TW202400796A - 雙向雙重啟動子表現載體及其用途 - Google Patents

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尤爵希瓦 夏瑪
歐瑪 弗蘭科尼
希拉德 魯賓
王薇
葛斯塔夫 瑟奇拉
賽琳娜 妮可 朵利維
安德魯 普拉
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美商同源醫藥公司
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Abstract

本文提供包含新穎雙向雙重表現卡匣之聚核苷酸、包含此等聚核苷酸之重組腺相關病毒(rAAV)以及製造及使用該等聚核苷酸及該rAAV之方法。亦提供新穎的轉錄控制元件(例如，啟動子、增強子、內含子、聚腺苷酸化序列及其組合)及新穎的抗體編碼序列。本文所揭示之組合物及方法特別有利，因為其允許在細胞中有效表現兩種不同多肽(例如，抗體重鏈及抗體輕鏈)。特定言之，其允許在個體中有效表現抗體(例如，抗C5抗體)，以治療疾病(例如C5介導之疾病，諸如PNH)。

Description

雙向雙重啟動子表現載體及其用途
治療性抗體代表對於有興趣的目標具有高度特異性的一類有效藥物。然而，許多抗體需要大的單獨劑量及定期投藥才能達到預期的治療效果。對於在患者血清中發現的高濃度抗體目標尤其如此。舉例而言，由於血清中C5之高豐度，因此用於治療C5介導之疾病(諸如陣發性夜間血紅素尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria；PNH)、視神經脊髓炎譜系病症(NMOSD)及非典型性溶血性尿毒性症候群(aHUS)之抗補體組分5 (C5)抗體需要多次大劑量之抗體。
病毒傳送機制為習知抗體治療提供了有吸引力的替代方案，尤其是對於在患者血清中發現的高濃度抗體目標而言。特定言之，單次投與含有能夠表現高水準抗體重鏈及輕鏈之病毒載體具有在個體之血清中產生持續治療水準之抗體的潛力，藉此避免對連續投與高劑量抗體之需求。
因此，本領域需要改善的病毒載體，以在個體中有效且持續表現抗體。
本文提供包含新穎雙向雙重表現卡匣之聚核苷酸、包含此等聚核苷酸之重組腺相關病毒(rAAV)以及製造及使用此等聚核苷酸及rAAV之方法。亦提供新穎的轉錄控制元件(例如，啟動子、增強子、內含子、聚腺苷酸化序列及其組合)及新穎的抗體編碼序列。本文所揭示之組合物及方法尤其有利，因為其允許在細胞中有效的同時表現兩種不同多肽(例如，抗體重鏈及抗體輕鏈)。特定言之，其允許在個體中有效且持續表現抗體(例如，抗C5抗體)，以治療疾病(例如C5介導之疾病，諸如PNH)。
旨在全身性表現全長單株抗體之基因療法載體需要兩個獨立轉殖基因(一個用於抗體重鏈且一個用於抗體輕鏈)之調控轉錄。用於抗體表現的rAAV之先前設計通常採用驅動編碼抗體重鏈及抗體輕鏈兩者之單個雙順反子轉殖基因之表現的單個啟動子，由核糖體跳躍元件隔開(van den Berg等人, Mol Ther Methods Clin Dev. 2019年9月13日; 14: 100-112.)。與此等先前技術rAAV載體相反，本文所揭示之載體採用新穎的雙向雙重啟動子單元，其包含背對背安置之兩個相異啟動子，以相反方向上轉錄抗體重鏈及輕鏈編碼序列。本文所揭示之雙向雙重啟動子載體針對鄰近於ITR之抗體重鏈及輕鏈表現卡匣中之各者定位聚腺苷酸化序列。申請人假設此類定位提供優於傳統構築體之設計，因為聚腺苷酸化序列可用於限制由ITR本身引發之任何有害轉錄。
本發明包括但不限於下文闡述之特定實施例。
實施例1 - 一種經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含：(a)反向互補人類α1-抗胰蛋白酶(hAAT)啟動子序列及人類肝臟控制區1 (hHCR1)序列；(b)與SEQ ID NO:17至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:22至少85%一致之hHCR1序列；(c)與SEQ ID NO:17至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:23至少85%一致之反向互補hHCR1序列；(d)與SEQ ID NO:18至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:22至少85%一致之hHCR1序列；(e)與SEQ ID NO:18至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:23至少85%一致之反向互補hHCR1序列；(f)與SEQ ID NO:20至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:22至少85%一致之hHCR1序列；(g)與SEQ ID NO:20至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:23至少85%一致之反向互補hHCR1序列；(h)與SEQ ID NO:17至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:24至少85%一致之hHCR1序列；(i)與SEQ ID NO:18至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:24至少85%一致之hHCR1序列；(j)與SEQ ID NO:18至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:25至少85%一致之反向互補hHCR1序列；(k)與SEQ ID NO:20至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:24至少85%一致之hHCR1序列；(l)與SEQ ID NO:20至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:25至少85%一致之反向互補hHCR1序列；
實施例2 - 如實施例1之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含：(a)由SEQ ID NO:17組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:22組成之hHCR1序列；(b)由SEQ ID NO:17組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:23組成之反向互補hHCR1序列；(c)由SEQ ID NO:18組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:22組成之hHCR1序列；(d)由SEQ ID NO:18組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:23組成之反向互補hHCR1序列；(e)由SEQ ID NO:20組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:22組成之hHCR1序列；(f)由SEQ ID NO:20組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:23組成之反向互補hHCR1序列；(g)由SEQ ID NO:17組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:24組成之hHCR1序列；(h)由SEQ ID NO:18組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:24組成之hHCR1序列；(i)由SEQ ID NO:18組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:25組成之反向互補hHCR1序列；(j)由SEQ ID NO:20組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:24組成之hHCR1序列；(k)由SEQ ID NO:20組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:25組成之反向互補hHCR1序列；
