CN113544278A - 用于逃避体液免疫的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开部分地提供了用于瞬时去除针对AAV载体的中和抗体的组合物和方法。这些组合物和方法扩大了适宜于基因治疗以及适宜于在之前用AAV载体治疗的患者中重新给药/重新施用AAV的患者群组。

Description

用于逃避体液免疫的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年10月14日提交的美国临时申请号62/914,682和2019年1月28日提交的美国临时申请号62/797,495的优先权，其每一个全文通过引用并入本文。
以电子方式提交的文本文件的描述
以电子方式提交的文本文件的内容在此通过引用全文并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：STRD_014_02WO_SeqList_ST25.txt，记录日期2020年1月28日，文件大小：～180千字节)。
技术领域
本申请通常涉及基因治疗领域，例如使用腺相关病毒(AAV)载体的基因治疗。更具体地，本公开涉及使用减少针对重组AAV的中和抗体的组合物和方法以改进利用重组AAV的治疗的有效性的组合物和方法。
联邦资助
本发明是在国立心肺和血液研究所(NIH/NHLBI)授予的联邦资助R01HL089221以及国立普通医学科学研究所(NIH/NIGMS)授予的联邦资助R01GM127708的政府支持下完成的。联邦政府享有本发明的某些权利。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是可用于人类的治疗性基因递送的辅助依赖性细小病毒。自2012年首个基于AAV1的基因治疗获得监管部门批准以来，涉及用于先天性黑朦、血友病和其他疾病的基因治疗的重组AAV载体的临床试验已经取得令人鼓舞的结果。
尽管他们使用了不同的天然AAV分离株，但这些基因治疗临床试验共用相同的排除标准，要求欲要入组的潜在患者具有低或不可检测的抗-AAV中和抗体(NAb)滴度。该资格标准的建立是因为人群中由自然暴露导致的预先存在的抗-AAV Nabs的高流行度，例如滴度>1:2的抗-AAV Nabs阳性的患有心力衰竭的人类受试者中总体流行率为～60％。此外，针对AAV血清型2具有高Nab滴度的大多数患者也具有可测量的针对AAV1的滴度，表明血清型之间存在交叉反应性。Nabs可通过调理素作用大幅度降低AAV载体的基因转染效率，其然后加速清除、改变生物分布、阻断细胞表面受体结合和/或对有效转导所必需的附着后步骤产生不利影响。
开发克服预先存在的抗-AAV Nabs的策略所做的尝试集中于AAV衣壳工程和诱饵、瞬时药理学免疫调节和血浆分离术。这些方法已证实通过在临床前动物模型或人类中回避或减少预先存在的Nabs来增强AAV基因转染的潜力是有限的。
因此，本领域需要用于减少、消除或灭活预先存在的抗-AAV Nabs以及产生针对施用于受试者后的AAV载体的抗体的产生的组合物和方法以改善使用AAV载体的基因递送的有效性。
发明内容
本文提供了用于在有需要的受试者中减少针对重组腺相关病毒(AAV)载体的一种或多种中和抗体的量的组合物和方法。本文所述组合物和方法可改善基因递送的有效性，例如通过增加受试者体内AAV的循环时间和/或感染力。本文所述组合物和方法还可允许对受试者重新给药治疗性AAV，其中所述受试者先前已被施用治疗性AAV。在一些实施方案中，施用野生型或突变形式的抗体降解酶(例如IdeZ)或其片段以减少需要的受试者体内的Nabs。
在一些实施方案中，本公开提供了一种减少需要的受试者体内针对重组腺相关病毒(AAV)载体的中和抗体的量的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的促进中和抗体降解的组合物。
还提供了一种使需要的受试者准备使用重组腺相关病毒(AAV)载体的治疗的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物(a)促进针对AAV载体的中和抗体的降解，和/或(b)减少中和抗体与Fc受体的结合。
还提供了一种用重组腺相关病毒(AAV)载体治疗有此需要的受试者的方法，所述方法包括：(i)向受试者施用有效量的组合物，所述组合物(a)促进针对AAV载体的中和抗体的降解，和/或(b)减少中和抗体与Fc受体的结合；以及(ii)向受试者施用有效量的AAV载体。
还提供了一种使用第二重组腺相关病毒(AAV)载体治疗有此需要的受试者的方法，其中所述受试者之前用第一重组AAV治疗，所述方法包括：(i)向所述受试者使用有效量的组合物，所述组合物(a)促进针对第一和/或第二重组AAV载体的中和抗体的降解，和/或(b)减少中和抗体与Fc受体的结合；以及(ii)向所述受试者施用有效量的第二重组AAV载体。
还提供了一种在需要的受试者体内减少针对包含异源核酸的腺相关病毒(AAV)载体的中和抗体的方法，包括向所述受试者施用有效量的AAV载体和组合物，所述组合物(a)促进针对AAV载体或通过异源核酸编码的重组蛋白质的抗体的降解；和/或(b)减少抗体与Fc受体的结合。
本文所述组合物可以包含，例如抗体降解酶或其片段。在一些实施方法中，所述组合物包含载体，所述载体包含编码抗体降解酶或其片段的多核苷酸。在一些实施方案中，所述抗体降解酶或其片段具有半胱氨酸蛋白酶活性。在一些实施方案中，所述抗体降解酶特异性裂解IgG。在一些实施方案中，所述抗体降解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
下文将更详细描述这些和其他实施方案。
附图说明
图1A-1B。图1A提供了GST-IdeZ表达载体的图谱。使用该载体，重组GST-IdeZ在大肠杆菌中表达，并使用谷胱甘肽琼脂糖纯化。图1B提供了用于可视化纯化的GST-IdeZ的凝胶图像。
图2A-2D。图2A提供了考马斯染色的SDS-PAGE凝胶的图像，其显示了未经处理(-)或用重组IdeZ处理(+)的重组IgG样品的带型图。图2B提供了类似染色的SDS-PAGE凝胶的图像，其显示了未处理(-)或用rIdeZ处理(+)的小鼠血清、灵长类动物血清及人类血清样品的带型图。在图2A和2B中，*指示IgG重链裂解产物(～31kDa)。图2C显示了相似的实验的结果，其中重组IdeZ被显示为裂解来自狗的血清IgG，而图2D显示了来自人类患者的血清IgG的IdeZ裂解。
图3A-3B。图3A提供了Western Blot的图像，其显示了IdeZ在小鼠中体内裂解人IVIG。*指示裂解产物。图3B提供了考马斯染色的SDS-PAGE凝胶的图像，其显示了在体外IdeZ处理人IVIG样品后的带型图。
图4。图4中提供的图表显示了实验的结果，该实验中小鼠腹膜内注射人静脉注射免疫球蛋白(IVIG)，并随后在24小时后注射PBS或重组IdeZ(2.5mg/kg)和AAV8-Luc(5x1012vg/kg)。在肝脏中注射后4周，分析肝脏中的荧光素酶(Luc)转基因表达水平。将荧光素酶表达水平对于总组织蛋白浓度标准化，并以每克肝组织的相对光单位(RLU)表示。所有实验重复三次。L.O.D＝检测限。*p<0.05。
图5。图5描绘了IdeZ蛋白的晶体结构。每个图面显示不同的视图。
图6。图6中，所指示的血清样品未处理(-)或在37℃下用重组GST-IdeZ(1μg)处理(+)3小时。反应以1:10稀释并在还原条件下通过SDS-PAGE进行分析。随后凝胶使用考马斯蓝染色。*指示IgG重链裂解产物(～31kDa)。
图7。图7显示了实验的结果，该实验中小鼠腹膜内注射8mg人IVIG。24小时后，相同的小鼠静脉注射PBS(-)或重组GST-IdeZ(2.5mg/kg)(+)。IVIG注射前以及IVIG注射24小时、48小时和72小时后采集血样。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹对血样进行分析。使用与HRP二级偶联的山羊抗人IgG(1:10,000)对IVIG进行探测。每条泳道代表来自个体小鼠的血样。
图8A-8B。图8A-8B显示了实验的结果，该实验中小鼠腹膜内注射8mg人IVIG。24小时后，相同的小鼠静脉注射PBS(-)(图8A，左侧图面)或0.25mg/kg(图8A，右侧图面)、1mg/kg(图8B，左侧图面)或2.5mg/kg(图8B，右侧图面)剂量的重组GST-IdeZ(+)。IVIG注射72小时后采集血样，并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析。使用与HRP二级偶联的山羊抗人IgG(1:10,000)对IVIG进行探测。每条泳道代表个体小鼠的血样。
图9。图9显示了实验的结果，该实验中小鼠腹膜内注射8mg人IVIG。24小时后，相同的小鼠静脉注射PBS(-)或重组GST-IdeZ(1mg/kg)(+)。IVIG注射72小时后采集血样，并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析。使用与HRP二级偶联的山羊抗人IgG(1:10,000)或与HRP二级偶联的山羊抗人IgG Fc(1:10,000)对IVIG进行探测。
图10。图10提供了用人IVIG的AAV8-Luc中和曲线。人IVIG样品未处理(左侧)或用GST-IdeZ(1μg)处理，并以1:1000至1:102,400的两倍增量进行连续稀释。随后，样品在体外与AAV8-Luc共同孵育(100,000vg/细胞)。实线代表用IVIG处理的AAV8-Luc以及用在不同稀释度的IVIG中与GST-IdeZ预孵育的IVIG处理的AAV8-Luc的相对转导效率。误差线代表SEM(n＝3)。
图11。图11显示了小鼠中AAV8-Luc的肝脏拷贝数。每一条代表不同的小鼠。前8条代表仅注射AAV8的小鼠(PBS-PBS-AAV8)。接下来的6条代表注射重组IdeZ和AAV8-Luc的小鼠(PBS-IdeZ-AAV8)。随后的6条代表注射IVIG且随后注射AAV8-Luc的小鼠(IVIG-PBS-AAV8)。最后8条代表注射IVIG且随后注射IdeZ和AAV8-Luc的小鼠(IVIG-IdeZ-AA8)。计算每个细胞的载体基因组拷贝数。
图12A-12D。图12A-12D中提供了显示实验结果的图表，该实验中小鼠被腹膜内注射8mg人IVIG，并随后在72小时后注射PBS或重组GST-IdeZ(2.5mg/kg)。然后，在IdeZ处理72小时后对小鼠静脉注射AAV9-Luc(2x1011vg/kg)。肝脏和心脏中注射后4周分析肝脏中的荧光素酶(Luc)转基因表达水平。将荧光素酶表达水平对于总组织蛋白浓度标准化，并以每克肝组织的相对光单位(RLU)表示。所有实验重复三次。L.O.D＝检测限。
图13A-13B。图13A-13B显示了肝脏(图13A)和心脏(13B)中的转导百分比。血清样品从18个人类患者获得。100μl的每个人患者的血清样品腹膜内注射到两个不同的小鼠中。72小时后，小鼠静脉注射PBS或重组GST-IdeZ(2.5mg/kg)。随后，在IdeZ处理72小时后小鼠静脉注射AAV9-Luc(2x1011vg/小鼠)。注射4周后分析肝脏和心脏转导水平。转导水平针对注射AAV9-Luc(2x1011vg/小鼠)而无血清处理的对照小鼠标准化。
具体实施方式
除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语的含义与本申请所述技术领域内普通技术人员通常理解的含义相同。本文详细说明中所用术语仅以描述特定实施方案为目的，并不旨在进行限制。
本文提及的全部出版物、专利申请、专利、GenBank或其他登录号和其他参考文献均以引用全文并入本文。
本公开和所附权利要求中AAV衣壳蛋白的全部氨基酸位置的命名是相对于VP1衣壳亚单位编号。本领域技术人员应当理解，本文所述的修饰(如果插入AAV帽基因中)可能导致VP1、VP2和/或VP3衣壳亚单位中的修饰。或者，衣壳亚单位可以独立表达以便只在所述衣壳亚单位的一个或两个(VP1、VP2、VP3、VP1+VP2、VP1+VP3或VP2+VP3)中实现修饰。
除非上下文另有说明，特别预期的是本文所描述的各种特征可以任何组合使用。
定义
本文说明书和所附权利要求中使用以下术语：
单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。
此外，当涉及可测量的值(例如，多核苷酸或多肽序列的长度、剂量、时间、温度等的量)，本文所用术语“约”是指包含指定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。
另外，如本文所用，“和/或”是指并包括一个或多个相关的列出事项的任何和所有可能的组合，以及当以择一方式(“或”)解释时组合的缺乏。
除非本文另有说明，本文中数值范围的列举仅旨在作为单独提及落入该范围的每个单独值的速记方法，并且每个单独值被并入说明书中，如同其在本文中单独陈述一样。例如，如果浓度范围被陈述为1％至50％，则意图的是本说明书中明确列举例如2％至40％、10％至30％或1％至3％等数的值。这些仅是具体意图的示例，且所列举的最低值和最高值之间且包含最低值和最高值的数值的所有可能的组合被视为在本公开中明确陈述。
如本文所用，术语“腺相关病毒”(AAV)包括但不限于：AAV1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A型和3B型)、AAV 4型、AAV5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV11型、AAV 12型、AAV 13型、AAV rh32.33型、AAV rh8型、AAV rh10型、AAV rh74型、AAVhu.68型、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、羊AAV、蛇AAV、松狮蜥AAV、AAV2i8、AAV2g9、AAV-LK03、AAV7m8、AAV Anc80、AAV PHP.B以及任何现在已知的或以后发现的其他AAV。参见，例如，BERNARD N.FIELDS等，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven出版社)。已确定多种AAV血清型和进化枝(参见，例如，Gao等，(2004)J.Virology 78:6381-6388；Moris等，(2004)Virology 33-:375-383；和表2)。在一些实施方案中，AAV载体选自WO2019/028306的表1所公开的任何AAV载体，该文献通过引用全文并入本文。
如本文所用，术语“嵌合AAV”指包含具有源自AAV的两种或更多种不同血清型的区域、结构域、单个氨基酸的衣壳蛋白的AAV。在一些实施方案中，嵌合AAV包含由源自第一AAV血清型的第一区域和源自第二AAV血清型的第二区域组成的衣壳蛋白。在一些实施方案中，嵌合AAV包含由源自第一AAV血清型的第一区域、源自第二AAV血清型的第二区域和源自第三AAV血清型的第三区域组成的衣壳蛋白。在一些实施方案中，嵌合AAV可包含源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和/或AAV12中的两种或更多种的区域、结构域、单个氨基酸。例如，嵌合AAV可包括来自如下所示(表1)的第一和第二AAV血清型的区域、结构域和/或单个氨基酸，其中AAVX+Y表示包括源自AAVX和AAVY的序列的嵌合AAV。
Figure BDA0003252555460000091
