KR20210126029A - 체액성 면역을 회피하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

체액성 면역을 회피하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 부분적으로 AAV 벡터에 대한 중화 항체를 일시적으로 제거하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 조성물 및 방법은 유전자 요법에 적합한 환자 코호트를 확장하고, 기존에 AAV 벡터가 처치된 환자에 AAV를 재투약/재투여하기 위한 것이다.

Description

체액성 면역을 회피하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2019년 10월 14일자 미국 가출원 번호 62/914,682 및 2019년 1월 28일자 미국 가출원 번호 62/797,495에 대해 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
전자 제출된 문서 파일에 대한 설명
본 출원과 함께 전자 제출된 문서 파일의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다: 서열목록의 컴퓨터 판독가능한 형식의 복사본 (파일명: STRD_014_02WO_SeqList_ST25.txt, 기록일 2020년 1월 28일, 파일 크기 ~180 kb).
기술 분야
본 출원은 일반적으로 유전자 요법, 예를 들어 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터를 이용한 유전자 요법 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 내용은 재조합 AAV 처치 효과를 개선하기 위한 조성물 및 재조합 AAV에 대한 중화 항체를 저하하는 조성물 및 방법을 이용한 재조합 AAV 처치 효과를 개선하는 방법에 관한 것이다.
연방 자금 지원
본 발명은 국립 심장, 폐 및 혈액 협회 (NIH/NHLBI)로부터 부여된 연방 지원 번호 R01HL089221 및 국립 일반 의학 과학 협회 (NIH/NIGMS)로부터 부여된 연방 지원 번호 R01GM127708의 정부 지원 하에 수행되었다. 연방 정부가 본 발명에 대해 소정의 권리를 가진다.
아데노-부속 바이러스 (AAV)는 인간에서 치료학적 유전자를 전달하는데 이용가능한 헬퍼-의존적인 파르보바이러스이다. 최초의 AAV1-기반의 유전자 요법이 2012년에 규제 기관으로부터 승인된 이후로, 레버 선천성 흑내장, 혈우병 및 기타 질환들에 대한 재조합 AAV 벡터를 이용한 임상 유전자 요법 실험들에서 고무적인 결과들이 발표되어 왔다.
유전자 요법 실험은 여러가지 천연 AAV 분리주들을 이용하고 있지만, 참가하고자 하는 향후 환자들에서 항-AAV 중화 항체 (NAb) 역가가 낮거나 또는 검출되지 않아야 한다는 동일한 제외 기준이 공통적으로 적용되고 있다. 이러한 자격 기준은 인간 집단에서 자연 노출로 발생되는 기존 항-AAV Nab에 대한 높은 유병률로 인해 확립되었으며; 예를 들어, 심부전 인간 개체에서 역가 >1:2에서 항-AAV1 NAb 양성인 전체 유병률은 ~60%이다. 아울러, AAV 혈청형 2에 대한 Nab 역가가 높은 대부분의 환자들은 AAV1에 대해서도 측정가능한 수준의 역가가 확인되는데, 이는 혈청형 간의 교차-반응성을 시사해준다. Nab는 옵소닌화를 통해 AAV 벡터의 유전자 전달 효율을 실질적으로 감소시키며, 그래서 이의 제거가 가속화되고, 생체분포가 변형되고, 세포 표면 수용체에의 결합이 차단되며, 및/또는 효율적인 형질도입에 필수적인 부착 이후의 과정에 부정적인 영향을 미치게 된다.
이미 존재하는 항-AAV Nab에 대한 해결 전략을 개발하고자 하는 시도들은 AAV 캡시드 조작 및 유인, 일시적인 약리학적 면역조절, 및 혈장분리교환술에 초점이 맞추어져 있다. 이러한 방식들은 전임상 동물 모델 및 인간에서 이미 존재하는 Nab를 피하거나 또는 감소시킴으로써 AAV 유전자 전달을 강화할 가능성이 제한적인 것으로 확인되었다.
이에, 당해 기술 분야에서는, AAV 벡터를 이용한 유전자 전달의 효율을 개선하기 위해, 기존 항-AAV Nab와 개체에 AAV 벡터 투여 후 이에 대한 항체 생성을 낮추거나, 없애거나 또는 비활성화하기 위한 조성물 및 방법들이 요구되고 있다.
본 발명은 필요한 개체에서 하나 이상의 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 중화 항체의 함량을 저하하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법은, 예를 들어, 개체에서 AAV의 순환 시간 및/또는 감염성을 높임으로써, 유전자 전달 효율을 개선할 수 있다. 본원에 기술된 조성물 및 방법은 또한 이전에 치료학적 AAV가 처치된 개체에 치료학적 AAV를 재-투여 가능하게 해준다. 일부 구현예에서, 필요한 개체에서 NAb를 저하하기 위해 IdeZ와 같은 항체-분해 효소의 야생형 또는 돌연변이 형태 (또는 이의 단편)를 투여한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 중화 항체의 분해를 촉진하는 조성물을 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 중화 항체의 함량을 필요한 개체에서 저하하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, (a) AAV 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하거나, 및/또는 (b) Fc 수용체에 대한 중화 항체의 결합을 저하하는 조성물을 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터를 이용한 처치를 위해 필요한 개체를 준비시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, (i) (a) AAV 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하거나, 및/또는 (b) Fc 수용체에 대한 중화 항체의 결합을 저하하는 조성물을 유효량으로 개체에 투여하는 단계; 및 (ii) AAV 벡터를 유효량으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 필요한 개체를 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터로 처치하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, (i) (a) 제1 재조합 AAV 벡터 및/또는 제2 재조합 AAV 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하거나, 및/또는 (b) Fc 수용체에 대한 상기 중화 항체의 결합을 저하하는 조성물을 유효량으로 개체에 투여하는 단계; 및 (ii) 개체에 유효량의 제2 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 제1 재조합 AAV가 이미 처치된 필요한 개체에 제2 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터를 처치하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, AAV 벡터, 및 (a) AAV 벡터 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 재조합 단백질에 대한 항체의 분해를 촉진하거나; 및/또는 (b) Fc 수용체에 대한 항체의 결합을 저하하는 조성물을 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체에서 이종의 핵산을 포함하는 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 중화 항체를 저하하는 방법을 제공한다.
본원에 기술된 조성물은, 예를 들어, 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기한 조성물은 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기한 항체-분해 효소 또는 이의 단편은 시스테인 프로테아제 활성을 가진다. 일부 구현예에서, 상기한 항체-분해 효소는 IgG를 특이적으로 절단한다. 일부 구현예에서, 상기한 항체-분해 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
이하, 이들 구현예들과 기타 구현예들이 보다 상세하게 기술될 것이다.
도 1A-1B. 도 1A는 GST-IdeZ 발현 벡터의 지도를 도시한다. 이 벡터를 이용해, 재조합 GST-IdeZ를 E. coli에서 발현시켰으며, 글루타티온 세파로스를 사용해 정제하였다. 도 1B는 정제한 GST-IdeZ를 가시화하기 위해 이용한 겔 사진을 보여준다.
도 2A-2D. 도 2A에는 재조합 IdeZ가 무처리 (-) 또는 처리 (+)된 재조합 IgG 샘플의 밴드 패턴을 보여주는 코마시 염색된 SDS-PAGE 겔 사진을 도시한다. 도 2B는 rIdeZ가 무처리 (-) 또는 처리 (+)된 마우스 혈청, 영장류 혈청 및 인간 혈청 샘플의 밴드 패턴을 보여주는 동일하게 염색된 SDS-PAGE 겔 사진을 도시한다. 도 2A 및 2B에서, *는 IgG 중쇄 절단 산물 (~31 kDa)을 표시한다. 도 2C는 재조합 IdeZ가 개 유래 혈청 IgG를 절단함을 입증해주는 유사 실험의 결과를 도시한 것이고, 도 2D는 인간 환자 유래 혈청 IgG의 IdeZ 절단을 도시한 것이다.
도 3A-3B. 도 3A는 IdeZ가 마우스에서 인간 IVIG를 생체내 절단함을 보여주는 웨스턴 블롯 사진이다. *는 절단 산물을 표시한다. 도 3B는 인간 IVIG에 IdeZ를 시험관내 처리한 이후의 밴드 패턴을 보여주는 코마시 염색된 SDS-PAGE 겔 사진이다.
도 4. 도 4에는 마우스에 인간 정맥내 면역글로불린 (IVIG)을 복막내 주사한 다음 24시간 후 PBS 또는 재조합 IdeZ (2.5 mg/kg) 및 AAV8-Luc (5 x 1012 vg/kg)를 주사한 실험의 결과를 보여주는 그래프가 제시된다. 간에서 루시퍼라제 (Luc) 전이유전자 수준을 간에 주사한 지 4주 후 분석하였다. 루시퍼라제 발현 수준을 총 조직 단백질 농도에 대해 표준화하고, 간 조직 g 당 상대적인 광도 단위 (RLU)로 나타내었다. 모든 실험은 3세트로 수행하였다. L.O.D = 검출 한계. * p < 0.05.
도 5. 도 5는 IdeZ 단백질의 결정 구조를 도시한 것이다. 각 패널은 여러가지 뷰를 도시한다.
도 6. 도 6에서, 지정된 혈청 샘플에 재조합 GST-IdeZ (1 ㎍)를 3시간 동안 37℃에서 처리 (+)하거나 또는 무처리 (-)하였다. 반응물을 1:10으로 희석하고, 환원 조건 하에 SDS-PAGE로 분석하였다. 그런 후, 겔을 코마시 블루로 염색하였다. *는 IgG 중쇄 절단 산물 (~31 kDa)을 표시한다.
도 7. 도 7은 인간 IVIG 8 mg을 마우스 복막내 주사한 실험의 결과를 보여준다. 24시간 후, 동일 마우스에 PBS (-) 또는 재조합 GST-IdeZ (2.5 mg/kg) (+)를 정맥내 주사하였다. IVIG 주사하기 전 혈액 샘플을 채혈하였으며, IVIG 주사 후 24시간, 48시간 및 72시간 경과시 혈액 샘플을 채혈하였다. 혈액 샘플을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. HRP가 접합된 염소 항-humIgG (1:10,000) 2차 항체로 IVIG를 탐침하였다. 각각의 레인은 개개 마우스로부터 수득한 혈액 샘플이다.
도 8A-8B. 도 8A-8B는 인간 IVIG 8 mg을 마우스 복막내 주사한 실험의 결과를 보여준다. 24시간 후, 동일 마우스에 PBS (-) (도 8A, 좌측 패널) 또는 재조합 GST-IdeZ를 투여량 0.25 mg/kg (도 8A, 우측 패널), 1 mg/kg (도 8B, 좌측 패널) 또는 2.5 mg/kg (도 8B, 우측 패널)(+)으로 정맥내 주사하였다. IVIG 주사 후 72시간 경과시 혈액 샘플을 채혈하고, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. HRP가 접합된 염소 항-humIgG (1:10,000) 2차 항체로 IVIG를 탐침하였다. 각각의 레인은 개개 마우스로부터 수득한 혈액 샘플이다.
도 9. 도 9는 인간 IVIG 8 mg을 마우스 복막내 주사한 실험의 결과를 보여준다. 24시간 후, 동일 마우스에 PBS (-) 또는 재조합 GST-IdeZ (1 mg/kg) (+)를 정맥내 주사하였다. IVIG 주사 후 72시간 경과시 혈액 샘플을 채혈하고, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. HRP가 접합된 염소 항-humIgG (1:10,000) 2차 항체 또는 HRP가 접합된 염소 항-humIgG Fc (1:10,000) 2차 항체로 IVIG를 탐침하였다.
도 10. 도 10은 인간 IVIG를 이용한 AAV8-Luc의 중화 프로파일을 나타낸 것이다. 인간 IVIG 샘플을 GST-IdeZ (1 ㎍)로 처리하거나 또는 무처리하였으며, 1:1000에서 1:102,400까지 2배씩 증가시켜 연속 희석하였다. 그 후, 샘플을 AAV8-Luc (100,000 vg/세포)와 시험관내에서 공배양하였다. 실선은 IVIG 처리된 AAV8-Luc와, 여러가지 IVIG 희석물에서 GST-IdeZ와 사전 인큐베이션한 IVIG로 처리된 AAV8-Luc의 상대적인 형질도입 효율을 나타낸다. 오차 막대는 SEM (n=3)을 나타낸다.
도 11. 도 11은 마우스 간에서 AAV8-Luc 카피 수를 나타낸 것이다. 각각의 막대는 서로 다른 마우스이다. 앞의 막대 8개는 AAV8 단독 주사한 마우스 (PBS-PBS-AAV8)이다. 그 다음 막대 6개는 재조합 IdeZ 및 AAV8-Luc (PBS-IdeZ-AAV8) 주사한 마우스이다. 그 다음 막대 6개는 IVIG 주사한 다음 AAV8-Luc 주사한 마우스 (IVIG-PBS-AAV8)이다. 마지막 막대 8개는 IVIG 주사 후, IdeZ 및 AAV8-Luc 둘다 주사한 마우스 (IVIG-IdeZ-AA8)이다. 세포별 벡터 게놈의 카피수를 계산하였다.
도 12A-12D. 도 12A-12D에는 인간 IVIG 8 mg을 마우스 복막내 주사한 다음 72시간 후 PBS 또는 재조합 GST-IdeZ (2.5 mg/kg)를 주사한 실험의 결과를 보여주는 그래프가 제시된다. IdeZ 처리 후 72시간 경과시 AAV9-Luc (2 x 1011 vg/kg)을 마우스에 정맥내 주사하였다. 간 및 심장에서 주사 후 4주 경과시 간의 루시퍼라제 (Luc) 전이유전자 발현 수준을 분석하였다. 루시퍼라제 발현 수준을 전체 조직 단백질 농도에 대해 표준화하고, 간 조직 g 당 상대적인 광도 단위 (RLU)로 나타내었다. 모든 실험은 3세트로 수행하였다. L.O.D = 검출 한계.
도 13A-13B. 도 13A-13B는 간 (도 13A) 및 심장 (도 13B)에서 형질도입 %를 나타낸 것이다. 인간 환자 18명으로부터 혈청 샘플을 수득하였다. 각각의 인간 환자 혈청 샘플 100 ㎕를 마우스 2마리에 복막내 주사하였다. 그 후, 72시간 경과하면, PBS 또는 재조합 GST-IdeZ (2.5 mg/kg)를 마우스에 정맥내 주사하였다. IdeZ 처리하고 72시간 후, AAV9-Luc (2 x 1011 vg/마우스)를 마우스 정맥내 주사하였다. 간 및 심장에서의 형질도입 수준을 주사 후 4주차에 분석하였다. 형질도입 수준은 혈청 처리 없이 AAV9-Luc (2 x 1011 vg/마우스) 주사한 대조군 마우스에 대해 표준화하였다.
달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원의 상세한 설명에서 사용된 용어들은 구체적인 구현예들을 단지 기술하기 위한 목적일 뿐 제한하고자 하는 것은 아니다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, GenBank 또는 기타 등재 번호 및 기타 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구항에서 AAV 캡시드 단백질에서 모든 아미노산 위치들은 VP1 캡시드 서브유닛 번호 체계를 따라 표시된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 언급된 변형들은, 만일 AAV cap 유전자에 삽입된다면, VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서브유닛에 변형이 발생될 수 있음을 알 것이다. 대안적으로, 캡시드 서브유닛들은 독립적으로 캡시드 서브유닛들 중 단 하나 또는 2종 (VP1, VP2, VP3, VP1 + VP2, VP1 + VP3, 또는 VP2 +VP3)에 변형이 달성되도록 발현될 수 있다.
문맥상 달리 지시되지 않은 한, 본원에 기술된 다양한 특징들은 임의의 조합으로 사용될 수 있는 것으로 명시적으로 의도된다.
정의
하기 용어들은 본원의 설명과 첨부된 청구항에서 사용된다:
단수 형태 ("a," "an" 및 "the")는 문맥상 명확하게 달리 지시되지 않은 한 복수 형태도 포괄하는 것으로 의도된다.
아울러, 본원에서, 용어 "약"은, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 서열의 길이, 양, 시간, 온도 등과 같이 측정가능한 값을 언급하는 경우에, 명시된 값에 대한 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5% 또는 심지어 ± 0.1%의 편차를 망라하는 것을 의미한다.
또한, 본원에서, "및/또는"는 연결하여 열거된 항목들 중 하나 이상의 임의의 모든 가능한 조합들뿐 아니라 선택 ("또는")으로서 해석될 경우에는 조합을 제외한 경우들을 의미하며, 이를 모두 포괄한다.
