Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro
165 170 175
Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys
180 185 190
Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile
195 200 205
Ser Asp Leu Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu
210 215 220
Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp
225 230 235 240
Gly Ala Asp Phe Asp Ala Glu Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr
245 250 255
Asp Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly
260 265 270
Val Asn Ala Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly
275 280 285
Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly
290 295 300
Gln Asp Ser Trp Asn Gln Thr Ser
305 310
<210> 24
<211> 312
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 24
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro
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Glu Gln Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala
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50 55 60
Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe
65 70 75 80
Asp Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu
85 90 95
Lys Gln Lys Ile Asn Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu
100 105 110
Ala Ile Arg Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr
115 120 125
Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val
130 135 140
Phe Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser
145 150 155 160
Leu Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Lys Gly Ser Lys Asp Pro
165 170 175
Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys
180 185 190
Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile
195 200 205
Ser Asp Leu Ile Lys Glu Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly Leu
210 215 220
Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp
225 230 235 240
Gly Ala Asp Phe Asp Ala Glu Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr
245 250 255
Asp Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly
260 265 270
Val Asn Lys Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly
275 280 285
Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly
290 295 300
Gln Asp Ser Trp Asn Gln Thr Asn
305 310
<210> 25
<211> 310
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 25
Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro
1 5 10 15
His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln
20 25 30
Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln
35 40 45
Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu
50 55 60
Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln
65 70 75 80
Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln
85 90 95
Lys Ile Asn Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Lys Ala Ile
100 105 110
Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Asn Tyr Phe Lys
115 120 125
Glu Lys Ala Phe Pro Gly Leu Ser Ala Arg Arg Ile Gly Val Phe Pro
130 135 140
Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr
145 150 155 160
Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly
165 170 175
Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu
180 185 190
Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Asn Lys Asn Leu Asn Asp Ile Ser Thr
195 200 205
Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His
210 215 220
Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala
225 230 235 240
Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser
245 250 255
Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn
260 265 270
Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly Glu Asn
275 280 285
Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp
290 295 300
Ser Trp Gln Lys Leu Ser
305 310
<210> 26
<211> 320
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 26
Met Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr
1 5 10 15
Pro Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala
20 25 30
Asn Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn
35 40 45
Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu
50 55 60
Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp
65 70 75 80
Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys
85 90 95
Gln Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala
100 105 110
Ile Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe
115 120 125
Lys Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe
130 135 140
Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu
145 150 155 160
Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg
165 170 175
Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu
180 185 190
Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser
195 200 205
Asp Leu Ile Lys Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser
210 215 220
His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly
225 230 235 240
Ala Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp
245 250 255
Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val
260 265 270
Asn Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp
275 280 285
Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln
290 295 300
Asp Ser Trp Asn Gln Thr Asn Gly Gly Gly His His His His His His
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<210> 27
<211> 325
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 27
Met Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val
1 5 10 15
Pro His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr
20 25 30
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35 40 45
Leu Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys
50 55 60
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130 135 140
Gly Val Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr
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165 170 175
Asp Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly
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195 200 205
Leu Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg
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Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala
245 250 255
Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys
260 265 270
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275 280 285
Lys Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr
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Leu Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser Gly Gly Gly His
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<212> PRT
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275 280 285
Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser
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<213> Streptococcus pyogenes
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<213> Streptococcus pyogenes
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<211> 20
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 32
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20
<210> 33
<211> 963
<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 33
atggatagtt tttctgctaa tcaagagatt agatattcgg aagtaacacc ttatcacgtt 60
acttccgttt ggaccaaagg agttactcct ccagcaaact tcactcaagg tgaagatgtt 120
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aaagacgatc ttctttgcgg ggctgccaca gcagggaata tgcttcactg gtggttcgat 240
caaaacaaag accaaattaa acgttatttg gaagagcatc cagaaaagca aaaaataaac 300
ttcaatggcg aacagatgtt tgacgtaaaa gaagctatcg acactaaaaa ccaccagcta 360
gatagtaaat tatttgaata ttttaaagaa aaagctttcc cttatctatc tactaaacac 420
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tcaacagggc aagatagttg gaatcagacc aatggcggtg gccatcatca ccatcaccac 960
taa 963
<210> 34
<211> 978
<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 34
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acttctgtat ggaccaaagg tgttacacca ctaacacccg agcagtttcg atataataac 120
gaagatgtga tccatgcgcc atatcttgct catcaaggct ggtacgatat caccaaggcc 180
ttcgatggga aggataatct cttgtgtggc gcagcaacgg caggtaatat gctgcattgg 240
tggtttgatc aaaataaaac agagattgaa gcctatttaa gtaaacaccc tgaaaagcaa 300
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ttaaatgtgt ttaaaacaca gtctactgat gtcaatcgac cttatcagga caaggacaaa 540
cgaggtggta ttttcgatgc tgttttcacc agaggagatc agacaacgct cttgacagct 600
cgtcatgatt taaaaaataa aggactaaat gacatcagca ccattatcaa gcaagaactg 660
actgaaggaa gagcccttgc tttatcacat acctacgcca atgttagcat tagccatgtg 720
attaacttgt ggggagctga ttttaatgct gaaggaaacc ttgaggccat ctatgtcaca 780
gactcagatg ctaatgcgtc tattggtatg aaaaaatatt ttgtcggcat taatgctcat 840
ggacatgtcg ccatttctgc caagaaaata gaaggagaaa acattggcgc tcaagtatta 900
ggcttattta cgctttccag tggcaaggac atttggcaga aactgagcgg cggtggccat 960
catcaccatc accactaa 978
<210> 35
<211> 972
<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 35
atggatgatt atcagcgcaa cgcgaccgaa gcgtatgcga aagaagtgcc gcatcagatt 60