實施例3 - 如實施例2之經分離聚核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO:36-40及72組成之群的序列。
實施例4 - 如前述實施例中任一項之經分離聚核苷酸，其進一步包含位於該hHCR1序列或該反向互補hHCR1序列之3′的甲狀腺素運載蛋白(TTR)啟動子序列。
實施例5 - 如實施例4之經分離聚核苷酸，其中該TTR啟動子序列包含與SEQ ID NO:26至少85%一致之核酸序列，視情況該TTR啟動子序列包含SEQ ID NO:26，視情況該TTR啟動子序列由SEQ ID NO:26組成。
實施例6 - 一種經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含：(a)與SEQ ID NO:22至少85%一致之hHCR1序列，及與SEQ ID NO:26至少85%一致之TTR啟動子序列；(b)與SEQ ID NO:23至少85%一致之反向互補hHCR1序列，及與SEQ ID NO:26至少85%一致之TTR啟動子序列；(c)與SEQ ID NO:24至少85%一致之hHCR1序列，及與SEQ ID NO:26至少85%一致之TTR啟動子序列；或(d)與SEQ ID NO:25至少85%一致之反向互補hHCR1序列，及與SEQ ID NO:26至少85%一致之TTR啟動子序列。
實施例7 - 如實施例6之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含：(a)由SEQ ID NO:22組成之hHCR1序列，及由SEQ ID NO:26組成之TTR啟動子序列；(b)由SEQ ID NO:23組成之反向互補hHCR1序列，及由SEQ ID NO:26組成之TTR啟動子序列；(c)由SEQ ID NO:24組成之hHCR1序列，及由SEQ ID NO:26組成之TTR啟動子序列；或(d)由SEQ ID NO:25組成之反向互補hHCR1序列，及由SEQ ID NO:26組成之TTR啟動子序列。
實施例8 - 如實施例6之經分離聚核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO:41-43組成之群的序列。
實施例9 - 如實施例4至7中任一項之經分離聚核苷酸，其進一步包含插入於該hHCR1序列或該反向互補hHCR1序列與該TTR啟動子序列之間的聚腺苷酸化序列或其反向互補序列。
實施例10 - 如實施例9之經分離聚核苷酸，其中該聚腺苷酸化序列為β血球蛋白聚腺苷酸化(BGpA)序列。
實施例11 - 如實施例10之經分離聚核苷酸，其中該BGpA序列包含與SEQ ID NO:27至少85%一致之序列，視情況其中該BGpA序列包含SEQ ID NO:27，視情況其中該BGpA序列由SEQ ID NO:27組成。
實施例12 - 如實施例4至11中任一項之經分離聚核苷酸，其包含與選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的序列至少85%一致之序列。
實施例13 - 如實施例12之經分離聚核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的序列。
實施例14 - 如前述實施例中任一項之實施例之經分離聚核苷酸，其進一步包含位於該反向互補hAAT啟動子序列之5′的第一內含子元件。
實施例15 - 如實施例4至14中任一項之實施例之經分離聚核苷酸，其進一步包含位於該TTR啟動子序列之3′的第二內含子元件。
實施例16 - 如實施例14或15之經分離聚核苷酸，其中該第一內含子元件及/或該第二內含子元件為嵌合內含子元件。
實施例17 - 如實施例14至16中任一項之經分離聚核苷酸，其中該第一內含子元件包含與SEQ ID NO:28、29、30、31或32至少85%一致之序列，視情況其中該第一內含子元件包含SEQ ID NO:28、29、30、31或32，視情況其中該第一內含子元件之序列由SEQ ID NO:28、29、30、31或32組成。
實施例18 - 如實施例15至17中任一項之經分離聚核苷酸，其中該第二內含子元件包含與SEQ ID NO:28、29、30、31或32至少85%一致之序列，視情況其中該第二內含子元件包含SEQ ID NO:28、29、30、31或32，視情況其中該第二內含子元件之序列由SEQ ID NO:28、29、30、31或32組成。
實施例19 - 如實施例15至18中任一項之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含：(a)包含與SEQ ID NO:28至少85%一致之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含與SEQ ID NO:29至少85%一致之序列的第二內含子元件；(b)包含與SEQ ID NO:28至少85%一致之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含與SEQ ID NO:30至少85%一致之序列的第二內含子元件；(c)包含與SEQ ID NO:28至少85%一致之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含與SEQ ID NO:31至少85%一致之序列的第二內含子元件；或(d)包含與SEQ ID NO:28至少85%一致之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含與SEQ ID NO:32至少85%一致之序列的第二內含子元件。
實施例20 - 如實施例15至19中任一項之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含：(a)包含SEQ ID NO:28之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含SEQ ID NO:29之序列的第二內含子元件；(b)包含SEQ ID NO:28之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含SEQ ID NO:30之序列的第二內含子元件；(c)包含SEQ ID NO:28之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含SEQ ID NO:31之序列的第二內含子元件；或(d)包含SEQ ID NO:28之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含SEQ ID NO:32之序列的第二內含子元件。
實施例21 - 如實施例4至20中任一項之經分離聚核苷酸，其包含與選自由SEQ ID NO:79-116組成之群的序列至少85%一致之序列。
實施例22 - 如實施例21之經分離聚核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO:79-116組成之群的序列。
實施例23 - 如實施例4至22中任一項之經分離聚核苷酸，其進一步包含：位於該反向互補hAAT啟動子序列或該第一內含子元件之5′的反向互補第一編碼序列；及位於該第二內含子元件之該TTR啟動子序列之3′的第二編碼序列。
實施例24 - 如實施例23之經分離聚核苷酸，其進一步包含位於該反向互補第一編碼序列之5′的反向互補第一聚腺苷酸化序列。
實施例25 - 如實施例24之經分離聚核苷酸，其中該反向互補第一聚腺苷酸化序列包含與SEQ ID NO:33、34或35至少85%一致之序列，視情況其中該反向互補第一聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:33、34或35，視情況其中該反向互補第一聚腺苷酸化序列之序列由SEQ ID NO:33、34或35組成。
實施例26 - 如實施例23至25中任一項之經分離聚核苷酸，其進一步包含位於該第二編碼序列之3′的第二聚腺苷酸化序列。