通过在一个衣壳蛋白中包含来自多种AAV血清型的单个氨基酸或区域，可以获取具有分别源自多种AAV血清型的多种所需特性的衣壳蛋白。
AAV的各种不同血清型和自主性细小病毒的基因组序列，以及天然末端重复序列(TRs)、Rep蛋白和衣壳亚单位的序列为本领域内已知的。这些序列可在文献或公共数据库(例如GenBank)中找到。参见，例如GenBank登录号NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852、AY530579；其公开内容通过引用并入本文以教导细小病毒和AAV核酸和氨基酸序列。还参见，例如Srivistava等，(1983)J.Virology，45:555；Chiorini等，(1998)J Virology，71:6823；Chiorini等，(1999)J.Virology，73:1309；Bantel-Schaal等，(1999)JVirology，73:939；Xiao等，(1999)J Virology，73:3994；Muramatsu等，(1996)Virology，221:208；Shade等，(1986)J.Virol.58:921；Gao等，(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；Moris等，(2004)Vitology，33:375-383；国际专利公开号WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244和美国专利号No.6,156,303；其公开内容通过引用并入本文以教导细小病毒和AAV核酸和氨基酸序列。还参见表2。BERNARD N.FIELDS等，VIROLOGY，第2卷，第69和70章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)中更详细地描述了自主性细小病毒和AAV的衣壳结构。还参见，AAV2(Xie等，(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.99:10405-10)、AAV9(DiMattia等，(2012)J.Virol.86:6947-6958)、AAV8(Nam等，(2007)J.Virol.81:12260-12271)、AAV6(Ng等，(2010)J.Virol.84:12945-12957)、AAV5(Govindasamy等，(2013)J.Virol.87,11187-11199)、AAV4(Govindasamy等，(2006)J.Virol.80:11556-11570)、AAV3B(Lerch等，(2010)Virology403:26-36)、BPV(Kailasan等，(2015)J.Virol.89:2603-2614)和CPV(Xie等，(1996)J.Mol.Biol.6:497-520和Tsao等，(1991)Science251:1456-64)的晶体结构的描述。
表2
Figure BDA0003252555460000111
Figure BDA0003252555460000121
本文所用术语“嗜性”指病毒优先进入某些细胞或组织，任选地随后在细胞中表达(例如转录和任选地翻译)病毒基因组携带的序列，例如对于重组病毒，目标异源核酸的表达。
本领域技术人员应当理解，来自病毒基因组的异源核酸序列的转录可能不在缺乏反式作用因子的情况下启动，例如，对于诱导型启动子或其他调节的核酸序列。在rAAV基因组的情况中，病毒基因组的基因表达可能来自稳定整合的前病毒、非整合的游离体以及病毒在细胞中可采取的任何其他形式。
如本文所用，“系统嗜性”和“系统性转导”(及等同术语)表示本公开的病毒衣壳或病毒载体分别表示出对全身的组织(例如，脑、肺、骨骼肌、心脏、肝脏、肾脏和/或胰腺)的嗜性或转导该组织。在实施方案中，观察到肌肉组织(例如骨骼肌、隔膜肌和心肌)的系统性转导。在其他实施方案中，实现骨骼肌组织的系统性转导。例如，在特定实施方案中，全身的基本上所有骨骼肌被转导(尽管转导效率可因肌肉类型而变化)。在特定实施方案中，实现四肢肌肉、心肌和隔膜肌的系统性转导。任选地，通过系统途径(如静脉内、关节内或淋巴内的系统途径)施用病毒衣壳或病毒载体。或者，在其他实施方案中，衣壳或病毒载体被局部递送(例如，递送至足垫、肌内、皮内、皮下、外用)。
除非另有说明，“高效转导”或“高效嗜性”或相似术语可通过参照适合的对照(例如，对照的分别至少约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％或以上的转导或嗜性)确定。在一些实施方案中，病毒载体高效转导骨骼肌、心肌、隔膜肌、胰腺(包括β-胰岛细胞)、脾脏、胃肠道(例如上皮和/或平滑肌)、中枢神经系统细胞、肺、关节细胞和/或肾脏，或对其具有高效嗜性。合适的对照取决于多种因素，包括所需嗜性分布。例如，AAV8和AAV9高效地转导骨骼肌、心肌和隔膜肌，但具有也高效转导肝脏的缺点。因此，可以确定表现出AAV8或AAV9对骨骼肌、心肌和/或隔膜肌的高效转导的病毒载体，但是对于肝脏的转导效率低得多。此外，因为目标的嗜性分布可以反映对于多个靶组织的嗜性，所以应当理解，合适的载体可代表一些折衷。举例来说，本公开的病毒载体在转导骨骼肌、心肌和/或隔膜肌的方面可能比AAV8或AAV9效率低，但由于肝脏的低水平转导，其仍然可以是非常理想的。
类似地，通过参考合适的对照，可以确定病毒是否“不高效转导”靶组织或对靶组织“不具有高效的嗜性”或相似的术语。在特定实施方案中，病毒载体不高效转导肝脏、肾脏、生殖腺和/或生殖细胞(即，不具有高效的嗜性)。在特定实施方案中，组织(例如，肝脏)的不希望的转导是所需靶组织(例如，骨骼肌、隔膜肌、心肌和/或中枢神经系统细胞)的转导水平的约20％或更低、约10％或更低、约5％或更低、约1％或更低、约0.1％或更低。
除非另有说明，本文所用术语“多肽”包括肽和蛋白质。
“多核苷酸”是核苷酸碱基的序列，且可以是RNA、DNA或DNA-RNA杂交序列(包括天然存在和非天然存在的核苷酸)，但在代表性实施方案中，是单链或双链DNA序列。
如本文所用，“分离的”多核苷酸(例如，“分离的DNA”或“分离的RNA”)是指从天然存在的有机体或病毒的至少一些其他组分(例如细胞或病毒结构组分或与该多核苷酸相关的常见的其他多核苷酸或核酸)至少部分地分离的多核苷酸。在代表性实施方案中，“分离的”核苷酸相比于原始材料，富集了至少约10倍、约100倍、约1000倍、约10,000倍或更多。
同样地，“分离的”多肽是指从天然存在的有机体或病毒的至少一些其他组分(例如细胞或病毒结构组分或与该多肽相关的常见的其他多核苷酸或核酸)至少部分地分离的多肽。在代表性实施方案中，“分离的”多肽相比于原始材料富集至少约10倍、约100倍、约1000倍、约10,000倍或更多。
如本文所用，“分离”或“纯化”(或语法等效语)多肽或病毒载体，意味着多肽或病毒载体至少部分地与原始材料中的至少一些其他组分分离。在代表性实施方案中，“分离的”或“纯化的”多肽或病毒载体相比于原始材料富集至少约10倍、约100倍、约1000倍、约10,000倍或更多。
本文公开的组合物和方法可用于兽医和医学应用。合适的受试者包括禽类和哺乳动物。本文所用术语“禽类”包括但不限于鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡、野鸡、鹦鹉、长尾小鹦鹉等。本文所用术语“哺乳动物”包括但不限于人类、非人类灵长动物、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬、兔等。人类受试者包括新生儿、婴儿、青少年、成人和老年人受试者。在一些实施方案中，人类受试者可以不满6个月、不满2岁、不满5岁、不满10岁、10-18岁、19-29岁、30-35岁、36-40岁或大于40岁。在代表性实施方案中，受试者“需要”本文所述的方法。术语“受试者”和“患者”在本文中可互相地用于指人类受试者。
“治疗性多肽”是可缓和、降低、预防、迟缓和/或稳定细胞或受试者中的蛋白质缺乏或缺陷导致的症状的多肽，和/或是以其他方式赋予受试者益处(例如抗癌效果或改善移植存活力)的多肽。
术语“治疗(treat)”、“处理(treating)”或“疗法(treatment of)”(及其语法变体)意指受试者的病情严重程度降低、至少部分改善或稳定和/或指至少一项临床症状得到一定程度缓和、减轻、降低或稳定和/或疾病或紊乱的发展得到延迟。
术语“预防(prevent)”、“防止(preventing)”和“阻止(prevention)”(及其语法变体)是指预防和/或延迟受试者的疾病、紊乱和/或临床症状的发作，和/或相对于在缺乏本公开的方法时发生的情况减轻疾病、紊乱和/或临床症状发作的严重程度。预防可以是完全的，例如完全不存在疾病、紊乱和/或临床症状。预防也可以是部分的，使得受试者的疾病、紊乱和/或临床症状的发生和/或发作的严重程度低于缺乏本公开时的发生和/或发作的情况。
“有效量”是指为治疗疾病、紊乱或病症向受试者施用时足以影响或缓和疾病、紊乱或病症的一种或多种症状的量。“有效量”可根据例如疾病、紊乱或病症和/或其症状；疾病、紊乱、病症和/或其症状的严重程度；受试者的年龄、体重和/或健康以及处方医师的判断而变化。在任何给定情况下的适当量可由本领域技术人员确定或能够通过常规实验确定。在一些实施方案中，有效量是治疗有效量。
如本文所用，术语“病毒载体”或“基因递送载体”指可以用作核酸递送媒介的病毒(例如AAV)颗粒，且其包括包装在病毒颗粒内的载体基因组(例如病毒DNA[vDNA])。或者，在某些情况中，术语“病毒载体”可被用于指单独的病毒载体基因组/vDNA。
“rAAV载体基因组”或“rAAV基因组”是包含一个或多个异源核酸序列的AAV基因组(即vDNA)。rAAV载体通常仅需要顺式的末端重复序列(TR(s))来产生病毒。所有其他病毒序列是非必需的且可以反式提供。典型地，rAAV载体基因组将仅保留一个或多个TR序列，以便最大化可被载体有效包装的转基因的尺寸。结构和非结构蛋白编码序列可以反式提供(例如，从载体(如质粒)或通过将序列稳定整合到包装细胞中)。在实施方案中，rAAV载体基因组包含至少一个TR序列(例如，AAV TR序列)，任选地包含两个TRs(例如，两个AAV TRs)，所述TR序列典型地位于载体基因组的5’和3’末端，并且位于异源核酸的侧翼，但无需与其连续。所述TRs可以是相同的或彼此不同的。
术语“末端重复序列”或“TR”包括任何病毒末端重复序列或形成发夹结构且可起反向末端重复序列作用(即介导所需功能，例如复制、病毒包装、整合和/或前病毒挽救(provirus rescue)等)的合成序列。TR可以是AAV TR或非AAV TR。例如，非AAV TR序列，如其他细小病毒(例如犬细小病毒(CPV)、小鼠细小病毒(MVM)、人细小病毒B-19)的那些或任何其他合适的病毒序列(例如，用作SV40复制起点的SV40发夹)可以用作TR，其可通过截短、置换、删除、插入和/或添加进一步修饰。此外，TR可以是部分或完全合成的。
“AAV末端重复序列”或“AAV TR”可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或现在已知的或以后发现的任何其他AAV(参见，例如表2)。AAV末端重复序列不需要具有天然末端重复序列(例如，天然AAV TR序列可以通过插入、删除、截短和/或错义突变而改变)，只要该末端重复序列介导所需功能，例如复制、病毒包装、整合和/或前病毒挽救等。
本公开的病毒载体还可以是“靶向的”病毒载体(例如，具有定向的嗜性)和/或“杂合”细小病毒(即，其中病毒TRs和病毒衣壳来自于不同的细小病毒)。本公开的病毒载体还可以是双套(duplexed)细小病毒颗粒。因此，在一些实施方案中，双链的(双链体)基因组可被包装到本公开的病毒衣壳中。此外，病毒衣壳或基因组元件可包含其他修饰，包括插入、删除和/或置换。
如本文所用，术语“氨基酸”包括任何天然存在的氨基酸、其修饰形式和合成氨基酸。
表3显示了天然存在的左旋(L-)氨基酸。
表3：氨基酸残基和缩写
Figure BDA0003252555460000171
Figure BDA0003252555460000181
或者，氨基酸可以是经修饰的氨基酸残基(表4显示非限制性实例)和/或可以是通过翻译后修饰(例如乙酰化、酰胺化、甲酰化、羟基化、甲基化、磷酸化或硫酸化)进行修饰的氨基酸。
表4：修饰的氨基酸残基
Figure BDA0003252555460000182
Figure BDA0003252555460000191
Figure BDA0003252555460000201
此外，非天然存在的氨基酸可以是“非天然的”氨基酸(如Wang等，Annu RevBiophys Biomol Struct.35:225-49(2006)所述)。这些非天然氨基酸可有利地被用于将目标分子与AAV衣壳蛋白化学连接。
本文所用术语“结构域”旨在包含蛋白质序列和结构的一部分，其可独立于蛋白质链的其余部分进化、发挥作用和存在。结构域能够形成紧密的三维结构，并且通常可独立稳定和折叠。一个结构域可出现在多种进化相关的蛋白质中。结构域的长度在约25个氨基酸至约500个氨基酸的长度间变化。“结构域”还可包括来自野生型蛋白质的结构域，其具有一个或多个被保守置换替代的氨基酸残基。因为它们在蛋白质环境中是自稳定的，结构域可以通过基因工程在一种蛋白质和另一种蛋白质之间“交换”以形成嵌合蛋白质本文所用术语“突变体(mutant)”、“突变型(mutants)”、“变体(variant)”或“变型(variants)”意图指天然蛋白质或AAV，其中亲本蛋白质或AAV的一个或多个氨基酸被另一氨基酸置换，和/或其中亲本AAV蛋白质的一个或多个氨基酸被删除，和/或其中一个或多个氨基酸被插入蛋白质或AAV中和/或其中一个或多个氨基酸被添加到亲本蛋白质或AAV。这样的添加可发生在亲本蛋白质的N-端末端或C-端末端或二者处以及内部。在一些实施方案中，变体的氨基酸序列与天然蛋白质的氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％或至少70％同一性。
本文所用术语“载体”是指能够在宿主细胞中扩增的任何核酸实体。因此，载体可以是自主复制载体，即载体(其作为染色体外实体存在)，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，载体可以是，当被引入宿主细胞中时，被整合到宿主细胞基因组中并与其被整合到其中的染色体一起复制。载体的选择通常取决于其被引入的宿主细胞。载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒或粘粒载体。载体通常包含复制起点和至少一个选择基因，即编码易于检测的产物或其存在对细胞生长必要的基因。
术语“基因治疗”是指通过基因的外源性施用改变内源基因表达的方法。如本文所用，“基因治疗”还指通过将对应于缺陷或缺失基因的功能性基因引入有需要的个体的体细胞或干细胞中替换编码缺陷蛋白质的缺陷基因或替换缺失基因。基因治疗可以通过离体方法完成，其中从个体的体内移除分化的或体干细胞，随后使用病毒载体作为基因递送媒介将缺陷基因的正常拷贝引入外植细胞中。此外，体内直接基因转移技术允许使用广泛的病毒载体、脂质体、蛋白质DNA复合体或裸DNA将基因原位转移至个体的细胞中以实现治疗效果。术语“基因治疗”还指通过将功能与缺陷基因或蛋白不存在缺陷时的功能基本上一样的多核苷酸引入需要的个体的体细胞或干细胞中替换编码缺陷蛋白质的缺陷基因。