본원에서 수치 범위 언급은, 본원에 달리 지시되지 않은 한, 주로 그 범위에 속하는 각각의 개별 수치를 각각 지칭하는 약칭 방식으로서 사용하기 위한 것이며, 각각의 개별 수치는 본원에 각각 언급된 것처럼 명세서에 통합된다. 예를 들어, 만일 농도 범위가 1% 내지 50%로 언급된다면, 2% 내지 40%, 10% 내지 30% 또는 1% 내지 3% 등과 같은 수치들이 본 명세서에 명확하게 열거된 것으로 의도된다. 이는 구체적으로 의도되는 예일 뿐이며, 열거된 최소 값과 최대 값을 포함한 그 사이의 수치 값들의 모든 가능한 조합들이 본원에 명시적으로 언급된 것으로 간주하여야 한다.
본원에서, 용어 "아데노-부속 바이러스" (AAV)는 AAV 타입 1, AAV 타입 2, AAV 타입 3 (타입 3A 및 타입 3B 포함), AAV 타입 4, AAV 타입 5, AAV 타입 6, AAV 타입 7, AAV 타입 8, AAV 타입 9, AAV 타입 10, AAV 타입 11, AAV 타입 12, AAV 타입 13, AAV 타입 rh32.33, AAV 타입 rh8, AAV 타입 rh10, AAV 타입 rh74, AAV 타입 hu.68, 조류 AAV, 보바인 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 뱀 AAV, 비어디드 드래곤 AAV, AAV2i8, AAV2g9, AAV-LK03, AAV7m8, AAV Anc80, AAV PHP.B 및 그외 현재 공지되어 있거나 향후 발굴될 기타 AAV들을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)을 참조한다. 다수의 AAV 혈청형과 클레이드들이 동정되어 있다 (예를 들어, Gao et al, (2004) J. Virology 78:6381-6388; Moris et al, (2004) Virology 33-:375-383; 및 표 2 참조). 일부 구현예에서, AAV 벡터는 WO 2019/028306의 표 1에 기술된 임의의 AAV 벡터들로부터 선택되며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본원에서, 용어 "키메라 AAV"는 2종 이상의 서로 다른 AAV 혈청형으로부터 유래되는 영역, 도메인, 개별 아미노산을 가진 캡시드 단백질을 포함하는 AAV를 지칭한다. 일부 구현예에서, 키메라 AAV는 제1 AAV 혈청형으로부터 유래되는 제1 영역과 제2 혈청형으로부터 유래되는 제2 영역으로 구성되는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 AAV는 제1 AAV 혈청형으로부터 유래되는 제1 영역, 제2 혈청형으로부터 유래되는 제2 영역 및 제3 혈청형으로부터 유래되는 제3 영역으로 구성되는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및/또는 AAV12 중 2 이상으로부터 유래되는 영역, 도메인, 개별 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 AAV는 하기 (표 1) 나타낸 제1 AAV 혈청형 및 제2 AAV 혈청형으로부터 유래된 영역, 도메인 및/또는 개별 아미노산을 포함할 수 있으며, 여기서 AAVX+Y는 AAVX 및 AAVY로부터 유래된 서열을 함유한 키메라 AAV이다.
Figure pct00001
하나의 캡시드 단백질이 여러가지 AAV 혈청형들로부터 유래된 개개 아미노산 또는 영역들을 포함함으로써, 복수의 AAV 혈청형들로부터 각각 유래되는 복수의 원하는 특성을 가진 캡시드 단백질들을 입수할 수 있다.
다양한 혈청형의 AAV의 게놈 서열 및 자율적인 파르보바이러스의 게놈 서열 뿐 아니라 천연 말단 반복체 (TR), Rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 이들 서열은 문헌 또는 GenBank 등의 공공 데이터베이스에서 확인할 수 있다. 예를 들어, GenBank 등재 번호 NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852, AY530579를 참조하며; 이들 내용은 파르보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열에 대해 본 명세서에 원용에 의해 포함된다. 예를 들어, Srivistava et al., (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al, (1998) J Virology 71:6823; Chiorini et al., (1999) J. Virology 73: 1309; Bantel-Schaal et al., (1999) J Virology 73:939; Xiao et al, (1999) J Virology 73:3994; Muramatsu et al., (1996) Virology 221:208; Shade et al, (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al, (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; Moris et al, (2004) Virology 33:375-383; 국제 특허 공개번호 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 및 미국 특허 번호 6,156,303을 참조하며; 이들 내용은 파르보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열에 대해 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 또한, 표 2를 참조한다. 자율적인 파르보바이러스 및 AAV의 캡시드 구조는 BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)에 더욱 상세하게 기술되어 있다. 또한, AAV2 (Xie et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 10405-10), AAV9 (DiMattia et al., (2012) J. Virol. 86:6947-6958), AAV8 (Nam et al, (2007) J. Virol. 81: 12260-12271), AAV6 (Ng et al., (2010) J. Virol. 84:12945-12957), AAV5 (Govindasamy et al. (2013) J. Virol. 87, 11187-11199), AAV4 (Govindasamy et al. (2006) J. Virol. 80:11556-11570), AAV3B (Lerch et al., (2010) Virology 403:26-36), BPV (Kailasan et al., (2015) J. Virol. 89:2603-2614) 및 CPV (Xie et al, (1996) J. Mol. Biol. 6:497-520 및 Tsao et al, (1991) Science 251:1456-64)의 결정 구조에 대한 내용을 참조한다.
GenBank 등재 번호 GenBank 등재 번호 GenBank 등재 번호
전체 게놈 Clade C Rh57 AY530569
아데노-부속 바이러스 1 NC_002077, AF063497 Hu9 AY530629 Rh50 AY530563
아데노-부속 바이러스 2 NC_001401 Hu10 AY530576 Rh49 AY530562
아데노-부속 바이러스 3 NC_001729 Hu11 AY530577 Hu39 AY530601
아데노-부속 바이러스 3B NC_001863 Hu53 AY530615 Rh58 AY530570
아데노-부속 바이러스 4 NC_001829 Hu55 AY530617 Rh61 AY530572
아데노-부속 바이러스 5 Y18065, AF085716 Hu54 AY530616 Rh52 AY530565
아데노-부속 바이러스 6 NC_001862 Hu7 AY530628 Rh53 AY530566
조류 AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828 Hu18 AY530583 Rh51 AY530564
조류 AAV 균주 DA-1 NC_006263, AY629583 Hu15 AY530580 Rh64 AY530574
보바인 AAV NC_005889, AY388617, AAR26465 Hu16 AY530581 Rh43 AY530560
AAV11 AAT46339, AY631966 Hu25 AY530591 AAV8 AF513852
AAV12 ABI16639, DQ813647 Hu60 AY530622 Rh8 AY242997
Clade A Ch5 AY243021 Rh1 AY530556
AAV1 NC_002077, AF063497 Hu3 AY530595 Clade F
AAV6 NC_001862 Hu1 AY530575 Hu14 (AAV9) AY530579
Hu.48 AY530611 Hu4 AY530602 Hu31 AY530596
Hu 43 AY530606 Hu2 AY530585 Hu32 AY530597
Hu 44 AY530607 Hu61 AY530623 HSC1 MI332400.1
Hu 46 AY530609 Clade D HSC2 MI332401.1
Clade B Rh62 AY530573 HSC3 MI332402.1
Hu. 19 AY530584 Rh48 AY530561 HSC4 MI332403.1
Hu. 20 AY530586 Rh54 AY530567 HSC5 MI332405.1
Hu 23 AY530589 Rh55 AY530568 HSC6 MI332404.1
Hu22 AY530588 Cy2 AY243020 HSC7 MI332407.1
Hu24 AY530590 AAV7 AF513851 HSC8 MI332408.1
Hu21 AY530587 Rh35 AY243000 HSC9 MI332409.1
Hu27 AY530592 Rh37 AY242998 HSC11 MI332406.1
Hu28 AY530593 Rh36 AY242999 HSC12 MI332410.1
Hu 29 AY530594 Cy6 AY243016 HSC13 MI332411.1
Hu63 AY530624 Cy4 AY243018 HSC14 MI332412.1
Hu64 AY530625 Cy3 AY243019 HSC15 MI332413.1
Hu13 AY530578 Cy5 AY243017 HSC16 MI332414.1
Hu56 AY530618 Rh13 AY243013 HSC17 MI332415.1
Hu57 AY530619 Clade E Hu68
Hu49 AY530612 Rh38 AY530558 클론 분리
Hu58 AY530620 Hu66 AY530626 AAV5 Y18065, AF085716
Hu34 AY530598 Hu42 AY530605 AAV 3 NC_001729
Hu35 AY530599 Hu67 AY530627 AAV 3B NC_001863
AAV2 NC_001401 Hu40 AY530603 AAV4 NC_001829
Hu45 AY530608 Hu41 AY530604 Rh34 AY243001
Hu47 AY530610 Hu37 AY530600 Rh33 AY243002
Hu51 AY530613 Rh40 AY530559 Rh32 AY243003
Hu52 AY530614 Rh2 AY243007 기타
Hu T41 AY695378 Bb1 AY243023 Rh74
Hu S17 AY695376 Bb2 AY243022 비어디드 드래곤 AAV
Hu T88 AY695375 Rh10 AY243015 뱀 AAV NC_006148.1
Hu T71 AY695374 Hu17 AY530582
Hu T70 AY695373 Hu6 AY530621
Hu T40 AY695372 Rh25 AY530557
Hu T32 AY695371 Pi2 AY530554
Hu T17 AY695370 Pi1 AY530553
Hu LG15 AY695377 Pi3 AY530555
본원에서, 용어 "향성 (tropism)"은 바이러스가 특정 세포 또는 조직으로 선호적으로 유입되고, 선택적으로 이후 세포내에서 바이러스 게놈에 의해 운반된 서열(들)이 발현 (예를 들어, 전사, 선택적으로 번역)되는 것을, 예를 들어 재조합 바이러스의 경우에는 이종의 대상 핵산(들)이 발현되는 것을 의미한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 바이러스 게놈으로부터 이종의 핵산 서열의 전사가, 예를 들어, 유도성 프로모터의 경우, 트랜스-작용 인자 없이 또는 다른 조절되는 핵산 서열 없이 개시될 수 없음을 알 것이다. rAAV 게놈의 경우, 바이러스 게놈으로부터 유전자의 발현은 안정적으로 통합된 프로바이러스로부터, 통합되지 않은 에피좀으로부터, 뿐만 아니라 바이러스를 세포 내부로 흡수할 수 있는 임의의 기타 형태로부터 이루어질 수 있다.
본원에서, "전신 향성 (systemic tropism)" 및 "전신 형질도입 (systemic transduction)" (및 유사 용어들)은, 본원의 바이러스 캡시드 또는 바이러스 벡터가 각각 신체 전역의 조직 (예, 뇌, 폐, 골격근, 심장, 간, 신장 및/또는 췌장)에 대해 향성을 나타내거나 또는 형질도입되는 것을 의미한다. 구현예들에서, 근육 조직 (예, 골격근, 횡격막 및 심근)으로의 전신 형질도입이 관찰된다. 다른 구현예들에서, 골격근 조직으로의 전신 형질도입이 달성된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 기본적으로 전신의 모든 골격근으로 형질도입된다 (형질도입 효율은 근육의 유형에 따라 다를 수 있음). 특정 구현예에서, 사지 근육, 심근 및 횡격막 근육으로의 전신 형질도입이 달성된다. 선택적으로, 바이러스 캡시드 또는 바이러스 벡터는 전신 경로 (예, 정맥내, 관절내 또는 림프계내와 같은 전신 경로)를 통해 투여된다. 대안적으로, 다른 구현예에서, 캡시드 또는 바이러스 벡터는 국소로 (예, 발바닥으로, 근육내, 진피내, 피하, 국부적으로) 전달된다.
달리 지시되지 않은 한, "효율적인 형질도입" 또는 "효율적인 향성" 또는 유사 용어들은 적정 대조군을 참조하여 결정할 수 있다 (예, 대조군의 형질도입 또는 향성 각각에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 그 이상). 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 골격근, 심근, 횡격막근, 췌장 (베타-섬세포 등), 비장, 위장관 (예를 들어, 상피 및/또는 평활근), 중추 신경계 세포, 폐, 관절 세포 및/또는 신장에 대해 효율적으로 형질도입되거나 또는 효율적인 향성을 가진다. 적절한 대조군은 원하는 향성 프로파일을 비롯하여 다양한 인자들에 따라 결정될 것이다. 예를 들어, AAV8 및 AAV9은 골격근, 심근 및 횡격막근에 대한 형질도입이 매우 효과적이지만, 간으로의 형질도입은 효율은 높지만 문제점들이 존재한다. 따라서, AAV8 또는 AAV9을 골격근, 심근 및/또는 횡격막근으로 효율적으로 형질도입하지만, 간 형질도입 효율은 훨씬 낮은, 바이러스 벡터들을 동정할 수 있다. 또한, 대상 향성 프로파일은 복수의 표적 조직들에 대한 향성을 나타낼 수 있으므로, 적정 벡터는 균형을 유지할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이에 대한 설명으로, 본 발명의 바이러스 벡터는 골격근, 심근 및/또는 횡격막근의 형질도입에는 AAV8 또는 AAV9보다 효율이 낮을 수 있지만, 낮은 간 형질도입성으로 인해, 그럼에도 불구하고 매우 적합할 수 있다.
마찬가지로, 바이러스가 적절한 대조군을 참조하여 표적 조직에 대해 "효율적으로 형질도입되지 않는다" 또는 "효율적인 향성을 가지지 않는다" 또는 비슷한 표현으로 기술되는지를 정할 수 있다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 간, 신장, 생식샘 및/또는 생식 세포에 효율적으로 형질도입되지 않는다 (즉, 효율적인 향성을 가지지 않는다). 특정 구현예에서, 부적절한 조직(들) (예, 간)에 대한 형질도입은 원하는 표적 조직(들)(예, 골격근, 횡격막근, 심근 및/또는 중추 신경계 세포)에서의 형질도입 수준의 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만이다.
본원에서, 용어 "폴리펩타이드"는 달리 지시되지 않은 한 펩타이드 및 단백질 둘다를 포괄한다.
"폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 염기들로 된 서열이며, (자연 생성 및 비-자연 생성 뉴클레오티드 둘다를 포함한) RNA, DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드일 수 있지만, 대표적인 구현예들에서, 이는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 서열이다.
본원에서, "단리된" 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, "단리된 DNA" 또는 "단리된 RNA")는 자연 생성 유기체 또는 바이러스의 적어도 일부 다른 성분들로부터, 예를 들어, 세포 또는 바이러스 구조 성분 또는 통상적으로 폴리뉴클레오티드와 조합되어 발견되는 기타 폴리펩타이드 또는 핵산으로부터 일정 부분 이상 분리된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 대표적인 구현예에서, "단리된" 뉴클레오티드는 출발 물질과 비교해 적어도 약 10배, 약 100배, 약 1000배, 약 10,000배 또는 그 이상으로 농화된다.
마찬가지로, "단리된" 폴리펩타이드는, 자연 생성 유기체 또는 바이러스의 적어도 일부 다른 성분들로부터, 예를 들어 세포 또는 바이러스 구조 성분 또는 통상적으로 폴리펩타이드와 조합하여 발견되는 기타 폴리펩타이드 또는 핵산으로부터 일정 부분 이상 분리된 폴리펩타이드를 의미한다. 대표적인 구현예에서, "단리된" 폴리펩타이드는 출발 물질과 비교해 적어도 약 10배, 약 100배, 약 1000배, 약 10,000배 또는 그 이상의 수준으로 농화된다.
본원에서, 폴리펩타이드 또는 바이러스 벡터를 "단리한다" 또는 "정제한다" (또는 문법상 동의어)는, 폴리펩타이드 또는 바이러스 벡터를 출발 물질에 함유된 적어도 일부의 다른 물질로부터 일정 부분 이상 분리하는 것을 의미한다. 대표적인 구현예에서, "단리된" 또는 "정제된" 폴리펩타이드 또는 바이러스 벡터는 출발 물질과 비교해 적어도 약 10배, 약 100배, 약 1000배, 약 10,000배 또는 그 이상으로 농화된다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 수의학 및 의학적 용도 둘다에서 유용하다. 적절한 개체로는 조류 및 포유류 둘다를 포함한다. 본원에서, 용어 "조류"는 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조, 꿩, 앵무새, 잉꼬 등을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본원에서, 용어 "포유류"는 인간, 인간을 제외한 영장류, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개, 토끼목 등을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 인간 개체는 신생아, 유아, 청소년, 어른 및 노인 개체를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 개체는 6개월 미만, 2세 미만, 5세 미만, 10세 미만, 10-18세, 19-29세, 30-35세, 36-40세 또는 40세 이상일 수 있다. 대표적인 구현예에서, 개체는 본원에 기술된 방법을 "필요로" 한다. 용어 "개체" 및 "환자"는 본원에서 상호 호환적으로 인간 개체에 대해 사용된다.