實施例27 - 如實施例26之經分離聚核苷酸，其中該第二聚腺苷酸化序列包含與SEQ ID NO:33、34或35至少85%一致之序列，視情況其中該第二聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:33、34或35，視情況其中該第二聚腺苷酸化序列之序列由SEQ ID NO:33、34或35組成。
實施例28 - 如實施例27之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含：(a)包含與SEQ ID NO:33至少85%一致之序列的反向互補第一聚腺苷酸化序列；反向互補第一編碼序列；與選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列至少85%一致之核酸序列；第二編碼序列；及包含與SEQ ID NO:35至少85%一致之序列的第二聚腺苷酸化序列；或(b)包含與SEQ ID NO:34至少85%一致之序列的反向互補第一聚腺苷酸化序列；反向互補第一編碼序列；與選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列至少85%一致之核酸序列；第二編碼序列；及包含與SEQ ID NO:35至少85%一致之序列的第二聚腺苷酸化序列。
實施例29 - 如實施例27之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含：(a)包含SEQ ID NO:33之序列的反向互補第一聚腺苷酸化序列；反向互補第一編碼序列；選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；第二編碼序列；及包含SEQ ID NO:35之序列的第二聚腺苷酸化序列；或(b)包含SEQ ID NO:34之序列的反向互補第一聚腺苷酸化序列；反向互補第一編碼序列；選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；第二編碼序列；及包含SEQ ID NO:35之序列的第二聚腺苷酸化序列。
實施例30 - 如實施例23至29中任一項之經分離聚核苷酸，其中：(a)該第一編碼序列編碼抗體重鏈或其抗原結合片段，且該第二編碼序列編碼抗體輕鏈或其抗原結合片段；或(b)該第一編碼序列編碼抗體輕鏈或其抗原結合片段，且該第二編碼序列編碼抗體重鏈或其抗原結合片段。
實施例31 - 如實施例30之經分離聚核苷酸，其中該抗體重鏈包含SEQ ID NO:178之胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO:179之胺基酸序列。
實施例32 - 如實施例30之經分離聚核苷酸，其中： (a)該第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:178-199組成之群的核酸序列，且該第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列；或 (b)該第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列，且該第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:178-199組成之群的核酸序列。
實施例33 - 如實施例30之經分離聚核苷酸，其中：(a)該第一編碼序列及該第二編碼序列分別包含SEQ ID NO:200及181、191及209、193及211、195及213、197及215或199及217中所闡述之核酸序列。或(b)該第一編碼序列及該第二編碼序列分別包含SEQ ID NO:181及200、209及191、211及193、213及195、215及197或217及199中所闡述之核酸序列。
實施例34 - 如實施例30至33中任一項之經分離聚核苷酸，其中該第一編碼序列及/或該第二編碼序列包含訊息序列，視情況其中該訊息序列包含SEQ ID NO:167或173之胺基酸序列。
實施例35 - 如實施例30至33中任一項之經分離聚核苷酸，其中該第一編碼序列及/或第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:168-172及174-177組成之群的核酸序列。
實施例36 - 如實施例35之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含：(a) SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35；(b) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:181之反向互補序列；SEQ ID NO:168之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:174；SEQ ID NO:200；及SEQ ID NO:35；(c) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35；(d) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:193之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:211；及SEQ ID NO:35；(e) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:195之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:213；及SEQ ID NO:35；(f) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:197之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:215；及SEQ ID NO:35；或(g) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:199之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:217；及SEQ ID NO:35。
實施例37 - 如實施例1之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含：(a) SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:209之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:191；及SEQ ID NO:35；(b) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:200之反向互補序列；SEQ ID NO:174之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:168；SEQ ID NO:181；及SEQ ID NO:35；(c) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:209之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:191；及SEQ ID NO:35；(d) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:211之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:193；及SEQ ID NO:35；(e) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:213之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:195；及SEQ ID NO:35；(f) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:215之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:197；及SEQ ID NO:35；或(g) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:217之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:199；及SEQ ID NO:35。