术语“基因编辑”是指在有机体或细胞的基因组中特定位点的DNA的插入、删除或替换。基因编辑可使用一种或多种靶向核酸酶系统进行，例如CRISPR/Cas系统、CRISPR/Cpf1系统、Zn指核酸酶、TALEN、归巢核酸内切酶等。
如本文所用，术语“Fc受体”是指存在于细胞上的Fcγ免疫球蛋白受体(FcγRs)。在人类中，FcγR指包含FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)的受体家族中的一个、一些或全部。如本文所用，术语FcγR包括FcγRI(CD64)、FcγyRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)的天然存在的多态性。
如本文所述，半胱氨酸蛋白酶是降解蛋白质的酶。半胱氨酸蛋白酶通常具有共同的催化机制，其涉及催化三联体或二联体中的亲核半胱氨酸硫醇。在一些实施方案中，半胱氨酸蛋白酶是切割IgG以使抗原结合域(Fab)和恒定域(Fc)相互分离的IgG半胱氨酸蛋白酶。
用于减少针对生物制品的中和抗体的组合物
本公开提供了可在受试者体内减少针对重组生物制品或药物实体的中和抗体的组合物。在一些实施方案中，重组生物制品包含载体，所述载体包含编码一种或多种重组蛋白质的异源核酸。在一些实施方案中，所述载体为重组病毒载体，例如重组AAV载体。
在一些实施方案中，所述组合物通过促进针对重组生物制品或药物实体的抗体的清除或降解；和/或通过减少针对重组生物制品或药物实体的抗体与Fc受体的结合减少受试者体内针对重组生物制品或药物实体的中和抗体。在一些实施方案中，所述组合物通过促进针对AAV载体或者由异源核酸编码的一种或多种重组蛋白质的抗体的清除或降解；和/或通过减少针对AAV载体的抗体与Fc受体的结合，减少受试者体内针对含有异源核酸的AAV载体的中和抗体。
在一些实施方案中，组合物包含抗体降解酶或其片段，其可降解识别腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白或病毒粒的抗体；或阻止重组AAV载体的中和。在一些实施方案中，组合物包含载体，所述载体包含编码抗体降解酶或其片段的多核苷酸。在一些实施方案中，抗体包括IgG(包括IgG1、IgG2a、IgG2b和/或IgG3)、IgM、IgE和/或IgA。在示例性实施方案中，抗体包括IgGs。因此，在一些实施方案中，组合物包含IgG-降解酶或其片段。在一些实施方案中，IgG-降解酶或其片段具有半胱氨酸蛋白酶活性。
在一些实施方案中，IgG-降解酶或其片段从细菌(例如来自链球菌属的细菌)分离或来源于该细菌。在一些实施方案中，IgG-降解酶包含与如下SEQ ID NO:1中所示马链球菌(S.equi)的以下氨基酸序列具有至少约50％(例如，约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或100％，包括位于其间的所有值和子范围)同一性的氨基酸序列：
MKTIAYPNKPHSLSAGLLTAIAIFSLASSNITYADDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWSKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS。
SEQ ID NO:1的序列对应于IdeZ蛋白。图5示出IdeZ蛋白的示例性晶体结构，其中每个图面显示不同的视图。
本文公开的IdeZ蛋白是A群链球菌中鉴定的半胱氨酸蛋白酶，其通过在重链的下铰链区处切割IgG从而产生一个F(ab’)2和一个同型二聚体Fc片段来灭活IgG抗体。这种IgG-降解酶具有短的半衰期，并且大部分随着高效但瞬时的IgG去除而从循环中快速清除。
在一些实施方案中，IgG-降解酶或其片段从酿脓链球菌分离或源自该细菌。在一些实施方案中，IgG-降解酶包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有至少约50％(例如，约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或100％，包括位于其间的所有值和子范围)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，IgG-降解酶或其片段是合成酶。在一些实施方案中，IgG-降解酶包含与SEQ ID NO:15-52中任一个具有至少约50％(例如，约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或100％，包括位于其间的所有值和子范围)同一性的序列。
本文所述用于减少中和抗体的组合物可包含融合蛋白，所述融合蛋白包含抗体降解酶或其片段；和第二蛋白。在一些实施方案中，第二蛋白是IgG蛋白酶。
在一些实施方案中，用于减少中和抗体的组合物减少针对AAV载体的抗体与Fc受体的结合。在一些实施方案中，组合物通过与针对AAV载体的抗体的Fc受体结合促进抗体的快速清除。例如，所述组合物可以通过结合IgG的受体(例如，FcRN)促进针对AAV载体的IgGs的快速清除，从而也促进IgG受体的内化和降解。在一些实施方案中，组合物包含治疗性抗体。在一些实施方案中，治疗性抗体为IgG。在一些实施方案中，治疗性抗体为洛利昔珠单抗(rozanolixizumab)。在一些实施方案中，治疗性抗体的剂量为0.05mg/kg至约150mg/kg，例如约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约110mg/kg、约120mg/kg、约130mg/kg、约140mg/kg或约150mg/kg，包括位于其间的所有值和子范围。
在一些实施方案中，用于减少中和抗体的组合物降低和/或抑制补体激活。例如，所述组合物可切割中和抗体，从而阻止C1q与抗原-抗体复合物(例如，AAV-抗体复合物)结合。通过降低和/或抑制补体激活，可防止补体级联中的下游过程，例如，炎性细胞募集和(例如，AAV的)调理素作用。在一些实施方案中，在使用AAV治疗前使用用于减少中和抗体的组合物治疗受试者防止施用AAV后患者体内的补体激活，并且在一些实施方案中，施用AAV时补体激活被降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，患者与AAV治疗同时接受用于减少中和抗体的组合物治疗可防止患者体内由于AAV治疗的补体激活，并且在一些实施方案中，补体激活被降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，在AAV治疗后使用用于减少中和抗体的组合物之一治疗患者降低患者体内的补体激活，并且在一些实施方案中，补体激活被降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
在一些实施方案中，本文公开的组合物还包含至少一种药学上可接受的载体、赋形剂和/或媒介，例如，溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。在一些实施方案中，药学上可接受的载体、赋形剂和/或媒介可包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、无菌等渗水性缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、氨基酸其缓冲液、碳酸氢盐缓冲溶液及其组合。在一些实施方案中，药学可接受的载体、赋形剂和/或媒介包括磷酸盐缓冲盐水、无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油、医用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)或其合适的混合物。在一些实施方案中，本文公开的组合物还包含少量的乳化或湿润剂或pH缓冲剂。本文公开的组合物的制剂可通过与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合以例如冻干粉、浆液、水性溶液或混悬剂形式制备用于储存(参见，例如，Hardman等，(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,N.Y.；Avis等(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications，Marcel Dekker,NY；Lieberman等(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker,NY；Lieberman等(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems，Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker,Inc.,NewYork,N.Y.)。
在一些实施方案中，本文公开的组合物还包含其他常见药物成分，例如防腐剂，或化学稳定剂，例如氯代丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚、对氯苯酚或白蛋白。在一些实施方案中，本文公开的组合物还可包含抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸或硫柳汞；等渗剂，例如糖或氯化钠，和/或吸收延迟剂，例如单硬脂酸铝和明胶。
在一些实施方案中，本公开的组合物以中性或盐的形式配制。药学上可接受的盐包括，例如，由无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)衍生的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。在一些实施方案中，与蛋白质的游离羧基形成的盐可衍生自无机碱(例如钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物)或衍生自有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因)等。
在一些实施方案中，组合物为固体形式如适合于重构的冻干粉、液体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末。在一些实施方案中，组合物可使用脂质体(liposomes)、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡、脂质体(liposome)、纳米球、纳米颗粒等配制以用于递送。
用于减少中和抗体的组合物的剂量和施用方式
本文公开的任何一种用于减少针对生物制品的中和抗体的组合物的施用可通过注射、输注或其组合进行。包含本文公开的任何一种组合物的药物组合物可以约0.05mg/kg至约150mg/kg的剂量施用，例如约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约110mg/kg、约120mg/kg、约130mg/kg、约140mg/kg或约150mg/kg，包括位于其间的所有值和子范围。
本文公开的任何一种组合物的治疗有效量可以在一个剂量中提供，但不限于一个剂量。因此，所述施用可以是1至50个剂量，例如2个剂量、5个剂量、10个剂量、15个剂量、20个剂量、25个剂量、30个剂量、35个剂量、40个剂量、45个剂量或50个剂量，包括位于其间的所有值和子范围。在本方法中存在一次以上施用的情况下，施用的时间间隔可以为约1分钟至约1个月，例如约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约20分钟、约40分钟、约1小时、约2小时、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约24小时、约2天、约5天、约10天、约15天、约20天，包括位于其间的所有子范围和值。本发明不限于时间上相等间隔的给药间隔，而是包括间隔不等的给药，例如由1天、4天、7天和25天的施用组成的启动时间表，仅作为非限制性实例提供。
给药方案(例如一次/周、两次/周、三次/周、四次/周、五次/周、六次/周、七次/周、一次/两周、一次/三周、一次/四周、一次/五周等)可用于本发明。给药方案包括约一日至约一年的总时间段的给药，例如一周、两周、三周、四周、五周、六周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月和十二个月，包括位于其间的所有值和子范围。
提供了上述给药方案的周期的实例。该周期可以例如约每7天；每14天；每21天；每28天；每35天；42天；每49天；每56天；每63天；每70天等重复。一个周期之间可以出现不给药的间隔，其中该间隔可以为约例如7天；14天；21天；28天；35天；42天；49天；56天；63天；70天等。
本文公开的组合物可与一种或多种附加治疗剂一起施用。与附加治疗剂共同施用的方法在本技术领域内是公知的(Hardman等(eds.)(2001)Goodman and Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill,纽约，N.Y.；Poole和Peterson(eds.)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A PracticeApproach，Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner和Longo(eds.)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy，Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.)。
本文中待治疗的受试者包括哺乳动物，例如人类和非人类灵长动物。在一些实施方案中，受试者可选自人类、非人类灵长动物、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬和兔。
减少针对生物制品的中和抗体的方法
本文提供了减少受试者体内针对重组生物制品或药物实体的中和抗体的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的重组生物制品或药物实体和本文公开的任何一种组合物，所述组合物(a)促进针对重组生物制品或药物实体的抗体的降解；和/或(b)减少所述抗体与Fc受体的结合。
在一些实施方案中，在受试者体内减少针对重组腺相关病毒(AAV)载体的中和抗体的量的方法包括向受试者施用治疗有效量的促进中和抗体降解的组合物。
在一些实施方案中，使受试者准备用重组腺相关病毒(AAV)载体治疗的方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物(a)促进针对所述AAV载体的中和抗体的降解，和/或(b)减少所述中和抗体与Fc受体的结合。
在一些实施方案中，使用重组腺相关病毒(AAV)治疗有此需要的受试者的方法包括：(i)向所述受试者施用治疗有销量的组合物，所述组合物(a)促进针对所述AAV载体的中和抗体的降解，和/或(b)减少所述中和抗体与Fc受体的结合；和(ii)向所述受试者施用治疗有效量的所述AAV载体。