"치료학적 폴리펩타이드"는 개체 또는 세포에서 단백질의 결핍 또는 결함으로 인해 발생하는 증상들을 완화, 경감, 예방, 지연 및/또는 안정화하는 폴리펩타이드, 및/또는 개체에게 이득, 예를 들어 항암 효과 또는 이식 생존 개선을 부여하는 폴리펩타이드이다.
용어 "처치한다", "처치하는" 또는 "의 처치" (및 문법적인 변형어)는, 개체의 병태의 중증도가 감소되거나, 적어도 부분적으로 개선되거나 또는 안정화되거나, 및/또는 한가지 이상의 임상 증상의 일부 완화, 경감, 감소 또는 안정화가 달성되거나, 및/또는 질환 또는 장애의 진행이 지연되는 것을 의미한다.
용어 "방지한다", "방지하는" 및 "방지" (및 문법적인 변형어)는 개체에서 질환, 장애 및/또는 임상적인 증상(들)의 방지 및/또는 개시 지연, 및/또는 본 발명의 방법을 실시하지 않을 경우와 비교해 질환, 장애 및/또는 임상적인 증상(들)의 발병의 중증도 저하를 의미한다. 방지는 완전할 수 있으며, 예를 들어 질환, 장애 및/또는 임상적인 증상(들)이 완전히 발생하지 않는 것일 수 있다. 또한, 방지는 개체에서 질환, 장애 및/또는 임상적인 증상(들)의 발생 및/또는 발병의 중증도가 본 발명의 방법을 실시하지 않을 경우와 비교해 낮은 부분적일 수 있다.
"유효량"은, 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위해 개체에 투여하였을 때 질환, 장애 또는 병태의 한가지 이상의 증상에 영향을 미치거나 또는 완화하는데 충분한 양을 의미한다. "유효량"은 예를 들어 질환, 장애 또는 병태 및/또는 이의 증상에 따라, 질환, 장애, 병태 및/또는 이의 증상의 중증도, 개체의 나이, 체중 및/또는 건강 상태, 그리고 주치의의 판단에 따라 달라질 수 있다. 임의의 소정의 경우에 적절한 함량은 당해 기술 분야의 당업자라면 알 수 있거나, 또는 일상적인 실험을 통해 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 유효량은 치료학적 유효량이다.
본원에서, 용어 "바이러스 벡터" 또는 "유전자 전달 벡터"는 핵산 전달 비히클로서 기능하며; 비리온 안에 패킹된 벡터 게놈 (예, 바이러스 DNA [vDNA])을 포함하는, 바이러스 (예를 들어, AAC) 입자를 지칭한다. 대안적으로, 일부 맥락에서, 용어 "바이러스 벡터"는 바이러스 벡터 게놈/vDNA 단독을 지칭하기 위해 사용될 수도 있다.
"rAAV 벡터 게놈" 또는 "rAAV 게놈"은 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 포함하는 AAV 게놈 (즉, vDNA)이다. rAAV 벡터는 일반적으로 바이러스를 구축하기 위해서는 말단 반복체(들)(TR(들))만 cis로 필요로 한다. 그외 바이러스 서열들 모두 필요하지 않을 수 있으며, 트랜스로 제공될 수 있다. 전형적으로, rAAV 벡터 게놈은, 벡터에 의해 효율적으로 패킹할 수 있는 전이유전자의 크기를 최대화하기 위해, 오직 하나 이상의 TF 서열만 보유할 것이다. 구조 단백질 및 비-구조 단백질 암호화 서열은 (예를 들어, 플라스미드와 같은 벡터로부터, 또는 패킹 세포에 서열을 안정적으로 병합함으로써) 트랜스로 제공될 수 있다. 구현예들에서, rAAV 벡터 게놈은 하나 이상의 TR 서열 (예를 들어, AAV TR 서열), 선택적으로 TR 2개 (예를 들어, AAV TR 2개)를 포함하며, 이는 전형적으로 벡터 게놈의 5' 말단과 3' 말단에, 이종 핵산의 측면에 위치할 것이나, 인접하여야 하는 것은 아니다. TR들은 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
용어 "말단 반복체" 또는 "TR"은 임의의 바이러스 말단 반복체, 또는 헤어핀 구조를 형성하며 역순 말단 반복체로서 기능하는 (즉, 복제, 바이러스 패킹, 병합 및/또는 프로바이러스 회수 등과 같이 바람직한 기능을 매개하는) 합성 서열을 포괄한다. TR은 AAV TR 또는 비-AAV TR일 수 있다. 예를 들어, 다른 파르보바이러스 (예를 들어, 개 파르보바이러스 (CPV), 마우스 파르보바이러스 (MVM), 인간 파르보바이러스 B-19)의 TR 또는 임의의 다른 적절한 바이러스 서열 (예, SU40 복제의 오리진으로서 작용하는 SV40 헤어핀) 등의 비-AAV TR 서열을 TR로서 이용할 수 있으며, 이는 말단 절단 (truncation), 치환, 결손, 삽입 및/또는 부가에 의해 더욱 변형될 수 있다. 나아가, TR은 부분적으로 합성되거나 또는 전체 합성될 수 있다.
"AAV 말단 반복체" 또는 "AAV TR"은, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 현재 공지되어 있거나 향후 발굴될 임의의 기타 AAV를 포함하여, 임의의 AAV로부터 유래될 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다 (예를 들어, 표 2 참조). AAV 말단 반복체는, 말단 반복체가 요망하는 기능, 예를 들어, 복제, 바이러스 패킹, 병합 및/또는 프로바이러스 회수 등을 매개하는 한, 천연 AAV TR 서열을 가져야 하는 것은 아니다 (예를 들어, 천연 AAV TR 서열이 삽입, 결손, 말단 절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변형될 수 있음).
본원의 바이러스 벡터는 추가적으로 "표적화된" 바이러스 벡터 (예를 들어, 지시된 향성을 가짐) 및/또는 "하이브리드" 파르보바이러스 (즉, 바이러스 TR 및 바이러스 캡시드가 여러가지 파르보바이러스로부터 유래됨)일 수 있다. 본원의 바이러스 벡터는 또한 듀플렉스 파르보바이러스 입자일 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, 이중 가닥 (듀플렉스) 게놈이 본원의 바이러스 캡시드 안에 패킹될 수 있다. 아울러, 바이러스 캡시드 또는 게놈 요소는 삽입, 결손 및/또는 치환을 비롯한 기타 변형을 함유할 수 있다.
본원에서, 용어 "아미노산"은 모든 자연 생성 아미노산, 이의 변형된 형태 및 합성 아미노산을 망라한다.
자연 생성, 좌선성 (L-) 아미노산들을 표 3에 나타낸다.
표: 아미노산 잔기 및 약어.
아미노산 잔기 약어
3문자 코드 단문자 코드
알라닌 Ala A
아르기닌 Arg R
아스파라긴 Asn N
아스파르트산 (아스파르테이트) Asp D
시스테인 Cys C
글루타민 Gln Q
글루탐산 (글루타메이트) Glu E
글리신 Gly G
히스티딘 His H
이소루신 Ile I
루신 Leu L
라이신 Lys K
메티오닌 Met M
페닐알라닌 Phe F
프롤린 Pro P
세린 Ser S
트레오닌 Thr T
트립토판 Trp W
티로신 Tyr Y
발린 Val V
대안적으로, 아미노산은 변형된 아미노산 잔기 (이에 대한 비-제한적인 예들은 표 4에 나타냄)일 수 있거나, 및/또는 번역 후 수정 (예, 아세틸화, 아미드화, 포르밀화, 하이드록시화, 메틸화, 인산화 또는 황산화)에 의해 변형된 아미노산일 수 있다.
표 4: 변형된 아미노산 잔기
변형된 아미노산 잔기 약어
아미노산 잔기 유도체
2-아미노아디프산 Aad
3-아미노아디프산 bAad
β-알라닌, β-아미노프로피온산 bAla
2-아미노부티르산 Abu
4-아미노부티르산, 피페리딘산 4Abu
6-아미노카프로익산 Acp
2-아미노헵타노익산 Ahe
2-아미노이소부티르산 Aib
3-아미노이소부티르산 bAib
2-아미노피멜릭산 Apm
t-부틸알라닌 t-BuA
시트룰린 Cit
사이클로헥실알라닌 Cha
2,4-다이아미노부티르산 Dbu
데스모신 Des
2,21-다이아미노피멜릭산 Dpm
2,3-다이아미노프로피온산 Dpr
N-에틸글리신 EtGly
N-에틸아스파라긴 EtAsn
호모아르기닌 hArg
호모시스테인 hCys
호모세린 hSer
하이드록시라이신 Hyl
알로-하이드록시라이신 aHyl
3-하이드록시프롤린 3Hyp
4-하이드록시프롤린 4Hyp
이소데스모신 Ide
알로-이소루신 aIle
메티오닌 설폭사이드 MSO
N-메틸글리신, 사르코신 MeGly
N-메틸 이소루신 MeIle
6-N-메틸라이신 MeLys
N-메틸발린 MeVal
2-나프틸알라닌 2-Nal
노르발린 Nva
노르루신 Nle
오르니틴 Orn
4-클로로페닐알라닌 Phe(4-C1)
2-플루오로페닐알라닌 Phe(2-F)
3-플루오로페닐알라닌 Phe(3-F)
4-플루오로페닐알라닌 Phe(4-F)
페닐글리신 Phg
β-2-티에닐알라닌 Thi
나아가, 비-자연 생성 아미노산은 (Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)에 기술된 바와 같이) "비-천연" 아미노산일 수 있다. 이들 비-천연 아미노산은 대상 분자를 AAV 캡시드 단백질에 화학적으로 연결하기 위해 유용하게 이용할 수 있다.
본원에서, 용어 "도메인"은 단백질 쇄의 나머지 부분과 독립적으로 진화, 기능 및 존재하는 단백질 서열 및 구조의 일부를 망라하는 것으로 의도된다. 도메인은 압축된 3차원 구조를 형성할 수 있으며, 흔히 독립적으로 안정적이고 접힐 수 있다. 하나의 도메인이 진화적으로 관련있는 다양한 단백질들에서 나타날 수 있다. 도메인은 아미노산 약 25개 내지 최대 약 500개 길이로 다양하다. "도메인"은 또한 야생형 단백질로부터 유래되는, 보존적인 치환에 의해 치환된 아미노산 잔기 또는 잔기들을 가진 도메인을 포괄할 수 있다. 이들 도메인은 단백질 환경에서 자체-안정적이므로, 도메인은 하나의 단백질과 다른 단백질 간에 유전자 조작에 의해 치환되어 키메라 단백질이 만들어질 수 있다.
본원에서, 용어 "돌연변이", "돌연변이들", "변이체" 또는 "변이체들"은, 본래의 단백질 또는 AAV에서, 모 단백질 또는 AAV의 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되었거나 및/또는 모 AAV 단백질의 하나 이상의 아미노산이 결손되었거나, 및/또는 하나 이상의 아미노산이 단백질 또는 AAV에 삽입되었거나, 및/또는 하나 이상의 아미노산이 모 단백질 또는 AAV에 부가되었음을 나타내기 위한 것이다. 이러한 부가는 모 단백질의 N-말단에 또는 C-말단에, 또는 이 둘다에서, 아울러 내부에서 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체의 아미노산 서열은 본래의 단백질의 아미노산 서열과 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70%로 동일하다.
본원에서, 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 증폭할 수 있는 임의의 핵산 물질을 의미한다. 즉, 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터일 수 있으며, 즉 염색체외 물질로서 존재하며 이의 복제가 염색제 복제와는 독립적인 벡터, 예를 들어 플라스미드일 수 있다. 대안적으로, 벡터는, 숙주 세포에 도입되었을 때, 숙주 세포의 게놈에 병합되어, 이것이 병합된 염색체(들)와 함께 복제하는, 것일 수 있다. 벡터의 선택은 종종 이를 도입할 숙주 세포에 따라 결정될 것이다. 벡터로는 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 바이러스 또는 코스미드 벡터를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 벡터는 일반적으로 복제 오리진과 하나 이상의 선별가능한 유전자, 즉 그 존재가 세포 생장에 필수적이거나 또는 쉽게 검출가능한 산물을 암호화하는 유전자를 함유한다.
용어 "유전자 요법"은 유전자를 외부에서 투여함으로써 내인성 유전자의 발현에 변화를 야기하는 방법을 의미한다. 본원에서, "유전자 요법"은 또한 필요한 개체의 체세포 또는 줄기 세포에 결함 유전자 또는 생략 유전자에 대응하는 기능성 유전자를 도입함으로써, 결함 단백질을 암호화하는 결함 유전자를 치환하거나 또는 생략된 유전자를 대체하는 것을 의미한다. 유전자 요법은, 분화된 또는 체세포 줄기 세포를 개체의 신체로부터 채취한 후 결함 유전자의 정상 카피를 외식된 세포에 유전자 전달 비히클로서 바이러스 벡터를 이용해 도입하는, 생체외 방법에 의해 달성할 수 있다. 아울러, 생체내 직접 유전자 전달 기술들은 광범위한 바이러스 벡터, 리포좀, 단백질 DNA 복합체 또는 노출 DNA를 이용해 개체의 세포에 인 시추로 유전자를 전달하여, 치료학적 성과를 달성 가능하게 한다. 또한, 용어 "유전자 요법"은, 결함 유전자 또는 단백질이 결함성이 아닐 경우에 기능해야 하는 바와 실질적으로 동일하게 기능하는 폴리뉴클레오티드를 필요한 개체의 체세포 또는 줄기 세포에 도입함으로써, 결함 단백질을 암호화하는 결함 유전자를 대체하는 것을 의미한다.
용어 "유전자 편집"은 유기체 또는 세포의 게놈내 특정 부위에서의 DNA 삽입, 결손 또는 치환을 의미한다. 유전자 편집은 CRISPR/Cas 시스템, CRISPR/Cpf1 시스템, Zn 핑거 뉴클레아제, TALEN, 호밍 엔도뉴클레아제 등과 같은, 하나 이상의 표적화된 뉴클레아제 시스템을 사용해 수행할 수 있다.
본원에서, 용어 "Fc 수용체"는 세포 상에 존재하는 Fcγ 면역글로불린 수용체 (FcγR)를 지칭한다. 인간에서, FcγR은 FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 및 FcγRIIIB (CD16b)를 포함하는 수용체 계열에 속하는 것들 중 하나, 일부 또는 전부를 지칭한다. 본원에서, 용어 FcγR은 FcγRI (CD64), FcγyRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 및 FcγRIIIB (CD16b)의 자연적으로 생성되는 다형체들을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 시스테인 프로테아제는 단백질을 분해하는 효소이다. 시스테인 프로테아제는 일반적으로 촉매성 3분자 또는 2분자에서 친핵성 시스테인 티올이 참여하는 통상적인 촉매 기전을 가진다. 일부 구현예에서, 시스테인 프로테아제는 IgG를 절단하여, 항원 결합 도메인 (Fab)과 불변 도메인 (Fc)을 서로 분리시키는, IgG 시스테인 프로테아제이다.
생물제제에 대한 중화 항체를 감소시키기 위한 조성물
본원은 개체에서 재조합 생물제제 또는 약물 물질에 대한 중화 항체를 저하할 수 있는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 재조합 생물제제는 하나 이상의 재조합 단백질을 암호화하는 이종의 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 AAV 벡터와 같은 재조합 바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 조성물은 재조합 생물제제 또는 약물 물질에 대한 항체의 소거 또는 분해를 촉진함으로써; 및/또는 재조합 생물제제 또는 약물 물질에 대한 항체가 Fc 수용체에 결합하는 것을 감소시킴으로써, 개체에서 재조합 생물제제 또는 약물 물질에 대한 중화 항체를 저하한다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 AAV 벡터에 대한 항체 또는 이종의 핵산에 의해 암호화되는 하나 이상의 재조합 단백질에 대한 항체의 소거 또는 분해를 촉진하거나; 및/또는 AAV 벡터에 대한 항체가 Fc 수용체에 결합하는 것을 낮춤으로써, 개체에서 이종의 핵산을 포함하는 AAV 벡터에 대한 중화 항체를 저하한다.
일부 구현예에서, 조성물은 아데노부속 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질 또는 비리온을 인지하는 항체를 분해할 수 있거나; 또는 재조합 AAV 벡터의 중화를 방지할 수 있는, 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 (IgG1, IgG2a, IgG2b 및/또는 IgG3를 포함하여) IgG, IgM, IgE 및/또는 IgA를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 항체는 IgG를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 조성물은 IgG-분해 효소 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, IgG-분해 효소 또는 이의 단편은 시스테인 프로테아제 활성을 가진다.
일부 구현예에서, IgG-분해 효소 또는 이의 단편은 스트렙토코커스 속의 박테리아와 같은 박테리아로부터 단리 또는 유래된다. 일부 구현예에서, IgG-분해 효소는 하기 서열번호 1에 나타낸 스트렙토코커스 에퀴의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 50% (예를 들어, 이들 사이의 모든 수치 및 부분 범위를 비롯하여, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
MKTIAYPNKPHSLSAGLLTAIAIFSLASSNITYADDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWSKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS.
