RS64840B1

RS64840B1 - Cistein proteaza

Info

Publication number: RS64840B1
Application number: RS20231088A
Authority: RS
Inventors: Christian Kjellman; Sofia Jarnum; Emma Nordahl
Original assignee: Hansa Biopharma AB
Priority date: 2015-02-12
Filing date: 2016-02-12
Publication date: 2023-12-29
Also published as: JP6879921B2; NZ733962A; CN107532158A; ES2962794T3; US20180037962A1; BR112017017286A2; MY187486A; DK3256579T3; CL2017002066A1; EP4265719A1; SG11201706349YA; EA201791775A1; CA2976016C; CN113564150A; AU2016217801B2; US10758597B2; PL3256579T3; LT3256579T; JP2018510622A; IL253939B

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na novi polipeptid koji ispoljava aktivnost cisteinske proteaze IgG, i njegove in vivo i ex vivo upotrebe. Upotrebe polipeptida obuhvataju postupke za prevenciju ili lečenje bolesti i stanja koji su posredovani sa IgG, i postupke za analizu IgG.

Stanje tehnike pronalaska

[0002] IdeS (Imunoglobulin G-degradujući enzim S. pyogenes) je ekstraćelijska cisteinska proteaza koja je proizvedena od strane humanog patogena S. pyogenes. IdeS je prvobitno izolovana iz grupe A Streptococcus soja serotipa M1, ali gen za ides je sada identifikovan u svim ispitivanim Streptococcus sojevima grupe A. IdeS ima izvanredno visok stepen specifičnosti prema supstratu, sa jedinim identifikovanim supstratom IgG. IdeS katalizuje jedno proteolitičko cepanje u donjem regionu zgloba teških lanaca svih podklasa humanog IgG. IdeS takođe katalizuje ekvivalentno cepanje teških lanaca određenih podklasa IgG kod različitih životinja. IdeS efikasno cepa IgG do Fc i F(ab’)2fragmente preko mehanizma u dve faze. U prvoj fazi, jedan (prvi) težak lanac IgG je cepan da bi se dobio pojedinačni cepani IgG (scIgG) molekul sa nekovalentno vezanim Fc molekulom. Molekul scIgG je efikasan intermedijerni proizvod koji je zadržao preostali (drugi) težak lanac originalnog molekula IgG. U drugoj fazi mehanizma ovaj drugi težak lanac je cepan sa IdeS da se oslobodi F(ab’)2fragment i homodimerni Fc fragment. Ovo su proizvodi koji se generalno uočavaju pod fiziološkim uslovima. Pod uslovima redukcije fragment F(ab’)2može disocirati na dva Fab fragmenta i homodimerni Fc može disocirati u njegove komponente monomere.

Suština pronalaska

[0003] Pokazalo se da je sposobnost cepanja IdeS na IgG korisna ex vivo, na primer u postupcima dobijanja fragmenata Fab i Fc, koji se mogu koristiti za analizu IgG. Videti, na primer, WO2003051914 i WO2009033670. Takođe je pokazano da je IdeS koristan in vivo utility kao terapeutsko sredstvo, s obzirm da je sposobna za in vivo cepanje molekula IgG koji posreduju bolesti ili koji su inače nepoželjni. Videti, na primer, WO2003051914, WO2006131347 i WO2013110946. IdeS se može koristiti kao terapija za bilo koju bolest ili stanje koje je u celini ili delom posredovano sa IgG. Mnoge autoimune bolesti su u potpunosti ili delom posredovane sa IgG, kao što je akutno odbacivanje doniranih organa.

[0004] Međutim, IdeS je imunogeni protein. Odnosno, kada se IdeS koristi kao terapeutski agens imunski sistem subjekta koji je primio IdeS će često na njega reagovati. Reakcija imunskog sistema na IdeS obično će uključiti proizvodnju antitela specifičnih za IdeS. Ova antitela se ovde mogu nazvati kao antitela protiv leka (eng. anti-drug antibody, ADA) specifična za IdeS ili "IdeS-specifična ADA". Imunski odgovor na IdeS generalno, i proizvodnja IdeS-specifičnih ADA odeđeno, može izvati dva srodna tipa problema. Prvo, efikasnost IdeS može biti smanjena, npr. zbog vezivanja ADA, potencijalno zahtevajući veće ili ponovljene doze da bi se podstigao isti efekat. ADA sa ovim efektom mogu se označiti kao "neutrališuća ADA". Drugo, može doći do neželjenih ili čak štetnih komplikacija, kao što je hiperzapaljenski odgovor koji je izazvan imunskim kompleksima ADA i IdeS. Što je veća količina ADA specifičnih za IdeS kod datog subjekta, veća je verovatnoća ovih problema. Prisustvo i količina IdeS-specifičnih ADA molekula kod pacijenta mogu se odrediti bilo kojim pogodnim postupkom, kao što je agens specifični CAP FEIA (ImmunoCAP) test ili titarski test izveden na uzorku seruma od pacijenta. Iznad praga koji je odredio lekar, količina IdeS-specifičnih ADA molekula kod pacijenta može sprečiti primenu IdeS, ili ukazati na to da je potrebna veća doza IdeS. Ovako veća doza može zauzvrat rezultovati u povećanoj količini IdeS-specifičnih ADA molekula kod pacijenta, čime se onemogućava dalja primena IdeS.

[0005] IdeS je faktor virulencije S. pyogenes, koji je odgovoran za poznate infekcije kao što su tonzillitis i streptokokno grlo. Shodno tome većina humanih subjekata se u ovom kontekstu susrela sa IdeS i verovatno u krvotoku poseduje anti-IdeS antitela. IdeS-specifična ADA su rutinski detektovana u uzorcima seruma kod nasumičnih humanih subjekata (verovatno zbog prethodnih infekcija streptokokama), kao i kod IVIg (Intravenozni Imunoglobulin) preparata, koji su preparati IgG koji su ekstrahovani iz seruma sakupljenih od hiljada donora. Čak iako subjekt ne sadrži IdeS-specifična ADA pre inicijalnog davanja IdeS, verovatno je da će takvi molekuli biti naknadno proizvedeni. Prema tome, za bilo kojeg subjetkta u pitanju, problem koji su povezani sa imunogenošću IdeS će verovatno predstavljati barijeru za upotrebu IdeS kao tretmana. Ovi problemi mogu zahtevati povećanja u dozi IdeS i/ili u potpunosti sprečiti lečenje sa IdeS, posebno ukoliko je potrebno ponovljeno davanje. Postojeći pristupi problemima ovog tipa uključuju, na primer, PEG-ilaciju terapeutskog agensa da se smanji imunogenost ili zajedničko davanje terapeutskog agensa sa imuno-supresivnim agensom.

[0006] Predmetni pronalazači su usvojili u potpunosti različiti pristup. Pronalazači su analizirali sekvencu IdeS i uporedili je sa sekvencom proteina IdeZ, koji je približno 66% identičan sa IdeS. IdeZ je IgG cisteinska proteaza proizvedena od strane Streptococcus equi ssp. zooepidemicus, bakterije koja je predominatno nađena kod konja. Kako IdeZ nije humani patogen, humani subjekti uobičajeno nemaju antitela protiv ovog proteina u njihovoj plazmi. Međutim, IdeZ ima nivo aktivnosti IgG cisteinske proteaze protiv humanog IgG koja je značajno niža od one kod IdeS. Predmetni pronalazači su ispitivali pozicije u sekvenci IdeZ koja poboljšava svoju aktivnost protiv humanog IgG a da ne rezultira u značajnom povećanju u imunogenosti. Kao polazne tačke za ovo ispitivanje, pronalazači su koristiti i sekvencu IdeZ i sekvencu nove hibridne sekvence koju su dizajnirali pronalazači, koja je 81.7% identična sa IdeS i 81% identična sa IdeZ. Ova hibridna sekvenca se ovde može označiti sa IdeS/Z.

[0007] Puna sekvenca IdeS je javno dostupna kao NCBI Referentna Sekvenca br. WP_010922160.1 i obezbeđena je ovde kao SEQ ID NO: 1. Ova sekvenca uključuje N terminalni metionin nakon čega sledi signalna sekvenca sekrecije 28 aminokiselina. N terminalni metionin i signalna sekvenca (ukupno 29 aminokiselina na N terminusu) su obično uklonjeni da se obrazuje zreli IdeS protein, sekvenca koja je javno dostupna pod Genbank pristupni br. ADF13949.1 i ovde je obezbeđena kao SEQ ID NO: 2.

[0008] Puna sekvenca IdeZ je javnosti dostupna kod NCBI Referentna Sekvenca br WP_014622780.1 i ovde je obezbeđena kao SEQ ID NO: 3. Ova sekvenca uključuje N terminalni metionin nakon čega sledi signalna sekvenca sekrecije 33 aminokiselina. N terminalni metionin i signalna sekvenca (ukupno 34 aminokiselina na N terminusu) su obično uklonjene da se obrazuje zreli IdeZ protein, sekvenca koja je ovde obezbeđena kao SEQ ID NO: 4.

[0009] Sekvenca IdeS/Z hibrida dizajniran od strane pronalazača ima N terminalni deo zasnovan na IdeZ, bez N terminalnog metionina i signalne sekvence (ukupno 34 aminokiselina na N terminusu). Ova sekvenca je ovde obezbeđena kao SEQ ID NO: 5.

[0010] Predmetni pronalazači su bili sposobni da identifikuju pozicije unutar sekvence IdeZ i IdeS/Z hibrida koje, kada su modifikovane kao što je ovde opisano, dovode do novih polipeptida koji imaju povećanu aktivnost IgG cistein proteaze protiv humanog IgG u odnosu na IdeZ. Aktivnost IgG cistein proteaze protiv humanog IgG polipeptida iz pronalaska je poželjno bar onoliko visoka kao aktivnost IgG cistein proteaze protiv humanog IgG od IdeS. Polipeptid iz pronalaska može biti efikasniji u cepanju prvog lanca molekula IgG u odnosu na drugi lanac (videti šematski prikaza na Slici 18), posebno kada je IgG izotip IgG2. Polipeptid iz pronalaska može biti efikasniji u cepanju IgG1 od IgG2. Polipeptid iz pronalaska je obično manje imunogen od IdeS i može poželjno biti ne više imunogen od IdeZ ili IdeS/Z.

[0011] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, sve reference na numerisanja pozicija aminokiselina u ovde prikazanim polipeptidima je zasnovano na numerisanju odgovarajućih pozicija u SEQ ID NO: 3, počev od N terminusa. Prema tome, s obzirom da SEQ ID NOs: 4 i 5 ne sadrži N terminalni metionin i 33 aminokiselinsku signalnu sekvencu SEQ ID NO: 3, ostatak asparaginske kiseline (D) na N terminusu SEQ ID NOs: 4 i 5 je označen kao pozicija 35 kao što je ovo odgovarajuća pozicija u SEQ ID NO: 3. Primenom ove šeme za numerisanje, najkritičniji ostatak za cisteinsku proteaznu aktivnost IdeS kao cistein protease je cistein (C) na poziciji 102 (68-i ostatak sa N terminusa SEQ ID NOs: 4 i 5). Ostali ostaci koji će verovatno biti važni za aktivnost IgG cistein proteaze su lizin (K) na poziciji 92, histidin (H) na poziciji 272, i asparaginska kiselina (D) na svakoj od pozicija 294 i 296 prema SEQ ID NO: 3. Ovo su 58-i, 238-i, 260-i i 262-i ostaci od N terminusa SEQ ID NO: 4 i 58-i, 236-i, 258-i i 260-i od N terminusa SEQ ID NO: 5, tim redom.

[0012] U skladu da predmetnom pronalaskom, tako je obezbeđen polipeptid koji ima aktivnost IgG cisteinske proteaze i sadrži varijantu sekvence SEQ ID NO:4 ili 5, gde varijanta:

(a) je najmanje 80% identična SEQ ID NO: 4 ili 5;

(b) ima cistein (C) na poziciji u pomenutoj varijanti sekvence koja odgovara poziciji 102 SEQ ID NO: 3; i opciono

(c) ima, na pozicijama u pomenutoj varijanti sekvence koja odgovara pozicijama 92, 272, 294 i 296 SEQ ID NO: 3, lizin (K), histidin (H), asparaginsku kiselinu (D) i asparaginsku kiselinu (D), tim redom;

pri čemu je pomenuti polipeptid efikasniji u cepanju humanog IgG u odnosu na IdeZ i/ili je bar jednako efikasan u cepanju humanog IgG kao IdeS; dalje pri čemu je pomenuta varijanta SEQ ID NO: 4 ili 5:

(1) ima pozitivno naelektrisanu aminokiselinu na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 138 SEQ ID NO: 3, opciono pri čemu pomenuta pozitivno naelektrisana aminokiselina je arginin (R) ili lizin (K); i/ili

(2) ima pozitivno naelektrisanu aminokiselinu na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 139 SEQ ID NO: 3, opciono pri čemu pomenuta pozitivno naelektrisana aminokiselina je arginin (R) ili lizin (K); i/ili

(3) ne uključuje susednu sekvencu DDYQRNATEA YAKEVPHQIT; i/ili

(4) ima najmanje jednu od sledećih modifikacija:

i. delecija ostataka leucina (L) i treonina (T) na pozicijama u pozicijama u pomenutoj varijanti koji odgovaraju pozicijama 64 i 65 SEQ ID NO: 3;

ii. treonin (T) umesto arginina (R) na poziciji umesto varijante koja odgovara poziciji 70 SEQ ID NO: 3;

iii. delecija tirozina (Y) na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 71 SEQ ID NO: 3; iv. glutamin (Q) umesto asparagina (N) na poziciji u pomenutoj varijanti koji odgovara poziciji 72 SEQ ID NO: 3;

v. glicin (G) umesto asparagina (N) na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 73 SEQ ID NO: 3;

vi. alanin (A) umesto glutaminske kiseline (E) na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 67 SEQ ID NO: 3;

vii. asparagin (N) umesto glutamina (Q) na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 68 SEQ ID NO: 3.

[0013] Najmanje jedna modifikacija (4) je obično odabrana iz opcija i. do vii. gore navedenih. Polipeptid iz pronalaska može obuhvatiti varijantu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5, gde varijanta ima najmanje dve, tri, četiri, pet, šest ili svih sedam modifikacija opcija od i. do vii.

[0014] Pronalazak takođe obezbeđuje polinukleotid, ekspresioni vektor ili ćeliju domaćina koja kodira ili eksprimira polipeptid iz pronalaska.

[0015] Pronalazak takođe obezbeđuje polipeptid iz pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije bolesti ili stanja koje je posredovano sa IgG antitelima kod subjekta, postupak obuhvata davanje subjektu terapeutski ili profilaktički efikasne količine polipeptida iz pronalaska. Postupak može obično sadržati višestruka davanja subjektu pomenutog polipeptida.

[0016] Pronalazak takođe obezbeđuje postupak za lečenje, ex vivo, krv koja je uzeta od pacijenta, obično pacijenta koji pati od bolesti ili stanja koje je posredovano sa IgG antitelima, gde postupa obuhvata dovođenje u kontakt krvi sa polipeptidom iz pronalaska.

[0017] Pronalazak takođe obezbeđuje polipeptid iz pronalaska za upotrebu u postupku za poboljšanje koristi za subjekta terapije ili terapeutskog agensa, postupak obuhvata (a) davanje subjektu polipeptida iz pronalaska; i (b) naknadno davanje pomenute terapije ili pomenutog terapeutskog agensa subjektu; pri čemu:

- navedena terapija je transplantacija organa ili pomenuti terapeutski agens je antitelo, genska terapija kao što je virusni vektor, zamena za defektni endogeni faktor kao što je enzim, faktor rasta ili zgrušavanja, ili ćelijska terapija;

- količina pomenutog primenjenog polipeptida koja se daje je dovoljna da cepa suštinski sve IgG molekule prisutne u plazmi subjekta; i

- koraci (a) i (b) su razdvojeni vremenskim intervalom koji je dovoljan da cepa suštinski sve IgG molekule prisutne u plazmi subjekta.

[0018] Pronalazak takođe obezbeđuje ex vivo postupak za dobijanje Fc, Fab ili F(ab’)2fragmente IgG koji obuhvata dovođenje u kontakt IgG sa polipeptidom iz pronalaska.

[0019] Takođe su prikazani kompleti za izvođenje ovde opisanih postupaka.

Kratak opis nacrta

[0020]

Slike 1 i 2 prikazuje rezultate reprezentativnog testa za određivanje potencije (efikasnosti pri cepanju IgG) polipeptida iz pronalaska u poređenju sa kontrolama.

Slika 3 prikazuje rezultate reprezentativnog SDS-PAGE gela gela koji je korišćen za vizuelizaciju proizvoda cepanja proizvedenih inkubacijom IgG1 sa polipeptidima iz pronalaska ili kontrolama. Slika 4 prikazuje rezultate reprezentativnog SDS-PAGE gela koji je korišćen za vizuelizaciju proizvoda cepanja proizvedenih inkubacijom IVIg sa polipeptidima iz pronalaska ili kontrolama.

Slika 5 prikazuje rezultate reprezentativnog SDS-PAGE gela koji je korišćen za vizuelizaciju proizvoda cepanja proizvedenih inkubacijom IgG1 sa ostalim polipeptidima iz pronalaska ili kontrolama.

Slika 6 prikazuje rezultate reprezentativnog SDS-PAGE gela koji je korišćen za vizuelizaciju proizvoda cepanja proizvedenih inkubacijom IgG2 sa polipeptidima iz pronalaska ili kontrolama. Slika 7 prikazuje rezultate reprezentativnog SDS-PAGE gela koji je korišćen za vizuelizaciju proizvoda cepanja proizvedenih inkubacijom IVIg sa polipeptidima iz pronalaska ili kontrolama. Slike 8 i 9 prikazuju rezultate reprezentativnih testova kompeticije da bi se odredio nivo prepoznavanja polipeptida iz pronalaska IdeS-specifičnih antitela, u poređenju sa kontrolama. Slike 10 i 11 prikazuju rezultate reprezentativnih titacijskih testova da bi se odredio nivo prepoznavanja polipeptida iz pronalaska IdeS-specifičnim antitelima, u poređenju sa kontrolama. Slika 12 prikazuje reprezentative titracijske krive za cepanje IgG1 različitim polipeptidima IgG cistein proteaze.

Slika 13 prikazuje reprezentative titracijske krive za cepanje IgG2 različitim polipeptidima IgG cistein proteaze.

Slika 14 prikazuje rezultate reprezentativnog SDS-PAGE koji je korišćen za vizuelizaciju proizvoda proizvedenih inkubacijom IgG sa polipeptidima iz pronalaska ili kontrolama.

Slika 15 prikazuje rezultate reprezentativnog SDS-PAGE koji je korišćen za vizuelizaciju proizvoda proizvedenih inkubacijom IgG sa polipeptidima iz pronalaska ili kontrolama.

Slika 16 prikazuje rezultate reprezentativnog SDS-PAGE koji je korišćen za vizuelizaciju proizvoda proizvedenih inkubacijom IVIg sa polipeptidima iz pronalaska ili kontrolama.

Slika 17 prikazuje rezultate reprezentativnog SDS-PAGE koji je korišćen za vizuelizaciju proizvoda cepanja proizvedenih inkubacijom IVIg sa polipeptidima iz pronalaska ili kontrolama.

Slika 18 Šematski prikaz cepanja imunoglobulina polipeptidima iz pronalaska.

Slika 19 prikazuje rezultate reprezentativnog % kompeticije ADA vezujućih mesta sa polipeptidima iz pronalaska ili kontrolama.

Slika 20 prikazuje rezultate daljeg reprezentativnog % kompeticije ADA vezujućih mesta sa polipeptidima iz pronalaska ili kontrolama.

Slika 21 prikazuje rezultate reprezentativnu efikasnost ELISA koja je korišćena da bi se odredila efikasnost polipeptida iz pronalaska u cepanju humanog IgG in vivo.

Slika 22 prikazuje rezultate reprezentativnog SDS-PAGE koji je korišćen za vizuelizaciju proizvoda cepanja IgG dobijenih in vivo polipeptidima iz pronalaska.

Kratak opis sekvenci

[0021]

SEQ ID NO: 1 je puna sekvenca IdeS uključujući N terminalni metionin i signalnu sekvencu. Takođe je prikazana kao NCBI Referentna sekvenca br. WP_010922160.1

SEQ ID NO: 2 je zrela sekvenca IdeS, kojoj nedostaje N terminalni metionin i signalna sekvenca. Takođe je prikazana kao Genbank pristupni br. ADF13949.1

SEQ ID NO: 3 je puna sekvenca IdeZ uključujući N terminalni metionin i signalnu sekvencu. Takođe je prikazana NCBI Referentna sekvenca br. WP_014622780.1.

SEQ ID NO: 4 je zrela sekvennca IdeZ, kojoj nedostaje N terminalni metionin i signalna sekvenca. SEQ ID NO: 5 je sekvenca hibrida IdeS/Z dizajniran od strane pronalazača. N terminus je zasnovan na IdeZ kome nedostaje N terminalni metionin i signalna sekvenca.

SEQ ID NOs: 6 do 25 su sekvence primera polipeptida iz pronalaska

SEQ ID NO: 26 je sekvenca IdeS polipeptida koji je ovde korišćen kao kontrola. Sadrži sekvencu SEQ ID NO: 2 sa dodatnim N terminalnim metioninom i histidinskim tag-om (interna referenca pCART124).