在一些实施方案中，使用第二重组腺相关病毒(AAV)载体治疗受试者的方法，其中所述受试者之前接受第一重组AAV治疗，该方法包括：(i)向所述受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物(a)促进针对所述第一和/或第二重组AAV载体的中和抗体的降解，和/或(b)减少所述中和抗体与Fc受体的结合；以及(ii)向所述受试者施用治疗有效量的所述第二重组AAV载体。
在一些实施方案中，减少受试者体内针对含有异源核酸的腺相关病毒(AAV)载体的中和抗体的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述AAV载体和组合物，所述组合物(a)促进针对所述AAV载体或由所述异源核酸编码的重组蛋白的抗体的降解；和/或(b)减少所述抗体与Fc受体的结合。
在一些实施方案中，减少受试者体内针对本文公开的任何一种腺相关病毒(AAV)载体的中和抗体的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述AAV载体和本文公开的任何一种组合物，所述组合物(a)促进针对所述AAV载体或由异源核酸编码的重组蛋白质的抗体的降解；和/或(b)减少所述抗体与Fc受体的结合。
(a)促进针对第一和/或第二重组AAV载体的中和抗体的降解，和/或(b)减少所述中和抗体与Fc受体的结合的组合物包含抗体降解酶或其片段。在一些实施方案中，组合物包含载体，所述载体包含编码抗体降解酶或其片段的多核苷酸。在一些实施方案中，抗体降解酶或其片段可具有半胱氨酸蛋白酶活性。在一些实施方案中，抗体降解酶特异性地切割IgG。在一些实施方案中，抗体降解酶或其片段源自链球菌属。在一些实施方案中，抗体降解酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体降解酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一些实施方案中，组合物可包含融合蛋白，所述融合蛋白包含第一蛋白和第二蛋白，其中所述第一蛋白为抗体降解酶或其片段。在一些实施方案中，所述第一蛋白和所述第二蛋白通过接头分隔。在一些实施方案中，所述第二蛋白为IgG蛋白酶。
所述组合物可通过系统性途径(例如，静脉内、关节内或淋巴管内)施用。在一些实施方案中，组合物被局部递送(例如，肌内、皮内、皮下、外用)。在一些实施方案中，所述组合物被直接施用于已知含有中和抗体的部位，例如脑脊髓液(CSF)。组合物可包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。
在一些实施方案中，向受试者施用约0.1mg/kg至约100mg/kg的抗体降解酶或其片段。在一些实施方案中，向受试者施用约0.1mg/kg至约100mg/kg的融合蛋白。在一些实施方案中，向受试者施用约0.05mg/kg至约150mg/kg的抗体降解酶或其片段或融合蛋白，例如约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约110mg/kg、约120mg/kg、约130mg/kg、约140mg/kg或约150mg/kg，包括位于其间的所有值和子范围。
在一些实施方案中，待减少和/或降解的中和抗体包括IgG、IgM、IgE和/或IgA。在一些实施方案中，所述中和抗体包括IgG。在一些实施方案中，所述抗体是针对含转基因的AAV载体的中和抗体。在一些实施方案中，所述抗体结合由转基因编码的重组蛋白。在一些实施方案中，所述抗体结合腺相关病毒衣壳或其病毒粒。
在一些实施方案中，重组AAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽类AAV或牛AAV载体。在一些实施方案中，重组AAV载体包含具有SEQ ID NO:2-12中任一个的序列，或具有与其序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述AAV载体为野生型AAV载体。在一些实施方案中，所述AAV载体为突变型AAV载体。在一些实施方案中，所述AAV载体为野生型AAV1载体。在一些实施方案中，所述AAV载体为野生型AAV2载体。在一些实施方案中，所述AAV载体为野生型AAV4载体。在一些实施方案中，所述AAV载体为野生型AAV8载体。在一些实施方案中，所述AAV载体为野生型AAV9载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是突变型AAV1载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是突变型AAV2载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是突变型AAV4载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是突变型AAV8载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是突变型AAV9载体。在一些实施方案中，重组AAV载体包含编码治疗性蛋白质或治疗性RNA的异源核酸。
在一些实施方案中，本文所述方法包括降低抗体与其在细胞表面上的同源受体的相互作用。这些方法可扩展有资格接受基因治疗的患者群组，且也使预先接受AAV载体治疗的患者能够进行AAV再给药/再施用。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述受试者与组合物同时施用AAV载体。在一些实施方案中，所述受试者在施用所述组合物后施用AAV载体。在一些实施方案中，所述受试者在施用所述组合物之前施用AAV载体。在一些实施方案中，所述方法还包括施用一种或多种附加的或二次剂量的含有第二异源核酸的第二AAV载体。在一些实施方案中，第一AAV载体和第二AAV载体包含相同的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，第一AAV载体和第二AAV载体包含不同的AAV衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述方法促进针对AAV载体的抗体的降解。在一些实施方案中，抗体水平被降低至对照受试者中抗体水平的约95％至约0.01％范围内的水平(例如，约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、约0.1％或约0.01％，包括位于其间的所有值和子范围)。如本文所用，对照受试者是施用重组生物制品(例如AAV载体)但未施用本文公开的任何一种组合物的受试者。在一些实施方案中，所述方法导致施用所述组合物后至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的抗体被降解。
在一些实施方案中，受试者之前施用重组蛋白质。因此，在一些实施方案中，本文公开的任何一种组合物的施用降低受试者体内针对先前重组蛋白给药产生的抗体的循环水平。
重要的是，根据本公开的组合物和方法可与其他可减少抗体的药理学或介入方法联合使用。
重组病毒载体
在一些实施方案中，本文公开的载体可用于在体外、离体和体内递送异源核酸至细胞。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如AAV载体。特别地，病毒载体可有利地用于将核酸递送或转移至动物细胞，例如哺乳动物细胞。在一些实施方案中，病毒载体包含包裹异源核酸的重组病毒衣壳，例如AAV衣壳。在一些实施方案中，重组病毒衣壳包含重组衣壳蛋白，例如重组AAV衣壳蛋白。国际申请PCT/US2019/025617、PCT/US2019/025584和PCT/US2019/025610提供了关于可以根据本公开使用的病毒载体、病毒衣壳和/或衣壳蛋白的进一步细节，其中每项申请的内容均为所有目的通过引用方式全文并入本文。
在一些实施方案中，AAV载体包括选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.32.33、AAVrh74、牛AAV、禽类AAV或任何现在已知的或以后发现的其他AAV的衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白是嵌合的。
在一些实施方案中，衣壳蛋白是包含氨基酸序列中的修饰(例如，置换)的AAV衣壳蛋白(VP1、VP2和/或VP3)，以及包含修饰的AAV衣壳蛋白的病毒衣壳和病毒载体。在一些实施方案中，本文所述修饰可赋予包含修饰的AAV衣壳蛋白的病毒载体一种或多种所需特性，包括但不限于逃避中和抗体的能力。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸置换，其中所述一个或多个置换改变AAV衣壳蛋白上的一个或多个抗原性位点。一个或多个抗原性位点的修饰导致抑制抗体与所述一个或多个抗原性位点的结合和/或抑制包含所述AAV衣壳蛋白的病毒颗粒的传染性的中和。在一些实施方案中，一个或多个抗原性位点的修饰导致抑制抗体与所述一个或多个抗原性位点的结合。在一些实施方案中，修饰的抗原位点可防止抗体结合或识别或中和AAV衣壳，其中所述抗体为IgG(包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)、IgM、IgE或IgA。在一些实施方案中，一个或多个抗原性位点的修饰导致包含所述AAV衣壳蛋白的病毒颗粒的传染性的中和。
一个或多个氨基酸置换可以在由包含AAV衣壳蛋白的AAV-抗体复合物的肽表位作图和/或冷冻电子显微镜研究确定的一个或多个抗原足迹中。在一些实施方案中，一个或多个抗原性位点为WO2017/058892中所述的共同抗原基序或CAMs，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，抗原性位点位于AAV衣壳蛋白(例如，VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-VIII、VR-IX)的可变区(VR)。在一些实施方案中，一个或多个抗原性位点位于AAV衣壳蛋白的HI环中。
在一些实施方案中，氨基酸置换取代了以下任何一种血清型的AAV衣壳蛋白中的任何六个、七个或八个氨基酸：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh32.22、牛AAV或禽类AAV。在一些实施方案中，置换将删除引入AAV衣壳序列中。例如，例如，6、7、8或9个氨基酸的序列被置换以分别取代天然氨基酸衣壳序列的7、8、9或10个氨基酸。在一些实施方案中，置换将插入引入AAV衣壳序列中。例如，6、7、8或9个氨基酸的序列被置换以分别取代天然氨基酸衣壳序列的5、6、7或8个氨基酸。
在一些实施方案中，一个或多个抗原性位点的一个或多个置换可以将来自第一AAV血清型的衣壳蛋白的一个或多个抗原性位点引入与所述第一AAV血清型不同的第二AAV血清型的衣壳蛋白中。
如本文所用，“置换”可指单氨基酸置换，或超过一个氨基酸的置换。例如在一些实施方案中，本公开的衣壳蛋白可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等的单氨基酸置换。在一些实施方案中，本公开的衣壳蛋白可包含多个连续氨基酸的一个或多个置换，例如一个或多个2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续氨基酸的置换。
此外，在其中氨基酸残基被野生型或天然氨基酸序列中存在的氨基酸残基之外的任何氨基酸残基置换的本文所述实施方案中，所述的任何其他氨基酸残基可以是本领域内已知的任何天然或非天然氨基酸残基(例如，参见表3和表4)。在一些实施方案中，置换可以是保守的置换，并且在一些实施方案中，置换可以是非保守的置换。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含第一氨基酸置换和第二氨基酸置换，其中所述第一氨基酸置换和所述第二氨基酸置换各自修饰AAV衣壳蛋白上的不同抗原性位点。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含第一氨基酸置换、第二氨基酸置换和第三氨基酸置换，其中所述第一氨基酸置换、所述第二氨基酸置换和所述第三氨基酸置换各自修饰所述AAV衣壳蛋白上的不同抗原性位点。
本文所述的任何一种AAV衣壳还可以包含HI环中的修饰(例如，置换或删除)。HI环是AAV衣壳表面上的突出结构域，位于β链的βH和βI之间，其从与相邻的五倍VP重叠的每个病毒蛋白(VP)亚单元延伸。在一些实施方案中，AAV衣壳包含HI环中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸置换。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含一个、两个、三个或四个氨基酸置换，其中每个置换修饰AAV衣壳蛋白上的不同抗原性位点，并且其中至少一个氨基酸置换修饰衣壳蛋白的HI环。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含第一、第二、第三和第四氨基酸置换。
在一些实施方案中，本文公开的AAV衣壳蛋白由核酸序列或包含该核酸序列的表达载体编码并表达。所述核酸序列可以是DNA序列或RNA序列。
在一些实施方案中，修饰的衣壳蛋白通过修饰现在已知或以后发现的任何AAV的衣壳蛋白而产生。此外，待修饰的AAV衣壳蛋白可以是天然存在的AAV衣壳蛋白(例如AAV2、AAV3a或3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11衣壳蛋白或表2中所示的任何AAV)，但不限于此。本领域技术人员将理解，对AAV衣壳蛋白的多种操作在本领域内是已知的，而且本公开不限于对天然存在的AAV衣壳蛋白的修饰。例如，待修饰的衣壳蛋白相比于天然存在的AAV可能已经发生改变(源自天然存在的AAV衣壳蛋白，例如AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或现在已知或以后发现的任何其他AAV)。在一些实施方案中，衣壳蛋白可以是嵌合的衣壳蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白可以是工程化的AAV，例如AAV2i8、AAV2g9、AAV-LK03、AAV7m8、AAV Anc80、AAV PHP.B。这类AAV衣壳蛋白也在本公开的范围内。
因此，在一些实施方案中，待修饰的AAV衣壳蛋白可来源于天然存在的AAV，但还包含一个或多个外来序列(例如，对天然病毒是外源的)，其被插入和/或置换入衣壳蛋白中和/或已经通过删除一个或多个氨基酸而改变。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白的修饰是“选择性”修饰，这种途径与之前AAV血清型之间的全亚基或大结构域交换的工作(例如，参见国际专利公开WO 00/28004和Hauck等，(2003)J.Virology 77:2768-2774)相反。在特定实施方案中，“选择性”修饰导致少于或等于约20个、约18个、约15个、约12个、约10个、约9个、约8个、约7个、约6个、约5个、约4个或约3个连续氨基酸的插入和/或置换和/或删除。本公开的修饰衣壳蛋白和衣壳还可包含现在已知的或以后发现的任何其他修饰。