서열번호 1의 서열은 IdeZ 단백질에 해당한다. IdeZ 단백질에 대한 예시적인 결정 구조를, 각각의 패널에 여러가지 방향에서의 관찰도로 도 5에 도시한다.
본원에 언급된 IdeZ 단백질은 그룹 A 스크렙토콕시에서 동정된 시스테인 프로테아제로서, 이는 중쇄의 하위 힌지부에서 IgG를 절단해 F(ab')2 하나와 동형이량체 Fc 단편 하나를 해리하여 IgG 항체를 불활성화한다. 이 IgG-분해 효소는 반감기가 짧고, 대부분 순환계에서 빠르게 제거되며, 매우 효과적이지만, IgG 제거가 일시적이다.
일부 구현예에서, IgG-분해 효소 또는 이의 단편은 스트렙토코커스 피오게네스 (S. pyogenes)로부터 단리 또는 유래된다. 일부 구현예에서, IgG-분해 효소는 서열번호 13 또는 서열번호 14와 적어도 약 50% (예를 들어, 이들 사이의 모든 수치 및 부분 범위를 비롯하여, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, IgG-분해 효소 또는 이의 단편은 합성 효소이다. 일부 구현예에서, IgG-분해 효소는 서열번호 15-52 중 어느 하나와 적어도 약 50% (예를 들어, 이들 사이의 모든 수치 및 부분 범위를 비롯하여, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5% 또는 100%) 동일한 서열을 포함한다.
본원에 기술된 중화 항체를 저하하기 위한 조성물은 항체-분해 효소 또는 이의 단편; 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 단백질은 IgG 프로테아제이다.
일부 구현예에서, 중화 항체를 저하하기 위한 조성물은 AAV 벡터에 대한 항체가 Fc 수용체에 결합하는 것을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 그 항체에 대한 Fc 수용체에 결합함으로써 AAV 벡터 항체의 신속한 제거를 촉진한다. 예를 들어, 조성물은 IgG에 대한 수용체 (예를 들어, FcRN)에 결합함으로써 AAV 벡터에 대한 IgG의 신속한 제거를 촉진할 수 있으며, 따라서 IgG 수용체의 내재화 및 분해를 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 치료학적 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료학적 항체는 IgG이다. 일부 구현예에서, 치료학적 항체는 로자놀릭시주맵 (rozanolixizumab)이다. 일부 구현예에서, 치료학적 항체의 투여량은, 수치 사이에 존재하는 모든 수치와 부분 범위를 비롯하여, 0.05 mg/kg 내지 약 150 mg/kg, 예를 들어, 약 0.1 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 100 mg/kg, 약 110 mg/kg, 약 120 mg/kg, 약 130 mg/kg, 약 140 mg/kg, 또는 약 150 mg/kg이다.
일부 구현예에서, 중화 항체를 저하하는 조성물은 보체 활성화를 감소시키거나 및/또는 저해한다. 예를 들어, 조성물은 중화 항체를 절단하여, C1q가 항원-항체 복합체 (예를 들어, AAV-항체 복합체)에 결합하지 않도록 방지할 수 있다. 보체 활성화를 감소 및/또는 저해함으로써, 보체 캐스케이드에서 염증성 세포의 동원 및 (예를 들어, AAV의) 옵소닌 작용과 같은 하위 과정들이 방지된다. 일부 구현예에서, AAV를 이용한 처치 전에 중화 항체를 감소시키는 조성물로 개체를 처치하면, AAV 투여시 환자에서 보체 활성화가 방지되고, 일부 구현예에서, 보체 활성화는 AAV 투여시 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 감소된다. 일부 구현예에서, AAV를 이용한 처치와 동시에 중화 항체를 감소시키는 조성물을 이용한 환자 처치는 AAV 처치로 인한 환자에서의 보체 활성화를 방지하며, 일부 구현예에서, 보체 활성화는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 감소된다. 일부 구현예에서, AAV 처치 후 중화 항체를 감소시키는 조성물 하나를 이용한 환자 처치는 환자에서 보체 활성화를 감소시키며, 일부 구현예에서, 보체 활성화는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%로 감소된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 비히클, 예를 들어, 용매, 완충제, 용액제, 분산 매질, 코팅제, 항세균제 및 항진균제, 등장성 물질 및 흡수 지연제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 비히클은 식염수, 완충화된 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 무균 등장성 수성 완충액, 포스페이트 완충화된 용액, 아미노산-계 완충제, 바이카보네이트 완충화된 용액 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 비히클은 포스페이트 완충화된 염수, 무균 식염수, 락토스, 슈크로스, 칼슘 포스페이트, 덱스트란, 아가, 펙틴, 땅콩 오일, 참깨 오일, 약제 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 또는 이들의 적정 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 유화제 또는 습윤제 또는 pH 완충화제를 소량으로 더 포함한다. 본원에 기술된 조성물의 제형은 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써, 예를 들어 동결건조된 산제, 슬러리, 수용액 또는 현탁제의 형태로 준비할 수 있다 (예를 들어, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.를 참조함).
일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 보존제와 같은 통상적인 약제학적 성분, 또는 클로로부탄올, 포타슘 소르베이트, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 파라클로로페놀 또는 알부민과 같은 화학적 안정제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 또는 티메로살과 같은 항세균제 및 항진균제; 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제; 및/또는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 더 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원의 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화된다. 약제학적으로-허용가능한 염으로는, 예를 들어, 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등으로부터 유래된 (단백질의 유리 아미노 기와 형성된) 산 부가 염 등이 있다. 일부 구현예에서, 단백질의 유리 카르복시 기와 형성된 염은 무기 염기 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철) 또는 유기 염기 (예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인) 등으로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 재구성용으로 적합한 동결건조된 분말과 같은 고체 형태, 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐제, 지속 방출 제형 또는 산제 형태이다. 일부 구현예에서, 조성물은 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 미소구, 액체 입자, 소낭, 리포좀, 나노구, 나노입자 등을 이용하여 전달하도록 제형화될 수 있다.
중화 항체를 감소시키기 위한 조성물의 투여량 및 투여 방식
생물제제에 대한 중화 항체를 저하하기 위한 본원에 기술된 조성들 중 어느 하나의 투여는 주사, 주입 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물들 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물은 약 0.05 mg/kg 내지 약 150 mg/kg, 예를 들어, 수치 사이에 존재하는 모든 수치와 부분 범위를 비롯한, 약 0.1 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 100 mg/kg, 약 110 mg/kg, 약 120 mg/kg, 약 130 mg/kg, 약 140 mg/kg 또는 약 150 mg/kg의 투여량으로 투여할 수 있다.
본원에 기술된 어느 하나의 조성물의 치료학적 유효량은 1회분으로 제공될 수 있지만, 1회분으로 제한되는 것은 아니다. 즉, 투여는 1 내지 50회, 예를 들어, 2회, 5회, 10회, 15회, 20회, 25회, 30회, 35회, 40회, 45회 또는 50회로 이루어질 수 있다. 본 발명에서 2회 이상 투여하는 경우, 투여 간격은, 수치 사이에 존재하는 모든 수치와 부분 범위를 비롯하여, 약 1분 내지 약 1개월, 예를 들어 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 6분, 약 7분, 약 8분, 약 9분, 약 10분, 약 20분, 약 40분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 15시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 2일, 약 5일, 약 10일, 약 15일, 약 20일일 수 있다. 본 발명은 균등한 시간 간격의 투여 간격으로 한정되는 것은 아니며, 비-균등 간격, 예를 들어, 단지 비-제한적인 예를 제공하기 위해, 1일, 4일, 7일 및 25일에의 투여로 이루어진 프라이밍 계획 일정도 포괄한다.
예를 들어 1회/주, 2회/주, 3회/주, 4회/주, 5회/주, 6회/주, 7회/주, 1회/2주, 1회/3주, 1회/4주, 1회/5주 등과 같은 투여 일정도 본 발명에서 이용가능하다. 투여 일정은, 수치 사이에 존재하는 모든 수치와 부분 범위를 비롯하여, 약 1일 내지 약 1년, 예를 들어 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 및 12개월의 전체 기간 동안 투여하는 것을 포괄한다.
상기한 투여 일정의 주기의 예들이 제공된다. 주기는 대략적으로 예를 들어 7일 마다; 14일 마다; 21일 마다; 28일 마다; 35일 마다; 42일 마다; 49일 마다; 56일 마다; 63일 마다; 70일 마다 등으로 반복될 수 있다. 주기 사이에 비-투여 간격이 있을 수 있으며, 그 간격은 대략적으로 예를 들어, 7일; 14일; 21일; 28일; 35일; 42일; 49일; 56일; 63일; 70일 등일 수 있다.
본원에 기술된 조성물은 하나 이상의 부가적인 치료학적 물질과 함께 투여할 수 있다. 부가적인 치료학적 물질과 공동-투여하기 위한 방법은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다 (Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.).
본원에서 처치 개체는 인간 및 인간을 제외한 영장류 등의 포유류를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체는 인간, 인간을 제외한 영장류, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개 및 토끼목으로부터 선택될 수 있다.
생물제제에 대한 중화 항체를 저하하는 방법
본 발명은 재조합 생물제제 또는 약물 물질, 및 (a) 재조합 생물제제 또는 약물 물질에 대한 항체의 분해를 촉진하거나; 및/또는 (b) Fc 수용체에의 상기 항체의 결합을 저하하는 본원에 기술된 임의의 하나의 조성물을 치료학적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 재조합 생물제제 또는 약물 물질에 대한 중화 항체를 저하하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 중화 항체의 함량을 개체에서 감소시키는 방법은 중화 항체의 분해를 촉진하는 조성물을 치료학적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터를 이용한 처치를 위해 개체를 준비시키는 방법은 (a) AAV 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하거나, 및/또는 (b) Fc 수용체에 대한 중화 항체의 결합을 저하하는 조성물을 치료학적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 필요한 개체를 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터로 처치하는 방법은, (i) (a) AAV 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하거나, 및/또는 (b) Fc 수용체에 대한 중화 항체의 결합을 저하하는 조성물을 치료학적 유효량으로 개체에 투여하는 단계; 및 (ii) AAV 벡터를 치료학적 유효량으로 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 재조합 AAV로 이전에 처치된 개체를 제2 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터로 처치하는 방법은, (i) (a) 제1 및/또는 제2 재조합 AAV 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하거나, 및/또는 (b) Fc 수용체에 대한 중화 항체의 결합을 저하하는 조성물을 치료학적 유효량으로 개체에 투여하는 단계; 및 (ii) 제2 재조합 AAV 벡터를 치료학적 유효량으로 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 개체에서 이종의 핵산을 포함하는 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 중화 항체를 저하하는 방법은 치료학적 유효량의 AAV 벡터, 및 (a) AAV 벡터에 대한 항체 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 재조합 단백질의 분해를 촉진하거나; 및/또는 (b) Fc 수용체에의 항체의 결합을 감소시키는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 하나의 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 중화 항체를 저하하는 방법은 치료학적 유효량의 AAV 벡터, 및 (a) AAV 벡터에 대한 항체 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 재조합 단백질의 분해를 촉진하거나; 및/또는 (b) 항체의 Fc 수용체에의 결합을 감소시키는 본원에 기술된 임의의 하나의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
(a) 제1 및/또는 제2 재조합 AAV 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하거나, 및/또는 (b) Fc 수용체에 대한 중화 항체의 결합을 저하하는 조성물은 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이 조성물은 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기한 항체-분해 효소 또는 이의 단편은 시스테인 프로테아제 활성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 상기한 항체-분해 효소는 IgG를 특이적으로 절단한다. 일부 구현예에서, 상기한 항체-분해 효소 또는 이의 단편은 스트렙토코커스 속으로부터 유래된다.　일부 구현예에서, 상기한 항체-분해 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기한 항체-분해 효소는 서열번호　1의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있으되, 제1 단백질은 항체-분해 효소 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 제1 단백질과 제2 단백질은 링커에 의해 분리되어 있다. 일부 구현예에서, 제2 단백질은 IgG 프로테아제이다.
조성물은 전신 경로 (예, 정맥내, 관절내 또는 림프계내)를 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 국소 전달된다 (예를 들어, 근육내, 진피내, 피하, 국부적으로). 일부 구현예에서, 조성물은 뇌척수액 (CSF)와 같이 중화 항체를 함유한 것으로 알려진 부위로 직접 투여된다. 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함할 수도 있다.
일부 구현예에서, 개체에 항체-분해 효소 또는 이의 단편 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg이 투여된다. 일부 구현예에서, 개체에 융합 단백질 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg이 투여된다. 일부 구현예에서, 개체에 항체-분해 효소 또는 이의 단편, 또는 융합 단백질 약 0.05 mg/kg 내지 약 150 mg/kg이 투여되며, 예를 들어, 수치 사이에 존재하는 모든 수치와 부분 범위를 비롯하여, 약 0.1 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 100 mg/kg, 약 110 mg/kg, 약 120 mg/kg, 약 130 mg/kg, 약 140 mg/kg, 또는 약 150 mg/kg이 투여된다.
일부 구현예에서, 저하되거나 및/또는 분해할 중화 항체는 IgG, IgM, IgE 및/또는 IgA를 포함한다. 일부 구현예에서, 중화 항체는 IgG를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 전이유전자를 포함하는 AAV 벡터에 대한 중화 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 전이유전자에 의해 암호화된 재조합 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 아데노부속 바이러스 캡시드 단백질 또는 이의 비리온에 결합한다.
일부 구현예에서, 재조합 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 보바인 AAV 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 AAV 벡터는 서열번호 2-12 중 어느 하나의 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 가진 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 야생형 AAV 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 돌연변이 AAV 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 야생형 AAV1 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 야생형 AAV2 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 야생형 AAV4 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 야생형 AAV8 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 야생형 AAV9 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 돌연변이 AAV1 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 돌연변이 AAV2 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 돌연변이 AAV4 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 돌연변이 AAV8 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 돌연변이 AAV9 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 AAV 벡터는 치료학적 단백질 또는 치료학적 RNA를 암호화하는 이종의 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 세포 표면 상에서 항체와 이의 동족 수용체 간의 상호작용의 저하를 포함한다. 이러한 방법은 유전자 요법에 적합한 환자 코호트를 확장시킬 수 있으며, 또한 이전에 AAV 벡터가 처치된 환자에서 AAV 재-투약/재-투여를 실시할 수 있다.
본원의 방법에 대한 일부 구현예에서, 개체에 AAV 벡터를 조성물과 함께 투여한다. 일부 구현예에서, 개체에 조성물을 투여한 후 AAV 벡터를 투여한다. 일부 구현예에서, 개체에 조성물을 투여하기 전에 AAV 벡터를 투여한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제2의 이종의 핵산을 포함하는 제2의 AAV 벡터를 추가적인 투여량으로 또는 2차 투여량으로 1회 이상 투여하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 AAV 벡터와 제2 AAV 벡터는 동일한 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 AAV 벡터와 제2 AAV 벡터는 서로 다른 AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 AAV 벡터에 대한 항체의 분해를 촉진한다. 일부 구현예에서, 항체의 수준이 대조군 개체에서의 항체 수준에 대해 약 95% 내지 약 0.01% 범위 (예를 들어, 수치 사이의 모든 수치와 부분 범위를 포함하여, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 1%, 약 0.1%, 또는 약 0.01%)의 수준까지 낮아진다. 본원에서, 대조군 개체는, AAV 벡터와 같은 재조합 생물제제가 투여되나 본원에 기술된 어느 하나의 조성물은 투여되지 않은, 개체이다. 일부 구현예에서, 이러한 방법에서, 조성물의 투여 후, 항체들 중 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99%가 분해된다.
일부 구현예에서, 개체는 이전에 재조합 단백질이 투여된 개체이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물들 중 어느 하나의 투여는 개체에서 재조합 단백질을 투여하기 전에 생성된 항체의 순환 수준을 감소시킨다.
중요하게도, 본 발명에 따른 조성물 및 방법(들)은 항체를 줄일 수 있는 다른 약리학적 또는 개입적 접근법과 함께 사용할 수 있다.
재조합 바이러스 벡터
일부 구현예에서, 본원에 기술된 벡터는 이종의 핵산을 세포에 시험관내, 생체외 및 생체내에서 전달하기 위해 이용가능하다. 일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터이다. 특히, 유익하게는 핵산을 동물 세포, 예를 들어, 포유류 세포에 전달하기 위해 바이러스 벡터를 채택할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 이종의 핵산을 둘러싼 재조합 바이러스 캡시드, 예를 들어, AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 캡시드는 재조합 캡시드 단백질, 예를 들어 재조합 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 본 발명에서 이용가능한 바이러스 벡터, 바이러스 캡시드 및/또는 캡시드 단백질에 대한 상세한 설명은 국제 출원 PCT/US2019/025617, PCT/US2019/025584 및 PCT/US2019/025610에 제공되며, 이들 내용은 각각 그 전체가 모든 목적으로 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh.32.33, AAVrh74, 보바인 AAV, 조류 AAV 또는 현재 알려져 있거나 또는 향후 동정될 임의의 기타 AAV로부터 선택되는 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 키메라형이다.