實施例38 - 如實施例1至3中任一項之經分離聚核苷酸，其進一步包含位於該hHCR1序列或該反向互補hHCR1序列之3′的聚腺苷酸化序列或其反向互補序列。
實施例39 - 如實施例38之經分離聚核苷酸，其中該聚腺苷酸化序列為β血球蛋白聚腺苷酸化(BGpA)序列，視情況其中該BGpA序列包含與SEQ ID NO:27至少85%一致之序列，視情況其中該BGpA序列包含SEQ ID NO:27，視情況其中該BGpA序列由SEQ ID NO:27組成。
實施例40 - 一種經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含：聚腺苷酸化序列，或其反向互補序列；及TTR啟動子序列。
實施例41 - 如實施例40之經分離聚核苷酸，其中該TTR啟動子序列包含與SEQ ID NO:26至少85%一致之核酸序列，視情況該TTR啟動子序列包含SEQ ID NO:26，視情況該TTR啟動子序列由SEQ ID NO:26組成。
實施例42 - 如實施例40或41之經分離聚核苷酸，其中該聚腺苷酸化序列為β血球蛋白聚腺苷酸化(BGpA)序列，視情況其中該BGpA序列包含與SEQ ID NO:27至少85%一致之序列，視情況其中該BGpA序列包含SEQ ID NO:27，視情況其中該BGpA序列由SEQ ID NO:27組成。
實施例43 - 一種經分離聚核苷酸，其包含：(a)選自由SEQ ID NO:19、29-31、44-59、117-140、168-172、174-177及180-217組成之群的核酸序列；(b)由與SEQ ID NO:21或22至少85%一致之序列組成的hAAT啟動子序列，視情況其中該hAAT啟動子序列由SEQ ID NO:21或22組成；或(c)包含SEQ ID NO:19之hAAT啟動子序列，視情況其中該hAAT啟動子序列由SEQ ID NO:19組成。
實施例44 - 一種聚核苷酸，其為如前述實施例中任一項之聚核苷酸之互補序列。
實施例45 - 一種聚核苷酸，其為如前述實施例中任一項之聚核苷酸之反向互補序列。
實施例46 - 一種重組腺相關病毒(rAAV)基因體，其包含如前述實施例中任一項之聚核苷酸。
實施例47 - 如實施例46之rAAV基因體，其中該rAAV基因體進一步包含5′反向末端重複(5′ ITR)序列及3′反向末端重複(3′ ITR)序列。
實施例48 - 如實施例47之rAAV基因體，其中該5′ ITR核酸序列與SEQ ID NO:165中所闡述之核酸序列至少85%一致，及/或該3′ ITR核酸序列與SEQ ID NO:166中所闡述之核酸序列至少85%一致。
實施例49 - 如實施例48之rAAV基因體，其中該5′ ITR核酸序列包含SEQ ID NO:165中所闡述之核酸序列，及/或該3′ ITR核酸序列包含SEQ ID NO:166中所闡述之核酸序列。
實施例50 - 如實施例46之rAAV基因體，其中該rAAV基因體包含與SEQ ID NO:141-164中所闡述之核酸序列至少85%的核酸序列，或其互補序列。
實施例51 - 如實施例46之rAAV基因體，其中該rAAV基因體包含SEQ ID NO:141-164中所闡述之核酸序列，或其互補序列。
實施例52 - 如實施例46至51中任一項之rAAV基因體，其中該rAAV基因體為單股rAAV基因體。
實施例53 - 如實施例46至51中任一項之rAAV基因體，其中該rAAV基因體為自互補rAAV基因體。
實施例54 - 一種核酸載體，其包含如前述實施例中任一項之經分離聚核苷酸或rAAV基因體，視情況其中該核酸載體為質體、病毒或DNA最小載體。
實施例55 - 一種rAAV，其包含：包含AAV衣殼蛋白之AAV衣殼；及如實施例46至53中任一項之rAAV基因體。
實施例56 - 如實施例55之rAAV，其中該衣殼蛋白係選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAV-DJ、AAV-LK03、NP59、VOY101、VOY201、VOY701、VOY801、VOY1101、AAVPHP.N、AAVPHP.A、AAVPHP.B、PHP.B2、PHP.B3、G2A3、G2B4、G2B5及PHP.S。
實施例57 - 如實施例55或56之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸203-736之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。
實施例58 - 如實施例57之rAAV，其中：該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸206的胺基酸為C；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸296的胺基酸為H；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸312的胺基酸為Q；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸346的胺基酸為A；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸464的胺基酸為N；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸468的胺基酸為S；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸501的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸590的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸681的胺基酸為M；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸687的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸690的胺基酸為K；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸706的胺基酸為C；或該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸718的胺基酸為G。
實施例59 - 如實施例57之rAAV，其中：(a)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為G，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸718的胺基酸為G；(b)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸296的胺基酸為H，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸464的胺基酸為N，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸681的胺基酸為M；(c)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸687的胺基酸為R；(d)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸346的胺基酸為A，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R；或(e)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸501的胺基酸為I，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸706的胺基酸為C。