因此，当本文提及特定AAV衣壳蛋白(例如，AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11衣壳蛋白或来自表2所示的任何AAV的衣壳蛋白等)时，意图包括天然衣壳蛋白以及具有本公开的修饰以外的改变的衣壳蛋白。这类改变包括置换、插入和/或删除。在特定实施方案中，相比于天然AAV衣壳蛋白序列，衣壳蛋白包含插入其中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个、少于20个、少于30个、少于40个、少于50个、少于60个或少于70个氨基酸(本公开的插入以外的)。在实施方案中，相比于天然AAV衣壳蛋白序列，衣壳蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个、少于20个、少于30个、少于40个、少于50个、少于60个或少于70个氨基酸置换(根据本公开的氨基酸置换以外的)，在本公开的实施方案中，相比于天然AAV衣壳蛋白序列，衣壳蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个、少于20个、少于30个、少于40个、少于50个、少于60个或少于70个氨基酸的删除(本文公开的氨基酸删除以外的)。
确定两个或更多个氨基酸序列间的序列相似性或同一性的方法在本技术领域内是已知的。序列相似性或同一性可以使用本技术领域内已知的标准技术确定，其包括但不限于局部序列同一性算法(Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2,482(1981))、序列同一性比对算法(Needleman&Wunsch,J Mol.Biol.48,443(1970))、相似性检索方法(Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,2444(1988))、通过这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传计算机组，575Science Drive,Madison,WI)、最佳匹配序列程序(如Devereux等，Nucl.Acid Res.12所述)，或通过检查。
另一合适的算法为BLAST算法，如Altschul等，J Mol.Biol.215,403-410,(1990)和Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5873-5787(1993)所述。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，该程序获自Altschul等，Methods in Enzymology，266,460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html。WU-BLAST-2使用多个搜索参数，这些参数任选地设置为默认值。所述参数为动态值，且根据特定序列的组成和目的序列正针对其搜索的特定数据库的组成由程序自身建立；但是，该值可调整以提高灵敏度。
此外，另一种有用的算法为如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402报道的gapped BLAST。
在一些实施方案中，AAV载体包含AAV衣壳和AAV基因组，并且具有逃避中和抗体的表型。此外，除逃避中和抗体的表型之外，本文公开的AAV病毒颗粒或载体还可具有增强或维持转导效率的表型。
根据本公开的病毒载体可使用本技术领域已知的任何方法产生，例如通过使用杆状病毒系统表达。
在本公开的一些实施方案中，病毒衣壳可以是靶向的病毒衣壳，其包含指导病毒衣壳与所需靶组织上存在的细胞表面分子相互作用的靶向序列(例如，置换或插入病毒衣壳中)。例如，本公开的病毒衣壳可能对某些目的靶组织(例如，肝脏、骨骼肌、心脏、隔膜肌、肾脏、脑、胃、肠、皮肤、内皮细胞和/或肺)具有相对无效的嗜性。靶向序列可以被有利地并入到这些低转导载体中，从而赋予病毒衣壳所需的嗜性，并任选地赋予对特定组织的选择性嗜性。例如，国际专利公开WO 00/28004中描述了包含靶向序列的AAV衣壳蛋白、衣壳和载体。作为另一个实例，一个或多个非天然存在的氨基酸(如Wang等，Annu Rev BiophysBiomol Struct.35:225-49(2006)所述)可在正交位点处被并入本文公开的AAV衣壳亚单位中作为将低转导载体重新定向至所需靶组织的手段。这些非天然氨基酸可有利地用于将目标分子化学连接至AAV衣壳蛋白，包括但不限于：聚糖(甘露糖-树突细胞靶向)；RGD，用于靶向递送至特定癌细胞类型的铃蟾肽或神经肽；能够靶向特定细胞表面受体(例如生长因子受体、整合素等)的选自噬菌体展示的RNA适体或肽。化学修饰氨基酸的方法在本技术领域内是已知的。
在本公开的一些实施方案中，相对于本公开的衣壳蛋白、病毒衣壳或载体所来源的AAV血清型的转导效率，本公开的衣壳蛋白、病毒衣壳或载体可具有等同或增强的转导效率。在本公开的一些实施方案中，相对于本公开的衣壳蛋白、病毒衣壳或载体所来源的AAV血清型的转导效率，本公开的衣壳蛋白、病毒衣壳或载体可具有降低的转导效率。在本公开的一些实施方案中，相对于源自公开的衣壳蛋白、病毒衣壳或载体所来源的AAV血清型的嗜性，本公开的衣壳蛋白、病毒衣壳或载体可具有等同或增强的嗜性。在本公开的一些实施方案中，相对于本公开的衣壳蛋白、病毒衣壳或载体所来源的AAV血清型的嗜性，本公开的衣壳蛋白、病毒衣壳或载体可具有改变或不同的嗜性。在本公开的一些实施方案中，本公开的衣壳蛋白、病毒衣壳或载体可以具有或经工程化以具有对脑组织的嗜性。在本公开的一些实施方案中，本公开的衣壳蛋白、病毒衣壳或载体可以具有或经工程化以具有对肝组织的嗜性。
本领域技术人员将理解，对于一些AAV衣壳蛋白，相应的修饰是插入和/或置换，取决于相应的氨基酸位置是部分还是完全存在于病毒中，或者是完全不存在的。如本文其他地方所述的，使用众所周知的技术，相应的氨基酸位置对本领域技术人员而言是显而易见的。
AAV病毒载体
在一些实施方案中，病毒载体包含修饰的AAV衣壳(其包含本公开的修饰的衣壳亚单位)和载体基因组。例如，在一些实施方案中，病毒载体包含：(a)修饰的病毒衣壳(例如修饰的AAV衣壳)，其包含本公开的修饰的衣壳蛋白；和(b)包含末端重复序列(例如AAV TR)的异源核酸，其中所述包含末端重复序列的异源核酸被修饰的病毒衣壳包裹。核酸可任选地包含两个末端重复序列(例如，两个AAV TRs)。
在一些实施方案中，本公开的病毒载体(i)相比于不具有修饰的衣壳蛋白的病毒载体的转导水平，具有降低的肝转导；(ii)相比于通过不具有修饰的衣壳蛋白的病毒载体观察的水平，在动物受试者中显示出增强的病毒载体系统性转导；(iii)相比于不具有修饰的衣壳蛋白的病毒载体的运动水平，表现出增强的跨内皮细胞的运动，和/或(iv)展示出选择性增强的肌肉组织(例如骨骼肌、心肌和/或隔膜肌)的转导，(v)展示出选择性增强的肝组织的转导，和/或(vi)相比于不具有修饰的衣壳蛋白的病毒载体的转导水平，降低脑组织(例如神经元)的转导。在特定实施方案中，病毒载体具有向肝脏的系统性转导。
在一些实施方案中，病毒载体是包含编码目标多肽或功能性RNA的异源核酸的重组病毒载体。在一些实施方案中，核酸是编码多肽的核酸，包括治疗性(例如，用于医学或兽医学用途)或免疫原性(例如，用于疫苗)多肽或RNA。
或者，免疫原性多肽可以是任何肿瘤或癌细胞抗原。任选地，肿瘤或癌症抗原在癌细胞表面上表达。
本领域技术人员应当理解，异源核酸可以与适当的控制序列可操作地结合。例如，异源核酸可以与表达控制元件(例如转录/翻译控制信号、复制起点、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子和/或增强子等)可操作地结合。此外，目标异源核酸的调控表达可在转录后水平实现，例如，通过寡核苷酸、小分子和/或在特定位点选择性地阻断剪接活性的其他化合物的存在或缺失调节不同内含子的选择性剪接。
本领域技术人员将理解，可根据所需的水平和组织特异性表达使用多种启动子/增强子元件。根据所需的表达模式，启动子/增强子可以是组成型或诱导型的。启动子/增强子可以是天然的或外来的，并且可以是天然的或合成的序列。外来的意指转录起始区不存在于转录起始区被引入的野生型宿主中。
在特定实施方案中，启动子/增强子元件可以是靶细胞或待治疗受试者原始的。在代表性的实施方案中，启动子/增强子元件可以是异源核酸序列原始的。通常选择启动子/增强子元件使得其在目标靶细胞中发挥作用。此外，在特定实施方案中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以是组成型或诱导型的。
诱导型表达控制元件在其中期望提供对异源核酸序列表达的调控的应用中通常是有利的。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性的或优先的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性的或优先的(包括心脏、骨骼和/或平滑肌特异性的或优先的)、神经组织特异性的或优先的(包括脑特异性的或优先的)、眼睛特异性的或优先的(包括视网膜特异性的和角膜特异性的)、肝脏特异性的或优先的、骨髓特异性的或优先的、胰腺特异性的或优先的、脾脏特异性的或优先的以及肺特异性的或优先的启动子/增强子元件。其他诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导的和金属诱导的元件。示例性诱导型启动子/增强子元件包括但不限于Tet开/关元件、RU486诱导启动子、蜕化素诱导启动子、雷帕霉素诱导启动子和金属硫蛋白启动子。
根据本公开的病毒载体提供了将异源核酸递送至广泛的细胞(包括分裂细胞和非分裂细胞)中的方法。病毒载体可被用于在体外将目标核酸递送至细胞，例如，以在体外产生多肽，或用于离体基因治疗。病毒载体另外可用于向有此需要的受试者递送核酸的方法中，例如以表达免疫原性或治疗性多肽或功能性RNA。通过这种方式，可以在受试者体内产生多肽或功能性RNA。受试者可能需要多肽，因为受试者缺乏所述多肽。此外，因为受试者体内多肽或功能性RNA的产生可影响一些有益的效果，所以所述方法可以实施。
本公开的病毒载体可用于递送编码多肽或功能性RNA的异源核酸以治疗和/或预防递送治疗性多肽或功能性RNA对其有益的任何疾病状态。基因转移对疾病状态的理解和提供治疗具有实质意义。许多遗传性疾病的缺陷基因是已知的或已被克隆。一般而言，上述疾病状态分为两类：缺陷状态，通常为酶的缺陷，其一般以隐性方式遗传；和不平衡状态，其可涉及调控或结构蛋白，且其通常以显性方式遗传。对于缺陷状态疾病，基因转移可用于将正常基因带入受影响的组织中进行替代治疗，以及使用反义突变建立所述疾病的动物模型。对于不平衡疾病状态，基因转移可用于在模型系统中创建疾病状态，其然后可用于试图对抗疾病状态。因此，根据本公开的病毒载体允许治疗和/或预防遗传疾病。
根据本公开的病毒载体也可用于在体外或体内向细胞提供功能性RNA。功能性RNA可以是例如非编码RNA。在一些实施方案中，功能性RNA在细胞中的表达可减少细胞的特定靶蛋白的表达。因此，功能性RNA可施用以降低有此需要的受试者体内特定蛋白质的表达。在一些实施方案中，功能性RNA在细胞中的表达可增强细胞的特定靶蛋白的表达。因此，功能性RNA可施用以增强有此需要的受试者体内特定蛋白质的表达。在一些实施方案中，功能性RNA的表达可以调节细胞中特定靶RNA的剪接。因此，功能性RNA可施用以调节有此需要的受试者体内特定RNA的剪接。在一些实施方案中，功能性RNA在细胞中的表达可调节细胞的特定靶蛋白的功能。因此，功能性RNA可施用以调节有此需要的受试者体内的特定蛋白的功能。功能性RNA还可在体外施用于细胞以调节基因表达和/或细胞生理学，例如以优化细胞或组织培养系统或筛选方法。
或者，病毒载体可被施用于离体细胞，并将改变的细胞施用于受试者。包含异源核酸的病毒载体被引入细胞中，并将所述细胞施用于受试者，其中编码免疫原的异源核酸可被表达并诱导受试者体内针对所述免疫原的免疫反应。在特定实施方案中，细胞是抗原呈递细胞(例如树状细胞)。
试剂盒
本公开的另一方面提供了一种用于减少和/或消除受试者体内针对重组生物制品和/或药物实体的中和抗体和/或免疫球蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括本文所述的任何一种组合物、施用所述组合物的方式和使用说明，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，试剂包括免疫球蛋白G(IgG)-降解酶。
编号的实施方案
本公开的范围内包括以下编号的实施方案。
1.一种用于减少有需要的受试者体内针对重组腺相关病毒(AAV)载体的中和抗体的量的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的促进所述中和抗体降解的组合物。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述中和抗体为IgG、IgM、IgE或IgA。
3.根据实施方案2所述的方法，其中所述中和抗体为IgG。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述重组AAV载体为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽类AAV或牛AAV载体。
5.根据实施方案4所述的方法，其中所述AAV载体为野生型AAV载体。
6.根据实施方案4所述的方法，其中所述AAV载体为突变型AAV载体。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述重组AAV载体包含编码治疗性蛋白质或治疗性RNA的异源核酸。
8.根据实施方案1-7中任一项的方法，其中施用所述组合物后，所述受试者体内至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的抗体被降解。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述组合物包含抗体降解酶或其片段。
10.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述组合物包含载体，所述载体包含编码抗体降解酶或其片段的多核苷酸。
11.根据实施方案9或10所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段具有半胱氨酸蛋白酶活性。
12.根据实施方案9-11中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶特异性裂解IgG。
13.根据实施方案9-12中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段来源于链球菌属。
14.根据实施方案9-13中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶包含与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
15.根据实施方案14所述的方法，其中所述抗体降解酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白包含第一蛋白和第二蛋白，其中所述第一蛋白是抗体降解酶或其片段。