일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 아미노산 서열에 변형 (예, 치환)을 포함하는 AAV 캡시드 단백질 (VP1, VP2 및/또는 VP3)이고, 바이러스 캡시드 및 바이러스 벡터는 변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 변형은 변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 벡터에, 비-제한적으로, 중화 항체를 회피하는 능력을 비롯하여, 한가지 이상의 요망한 특성을 부여할 수 있다.
일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 하나 이상의 치환은 AAV 캡시드 단백질의 하나 이상의 항원성 부위를 변형시킨다. 하나 이상의 항원성 부위의 변형으로, 하나 이상의 항원성 부위에의 항체의 결합 저해 및/또는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자의 감염성의 중화 저해가 달성된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원성 부위의 변형으로 하나 이상의 항원성 부위에의 항체 결합이 저해된다. 일부 구현예에서, 변형된 항원성 부위는 항체가 AAV 캡시드에 결합 또는 인지 또는 중화하지 못하게 방지할 수 있으며, 여기서 항체는 IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 등), IgM, IgE 또는 IgA이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원성 부위의 변형으로 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자의 감염성이 중화된다.
하나 이상의 아미노산 치환은 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV-항체 복합체의 저온-전자 현미경 실험 및/또는 펩타이드 에피토프 맵핑에 의해 동정된 하나 이상의 항원성 풋프린트에서 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원성 부위는 WO 2017/058892에 기술된 바와 같이 공통 항원성 모티프 또는 CAM이며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함된다. 일부 구현예에서, 항원성 부위는 VR-I, VR-II, VR-III, VR-IV, VR-V, VR-VI, VR-VII, VR-VIII, VR-IX와 같은 AAV 캡시드 단백질의 가변부 (VR)에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원성 부위는 AAV 캡시드 단백질의 HI 루프에 존재한다.
일부 구현예에서, 아미노산 치환은 다음과 같은 혈청형들 중 어느 하나로부터 유래된 AAV 캡시드 단백질에서 임의의 아미노산 6개, 7개 또는 8개를 교체한다: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh10, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh32.22, 보바인 AAV 또는 조류 AAV. 일부 구현예에서, 치환은 AAV 캡시드 서열에 결손을 도입한다. 예를 들어, 아미노산 6, 7, 8 또는 9개로 된 서열은 본래의 아미노산 캡시드 서열의 아미노산 7개, 8개, 9개 또는 10개를 각각 치환한다. 일부 구현예에서, 치환은 AAV 캡시드 서열에 삽입을 도입한다. 예를 들어, 아미노산 6, 7, 8 또는 9개로 된 서열은 본래의 아미노산 캡시드 서열의 아미노산 5개, 6개, 7개 또는 8개를 각각 치환한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 항원성 부위의 하나 이상의 치환은 제1 AAV 혈청형의 캡시드 단백질로부터 유래된 하나 이상의 항원성 부위를 제1 AAV 혈청형과 상이한 제2 AAV 혈청형의 캡시드 단백질에 도입할 수 있다.
본원에서, "치환"은 단일 아미노산의 치환, 또는 아미노산 2개 이상의 치환을 의미할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원의 캡시드 단백질은 적어도 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 등의, 단일 아미노산의 치환들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 캡시드 단백질은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 인접 아미노산들의 하나 이상의 치환과 같이, 복수의 인접 아미노산들의 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
아울러, 아미노산 잔기가 야생형 또는 본래의 아미노산 서열에 존재하는 아미노산 잔기 이외의 다른 임의의 아미노산 잔기로 치환된 본원에 기술된 구현예들에서, 임의의 다른 아미노산 잔기는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기일 수 있다 (예를 들어, 표 3 및 4를 참조함). 일부 구현예에서, 치환은 보존적인 치환일 수 있으며, 일부 구현예에서, 치환은 비-보존적인 치환일 수 있다.
일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 제1 아미노산 치환 및 제2 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 제1 아미노산 치환과 제2 아미노산 치환은 각각 AAV 캡시드 단백질 상의 서로 다른 항원성 부위를 변형한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 제1 아미노산 치환, 제2 아미노산 치환 및 제3 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 제1 아미노산 치환, 제2 아미노산 치환 및 제3 아미노산 치환은 각각 AAV 캡시드 단백질 상의 서로 다른 항원성 부위들을 변형한다.
본원에 기술된 AAV 캡시드들 중 어느 하나는 HI 루프에 변형 (예, 치환 또는 결손)을 더 포함할 수 있다. HI 루프는, 각각의 바이러스 단백질 (VP) 서브유닛으로부터 연장되어 이웃한 5중 VP와 겹치는, β 가닥 βH와 βI 사이에 존재하는 AAV 캡시드 표면의 주요 도메인이다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 HI 루프에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하되, 각각의 치환은 AAV 캡시드 단백질 상의 서로 다른 항원성 부위를 변형하며, 아미노산 치환들 중 하나 이상은 캡시드 단백질의 HI 루프를 변형한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 첫번째, 2번째, 3번째 및 4번째 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 AAV 캡시드 단백질은 뉴클레오티드 서열 또는 이를 포함하는 발현 벡터에 의해 암호화되며, 이로부터 발현된다. 뉴클레오티드 서열은 DNA 서열 또는 RNA 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 캡시드 단백질은, 현재 알려져 있거나 또는 향후 개발될 임의의 AAV의 캡시드 단백질을 변형함으로써, 제조된다. 아울러, 변형하고자 하는 AAV 캡시드 단백질은 자연 생성 AAV 캡시드 단백질 (예를 들어, AAV2, AAV3a 또는 3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 캡시드 단백질 또는 표 2에 나타낸 임의의 AAV)일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 당해 기술 분야의 당업자라면, AAV 캡시드 단백질에 대한 다양한 조작들이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 내용이 자연 생성 AAV 캡시드 단백질의 변형으로 제한되지 않음을, 이해할 것이다. 예를 들어, 변형할 캡시드 단백질은 자연 생성 AAV (예를 들어, 자연 생성 AAV 캡시드 단백질 유래의, 예를 들어, AAV2, AAV3a, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 현재 공지되어 있거나 또는 향후 발견될 임의의 다른 AAV)와 비교해 이미 변형된 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 키메라 캡시드 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 조작된 AAV, 예를 들어 AAV2i8, AAV2g9, AAV-LK03, AAV7m8, AAV Anc80, AAV PHP.B일 수 있다. 이러한 AAV 캡시드 단백질 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
따라서, 일부 구현예에서, 변형할 AAV 캡시드 단백질은 자연 생성 AAV로부터 유래될 수 있으나, 캡시드 단백질에 삽입되거나 및/또는 치환되거나 및/또는 하나 이상의 아미노산의 결손에 의해 변형된, (예를 들어, 본래의 바이러스에 외인성인) 외래 서열 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질에 대한 변형은 "선택적인" 변형이다. 이러한 방식은, AAV 혈청형들 간에 서브유닛 전체 또는 큰 도메인을 교환하는 이전의 방법과는, 대비된다 (예를 들어, 국제 특허 공개번호 WO 00/28004 및 Hauck et al., (2003) J. Virology 77:2768-2774를 참조함). 특정 구현예에서, "선택적인" 변형은 인접 아미노산 약 20개 이하, 약 18개 이하, 약 15개 이하, 약 12개 이하, 약 10개 이하, 약 9개 이하, 약 8개 이하, 약 7개 이하, 약 6개 이하, 약 5개 이하, 약 4개 이하 또는 약 3개 이하의 삽입 및/또는 치환 및/또는 결손을 유발한다. 본 발명의 변형된 캡시드 단백질 및 캡시드는 현재 공지되거나 또는 향후 동정될 임의의 다른 변형을 더 포함할 수 있다.
이에, 본원에서 특정 AAV 캡시드 단백질 (예를 들어, 표 2에 언급된 임의의 AAV로부터 유래되는 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 캡시드 단백질 또는 캡시드 단백질 등)을 언급하는 경우, 본래의 캡시드 단백질뿐 아니라 본원의 변형 이외의 다른 변이를 가진 캡시드 단백질을 망라하는 것으로 의도된다. 이러한 변이는 치환, 삽입 및/또는 결손을 포함한다. 특정 구현예에서, 캡시드 단백질은, 본래의 AAV 캡시드 단백질 서열과 비교해, (본 발명에 언급된 삽입 이외의 다른) 내부 삽입 아미노산을 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개, 20개 미만, 30개 미만, 40개 미만, 50개 미만, 60개 미만 또는 70개 미만으로 포함한다. 구현예들에서, 캡시드 단백질은, 본래의 AAV 캡시드 단백질 서열과 비교해, (본 발명에 언급된 아미노산 치환 이외의 다른) 아미노산 치환을 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개, 20개 미만, 30개 미만, 40개 미만, 50개 미만, 60개 미만 또는 70개 미만으로 포함하며, 본 발명의 구현예들에서, 캡시드 단백질은, 본래의 AAV 캡시드 단백질 서열과 비교해, (본 발명에 언급된 아미노산 결손 이외의 다른) 아미노산 결손을 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개, 20개 미만, 30개 미만, 40개 미만, 50개 미만, 60개 미만 또는 70개 미만으로 포함한다.
2종 이상의 아미노산 서열들 간의 서열 유사성 또는 동일성을 결정하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 서열 유사성 또는 동일성은, 비-제한적으로, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)의 국소 서열 동일성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J Mol. Biol. 48,443 (1970)의 서열 동일성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 전산 처리 (GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)에 의해 기술된 베스트 핏 서열 프로그램 또는 검사에 의해서 등의, 당해 기술 분야에 공지된 표준 기법을 이용해 결정할 수 있다.
다른 적절한 알고리즘은 Altschul et al., J Mol. Biol. 215, 403-410, (1990) 및 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993)에 기술된 BLAST 알고리즘이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 Altschul et al., Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/ README.html로부터 입수한 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는, 선택적으로 디폴트 값으로 설정된, 여러가지 검색 매개변수를 사용한다. 매개변수는 동적 수치이며, 구체적인 서열의 조성 및 대상 서열을 검색하는 구체적인 데이터베이스의 구성에 따라 자체 프로그램에 의해 설정되지만; 이들 값들은 민감성을 높이기 위해 조정할 수 있다.
아울러, 부가적으로 이용가능한 알고리즘은 Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402에서 발표된 gapped BLAST이다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV 캡시드와 AAV 게놈을 포함하며, 중화 항체를 회피하는 표현형을 가진다. 또한, 본원에 기술된 벡터 또는 AAV 바이러스 입자는, 중화 항체를 회피하는 표현형과 더불어, 강화되거나 또는 유지된 형질도입 효율을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 이용해, 예를 들어 베큘로바이러스 시스템을 이용해 발현시킴으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 바이러스 캡시드는, 바이러스 캡시드가 원하는 표적 조직(들) 상에 존재하는 세포-표면 분자와 상호작용하도록 지시하는 (예, 바이러스 캡시드에서 치환 또는 삽입된) 표적화 서열을 포함하는, 표적화된 바이러스 캡시드일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바이러스 캡시드는 특정 대상 표적 조직 (예를 들어, 간, 골격근, 심장, 횡격막근, 신장, 뇌, 위, 장, 피부, 내피 세포 및/또는 폐)으로 향하는 향성이 상대적으로 유효하지 않을 수 있다. 표적화 서열을 유익하게는 이러한 저 효율-형질도입 벡터에 통합하여, 바이러스 캡시드에 원하는 향성을 부여할 수 있으며, 선택적으로 특정 조직(들)에 대한 선택적인 향성을 부여할 수 있다. AAV 캡시드 단백질, 캡시드 및 표적화 서열을 포함하는 벡터는, 예를 들어, 국제 특허 공개번호 WO 00/28004에 기술되어 있다. 다른 예로, Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006))에 의해 개시된 하나 이상의 비-자연 생성 아미노산이, 원하는 저 효율-형질도입 벡터를 표적 조직(들)으로 재-인가하는 방식으로서, 오르토고날 (orthogonal) 부위에서 본원의 AAV 캡시드 서브유닛에 병합될 수 있다. 이들 비-천연 아미노산은, 유익하게는, 비-제한적으로, 글리칸 (만노스 - 수지상 세포 표적화); RGD, 봄베신 또는 특정 암 세포 유형으로 표적 전달하기 위한 뉴로펩타이드; 성장인자 수용체, 인테그린 등과 같은 특정 세포 표면 수용체를 표적화하는 파지 디스플레이로부터 선택되는 RNA 앱타머 또는 펩타이드를 비롯하여, 대상 분자를 AAV 캡시드 단백질에 화학적으로 연결하기 위해, 이용할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 캡시드 단백질, 바이러스 캡시드 또는 벡터는 본 발명의 캡시드 단백질, 바이러스 캡시드 또는 벡터의 기원이 되는 AAV 혈청형의 형질도입 효율에 대하여 등가의 또는 강화된 형질도입 효율을 가질 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 캡시드 단백질, 바이러스 캡시드 또는 벡터는 본 발명의 캡시드 단백질, 바이러스 캡시드 또는 벡터의 기원이 되는 AAV 혈청형의 형질도입 효율에 대하여 감소된 형질도입 효율을 가질 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 캡시드 단백질, 바이러스 캡시드 또는 벡터는 본 발명의 캡시드 단백질, 바이러스 캡시드 또는 벡터의 기원이 되는 AAV 혈청형의 향성에 대하여 등가의 또는 강화된 향성을 가질 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 캡시드 단백질, 바이러스 캡시드 또는 벡터는 본 발명의 캡시드 단백질, 바이러스 캡시드 또는 벡터의 기원이 되는 AAV 혈청형의 향성에 대하여 수정된 또는 상이한 향성을 가질 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 캡시드 단백질, 바이러스 캡시드 또는 벡터는 뇌 조직에 대해 향성을 가지거나 또는 가지도록 조작될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 캡시드 단백질, 바이러스 캡시드 또는 벡터는 간 조직에 대해 향성을 가지거나 또는 가지도록 조작될 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 일부 AAV 캡시드 단백질의 경우, 해당 아미노산 위치가 일부 또는 전부 바이러스에 존재하거나 또는 대안적으로 전부 존재하지 않는지에 따라, 해당 변형이 삽입 및/또는 치환일 것임을 알 것이다. 본원의 도처에 기술된 바와 같이, 당해 기술 분야의 당업자라면 해당 아미노산 위치(들)를 잘 알려진 기법들을 이용해 쉽게 파악할 수 있을 것이다.
AAV 바이러스 벡터
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 본 발명의 변형된 캡시드 서브유닛을 포함하는 변형된 AAV 캡시드 및 벡터 게놈을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 (a) 본 발명의 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 변형된 바이러스 캡시드 (예를 들어, 변형된 AAV 캡시드); 및 (b) 말단 반복 서열 (예를 들어, AAV TR)을 포함하는 이종의 핵산을 포함하며, 여기서 말단 반복 서열을 포함하는 이종의 핵산은 변형된 바이러스 캡시드로 둘러싸인다. 핵산은 선택적으로 말단 반복체 2개 (예를 들어, AAV TR 2개)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 (i) 캡시드 단백질이 변형되지 않은 바이러스 벡터에 의한 형질도입 수준과 비교해 간에서의 형질도입은 감소되고; (ii) 캡시드 단백질이 변형되지 않은 바이러스 벡터에 의해 관찰되는 수준과 비교해 동물 개체에서 바이러스 벡터에 의한 전신 형질도입은 강화되며; (iii) 캡시드 단백질이 변형되지 않은 바이러스 벡터에 의한 이동 수준과 비교해 내피 세포를 통과하는 이동이 강화되고; 및/또는 (iv) 근육 조직 (예를 들어, 골격근, 심근 및/또는 횡격막근)으로의 형질도입이 선택적으로 강화되고, (v) 간 조직으로의 형질도입이 선택적으로 강화되고, 및/또는 (vi) 캡시드 단백질이 변형되지 않은 바이러스 벡터에 의한 형질도입 수준과 비교해 뇌 조직 (예, 뉴런)으로의 형질도입이 감소된다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 간으로 전신 형질도입된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 이종의 핵산 또는 기능성 RNA를 포함하는 재조합 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 핵산은 치료학적 (예, 의학적 또는 수의학적 용도) 또는 면역원성 (예, 백신용) 폴리펩타이드 또는 RNA를 포함한, 폴리펩타이드 암호화 핵산이다.