實施例60 - 如實施例57之rAAV，其中該衣殼蛋白包含SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸203-736的胺基酸序列。
實施例61 - 如實施例60之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白係由SEQ ID NO:16之核苷酸607-2208之核酸序列編碼。
實施例62 - 如實施例55或56之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸138-736之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。
實施例63 - 如實施例62之rAAV，其中：該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸151的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸160的胺基酸為D；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸206的胺基酸為C；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸296的胺基酸為H；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸312的胺基酸為Q；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸346的胺基酸為A；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸464的胺基酸為N；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸468的胺基酸為S；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸501的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸590的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸681的胺基酸為M；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸687的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸690的胺基酸為K；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸706的胺基酸為C；或該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸718的胺基酸為G。
實施例64 - 如實施例63之rAAV，其中：(a)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為G，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸718的胺基酸為G；(b)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸296的胺基酸為H，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸464的胺基酸為N，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸681的胺基酸為M；(c)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸687的胺基酸為R；(d)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸346的胺基酸為A，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R；或(e)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸501的胺基酸為I，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸706的胺基酸為C。
實施例65 - 如實施例63之rAAV，其中該衣殼蛋白包含SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸138-736的胺基酸序列。
實施例66 - 如實施例63之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白係由SEQ ID NO:16之核苷酸414-2208之核酸序列編碼。
實施例67 - 如實施例55或56之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸1-736之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。
實施例68 - 如實施例67之rAAV，其中：該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸2的胺基酸為T；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸65的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸68的胺基酸為V；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸77的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸119的胺基酸為L；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸151的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸160的胺基酸為D；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸206的胺基酸為C；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸296的胺基酸為H；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸312的胺基酸為Q；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸346的胺基酸為A；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸464的胺基酸為N；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸468的胺基酸為S；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸501的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸590的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸681的胺基酸為M；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸687的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸690的胺基酸為K；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸706的胺基酸為C；或該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸718的胺基酸為G。