17.根据实施方案16所述的方法，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白通过接头分隔。
18.根据实施方案16或17所述的方法，其中所述第二蛋白为IgG蛋白酶。
19.根据实施方案9-15中任一项所述的方法，其特征在于，向所述受试者施用约0.1mg/kg至约100mg/kg的所述抗体降解酶或其片段。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述施用减少所述抗体与Fc受体的结合。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述组合物静脉内施用。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所述组合物包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述受试者在施用所述组合物前用重组腺相关病毒(AAV)载体治疗。
25.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中受试者在施用所述组合物前未用重组AAV治疗。
26.一种使受试者准备用重组腺相关病毒(AAV)载体治疗的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物(a)促进针对所述AAV载体的中和抗体的降解，和/或(b)减少所述中和抗体与Fc受体的结合。
27.根据实施方案26所述的方法，其中所述中和抗体为IgG、IgM、IgE或IgA。
28.根据实施方案27所述的方法，其中所述中和抗体为IgG。
29.根据实施方案26-28中任一项所述的方法，其中所述重组AAV载体为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽类AAV或牛AAV载体。
30.根据实施方案29所述的方法，其中所述AAV载体为野生型AAV载体。
31.根据实施方案29所述的方法，其中所述AAV载体为突变型载体。
32.根据实施方案26-31中任一项所述的方法，其中所述重组AAV包含编码治疗性蛋白质或治疗性RNA的异源核酸。
33.根据实施方案26-32中任一项所述的方法，其中在施用所述组合物后，所述受试者体内至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的抗体被降解。
34.根据实施方案26-33中任一项所述的方法，其中所述组合物包含抗体降解酶或其片段。
35.根据实施方案26-33中任一项所述的方法，其中所述组合物包含载体，所述载体包含编码抗体降解酶或其片段的多核苷酸。
36.根据实施方案34或35所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段具有半胱氨酸蛋白酶活性。
37.根据实施方案26-36中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶特异性裂解IgG。
38.根据实施方案26-37中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段来源于链球菌属。
39.根据实施方案26-38中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶包含与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
40.根据实施方案39所述的方法，其中所述抗体降解酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
41.根据实施方案26-40中任一项所述的方法，其中所述组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白包含第一蛋白和第二蛋白，其中所述第一蛋白为抗体降解酶或其片段。
42.根据实施方案41所述的方法，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白通过接头分隔。
43.根据实施方案41或42所述的方法，其中所述第二蛋白为IgG蛋白酶。
44.根据实施方案34-43中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用约0.1mg/kg至约100mg/kg的所述抗体降解酶或其片段。
45.根据实施方案28-44中任一项所述的方法，其中所述施用减少所述抗体与Fc受体的结合。
46.根据实施方案26-45中任一项所述的方法，其中所述组合物静脉内施用。
47.根据实施方案26-46中任一项所述的方法，其中所述组合物包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。
48.根据实施方案26-47中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
49.一种利用重组腺相关病毒(AAV)载体治疗需要的受试者的方法，所述方法包括：
(i)向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物(a)促进针对所述AAV载体的中和抗体的降解，和/或(b)减少所述中和抗体与Fc受体的结合；以及
(ii)向所述受试者施用有效量的所述AAV载体。
50.根据实施方案49所述的方法，其中所述AAV载体与所述组合物同时施用。
51.根据实施方案49所述的方法，其中所述AAV载体在施用所述组合物之后施用。
52.根据实施方案49所述的方法，其中所述AAV载体在施用所述组合物之前施用。
53.根据实施方案49-52中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用第二AAV载体。
54.根据实施方案53所述的方法，其中所述AAV载体和所述第二AAV载体包含具有相同血清型的AAV衣壳蛋白。
55.根据实施方案53所述的方法，其中所述AAV载体和所述第二AAV载体包含具有不同血清型的AAV衣壳蛋白。
56.根据实施方案45-55中任一项所述的方法，其中所述中和抗体为IgG、IgM、IgE或IgA。
57.根据实施方案56所述的方法，其中所述中和抗体为IgG。
58.根据实施方案49-57中任一项所述的方法，其中所述重组AAV载体为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽类AAV或牛AAV载体。
59.根据实施方案58所述的方法，其中所述AAV载体为野生型AAV载体。
60.根据实施方案58所述的方法，其中所述AAV载体为突变型AAV载体。
61.根据实施方案49-60中任一项所述的方法，其中所述重组AAV载体包含编码治疗性蛋白质或治疗性RNA的异源核酸。
62.根据实施方案49-61中任一项所述的方法，其中在施用所述组合物后，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的所述抗体被降解。
63.根据实施方案49-62中任一项所述的方法，其中所述组合物包含抗体降解酶或其片段。
64.根据实施方案49-62中任一项所述的方法，其中所述组合物包含载体，所述载体包含编码抗体降解酶或其片段的多核苷酸。
65.根据实施方案63或64所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段具有半胱氨酸蛋白酶活性。
66.根据实施方案63-65中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶特异性裂解IgG。
67.根据实施方案63-66中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段来源于链球菌属。
68.根据实施方案63-67中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶包含与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
69.根据实施方案68所述的方法，其中所述抗体降解酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
70.根据实施方案49-69中任一项所述的方法，其中所述组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白包含第一蛋白和第二蛋白，其中所述第一蛋白为抗体降解酶或其片段。
71.根据实施方案70所述的方法，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白通过接头分隔。
72.根据实施方案70或71所述的方法，其中所述第二蛋白为IgG蛋白酶。
73.根据实施方案63-72中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用约0.1mg/kg至约100mg/kg的所述抗体降解酶或其片段。
74.根据实施方案49-73中任一项所述的方法，其中所述施用减少所述抗体与Fc受体的结合。
75.根据实施方案49-74中任一项所述的方法，其中所述组合物静脉内施用。
76.根据实施方案49-75中任一项所述的方法，其中所述组合物包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。
77.根据实施方案49-76中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
78.一种使用第二重组腺相关病毒(AAV)载体治疗需要的受试者的方法，其中所述受试者之前用第一重组AAV治疗，所述方法包括：
(i)向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物(a)促进针对所述第一和/或所述第二重组AAV载体的中和抗体的降解，和/或(b)减少所述中和抗体与Fc受体的结合；以及
(ii)向所述受试者施用有效量的所述第二重组AAV载体。
79.根据实施方案78所述的方法，其中所述第一重组AAV和所述第二重组AAV具有相同的血清型。
80.根据实施方案78所述的方法，其中所述第一重组AAV和所述第二重组AAV具有不同的血清型。
81.根据实施方案78-80中任一项所述的方法，其中所述中和抗体为IgG、IgM、IgE或IgA。
82.根据实施方案81所述的方法，其中所述中和抗体为IgG。
83.根据实施方案76-82中任一项所述的方法，其中所述重组AAV载体为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽类AAV或牛AAV载体。
84.根据实施方案83所述的方法，其中所述AAV载体为野生型AAV载体。
85.根据实施方案83所述的方法，其中所述AAV载体为突变型AAV载体。
86.根据实施方案78-85中任一项所述的方法，其中所述重组AAV包含编码治疗性蛋白质或治疗性RNA的异源核酸。
87.根据实施方案78-86中任一项所述的方法，其中在施用所述组合物后，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的所述抗体被降解。
88.根据实施方案78-87中任一项所述的方法，其中所述组合物包含抗体降解酶或其片段。
89.根据实施方案78-87中任一项所述的方法，其中所述组合物包含载体，所述载体包含编码抗体降解酶或其片段的多核苷酸。
90.根据实施方案88或89所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段具有半胱氨酸蛋白酶活性。
91.根据实施方案78-90中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶特异性裂解IgG。
92.根据实施方案78-91中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段来源于链球菌属。
93.根据实施方案78-92中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶包含与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
94.根据实施方案93所述的方法，其中所述抗体降解酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
95.根据实施方案87-94中任一项所述的方法，其中所述组合物包含融合蛋白，其中所述融合蛋白包含第一蛋白和第二蛋白，其中所述第一蛋白为抗体降解酶或其片段。
96.根据实施方案95所述的方法，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白通过接头分隔。
97.根据实施方案95或96所述的方法，其中所述第二蛋白为IgG蛋白酶。
98.根据实施方案78-97中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用约0.1mg/kg至约100mg/kg的所述抗体降解酶或其片段。
99.根据实施方案78-98中任一项所述的方法，其中所述施用减少所述抗体与Fc受体的结合。
100.根据实施方案78-99中任一项所述的方法，其中所述组合物静脉内施用。
101.根据实施方案78-100中任一项所述的方法，其中所述组合物包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。
102.根据实施方案78-101中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
103.一种在需要的受试者体内减少针对包含异源核酸的腺相关病毒(AAV)载体的中和抗体的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述AAV载体和组合物，所述组合物(a)促进针对所述AAV载体或通过所述异源核酸编码的重组蛋白质的抗体的降解；和/或(b)减少所述抗体与Fc受体的结合。
104.根据实施方案103所述的方法，其中所述抗体为IgG。
105.根据实施方案103或104所述的方法，其中与所述组合物同时向所述受试者施用所述AAV载体。
106.根据实施方案103或104所述的方法，其中在施用所述组合物之后向所述受试者施用所述AAV载体。
107.根据实施方案103或104所述的方法，其中在施用所述组合物之前向所述受试者施用所述AAV载体。
108.根据实施方案107所述的方法，还包括施用一个或多个剂量的包含第二异源核酸的第二AAV载体。
109.根据实施方案108所述的方法，其中所述AAV载体和所述第二AAV载体包含具有相同血清型的AAV衣壳蛋白。
110.根据实施方案108所述的方法，其中所述AAV载体和所述第二AAV载体包含具有不同血清型的AAV衣壳蛋白。
111.根据实施方案102-110中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。
112.根据实施方案102-111中任一项所述的方法，其中所述组合物促进所述抗体的降解。
113.根据实施方案112所述的方法，其中所述受试者体内的抗体水平相对于对照受试者体内的抗体水平降低至约95％至约0.01％范围内的水平，其中所述对照受试者被施用所述AAV载体而未施用所述组合物。