대안적으로, 면역원성 폴리펩타이드는 임의의 종양 또는 암 세포 항원일 수 있다. 선택적으로, 종양 또는 암 항원은 암 세포의 표면 상에서 발현된다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 이종의 핵산이 적절한 조절 서열과 작동가능하게 조합될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 이종의 핵산은 전사/번역 제어 신호, 복제 오리진, 폴리아데닐화 신호, 내부 리소좀 도입부 (IRES), 프로모터 및/또는 인핸서 등과 같은 발현 조절 인자와 작동가능하게 조합될 수 있다. 아울러, 대상 이종의 핵산(들)의 제어된 발현은 번역 후 수준에서, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 소형 분자 및/또는 특이적인 부위에서 스플라이싱 활성을 선택적으로 차단하는 기타 화합물의 존재 또는 부재에 의해 여러가지 인트론의 선택적인 스플라이싱을 제어함으로써, 달성될 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 다양한 프로모터/인핸서 인자들을 원하는 조직-특이적인 발현 및 수준에 따라 이용할 수 있음을 알 것이다. 프로모터/인핸서는 원하는 발현 패턴에 따라 구성적이거나 또는 유도성일 수 있다. 프로모터/인핸서는 본래의 것이거나 또는 외래의 것일 수 있으며, 천연 또는 합성 서열일 수 있다. 외래는, 전사 개시부가 도입되는 야생형 숙주에서는 그 전사 개시부가 발견되지 않는 것을 의미한다.
특정 구현예에서, 프로모터/인핸서 인자는 처리하고자 하는 표적 세포 또는 개체에 본래의 것일 수 있다. 대표적인 구현예에서, 프로모터/인핸서 인자는 이종의 핵산 서열에 본래의 것일 수 있다. 프로모터/인핸서 인자는 일반적으로 대상 표적 세포(들)에서 기능하도록 정해진다. 아울러, 특정 구현예에서, 프로모터/인핸서 인자는 포유류 프로모터/인핸서 인자이다. 프로모터/인핸서 인자는 구성적이거나 또는 유도성일 수 있다.
유도성 발현 조절 인자는 전형적으로 이종의 핵산 서열(들)의 과다 발현 조절을 제공하는 것이 바람직한 용도에서 유익하다. 유전자 전달을 위한 유도성 프로모터/인핸서 인자는 조직-특이적인 또는 조직-선호적인 프로모터/인핸서 인자일 수 있으며, 근육 특이적인 또는 선호적인 (심장, 골격근 및/또는 평활근 특이성 또는 선호성 등), 신경 조직 특이적인 또는 선호적인 (뇌-특이성 또는 선호성 등), 눈 특이적인 또는 선호적인 (망막-특이성 및 각막-특이성 등), 간 특이적인 또는 선호적인, 골수 특이적인 또는 선호적인, 췌장 특이적인 또는 선호적인, 비장 특이적인 또는 선호적인, 및 폐 특이적인 또는 선호적인 프로모터/인핸서 인자들을 포함한다. 그외 유도성 프로모터/인핸서 인자로는 호르몬-유도성 인자 및 금속-유도성 인자를 포함한다. 유도성 프로모터/인핸서 인자의 예로는, 비-제한적으로, Tet on/off 인자, RU486-유도성 프로모터, 에크디슨-유도성 프로모터, 라파마아신-유도성 프로모터, 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함한다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터는 이종의 핵산을, 분열 세포 및 비-분열 세포 등의, 광범위한 세포로 전달하기 위한 수단을 제공한다. 바이러스 벡터는 대상 핵산을 시험관내 세포에 전달하기 위해, 예를 들어 시험관내에서 폴리펩타이드를 생산하거나 또는 생체외 유전자 요법을 위해 채택될 수 있다. 바이러스 벡터는 부가적으로, 예를 들어, 면역원성 또는 치료학적 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA를 발현하기 위해, 핵산을 필요한 개체에 전달하는 방법에서 이용가능하다. 이러한 방식으로, 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA를 개체에서 생체내 생산할 수 있다. 개체는 폴리펩타이드에 대해 결핍성이므로, 개체는 그 폴리펩타이드를 필요로 할 수 있다. 아울러, 개체에서 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA의 생산이 일부 유익한 효과를 부여할 수 있으므로, 본 방법을 실시할 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터를 이용해, 폴리펩타이드를 암호화하는 이종의 핵산 또는 기능성 RNA를 전달하여, 치료학적 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA를 전달하는 것이 유익한 임의의 질환 상태를 치료 및/또는 예방할 수 있다. 유전자 전달은 질환 상태에 대한 요법을 파악 및 제공하는데 실질적인 용도를 가진다. 결함 유전자들이 공지되어 있으며 클로닝된 유전 질환들이 다소 존재한다. 일반적으로, 상기한 질환들은 2가지 계열로 나뉜다: 일반적으로 열성 방식으로 유전되는, 통상적으로 효소가 결핍된 상태, 및 조절성 또는 구조 단백질을 수반할 수 있으며 전형적으로 우성 방식으로 유전되는 불균형 상태. 결핍 상태의 질환의 경우, 유전자 전달을 이용해 정상 유전자를 영향이 미치는 조직에 대체 요법으로서 전달할 수 있을 뿐 아니라 안티센스 돌연변이를 이용해 동물 질환 모델을 구축할 수 있다. 불균형 질환 상태의 경우, 유전자 전달을 이용해 모델 시스템에 질환 상태를 구축할 수 있으며, 이후 이를 질환 상태에 대응하기 위한 시도로 활용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 바이러스 벡터는 유전자 질환을 치료 및/또는 예방을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터는 또한 기능성 RNA를 세포에 시험관내 또는 생체내에서 공급하기 위해 활용할 수 있다. 기능성 RNA는, 예를 들어, 비-암호화 RNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포에서 기능성 RNA의 발현은 세포에 의한 특정 표적 단백질의 발현을 약화시킬 수 있다. 이에, 기능성 RNA는 필요로 하는 개체에서 특정 단백질의 발현을 줄이기 위해 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포에서 기능성 RNA의 발현은 세포에 의한 특정 표적 단백질의 발현을 높일 수 있다. 따라서, 기능성 RNA를 투여하여, 필요한 개체에서 특정 단백질의 발현을 높일 수 있다. 일부 구현예에서, 기능성 RNA의 발현은 세포에서 특정 표적 RNA의 스플라이싱을 제어할 수 있다. 이에, 기능성 RNA를 투여하여, 필요한 개체에서 특정 RNA의 스플라이싱을 제어할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포에서 기능성 RNA의 발현은 세포에 의한 특정 표적 단백질의 기능을 제어할 수 있다. 즉, 기능성 RNA를 투여하여, 필요한 개체에서 특정 단백질의 기능을 제어할 수 있다. 또한, 기능성 RNA를 세포에 시험관내 투여하여, 유전자 발현 및/또는 세포 생리학적 특성을 조절할 수 있으며, 예를 들어 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화하거나 또는 스크리닝 방법에서 최적화할 수 있다.
대안적으로, 바이러스 벡터를 세포에 생체외로 투여할 수 있으며, 변이된 세포를 개체에 투여한다. 이종의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 세포에 도입하고, 그 세포를 개체에 투여하며, 이때 면역원을 암호화하는 이종의 핵산이 발현되어 개체에서 면역원에 대한 면역 반응이 유도될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 항원-제시 세포 (예, 수지상 세포)이다.
키트
본 발명의 다른 측면은 개체에서 재조합 생물제제 및/또는 약물 물질에 대한 중화 항체 및/또는 면역글로불린을 저하 및/또는 소거하기 위한 키트를 제공하며, 키트는 본원에 기술된 조성물들 중 어느 하나, 조성물의 투여 수단 및 사용 설명서를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 시약은 면역글로불린 G (IgG)-분해 효소를 포함한다.
번호로 열거된 구현예들
아래 번호로 열거된 구현예들은 본 발명의 범위에 포함된다.
1. 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하는 조성물을 치료학적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체에서 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 중화 항체의 함량을 저하하는 방법.
2. 중화 항체가 IgG, IgM, IgE 또는 IgA인, 구현예 1에 따른 방법.
3. 중화 항체가 IgG인, 구현예 2의 방법.
4. 재조합 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 보바인 AAV 벡터인, 구현예 1-3 중 어느 하나에 따른 방법.
5. AAV 벡터가 야생형 AAV 벡터인, 구현예 4에 따른 방법.
6. AAV 벡터가 돌연변이 AAV 벡터인, 구현예 4에 따른 방법.
7. 재조합 AAV 벡터가 치료학적 단백질 또는 치료학적 RNA를 암호화하는 이종의 핵산을 포함하는, 구현예 1-6 중 어느 하나에 따른 방법.
8. 개체에서 항체의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99%가 상기 조성물의 투여 후 분해되는, 구현예 1-7 중 어느 하나에 따른 방법.
9. 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 포함하는, 구현예 1-8 중 어느 하나에 따른 방법.
10. 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 구현예 1-8 중 어느 하나에 따른 방법.
11. 상기 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 시스테인 프로테아제 활성을 가진, 구현예 9 또는 10에 따른 방법.
12. 항체-분해 효소가 IgG를 특이적으로 절단하는, 구현예 9-11 중 어느 하나에 따른 방법.
13. 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 스트렙토코커스 속으로부터 유래되는, 구현예 9-12 중 어느 하나에 따른 방법.
14. 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 9-13 중 어느 하나에 따른 방법.
15. 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 14에 따른 방법.
16. 조성물이 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하되 제1 단백질이 항체-분해 효소 또는 이의 단편인, 구현예 1-15 중 어느 하나에 따른 방법.
17. 제1 단백질 및 제2 단백질이 링커에 의해 분리된, 구현예 16에 따른 방법.
18. 제2 단백질이 IgG 프로테아제인, 구현예 16 또는 17에 따른 방법.
19. 항체-분해 효소 또는 이의 단편 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 개체에 투여하는, 구현예 9-15 중 어느 하나에 따른 방법.
20. 투여가 상기 항체의 Fc 수용체에의 결합을 감소시키는, 구현예 1-19 중 어느 하나에 따른 방법.
21. 조성물이 정맥내 투여되는, 구현예 1-20 중 어느 하나에 따른 방법.
22. 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 구현예 1-21 중 어느 하나에 따른 방법.
23. 개체가 인간인, 구현예 1-22 중 어느 하나에 따른 방법.
24. 조성물의 투여 전에 개체에 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터가 처치되는, 구현예 1-23 중 어느 하나에 따른 방법.
25. 조성물의 투여 전 개체에 재조합 AAV가 처치되지 않는, 구현예 1-23 중 어느 하나에 따른 방법.
26. (a) AAV 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하거나, 및/또는 (b) Fc 수용체에 대한 중화 항체의 결합을 저하하는 조성물을 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터를 이용한 처치를 위해 개체를 준비시키는 방법.
27. 중화 항체가 IgG, IgM, IgE 또는 IgA인, 구현예 26에 따른 방법.
28. 중화 항체가 IgG인, 구현예 27에 따른 방법.
29. 재조합 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 보바인 AAV 벡터인, 구현예 26-28 중 어느 하나에 따른 방법.
30. AAV 벡터가 야생형 AAV 벡터인, 구현예 29에 따른 방법.
31. AAV 벡터가 돌연변이 AAV 벡터인, 구현예 29에 따른 방법.
32. 재조합 AAV가 치료학적 단백질 또는 치료학적 RNA를 암호화하는 이종의 핵산을 포함하는, 구현예 26-31 중 어느 하나에 따른 방법.
33. 조성물의 투여 후 항체의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99%가 개체 체내에서 분해되는, 구현예 26-32 중 어느 하나에 따른 방법.
34. 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 포함하는, 구현예 26-33 중 어느 하나에 따른 방법.
35. 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 구현예 26-33 중 어느 하나에 따른 방법.
36. 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 시스테인 프로테아제 활성을 가진, 구현예 34 또는 35에 따른 방법.
37. 항체-분해 효소가 IgG를 특이적으로 절단하는, 구현예 26-36 중 어느 하나에 따른 방법.
38. 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 스트렙토코커스 속으로부터 유래되는, 구현예 26-37 중 어느 하나에 따른 방법.
39. 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 26-38 중 어느 하나에 따른 방법.
40. 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 30에 따른 방법.
41. 조성물이 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하되 제1 단백질이 항체-분해 효소 또는 이의 단편인, 구현예 26-40 중 어느 하나에 따른 방법.
42. 제1 단백질 및 제2 단백질이 링커에 의해 분리된, 구현예 41에 따른 방법.
43. 제2 단백질이 IgG 프로테아제인, 구현예 41 또는 42에 따른 방법.
44. 개체에 항체-분해 효소 또는 이의 단편 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 투여하는, 구현예 34-43 중 어느 하나에 따른 방법.
45. 투여가 Fc 수용체에 대한 항체의 결합을 감소시키는, 구현예 28-44 중 어느 하나에 따른 방법.
46. 조성물이 정맥내로 투여되는, 구현예 26-45 중 어느 하나에 따른 방법.
47. 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 구현예 26-46 중 어느 하나에 따른 방법.
48. 개체가 인간인, 구현예 26-47 중 어느 하나에 따른 방법.
49. 하기 단계를 포함하는, 필요한 개체를 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터로 치료하는 방법:
(i) (a) AAV 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하거나, 및/또는 (b) Fc 수용체에 대한 중화 항체의 결합을 저하하는 조성물을 유효량으로 개체에 투여하는 단계; 및
(ii) 상기 개체에 AAV 벡터를 유효량으로 투여하는 단계.
50. AAV 벡터가 상기 조성물과 동시에 투여되는, 구현예 49에 따른 방법.
51. AAV 벡터가 상기 조성물의 투여 후 투여되는, 구현예 49에 따른 방법.
52. AAV 벡터가 상기 조성물을 투여하기 전에 투여되는, 구현예 49에 따른 방법.
53. 방법이 제2 AAV 벡터를 개체 투여하는 단계를 더 포함하는, 구현예 49-52 중 어느 하나에 따른 방법.
54. AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터가 동일한 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 구현예 53에 따른 방법.
55. AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터가 서로 다른 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 구현예 53에 따른 방법.
56. 중화 항체가 IgG, IgM, IgE 또는 IgA인, 구현예 45-55 중 어느 하나에 따른 방법.
57. 중화 항체가 IgG, 구현예 56에 따른 방법.
58. 재조합 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 보바인 AAV 벡터인, 구현예 49-57 중 어느 하나에 따른 방법.
59. AAV 벡터가 야생형 AAV 벡터인, 구현예 58에 따른 방법.
60. AAV 벡터가 돌연변이 AAV 벡터인, 구현예 58에 따른 방법.
61. 재조합 AAV 벡터가 치료학적 단백질 또는 치료학적 RNA를 암호화하는 이종의 핵산을 포함하는, 구현예 49-60 중 어느 하나에 따른 방법.
62. 조성물의 투여 후 항체의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99%가 개체 체내에서 분해되는, 구현예 49-61 중 어느 하나에 따른 방법.
63. 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 포함하는, 구현예 49-62 중 어느 하나에 따른 방법.
64. 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 구현예 49-62 중 어느 하나에 따른 방법.
65. 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 시스테인 프로테아제 활성을 가진, 구현예 63 또는 64에 따른 방법.
66. 항체-분해 효소가 IgG를 특이적으로 절단하는, 구현예 63-65 중 어느 하나에 따른 방법.
67. 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 스트렙토코커스 속으로부터 유래되는, 구현예 63-66 중 어느 하나에 따른 방법.
68. 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 63-67 중 어느 하나에 따른 방법.
69. 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 68에 따른 방법.
70. 조성물이 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하되 제1 단백질이 항체-분해 효소 또는 이의 단편인, 구현예 49-69 중 어느 하나에 따른 방법.
71. 제1 단백질 및 제2 단백질이 링커에 의해 분리된, 구현예 70에 따른 방법.
72. 제2 단백질이 IgG 프로테아제인, 구현예 70 또는 71에 따른 방법.
73. 개체에 항체-분해 효소 또는 이의 단편 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 투여하는, 구현예 63-72 중 어느 하나에 따른 방법.
74. 투여가 Fc 수용체에 대한 항체의 결합을 감소시키는, 구현예 49-73 중 어느 하나에 따른 방법.
75. 조성물이 정맥내로 투여되는, 구현예 49-74 중 어느 하나에 따른 방법.
76. 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 구현예 49-75 중 어느 하나에 따른 방법.
77. 개체가 인간인, 구현예 49-76 중 어느 하나에 따른 방법.
78. 하기 단계를 포함하는, 제1 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터로 이전에 처치된 개체에 제2 재조합 AAV를 처치하는 방법:
(i) (a) 제1 및/또는 제2 재조합 AAV 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하거나, 및/또는 (b) Fc 수용체에 대한 중화 항체의 결합을 저하하는 조성물을 유효량으로 개체에 투여하는 단계; 및
(ii) 상기 개체에 제2 재조합 AAV 벡터를 유효량으로 투여하는 단계.