SEQ ID NO: 27 je sekvenca IdeZ polipeptida koji je ovde korišćen kao kontrola. Sadrži sekvencu SEQ ID NO: 4 sa dodatnim N terminalni metioninom i histidinskim tag-om (interna referenca pCART144). SEQ ID NO: 28 je sekvenca IdeS/Z polipeptida koji je ovde korišćen kao kontrola. Sadrži sekvencu SEQ ID NO: 5 sa dodatnim N terminalnim metioninom i histidinskim tag-om (interna referenca pCART145).

SEQ ID NO: 29 je susedna sekvenca PLTPEQFRYNN, koja odgovara pozicijama 63-73 SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 30 je susedna sekvenca PPANFTQG, koja odgovara pozicijama 58-65 SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 31 je susedna sekvenca DDYQRNATEAYAKEVPHQIT, koja odgovara pozicijama 35-54 of SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 32 je susedna sekvenca DSFSANQEIRYSEVTPYHVT, koja odgovara pozicijama 30-49 SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NOs: 33 do 55 su sekvence nukleotida koji kodiraju ovde prikazane polipeptide.

Detaljan opis pronalaska

[0022] Potrebno je razumeti se da različite primene izloženih proizvoda i postupaka mogu prilagoditi specifičnim potrebama u oblasti tehnike. Takođe treba razumeti da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisa određenih izvođenja pronalaska, i nije namera da bude ograničavajuća.

[0023] Pored toga, kako se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, oblici u jednini uključuju reference za množinu osim ako sadržaj jasno ne ukazuje drugačije. Tako, na primer, referenca na "polipeptid" uključuje "polipeptide" i slično.

[0024] "Polipeptid" se ovde koristi u svom najširem smislu da se odnosi na jedinjenje od dve ili više podjedinica aminokiselina, analoga aminokiselina ili drugih peptidomimetika. Izraz "polipeptid" stoga uključuje kratke peptidne sekvence i takođe duže polipeptide i proteine. Kako se ovde koristi, izraz "aminokiselina" se odnosi na prirodne i/ili neprirodne ili sintetičke aminokiseline, uključujući i D ili L optičke izomere, i analoge aminokiselina i peptidomimetike.

[0025] Izrazi "pacijent" i "subjekt" se koriste istovremeno i obično se odnose na čoveka. Reference na IgG tipično se odnose na humani IgG osim ako nije drugačije navedeno.

Funkcionalne osobine polipeptida

[0026] Predmetni pronalazak se odnosi na novi polipeptid koji ima aktivnost IgG cistein proteaze, pri čemu je pomenuti polipeptid efikasniji u cepanju humanog IgG od IdeZ. Aktivnost cistein protease IgG protiv humanog IgG polipeptida iz pronalaska je poželjno bar onoliko visoka kao aktivnost cistein proteaze IgG protiv humanog IgG IdeS. Pored toga, polipeptid iz pronalaska je obično manje immunogen od IdeS i može poželjno biti ne više immunogen od IdeZ ili IdeS/Z. U kontekstu kontrole ili poređenja u odnosu na polipeptid iz pronalaska, "IdeS", "IdeZ" i "IdeS/Z" se odnosi na polipeptid koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 2, 4 i 5, tim redom. Alternativno ili dodatno, "IdeS", "IdeZ" i "IdeS/Z" kada su korišćeni kao kontrola ili poređenje može se odnositi na polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 2, 4 i 5, tim redom, sa dodatnim ostatkom metionina (M) na N terminusu i/ili tag-u na C terminusu za pomoć u ekspresiji i izolovanju iz standardnih bakterijskih ekspresionih sistema. Pogodni tag-ovi uključuju histidinski tag koji može biti u direktnoj vezi sa C terminusom polipeptida ili indirektno spojen sa bilo kojom pogodnom linker sekvencom, kao što su 3, 4 ili 5 ostataka glicina. Histidinski tag se obično sastoji iz šest ostataka histidina, iako može biti duži u odnosu na njih, obično do 7, 8, 9, 10 ili 20 aminokiselina ili kraće, na primer 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselina. Sekvenca ovde korišćenog primera IdeS polipeptida je kontrola obezbeđena u SEQ ID NO: 22. Ovaj polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 2 sa dodatnim N terminalnim metioninom i histidinskim tag-om i ovde može biti označen sa pCART124. Sekvenca ovde korišćenog primera IdeZ polipeptida je kontrola obezbeđena u SEQ ID NO: 23. Ovaj polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 4 sa dodatnim N terminalnim metioninom i histidinskim tag-om i ovde može biti označena sa pCART144. Sekvenca primera IdeS/Z polipeptida koji je ovde korišćen je kontrola i obezbeđena je kao SEQ ID NO: 24. Ovaj polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 5 da dodatnim N terminalnim metioninom i histidiskim tag-om i ovde može biti označena sa pCART145.

[0027] Aktivnost IgG cistein proteaze može se proceniti bilo kojim pogodnim postupkom, na primer inkubacijom polipeptida sa uzorkom koji sadrži IgG i određivanjem prisustva proizvoda cepanja IgG. Efikasnost se može proceniti u prisustvu ili odsustvu inhibitora, kao što je neutrališuće antitelo. Međutim, efikasnost ovde će tipično značiti efikasnost koja je procenjena u odsustvu takvog inhibitora, osim ako nije drugačije navedeno. Pogodni postupci su opisani u Primerima. Efikasnost polipeptida na cepanje IgG se ovde može nazvati "potentnošću" polipeptida. Potentnost polipeptida pronalaska je poželjno najmanje 2.0 puta veća od potencije IdeZ merene u istom testu. Alternativno, moć polipeptida pronalaska je poželjno najmanje ekvivalentna potenciji IdeS izmerenoj u istom testu. Potentnost polipeptida pronalaska može biti najmanje 1.5 puta, 2.0 puta, 2.5 puta, 3.0 puta, 4.0 puta, 4.5 puta, 5.0 puta, 6.0 puta, 7.0 puta, 7.5 puta ili 8.0 puta veća od potencije merene u istom testu. Potentnost polipeptida pronalaska je poželjno najmanje 2.0 puta, poželjnije najmanje 3.0 ili 4.0 puta i najpoželjnije najmanje 8.0 puta veća od potencije IdeS merene u istom testu.

[0028] Polipeptid pronalaska je tipično manje imunogen od IdeS i tako povećana potencija u odnosu na IdeZ i/ili potentnost ekvivalentna onoj kod IdeS je prihvatljiv minimalni standard za aktivnost cistein proteaze protiv humanog IgG. Međutim, povećana potencija u odnosu na IdeS je poželjno poboljšanje. Takva povećana potentnost će tipično omogućiti upotrebu niže doze polipeptida pronalaska za isti terapeutski efekat kao i veća doza IdeS. Niža doza takođe može dozvoliti veći broj ponovljenih davanja polipeptida pronalaska u odnosu na IdeS. To je zato što upotreba niže doze smanjuje probleme povezane sa imunogenošću terapeutskog agensa, jer je manje verovatno da će imuni sistem reagovati, ili će reagovati manje energično, na agens koji je prisutan u nižoj koncentraciji.

[0029] Testovi za procenu efikasnosti polipeptida na cepanje IgG, odnosno testovi za procenu potencije polipeptida, dobro su poznati u tehnici i može se koristiti bilo koji odgovarajući test. Pogodni testovi uključuju test zasnovan na ELISA, kao što je onaj koji je opisan u Primerima. U takvom testu, bunarčići na ploči za ispitivanje će tipično biti obloženi metom antitela, kao što je albumin goveđeg seruma (BSA). Uzorci polipeptida koji se testiraju se zatim dodaju u bunarčiće, a zatim uzorci ciljnospecifičnog antitela koje je antitelo specifično za BSA u ovom primeru. Polipeptidu i antitelu je dozvoljeno da interaguju pod uslovima pogodnim za aktivnost IgG cistein proteaze. Nakon odgovarajućeg intervala, ploča za analizu će biti isprana i detektorsko antitelo koje se specifično vezuje za ciljno specifično antitelo će biti dodato pod uslovima pogodnim za vezivanje za ciljno specifično antitelo. Detektorsko antitelo će se vezati za bilo koje netaknuto ciljno specifično antitelo koje se vezalo za cilj u svakom bunarčiću. Nakon ispiranja, količina detektorskog antitela prisutnog u bunarčiću biće proporcionalna količini ciljno-specifičnog antitela vezanog za taj bunarčić. Detektorsko antitelo može biti konjugovano direktno ili indirektno sa obeleživačem ili drugim reporterskim sistemom (kao što je enzim), tako da se može odrediti količina detektorskog antitela preostalog u svakom bunarčiću. Što je veća potencija testiranog polipeptida koji je bio u bunarčiću, to će ostati manje netaknuto antitelo specifično za cilj i samim tim će biti manje detektorskih antitela. Tipično, najmanje jedan bunarčić na datoj ploči za ispitivanje će uključivati IdeS umesto polipeptida koji se testira, tako da se potencija testiranih polipeptida može direktno uporediti sa potencijom IdeS. IdeZ i IdeS/Z takođe mogu biti uključeni za svrhu poređenja.

[0030] Drugi testovi mogu da odrede potenciju testiranog polipeptida direktnom vizuelizacijom i/ili kvantifikacijom fragmenata IgG koji su rezultat cepanja IgG od strane testiranog polipeptida. Test ovog tipa je takođe opisan u Primerima. Takav test će tipično inkubirati uzorak IgG sa ispitivanim polipeptidom (ili sa jednim ili više od IdeS, IdeZ i IdeS/Z kao kontrola) pri različitim koncentracijama u seriji titracije. Proizvodi koji nastaju inkubacijom pri svakoj koncentraciji se zatim razdvoje korišćenjem gel elektroforeze, na primer pomoću SDS-PAGE. Celi IgG i fragmenti koji nastaju cepanjem IgG mogu se zatim identifikovati po veličini i kvantifikovati prema intenzitetu bojenja odgovarajućom bojom. Što je veća količina fragmenata cepanja, to je veća potencija testiranog polipeptida u datoj koncentraciji. Polipeptid pronalaska će tipično proizvesti detektabilne količine fragmenata cepanja pri nižoj koncentraciji (niža tačka u seriji titracije) od IdeZ i/ili IdeS. Ovaj tip testa takođe može da omogući identifikaciju test polipeptida koji su efikasniji u cepanju prvog ili drugog teškog lanca IgG molekula, pošto se mogu odrediti i količine različitih fragmenata koji su rezultat svakog događaja cepanja. Polipeptid pronalaska može biti efikasniji u cepanju prvog lanca IgG molekula nego drugog lanca (videti šematski prikaz na Slici 18), posebno kada je IgG izotip IgG2. Polipeptid pronalaska može biti efikasniji u cepanju IgG1 u odnosu na IgG2.

[0031] Ovaj tip testa se takođe može prilagoditi da bi se odredio stepen do kojeg prisustvo IdeS-specifične ADA može da smanji potenciju polipeptida pronalaska. U prilagođenom testu, kada se uzorak IgG inkubira sa test polipeptidom (ili sa IdeS kao kontrolom), serum ili IVIg preparat koji sadrži ADA specifičnu za IdeS se uključuje u reakcioni medijum. Poželjno, na moć polipeptida pronalaska ne utiče prisustvo ADA ili je manje smanjena prisustvom ADA nego potenciju IdeS u istom testu. Drugim rečima, poželjno je da je neutrališući efekat IdeS-specifične ADA na polipeptid prema pronalasku isti ili niži od neutrališućeg efekta IdeS-specifične ADA na IdeS, izmeren u istom testu.

[0032] Kao što je gore navedeno, polipeptid pronalaska je tipično manje imunogen od IdeS. Odnosno, polipeptid pronalaska može dovesti do istog ili poželjno nižeg imunološkog odgovora od IdeS kada je prisutan u ekvivalentnoj dozi ili koncentraciji i izmeren u istom testu. Imunogenost polipeptida prema pronalasku obično nije veća od 50%, ne više od 45%, ne više od 40%, ne više od 35%, ne više od 30% ili ne više od 25% imunogenosti IdeS izmeren u istom testu. Poželjno, imunogenost polipeptida pronalaska nije više od 25% imunogenosti IdeS merene u istom testu.

[0033] Testovi za procenu imunogenosti polipeptida su takođe dobro poznati u tehnici i može se koristiti bilo koji odgovarajući test. Poželjni testovi za procenu imunogenosti polipeptida u odnosu na imunogenost IdeS obuhvataju procenu stepena do kojeg se ADA specifična za IdeS takođe vezuje za polipeptid pronalaska. Testovi ovog tipa su opisani u Primerima.

[0034] Jedan takav test uključuje testiranje konkurencije između IdeS i test polipeptida za vezivanje za IdeS-specifičnu ADA. Tipično, bunaričići ploče za ispitivanje su obloženi IdeS, nakon čega sledi davanje prethodno inkubirane smeše rastvora koji sadrži IdeS-specifičan ADA, npr. IVIg preparat i ispitivani polipeptid (ili IdeS kao kontrola). Predinkubacija se odvija u prisustvu inhibitora aktivnosti IgG cistein proteaze, npr. jodosirćetne kiseline (IHAc), i u visokoj koncentraciji soli, tako da je dozvoljeno samo vezivanje visokog afiniteta između proteina i ADA. Prethodno inkubiranoj smeši je dozvoljeno da stupi u interakciju sa IdeS obloženim bunarčićima. Bilo koja IdeS-specifična ADA koja nije vezana za testiranje polipeptida će se vezati za IdeS na bunarima. Nakon odgovarajućeg intervala, ploča za analizu će biti isprana i detektorsko antitelo koje se specifično vezuje za IgG će biti dodato pod uslovima pogodnim za vezivanje. Detektorsko antitelo će se vezati za bilo koju ADA koja se vezala za IdeS u svakom bunarčiću. Nakon ispiranja, količina detektorskog antitela prisutnog u bunarčiću biće obrnuto proporcionalna količini ADA koja se vezala za ispitivani polipeptid. Detektorsko antitelo može biti konjugovano direktno ili indirektno sa obeleživačem ili drugim reporterskim sistemom (kao što je enzim), tako da se može odrediti količina detektorskog antitela preostalog u svakom bunarčiću. Obično će se najmanje jedan bunarčić na datoj ploči za ispitivanje testirati sa prethodno inkubiranom mešavinom IVIg i IdeS umesto polipeptida koji se testira, tako da se vezivanje ADA za testirane polipeptide može direktno uporediti sa vezivanjem za IdeS, IdeZ i/ili IdeS/Z takođe mogu biti uključeni kao dodatne kontrole.

[0035] Još jedan pogodan test uključuje testiranje stepena do kojeg titraciona serija različitih koncentracija IdeS-specifične ADA, npr. IVIg preparat, vezuje se za test polipeptid u poređenju sa IdeS i/ili IdeZ kao kontrolom. Poželjno, polipeptid pronalaska će zahtevati veću koncentraciju ADA da bi vezivanje moglo da se detektuje, u odnosu na koncentraciju ADA za koju se vezivanje za IdeS može detektovati. Takav test je opisan u Primerima. Takav test tipično uključuje oblaganje bunarčića na ploči za testiranje ispitivanim polipeptidom ili kontrolom, nakon čega sledi inkubacija sa svakim bunarčićem sa različitom koncentracijom IdeS-specifične ADA iz serije titracije. Inkubacije se sprovode u prisustvu inhibitora aktivnosti IgG cistein proteaze, npr. jodosirćetne kiseline (IHAc), i u visokoj koncentraciji soli, tako da je dozvoljeno samo vezivanje visokog afiniteta između proteina i ADA. Nakon odgovarajućeg intervala, ploča za analizu će biti isprana i detektorsko antitelo koje se specifično vezuje za IgG F(ab’)2će se dodati pod uslovima pogodnim za vezivanje. Detektorsko antitelo će se vezati za bilo koju ADA koja se vezala za ispitivani polipeptid ili IdeS u svakom bunarčiću. Nakon ispiranja, količina detektorskog antitela prisutnog u bunarčiću biće direktno proporcionalna količini ADA koja se vezala za ispitivani polipeptid ili kontrolu. Detektorsko antitelo može biti konjugovano direktno ili indirektno sa oznakom ili drugim reporterskim sistemom (kao što je enzim), tako da se može odrediti količina detektorskog antitela preostalog u svakom bunarčiću. Najmanje jedan bunarčić na datoj ploči za ispitivanje će biti inkubiran sa puferom kojem nedostaje ADA kao slepom probom da bi se uspostavio nivo praga za detekciju vezivanja u ispitnim bunarčićima.

Strukturne osobine polipeptida

[0036] Ovaj odeljak postavlja strukturne karakteristike polipeptida pronalaska, koje se primenjuju pored funkcionalnih karakteristika navedenih u prethodnom odeljku.

[0037] Polipeptid iz pronalaska je tipično dugačak najmanje 100, 150, 200, 250, 260, 270, 280, 290, 300 ili 310 aminokiselina. Polipeptid pronalaska tipično nije duži od 400, 350, 340, 330, 320 ili 315 aminokiselina. Jasno je da se bilo koja od gore navedenih donjih granica može kombinovati sa bilo kojom od gore navedenih gornjih granica da bi se obezbedio opseg dužine polipeptida pronalaska. Na primer, polipeptid može biti dužine od 100 do 400 aminokiselina ili od 250 do 350 aminokiselina. Polipeptid je poželjno 290 do 320 aminokiselina u dužini, najpoželjnije 300 do 315 aminokiselina u dužini.

[0038] Primarna struktura (aminokiselinska sekvenca) polipeptida iz pronalaska je zasnovana na primarnoj strukturi IdeZ ili IdeS/Z, naročito aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 4 ili 5, tim redom. Sekvenca polipeptida iz pronalaska sadrži varijantu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5, koja je najmanje 80% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4 ili 5, i dalje gde je pomenuta varijanta SEQ ID NO: 4 ili 5:

(1) ima pozitivno naelekrisanu aminokiselinu na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 138 SEQ ID NO: 3, opciono pri čemu pomenuta pozitivno naelektrisana aminokiselina je arginin (R) ili lizin (K); i/ili

(2) ima pozitivno naelekrisanu aminokiselinu na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 139 SEQ ID NO: 3, opciono pri čemu pomenuta pozitivno naelektrisana aminokiselina je arginin (R) ili lizin (K); i/ili

(3) ne uključuje susednu sekvencu DDYQRNATEA YAKEVPHQIT; i/ili

(4) ima bar jednu od sledećih modifikacija:

1

i. deleciju ostataka leucina (L) i treonina (T) na pozicijama u pomenutoj varijanti koje odgovaraju pozicijama 64 i 65 SEQ ID NO: 3;

ii. treonin (T) umesto arginina (R) na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 70 SEQ ID NO: 3;

iii. deleciju tirozina (Y) na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 71 SEQ ID NO: 3; iv. glutamin (Q) umesto asparagina (N) na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 72 SEQ ID NO: 3;

[0039] Varijanta sekvence kao što je ovde izložena može biti najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje, 85%, poželjno najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 4 ili 5. Varijanta može biti identična sekvenci SEQ ID NO: 4 ili 5 izuzev inkluzije jedne ili više od ovde identifikovanih modifikacija. Identitet u odnosu na sekvencu SEQ ID NO: 4 ili 5 može se meriti u regionu od najmanje 50, najmanje 100, najmanje 200, najmanje 300 ili više susednih aminokiselina sekvence prikazane u SEQ ID NO: 4 ili 5, ili poželjnije u punoj dužini SEQ ID NO: 4 ili 5.

[0040] Aminokiselinski identitet može se izračunati korišćenjem odgovarajućeg algoritma. Na primer PILEUP i BLAST algoritmi mogu se koristiti za izračunavanje identiteta ili poređati sekvence (kao što je identifikovanje ekvivalenta ili odgovarajuće sekvence (obično na njihovim podrazumevanim podešavanjima), na primer kao što je opisano u Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10. Softver za sprovođenje BLAST analize je javno dostupan u Nacionalni centar za biotehnološku informaciju (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ovaj algoritam uključuje prvi identifikujući par sekvenci sa visokim rezultatom (HSPs) identifikovanjem kratkih reči dužina W u ispitivanoj sekvenci koji se ili poklapaju ili zadovoljavaju neki granični rezultat sa pozitivnom vrednošću T kada su poravnati sa rečju iste dužine u nizu baze podataka. T je označen pragom rezultata susedske reči (Altschul et al, supra). Ovi početni pogodci reči u susedstvu deluju kao semena za započinjanje pretraga da bi se pronašli HSPs koji sadrže. Pogodci u reči su prošireni u oba pravca duž svake sekvence za onoliko koliko se kumulativni rezultat poravnanja može povećati. Ekstenzije za pogotke u rečima u svakom pravcu se zaustavljaju: kumulativni rezultat poravnanja pada za količinu X od njene maksimalne postignute vrednosti; kumulativni rezulat ide do nula ili ispod, zbog nakupljanja jednog ili više poravnanja ostatka sa negativnim bodovanjem; ili je dostignut kraj bilo koje sekvence. Parametri W, T i X algoritma BLAST određuju osetljivost i brzinu poravnanja. BLAST koristi kao podrazumevanu dužinu reči (W) 11, BLOSUM62 matricu bodovanja (videti Henikoff i Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) poravnanja (B) 50, očekivanje (E) 10, M=5, N=4, i poređenje oba lanca.