accagcgtgt ggaccaaagg cgtgaccccg ctgaccccgg aacagtttcg ctataacaac 120
gaagatgtgt ttcatgcgcc gtatgtggcg aaccagggct ggtatgatat taccaaagcg 180
tttgatggca aagataacct gctgtgcggc gcggcgaccg cgggcaacat gctgcattgg 240
tggtttgatc agaacaaaga tcagattaaa cgctatctgg aagaacatcc ggaaaaacag 300
aaaattaact ttaacggcga taacatgttt gatgtgaaaa aagcgattga taccaaaaac 360
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gcgcgccgca ttggcgtgtt tccggatcat gtgattgata tgtttattaa cggctatcgc 480
ctgagcctga ccaaccatgg cccgaccccg gtgaaagaag gcagcaaaga tccgcgcggc 540
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catcaccact aa 972
<210> 36
<211> 978
<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 36
atggatgatt atcagcgcaa cgcgaccgaa gcgtatgcga aagaagtgcc gcatcagatt 60
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tggtttgatc agaacaaaac cgaaattgaa gcgtatctga gcaaacatcc ggaaaaacag 300
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gcgcgccagc tgggcgtgat gccggatctg gtgctggata tgtttattaa cggctattat 480
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cgccatgatc tgaaaaacaa aggcctgaac gatattagca ccattattaa agaagaactg 660
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gatagcgatg cgaacgcgag cattggcatg aaaaaatatt ttgtgggcat taacaaacat 840
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catcaccatc accactaa 978
<210> 37
<211> 978
<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 37
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accagcgtgt ggaccaaagg cgtgaccccg ctgaccccgg aacagtttcg ctataacaac 120
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<210> 38
<211> 978
<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 38
atggatagct ttagcgcgaa ccaggaaatt cgctatagcg aagtgacccc gtatcatgtg 60
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gaagatgtga ttcatgcgcc gtatctggcg catcagggct ggtatgatat taccaaagcg 180
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catcaccatc accactaa 978
<210> 39
<211> 918
<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 39
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<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 40
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tttgatcaaa ataaaacaga gattgaagcc tatttaagta aacaccctga aaagcaaaaa 300
atcattttta acaaccaaga gctatttgat ttgaaagctg ctatcgatac caaggacagt 360
caaaccaata gtcagctttt taattatttt agagataaag cctttccaaa tctatcagca 420
cgtcaactcg gggttatgcc tgatcttgtt ctagatatgt ttatcaatgg ttactactta 480
aatgtgttta aaacacagtc tactgatgtc aatcgacctt atcaggacaa ggacaaacga 540
ggtggtattt tcgatgctgt tttcaccaga ggagatcaga caacgctctt gacagctcgt 600
catgatttaa aaaataaagg actaaatgac atcagcacca ttatcaagca agaactgact 660
gaaggaagag cccttgcttt atcacatacc tacgccaatg ttagcattag ccatgtgatt 720
aacttgtggg gagctgattt taatgctgaa ggaaaccttg aggccatcta tgtcacagac 780
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catgtcgcca tttctgccaa gaaaatagaa ggagaaaaca ttggcgctca agtattaggc 900
ttatttacgc tttccagtgg caaggacatt tggcagaaac tgagcggcgg tggccatcat 960
caccatcacc actaa 975
<210> 41
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<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 41
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acttctgtat ggaccaaagg tgttacacca cccgagcagt ttactcaagg tgaagatgtg 120
atccatgcgc catatcttgc tcatcaaggc tggtacgata tcaccaaggc cttcgatggg 180
aaggataatc tcttgtgtgg cgcagcaacg gcaggtaata tgctgcattg gtggtttgat 240
caaaataaaa cagagattga agcctattta agtaaacacc ctgaaaagca aaaaatcatt 300
tttaacaacc aagagctatt tgatttgaaa gctgctatcg ataccaagga cagtcaaacc 360
aatagtcagc tttttaatta ttttagagat aaagcctttc caaatctatc agcacgtcaa 420
ctcggggtta tgcctgatct tgttctagat atgtttatca atggttacta cttaaatgtg 480
tttaaaacac agtctactga tgtcaatcga ccttatcagg acaaggacaa acgaggtggt 540
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<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 42
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acttctgtat ggaccaaagg tgttacacca cccgagcagt ttcgatataa taacgaagat 120
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gggaaggata atctcttgtg tggcgcagca acggcaggta atatgctgca ttggtggttt 240
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atttttaaca accaagagct atttgatttg aaagctgcta tcgataccaa ggacagtcaa 360
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<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