79. 제1 재조합 AAV와 상기 제2 재조합 AAV가 동일한 혈청형인, 구현예 78에 따른 방법.
80. 제1 재조합 AAV와 상기 제2 재조합 AAV가 서로 다른 혈청형인, 구현예 78에 따른 방법.
81. 중화 항체가 IgG, IgM, IgE 또는 IgA인, 구현예 78-80 중 어느 하나에 따른 방법.
82. 중화 항체가 IgG인, 구현예 81에 따른 방법.
83. 재조합 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 보바인 AAV 벡터인, 구현예 76-82 중 어느 하나에 따른 방법.
84. AAV 벡터가 야생형 AAV 벡터인, 구현예 83에 따른 방법.
85. AAV 벡터가 돌연변이 AAV 벡터인, 구현예 83에 따른 방법.
86. 재조합 AAV가 치료학적 단백질 또는 치료학적 RNA를 암호화하는 이종의 핵산을 포함하는, 구현예 78-85 중 어느 하나에 따른 방법.
87. 조성물의 투여 후 항체의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99%가 분해되는, 구현예 78-86 중 어느 하나에 따른 방법.
88. 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 포함하는, 구현예 78-87 중 어느 하나에 따른 방법.
89. 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 구현예 78-87 중 어느 하나에 따른 방법.
90. 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 시스테인 프로테아제 활성을 가진, 구현예 88 또는 89에 따른 방법.
91. 항체-분해 효소가 IgG를 특이적으로 절단하는, 구현예 78-90 중 어느 하나에 따른 방법.
92. 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 스트렙토코커스 속으로부터 유래되는, 구현예 78-91 중 어느 하나에 따른 방법.
93. 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 78-92 중 어느 하나에 따른 방법.
94. 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 93에 따른 방법.
95. 조성물이 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하되 제1 단백질이 항체-분해 효소 또는 이의 단편인, 구현예 87-94 중 어느 하나에 따른 방법.
96. 제1 단백질 및 제2 단백질이 링커에 의해 분리된, 구현예 95에 따른 방법.
97. 제2 단백질이 IgG 프로테아제인, 구현예 95 또는 96에 따른 방법.
98. 항체-분해 효소 또는 이의 단편 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 개체에 투여하는, 구현예 78-97 중 어느 하나에 따른 방법.
99. 투여가 상기 항체의 Fc 수용체에의 결합을 감소시키는, 구현예 78-98 중 어느 하나에 따른 방법.
100. 조성물이 정맥내 투여되는, 구현예 78-99 중 어느 하나에 따른 방법.
101. 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 구현예 78-100 중 어느 하나에 따른 방법.
102. 개체가 인간인, 구현예 78-101 중 어느 하나에 따른 방법.
103. 개체에 유효량의 AAV 벡터, 및 (a) AAV 벡터에 대한 항체 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 재조합 단백질의 분해를 촉진하거나; 및/또는 (b) 항체의 Fc 수용체에의 결합을 감소시키는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에서 이종의 핵산을 포함하는 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 중화 항체를 저하하는 방법.
104. 항체가 IgG인, 구현예 103에 따른 방법.
105. 개체에 상기 AAV 벡터가 상기 조성물과 동시에 투여되는, 구현예 103 또는 104에 따른 방법.
106. 개체에 상기 조성물을 투여한 후 상기 AAV 벡터가 투여되는, 구현예 103 또는 104에 따른 방법.
107. 개체에 상기 조성물을 투여하기 전에 상기 AAV 벡터가 투여되는, 구현예 103 또는 104에 따른 방법.
108. 제2 이종의 핵산을 포함하는 제2 AAV 벡터를 1회 이상 투여하는 것을 더 포함하는, 구현예 107에 따른 방법.
109. AAV 벡터 및 상기 제2 AAV 벡터가 동일한 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 구현예 108에 따른 방법.
110. AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터가 서로 다른 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 구현예 108에 따른 방법.
111. 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 더 포함하는, 구현예 102-110 중 어느 하나에 따른 방법.
112. 조성물이 항체의 분해를 촉진하는, 구현예 102-111 중 어느 하나에 따른 방법.
113. 개체의 체내에서 항체의 수준이 대조군 개체에서의 항체 수준에 대해 약 95% 내지 약 0.01% 범위의 수준으로 감소하고, 대조군 개체는 AAV 벡터가 투여되나 조성물은 투여되지 않은 개체인, 구현예 112에 따른 방법.
114. 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 포함하는, 구현예 112 또는 113에 따른 방법.
115. 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 구현예 112 또는 113에 따른 방법.
116. 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 포함하는, 구현예 114 또는 115에 따른 방법.
117. 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 스트렙토코커스 속으로부터 유래되는, 구현예 114-116 중 어느 하나에 따른 방법.
118. 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 114-117 중 어느 하나에 따른 방법.
119. 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 114-118 중 어느 하나에 따른 방법.
120. 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편; 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 구현예 114-119 중 어느 하나에 따른 방법.
121. 제2 단백질이 IgG 프로테아제인, 구현예 120에 따른 방법.
122. 개체에 항체-분해 효소 또는 이의 단편 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 투여하는, 구현예 114-121 중 어느 하나에 따른 방법.
123. 개체가 인간인, 구현예 108-122 중 어느 하나에 따른 방법.
124. 조성물이 항체의 Fc 수용체에의 결합을 감소시키는, 구현예 102에 따른 방법.
전술한 설명뿐 아니라 후술한 실시예들은 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 범위내에서 기타 측면, 이점 및 변형들이 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 재조합 IdeZ ( rIdeZ )의 클로닝 , 발현 및 정제
IdeZ 코딩 서열을 pGEX-6P-3 벡터에 BamHI 및 SalI 제한효소 부위를 이용해 클로닝하여, N-말단에 GST 부착된 IdeZ 융합체 (GST-IdeZ) (도 1A)를 구축하였다. GST-IdeZ의 발현은 lac 오페론 하에 제어되며, 생산은 IPTG 첨가에 의해 유도되었다. IdeZ 단백질을 글루타티온 세파로스를 사용해 정제하고, 과량의 글루타티온으로 용출시켰다. SDS-PAGE를 이용해 발현 및 정제를 모니터링하였다 (도 1B). 재조합 IdeZ는 Biorad ImagelabTM 소프트웨어에서 표준 물질로 BSA를 이용해 정량하였다.
실시예 2: IdeZ는 재조합 마우스 IgG 및 복수의 종으로부터 유래된 혈청 IgG 를 절단한다.
rIdeZ가 시험관내에서 활성인지를 확인하기 위해, 마우스, 영장류 및 인간 혈청 샘플에 재조합 GST-IdeZ (1㎍)를 3시간 동안 37℃에서 처리하였다. 도 6에 도시한 바와 같이, GST-IdeZ 절단된 IgG는 인간 및 영장류 혈청에 존재하였다.
별개의 실험으로, 재조합 마우스 IgG (40 ㎍)를 rIdeZ (NEB P0770S, 160 unit)와 함께 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 반응은 SDS-PAGE에 의해 비-환원 조건 하에 분석하였으며, 코마시 블루로 염색하였다 (도 2A). IdeZ의 존재시, 재조합 마우스 IgG는 별표로 표시된 바와 같이 여러 개의 밴드로 절단되었다. 화살표시는 IdeZ 단백질을 가르킨다.
추가적인 실험으로, 마우스, 영장류 및 인간의 혈청 샘플에 재조합 IdeZ (NEB P0770S, 320단위)를 3시간 동안 37℃에서 무처리 (-)하거나 또는 처리하였다 (+). 반응물을 1:10으로 희석하고, SDS-PAGE에 의해 환원 조건 하에 분석하였다. 그 후, 겔을 코마시 블루로 염색하였다. 도 2B에 나타낸 바와 같이, 혈청에 존재하는 IgG가 IdeZ에 의해 절단되었다. 도 2B에서, 겔 아래쪽은 IgG 중쇄 절단 산물 (~31 kDa)이 함유된 겔 부분이 과다 노출된 것으로 보인다. IdeZ는 또한 다른 인간 환자 (공여자 1-5)의 혈청 샘플에서도 IgG를 절단하였다 (도 2D). 비슷한 실험에서, IdeZ가 개 혈청으로부터 IgG를 절단할 수 있는 것으로 또한 관찰되었다 (도 2C). 요컨대, 이들 데이터는 IdeZ가 여러 종의 혈청에서 IgG를 절단할 수 있다는 것을, 입증해준다.
실시예 3: IdeZ는 인간 IVIG를 시험관내 및 생체내에서 절단한다.
인간 정맥내 면역글로불린 (IVIG)을 GST-IdeZ (1 ㎍) 또는 IdeZ (NEB P0770S 또는 Genscript)와 함께 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 반응을 SDS-PAGE에 의해 환원 조건 하에 분석하고, 코마시 블루로 염색하였다. 도 3B에 나타낸 바와 같이, IdeZ는 인간 IVIG를 시험관내에서 절단하였다.
마우스에 인간 IVIG 8 mg을 복막내 주사하였다. 24시간 후, 동일한 마우스에 PBS (-) 또는 재조합 IdeZ (2.5 mg/kg) (+)를 정맥내 주사하였다. IVIG 주사 후 72시간 경과시, 혈액 샘플을 채혈한 다음 SDS-PAGE에 의해 환원 조건 하에 분석하고 면역블롯팅을 수행하였다. IVIG를 염소 항-humIgG Alexa Fluor 647 (1:10,000)로 탐침하였다. IdeZ의 존재시, 인간 IVIG는 별표로 표시한 바와 같이 여러개의 작은 절단 산물들로 절단되었다 (도 3A). 이들 데이터는, IdeZ가 인간 IVIG를 생체내에서 절단함을 보여준다.
유사 실험으로, 마우스에 인간 IVIG 8 mg을 복막내 주사하였다. 24시간 후, 동일한 마우스에 PBS (-) 또는 재조합 GST-IdeZ (2.5 mg/kg) (+)를 정맥내 주사하였다. 주사 전, 그리고 IVIG 주사 후 24시간, 48시간 및 72시간 경과시 혈액 샘플을 채혈하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, IdeZ는 24시간 이내에 인간 IVIG를 절단하였으며, 절단 수준은 최대 72시간 (3일)까지 계속 증가하였다.
실시예 4: GST - IdeZ 매개 IVIG 절단에 대한 용량 분석
GST-IdeZ 매개 IVIG 절단에 대한 용량 분석을 또한 수행하였다. 본 실험에서, 마우스에 인간 IVIG 8 mg을 복막내 주사하였다. 24시간 후, 동일 마우스에 PBS (-) 또는 재조합 GST-IdeZ (0.25 mg/kg) (+)를 정맥내 주사하였다. 도 8A-8B에 나타낸 바와 같이, 절단은 용량 의존적이었다. 최고 용량 (2.5 mg/kg)에서, 밴드의 크기 변동에 의해 확인된 바와 같이, 샘플에서 거의 모든 IVIG가 절단되었다.
IdeZ의 절단 부위는 인간 면역글로불린의 힌지부에 존재한다. IdeZ가 IVIG를 절단하였는지를 검증하기 위해, 마우스 PBS(-) 또는 1 mg/kg IdeZ(+)의 혈청 샘플을 SDS-PAGE에서 전개한 다음 항-Fab 또는 항-Fc 항체로 탐침하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, IdeZ 처리 결과로 인해 Fab 밴드 크기가 달라졌으며 (약 250 -> 약 150 kDa), 이는 절단되었다는 것을 의미한다. IdeZ 처리 샘플에서 Fc 밴드는 약 50 kDa에서 관찰되었으며, 이는 이 도메인이 Fab로부터 분리되었다는 것을 의미한다.
인간 IVIG를 이용한 AAV8-Luc의 중화 프로파일 또한 구축하였다. GST-IdeZ (1 ㎍) 처리된 또는 무처리된 인간 IVIG를 1:1000에서 1:102,400까지 2배 연속 희석하고, AAV8-Luc와 함께 인큐베이션한 다음 배양 중에 세포에 투여하였다 (100,000 vg/cell). 도 10의 그래프에 의해 확인되는 바와 같이, AAV8-Luc의 중화는 GST-IdeZ 존재시 감소하였다.
실시예 5: IdeZ는 IVIG 처리 마우스에서 AAV8 -Luc 간 형질도입을 구제한다
마우스에 인간 IVIG 8 mg을 복막내 주사하였다. 24시간 후, 동일 마우스에 PBS 또는 재조합 IdeZ (2.5 mg/kg)와 AAV8-Luc (5 x 1012 vg/kg)를 정맥내 주사하였다. 주사 후 4주차에 간에서 루시퍼라제 전이유전자의 발현 수준을 분석하였다. 루시퍼라제 발현 수준은 전체 조직 단백질의 농도에 대해 표준화하고, 간 조직 g 당 상대적인 광도 단위 (RLU)로 표시하였다. 모든 실험은 3세트로 수행하였다. * p < 0.05.; L.O.D = 검출 한계.
도 4에 나타낸 바와 같이, IVIG 처리 마우스에서는 간 AAV8-Luc 형질도입 수준 저하가 관찰되었다. 그러나, IVIG 처리 마우스에 IdeZ를 공동 주사한 경우에는, PBS 처리 마우스와 비슷한 수준에서 AAV8-Luc 간 형질도입이 관찰되었다.
AAV8-Luc 카피수를 마우스의 간 샘플에서 계산하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 세포 당 AAV-Luc 카피수는 AAV8-Luc 및 IdeZ를 공동 주사한 IVIG 처리 마우스의 샘플에서 더 높았다. IdeZ 무처리 마우스에서는 간 형질도입이 매우 낮았다.
요컨대, 이들 데이터는, IdeZ가 IVIG에 의한 AAV 중화를 감소시키고, AAV8-Luc의 간 형질도입을 촉진한다는 것을, 보여준다.
실시예 6: IdeZ는 IVIG 처리 마우스에서 AAV9 -Luc 간 및 심장 형질도입을 구제한다
마우스에 인간 IVIG 8 mg을 복막내 주사하였다. 72시간 후, 동일 마우스에 PBS 또는 재조합 GST-IdeZ (2.5 mg/kg)를 정맥내 주사하였다. IdeZ 처리한지 72시간 후, 마우스에 AAV9-Luc (2 x 1011 vg/마우스)를 처리하였다. 주사 후 4주차에 간 및 심장에서 루시퍼라제 전이유전자의 발현 수준을 분석하였다. 루시퍼라제 발현 수준은 전체 조직 단백질의 농도에 대해 표준화하고, 간 조직 g 당 상대적인 광도 단위 (RLU)로 표시하였다.
IVIG 처리된 수컷 및 암컷 마우스의 경우, 간 (도 12A, 도 12C) 및 심장 (도 12B, 도 12D)에서 AAV9-Luc 형질도입 수준 저하가 관찰되었다. 그러나, GST-IdeZ가 공동 주사된 IVIG 처리 마우스의 경우에는 AAV9-Luc 간 및 심장 형질도입이 PBS 처리 마우스와 비슷한 수준으로 관찰되었다.
요컨대, 이들 데이터는, IdeZ가 AAV의 IVIG 매개 중화를 무효화하고 AAV9-Luc 간 및 심장 형질도입을 촉진한다는 것을 보여준다 (L.O.D = 검출 한계).
실시예 7: IdeZ는 환자 혈청이 처리된 마우스에서 AAV9 -Luc 간 및 심장 형질도입을 개선한다
인간 환자 18명으로부터 수득한 혈청 샘플에 대해, 간 및 심장에서 AAV9 형질도입을 중화하는 능력을 검사하였다.
실험에서 인간 혈청 샘플 당 마우스 2마리를 사용하였으며, 이들 2마리 모두에 인간 환자 혈청 100 ㎕를 복막내 주사하였다. 그런 후, 72시간 후 마우스에 PBS 또는 재조합 GST-IdeZ (2.5 mg/kg)를 정맥내 주사하였다. IdeZ 처리한지 72시간 후 마우스에 AAV9-Luc (2 x 1011 vg/마우스)를 정맥내 주사하였다.
주사 후 4주 경과시 간 및 심장으로의 형질도입 수준을 분석하였다. 형질도입 수준을 혈청 처리없이 AAV9-Luc (2 x 1011 vg/마우스)를 주사한 대조군 마우스에 대해 표준화하였다.
도 13A 및 13B에 나타낸 바와 같이, 인간 환자 혈청이 처리된 마우스에서는 차별적인 형질도입 수준이 관찰되었다. 강력한 중화성을 가진 환자 혈청이 처리된 마우스에서는, GST-IdeZ 공동 주사시, 간 (도 13A) 및 심장 (도 13B)에서의 형질도입 증가가 관찰되었다.