[0041] BLAST algoritam vrši statističku analizu sličnosti između dve sekvence; videti npr., Karlin i Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Jedna od mera sličnosti koja je obezbeđena BLAST algoritmom je najmanja verovatnoća zbira (P(N)), koja obezbeđuje indikaciju verovatnoće da bi slučajno došlo do podudaranja između dve polinukleotidne ili aminokiselinske sekvence. Na primer, sekvenca je smatrana sličnoj drugoj sekvenci ukoliko najmanji zbir verovatnoća u poređenju prve sekvence sa drugom sekvencom je manja od oko 1, poželjno manja od oko 0.1, poželjnije manja od oko 0.01, i najpoželjnije manja od oko 0.001. Alternativno, UWGCG Paket obezbeđuje BESTFIT program koji se može koristiti da bi se izračunao identitet (na primer koristi se na podrazumevanim podešavanjima) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395).

[0042] Sekvenca polipeptida iz pronalaska sadrži varijantu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5 u kojoj modifikacije, kao što su aminokiselinske adicije, delecije ili supstitucije napravljene u odnosu na sekvencu SEQ ID NO: 4 ili 5. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, modifikacije su poželjno konzervativne aminokiselinske supstitucije.. Konzervativne supstitucije zamenjuju aminokiseline sa drugim aminokiselinama slične hemijske strukture, sličnim hemijskim osobinama ili sličnim volumenom bočnog lanca. Uvedene aminokiseline mogu imati sličan polaritet, hidrofilitet, hidrofobnost, baznost, kiselost, neutralnost ili naelektrisanje aminokiselina koje zamenjuju. Alternativno, konzervativna supstitucija može uvesti drugu aminokiselinu koja je aromatična ili alifatična umesto prethodno postojeće aromatične ili alifatične aminokiseline. Konzervativne aminokiselinske promene su dobro poznate u oblasti tehnike i mogu biti odabrane u skladu sa osobinama 20 glavnih aminokiselina kao što je definisano ispod u Tabeli A1. Gde aminokiseline imaju sličan polaritet, to se može odrediti pozivanjem na skalu hidropatije za aminokiselinske bočne lance u Tabeli A2.

Tabela A1 – Hemijske osobine aminokiselina

Tabela A2 -Skala hidropatije

Bočni lanac Hidropatija

Ile 4.5

Val 4.2

Leu 3.8

Phe 2.8

Cys 2.5

Met 1.9

Ala 1.8

Gly -0.4

(nastavak)

Bočni lanac Hidropatija

Thr -0.7

Ser -0.8

Trp -0.9

Tyr -1.3

Pro -1.6

His -3.2

Glu -3.5

Gln -3.5

Asp -3.5

Asn -3.5

Lys -3.9

Arg -4.5

[0043] Aminokiselinska sekvenca polipeptida iz pronalaska sadrži varijantu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5. Međutim, određeni ostaci u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 4 ili 5 su poželjno zadržani u pomenutoj varijanti sekvence. Nа primer, pomenuta varijanta sekvence obično zadržava određene ostatke koji su potrebni za aktivnosti IgG cistein proteaze. Prema tome, cistein na poziciji 102 SEQ ID NO: 3 mora se zadržati (68. ostatak SEQ ID NO: 4 ili 5) u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida iz pronalaska. U polipeptidu iz pronalaska, lizin (K) na poziciji 92, histidin (H) na poziciji 272, i asparaginska kiselina (D) na svakoj od pozicija 294 i 296 SEQ ID NO: 3. su takođe zadržane. To su ostaci 58<.>, 238<.>, 260. i 262-i ostatke iz N terminusa SEQ ID NO: 4 i 58, 236, 258 i 260 sa N terminusa SEQ ID NO: 5, tim redom. Prema tome, polipeptid iz pronalaska obično sadrži varijantu aminokiselinskee sekvence SEQ ID NO: 2 koja ima cistein (C) na poziciji u pomenutoj varijanti sekvence koja odgovara poziciji 102 SEQ ID NO: 3; i opciono ima, na pozicijama u pomenutoj varijanti sekvence koja odgovara pozicijama 92, 272, 294 i 296 SEQ ID NO: 3, lizin (K), histidin (H), asparaginska kiselina (D) i asparaginska kiselina (D), tim redom.

[0044] Počev od gore naznačenih strukturalnih modifikacija, pronalazači su identifikovali specifične pozicije za modifikaciju da se prilagode funkcionalne osobine IdeS by ispitivanjem tri dimenzionog modela IdeS. Pronalazači su identifikovali da:

(1) Zamena asparagina (N) na poziciji 138 SEQ ID NO: 3 sa pozitivno naelektrisanom aminokiselinom pojačava potenciju polipeptida koji uključuje ovu promenu. Prema tome, polipeptid iz pronalaska može sadržati varijantu amino aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5 koja ima pozitivno naelektrisanu aminokiselinu na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 138 SEQ ID NO: 3. Uobičajene pozitivno naelektrisane aminokiseline su gore identifikovane u Tabeli A1. Pozitivno naelektrisana aminokiselina je poželjno arginin (R) ili lizin (K). Prema tome ova posebna modifikacija se može ovde identifikovati terminom "N138R/K".

(2) Zamena aparagina (N) na poziciji 139 SEQ ID NO: 3 sa pozitivno naelektrisanom aminokiselinom pojačava potenciju polipeptida koji uključuje ovu promenu. Prema tome, polipeptid iz pronalaska može sadržati varijantu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5 koja ima pozitivno naelektrisanu aminokiselinu na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 139 SEQ ID NO: 3. Uobičajeno poznate pozitivno naelektrisane aminokiseline su gore identifikovane u Tabeli A. Pozitivno naelektrisna aminokiselina je poželjno arginin (R) ili lizin (K). Prema tome ova posebna modifikacija može se ovde identifikovati terminom "N139R/K".

1

(3) Delecijom prvih dvadeset ostataka na N terminusu SEQ ID NO: 3 može pojačati potenciju polipeptida koji uključuje ovu promenu i/ili može smanjiti imunogenost bez negativnog uticaja na potenciju. Prvih dvadeset ostataka na N terminusu SEQ ID NO: 3 sastoje se od susedne sekvence DDYQRNATEAYAKEVPHQIT. Prema tome, polipeptid iz pronalaska može sadržati varijantu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5 koja ne ukključuje susednu sekvencu DDYQRNATEAYAKEVPHQIT. Odnosno, prvih dvadeset ostataka na N terminusu SEQ ID NO: 4 ili 5 mogu biti odsutni iz pomenute varijante SEQ ID NO: 4 ili 5. Prvih dvadeset ostataka SEQ ID NOs: 4 i 5 odgovaraju pozicijama 35-54 SEQ ID NO: 3. Prema tome, određena modifikacija može se ovde identifikovati pomoću termina "D35_T54del".

(4) Region koji odgovara pozicijama 63 -73 SEQ ID NO: 3 je važan za aktivnost IgG cisteinske proteaze polipeptida iz pronalaska. Modifikacije u ovom regionu primarno unapređuju sposobnost polipeptida da cepa težak lanac drugog IgG, ali oni takođe pojačavaju cepanje teškog lanca prvog IgG. Specifično, modifikovanjem jednog ili više ostatka u ovom regionu u korist odgovarajućeg ostatka (ili aminokiseline sa sličnim karakteristikama sa odgovarajućim ostatkom) u ekvivalentnom regionu IdeS povećava potenciju polipeptida iz pronalaska. Ekvivalentni region u IdeS odgovara pozicijama 58 -65 SEQ ID NO: 1. Poravnanje u nastavku pokazuje pozicije 63-73 SEQ ID NO: 3 pored pozicija 58-65 SEQ ID NO: 1.

<63>PLTPEQFRYNN<73>(region IdeZ, SEQ ID NO: 3)

<58>P--PANFT-QG<65>(region IdeS, SEQ ID NO: 1)

"-" označava odsutni ostatak

[0045] Prema tome, polipeptid iz pronalaska može sadržati varijantu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5, pri čemu varijanta može imati bar jednu od sledećih modifikacija:

i. delecija ostataka leucina (L) i treonina (T) na pozicijama u pomenutoj varijanti koja odgovara pozicijama 64 i 65 SEQ ID NO: 3;

iii. delecija tirozina (Y) na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 71 SEQ ID NO: 3; iv. glutamin (Q) umesto asparagina (N) na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 72 SEQ ID NO: 3;

[0046] Najmanje jedna modifikacija iz opcija i. do vii. gore se obično bira između opcija i. do v. Polipeptid pronalaska može da sadrži varijantu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5, gde varijanta ima najmanje dve, tri, četiri ili svih pet modifikacija i. do v. Poželjno, navedena varijanta ima najmanje jednu, dve, tri od sve četiri modifikacije ii. do v., i opciono modifikacija je i. takođe prisutna. U posebno poželjnoj pomenutoj varijanti, sve modifikacije i. do v. su prisutne.

[0047] Dakle u sažetku, polipeptid iz pronalaska sadrži varijantu sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5, pri čemu varijanta:

(a) je najmanje 80% identična SEQ ID NO: 4 ili 5;

(b) ima cistein (C) na poziciji u pomenutoj varijanti sekvence koji odgovara poziciji 102 SEQ ID NO: 3; i opciono

(c) ima, na pozicijama u pomenutoj varijanti sekvence koja odgovara pozicijama 92, 272, 294 i 296 SEQ ID NO: 3, lizin (K), histidin (H), asparaginska kiselina (D) i asparaginska kiselina (D), tim redom;

dalje pri čemu pomenuta varijanta SEQ ID NO: 4 ili 5:

(3) ne uključuje susednu sekvencu DDYQRNATEA YAKEVPHQIT; i/ili

(4) ima bar jednu od sledećih modifikacija:

v. glicin (G) umesto asparagina (N) na poziciji u pomenutoj varijanti koji odgovara poziciji 73 SEQ ID NO: 3;

vi. alanin (A) umesto glutaiminske kiseline (E) na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 67 SEQ ID NO: 3;

pri čemu se najmanje jedna modifikacija (4) tipično bira između opcija i. do v, i pri čemu su poželjno sve opcije ii. do v. prisutne po potrebi takođe sa opcijom i.

[0048] Polipeptid iz pronalaska tipično sadrži varijantu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5 gde varijanta uključuje najmanje jednu, dve, tri ili sve četiri modifikacije (1) do (4) koje su gore navedene. Navedena varijanta može uključiti bilo koju kombinaciju dve ili tri modifikacije od (1) do (4). Poželjna varijanta uključuje modifikaciju (3) i najmanje jednu od modifikacija (1) i (2). Alternativno, varijanta može da uključi nijednu od gore navedenih modifikacija od (1) do (3).

[0049] Pronalazači su takođe utvrdili da određene druge modifikacije sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5, koje se mogu primeniti alternativno ili kao dodatak bilo kojoj kombinaciji gore opisanih modifikacija, mogu povećati potenciju polipeptida pronalaska i/ ili može smanjiti prepoznavanje polipeptida pronalaska od strane IdeS-specifične ADA. Prema tome, alternativno ili kao dodatak gore navedenim modifikacijama, polipeptid pronalaska može da sadrži:

(A) varijantu sekvence SEQ ID NO: 4 u kojoj je supstitucija napravljena na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju pozicijama 84, 93, 95, 97, 137, 140, 147, 150, 162, 165, 166, 171, 174, 205, 226, 237, 239, 243, 250, 251, 254, 255, 282, 288, 312, 315, 347, 349 SEQ ID NO: 3, i/ili u kojoj neprekidna sekvenca odgovara pozicijama 36 do 53 SEQ ID NO: 3 je zamenjena sa susednom sekvencom na pozicijama 31 do 48 SEQ ID NO: 2 (ova promena može biti označena sa "D36_I53zamenaS31_V48 SEQ 2"); ili

1

(B) varijantu sekvence SEQ ID NO: 5 u kojoj je supstitucija napravljena na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju pozicijama 77, 93, 95, 99, 140, 141, 147, 150, 162, 171, 174, 175, 176, 177, 206, 224, 237, 241, 242, 245, 246, 249,253, 267, 280, 286, 310, 311, 313, 344, 345, 346, 347.

[0050] Pomenuta varijanta (A) može sadržati supstituciju u svim navedenim pozicijama, ili bilo koju kombinaciju jedne ili više navedenih pozicija, ali obično sadrži supstituciju u ne više od dvanaest, jedanaest ili deset od ovih pozicija.

[0051] Navedena varijanta (B) može da sadrži supstituciju u svim navedenim pozicijama, ili bilo koju kombinaciju jedne ili više navedenih pozicija, ali tipično sadrži supstituciju u ne više od trideset ovih pozicija.

[0052] Supstitucije obično zamenjuju postojeću aminokiselinu drugom aminokiselinom koja ima drugačije osobine. Na primer, nenaelektrisana aminokiselina može biti zamenjena naelektrisanom aminokiselinom, i obrnuto. Poželjne zamene na ovim pozicijama su navedene u Tabeli B1 i B2 u tabeli ispod koristeći jednoslovni kod:

Tabela B1 -varijanta A

1

(nastavak)

Tabela B2 -varijanta B

1

(nastavak)

[0053] Svaka od supstitucija u tabelama B1 i B2 se ovde može označiti korišćenjem upotrebom termina dobijenog kombinovanjem unose u prvoj, drugoj i trećoj koloni za svaki red s leva na desno. Na primer, supstitucija u prvom redu tabele B1 može se ovde nazvati "H84N", supstitucija u drugom redu može se nazvati "A93T", i tako dalje. Specifična modifikacija "D226N" u Tabeli B1 i "D224N" u Tabeli B2 ima za cilj da poremeti poznati motiv ćelijske adhezije u sekvenci IdeZ i IdeS/Z, koja je susedna RGD sekvenci na pozicijama 224-226 SEQ ID NO : 3.

[0054] Tabela C1 i C2 ispod sumira modifikacije koje su napravljene da bi se proizvele aminokiselinske sekvence određenih primera polipeptida iz pronalaska.

Tabela C 1

1

(nastavak)

Tabela C2

[0055] Aminokiselinska sekvenca svake od SEQ ID NOs: 1 do 5 je u potpunosti prikazana ispod, zatim sledi aminokiselinska sekvenca svakog od polipeptida iz pronalaska koji se opisuju u Tabelama C1 i C2. SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO: 2

1

SEQ ID NO: 10 (pCART202)

2

SEQ ID NO: 18 (pCART219)

[0056] Polipeptid iz pronalaska može sadržati, u suštini se sastojati, ili sastojati se iz sekvence prema bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6 do 25. Svaka od SEQ ID NOs: 6 do 25 može opciono uključiti dodatni metionin na N terminusu i/ili histidinski tag na C terminusu. Histidinski tag se poželjno sastoji iz šest ostataka histidin. Histidinski tag je poželjno povezan sa C terminusom sa linkerom sa ostacima 3x glicina ili 5x glicina.

Proizvodnja polipeptida

[0057] Polipeptid kao što je ovde izložen se može proizvesti bilo kojim pogodnim sredstvima. Na primer, polipeptida se može sintetisati direktno upotrebom standardnih postupaka poznatih u oblasti tehnike, kao što je Fmoc hemija na čvrstoj fazi, Boc hemija na čvrstoj fazi ili sinteza peptida u fazi rastvora Alternativno, polipeptid se može proizvesti transformacijom ćelije, obično bakterijske ćelije, sa molekulom nukleinske kiseline ili vektorom koji kodira pomenuti polipeptid. Proizvodnja polipeptida ekspresijom u bakterijskoj ćeliji domaćinu je opisana ispod i predstavljena je u Primerima. Pronalazak obezbeđuje molekule nukleinske kiseline i vektore koji kodiraju polipeptid iz pronalaska. Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu ili vektor. Primer molekula polinukleotida koji kodiraju ovde prikazane polipeptide su obezbeđeni kao SEQ ID NOs: 33 do 55. Svaka od ovih sekvenci uključuje na 3’ kraju kodon za N terminal metionin (ATG) i, pre stop kodona (TAA) na 5’ kraju, kodoni za 3x gly linker i 6x his histidinski tag, koji se po potrebi mogu isključiti.

[0058] Termini "molekul nukleinske kiseline" i "polinukleotid" se ovde koriste istovremeno i odnose se na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, ili dezoksiribonukleotide ili ribonukleotide, ili njihove analoge. Neograničavajući primeri polinukleotida uključuju gen, genski fragment, informacionu RNK (iRNK), cDNK, rekombinantne polinukleotide, plazmide, vektore, izolovanu DNK bilo koje sekvence, izolovanu RNK bilo koje sekvence, probe nukleinskih kiselona, i prajmere. Polinukleotid iz pronalaska može biti obezbeđn u izolovanom ili suštinski izolovanom obliku. Pod suštinski izolovanim, podrazumeva se da može biti suštinski, ali ne u celini, izolacija polipeptida iz bilo kojeg medijuma iz okruženja. Polinukleotidi se mogu pomešati sa nosačima ili rastvaračima koji neće ometati njihovu namenjenu upotrebu i dalje će se smatrati kao suštinski izolovanim. Sekvenca nukleinske kiseline koja "kodira" odabrani polipeptid je molekul nukleinske kiseline koji se prepisuje (u slučaju DNK) i prevodi u proteine (u slučaju iRNK) u polipeptid in vivo kada se postavi pod kontrolu odgovarajućih regulatornih sekvenci, na primer u ekspresionim vektoru. Granice kodirajuće sekvence su određene početnim kodonom na 5’ (amino) terminusu i translacionim stop kodonom na 3’ (karboksi) terminusu. Za svrhe ovog pronalaska, takve sekvence nukleinskih kiselina mogu uključiti, ali niu ograničene na, cDNK iz virusnih, prokariotske ili eukariotske iRNK, genomskih sekvenci iz virusne ili prokariotske DNK ili RNK, i čak sintetičkih sekvenci DNK. Sekvenca za terminaciju transkripcije može biti locirana 3’ u odnosu na kodirajuću sekvencu.

[0059] Polinukleotidi se mogu sintetisati u skladu sa postupcima koji su dobro poznati iz oblasti tehnike, kao što je opisano primerom u Sambrook et al (1989, Molecular Cloning -a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press). Molekuli nukelinske kiseline iz predmetnog pronalaska mogu biti obezbeđeni u obliku ekspresione kasete koja uključuje kontrolne sekvence operativno u vezi sa insertovanom sekvencom, time omogućujući ekspresiju polipeptida iz pronalaska in vivo. Ovde ekspresione kasete, sa druge strane, su obično obezbeđene u vektorima (npr., plazmidima ili rekombinantnim virusnim vektorima). Takva ekspresiona kaseta se može direktno primeniti subjektu domaćinu. Alternativno, vektor koji sadrži polinukleotid iz pronalaska može se primeniti subjektu domaćinu. Poželjno polinukleotid je pripremljen i/ili primenjen korišćenjem genetičkog vektora. Pogodan vektor može biti bilo koji vektor koji je sposoban da nosi dovoljnu količinu genetičke informacije, i omogućava ekspresiju polipeptida iz pronalaska.

2

[0060] Ovaj pronalazak prema tome uključuje ekspresione vektore koji sadrže takve polinukleotidne sekvence. Takvi ekspresioni vektori su rutinski konstruisani u oblasti molekularne biologije i mogu na primer uključiti upotrebu plazmidne DNK i odgovarajućih inhibitora, promotora, pojačivača i drugih elemenata, kao što su na primer signali za poliadenilaciju koji mogu biti potrebni, i koji su pozicionirani u ispravnoj orijentaciji, da se omogući ekspresija peptida iz pronalaska. Drugi pogodni vektori mogu biti očigledni osobama koje su verzirane u stanje tehnike. Kao dalji primer u ovom pogledu pozivamo se na Sambrook et al.

[0061] Pronalazak takođe uključuje ćelije koje su modifikovane da eksprimuju polipeptid iz pronalaska. Takve ćelije obično uključuju prokariotske ćelije kao što su bakterijske ćelije, na primer E. coli. Takve ćelije se mogu kultivisati korišćenjem rutinskih postupaka da se proizvede polipeptid iz pronalaska.

[0062] Polipeptid može biti derivatizovan ili modifikovan da pomaže u njihovoj proizvodnji, izolaciji ili prečišćavanju. Na primer, gde je polipepid iz pronalaska proizveden rekombinantnom ekspresijom u bakterijskoj ćeliji domaćinu, sekvenca polipeptida može uključiti dodatni ostatak metionina (M) na N terminusu da se poboljša ekspresija. Kao drugi primer, polipeptid iz pronalaska može biti derivatizovan ili modifikovan dodavanjem liganda koji je sposoban za direktno vezivanje i određenije na sredstvo za razdvajanje. Alternativno, polipeptid može biti derivatizovan ili modifikovan dodavanjem jednog člana vezujućeg para i sredstvo razdvajanja sadrži reagens koji je derivatizovan ili modifikovan dodavanjem drugog člana vezujućeg para. Može se koristiti bilo koji vezujući par. U poželjnom izvođenju gde polipeptid za upotrebu u pronalasku je derivatizovan ili modifikovan dodavanjem jednog člana vezujućeg para, polipeptid je poželjno tagovan histidinom ili tagovan biotinom. Obično kodirajuća aminokiselinska sekvenca histidinskog ili biotinskog tag-a je uključena na genskom nivou i polipeptid je rekombinantno eksprimiran kod E. coli. Histidin ili biotinski tag se obično nalazi na bilo kom kraju polipeptida, poželjno na C-terminusu. Može biti direktno spojen sa polipeptidom ili spojen indirektno sa bilo kojom pogodnom sekvencom linkera, kao što su 3, 4 ili 5 ostatatka glicina. Histidinski tag se obično sastoji iz šest ostataka histidina, iako može biti duži, obično do 7, 8, 9, 10 ili 20 aminokiselina il kraći, na primer 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselina.