實施例69 - 如實施例68之rAAV，其中：(a)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸2的胺基酸為T，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸312的胺基酸為Q；(b)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸65的胺基酸為I，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為Y；(c)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸77的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸690的胺基酸為K；(d)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸119的胺基酸為L，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸468的胺基酸為S；(e)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為G，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸718的胺基酸為G；(f)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸296的胺基酸為H，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸464的胺基酸為N，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸681的胺基酸為M；(g)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸687的胺基酸為R；(h)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸346的胺基酸為A，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R；或(i)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸501的胺基酸為I，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸706的胺基酸為C。
實施例70 - 如實施例68之rAAV，其中該衣殼蛋白包含SEQ ID NO:1-15之胺基酸1-736之胺基酸序列。
實施例71 - 如實施例70之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白係由SEQ ID NO:16中所闡述之核酸序列編碼。
實施例72 - 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至45中任一項之聚核苷酸、如實施例46至54中任一項之rAAV基因體或如實施例55至71中任一項之rAAV。
實施例73 - 一種用於製備rAAV之封裝系統，其中該封裝系統包含：(a)第一核酸序列，其編碼一或多種AAV Rep蛋白；(b) 第二核酸序列，其編碼如實施例55至71中任一項之rAAV之衣殼蛋白；及(c)第三核酸序列，其包含如實施例46至53中任一項之rAAV之rAAV基因體序列。
實施例74 - 如實施例73之封裝系統，其中該封裝系統包含含有該第一核酸序列及該第二核酸序列之第一載體，以及含有該第三核酸序列之第二載體。
實施例75 - 如實施例73或74之封裝系統，其進一步包含含有一或多個輔助病毒基因之第四核酸序列。
實施例76 - 如實施例75之封裝系統，其中該第四核酸序列包含於第三載體內。
實施例77 - 如實施例75或76之封裝系統，其中該第四核酸序列包含一或多個來自選自由以下組成之群之病毒的基因：腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒及巨細胞病毒(CMV)。
實施例78 - 如實施例73至77中任一項之封裝系統，其中該第一載體、該第二載體及/或該第三載體為質體或DNA最小載體。
實施例79 - 一種用於重組製備rAAV之方法，該方法包含在產生該rAAV之條件下將如實施例73至78中任一項之封裝系統引入細胞中。
實施例80 - 如實施例55至71中任一項之rAAV、如實施例1至45中任一項之聚核苷酸、如實施例46至54中任一項之rAAV基因體或如實施例72之醫藥組合物，其用作藥劑。
實施例81 - 如實施例55至71中任一項之rAAV、如實施例1至45中任一項之聚核苷酸、如實施例46至54中任一項之rAAV基因體或如實施例72之醫藥組合物，其用於治療補體C5相關疾病。
實施例82 - 如實施例55至71中任一項之rAAV、如實施例1至45中任一項之聚核苷酸、如實施例46至54中任一項之rAAV基因體或如實施例72之醫藥組合物，其用於治療患有補體C5相關疾病之個體的方法中，該方法包含向該個體投與有效量的該rAAV、該醫藥組合物或該聚核苷酸。
實施例83 - 一種在個體中產生抗體之方法，該方法包含向該個體投與如實施例55至71中任一項之rAAV、如實施例1至45中任一項之聚核苷酸、如實施例46至54中任一項之rAAV基因體或如實施例72之醫藥組合物。
實施例84 - 一種治療有需要之個體之補體C5相關疾病的方法，該方法包含向該個體投與有效量的如實施例55至71中任一項之rAAV、如實施例1至45中任一項之聚核苷酸、如實施例46至54中任一項之rAAV基因體或如實施例72之醫藥組合物。
實施例85 - 如實施例84之方法，其中該補體C5相關疾病係選自由以下組成之群：地圖狀萎縮(geographic atrophy；GA)、格林-巴利症候群(Guillain-Barré syndrome)、重症肌無力、全身性紅斑性狼瘡(SLE)腎炎、增殖性腎炎、哮喘、類風濕性關節炎、敗血症、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、非典型性溶血性尿毒性症候群(aHUS)、視神經脊髓炎譜系病症(NMOSD)及年齡相關之黃斑變性(AMD)。
實施例86 - 如實施例83至85中任一項之方法，其中該rAAV、該聚核苷酸、該rAAV基因體或該醫藥組合物係靜脈內投與。
在前述實施例中之任一者中且對於本文所揭示之所有聚核苷酸，存在於聚核苷酸中之任一者中的個別序列元件(例如，hAAT啟動子序列、hHCR序列等)可為連續的或可具有插入於序列元件之間的額外核苷酸。在某些實施例中，至少2個(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個)個別序列元件為連續的。在某些實施例中，所有個別序列元件均為連續的。
相關申請案
本申請案主張2022年3月11日申請之美國臨時專利申請案第63/269,192號之優先權，其全部揭示內容以引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案含有序列表，其已以電子方式提交且以ST.26格式在此以全文引用之方式併入(創建於2023年3月9日之該ST.26副本命名為「HMW-053WO.XML」且大小為524,319個位元組)。
本文提供包含新穎雙向雙重表現卡匣之聚核苷酸、包含此等聚核苷酸之重組腺相關病毒(rAAV)以及製造及使用該等聚核苷酸及該rAAV之方法。亦提供新穎的轉錄控制元件(例如，啟動子、增強子、內含子、聚腺苷酸化序列及其組合)及新穎的抗體編碼序列。 I. 定義
如本文所使用，術語「人類α1-抗胰蛋白酶啟動子序列」或「hAAT啟動子序列」係指經分離轉錄調控元件，其包含當在相同條件下比較時與SEQ ID NO:21至少75%一致且展現至少與SEQ ID NO:21之核酸序列之啟動子活性相同之啟動子活性的核酸序列。