114.根据实施方案112或113所述的方法，其中所述组合物包含抗体降解酶或其片段。
115.根据实施方案112或113所述的方法，其中所述组合物包含载体，所述载体包含编码抗体降解酶或其片段的多核苷酸。
116.根据实施方案114或115所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段包含IgG半胱氨酸蛋白酶活性。
117.根据实施方案114-116中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段来源于链球菌属。
118.根据实施方案114-117中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶包含与SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少50％同一性的氨基酸序列。
119.根据实施方案114-118中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶包含SEQID NO:1的氨基酸序列。
120.根据实施方案114-119中任一项所述的方法，其中所述组合物包含含有所述抗体降解酶或其片段融合蛋白；和第二蛋白。
121.根据实施方案120所述的方法，其中所述第二蛋白为IgG蛋白酶。
122.根据实施方案114-121中任一项所述的方法，其中所述受试者被施用约0.1mg/kg至约100mg/kg的所述抗体降解酶或其片段。
123.根据实施方案108-122中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
124.根据实施方案102所述的方法，其中所述组合物减少所述抗体与Fc受体的结合。
应当理解，上述说明以及下述实施例旨在描述而非限制本发明的范围。本发明范围内的其他方面、优势和修改对于本发明所属技术领域的本领域技术人员而言是显而易见的。
实施例
实施例1：重组IdeZ(rIdeZ)的克隆、表达和纯化
利用BamHI和SalI限制性位点将IdeZ编码序列克隆到pGEX-6P-3载体中，以建立N-端GST标记的IdeZ融合体(GST-IdeZ)(图1A)。GST-IdeZ的表达受lac操纵子控制并通过添加IPTG诱导产生。使用谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化IdeZ蛋白，并用过量的谷胱甘肽洗脱。SDS-PAGE用于监测表达和纯化(图1B)。重组IdeZ以BSA为标准使用Biorad ImagelabTM软件进行量化。
实施例2：IdeZ切割重组小鼠IgG和来自多种物种的血清IgG
为确定rIdeZ在体外是否具有活性，使用重组GST-IdeZ(1μg)在37℃下处理小鼠、灵长动物和人类血清样品3小时。如图6所示，GST-IdeZ切割人和灵长动物血清中存在的IgG。
在单独的实验中，重组小鼠IgG与rIdeZ(NEB P0770S，160单位)在37℃下孵育(40μg)2小时。反应在非还原条件下通过SDS-PAGE分析，并用考马斯蓝染色(图2A)。在IdeZ存在的情况下，重组小鼠IgG被切割成多个带，如星号所示。箭头指示IdeZ蛋白。
在另外的实验中，来自小鼠、灵长动物和人类的血清样品未处理(-)或用重组IdeZ(NEB P0770S，320单位)在37℃下处理3小时(+)。以1:10稀释反应物，并在还原条件下通过SDS PAGE进行分析。随后使用考马斯蓝对凝胶染色。如图2B所示，血清中存在的IgG被IdeZ切割。在图2B中，较低的凝胶表示含有IgG重链切割产物(～31kDa)的凝胶部分过度曝光。IdeZ还切割来自其他人类患者(供体1-5)的血清样品中的IgG(图2D)。在相似的实验中，还观察到IdeZ可切割来自狗血清中的IgG(图2C)。综上所述，这些数据表明IdeZ可切割来自多个物种的血清中的IgG。
实施例3：IdeZ在体外和体内切割人IVIG
人静脉内免疫球蛋白(IVIG)与GST-IdeZ(1μg)或IdeZ(NEB P0770S或Genscript)在37℃下孵育2小时。反应在还原条件下通过SDS-PAGE分析，并用考马斯蓝染色。如图3B所示，IdeZ在体外切割人IVIG。
向小鼠腹膜内注射8mg人IVIG。24小时后，向相同的小鼠静脉内注射PBS(-)或重组IdeZ(2.5mg/kg)(+)。IVIG注射后72小时采集血液样品，并在还原条件下用免疫印迹法进行SDS-PAGE分析。用山羊抗人IgG Alexa Fluor 647(1:10,000)对IVIG进行了探测。在IdeZ的存在下，人IVIG被消化成多个较小的切割产物，如星号所示(图3A)。这些数据表明，IdeZ在体内切割人IVIG。
在类似的实验中，向小鼠腹膜内注射8mg人IVIG。24小时后，向相同的小鼠静脉内注射PBS(-)或重组GST-IdeZ(2.5mg/kg)(+)。在注射前、注射后24小时、48小时和72小时采集血液样本。如图7所示，IdeZ在24小时内切割人IVIG且切割水平持续提高直至72小时(第3天)时间点。
实施例4：GST-IdeZ介导的IVIG裂解的剂量分析
还进行了GST-IdeZ介导的IVIG裂解的剂量分析。在本实验中，向小鼠腹膜内注射8mg人IVIG。24小时后，向相同的小鼠静脉内注射PBS(-)或重组GST-IdeZ(0.25mg/kg)(+)。如图8A-8B所示，裂解是剂量依赖性的。在最高剂量(2.5mg/kg)下，每个样品中几乎所有的IVIG被切割，如从条带尺寸的偏移证明的。
IdeZ的切割位点位于人免疫球蛋白的铰链区内。为确定IdeZ是否切割IVIG，在SDS-PAGE凝胶上运行具有PBS(-)或含1mg/kG IdeZ(+)的来自小鼠的血清样品，并使用抗-Fab或抗-Fc抗体进行探测。如图9所示，作为IdeZ处理的结果，Fab条带的尺寸发生偏移(从约150kDa至约150kDa)，这表明发生了裂解。在IdeZ处理的样品中，50kDa附近出现Fc条带，表明该结构域已从Fab分离。
还制备了AAV8-Luc与人IVIG的中和曲线。以1:1000至1:102,400的两倍增量连续稀释经过和未经过GST-IdeZ(1μg)处理的人IVIG，然后与AAV8-Luc共孵育并施用于培养的细胞(100,000vg/细胞)。如图10中的曲线所证明的，在GST-IdeZ的存在下，AAV8-Luc的中和减少。
实施例5：IdeZ拯救IVIG处理的小鼠中的AAV8-Luc肝转导
向小鼠腹膜内注射8mg人IVIG。24小时后，向相同的小鼠静脉内注射PBS或重组IdeZ(2.5mg/kg)和AAV8-Luc(5x1012vg/kg)。注射后4周分析肝脏中的荧光素酶转基因表达水平。荧光素酶表达水平相对于总组织蛋白浓度标准化，并以每克肝组织的相对光单位(RLU)表示。所有实验重复三次。*p<0.05。L.O.D＝检测限。
如图4所示，IVIG处理的小鼠显示肝脏中AAV8-Luc转导水平降低。然而，用IdeZ共同注射的IVIG处理小鼠显示的AAV8-Luc肝转导水平与PBS处理的小鼠相似。
计算来自小鼠的肝脏样品中的AAV8-Luc拷贝数。如图11所示，每细胞的AAV-Luc拷贝数在来自共同注射AAV8-Luc和IdeZ的IVIG处理小鼠的样品较高。未用IdeZ处理的小鼠中肝转导非常低。
综上所述，这些数据表明IdeZ降低了IVIG对AVV的中和，并促进AAV8-Luc肝转导。
实施例6：IdeZ拯救IVIG处理的小鼠中的AAV9-Luc肝和心脏转导
向小鼠腹膜内注射8mg人IVIG。72小时后，向相同的小鼠静脉内注射PBS或重组GST-IdeZ(2.5mg/kg)。随后，在IdeZ处理后72小时，向小鼠静脉内注射AAV9-Luc(2x1011vg/小鼠)。注射4周后分析肝脏和心脏中的荧光素酶转基因表达水平。荧光素酶表达水平相对于总组织蛋白浓度标准化，并以每克肝组织的相对光单位(RLU)表示。
IVIG处理的雄性和雌性小鼠显示肝(图12A、图12C)和心脏(图12B、图12D)中的AAV9-Luc转导水平降低。然而，用GST-IdeZ共同注射的IVIG处理小鼠显示AAV9-Luc肝和心脏转导水平与PBS处理的小鼠相似。
综上所述，这些数据表明，IdeZ抑制IVIG介导的AAV的中和，并促进AAV9-Luc肝和心脏传导。(L.O.D＝检测限)
实施例7：IdeZ改善了患者血清处理的小鼠中的AAV9-Luc肝和心脏转导。
测试来自18名人类患者的血清样本中和肝脏和心脏中的AAV9转导的能力。
每个人血清样品的2只小鼠用于研究，并且两只小鼠腹膜内注射100μl人患者血清。72小时后，向小鼠静脉内注射PBS或重组GST-IdeZ(2.5mg/kg)。随后，在IdeZ治疗后72小时，向小鼠静脉内注射AAV9-Luc(2x1011vg/小鼠)。
注射后4周分析肝脏和心脏转导水平。转导水平相对于注射AAV9-Luc(2x1011vg/小鼠)而无血清处理的对照小鼠标准化。
如图13A和13B所示，用人患者血清处理的小鼠显示出差异的转导水平。然而，当用GST-IdeZ共同注射时，用强中和患者血清处理的小鼠显示出增加的肝脏(图13A)和心脏(图13B)转导。
综上所述，这些数据表明IdeZ拮抗患者血清介导的AAV中和并促进AAV9-Luc肝和心脏传导。
本领域技术人员将容易理解，本公开非常适合于实现目标并获得上述以及其中固有的目的和优点。如本文中所述的本公开目前是优选实施方案的代表，是示例性的，并且不旨在限制本公开的范围。本领域技术人员将想到其中的变化和其他用途，其包含在权利要求的保护范围限定的本公开的精神内。
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Claims (124)

1.一种用于在有需要的受试者中减少针对重组腺相关病毒(AAV)载体的中和抗体的量的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的促进所述中和抗体降解的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述中和抗体为IgG、IgM、IgE或IgA。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述中和抗体为IgG。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述重组AAV载体为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽类AAV或牛AAV载体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述AAV载体为野生型AAV载体。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述AAV载体为突变型AAV载体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述重组AAV载体包含编码治疗性蛋白质或治疗性RNA的异源核酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在施用所述组合物后，所述受试者中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的所述抗体降解。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述组合物包含抗体降解酶或其片段。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述组合物包含载体，所述载体包含编码抗体降解酶或其片段的多核苷酸。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段具有半胱氨酸蛋白酶活性。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶特异性裂解IgG。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段源自链球菌属。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗体降解酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白包含第一蛋白和第二蛋白，其中所述第一蛋白是抗体降解酶或其片段。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白通过接头分隔。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述第二蛋白为IgG蛋白酶。
19.根据权利要求9-15中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用约0.1mg/kg至约100mg/kg的所述抗体降解酶或其片段。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述施用减少所述抗体与Fc受体的结合。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述组合物静脉内施用。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述组合物包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中在施用所述组合物之前，所述受试者用所述重组腺相关病毒(AAV)载体治疗。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中在施用所述组合物之前，所述受试者未用所述重组AAV治疗。
26.一种使受试者准备用于重组腺相关病毒(AAV)载体的治疗的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物(a)促进针对所述AAV载体的中和抗体的降解，和/或(b)减少所述中和抗体与Fc受体的结合。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述中和抗体为IgG、IgM、IgE或IgA。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述中和抗体为IgG。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述重组AAV载体为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽类AAV或牛AAV载体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述AAV载体为野生型AAV载体。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述AAV载体为突变型载体。
32.根据权利要求26-31中任一项所述的方法，其中所述重组AAV包含编码治疗性蛋白质或治疗性RNA的异源核酸。
33.根据权利要求26-32中任一项所述的方法，其中在施用所述组合物后，所述受试者中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的所述抗体被降解。