[0063] Aminokiselinska sekvenca polipeptida može biti modifikovana da uključi aminokiseline koje se ne nalaze u prirodi, na primer da bi se poboljšala stabilnost. Kada su polipeptidi proizvedeni sintetičkim sredstvima, takve aminokiseline mogu biti uvedene tokom proizvodnje. Polipeptidi mogu takođe biti modifikovani u skladu sa ili sintetičkom ili rekombinantnom proizvodnjom. Polipeptidi mogu takođe biti proizvedeni korišćenjem D-aminokiselina. U takvim slučajevima aminokiseline će biti spojene u reverznoj sekvenci u orijentaciji C prema N. Ovo je u oblasti tehnike pogodno za proizvodnju takvih polipeptida.

[0064] Brojne modifikacije bočnog lanca su poznate u oblasti tehnike i mogu se napraviti na bočnim lancima polipeptida, pod uslovom da polipeptidi zadrže bilo koju dalju potrebnu aktivnost ili karakeristiku kao što ovde može biti specifikovano. Takođe je jasno da polipeptidi mogu biti hemijski modifikovani, npr. post-translaciono modifikovani. Na primer, mogu biti glikozilovani, fosforilovani ili sadržati modifikovane aminokiselinske ostatke.

[0065] Polipeptid može biti PEGilovan. Polipeptid iz pronalaska može biti u suštinski izolovanom obliku. Može biti pomešan sa nosačima ili rastvaračima (kao što je ispod razmatrano) koji neće ometati namenjenu upotrebu i dalje će se smatrati kao suštinski izolovanim. Može takođe biti u suštinski prečišćenom obliku, u kom slučaju će generalno sadržati najmanje 90%, npr. najmanje 95%, 98% ili 99%, proteina u preparatu.

Kompozicije i formulacije koje sadrže polipeptide

[0066] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže polipeptid iz pronalaska. Na primer, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži jedan ili više polipeptida iz pronalaska, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač ili rastvarač. Nosači (s) moraju biti ’prihvatljivi’ u smislu da budu kompatibilni sa drugim sastojcima iz kompozicije i da ne budu štetni za subjekta kojem se ova kompozicija daje. Uobičajeno, nosači i konačna kompozicija, su sterilni i bez pirogena.

[0067] Formulacija pogodne kompozicije može biti izvedena upotrebom korišćenjem standardne hemijske farmaceutske formulacije i postupaka od kojih su svi lako dostupni dobro obučenom stručnjaku iz oblasti tehnike. Na primer, sredstvo se može kombinovati sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa ili nosača. Pomoćne supstance, kao što su agensi za vlaženje ili emulgovanje, supstance pufera za pH, redukujuće agense i slično, mogu biti prisutni u ekscipijensu ili nosaču. Pogodni redukcioni agensi uključuju cistein, tioglicerol, tioreducin, glutation i slično. Ekscipijensi, nosači i pomoćne supstance su generalno farmaceutski agensi koji ne indukuju imunski odgovor kod individue koja prima kompoziciju, i koji se mogu davati bez neželjene toksičnosti. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, tčnosti kao što su voda, slani rastvor, polietilenglikol, hijaluronska kiselina, glicerol, tioglicerol i etanol. Takođe mogu biti uključene farmaceutski prihvatljive soli, na primer, soli mineralnih kiselina kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati, sulfati, i slično; i soli organskih kiselina kao što su acetati, propionati, malonati, benzoati, i slično. Detaljno razmatranje farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, nosača i pomoćnih supstanci je dostupno kod Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J.1991).

[0068] Takve kompozicije mogu biti pripremljene, spakovane, ili prodate u obliku pogodnom za bolus davanje ili za neprekidnu primenu. Injektabilne kompozicije mogu biti pripremljene, spakovane, ili prodate u jediničnom doznom obliku, kao što su ampule ili u višedoznim kontejnerima koji sadrže konzervans. Kompozicije uključuju, ali nisu ograničene na, suspenzije, rastvore, emuzije u ulju ili vodenim nosačima, paste, i implantabilne formulacije sa odloženim oslobađanjem ili biorazgradive. Takve kompozicije mogu dalje sadržati jedan ili više dodatnih sastojaka uključujući, ali bez ograničenja na, agense za suspenziju, stabilizaciju, ili dispergovanje. U jednom izvođenju kompozicije za parentalno davanje, aktivni sastojak je obezbeđen u suvom (za npr., prašak ili granule) obliku za rekonstituisanje sa pogodnim nosačem (npr., sterilna voda oslobođena od pirogena) pre parentalne primene rekonstituisane kompozicije. Kompozicije mogu biti pripremljene, spakovane, ili prodate u obliku sterilne injktabilne vodene ili uljane suspenzije ili rastvora. Ova suspenzija ili rastvor mogu biti formulisani u skladu sa poznatom oblasti tehnike, i mogu sadržati, pored aktivnog sastojka, dodatne sastojke kao što su agensi za disperziju, agensi za vlaženje, ili ovde opisani agensi za suspenziju. Takve sterilne injektabilne formulacije se mogu pripremiti korišćenjem netoksičnog parentalno prihvatljivnog razblaživača ili rastvarača, kao što je voda ili 1,3-butan diol, na primer. DRugi prihvatljivi razblaživati i rastvarači uključuju, ali nisu ograničeni na, Ringerov rastvor, izotonični rastvor natrijum hlorida, i fiksna ulja kao što su sintetički mono-ili di-gliceridi.

[0069] Druge kompozicije koje se primenjuju parentalno koje su korisne uključuju one koje sadrže aktivni sastojak u mikrokristalnom obliku, u lipozomalnom preparatu, ili kao komponentu biorazgradivih polimernih sistema. Kompozicije za produženo oslobađanje ili implantaciju mogu sadržati farmaceutski prihvatljive polimerne ili hidrofobne materijale kao što su emulzija, jonoizmenjivačka smola, umereno rastvorljiv polimer ili slabo rastvorljiva so. Kompozicije mogu biti pogodne za primenu na bilo koji pogodan način uključujući, na primer, intradermalni, subkutani, perkutani, intramuskularni, intraarterijski, intraperitonealni, intraartikularni, intraosealni ili druge odgovarajuće načine primene. Poželjne kompozicije su pogodne za primenu intravenskom infuzijom.

2

Postupci upotrebe polipeptida

[0070] Pronalazak obezbeđuje upotrebu polipeptida pronalaska u različitim postupcima. Na primer, predmetni polipeptidi mogu pružiti korisne alate za biotehnologiju. Polipeptidi se mogu koristiti za specifično ex vivo cepanje IgG, posebno humanog IgG. U takvom postupku, polipeptid se može inkubirati sa uzorkom koji sadrži IgG pod uslovima koji dozvoljavaju da se javi specifična aktivnost cistein proteaze. Specifično cepanje se može verifikovati, a proizvodi cepanja izolovati korišćenjem bilo koje pogodne metode, kao što su oni opisani u WO2003051914 i WO2009033670. Stoga se postupak može posebno koristiti za generisanje Fc i F(ab’)2fragmenata. Fab fragmenti se zatim mogu proizvesti izvođenjem koraka redukcije (na primer u 2-merkaptoetanolaminu ili cisteaminu) na F(ab’)2fragmentima koji su rezultat cepanja IgG polipeptidom iz pronalaska.

[0071] Postupak se takođe može koristiti za otkrivanje ili analizu IgG u uzorku, ili za uklanjanje IgG iz uzorka. Metoda za detekciju IgG u uzorku tipično uključuje inkubaciju polipeptida sa uzorkom pod uslovima koji dozvoljavaju IgG-specifično vezivanje i cepanje. Prisustvo IgG se može verifikovati detekcijom specifičnih proizvoda cepanja IgG, koji se naknadno mogu analizirati.

[0072] Polipeptidi u skladu sa ovim pronalaskom se takođe mogu koristiti u terapiji ili profilaksi. U terapijskim primenama, polipeptidi ili kompozicije se daju subjektu koji već pati od poremećaja ili stanja, u količini dovoljnoj da izleči, ublaži ili delimično zaustavi stanje ili jedan ili više njegovih simptoma. Takav terapijski tretman može dovesti do smanjenja težine simptoma bolesti ili povećanja učestalosti ili trajanja perioda bez simptoma. Količina koja je adekvatna da se ovo postigne je definisana kao "terapijski efikasna količina". U profilaktičkim primenama, polipeptidi ili kompozicije se daju subjektu koji još uvek ne pokazuje simptome poremećaja ili stanja, u količini dovoljnoj da spreči ili odloži razvoj simptoma. Takva količina je definisana kao „profilaktički efikasna količina“. Subjekat može biti identifikovan kao izložen riziku od razvoja bolesti ili stanja na bilo koji pogodan način. Stoga pronalazak takođe obezbeđuje polipeptid pronalaska za upotrebu u lečenju humanog ili životinjskog tela. Ovde je takođe otkriven postupak prevencije ili lečenja bolesti ili stanja kod subjekta, koji se sastoji od davanja polipeptida pronalaska subjektu u profilaktički ili terapeutski efikasnoj količini. Polipeptid se može primenjivati zajedno sa agensom za supresiju imuniteta. Polipeptid se poželjno primenjuje intravenskom infuzijom, ali se može primeniti na bilo koji pogodan način uključujući, na primer, intradermalni, subkutani, perkutani, intramuskularni, intraarterijski, intraperitonealni, intraartikularni, intraosealni ili drugi odgovarajući način primene. Količina pomenutog polipeptida koja se primenjuje može biti između 0.01 mg/kg TM i 2 mg/kg TM, između 0.04 i 2 mg/kg TM, između 0.12 mg/kg TM i 2 mg/kg TM, poželjno između 0.24 mg/kg i 2 mg /kg TM i najpoželjnije između 1mg/kg i 2mg/kg TM. Polipeptid se može davati u više navrata istom subjektu, pod uslovom da količina ADA u serumu subjekta koja je sposobna da se veže za polipeptid ne prelazi prag koji odredi lekar kliničar. Količina ADA u serumu subjekta koja je sposobna da se veže za polipeptid može se odrediti bilo kojim pogodnim postupkom, kao što je CAP FEIA test (ImmunoCAP) specifičan za agens ili test titra.

[0073] Polipeptidi pronalaska mogu biti posebno korisni u lečenju ili prevenciji bolesti ili stanja posredovanih patogenim IgG antitelima. Shodno tome, pronalazak obezbeđuje polipeptid pronalaska za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti ili stanja posredovanih patogenim IgG antitelima. Izlaganje takođe obezbeđuje postupak lečenja ili prevencije bolesti ili stanja posredovanih patogenim IgG antitelima koji se sastoji od davanja polipeptida pronalaska pojedincu. Postupak može da obuhvata ponovljeno davanje navedenog polipeptida. Pronalazak takođe obezbeđuje polipeptid pronalaska za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja posredovanih patogenim IgG antitelima, posebno autoimune bolesti koja je u celini ili delimično posredovana patogenim IgG antitelima.

2

[0074] Patogena antitela mogu tipično biti specifična za antigen koji je usmeren na autoimunu bolest ili drugo stanje posredovano u celini ili delimično antitelima. Tabela D predstavlja listu takvih bolesti i pridruženih antigena. Polipeptid pronalaska se može koristiti za lečenje bilo koje od ovih bolesti ili stanja. Polipeptid je posebno efikasan za lečenje ili prevenciju autoimune bolesti koja je u celini ili delimično posredovana patogenim IgG antitelima.

Tabela D

2

Esencijalna mešana krioglobulinemija Esencijalni mešoviti antigeni krioglobulinemije

(nastavak)

2

(nastavak)

[0075] U drugom izvođenju, polipeptid iz pronalaska može biti korišćen u postupku da se unapredi benefit subjektu terapije ili terapeutski agens. Postupak sadrži dva koraka koji su ovde naznačeni kao (a) i (b).

[0076] Korak (a) obuhvata davanje subjektu polipeptida iz pronalaska. Količina polipeptida koji se daje je poželjno dovoljna da cepa suštinski sve molekule IgG koji su prisutni u plazmi subjekta. Korak (b) obuhvata naknadnu primenu subjektu pomenute terapije ili terapeutskog agensa. Koraci (a) i (b) su odvojeni vremenskim intervalom koji je poželjno dovoljan za dešavanje cepanja suštinski svih molekula IgG koji su prisutni u plazmi subjekta. Pomenuti interval može biti obično najmanje 30 minuta i najviše 21 dan.

[0077] Terapeutski agens zbog kojeg je benefit unapređen je obično antitelo koje se daje za lečenje kancera ili druge bolesti. Terapeutski agens mož biti IVIg. U ovom kontekstu, ovde je takođe prikazan postupak za lečenje kancera ili druge bolesti kod subjekta, postupak obuhvata (a) davanje subjektu polipeptida iz pronalaska; i (b) naknadno davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela koji je tretman za pomenuti kancer ili pomenutu drugu bolest; gde:

- količina pomenutog davanog polipeptida je dovoljna za cepanje suštinki svih molekula IgG prisutnih u plazmi subjekta; i

-koraci (a) i (b) su razdvojeni vremenskim intervalom od najmanje 2 h i najviše 21 dan.

[0078] Drugim rečima, pronalazak takođe obezbeđuje polipeptid za upotrebu u postupku za lečenje kancera ili druge bolesti. Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu agensa u proizvodnji leka za lečenje kancera ili druge bolesti takvim postupkom. Kancer može biti akutna limfoblastna leukemija, akutna mijeloidna leukemija, adrenokortikalni karcinom, karcinomi povezani sa AIDS-om, limfom povezan sa AIDS-om, analni kancer, kancer slepog creva, astrocitom, cerebelarni ili cerebralni karcinom u detinjstvu, karcinom bazalnih ćelija, kancer žučnih kanala, ekstrahepatični, kancer bešike, Rak kostiju,

2

Osteosarkom/maligni fibrozni histiocitom, Gliom moždanog stabla, Kancer mozga, tumor mozga, cerebelarni astrocitom, tumor mozga, cerebralni astrocitom/malignani gliom, tumor mozga, ependimom, tumor mozga, meduloblastom, tumor mozga, supratentorialni primitivni neuroektodermalni tumori, tumor mozga, gliom vidnog puta i hipotalamusa, kancer dojke, bronhijalni adenomi/karcinoidi, Burkitov limfom, Karcinoidni tumor, Karcinoidni tumor, gastrointestinalni, Karcinom nepoznatog primarnog, limfom centralnog nervnog sistema, Cerebelarni astrocitom, Cerebralni astrocitom/Maligni gliom, Cervikalni kancer, Hronična limfocitna leukemeija, Hronična mijelogena leukemija Hronični mijeloproliferativni poremećaji, Kancer debelog creva, Kožni T-ćelijski limfom, Desmoplastični mali okrugli ćelijski tumor, Endometrijalni kancer, Ependimom, kancer jednjaka, Ewingov sarkom u Ewing familiji tumora, Ekstrakrajnijalni tumor germinativnih ćelija, u detinjstvu, Ekstragonadalni tumor zametnih ćelija, kancer ekstrahepatičnog žučnog kanala, Kancer oka, Intraokularni melanom, kancer oka, Retinoblastom, kancer žučne kese, kancer želudca (Stomaka), Gastrointestinalni karcinoidni tumor, Gastrointestinalni stromalni tumor (GIST), tumor germinativne ćelije: ekstrakranijalni, ekstragonadalni, ili jajnika, Gestacioni trofoblastni tumor, Gliom moždanog stabla, Gliom, Cerebralni Astrocitom u detinjstvu, Gliom, vidnog puta u detinjstvu i hipotalamusa, karcinoid želudca, leukemija dlakastih ćelija, kancer glave i vrata, kancer srca, Hepatocelularni kancer (jetre), Hodčkinov limfom, Hipofaringealni kancer, gliom hipotalamusa i vidnog puta, Intraokularni Melanom, Karcinom ćelija ostrvaca (Endokrinog pankreasa), Kapošijev sarkom, kancer bubrega (kancer ćelija bubrega), kancer larinksa, Leukemije, Leukemija, akutna limfoblastna (takođe nazvana akutna limfocitna leukemija), Leukemija, akutna mijeloidna (takođe nazvana akutna mijelogena leukemija), Leukemija, hronična limfocita (takođe nazvana hronična limfocitna leukemija), Leukemija, hronična mijelogena (takođe nazvana mijeloidna leukemija), Leukemija, dlakaste ćelije, kancer usta i usne šupljine, Liposarkom, Kancer jetre (Primarni), Kancer pluća, Nemikrocelularni kancer pluća, mikrocelularni, Limfomi, Limfom, u vezi sa AIDS, Limfom, Burkit, Limfom, kožni T-ćelijski, limfom, Hodčkinov, Limfomi, Ne-Hodčkinov (stara klasifikacija svih limfoma osim Hodčkinovog), Limfom, Primarnog centralnog nervnog sistema, Makroglobulinemija, Waldenströmova, Maligni fibrozni histiocitom kostiju/Osteosarkom, Meduloblastom, Melanom, Melanoa, Intraokularni (Očni), Karcinom Merkel ćelija, Mezoteliom, Adultni Maligni, Mezoteliom, Metastatski skvamozni kancer vrata sa okultnim primarnim, kancer usta, Multipli sindrom endokrine neoplazije, Multipli mijelom/neoplazma plazma ćelija, Mycosis Fungoides, Mijelodisplastični sindromi, Mijelodisplastične/Mijeloproliferativne bolesti, Mijelogena Leukemija, Hronična, Mijeloidna leukemija, Adultna akutna, Mijeloidna leukemija, akutna u detinjstvu, Mijelom, Multipli (Kancer kostne srži), Mijeloproliferativni poremećaji, Kancer nosne šupljine i paranazalnog sinusa, Nazofaringealni karcinom, Neuroblastom, Ne-Hodčkinov limfom, Nemikrocelularni kancer pluća, Oralni Kancer, Orofaringealni kancer, Osteosarkom/maligni fibrozni histiocitom kostiju, Kancer jajnika, Epitelni kancer jajnika (Površinski epitelni-stromalni tumor), tumor germinativnih ćelija jajnika, Nisko maligni potencijalni tumor jajnika, Kancer pankreasa, Kancer pankreasa, ćelija ostrvaca, Paranazalni sinus i kancer nosne šupljine, Paratiroidni kancer, kancer penisa, faringealni kancer, feohromocitom, Pinealni astrocitom, Pinealni germinom, Pineoblastom i supratentorijalni primitivni neuroektodermalni tumori, Adenom hipofize, Neoplazija plazma ćelija/Multipli mijelom, Pleuropulmonarni blastom, Limfom primarnog centralnog nervnog sistema, Kancer prostate, Kancer rektuma, Karcinom bubrežnih ćelija (kancer bubrega), Bubrežne karlice i uretre, kancer prelaznih ćelija, Retinoblastom, Rabdomiosarkom, Kancer pljuvačne žlezde, Sarkom, Ewing familija tumora, Kapošijev Sarkom, Sarkom, mekog tkiva, Sarkom, jajnika, kancer kože (nemelanom), kancer kože (melanom), karcinom kože, merkelova ćelija, mikrocelularni karcinom pluća, kancer tankog creva, sarkom mekog tkiva, karcinom skvamoznih ćelija, skvamozni kancer vrata sa okultnim primarnim, metastatski, kancer želuca, supratentorijalni primitivni neuroektodermni tumor, T-ćelijski limfom, kožni - vidi Mycosis Fungoides i Sezarijev sindrom, kancer testisa, kancer grla, timom, timom i karcinom timusa, kancer štitne žlezde, kancer štitaste žlezde, kancer prelaznih ćelija bubrežne karlice i uretera, trofoblastični tumor karlice bubrega, kancer prelaznih ćelija kancer uretre, kancer materice, endometrijuma, sarkomo materice, kancer vagine, gliomom vidnog puta i hipotalamusa, kancer vulve, Valdenstromova makroglobulinemija i Vilmsov tumorom (kancer bubrega).

[0079] Kancer je poželjno kancer prostate, kancer dojke, kancer mokraćne bešike, kancer debelog creva, kancer rektuma, kancera pankreasa, kancer jajnika, kancer pluća, kancer grlića materice, kancer endometrijuma, kancer bubrega (bubrežne ćelije), kancer jednjaka, kancer štitne žlezde, kancer kože, limfom, melanom ili leukemija.