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caccactaa 969
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<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
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<213> Streptococcus pyogenes
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<213> Streptococcus pyogenes
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<210> 52
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<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 52
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<213> Streptococcus pyogenes
<400> 55
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ctgggcctga gccataccta tgcgaacgtg agcattaacc atgtgattaa cctgtggggc 720
gcggatttta acgcggaagg caacctggaa gcgatttatg tgaccgatag cgatagcaac 780
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agcaccggcc aggatagctg gcagaaactg agcggcggtg gccatcatca ccatcaccac 960
taa 963
Claims (14)
- IgG 시스테인 프로테아제 활성을 가지며, 또한 서열번호: 4 또는 5의 서열의 변이체 (variant)를 포함하는 폴리펩티드 (polypeptide)로서, 상기 변이체는:
(a) 서열번호: 4 또는 5에 대해 적어도 50% 동일하고;
(b) 서열번호: 3의 위치 102에 해당하는, 상기 변이체 서열의 상기 위치에 시스테인 (C)을 가지며; 또한 선택적으로
(c) 서열번호: 3의 위치 92, 272, 294 및 296에 해당하는, 상기 변이체 서열의 상기 위치에, 각각 리신 (K), 히스티딘 (H), 아스파르트산 (D) 및 아스파르트산 (D)을 가지며;
상기 폴리펩티드는 인간 IgG 절단 (cleaving) 시에 IdeZ보다 더 효과적이고 및/또는 인간 IgG 절단 시에 적어도 IdeS 만큼의 효과를 갖는 것인 폴리펩티드. - 청구항 1에 있어서, 서열번호: 4 또는 5의 서열의 상기 변이체는:
(1) 서열번호: 3의 위치 138에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 양으로 대전된 아미노산을 가지며, 선택적으로 상기 양으로 대전된 아미노산은 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)이고; 및/또는
(2) 서열번호: 3의 위치 139에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 양으로 대전된 아미노산을 가지며, 선택적으로 상기 양으로 대전된 아미노산은 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)이고; 및/또는
(3) 연속된 서열 (contiguous sequence) DDYQRNATEA YAKEVPHQIT를 포함하지 않고; 및/또는
(4) 하기 변형들 중 적어도 하나를 갖는 것인 폴리펩티드:
i. 서열번호: 3의 위치 64 및 65에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 루신 (L) 및 트레오닌 (T) 잔기의 결실;
ii. 서열번호: 3의 위치 70에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 아르기닌 (R) 대신에 트레오닌 (T);
iii. 서열번호: 3의 위치 71에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 티로신 (Y)의 결실;
iv. 서열번호: 3의 위치 72에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 아스파라긴 (N) 대신에 글루타민 (Q);
v. 서열번호: 3의 위치 73에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 아스파라긴 (N) 대신에 글리신 (G);
vi. 서열번호: 3의 위치 67에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 글루탐산 (E) 대신에 알라닌 (A);
vii. 서열번호: 3의 위치 68에 해당하는, 상기 변이체의 위치에 글루타민 (Q) 대신에 아스파라긴 (N). - 청구항 1 또는 2에 있어서, 서열번호: 4 또는 5의 서열의 상기 변이체는 서열번호: 4 또는 5에 각각 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일하고, 및/또는 상기 폴리펩티드는, 동일한 분석으로 측정되었을 때, IdeS보다 면역원성이 떨어지고, 또한 바람직하게 IdeZ 또는 IdeS/Z 보다 면역원성이 높지 않은 것인 폴리펩티드.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 6 내지 25 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되고, 선택적으로 상기 서열은 N 말단에서 부가의 메티오닌 및/또는 C 말단에서 히스티딘 태그 (tag)를 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는, 동일한 분석으로 측정되었을 때, 인간 IgG 절단 시에 IdeZ보다 적어도 2.0배 더 효과적인 것인 폴리펩티드.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, IdeS보다 면역원성이 떨어지고, 바람직하게, 상기 폴리펩티드의 면역원성은, 동일한 분석으로 측정되었을 때, IdeS의 면역원성의 85% 이하인 것인 폴리펩티드.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 인코딩 (encoding)하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (polynucleotide) 또는 발현 벡터 (expression vector).
- 청구항 7의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 (host cell), 바람직하게는 박테리아 세포 (bacterial cell), 가장 바람직하게는 이. 콜 리 (E. coli)의 세포.
- 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 적어도 하나의 약학적 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물 (composition).
- 인간 또는 동물의 치료에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드.
- 대상 (subject)에서 질병 (disease) 또는 상태 (condition)의 예방 또는 치료를 위한 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 상기 대상에게 예방적 또는 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 11에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 병원성 IgG 항체에 의해 전부 또는 일부 매개된 질병 또는 상태이고, 바람직하게 상기 질병 또는 상태는 상기 표 D에 열거된 것인 방법.
- IgG의 절단 (cleavage)을 위한 방법으로서, 상기 방법은 IgG를 포함하는 시료를 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와, IgG 시스테인 프로테아제 활성이 발생될 수 있는 조건 하에서, 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 방법이 엑스 비보 (ex vivo)에서 수행 및/또는 실행되어 Fc 및 Fab 단편이 생성되고, 및/또는 상기 시료는 청구항 12에 정의된 바와 같은 질병 또는 상태를 가진 대상으로부터 채취된 혈액 시료인 것인 방법.
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