34.根据权利要求26-33中任一项所述的方法，其中所述组合物包含抗体降解酶或其片段。
35.根据权利要求26-33中任一项所述的方法，其中所述组合物包含载体，所述载体包含编码抗体降解酶或其片段的多核苷酸。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段具有半胱氨酸蛋白酶活性。
37.根据权利要求26-36中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶特异性裂解IgG。
38.根据权利要求26-37中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段源自链球菌属。
39.根据权利要求26-38中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述抗体降解酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
41.根据权利要求26-40中任一项所述的方法，其中所述组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白包含第一蛋白和第二蛋白，其中所述第一蛋白为抗体降解酶或其片段。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白通过接头分隔。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述第二蛋白为IgG蛋白酶。
44.根据权利要求34-43中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用约0.1mg/kg至约100mg/kg的所述抗体降解酶或其片段。
45.根据权利要求28-44中任一项所述的方法，其中所述施用减少所述抗体与Fc受体的结合。
46.根据权利要求26-45中任一项所述的方法，其中所述组合物静脉内施用。
47.根据权利要求26-46中任一项所述的方法，其中所述组合物包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。
48.根据权利要求26-47中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
49.一种利用重组腺相关病毒(AAV)载体治疗需要的受试者的方法，所述方法包括：
(i)向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物(a)促进针对所述AAV载体的中和抗体的降解，和/或(b)减少所述中和抗体与Fc受体的结合；以及
(ii)向所述受试者施用有效量的所述AAV载体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述AAV载体与所述组合物同时施用。
51.根据权利要求49所述的方法，其中在施用所述组合物之后施用所述AAV载体。
52.根据权利要求49所述的方法，其中在施用所述组合物之前施用所述AAV载体。
53.根据权利要求49-52中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用第二AAV载体。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述AAV载体和所述第二AAV载体包含具有相同血清型的AAV衣壳蛋白。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述AAV载体和所述第二AAV载体包含具有不同血清型的AAV衣壳蛋白。
56.根据权利要求45-55中任一项所述的方法，其中所述中和抗体为IgG、IgM、IgE或IgA。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述中和抗体为IgG。
58.根据权利要求49-57中任一项所述的方法，其中所述重组AAV载体为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽类AAV或牛AAV载体。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述AAV载体为野生型AAV载体。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述AAV载体为突变型AAV载体。
61.根据权利要求49-60中任一项所述的方法，其中所述重组AAV包含编码治疗性蛋白质或治疗性RNA的异源核酸。
62.根据权利要求49-61中任一项所述的方法，其中在施用所述组合物后，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的所述抗体被降解。
63.根据权利要求49-62中任一项所述的方法，其中所述组合物包含抗体降解酶或其片段。
64.根据权利要求49-62中任一项所述的方法，其中所述组合物包含载体，所述载体包含编码抗体降解酶或其片段的多核苷酸。
65.根据权利要求63或64所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段具有半胱氨酸蛋白酶活性。
66.根据权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶特异性裂解IgG。
67.根据权利要求63-66中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段源自链球菌属。
68.根据权利要求63-67中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述抗体降解酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
70.根据权利要求49-69中任一项所述的方法，其中所述组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白包含第一蛋白和第二蛋白，其中所述第一蛋白为抗体降解酶或其片段。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白通过接头分隔。
72.根据权利要求70或71所述的方法，其中所述第二蛋白为IgG蛋白酶。
73.根据权利要求63-72中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用约0.1mg/kg至约100mg/kg的所述抗体降解酶或其片段。
74.根据权利要求49-73中任一项所述的方法，其中所述施用减少所述抗体与Fc受体的结合。
75.根据权利要求49-74中任一项所述的方法，其中所述组合物静脉内施用。
76.根据权利要求49-75中任一项所述的方法，其中所述组合物包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。
77.根据权利要求49-76中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
78.一种使用第二重组腺相关病毒(AAV)载体治疗需要的受试者的方法，其中所述受试者之前用第一重组AAV治疗，所述方法包括：
(i)向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物(a)促进针对所述第一和/或所述第二重组AAV载体的中和抗体的降解，和/或(b)减少所述中和抗体与Fc受体的结合；以及
(ii)向所述受试者施用有效量的所述第二重组AAV载体。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述第一重组AAV和所述第二重组AAV具有相同的血清型。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述第一重组AAV和所述第二重组AAV具有不同的血清型。
81.根据权利要求78-80中任一项所述的方法，其中所述中和抗体为IgG、IgM、IgE或IgA。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述中和抗体为IgG。
83.根据权利要求76-82中任一项所述的方法，其中所述重组AAV载体为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽类AAV或牛AAV载体。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述AAV载体为野生型AAV载体。
85.根据权利要求83所述的方法，其中所述AAV载体为突变型AAV载体。
86.根据权利要求78-85中任一项所述的方法，其中所述重组AAV包含编码治疗性蛋白质或治疗性RNA的异源核酸。
87.根据权利要求78-86中任一项所述的方法，其中在施用所述组合物后，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的所述抗体被降解。
88.根据权利要求78-87中任一项所述的方法，其中所述组合物包含抗体降解酶或其片段。
89.根据权利要求78-87中任一项所述的方法，其中所述组合物包含载体，所述载体包含编码抗体降解酶或其片段的多核苷酸。
90.根据权利要求88或89所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段具有半胱氨酸蛋白酶活性。
91.根据权利要求78-90中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶特异性裂解IgG。
92.根据权利要求78-91中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段源自链球菌属。
93.根据权利要求78-92中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述抗体降解酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
95.根据权利要求87-94中任一项所述的方法，其中所述组合物包含融合蛋白，其中所述融合蛋白包含第一蛋白和第二蛋白，其中所述第一蛋白为抗体降解酶或其片段。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白通过接头分隔。
97.根据权利要求95或96所述的方法，其中所述第二蛋白为IgG蛋白酶。
98.根据权利要求78-97中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用约0.1mg/kg至约100mg/kg的所述抗体降解酶或其片段。
99.根据权利要求78-98中任一项所述的方法，其中所述施用减少所述抗体与Fc受体的结合。
100.根据权利要求78-99中任一项所述的方法，其中所述组合物静脉内施用。
101.根据权利要求78-100中任一项所述的方法，其中所述组合物包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。
102.根据权利要求78-101中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
103.一种在需要的受试者中减少针对包含异源核酸的腺相关病毒(AAV)载体的中和抗体的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述AAV载体和组合物，其中所述组合物(a)促进针对所述AAV载体或通过所述异源核酸编码的重组蛋白质的抗体的降解；和/或(b)减少所述抗体与Fc受体的结合。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述抗体为IgG。
105.根据权利要求103或104所述的方法，其中与所述组合物同时向所述受试者施用所述AAV载体。
106.根据权利要求103或104所述的方法，其中在施用所述组合物之后向所述受试者施用所述AAV载体。
107.根据权利要求103或104所述的方法，其中在施用所述组合物之前向所述受试者施用所述AAV载体。
108.根据权利要求107所述的方法，还包括施用一个或多个剂量的包含第二异源核酸的第二AAV载体。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述AAV载体和所述第二AAV载体包含具有相同血清型的AAV衣壳蛋白。
110.根据权利要求108所述的方法，其中所述AAV载体和所述第二AAV载体包含具有不同血清型的AAV衣壳蛋白。
111.根据权利要求102-110中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。
112.根据权利要求102-111中任一项所述的方法，其中所述组合物促进所述抗体的降解。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述受试者中所述抗体的水平相对于对照受试者中所述抗体的水平降低至约95％至约0.01％的范围内的水平，其中所述对照受试者施用所述AAV载体而不施用所述组合物。
114.根据权利要求112或113所述的方法，其中所述组合物包含抗体降解酶或其片段。
115.根据权利要求112或113所述的方法，其中所述组合物包含载体，所述载体包含编码抗体降解酶或其片段的多核苷酸。
116.根据权利要求114或115所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段包含IgG半胱氨酸蛋白酶活性。
117.根据权利要求114-116中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶或其片段源自链球菌属。
118.根据权利要求114-117中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶包含与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少50％同一性的氨基酸序列。
119.根据权利要求114-118中任一项所述的方法，其中所述抗体降解酶包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。
120.根据权利要求114-119中任一项所述的方法，其中所述组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白包含所述抗体降解酶或其片段；和第二蛋白。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述第二蛋白为IgG蛋白酶。
122.根据权利要求114-121中任一项所述的方法，其中所述受试者施用约0.1mg/kg至约100mg/kg的所述抗体降解酶或其片段。
123.根据权利要求108-122中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
124.根据权利要求102所述的方法，其中所述组合物减少所述抗体与Fc受体的结合。
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