[0080] Antitelo koje je davano u koraku (b) je poželjno specifično za tumorski antigen koji je u vezi sa jednim ili više gore pomenutih tipova kancera. Mete od interesa za antitelo za upotrebu u postupku uključuju CD2, CD3, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD32, CD33, CD40, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD80, CD86, CD105, CD138, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, MUC16, GPNMB, PSMA, Cripto, ED-B, TMEFF2, EphA2, EphB2, FAP, av integrin, Mezotelin, EGFR, TAG-72, GD2, CA1X, 5T4, α4β7 integrin, Her2. Druge mete su citokini, kao što su interleukini IL-I do IL-13, faktori nektroze tumora α & β, interferoni α, β i γ, tumorski faktor rasta Beta (TGF-β), faktor stimulacije rasta kolonije (CSF) i faktor stimulacije kolonija granulocita i makrofaga (GMCSF). Vidi Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research (Aggrawal et al. eds., Blackwell Scientific, Boston, MA 1991). Druge mete su hormoni, enzimi, i intra i interćelijski glasnici, kao što su, adenil ciklaza, guanil ciklaza, i fosfolipaza C. Druge mete od interesa su leukocitni antigeni, kao što su CD20, i CD33. Lekovi mogu takođe biti mete od interesa. Ciljni molekuli mogu biti humani, sisarski ili bakterijski. Druge mete su antigeni, kao što su proteini, glikoproteini i ugljeni hidrati iz mikrobnih patogena, oba virusna i bakterijska, i tumori. Ostale mete se opisuju u U.S.4,366,241.

[0081] Antitelo može biti direktno vezano ili indirektno za citotoksičnu grupu ili za detektibilni obeleživač. Antitelo se može primeniti na jedan ili više puteva primene koristeći jedan ili više različitih postupaka poznatih u tehnici. Put i/ili način primene će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. Poželjni načini davanja antitela uključuju intravenske, intramuskularne, intradermalne, intraperitonealne, subkutane, spinalne ili druge parenteralne puteve primene, na primer injekcijom ili infuzijom. Izraz "parenteralna primena" kako se ovde koristi označava načine primene koji nisu enteralni i lokalni, obično injekcijom. Alternativno, antitelo se može primeniti neparenteralnim putem, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni put primene. Lokalna primena je takođe poželjna, uključujući peritumoralnu, jukstatumoralnu, intratumoralnu, intralezijsku, perilezijsku, infuziju u šupljinu, primenu intravezikula i inhalaciju.

[0082] Odgovarajuću dozu antitela prema pronalasku može odrediti kvalifikovani lekar. Stvarni nivoi doze antitela mogu da variraju tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način primene, a da nije toksična za pacijenta. Odabrani nivo doze zavisiće od niza farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određenog antitela, način primene, vreme primene, brzinu izlučivanja antitela, trajanje tretmana, druge lekove, jedinjenja i /ili materijali koji se koriste u kombinaciji sa određenim upotrebljenim kompozicijama, starost, pol, težina, stanje, opšte zdravlje i prethodna medicinska istorija pacijenta koji se leči, i slični faktori dobro poznati u medicinskoj oblasti tehnike.

[0083] Pogodna doza antitela može biti, na primer, u opsegu od oko 0.1 µg/kg do oko 100 mg/kg telesne težine pacijenta koji se leči. Na primer, pogodna doza može biti od oko 1 µg/kg do oko 10 mg/kg telesne težine dnevno ili od oko 10 µg/kg do oko 5 mg/kg telesne težine dnevno.

1

[0084] Režimi doziranja se mogu prilagoditi da bi se obezbedio optimalan željeni odgovor (npr. terapijski odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus, ili korak (b) metode može da sadrži nekoliko podeljenih doza primenjenih tokom vremena ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno zahtevima terapijske situacije, pod uslovom da je potreban interval između koraka (a) i (b) nije prekoračen. Posebno je korisno formulisati parenteralne kompozicije u obliku jedinične doze radi lakše primene i uniformnosti doziranja. Jedinični oblik doze kako se ovde koristi odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinstvene doze za subjekte koji se leče; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapeutski efekat u kombinaciji sa potrebnim farmaceutskim nosačem.

[0085] Antitelo iz koraka (b) se može primeniti u kombinaciji sa hemoterapijom ili terapijom zračenjem. Postupak može dalje da obuhvata primenu dodatnog antitela protiv kancera ili drugog terapeutskog agensa, koji se može primeniti zajedno sa antitelom iz koraka (b) u jednoj kompoziciji ili u odvojenim kompozicijama kao deo kombinovane terapije. Na primer, antitelo iz koraka (b) se može primeniti pre, posle ili istovremeno sa drugim agensom.

[0086] Antitelo može biti Abagovomab, Abciksimab, Aktoksumab, Adalimumab, Adecatumumab, Afelimomab, Afutuzumab, Alacizumab pegol, ALD518, Alemtuzumab, Alirocumab, Altumomab pentetat, Amatuksimab, Anatumomab mafenatoks, Anrukinzumab, Apolizumab, Arcitumomab, Aselizumab, Atinumab, Atlizumab (=tocilizumab), Atorolimumab, Bapineuzumab, Basiliksimab, Bavituksimab, Bektumomab, Belimumab, Benralizumab, Bertilimumab, Besilesomab, Bevacizumab, Bezlotoksumab, Biciromab, Bimagrumab, Bivatuzumab mertansin, Blinatumomab, Blosozumab, Brentuksimab vedotin, Briakinumab, Brodalumab, Canakinumab, Cantuzumab mertansin, Cantuzumab ravtansin, Caplacizumab, Capromab pendetid, Carlumab, Catumaksomab, CC49, Cedelizumab, Certolizumab pegol, Cetuksimab, Ch.14.18, Citatuzumab bogatoks, Ciksutumumab, Clazakizumab, Clenoliksimab, Clivatuzumab tetraksetan, Conatumumab, Concizumab, Crenezumab, CR6261, Dacetuzumab, Daclizumab, Dalotuzumab, Daratumumab, Demcizumab, Denosumab, Detumomab, Dorlimomab aritoks, Drozitumab, Duligotumab, Dupilumab, Dusigitumab, Ecromeksimab, Eculizumab, Edobacomab, Edrecolomab, Efalizumab, Efungumab, Elotuzumab Elsilimomab, Enavatuzumab, Enlimomab pegol, Enokizumab, Enoticumab, Ensituksimab, Epitumomab cituksetan, Epratuzumab, Erlizumab, Ertumaksomab, Etaracizumab, Etrolizumab, Evolocumab, Eksbivirumab, Fanolesomab, Faralimomab Farletuzumab, Fasinumab, FBTA05, Felvizumab, Fezakinumab, Ficlatuzumab, Figitumumab, Flanvotumab, Fontolizumab, Foralumab, Foravirumab, Fresolimumab, Fulranumab, Futuksimab, Galiksimab, Ganitumab, Gantenerumab, Gavilimomab, Gemtuzumab ozogamicin, Gevokizumab, Girentuksimab, Glembatumumab vedotin, Golimumab, Gomiliksimab, GS6624, Ibalizumab, Ibritumomab tiuksetan, Icrucumab, Igovomab, Imciromab, Imgatuzumab, Inclacumab, Indatuksimab ravtansin, Infliksimab, Intetumumab, Inolimomab, Inotuzumab ozogamicin, Ipilimumab, Iratumumab, Itolizumab, Iksekizumab, Keliksimab, Labetuzumab, Lampalizumab, Lebrikizumab, Lemalesomab, Lerdelimumab, Leksatumumab, Libivirumab, Ligelizumab, Lintuzumab, Lirilumab, Lodelcizumab, Lorvotuzumab mertansin, Lucatumumab, Lumiliksimab, Mapatumumab, Maslimomab, Mavrilimumab, Matuzumab, Mepolizumab, Metelimumab, Milatuzumab, Minretumomab, Mitumomab, Mogamulizumab, Morolimumab, Motavizumab, Moksetumomab pasudotoks, Muromonab-CD3, Nacolomab tafenatoks, Namilumab, Naptumomab estafenatoks, Narnatumab, Natalizumab, Nebacumab, Necitumumab, Nerelimomab, Nesvacumab, Nimotuzumab, Nivolumab, Nofetumomab merpentan, Obinutuzumab, Ocaratuzumab, Ocrelizumab, Odulimomab, Ofatumumab, Olaratumab, Olokizumab, Omalizumab, Onartuzumab, Oportuzumab monatoks, Oregovomab, Orticumab, Oteliksizumab, Okselumab, Ozanezumab, Ozoralizumab, Pagibaximab, Palivizumab, Panitumumab, Panobacumab, Parsatuzumab, Pascolizumab, Pateclizumab, Patritumab, Pemtumomab, Perakizumab, Pertuzumab, Pekselizumab,

2

Pidilizumab, Pinatuzumab vedotin, Pintumomab, Placulumab, Polatuzumab vedotin, Ponezumab, Priliksimab, Pritoksksimab, Pritumumab, PRO140, Quilizumab, Racotumomab, Radretumab, Rafivirumab, Ramucirumab, Ranibizumab, Raksibacumab, Regavirumab, Reslizumab, Rilotumumab, Rituksimab, Robatumumab, Roledumab, Romosozumab, Rontalizumab, Rovelizumab, Ruplizumab, Samalizumab, Sarilumab, Satumomab pendetid, Secukinumab, Seribantumab, Setoksaksimab, Sevirumab, Sibrotuzumab, Sifalimumab, Siltuksimab, Simtuzumab, Siplizumab, Sirukumab, Solanezumab, Solitomab, Sonepcizumab, Sontuzumab, Stamulumab, Sulesomab, Suvizumab, Tabalumab, Tacatuzumab tetraksetan, Tadocizumab, Talizumab, Tanezumab, Taplitumomab paptoks, Tefibazumab, Telimomab aritoks, Tenatumomab, Teneliksimab, Teplizumab, Teprotumumab, TGN1412, Ticilimumab (= tremelimumab), Tildrakizumab, Tigatuzumab, TNX-650, Tocilizumab (= atlizumab), Toralizumab, Tositumomab, Tralokinumab, Trastuzumab, TRBS07, Tregalizumab, Tremelimumab Tucotuzumab celmoleukin, Tuvirumab, Ublituksimab, Urelumab, Urtoksazumab, Ustekinumab, Vapaliksimab, Vatelizumab, Vedolizumab, Veltuzumab,Vepalimomab Vesencumab, Visilizumab, Volociksimab, Vorsetuzumab mafodotin, Votumumab, Zalutumumab, Zanolimumab, Zatuksimab, Ziralimumab ili Zolimomab aritoks.

[0087] Poželjna antitela obuhvataju Natalizumab, Vedolizumab, Belimumab, Atacicept, Alefacept, Oteliksizumab, Teplizumab, Rituksimab, Ofatumumab, Ocrelizumab, Epratuzumab, Alemtuzumab, Abatacept, Eculizamab, Omalizumab, Canakinumab, Meplizumab, Reslizumab, Tocilizumab, Ustekinumab, Briakinumab, Etanercept, Inlfliksimab, Adalimumab, Certolizumab pegol, Golimumab, Trastuzumab, Gemtuzumab, Ozogamicin, Ibritumomab, Tiuksetan, Tostitumomab, Cetuximab, Bevacizumab, Panitumumab, Denosumab, Ipilimumab, Brentuksimab i Vedotin.

[0088] Terapija čija je korist poboljšana obično je transplantacija organa. Organ se može izabrati između bubrega, jetre, srca, pankreasa, pluća ili tankog creva. Subjekat koji se leči može poželjno biti senzibilizovan ili visoko senzibilizovan. Pod "senzibilizovanim" se podrazumeva da je subjekt razvio antitela na humane antigene glavne histokompatibilnosti (MHC) (koji se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA)). Anti-HLA antitela potiču iz alogenski senzibilisanih B-ćelija i obično su prisutna kod pacijenata koji su prethodno bili senzibilizovani transfuzijom krvi, prethodnom transplantacijom ili trudnoćom (Jordan et al., 2003).

[0089] Bilo kojim pogodnim metodom može se utvrditi da li je potencijalni primalac transplantacije senzibilisan ili ne. Na primer, testom panela reaktivnih antitena (eng. Panel Reactive Antibody Test) (PRA) se može koristiti da se utvrdi da li je primalac osetljiv. PRA rezultat >30% se obično smatra da znači da je pacijent „visokog imunološkog rizika“ ili „senzibilizovan“. Alternativno, može se sprovesti unakrsni test u kome se uzorak krvi potencijalnog davaoca transplantacije pomeša sa uzorkom krvi predviđenog primaoca. Pozitivna unakrsna podudarnost znači da primalac ima antitela koja reaguju na uzorak donora, što ukazuje da je primalac osetljiv i da ne bi trebalo da dođe do transplantacije. Unakrsni testovi se obično sprovode kao konačna provera neposredno pred transplantaciju.

[0090] Prisustvo antitela visokog titra protiv MHC antigena potencijalnog donora (tj. donorska specifična antitela (DSA)) je direktna kontraindikacija za transplantaciju zbog rizika od akutnog odbacivanja posredovanog antitelima. Ukratko, senzibilizacija na donorske MHC antigene otežava identifikaciju odgovarajućeg donora. Pozitivan unakrsni test je nedvosmislena prepreka za transplantaciju. Pošto je otprilike jedna trećina pacijenata koji čekaju na transplantaciju bubrega senzibilizovana, a čak 15% je visoko senzibilizovano, to dovodi do gomilanja pacijenata koji čekaju na transplantaciju. U SAD, srednje vreme na listi čekanja za transplantaciju bubrega u 2001-2002 bilo je 1329 dana za one sa rezultatom Panel Reactive Antibody (PRA) 0-9%, 1920 dana za one sa PRA 10-79% i 3649 dana za one sa PRA 80% ili više (OPTN-baza podataka, 2011).

[0091] Jedna prihvaćena strategija za prevazilaženje DSA barijere je primena razmene plazme ili imunološke adsorpcije, često u kombinaciji sa npr. intravenskim gama globulinom (IVIg) ili rituksimabom, da bi se snizili nivoi DSA na nivo na kome se može razmotriti transplantacija (Jordan et al., 2004; Montgomery et al., 2000; Vo et al., 2008a; Vo et al., 2008b). Međutim, izmena plazme, imunska adsorpcija i tretmani IVIg imaju nedostatak u tome što su neefikasni i zahtevaju rigorozno planiranje jer uključuju ponovljene tretmane tokom dužeg vremenskog perioda. Kada organ od preminulog donora postane dostupan, mora se transplantirati u roku od nekoliko sati, pošto je produženo vreme hladne ishemije jedan od najvažnijih faktora rizika za odloženu funkciju grafta i gubitak alografta u transplantaciji bubrega (Ojo et al., 1997).

[0092] Nasuprot tome, postupak kako je ovde otkriven omogućava brzo, privremeno i bezbedno uklanjanje DSA kod potencijalnog primaoca transplanta. Primena polipeptida prema pronalasku neposredno pre transplantacije ima kapacitet da efikasno desenzibilizuje visoko senzibilizovanog pacijenta, čime se omogućava transplantacija i izbegava akutno odbacivanje posredovano antitelima. Jedna doza polipeptida pre transplantacije omogućiće transplantaciju hiljadama pacijenata sa donorskim specifičnim IgG antitelima.

[0093] U ovom kontekstu, ovde je takođe izložen postupak za lečenje otkazivanja rada organa kod subjekta, koji obuhvata (a) davanje subjektu polipeptida pronalaska i (b) naknadno transplantaciju zamenskog organa subjektu; pri čemu:

- količina pomenutog polipeptida koja se primenjuje je dovoljna da cepa suštinski sve IgG molekule prisutne u plazmi subjekta; i

-koraci (a) i (b) su razdvojeni vremenskim intervalom od najmanje 2 sata i najviše 21 dan.

[0094] Drugim rečima, ovde je izložen postupak za prevenciju odbacivanja transplantiranog organa kod subjekta, posebno akutnog odbacivanja transplanta posredovano antitelom, postupak koja obuhvata, najmanje 2 sata, a najviše 21 dan pre transplantacije organa, davanje subjektu polipeptida pronalaska, pri čemu je primenjena količina pomenutog polipeptida dovoljna da cepa suštinski sve IgG molekule prisutne u plazmi subjekta. Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu polipeptida pronalaska u takvom postupku lečenja otkazivanja organa ili prevencije odbacivanja transplantata, posebno akutnog odbacivanja transplantata posredovanog antitelom. Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu polipeptida pronalaska u proizvodnji leka za lečenje otkazivanja organa ili za prevenciju odbacivanja transplantata takvim postupkom. U ovom izvođenju, postupak prema pronalasku može dodatno da obuhvati korak koji se sprovodi u toku ili neposredno pre transplantacije, pri čemu korak obuhvata indukciju supresije T ćelija i/ili B ćelija kod pacijenta. Navedena indukcija supresije može tipično da obuhvata primenu efikasne količine agensa koji ubija ili inhibira T ćelije, i/ili primenu efikasne količine agensa koji ubija ili inhibira B ćelije. Sredstva koja ubijaju ili inhibiraju T ćelije uključuju Muromonab, Basiliksimab, Daklizumab, antitimocitno globulinsko (ATG) antitelo i imunoglobulin limfocita, preparat protiv timocitnog globulina (ATGAM). Poznato je da rituksimab ubija ili inhibira B ćelije.

Primeri

[0095] Osim ako nije drugačije naznačeno, postupci koji su korišćeni su standardni postupci biohemije i molekularne biologije. Primeri odgovarajućih metodoloških udžbenika Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) i Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley and Sons, Inc.

4

Primer 1 -Dizajn polipeptida, dobijanje i prečišćavanje

[0096] Zreo molekul IdeS je analiziran i identifikovani su regioni pogodni za mutaciju. U nekim slučajevima in silico procena je korišćena da proceni verovatan ishod mutacije. Nakon odluke o sekvenci svakog polipeptida, cDNK koja kodira svaki polipeptid je generisana u GeneCust, Luksemburg ili mutacijom usmerenom prema mestu početne sekvence ili sintezom koja zavisi od broja uvedenih mutacija. cDNK su sekvencirane i prenete u pET9a ekpresioni vektor (Novagene) u okviru sa C-terminalnim 6x His-tag-om, spojenim sa C-terminusom kratkim glicinskim linkerom (3x Gly). N terminalni metionin je dodat da bi se unapredila bakterijska ekspresija. Plazmidi su transformisani (toplotnim šokom) u E. coli BL21(DE3) (Stratagene) i zasejani na počama sa LB agarozom koja sadrži 30 µg/ml kanamicin. Pojedinačne kolonije su odabrane i prekonoćne kulture su (3 ml LB-medijum) su započete na 37°C, 250 oum. Sledećeg dana su pripremljeni štokovi glicerola i 10 ml TB-medijum dopunjen sa 30 µg/ml kanamicinom i sredstvom protiv pene su inokulisani sa prekonoćnom kulturom i uzgajani do OD 0.6-0.8 (37°C, 300 oum). U ovoj tački dodaje se IPTG (1 mM) i kulture su nastavljanje 1 h pre sakupljanja bakterija centrifugiranjem. Peleti su isprani u PBS-u i zamrznuti su na -20°C. Korišćen je protokol smrzavanja-otapanja za bakterijsku lizu (tri ciklusa smrzavanja/otapanja u 1 ml PBS svaki) i proteini su prečišćeni upotrebom Ni-NTA pre-pakovanih spin-kolona (Pierce). Nakon prečišćavanja eluirani proteini su aktivirani sa 10 mM DTT pre ismene puferom (3 zapremine PBS u MWCO 9K Millipore cfg uređaju). Prečišćavanja i stabilnost svakog proteina je procenjena korišćenjem natrijum dodecil sulfat poliakrilamidna gel electroforeza (SDS-PAGE) nerđajućeg 12% Mini-PROTEAN<®>TGX<™>precast gela (Biorad) SDS-PAGE.

[0097] Tabela u nastavku daje prikaz izmena koje su napravljene za svaki ispitani polipeptid u odnosu na zreli IdeZ ili IdeS/Z, bez uključivanja N terminalnog metionina i his tag. Prema tome, sekvenca za svaki ovde opisani polipeptid koji se koristi u eksperimentima obično sadrži sekvencu SEQ ID NO kao što je naznačeno u tabeli, plus dodatni N terminalni metionin i his tag spojen sa C terminalnim krajem kratkim glicinskim linkerom.

(nastavak)

[0098] Kao kontrole, verzije IdeS, IdeZ i IdeS/Z su proizvedene korišćenjem iste metodologije kao što je gore opisano. Ove verzije su ovde naznačene kao pCART124, pCART144 i pCART145 tim redom.

[0099] pCART124 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 2 plus dodatni N terminalni metionin i his tag spojen sa C terminalnim krajem sa kratkim linkerom glicina.

[0100] Sekvenca pCART124 je obezbeđena ispod:

[0101] pCART144 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 4 plus dodatni N terminalni metionin i his tag spojen sa C terminalnim krajem sa kratkim linkerom glicina. Sekvenca pCART144 je ovde obezbeđena:

[0102] pCART145 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 5 plus dodatni N terminalni metionin i his tag koji je spojen sa C terminalnim krajem sa kratkim glicerinskim linkerom. Sekvenca pCART145 je obezbeđena ispod:

[0103] IdeS bez tag-a je takođe nezavisno proizvedena prema GMP standardu korišćenjem automatizovanog višestepenog hromatografskog prečišćavanja, za upotrebu kao dalja kontrola. Ovaj polipeptid se ovde naziva BX1001865.