요컨대, 이들 데이터는, IdeZ가 환자 혈청 매개 AAV의 중화를 길항하고 AAV9-Luc의 간 및 심장으로의 형질도입을 촉진한다는 것을, 보여준다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 내용이 과제를 수행하고, 언급되고 아울러 내재된 목표와 이점을 수득하기 위해 원활하게 조정됨을 쉽게 알 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 내용은 바람직한 대표적인 구현예들을 기술하고 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되진 않는다. 당해 기술 분야의 당업자라면 이에 대한 수정 및 다른 활용도 행할 수 있으며, 이는 청구항의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 사상에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Duke University <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR EVADING HUMORAL IMMUNITY <130> DU6568PCT <150> US 62/914,682 <151> 2019-10-14 <150> US 62/797,495 <151> 2019-01-28 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 349 <212> PRT <213> Streptococcus equi <400> 1 Met Lys Thr Ile Ala Tyr Pro Asn Lys Pro His Ser Leu Ser Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Thr Ala Ile Ala Ile Phe Ser Leu Ala Ser Ser Asn Ile Thr 20 25 30 Tyr Ala Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu 35 40 45 Val Pro His Gln Ile Thr Ser Val Trp Ser Lys Gly Val Thr Pro Leu 50 55 60 Thr Pro Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro 65 70 75 80 Tyr Leu Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly 85 90 95 Lys Asp Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His 100 105 110 Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys 115 120 125 His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp 130 135 140 Leu Lys Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln 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Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln Phe Thr Gln Gly 1 5 10 15 Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp 20 25 30 Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Ala Asp Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala 35 40 45 Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu 50 55 60 Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe 65 70 75 80 Arg Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp 85 90 95 Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg Asp Lys Ala Phe 100 105 110 Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro Asp Leu Val Leu 115 120 125 Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser 130 135 140 Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile 145 150 155 160 Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala 165 170 175 Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile 180 185 190 Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr 195 200 205 Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe 210 215 220 Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Thr Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala 225 230 235 240 Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Ile Asn Ala His 245 250 255 Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly 260 265 270 Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp 275 280 285 Gln Lys Leu Ser 290 <210> 47 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG degrading enzyme amino acid sequence <400> 47 Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro 1 5 10 15 His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln 20 25 30 Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu 50 55 60 Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln 65 70 75 80 Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys Gln 85 90 95 Lys Ile Ile Phe Arg Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile 100 105 110 Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe Arg 115 120 125 Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met Pro 130 135 140 Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Phe 145 150 155 160 Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp Lys 165 170 175 Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Thr Thr 180 185 190 Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp Ile 195 200 205 Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Arg Ala Leu Ala Leu 210 215 220 Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His Val Ile Asn Leu Trp 225 230 235 240 Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Thr Tyr Val Thr 245 250 255 Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly 260 265 270 Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly 275 280 285 Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Ser Gly 290 295 300 Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser 305 310 <210> 48 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG degrading enzyme amino acid sequence <400> 48 Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro 1 5 10 15 His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro 20 25 30 Glu Gln Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala 35 40 45 Asn Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn 50 55 60 Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe 65 70 75 80 Asp Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu 85 90 95 Lys Gln Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Asn Met Phe Asp Val Lys Lys 100 105 110 Ala Ile Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Asn Tyr 115 120 125 Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Ala Lys His Leu Gly Val 130 135 140 Phe Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser 145 150 155 160 Leu Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro 165 170 175 Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys 180 185 190 Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Asn Lys Asn Leu Asn Asp Ile 195 200 205 Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly Leu 210 215 220 Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp 225 230 235 240 Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Thr Tyr Val Thr 245 250 255 Asp Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly 260 265 270 Val Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly 275 280 285 Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly 290 295 300 Gln Asp Ser Trp Gln Lys Leu Ser 305 310 <210> 49 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG degrading enzyme amino acid sequence <400> 49 Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro 1 5 10 15 His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro 20 25 30 Glu Gln Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala 35 40 45 Asn Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn 50 55 60 Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe 65 70 75 80 Asp Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu 85 90 95 Lys Gln Lys Ile Asn Phe Arg Gly Glu Asn Met Phe Asp Val Lys Glu 100 105 110 Ala Ile Arg Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr 115 120 125 Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Ala Lys His Leu Gly Val 130 135 140 Phe Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser 145 150 155 160 Leu Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Lys Gly Ser Lys Asp Pro 165 170 175 Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys 180 185 190 Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Asn Lys Asn Leu Asn Asp Ile 195 200 205 Ser Thr Ile Ile Lys Ser Glu Leu Thr Asn Gly Lys Ala Leu Gly Leu 210 215 220 Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp 225 230 235 240 Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Thr Tyr Val Thr 245 250 255 Asp Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly 260 265 270 Val Asn Lys His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly 275 280 285 Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly 290 295 300 Gln Asp Ser Trp Gln Lys Leu Asn 305 310 <210> 50 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG degrading enzyme amino acid sequence <400> 50 Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro 1 5 10 15 His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro 20 25 30 Glu Gln Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala 35 40 45 Asn Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp 50 55 60 Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe 65 70 75 80 Asp Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu 85 90 95 Lys Gln Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu 100 105 110 Ala Ile Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr 115 120 125 Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val 130 135 140 Phe Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser 145 150 155 160 Leu Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro 165 170 175 Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys 180 185 190 Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile 195 200 205 Ser Asp Leu Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu 210 215 220 Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp 225 230 235 240 Gly Ala Asp Phe Asp Ala Glu Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr 245 250 255 Asp Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly 260 265 270 Val Asn Ala Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly 275 280 285 Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly 290 295 300 Gln Asp Ser Trp Asn Gln Thr Ser 305 310 <210> 51 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG degrading enzyme amino acid sequence <400> 51 Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro 1 5 10 15 His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Leu Thr Pro 20 25 30 Glu Gln Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala 35 40 45 Asn Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp 50 55 60 Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe 65 70 75 80 Asp Gln Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu 85 90 95 Lys Gln Lys Ile Asn Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu 100 105 110 Ala Ile Arg Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr 115 120 125 Phe Lys Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val 130 135 140 Phe Pro Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser 145 150 155 160 Leu Thr Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Lys Gly Ser Lys Asp Pro 165 170 175 Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys 180 185 190 Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile 195 200 205 Ser Asp Leu Ile Lys Glu Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly Leu 210 215 220 Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp 225 230 235 240 Gly Ala Asp Phe Asp Ala Glu Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr 245 250 255 Asp Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly 260 265 270 Val Asn Lys Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly 275 280 285 Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly 290 295 300 Gln Asp Ser Trp Asn Gln Thr Asn 305 310 <210> 52 <211> 310 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG degrading enzyme amino acid sequence <400> 52 Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro 1 5 10 15 His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln 20 25 30 Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu Leu 50 55 60 Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln 65 70 75 80 Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln 85 90 95 Lys Ile Asn Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Lys Ala Ile 100 105 110 Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Asn Tyr Phe Lys 115 120 125 Glu Lys Ala Phe Pro Gly Leu Ser Ala Arg Arg Ile Gly Val Phe Pro 130 135 140 Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr 145 150 155 160 Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly 165 170 175 Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asn Gln Ser Lys Leu Leu 180 185 190 Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Asn Lys Asn Leu Asn Asp Ile Ser Thr 195 200 205 Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His 210 215 220 Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala 225 230 235 240 Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu Ala Thr Tyr Val Thr Asp Ser 245 250 255 Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn 260 265 270 Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala Lys Lys Ile Glu Gly Glu Asn 275 280 285 Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp 290 295 300 Ser Trp Gln Lys Leu Ser 305 310

Claims (124)

  1. 필요한 개체에서 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 중화 항체의 함량을 저하하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 개체에 상기 중화 항체의 분해를 촉진하는 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중화 항체가 IgG, IgM, IgE 또는 IgA인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 중화 항체가 IgG인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 보바인 AAV 벡터인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 야생형 AAV 벡터인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 돌연변이 AAV 벡터인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 치료학적 단백질 또는 치료학적 RNA를 암호화하는 이종의 핵산을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여 후, 상기 항체의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99%가 상기 개체 체내에서 분해되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 시스테인 프로테아제 활성을 가진, 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 IgG를 특이적으로 절단하는, 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속으로부터 유래되는, 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하고, 상기 제1 단백질이 항체-분해 효소 또는 이의 단편인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제1 단백질과 상기 제2 단백질이 링커에 의해 분리된, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 제2 단백질이 IgG 프로테아제인, 방법.
  19. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에 상기 항체-분해 효소 또는 이의 단편 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 투여하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 Fc 수용체에 대한 상기 항체의 결합을 감소시키는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내 투여되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 인간인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 상기 조성물의 투여 전 상기 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터로 처치되는, 방법.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 상기 조성물의 투여 전 상기 재조합 AAV로 처치되지 않는, 조성물.
  26. 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터를 이용한 처치를 위해 개체를 준비시키는 방법으로서, 상기 방법이 (a) AAV 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하거나, 및/또는 (b) Fc 수용체에의 중화 항체의 결합을 저하하는 조성물을 유효량으로 상기 개체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 중화 항체가 IgG, IgM, IgE 또는 IgA인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 중화 항체가 IgG인, 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 보바인 AAV 벡터인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 야생형 AAV 벡터인, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 돌연변이 AAV 벡터인, 방법.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV가 치료학적 단백질 또는 치료학적 RNA를 암호화하는 이종의 핵산을 포함하는, 방법.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여 후 항체의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99%가 상기 개체의 체내에서 분해되는, 방법.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 포함하는, 방법.
  35. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 시스테인 프로테아제 활성을 가진, 방법.
  37. 제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 IgG를 특이적으로 절단하는, 방법.
  38. 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 스트렙토코커스 속으로부터 유래되는, 방법.　
  39. 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  41. 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하고, 상기 제1 단백질이 항체-분해 효소 또는 이의 단편인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 제1 단백질 및 상기 제2 단백질이 링커에 의해 분리된, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 제2 단백질이 IgG 프로테아제인, 방법.
  44. 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에 항체-분해 효소 또는 이의 단편 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 투여하는, 방법.
  45. 제28항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 Fc 수용체에 대한 항체의 결합을 감소시키는, 방법.
  46. 제26항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내로 투여되는, 방법.
  47. 제26항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 방법.
  48. 제26항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 인간인, 방법.
  49. 필요한 개체에 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터를 처치하는 방법으로서, 상기 방법이
    (i) 상기 개체에 (a) AAV 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하거나, 및/또는 (b) Fc 수용체로의 중화 항체의 결합을 저하하는 조성물을 유효량으로 투여하는 단계; 및
    (ii) 상기 개체에 상기 AAV 벡터를 유효량으로 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 상기 조성물과 동시에 투여되는, 방법.
  51. 제49항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 상기 조성물을 투여한 후 투여되는, 방법.
  52. 제49항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 상기 조성물을 투여하기 전에 투여되는, 방법.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 제2 AAV 벡터를 상기 개체 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 AAV 벡터 및 상기 제2 AAV 벡터가 동일한 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 AAV 벡터 및 상기 제2 AAV 벡터가 서로 다른 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.
  56. 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중화 항체가 IgG, IgM, IgE 또는 IgA인, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 중화 항체가 IgG인, 방법.
  58. 제49항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 보바인 AAV 벡터인, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 야생형 AAV 벡터인, 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 돌연변이 AAV 벡터인, 방법.
  61. 제49항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV가 치료학적 단백질 또는 치료학적 RNA를 암호화하는 이종의 핵산을 포함하는, 방법.
  62. 제49항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여 후, 상기 항체의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99%가 분해되는, 방법.
  63. 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 포함하는, 방법.
  64. 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 시스테인 프로테아제 활성을 가진, 방법.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 IgG를 특이적으로 절단하는, 방법.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 스트렙토코커스 속으로부터 유래되는, 방법.
  68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  70. 제49항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하고, 상기 제1 단백질이 항체-분해 효소 또는 이의 단편인, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 제1 단백질과 상기 제2 단백질이 링커에 의해 분리된, 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 제2 단백질이 IgG 프로테아제인, 방법.
  73. 제63항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에 항체-분해 효소 또는 이의 단편 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 투여하는, 방법.
  74. 제49항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 Fc 수용체로의 상기 항체의 결합을 감소시키는, 방법.
  75. 제49항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내 투여되는, 방법.
  76. 제49항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 방법.
  77. 제49항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 인간인, 방법.
  78. 제1 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터가 사전에 처치된 필요한 개체에서 제2 재조합 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터를 처치하는 방법으로서, 상기 방법이
    (i) 상기 개체에 (a) 제1 및/또는 제2 재조합 AAV 벡터에 대한 중화 항체의 분해를 촉진하거나, 및/또는 (b) Fc 수용체에 대한 중화 항체의 결합을 저하하는 조성물을 유효량으로 투여하는 단계; 및
    (ii) 상기 개체에 제2 재조합 AAV 벡터를 유효량으로 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 제1 재조합 AAV와 상기 제2 재조합 AAV가 동일한 혈청형인, 방법.
  80. 제78항에 있어서, 상기 제1 재조합 AAV와 상기 제2 재조합 AAV가 서로 다른 혈청형인, 방법.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중화 항체가 IgG, IgM, IgE 또는 IgA인, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 중화 항체가 IgG인, 방법.
  83. 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 보바인 AAV 벡터인, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 야생형 AAV 벡터인, 방법.
  85. 제83항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 돌연변이 AAV 벡터인, 방법.
  86. 제78항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV가 치료학적 단백질 또는 치료학적 RNA를 암호화하는 이종의 핵산을 포함하는, 방법.
  87. 제78항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여 후 상기 항체의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99%가 분해되는, 방법.
  88. 제78항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 포함하는, 방법.
  89. 제78항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 방법.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 시스테인 프로테아제 활성을 가진, 방법.
  91. 제78항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 IgG를 특이적으로 절단하는, 방법.
  92. 제78항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 스트렙토코커스 속으로부터 유래되는, 방법.　
  93. 제78항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  95. 제87항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하고, 상기 제1 단백질이 항체-분해 효소 또는 이의 단편인, 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 제1 단백질 및 제2 단백질이 링커에 의해 분리된, 방법.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 상기 제2 단백질이 IgG 프로테아제인, 방법.
  98. 제78항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에 상기 항체-분해 효소 또는 이의 단편 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 투여하는, 방법.
  99. 제78항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 Fc 수용체에 대한 상기 항체의 결합을 감소시키는, 방법.
  100. 제78항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내 투여되는, 방법.
  101. 제78항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 방법.
  102. 제78항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 인간인, 방법.
  103. 필요한 개체에서 이종의 핵산을 포함하는 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 중화 항체를 감소시키는 방법으로서, 상기 개체에 유효량의 AAV 벡터, 및 (a) AAV 벡터에 대한 항체 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 재조합 단백질의 분해를 촉진하거나 및/또는 (b) Fc 수용체에 대한 항체의 결합을 저하하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  104. 제103항에 있어서, 상기 항체가 IgG인, 방법.
  105. 제103항 또는 제104항에 있어서, 상기 개체에 상기 AAV 벡터가 상기 조성물과 동시에 투여되는, 방법.
  106. 제103항 또는 제104항에 있어서, 상기 개체에 상기 조성물을 투여한 후 상기 AAV 벡터를 투여하는, 방법.
  107. 제103항 또는 제104항에 있어서, 상기 개체에 상기 조성물을 투여하기 전에 상기 AAV 벡터를 투여하는, 방법.
  108. 제107항에 있어서, 제2 이종의 핵산을 포함하는 제2 AAV 벡터를 1회 이상 투여하는 것을 더 포함하는, 방법.
  109. 제108항에 있어서, 상기 AAV 벡터와 상기 제2 AAV 벡터가 동일한 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.
  110. 제108항에 있어서, 상기 AAV 벡터와 제2 AAV 벡터가 서로 다른 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.
  111. 제102항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 더 포함하는, 방법.
  112. 제102항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 상기 항체의 분해를 촉진하는, 방법.
  113. 제112항에 있어서, 상기 개체에서 상기 항체의 수준이 대조군 개체에서의 항체 수준에 대해 약 95% 내지 약 0.01% 범위의 수준으로 감소하며, 상기 대조군 개체는 AAV 벡터는 투여되나 상기 조성물은 투여되지 않은 개체인, 방법.
  114. 제112항 또는 제113항에 있어서, 상기 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 포함하는, 방법.
  115. 제112항 또는 제113항에 있어서, 상기 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 방법.
  116. 제114항 또는 제115항에 있어서, 상기 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 포함하는, 방법.
  117. 제114항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소 또는 이의 단편이 스트렙토코커스 속으로부터 유래되는, 방법.　
  118. 제114항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  119. 제114항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-분해 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  120. 제114항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 항체-분해 효소 또는 이의 단편; 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 제2 단백질이 IgG 프로테아제인, 방법.
  122. 제114항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에 항체-분해 효소 또는 이의 단편 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 투여하는, 방법.
  123. 제108항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 인간인, 방법.
  124. 제102항에 있어서, 상기 조성물이 Fc 수용체에 대한 상기 항체의 결합을 감소시키는, 방법.
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