如本文所使用，術語「人類肝臟控制區1序列」或「hHCR1序列」係指經分離轉錄調控元件，其包含當在相同條件下比較時與SEQ ID NO:24至少75%一致且展現至少與SEQ ID NO:24之核酸序列之啟動子轉錄增強子活性相同之轉錄增強子活性的核酸序列。
如本文所使用，術語「甲狀腺素運載蛋白啟動子序列」或「TTR啟動子序列」係指經分離轉錄調控元件，其包含當在相同條件下比較時與SEQ ID NO:26至少75%一致且展現至少與SEQ ID NO:26之核酸序列之啟動子活性相同之啟動子活性的核酸序列。
如本文所使用，術語「β血球蛋白聚腺苷酸化序列」或「BGpA序列」係指經分離轉錄調控元件，其包含與SEQ ID NO:27至少75%一致且保留SEQ ID NO:27中所闡述之聚腺苷酸化序列的核酸序列。
如本文所使用，術語「反向互補序列」具有其此項技術中公認的含義。舉例而言，hHCR1序列及對應反向互補hHCR1序列分別闡述於SEQ ID NO:22及23中。
如本文所使用，在經分離核酸序列或聚核苷酸之情形中，術語「經分離」係指與核酸序列在自然界中存在的基因背景分離。
如本文所使用，術語「重組腺相關病毒」或「rAAV」係指包含缺乏功能性rep及cap基因之基因體的AAV。
如本文所使用，術語「rAAV基因體」係指包含rAAV之基因體序列的核酸分子(例如，DNA及/或RNA)。熟習此項技術者將瞭解，rAAV基因體包含轉殖基因(例如可操作地連接至轉錄調控元件之抗體重鏈或輕鏈編碼序列)時，該rAAV基因體可相對於轉殖基因之轉錄方向處於有義或反義定向。
如本文所使用，術語「AAV衣殼蛋白」係指AAV VP1、VP2或VP3衣殼蛋白。
如本文所使用，兩個核苷酸序列之間或兩個胺基酸序列之間的「一致性百分比」係藉由將比對序列對之間的匹配數乘以100，且除以比對區域的長度(包括內部間隙)來計算。一致性評分僅對完美匹配進行計數，且不考慮胺基酸彼此的相似性程度。當序列在本文中描述為與參考序列一致某一百分比時，與參考序列之一致性百分比係在參考序列之全長中測定。
當核酸序列在本文中被稱作「由」特定序列「組成」時，術語「由...組成」意欲僅限制核酸序列中之核苷酸序列。其不意欲排除核酸序列之核苷酸包含修飾(例如，甲基化、乙醯化等)或連接至另一分子。舉例而言，術語「由SEQ ID NO:17組成之hAAT啟動子序列」意謂hAAT啟動子序列僅含有SEQ ID NO:17中所闡述之核苷酸序列(且無來自hAAT啟動子之額外序列)。其不排除hAAT啟動子序列中之核苷酸包含鹼基修飾(例如，甲基化、乙醯化等)或連接至另一分子(例如，hHCR1序列)。
如本文所使用，術語「編碼序列」係指編碼多肽的互補DNA (cDNA)之部分，在起始密碼子處開始且在終止密碼子處結束。
如本文所使用，術語「聚腺苷酸化序列」係指當轉錄成RNA時構成聚腺苷酸化訊息序列的DNA序列，因為該術語為此項技術中已知(例如，RNA序列AAUAAA)。聚腺苷酸化序列可為(但不限於)天然存在的或合成的。
如本文所使用，術語「內含子元件」係指包含內含子之順式作用核苷酸序列。在某些實施例中，內含子元件包含經修飾之內含子，例如合成內含子序列。在某些實施例中，內含子元件包含與其所在的轉殖基因外源的內含子。在某些實施例中，內含子元件包含產生更強健剪接活性之經修飾剪接受體及/或剪接供體。雖然不想被理論所束縛，但假設此類內含子可增加轉殖基因的表現，例如藉由減少轉錄緘默及增強自細胞核至細胞質之mRNA輸出。熟練工作人員將瞭解，合成內含子序列可藉由引入此項技術中已知的任何共有剪接模體來設計以介導RNA剪接( 例如，在Sibley等人, (2016) Nature Reviews Genetics, 17, 407-21中，其以全文引用之方式併入本文中)。例示性內含子序列提供於Lu等人 (2013) Molecular Therapy 21(5): 954-63，及Lu等人 (2017) Hum. Gene Ther. 28(1): 125-34中，其以全文引用之方式併入本文中。
如本文所使用，在向個體投與物質之情形中，術語「有效量」係指實現所需治療作用的物質之量。 II. 聚核苷酸及核酸載體
本文提供適用於雙向雙重表現構築體之新穎聚核苷酸。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其包含hAAT啟動子序列及hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：反向互補hAAT啟動子序列；及hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:17至少85%一致之序列組成的反向互補hAAT啟動子序列，及由與SEQ ID NO:22至少85%一致之序列組成的hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:17至少85%一致之序列組成的反向互補hAAT啟動子序列，及由與SEQ ID NO:23至少85%一致之序列組成的反向互補hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:18至少85%一致之序列組成的反向互補hAAT啟動子序列，及由與SEQ ID NO:22至少85%一致之序列組成的hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:18至少85%一致之序列組成的反向互補hAAT啟動子序列，及由與SEQ ID NO:23至少85%一致之序列組成的反向互補hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:20至少85%一致之序列組成的反向互補hAAT啟動子序列，及由與SEQ ID NO:22至少85%一致之序列組成的hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:20至少85%一致之序列組成的反向互補hAAT啟動子序列，及由與SEQ ID NO:23至少85%一致之序列組成的反向互補hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:17至少85%一致之序列組成的反向互補hAAT啟動子序列，及由與SEQ ID NO:24至少85%一致之序列組成的hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:18至少85%一致之序列組成的反向互補hAAT啟動子序列，及由與SEQ ID NO:24至少85%一致之序列組成的hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:18至少85%一致之序列組成的反向互補hAAT啟動子序列，及由與SEQ ID NO:25至少85%一致之序列組成的反向互補hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:20至少85%一致之序列組成的反向互補hAAT啟動子序列，及由與SEQ ID NO:24至少85%一致之序列組成的hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:20至少85%一致之序列組成的反向互補hAAT啟動子序列，及由與SEQ ID