[0104] Sekvenca cDNK koja se koristi za proizvodnju svakog od testiranih polipeptida i pCART124, pCART144 i pCART145 je data u nastavku. Svaka cDNK sekvenca uključuje na 3’ kraju kodon za N terminalni metionin (ATG) i, pre stop kodona (TAA) na 5’ kraju, kodone za glicinski linker i histidinski tag.

pCART124 (IdeS; SEQ ID NO: 33)

pCART145 (IdeS/Z; SEQ ID NO: 35)

pCART200 (SEQ ID NO: 38)

pCART204 (SEQ ID NO: 42)

4

pCART210 (SEQ ID NO: 46)

pCART229 (SEQ ID NO: 50)

pCART194 (SEQ ID NO: 54)

Primer 2 - Procena potencije (efikasnost cepanja IgG)

ELISA

[0105] Enzimska aktivnost je merena korišćenjem ELISA testa potencije. Princip ELISA bio je da se bunarčići višetitarske ploče oblože ciljnim antitelom (BSA), zatim inkubiraju različite koncentracije polipeptida IgG cistein proteaze (test ili kontrola) sa anti-BSA antitelom u bunarčićima, pre nego što se detektuje količina anti-BSA antitela vezana za bunarčiće korišćenjem detektorskog antitela. Što je veća koncentracija datog IgG polipeptida cistein proteaze u bunarčiću, to će manje netaknut anti-BSA polipeptid biti vezan za bunar, dajući niži signal. Slično, moćniji polipeptid IgG cistein proteaze će dati niži signal od manje moćnog polipeptida IgG cistein proteaze kada je prisutan u istoj koncentraciji.

[0106] Referentni IdeS BX1001865 je pripremljen kao serija titracije u koracima razblaženja 1:2 od 320 nM do 0.16 nM da bi se omogućilo crtanje standardne kalibracione krive za test. Rezultati postignuti u testu za više poznatih koncentracija svakog testiranog polipeptida upoređeni su sa linearnim presekom kalibracione krive da bi se odredila koncentracija referentnog IdeS koja je postigla istu potenciju. Deljenjem poznate koncentracije svakog polipeptida sa utvrđenom ekvivalentnom koncentracijom referentnog IdeS iz krive, dobija se rezultat koji je stepen promene u potenciji u odnosu na referentni IdeS BX1001865. Na primer, ako testirani polipeptid od 5 nM postigne rezultat ekvivalentan 10 nM referentnog IdeS na kalibracionoj krivoj, testirani polipeptid ima potenciju 2 puta veću od referentnog IdeS BX1001865. Prosečan rezultat za stepen promene potencije u odnosu na referentni IdeS BX1001865 je izračunat iz svih rezultata postignutih pri različitim koncentracijama za svaki testirani polipeptid, pod uslovom da spadaju u linearni deo kalibracione krive. Ovaj srednji rezultat je zatim upoređen sa srednjim rezultatom postignutim za pCART124 referentni IdeS, koji je uključen na svaku ploču da bi se omogućilo poređenje između ploča. Prosečan rezultat za pCART124

4

je podeljen srednjim rezultatom za test polipeptid da bi se proizveo "odnos pCART124", koji je efektivno stepen promene potencije u odnosu na IdeS za svaki polipeptid. Ovaj pCART124 odnos bi se tada mogao vizualizovati na stupičatom dijagramu.

[0107] Kratak pregled laboratorijskog protokola: Bunarčići višetitarskih ploča su obloženi preko noći sa BSA (10 µg/ml), zatim isprani sa PBS-T i blokirani 1 h sa 2% želatina od riblje kože u PBS. Polipeptid IdeS BKS1001865 je pripremljen kao titraciona serija u koracima razblaženja 1:2 u PBS sa 0,1% želatina od 320 nM do 0,16 nM. Test polipeptidi i pCART124 kontrola su zatim pripremljeni na svakom od 15, 7.5, 3.75 i 1.9 nM u PBS sa 0,1% želatina. Uzorak od 50 µl polipeptida je dodat u svaki bunarčić sa 50 µl zečjeg anti-BSA (ACRIS, #R1048P, 10 nM) kao supstratom. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 1 sat, a zatim isprane sa PBS-T. Biotinilovano kozje anti-zečje Fc-specifično antitelo (30 000x razblaženo) je dodato kao detektorsko antitelo i inkubirano 30 min. Ploča je isprana i dodata je 40 000x razblažena SA-peroksidazom rena (HRP; Pierce) i inkubirana 30 min. Ploče su isprane i razvijene korišćenjem TMB One Component kao hromogenog supstrata za HRP tokom 7 minuta, zaustavljene sa 0.5 M H2SO4. Apsorbanca (OD) je merena na λ = 450 nm. Srednji rezultati za kratku promenu potencije u odnosu na BX1001865 su određeni za svaki testirani polipeptid i za pCART124. Zatim je izračunat "odnos pCART124" za svaki testirani polipeptid kao što je gore navedeno.

[0108] Rezultati „odnosa pCART124“ za pCART191, 192, 193, 194, 197, 198, 200 i 201 prikazani su na slici 1, pored rezultata za pCART124. Svi primeri polipeptida pronalaska koji su ovde prikazani postižu najmanje ekvivalentnu potenciju u odnosu na IdeS kontrolu (pCART124). pCART194, 197, 200 i 201 svi postižu mnogo veću potenciju, čak i do 8.0 puta poboljšanje u odnosu na kontrolu za pCART197 i pCART201.

[0109] Zanimljivo pCART200 i 201 oba uključuju modifikacije na N terminalnom kraju. Takođe, pCART194 i 197 imaju modifikaciju N138R/K. Očekuje se da će promena pozitivne aminokiseline na poziciji koja odgovara poziciji 139 SEQ ID NO: 3 dati slične rezultate kao supstitucija N138R/K. Pozicije 138 i 139 se nalaze u petlji beta strukture ukosnice koja obuhvata pozicije 134 do 144 SEQ ID NO: 3. Na osnovu ovde dobijenih rezultata, očekuje se da će promene pozitivnih aminokiselina na jednoj ili obe pozicije 138 i 139 povećati aktivnost IgG cistein proteaze.

[0110] Rezultati za pCART202, 203 i 204 su prikazani na Slici 2. pCART203 posebno je oko 3.5 puta potentniji u odnosu na IdeS. pCART202 je između 1 i 1.5 puta potentniji u odnosu na IdeS. pCART204 je uporedive potencije sa pCART144.

Vizuelizacija obrasca cepanja IgG

[0111] Efikasnost različitih pCART polipeptida je dalje procenjena vizuelizacijom na SDS-PAGE proizvoda cepanja proizvedenih serijom titracije svakog polipeptida u različitim supstratima. Da bi se testirala efikasnost u čistom IgG supstratu, adalimumab (Humira) je korišćen za IgG1 i denosumab (XGEVA) za IgG2. Da bi se testirala efikasnost u složenijem fiziološkom okruženju, neki od polipeptida su takođe titrirani u IVIg (Octagam). Ovo omogućava procenu uticaja neutralizujućih anti-IdeS antitela na aktivnost polipeptida. Obrasci cepanja za svaki polipeptid su upoređeni sa obrascima cepanja IdeS (BX1001865 i pCART124) u istom supstratu. Protokol je bio sledeći:

Za testove čistog IgG, svaki test polipeptid ili kontrola je razblažen u seriji titracije koraka 1:3 od 6.7 µg/ml do 0.04 ng/ml u PBS sa 0.05% BSA kao pomoćnim proteinom. 25 µl svake koncentracije je prebačeno na višetitarske ploče i reakcija cepanja je započela dodavanjem 25 µl bilo Humira ili XGEVA (2 mg/ml). Tako se svaka početna koncentracija polipeptida razblaži 1:2 u otvoru, dajući seriju titracije od 3.3 µg/ml do 0.02 ng/ml.

[0112] Za IVIg testove, svaki test polipeptid ili kontrola je razblažen u seriji titracije koraka 1:2 od 30 µg/ml do 0.015 ng/ml u PBS sa 0.05% BSA kao pomoćnim proteinom. 25 µl svake koncentracije je prebačeno na višetitarske ploče i reakcija cepanja je počela dodavanjem 25 µl 10 mg/ml IVIg. Tako se svaka početna koncentracija polipeptida razblaži 1:2 u otvoru, dajući seriju titracije od 15 µg/ml do 0.0075 ng/ml.

[0113] Ploče su inkubirane na 37°C tokom 1.5 sata. Uzorci su pomešani 1:4 u 2X SDS puferu za punjenje i zagrevani na 92°C tokom 5 min.10 µl je stavljeno na poliakrilamidni gel (15 bunarčića 4-20% Mini-PROTEAN®TGX™ prefabrikovani gel (Biorad) koji je očitan prema standardnim protokolima.

[0114] Slika 3 pokazuje obrasce za proizvodnju IgG1 supstrata za pCART202, 203 i 204 u poređenju sa obe IdeS kontrole (pCART124 i BX1001865) i IdeZ (pCART144). Enzimske koncentracije idu od 3.33 µg/ml (traka1) do 0.02 ng/ml (traka 12) u koracima serijskih razblaženja 1:3. Intaktni adalimumab (bez enzima) je prikazan u tragovima 13. Strelice na desnoj strani pokazuju različite produkte cepanja od IgG. Strelica 1: Intaktni IgG; strelica 2: scIgG (jednostruko cepljen IgG -rezultat cepanja prvog teškog lanca IgG); strelica 3: F(ab’)2fragment (rezultat cepanja drugog teškog lanca IgG). Vertikalne linije su dodate da bi se olakšalo poređenje na 1. cepanju teškog lanca IgG, gde intaktni IgG postaje scIgG (između trake 6 i 7) i kod cepanja 2. IgG teškog lanca, gde scIgG postaje F(ab')2fragment (između trake 2 i 3).

[0115] Enzim IdeZ (pCART144) ima nižu efikasnost cepanja i 1. i 2. teškog lanca IgG. IdeS (BX1001865 i pCART124) je oko 3 puta efikasniji (tj. jedan korak titracije) od pCART144 u cepanju oba teška lanca. Cepanje pri 1.5 ng/ml (traka 8) za IdeS (BX1001865 i pCART124) jednako je cepanju pCART144 (IdeZ) na 4.6 ng/ml (traka 7). BX1001865 i pCART124 pokazuju intenzivne scIGg trake (strelica 2) na 4.6 ng/ml (traka 7), dok pCART144 ima samo slab scIgG traku (strelica 2) pri ovoj koncentraciji (traka 7).

[0116] Važno je da i pCART202 i pCART203 pokazuju povećanu moć cepanja IgG (traka 7 i traka 3) u poređenju sa IdeZ (pCART144), što rezultira intenzivnijim scIgG trakama (strelica 2) i intenzivnijim F(ab')2 trakama (strelica 3). Nije primećena povećana efikasnost za enzim pCART204. Pokazano je da je efikasnost pCART202 u cepanju 2. teškog lanca približno ista kao za IdeS (BX1001865 i pCART124) (uporedi traku 3). pCART202 je manje efikasan od IdeS, ali efikasniji od pCART144 za cepanje 1. teškog lanca IgG (uporedi traku 7). Enzim pCART203 poseduje čak i veću efikasnost od IdeS u cepanju prvenstveno 2. teškog lanca, što rezultira intenzivnijim F(ab')2 trakom (strelica 3) i slabijim scIgG trakom (strelica 2) u poređenju sa BX1001865 i pCART124 (strelica 3 i 2) na 0.37 µg/ml (traka 3).

[0117] Dakle, ukupna slika 3 pokazuje da modifikovanje IdeZ sekvence sledećim modifikacijama R70T, I71del, N72K, N73G, koje se vide i u pCART202 i pCART203, povećava efikasnost cepanja 2. teškog lanca IgG u poređenju sa pCART144 (IdeZ). Dodatno uvođenje L64_T65del modifikacije takođe povećava efikasnost cepanja 1. teškog lanca, što se vidi za pCART203.

[0118] Slika 4 prikazuje obrasce cepanja proizvedene sa IVIg supstratom za pCART202, 203 i 204 u poređenju sa obema IdeS kontrolama (pCART124 i BX1001865) i IdeZ (pCART144). Koncentracije enzima idu od 30 µg/ml (traka 1) do 0.015 ng/ml (traka 12) u koraku serije razblaživanja 1:2. Intaktni IVIg (bez enzima) je prikazan u traci 13, sa izuzetkom slike za pCART203, na kojoj je ova traka odsutna. Strelice na desnoj strani pokazuju različite proizvode cepanja od IgG. Strelica 1: Intaktni IgG; strelica 2: scIgG (pojedinačno cepljen IgG - rezultat cepanja prvog teškog lanca IgG); strelica 3: F(ab’)2fragment (rezultat cepanja drugog teškog lanca IgG). Dodate su vertikalne linije da bi se olakšalo poređenje na 1. cepanju teškog lanca IgG, gde intaktni IgG postaje scIgG (između trake 6 i 7) i kod cepanja 2. teškog lanca IgG, gde scIgG postaje F(ab')2fragment (između trake 2 i 3).

4

[0119] Enzim pCART144 (IdeZ) pokazuje efikasnije cepanje na 1. teškom lancu IgG (traka 6) u poređenju sa IdeS (BX1001865 i pCART124), što rezultira intenzivnijim scIgG trakom (strelica 2) i slabijim trakom netaknutog IgG (strelica 1). Ovo je verovatno zbog nižeg nivoa vezivanja neutralizacijom anti-IdeS antitela za pCART144 (IdeZ) u poređenju sa njihovim prepoznavanjem IdeS. Kao što se vidi za pCART202, pCART203 i pCART204, povećana efikasnost u cepanju 1. teškog lanca važi za sve enzime izvedene iz IdeZ (traka 6). Koncentracije od 0.94 ng/ml (traka 6) za pCART202, pCART203 i pCART204 rezultiraju intenzivnom trakom scIgG (strelica 2), pri čemu je većina pojedinačnih IgG cepana, dok ista koncentracija IdeS rezultira sa manje od 50% scIgG (traka 6).

[0120] Međutim, pCART144 (IdeZ) je lošiji u cepanju 2. teškog lanca u poređenju sa IdeS (BX1001865 i pCART124). Ovo dovodi do intenzivnijeg scIgG trake (strelica 2) iz trake 5 (1.9 ng/ml enzima) i takođe u trakama 4 i 3, u poređenju sa IdeS za koji se cepanje nastavlja na F(ab')2 trake (strelica 3) već u sledećem koraku titracije (traka 4, 3.75 µg/ml). Primetno, pCART203 pokazuje kapacitet uporediv sa IdeS (BX1001865 i pCART124) na 2. mestu cepanja (traka 2, 3 i 4) i veću efikasnost cepanja od IdeS i IdeZ (pCART144) na 1. mestu cepanja (traka 7).

[0121] Enzim pCART203 pokazuje cepanje IgG na 0.5 ng/ml (traka 7) i generiše uglavnom scIgG (strelica 2) na oko 0.9 ng/ml (traka 6). Ovo odgovara 2 puta većoj efikasnosti u poređenju sa IdeS, koji počinje cepanje pri 0.9 ng/ml (traka 6) i ima dominantnu scIgG traku od 1.9 ng/ml (traka 5). Ukupna slika 4 pokazuje da modifikacija IdeZ-a sa modifikacijama L64_T65del, R70T, I71del, N72K i N73G povećava efikasnost cepanja humanog IgG čak i u prisustvu neutrališućeg ADA. Ovo se jasno vidi u pCART203 u poređenju sa IdeS-om.

[0122] Slika 5 prikazuje obrasce cepanja proizvedene sa IgG1 supstratom za pCART205, 206, 207, 208 i 210 u poređenju sa obema IdeS kontrolama (pCART124 i BX1001865) i IdeZ (pCART144). Koncentracije enzima idu od 3.33 µg/ml (traka 1) do 0.02 ng/ml (traka 12) u seriji razblaživanja koraka 1:3. Strelice na desnoj strani pokazuju različite proizvode cepanja od IgG. Strelica 1: Intaktni IgG; strelica 2: scIgG (jednostruko cepljen IgG - rezultat cepanja prvog teškog lanca IgG); strelica 3: F(ab’)2fragment (rezultat cepanja drugog teškog lanca IgG). Vertikalne linije su dodate da bi se olakšalo poređenje na 1. cepanju teškog lanca IgG, gde intaktni IgG postaje scIgG (između trake 6 i 7) i kod cepanja 2. IgG teškog lanca, gde scIgG postaje F(ab')2fragment (između trake 2 i 3).

[0123] Enzim pCART205 pokazuje povećan kapacitet u poređenju sa pCART144 (IdeZ) u cepanju oba teška lanca IgG (traka 6 i 3), što rezultira intenzivnijim scIgG trakom (strelica 2, traka 6) i veoma slabom trakom intaktnog IgG (strelica 1, traka 6) i intenzivnijom F(ab')2 trakom (strelica 3, traka 3) u poređenju sa pCART144 (IdeZ) (traka 6 i 3). Međutim, u odsustvu neutrališuće ADA u ovom eksperimentu (za razliku od onog prikazanog na slici 4), aktivnost cepanja IdeS (pCART124) za čisti IgG1 je veća od pCART205.

[0124] Oba polipeptida pCART207 i pCART210 pokazuju povećanu efikasnost cepanja IgG u poređenju sa oba IdeS (pCART124) i IdeZ (pCART144) (traka 7 za 1. cepanje i traka 3 za 2. cepanje). Najmoćniji enzim, pCART207, pokazuje približno 3 puta povećanje efikasnosti u cepanju oba teška lanca IgG u poređenju sa IdeS (pCART124). Potpuna konverzija u scIgG (strelica 2) za pCART124 se dobija pri 14 ng/ml (traka 6), dok se za pCART207 jedna scIgG traka (strelica 2) vidi već pri 4,6 ng/ml (traka 7). Veće povećanje efikasnosti za pCART207 u poređenju sa pCART124 uočeno je u cepanju 2. teškog lanca. Intenzivnija F(ab’)2 traka (strelica 3) se vidi za pCART207 pri 41 ng/ml (traka 4) nego što pCART124 pokazuje pri 0.37 µg/ml (traka 3).

4

[0125] pCART207 i pCART210 dele sledeće modifikacije u odnosu na sekvencu IdeZ : L64_T65del, R70T, Y71del, N72Q, N73G, N138R. Prema tome sveukupno Slika 5 pokazuje da ove promene povećavaju efikasnost cepanja humanog IgG1.

[0126] Slika 6 prikazuje obrasce cepanja proizvedene sa IgG2 supstratom za pCART203, 205, 206, 207, 208 i 210 u poređenju sa obema IdeS kontrolama (pCART124 i BX1001865) i IdeZ (pCART144). Koncentracije enzima idu od 3,33 µg/ml (traka 1) do 0,02 ng/ml (traka 12) u seriji razblaživanja koraka 1:3. Strelice na desnoj strani pokazuju različite proizvode cepanja od IgG. Strelica 1: Intaktni IgG; strelica 2: scIgG (jednostruko cepljen IgG -rezultat cepanja prvog teškog lanca IgG); strelica 3: F(ab’)2fragment (rezultat cepanja drugog teškog lanca IgG). Vertikalne linije su dodate da bi se olakšalo poređenje na 1. cepanju teškog lanca IgG, gde intaktni IgG postaje scIgG (između trake 6 i 7) i kod cepanja 2. IgG teškog lanca, gde scIgG postaje F(ab')2fragment (između trake 2 i 3).

[0127] Enzimi pCART203 i pCART207 oba pokazuju približno 3 struko povećanje u efikasnosti cepanja u poređenju sa pCART144 (IdeZ). pCART144 pokazuje jednu intenzivnu scIgG traku (strelica 2) u koncentraciji od 0.12 µg/ml (traka 4), u poređenju sa dominantnom scIgG trakom (strelica 2) za pCART203 i pCART207 na nižoj koncentraciji 41 ng/ml (traka 5). pCART203 i pCART207 su uporedivi sa IdeS (BX1001865 i pCART124) u efikasnosti cepanja i 1. i 2. teškog lanca IgG (traka 6 i traka 2). Međutim, u odsustvu neutrališućih ADA u ovom eksperimentu (suprotno sa onim što je prikazano na Slici 4), aktivnost cepanja IdeS (pCART124) je veća nego za svaki od pCART206, pCART208 i pCART210 za oba teška lanca čistog IgG2. Ovo se može uočiti iz jedne intenzivne scIgG trake (strelica 2) koja postoji čak i na najvećoj koncentraciji enzima 3.3 µg/ml (traka 1) za pCART206 i pCART208. pCART205 je izveden iz IdeS/Z hibridа (pCART145) ima približno istu efikasnost kao IdeZ (pCART144) u cepanju čistog humanog IgG2 (traka 5 za 1. mesto cepanja i traka 2 za 2. mesto cepanja), oba dovode do jedne scIgG trake (strelica 2) na 0.12 µg/ml (traka 4) i dominantne F(ab’)2 trake na najvećoj koncentraciji 3.3 µg/ml (traka 1).

[0128] Uopšteno, slika 6 pokazuje da najbolje modifikacije IdeZ, tj. koje su rezultovale najvećim povećanjem u efikasnosti cepanja IgG2, su bile one koje se nalaze u pCART203 i pCART207. Ovi enzimi dele modifikacije L64_T65del, R70T, Y71del, N72Q, N73G, sa pCART207 koji dodatno sadrži N138R modifikaciju.

[0129] Slika 7 pokazuje obrasce cepanja koji su proizvedeni sa IVIg supstratom pCART207, 208 i 210 u poređenju sa IdeS kontrolom (BX1001865). Koncentracije enzima idu od 30 µg/ml (traka 1) do 0.015 ng/ml (taka 12) u koraku 1:2 serijskih razblaženja. Intaktni IVIg (bez enzima) je prikazan u traci 13. Strelice na desno označavaju različite proizvode cepanja od IgG. Strelica 1: Intaktni IgG; strelica 2: scIgG (jednom cepani IgG - nastaje iz cepanja prvog IgG teškog lanca); strelica 3: F(ab’)2fragment (nastaje iz cepanja drugog IgG teškog lanca). Vertikalne linije su dodate da bi se olakšalo poređenje na 1. cepanju teškog lanca IgG, gde intaktni IgG postaje scIgG (između trake 6 i 7) i 2. cepanja teškog lanca IgG, gde scIgG postaje F(ab’)2fragment (između trake 2 i 3).

[0130] pCART207, pCART208 i pCART210 svaki pokazuje povećanu efikasnost u poređenju sa IdeS (BX1001865) u cepanju 1-og teškog lanca IgG (traka 6). IdeS (BX1001865) je generisao uglavnom scIgG (strelica 2) na koncentraciji od 1.9 ng/ml (traka 5). Slični rezultati su dobijeni na 0.9 ng/ml (traka 6) za oba pCART207 i pCART210, i na samo 0.5 ng/ml (traka 7) za pCART208. U slučaju pCART208 ovo je približno 4 struko povećanje u efikasnosti cepanja 1. teškog lanca. U cepanju 2. teškog lanca pCART208 pokazuje poboljšanu efikasnost cepanja, što dovodi dominatnoj F(ab’)2 traci (strelica 3) na 1.9 ng/ml (traka 5), pri čemu IdeS (BX1001865) je generisao samo scIgG (strelica 2) na istoj koncentraciji.

4

[0131] Uopšteno, Slika 7 pokazuje da pCART207, pCART208 i pCART210 imaju povećanu efikasnost cepanja humanog IgG u prisustvu anti-IdeS neutrališućih antitela (ADA), u poređenju sa IdeS. Sličan rezultat dobijen je za pCART206 (podaci nisu prikazani). pCART206, 207, 208 i 210 svaki dele sledeće modifikacije u odnosu na IdeZ sekvencu: L64_T65del, R70T, Y71del, N72Q i N73G. Dodatno, pCART207, 208 i 210 takođe dele modifikaciju N138R. Prema tome, Slika 7 takođe potvrđuje da ovde različite modifikacije povećavaju efikasnost cepanja humanog IgG u prisustvu neutrališućih ADA.

Primer 3 - Procena imunogenosti

Kompetitivni test anti-IdeS antitelo

[0132] Ovaj test je zasnovan na konkurenciji između testiranog polipeptida i IdeS za vezivanje za anti-IdeS antitelo. Prethodna inkubacija testiranog enzima i IVIg će omogućiti vezivanje anti-IdeS antitela za testirani pCART enzim. Nakon toga, mešavina IVIg-enzima se dodaje na ploču obloženu IdeS i svako anti-IdeS antitelo koje nije vezano za testirani polipeptid će se umesto toga vezati za IdeS na ploči. Sve inkubacije vezivanja su napravljene u prisustvu 2 mM jodosirćetne kiseline (IHAc) da inhibira cepanje IgG i u visokoj soli tako da se javlja samo vezivanje visokog afiniteta. Nakon ispiranja, kao detektor se koristi biotinilovani kozji anti-humani F(ab’)2-specifični F(ab’)2fragment. Slabo prepoznavanje testiranog polipeptida od strane anti-IdeS antitela u IVIg će dovesti do visokog vezivanja anti-IdeS antitela u IVIg za ploču, dajući visok signal. Dobro prepoznavanje testiranog polipeptida od strane anti-IdeS antitela u IVIg će dati suprotan rezultat. Detaljan protokol je sledeći:

Referentni IdeS (BX1001865) je obložen preko noći na višetitarskim pločama (5 µg/ml), zatim ispran sa PBS-T i blokiran 1 sat sa 2% BSA u PBS dopunjenom sa 2 mM IHAc i 1 M NaCl. Ploča za mešanje je pripremljena sa postepenim razblaženjima testiranog polipeptida i 20 µg/ml IVIg u PBS sa dodatkom 0.1% BSA, 2 mM IHAc i 1 M NaCl. Ploča za mešanje je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi na šejkeru. Posle inkubacije, rastvor za blokiranje je odbačen sa ploče obložene IdeS i 50 µl svake smeše sa ploče za mešanje je prebačeno u bunarčiće obložene ploče. Posle inkubacije od 1 sata na sobnoj temperaturi na šejkeru, ploča je isprana PBS-T i dodat je detektor, biotinilovani kozji anti-humani F(ab')2-specifični F(ab')2fragment (20000x razblažen). Posle inkubacije od 30 minuta ploča je isprana i dodato je 40 000x razblaženog SA-HRP (Pierce) i inkubirano 30 min. Ploča je isprana i razvijena korišćenjem TMB One Component kao hromogenog supstrata za HRP tokom 7 minuta, zaustavljeno sa 0.5 M H2SO4. Apsorbanca (OD) je merena na λ = 450 nm. Rezultati su obrnuti (1/OD vrednost) i predstavljeni kao odnos u poređenju sa pCART124 (1/(testirani polipeptid/pCART124)) za vizuelizaciju u stupčatim dijagramima.

[0133] Rezultati za pCART191, 192, 193, 194, 197, 198, 200 i 201 prikazani su na slici 8. Rezultati za pCART202, 203 i 204 su prikazani na Slici 9. Svi testirani polipeptidi pokazuju značajno smanjenje anti-IdeS prepoznavanje antitela u poređenju sa IdeS. Polipeptid koji pokazuje najmanju redukciju (pCART193) je prepoznat na nivou približno 60% nižem od IdeS. Preostali testirani polipeptidi bili su 70 ili čak 80% niži od IdeS.

Anti-IdeS titarski test

[0134] Ovaj test je zasnovan na poređenju titara razblaženja IVIg. Različiti testirani polipeptid i kontrolni IdeS (BX10018865 i pCART124) su obloženi na mikrotitarskim pločama. Vezivanje anti-IdeS antitela za test polipeptide ili kontrole je procenjeno dodavanjem titriranih količina IVIg (serija razblaženja 1:2 od 40 do 0.625 µg/ml, tj. u titrima koji odgovaraju 1:250 do 1:16000 razblaženog seruma) ploča. Pufer za razblaživanje ima visoku koncentraciju soli tako da se javlja samo vezivanje visokog afiniteta i uključuje 2 mM IHAc da inhibira cepanje IgG i u visokoj soli tako da se javlja samo vezivanje visokog afiniteta. “Cut off” vrednost OD je podešena u svakom eksperimentu na približno 3 puta veću od slepe probe. Dokumentovani rezultat za svaki testirani polipeptid bio je titar razblaženja IVIg koji je dao najniže vrednosti OD (najniže vezivanje anti-IdeS antitela) iznad granice “cut off”.

4

Drugim rečima; manje razblaženi IVIg je potreban za polipeptide sa niskim prepoznavanjem od strane anti-IdeS antitela (ADA), a više razblaženi IVIg je potreban za enzime koje ADA visoko prepoznaje. Ukratko, protokol je bio sledeći:

Referentni IdeS i svaki testirani enzim je obložen preko noći na višetitarskim pločama (2 µg/ml), ispran sa PBS-T i blokiran 1 sat sa 2% BSA u PBS dopunjenom sa 2 mM IHAc. Rastvor za blokiranje je odbačen i 50 µl postepenog razblaženja IVIg (pufer za razblaživanje: PBS 1M NaCl 0,1% BSA 2 mM IHAc) je dodato i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi na šejkeru. Ploče su isprane PBS-T i dodat je detektor, biotinilovani kozji anti-humani F(ab’)2-specifični F(ab’)2fragment (20000x razblažen) i inkubiran 30 min. Ploče su isprane i dodat je 40000x razblažen SA-HRP (Pierce) i inkubiran 30 min. Ploča je isprana i razvijena korišćenjem TMB One Component kao hromogenog supstrata za HRP tokom 7 minuta, zaustavljeno sa 0.5 M H2SO4. Apsorbanca (OD) je merena na λ = 450 nm.

[0135] Rezultati za pCART202, 203 i 204 su prikazani na Slici 10. Sva tri ispitivana antitela su imali razblaženja 3x niža od IdeS za prepoznavanje od strane anti-IdeS antitela.

[0136] Rezultati za pCART205, 206, 207, 208 i 210 su prikazani na Slici 11. Svi osim pCART206 su imali razblaženja 3x niža od IdeS za prepoznavanje anti-IdeS antitela. pCART206 su imali 2x niža razblaženja. Sveukupno, ispitivani polipeptidi su jasno manje imunogeni od IdeS.

Kratak pregled

[0137] Testirani polipeptidi su generalno efikasniji u cepanju humanog IgG od IdeZ i/ili su bar podjednako efikasni u cepanju humanog IgG kao IdeS, a takođe su tipično manje imunogeni od IdeS.

Primer 4 -Testiranje potentnosti

ELISA za testiranje potentnosti

[0138] Da bi se odgovorilo na kapacitet cepanja humanih IgG1 i IgG2, postavljena su dva testa potencije zasnovana na ELISA testu. Jedan test meri cepanje IgG1, a drugi cepanje IgG2. EC50 (polovina maksimalne efektivne koncentracije) vrednosti su izračunate za različite testirane polipeptide IgG cistein proteaze. Princip testova je bio da se bunarčići višetitarske ploče oblože F(ab)2-fragmentom usmerenim na humana IgG antitela sa specifičnošću za Fab region. Zatim su titrirane koncentracije polipeptida IgG cistein proteaze (test ili kontrola) inkubirane zajedno sa humanim IgG1 antitelom (Humira) ili humanim IgG2 antitelom (XGEVA) u bunarčićima. Količina intaktnog ili jednostruko cepanog humanog IgG (Humira ili XGEVA) vezanog za bunarčiće merena je korišćenjem detektorskog antitela usmerenog na humani IgG sa specifičnošću prema Fc delu antitela. Što je veća koncentracija datog polipeptida IgG cistein proteaze u bunarčiću, manje netaknuto humano IgG antitelo će biti vezano za bunarčić, dajući niži signal. Slično tome, moćniji polipeptid IgG cistein proteaze će dati niži signal od manje moćnog polipeptida IgG cistein proteaze kada je prisutan u istoj koncentraciji. Titracione krive doza-odgovor su pripremljene za IdeS kontrolu (pCART124) i sve testirane polipeptide IgG cistein proteaze, i u testu IgG1 (humira) i IgG2 (XGEVA). EC50 vrednosti su takođe izračunate za svaku testiranu varijantu, što predstavlja koncentraciju polipeptida gde se 50% njegovog maksimalnog efekta, u drugom teškom lancu cepanja IgG molekula, primećuje, odnosno koncentracija u kojoj je polovina IgG molekula jednostruko cepljena i polovina je potpuno cepana. Niža vrednost EC50 predstavlja efikasniju IgG cistein proteazu. Cepanje prvog teškog lanca IgG, IgG do scIgG, nije vidljivo u ovom testu jer je Fc-deo IgG još uvek prisutan i može se detektovati pomoću Fc specifičnog detektorskog antitela (slika 18).

[0139] Kratak pregled laboratorijskog protokola: Bunaričići višetitarskih ploča su obloženi preko noći (+2-8°C) sa kozjim anti-humanim Fab-specifičnim F(ab)2-fragmentom (0.5 µg/ml) (Jackson #109- 006-

4

097), zatim isprani sa PBS+0.05% Tween 20 (PBS-T) i blokirani u 0.45% ribljeg želatina u PBS-T (blok pufer) 45-120 min na sobnoj temperaturi. Kontrolni IdeS (pCART124) i polipeptidi IgG cistein proteaze koji se testiraju pripremljeni su kao titraciona serija u koracima razblaženja 1:4 u blok puferu sa početnom koncentracijom od 80 µg/ml. Jednake zapremine (25 µl) humanog IgG1 (Humira) u koncentraciji od 0.5 µg/ml i titrirane količine polipeptida IgG cistein proteaze su dodati u bunarčiće i inkubirani 2h uz mućkanje u okruženju sa kontrolisanom temperaturom na 37°C i zatim isprani sa PBS-T. Biotinilovano mišje anti-humano IgG Fc-specifično (m-a-hIgG Bio II, Serija: C0013-ZC43C, Southern Biotech) (600 ng/ml) antitelo je pomešano sa Strep-sulfo (200 ng/ml) i dodato u višetitarske ploče. Ploče su zapečaćene aluminijumskom trakom i inkubirane na 25°C u trajanju od 1h uz mućkanje. Ploče su zatim isprane u PBS-T i 150 µl 2x razblaženog pufera za čitanje T (MSD pufer za čitanje pufer T, Kat. br. R92TC-2) je dodato u svaki bunar. Ploče su odmah očitane na čitaču ploča, MSD (Meso Scale Discovery) QuickPlex SQ 120 Model 1300.

[0140] Testovi efikasnosti za vizuelizaciju na gelu: Test je sproveden kao što je opisano u Primeru 2 za cepanje IgG1 (Humira), IgG2 (XGEVA) kao i cepanje grupe humanih IgG, IVIg (Octagam).

Rezultati

ELISA test potencije

[0141] Dobijene krive doza-odgovor za testirane IgG cisteinske proteaze u testovima potencije su prikazane na slici 12 (cepanje IgG1) i slici 13 (cepanje IgG2). pCART207, 217, 219 primera polipeptida pronalaska koji su ovde testirani imaju poboljšanu potenciju (smanjene vrednosti EC50) u cepanju oba teška lanca IgG1 (slika 12) u poređenju sa IdeS kontrolnom pCART124 (tabela 1), sa višestrukim poboljšanjem potencije od 1.4 za pCART219, 3.2 za pCART217 i čak 4.0 za pCART207. pCART226 pokazuje nešto nižu potenciju od IdeS (pCART124) sa stepenom promene u EC50 od 0.6 (tabela 1). Za cepanje IgG2 (slika 13) svi testirani polipeptidi pokazuju nižu potenciju u poređenju sa originalnim IdeS (pCART124), sa višim vrednostima EC50 (tabela 1) i stepenom promene ispod 1, u cepanju drugog teškog lanca IgG. Međutim, svi testirani polipeptidi su potentniji od pCART144 (SEQ ID NO: 27) (podaci nisu prikazani) što je sekvenca iz koje su izvedeni polipeptidi IgG cistein proteaze pronalaska.

Testovi efikasnosti vizuelizovani na gelu

[0142] Cepanje IgG1 (slika 14A) i IgG2 (slika 14B) vizuelizovano na gelu jasno pokazuje prvi i drugi cepanje teškog lanca (vertikalne linije na slikama označavaju 1. i 2. cepanje teškog lanca IgG od strane BX1001865 i pCART124 cepanje). Znak * na slikama ilustruje približnu vrednost EC50, tj. koncentraciju u kojoj je 50% IgG jednostruko cepano (scIgG), a 50% je potpuno cepano (F(ab’)2). Podaci iz gelova su sumirani u tabeli 2 (cepanje IgG1) i tabeli 3 (cepanje IgG2). Cepanje 1. teškog lanca IgG1 (Humira) je otprilike isto, 1,5 ng/ml za IdeS (pCART124 i BX1001865), pCART207 i 217, ali je potrebna nešto veća koncentracija da bi se dobila dominantna scIgG traka, oko 4.6, za pCART219 i 226 (tabela 2). Međutim, za 2. cepanje teškog lanca IgG1, pCART207, 217 i 219 svi pokazuju veću efikasnost od IdeS (pCART124 i BX1001864) (tabela 2), oko 3x (jedan korak titracije) efikasniji u cepanju, oko 370 ng/ml IdeS i oko 120 ng/ml za pCART207, 217 i 219. U cepanju IgG2 (XGEVA) (slika 14B) pCART207, 217, 219 svi pokazuju jedan korak titracije (1:3) nižu efikasnost i pCART226 koraka titracije ima oko dva koraka titracije ( 1:6) niža efikasnost u poređenju sa IdeS u cepanju i 1. i 2. teškog lanca (tabela 3). pCART229 pokazuje približno istu efikasnost kao IdeS (BX1001865 i pCART124) u cepanju i 1. (4.6 ng/ml) i 2. (370 ng/ml) IgG teškog lanca IgG1 (Humira) (slika 15A i tabela 4). pri čemu cepanje IgG2 (XGEVA) pomoću pCART229 je oko jedan korak titracije (1:3) manje efikasan od IdeS u cepanju i 1. i 2. IgG teškog lanca (slika 15B i tabela 4).

[0143] Polipeptidi IgG cistein proteaze pCART207, 217, 219 i 226 su takođe titrirani u humanom IgG skupa, IVIg (Octagam) sa IdeS (BX1001865) kao kontrolom (Slika 16). Svi su pokazali veću efikasnost u cepanju 1. teškog lanca IgG IVIg u poređenju sa IdeS. Svim pCART207, 217, 219 i 226 je bilo potrebno 0,75 µg/ml da bi se postiglo 1. cepanje, dok je IdeS-u (BX1001865) bilo potrebno 1,5 µg/ml za stvaranje scIgG (slika 16 i tabela 5). U 2. cepanju, pCART207 i 217 su oba efikasnija od IdeS (BX1001865) sa koncentracijom od 3 µg/ml za generisanje pretežno F(ab')2 fragmenata, za IdeS treba oko 6 µg/ml (slika 16 i tabela 5). pCART219 i 226 su manje efikasni u poređenju sa IdeS u drugom cepanju IgG pula IVIg. Cepanje IVIg pomoću pCART229 je analizirano u širem titracionom spektru sa 1:2 razblaženjima od 30 µg/ml (slika 17) u poređenju sa testiranim polipeptidima na slici 16. Ista efikasnost je primećena za IdeS (BX1001865 i pCART122) (slika 17) sa koncentracijom od 1,9 µg/ml za stvaranje scIgG i 7,5 µg/ml za dobijanje F(ab')2 fragmenata (tabela 6).

Pregled slika za Primer 4

[0144] Slika 12. Titracione krive za cepanje IgG1 (Humira) različitim IgG polipeptidi cistein proteaze.

[0145] Slika 13. Titracione krive za cepanje IgG2 (XGEVA) različitim polipeptidima IgG cistein proteaze.

[0146] Slika 14. IgG cepanje analizirano sa SDS-PAGE upotrebom titriranih (1:3 razblaženje od 3300 ng/ml) količina pCART207, 217, 219 i 226 sa BX1001865 i pCART124 (originalna IdeS) kao kontrolama u istom eksperimentu cepanja. A: cepanje humira (IgG1) i B: cepanje XGEVA (IgG2). Vertikalne linije označavaju IdeS (BX1001865 i pCART124) koncentracije potrebne da se dobije cepanje 1 i 2 teškog lanca IgG (gde količina cepanog proizvoda dominira dominira u odnosu na necepani proizvod). *na slikama označava približnu vrednost EC50 u ovom eksperimentu.

[0147] Slika 15. IgG cepanje analizirano SDS-PAGE upotrebom titriranih (1:3 razblaženje od 3300 ng/ml) količina pCART229 sa BX1001865 i pCART124 (originalna IdeS) kao kontrolama u istom eksperimentu cepanja. A: cepanje humira (IgG1) i B: cepanje XGEVA (IgG2). Vertikalne linije označavaju IdeS (BX1001865 i pCART124) koncentracije potrebne da se dobije 1 i 2 cepanje teškog lanca IgG (gde količina cepanog proizvoda dominira u odnosu na necepani proizvod).

[0148] Slika 16. IVIg cepanje analizirano sa SDS-PAGE korišćenjem titriranih (1:2 razblaženje 6 µg/ml) količina ispitanih polipeptida IgG cistein proteaze i IdeS (BX1001865) kao kontrole u istom eksperimentu cepanja.

[0149] Slika 17. IVIg cepanje analizirano SDS-PAGE korišćenjem titriranih količina (1:2 razblaženje od 30 µg/ml) pCART229 sa BX1001865 i pCART124 (originalna IdeS) kao kontrole u istom eksperimentu cepanja.

[0150] Slika 18. Šematski prikaz cepanja imunoglobulina polipeptidima iz pronalaska. Enzimsko cepanje IgG je sprovedeno u dva koraka. Prvo, jedan težak lanac intaktno IgG je cepan i generisan je pojedinačno cepani IgG (scIgG). Drugo, sledeći težak lanac se cepa i deo Fc se oslobađa. Fc-deo je još vezan sa Fab-delom u molekulu scIgG i s obzirom na to da detektorsko antitelo u ELISA testu za potenciju prepoznaje Fc-deo molekula IgG test neće praviti razliku između kompletnog IgG od scIgG.

Diskusija i zaključak

[0151] Niže vrednosti EC50 pCART207, 217, 219 u Humira potenciji ELISA prikazuje poboljšanu potenciju u 2. cepanju (od scIgG do F(ab’)2) IgG 1 u poređenju sa pCART124 (originalna IdeS). Nešto niža aktivnost pCART226 u cepanju IgG1 je prikazana kod oba Humira ELISA testa potencije i Humira testa efikasnosti analiziranom sa SDS-PAGE.

1

[0152] U ELISA testu potencije XGEVA pokazano je da svaki od ispitivanih polipeptida pCART207, 217, 219 i 226 ima nižu potenciju u poređenju sa IdeS (pCART124) u cepanju oba IgG teška lanca IgG2. Međutim, kada se umesto toga na gelu vizuelizuje cepanje jasno je da pCART207 ima približno istu aktivnost kao IdeS (BX1001865 i pCART124) u 1. cepanju teškog lanca IgG, gde je oko 3 puta manje efikasan (jedan korak titracije) u 2. cepanju u poređenju sa IdeS. Isti obrazac je uočen za pCART229 sa visokom efikasnosti u cepanju IgG1, u poređenju sa aktivnosti IdeS, ali sa nižom efikasnosti za cepanje IgG2, primarno isecanjem 2. teškog lanca IgG. Analizom cepanja IgG na gelu isecanjem 1. teškog lanca (od IgG do scIgG) postaje evidentno, ovo cepanje je nevidljivo u ELISA potenciji korišćenjem Fcspecifičnog detektorskog antitela. Većina Fc-posredovanih akcija IgG su izgubljena već u jednom molekulu koji se cepa (podaci nisu prikazani), koje su centralne u kliničkoj situaciji gde je glavni fokus onesposobiti patogene molekule IgG.

[0153] IVIg je skup humanih IgG koji sadrži približno 65-70% IgG1, 35-30% IgG2 i IgG3/IgG4 koji dele približno 1%. Humani IVIg takođe prirodno sadrži anti-IdeS antitela, iz ranijeg izlaganja IgG donora S. pyogenes, neka od ovih antitela će biti neutrališuća tj. vezivanje ovih IdeS specifičnih antitela sa IdeS će smanjiti ili potpuno uništiti IdeS proteaznu aktivnost IgG. Rezultati cepanja IVIg različitim polipeptidima IgG cistein proteaze na taj način prikazuju sveukupno cepanje svih četiri potklasa humanih IgG u približno njihovom normalnom odnosu u normalnom serumu ali takođe u prisustvu neutrališućih anti-IdeS antitela.

[0154] Uopšteno svi ispitivani polipeptidi IgG cistein proteaze imaju nižu efikasnost u cepanju IgG2 u poređenju sa IgG1. pCART207, 217 i 219 su efikasniji u odnosu na IdeS u cepanju IgG1 ali manje efikasni u cepanju primarno 2. teškog lanca IgG2. scIgG trake uočene na slici 16 u najvećoj dozi (6 µg/ml) pCART207, 217, 219 i 226 i na slici 17 za pCART229 najverovatnije predstavljaju molekule IgG2 u IgG skupu, IVIg (uporediti sliku 14A sa 14B i 15A sa 15B).

Tabela 1. EC50 (ng/ml) mereno potencijom ELISA i stepenom promene u potenciji u poređenju sa originalnom IdeS (pCART124).

Tabela 2. Podaci IgG1 (Humira) cepanja prikazani na gelu (slika 14A). Koncentracija (ng/ml) polipeptida potrebna da se postigne 1 i 2 cepanje IgG, gde cepani proizvod dominira u količinama u odnosu na necepani. Približna vrednost EC50 (* na slici 14A).

2

Tabela 3. Podaci za cepanje IgG2 (KSGEVA) prikazani na gelu (slika 14B). Koncentracija (ng/ml) polipeptida potrebna da bi se postiglo cepanje 1-og i 2-og IgG, pri čemu cepani proizvod dominira u odnosu na necepani. Približna vrednost EC50 (* na slici 14B).

Tabela 4. Podaci za IgG1 (Humira) cepanja i IgG2 (XGEVA) sa pCART229 prikazanim na gelu (slika 15). Koncentracija (ng/ml) polipeptida koji je potreban da se postigne 1. i 2. cepanje IgG (gde cepani proizvod dominira u količinama u odnosu na necepani).

Tabela 5. Podaci za IVIg cepanje sa pCART207, 217, 219 i 226 prikazani na gelu (slika 16). Koncentracija (ng/ml) polipeptida koja je potrebna da bi se postiglo 1. i 2. cepanje IgG, gde cepani proizvod dominira u količinama u odnosu na necepani.

Tabela 6. Podaci za IVIg cepanje sa pCART229 prikazani na gelu (slika 17). Koncentracija (ng/ml) polipeptida potrebnog da bi se postiglo 1 i 2 cepanje IgG, gde cepani proizvod dominira u količinama u odnosu na necepani.

Primer 5 -ADA ELISA, kompetitivna ELISA za ADA-IdeS mesta vezivanja.

[0155] Mesta vezivanja antitela na lek (ADA) protiv IdeS merena su za "ADA" modifikovani polipeptid pronalaska (pCART207, 217, 219 i 226), korišćenjem ELISA testa zasnovanog na Meso Scale Discovery (MSD). Princip ELISA bio je da se bunarčići na ploči sa više titara oblože originalnim his-tagged-IdeS (pCART124). Većina ljudi imaju antitela protiv IdeS u svom serumu zbog ranijih infekcija S. piogenes. Ovde su dve različite grupe kliničkih humanih seruma korišćene kao standardi za detekciju ADA. Prvi skup je normalan humani serum iz skupa seruma od 100 pojedinaca, nazvan Humani serumski skup 1191807, a drugi je skup seruma pacijenata u fazi II studije 13-HMedIdeS-02, nazvan Faza II skup-2. Ovim pacijentima je davan IdeS jednom u rasponu doza od 0.24 -0.5 mg/kg telesne težine i na taj način su indukovali nivoe (približno 50 puta) anti-IdeS ADA u njihovom serumu.

[0156] Pregled ove konkurentne ADA ELISA analize je da je IdeS (pCART124) obložen na dnu mikro titarske ploče. Setovi humanog seruma se prethodno inkubiraju zajedno sa polipetidom koji se ispituje na mesta prepoznavanja ADA, ili sa pozitivnom kontrolom IdeS (pCARTI24) u molarnom odnosu 1:100 sa 100x viškom ispitivanog polipeptida. Koncentracija dva različita seta seruma korišćena za preinkubaciju je procenjena na osnovu standardne krive da daje približno 80% vezivanja za originalni IdeS. Ako su mesta vezivanja ADA ukinuta u ispitivanim polipeptidima, ovi polipeptidi ne bi mogli da se takmiče sa vezivanjem ADA za originalni IdeS na dnu bunarčića, tj. nizak signal pokazuje snažnu ADA sličnost sa originalnim IdeS (pCART124) a visok signal pokazuje slabu ADA sličnost sa originalnim IdeS.

[0157] Koncentracija oba standarda postigla je približno 80% vezivanje na linearnom delu standardne krive bila je oko 200 ng ADA (IdeS)/ml. U kompetitivnoj preinkubaciji ova koncentracija oba standarda je korišćena odvojeno i koncentracija polipeptida IgG cisteinske proteaze je korišćena u razmeri 100 puta koncentracije ADA, uključujući razliku u molekulskoj težini između antitela 150 kDa i IdeZ od približno 35 kDa, 4.2 puta, dajući 100 puta 200 ng/ml deljenjem sa 4.2 dajući približno 5 µg/ml ispitivanih polipeptida. Standardni serum sadrži 200 ng/ml ADA i IdeS (pCART124) ili ispitivani polipeptidi su zajedno prethodno inkubirani u trajanju od 1 h na sobnoj temperaturi (ST). Kao kontrola za maksimum vezivanja ADA, standardi u istoj koncentraciji su prethodno inkubirani bez IdeS (pCART124) ili bilo kojim drugim IgG cisteinskim proteazama i korišćeni kao maksimalna vrednost 80% vezivanja. Najniži nivo standarda krive, su korišćeni kao donje granične vrednosti za opseg izračuna kompeticije. Srednja vrednost za standarde prethodno inkubirane sa IdeS (pCART124) ili ispitivanih polipeptida je oduzet sa 80% standardnom vrednošću vezivanja podeljenom sa 80% standardnom vrednošću vezivanja oduzetom sa donjim graničnim vrednostima dajući % kompetitivne vrednosti.

4

Polipeptid IgG cisteinske proteaze sa najnižim % kompeticije znači da većina epitopa koji se vezuju za ADA ukinuti u poređenju sa IdeS (pCART124).

[0158] Kratak pregled laboratorijskog protokola: Bunarčići u višetitarskim pločama su obloženi preko noći sa pCART124 (1 mg/ml), isprani su 3 puta sa PBS-T i blokirani u trajanju od 1 sat sa 0.45% želatinom riblje kože i 2 mM inhibitorom cisteinske proteaze jodosirćetnom kiselinom u (IHAc) u PBS-u.

[0159] Oba standarda su pripremljena kao titracione serije u koracima razblaženja 1:3 u 0.45% želatinu riblje kože i 2 mM IHAc u PBS, od 5000 ng ADA (IdeS)/ml do 2.5 ng ADA (IdeS)/ml da se omogući prikaz standardne kalibracione krive za test, sa merenjima i linearnog dela i maksimuma i minimalnog dela standardne krive. U isto vreme sa blokiranjem ploče, standardi i IdeS (pCART124) ili ispitanim polipeptidima su prethodno inkubirani zajedno tokom 1 h na ST, tj. uzorci u koraku kompeticije, korišćenjem 200 ng/ml ADA (standardi) i 5 mg/ml IdeS kontrole (pCART124) ili polipeptidi IgG cisteinske protease za ispitivanje.

[0160] Ploča obložena sa pCART124 je isprana 3 puta i zatim se u svaki bunarčič ploče sa više titara dodaje 50 µl pre-inkubiranih uzoraka ili 50 µl standarda.

[0161] Ploča je inkubirana na ST tokom 2h i zatim je isprana sa PBS-T. Kozji-anti-humani F(ab) specifični F(ab)2fragment-bio (Jackson #109-066-097, 0.65 mg/ml), (1000x razblaženja) je dodat kao antitelo za detekciju i Streptavidin-Sulfo (MSD Cat. No: R32AD-1 ili R32AD-5) (2000x razblaženja) u puferu za blokiranje inkubiran u trajanju od 1 h na ST u mraku. Ploča je isprana 3 puta i pufer za čitanje T (MSD pufer za čitanje T (4x) 4x razblažen je dodat i ploča je direktno analizirana na Čitaču ploča, MSD (Meso Scale Discovery) QuickPlex SQ 120 Model 1300.

Rezultati i diskusija

[0162] Procenat (%) blokiranja IdeS-ADA vezujućih mesta za pCART207, 217, 219 i 226 prikazan je na Slici 19 i Slici 20 i originalni IdeS pCART124 se koristi kao pozitivna kontrola za 100% sličnosti.

[0163] Svi testirani polipeptidi IgG cisteinske proteaze, pCART207, 217, 219 i 226 zauzimaju manje mesta vezivanja ADA u humanom serumu u poređenju sa originalnim IdeS (pCART124). Pacijenti koji su jednom tretirani sa IdeS (Faza II skup-2) razvili su više IdeS specifičnih ADA i bilo je minimalno prepoznavanje pCART207, 217 i 219 (Slika 20) u poređenju sa skupom seruma iz zdravih volontera (skup humanog seruma 1191807) (Slika 19).

Primer 6 - Procena in vivo efikasnosti u Octagam (human IVIg) modelu miša

[0164] U ovoj studiji BALB/c miševima je intraperitonealno ubrizgan (i.p.) humani IVIg (Octagam). Koncentracija humanog IVIg je primenjena u dozi 900 mg/kg, da korelira sa koncentracijom humanog IgG u plazmi (10 mg/ml).

[0165] Humani IVIg je ubrizgan i.p. dana 0. Dvadeset i četiri časa (dan 1) nakon ubrizgavanja IVIg, PBS, IdeS kontrole (BX1001865 i pCART124), ili proteaze IgG koje će se ispitati, pCART207, pCART217, pCART219 i pCART226, su primenjeni intravenozno (i.v.) u dozi od 1 mg/kg. Dva sata kasnije sakupljeni su uzorci seruma i miševi su žrtvovani.

Efikasnost ELISA

[0166] Princip testa je bio obložiti bunarčiće multititarske ploče sa F(ab’)2-fragmentom usmerenim na humana IgG antitela sa specifičnošću prema Fab regionu. Zatim je dodat serum iz miševa koji su tretirani sa IVIg i IdeS kontrolama (BX1001865 i pCART124) ili ispitivani polipeptid IgG cistein proteaze. Količina inaktnog ili jednom cepanog humanog IgG (IVIg) vezanog za bunarčiče je merena korišćenjem antitela za detekciju usmerenog na humani IgG (IVIg) sa specifičnošću protiv Fc dela antitela. Što je niža otkrivena koncentracija intaktnog humanog IgG antitela (IVIg) očekuje se da će biti efikasniji polipeptid IgG cisteinske proteaze.

[0167] Kratak pregled laboratorijskog protokola: Bunarčići višetitarske ploče su obloženi preko noći (+2-8°C) sa Kozjim-anti-humanim Fab-specifičnim F(ab)2-fragmentom (0.5 mg/ml) (Jackson #109-006-097), zatim su isprani sa PBS+0.05% Tween 20 (PBS-T) i blokirani u 2% BSA u PBS-T (pufer za blokiranje) tokom 45-120 min na ST (sobnoj temperaturi). Kalibrator humanog serumskog proteina (DAKO #X0908) je korišćen kao standard i dodat u opsegu od 0.5-300 ng/ml. Uzorci seruma koji su uzeti iz miševa tretiranih sa IVIg i različitim polipeptidima IgG cistein proteaze su otopljeni i razblaženi u puferu za blokiranje 100000 puta pre dodavanja na multititarsku ploču testa. Ploča je inkubirana 2 h uz mućkanje na ST i zatim je isprana sa PBS-T. Biotinilovano mišje anti-humano IgG Fc-specifično (600 ng/ml) (Jackson #109-066-098) antitelo je pomešano sa Strep-sulfo (200 ng/ml) (MSD #R32AD-1) i dodato na multititarsku ploču. Ploča je zatvorena aluminijumskom trakom i inkubirana na ST u trajanju od 1 h sa mućkanjem. Ploča je zatim isprana u PBS-T i 150 µl 23 razblaženog pufera za čitanje T (MSD #R92TC-2) je dodato u svaki bunarčić. Ploča je odmah direktno analizirana na čitaču ploča, MSD (Meso Scale Discovery) QuickPlex SQ 120 Model 1300.

Efikasnost vizuelizacije na gelu

[0168] Da bi se vizuelizovalo in vivo cepanje humanog IgG u mišu 10 µl seruma je razblaženo u razmeri 1: 10 u 90 µl PBS. Zatim je 10 µl razblaženog seruma pomešano sa 30 µl 4 X SDS-PAGE pufera za nalivanje. 5 µl IgG internog markera je korišćeno da se pokažu različiti fragmenti IgG (IgG, scIgG i F(ab’)2). Uzorci su zagrejani na 92°C tokom 3 min (Thermo mixer compact, ependorf) i kratko centrifugirani pre nanošenja 10 µl na 4-20% Mini-Protean<®>TGX, Stain-free<™>gel (Cat. #456-8096, Biorad). Gelovi su vođeni na 200 V u trajanju od 40 min.

Rezultati i zaključak

[0169] In vivo cepanja humanog IVIg (Octagam) sa IdeS (BX1001865 i pCART124) i pCART207, 217, 219 i 226 su poređenja ispitivanjem nivoa humanog IgG u serumu pomoću ELISA efikasnosti i analizom degradacije IgG sa SDS-PAGE.

[0170] Tretman sa IdeS (BX1001865 i pCART 124) i različitim IgG cisteinskim proteazama pCART207, pCART217, pCART219 i pCART226 u IVIg-miševima nedvosmisleno je pokazao cepanje humanog IgG in vivo na ovom mišjem modelu (Tabela 7 i slika 21).

[0171] Potpuno cepanje je prikazano za IdeS kontrolu (BX1001865), pCART207 i pCART217, bez vidljivih scIgG traka i značajnih F(ab’)2traka na gelovima (Slika 22). pCART219 i pCART226 su pokazali smanjenu efikasnost u ovom mišjem modelu sa scIgG molekulima koji su još uvek prisutni u serumu miša nakon dva sata (Slika 22C). Međutim, na gelu nije mogao da se detektuje intaktni IVIg što ukazuje da viša koncentracija IgG-Fc sa antitelom za detekciju (viša traka) za pCART219 i pCART226 na slici 21 dolazi od scIgG a ne od intaktnog IgG. Miš br: 2 u pCART207 grupi i miš br: 4 u pCART219 grupi nisu primili IVIg injekciju (Slika 22B i C), prema tome na gelu ovih životinja nisu vidljivi fragmenti cepanja IgG. Obrasci proteinskih traka će predstavljati pozadinske proteine u serumu BALB/c miša. Ovo pokazuje da polipeptidi iz pronalaska cepaju IgG u in vivo modelu.

[0172] Tabela 7. Analiza in vivo cepanja of humanog IgG u serumu iz miševa tretiranih sa IdeS (BX1001865 i pCART124 / testirane IgG cistein proteaze pomoću ELISA efikasnosti (srednja vrednost ± Stdev).

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

11

12

1

14

1

11

12

1

11

12

1

14

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Polipeptid koji ima aktivnost IgG cistein proteaze i sadrži varijantu sekvence SEQ ID NO:4 ili 5, pri čemu je varijanta:

(a) najmanje 80% identična SEQ ID NO: 4 ili 5;

(b) ima cistein (C) na poziciji u pomenutoj varijanti sekvence koja odgovara poziciji 102 SEQ ID NO: 3; i

pri čemu je pomenuti peptid efikasniji u cepanju humanog IgG od IdeZ i/ili je bar jednako efikasan u cepanju humanog IgG kao IdeS; dalje pri čemu pomenuta varijanta sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5:

(2) ima pozitivno naelektrisanu aminokiselinu na poziciji u pomenutoj varijanti koja odgovara poziciji 139 SEQ ID NO: 3, opciono gde pomenuta pozitivno naelektrisana aminokiselina je arginin (R) ili lizin (K); i/ili

(3) ne uključuje susednu sekvencu DDYQRNATEA YAKEVPHQIT; i/ili

(4) ima bar jednu od sledećih modifikacija:

ii. treonin (T) umesto arginina (R) na poziciji u pomenutoj varijanti koji odgovara poziciji 70 SEQ ID NO: 3;

iii. delecija tirozina (Y) na poziciji u pomenutoj varijanti koji odgovara poziciji 71 SEQ ID NO: 3; iv. glutamin (Q) umesto asparagina (N) na poziciji u pomenutoj varijanti koji odgovara poziciji 72 SEQ ID NO: 3;

vi. alanin (A) umesto glutaminske kiseline (E) na poziciji u pomenutoj varijanti koji odgovara poziciji 67 SEQ ID NO: 3;

vii. asparagin (N) umesto glutamina (Q) na poziciji u pomenutoj varijanti koji odgovara poziciji 68 SEQ ID NO: 3.

2. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuta varijanta sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5 je bar 90%, 95% ili 99% identična SEQ ID NO: 4 ili 5, tim redom, i/ili pri čemu je pomenuti polipeptid manje imunogen od IdeS i poželjno ne više imunogen od IdeZ ili IdeS/Z, kada je mereno u istom testu.

3. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji sadrži ili se sastoji od sekvence prema bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6 do 25, opciono gde pomenuta sekvenca uključuje dodatni metionin na N terminusu i/ili histidinski tag na C terminusu.

4. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je pomenuti polipeptid najmanje 2.0 puta efikasniji od IdeZ u cepanju IgG, kada je mereno u istom testu.

5. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva koji je manje imunogen od IdeS, pri čemu poželjno imunogenost pomenutog polipeptida nije veća od 85% imunogenosti IdeS kada je mereno u istom testu.

6. Polinukleotid ili ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.

7. Ćelija domaćina koja sadrži polinukleotid ili ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 6, koja je poželjno bakterijska ćelija, najpoželjnije ćelija E. coli.

8. Kompozicija koja sadrži polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 i bar jedan farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

9. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za upotrebu u lečenju humanog ili životinjskog tela.

10. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za upotrebu u postupku prevencije ili lečenja bolesti ili stanja kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata davanje polipeptida subjektu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 subjektu u profilaktički ili terapeutski efikasnoj količini, pri čemu pomenuta bolest ili stanje je bolest ili stanje koje je posredovano u celini ili delom patogenim IgG antitelima, poželjno gde je pomenuta bolest ili stanje navedeno u Tabeli D.

11. Postupak ex vivo za cepanje IgG, postupak obuhvata dovođenje u kontakt uzorka koji sadrži IgG sa polipeptidom u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5 pod uslovima koji omogućavaju da se dogodi aktivnost IgG cistein proteaze.

12. Postupak ex vivo prema patentnom zahtevu 11 koji je sproveden za dobijanje Fc i Fab fragmenata i/ili gde je uzorak uzorak krvi uzet iz subjekta koji boluje od bolesti ili stanja kao što je definisano u patentnom zahtevu 10.

1