NO:25至少85%一致之序列組成的反向互補hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:17組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:22組成之hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:17組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:23組成之反向互補hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:18組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:22組成之hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:18組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:23組成之反向互補hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:20組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:22組成之hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:20組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:23組成之反向互補hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:17組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:24組成之hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:18組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:24組成之hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:18組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:25組成之反向互補hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:20組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:24組成之hHCR1序列。在某些實施例中，聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:20組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:25組成之反向互補hHCR1序列。
在某些實施例中，經分離聚核苷酸包含選自由SEQ ID NO:36-40及72組成之群的序列。
在前述實施例中之各者之某些實施例中，經分離聚核苷酸進一步包含位於hHCR1序列或反向互補hHCR1序列之3′的TTR啟動子序列。在某些實施例中，TTR啟動子序列包含與SEQ ID NO:26至少85%一致之核酸序列。在某些實施例中，TTR啟動子序列由與SEQ ID NO:26至少85%一致之序列組成。在某些實施例中，TTR啟動子序列包含SEQ ID NO:26。在某些實施例中，TTR啟動子序列由SEQ ID NO:26組成。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含：hHCR1序列，及TTR啟動子序列。
在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:22至少85%一致之序列組成的hHCR1序列，及由與SEQ ID NO:26至少85%一致之序列組成的TTR啟動子序列。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:22組成之hHCR1序列，及由SEQ ID NO:26組成之TTR啟動子序列。
在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:23至少85%一致之序列組成的反向互補hHCR1序列，及由與SEQ ID NO:26至少85%一致之序列組成的TTR啟動子序列。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:23組成之反向互補hHCR1序列，及由SEQ ID NO:26組成之TTR啟動子序列。
在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:24至少85%一致之序列組成的hHCR1序列，及由與SEQ ID NO:26至少85%一致之序列組成的TTR啟動子序列。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:24組成之hHCR1序列，及由SEQ ID NO:26組成之TTR啟動子序列。
在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：由與SEQ ID NO:25至少85%一致之序列組成的反向互補hHCR1序列，及由與SEQ ID NO:26至少85%一致之序列組成的TTR啟動子序列。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：由SEQ ID NO:25組成之反向互補hHCR1序列，及由SEQ ID NO:26組成之TTR啟動子序列。
在某些實施例中，經分離聚核苷酸包含選自由SEQ ID NO:41-43組成之群的序列。
在前述實施例中之各者之某些實施例中，經分離聚核苷酸進一步包含插入於hHCR1序列或反向互補hHCR1序列與TTR啟動子序列之間的聚腺苷酸化序列或其反向互補序列。在某些實施例中，聚腺苷酸化序列為BGpA序列。在某些實施例中，BGpA序列包含與SEQ ID NO:27至少85%一致之序列。在某些實施例中，BGpA序列由與SEQ ID NO:27至少85%一致之序列組成。在某些實施例中，BGpA序列包含SEQ ID NO:27。在某些實施例中，BGpA序列由SEQ ID NO:27組成。
在某些實施例中，經分離聚核苷酸包含與選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的序列至少85%一致之序列。在某些實施例中，經分離聚核苷酸包含選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的序列。
在前述實施例中之各者之某些實施例中，經分離聚核苷酸進一步包含位於反向互補hAAT啟動子序列之5′的第一內含子元件。在前述實施例中之各者之某些實施例中，經分離聚核苷酸進一步包含位於TTR啟動子序列之3′的第二內含子元件。
任何內含子元件可用作本文所揭示之聚核苷酸中之第一或第二內含子元件。內含子元件可為天然存在的或合成的(例如，嵌合內含子元件)。在某些實施例中，第一內含子元件包含與SEQ ID NO:28、29、30、31或32至少85%一致之序列，視情況其中第一內含子元件包含SEQ ID NO:28、29、30、31或32，視情況其中第一內含子元件之序列由SEQ ID NO:28、29、30、31或32組成。在某些實施例中，第二內含子元件包含與SEQ ID NO:28、29、30、31或32至少85%一致之序列，視情況其中第二內含子元件包含SEQ ID NO:28、29、30、31或32，視情況其中第二內含子元件之序列由SEQ ID NO:28、29、30、31或32組成。
在某些實施例中，本文所揭示之聚核苷酸自5′至3′包含：(a)包含與SEQ ID NO:28至少85%一致之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含與SEQ ID NO:29至少85%一致之序列的第二內含子元件；(b)包含與SEQ ID NO:28至少85%一致之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含與SEQ ID NO:30至少85%一致之序列的第二內含子元件；(c)包含與SEQ ID NO:28至少85%一致之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含與SEQ ID NO:31至少85%一致之序列的第二內含子元件；或(d)包含與SEQ ID NO:28至少85%一致之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含與SEQ ID NO:32至少85%一致之序列的第二內含子元件。
在某些實施例中，本文所揭示之聚核苷酸自5′至3′包含：(a)包含SEQ ID NO:28之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含SEQ ID NO:29之序列的第二內含子元件；(b)包含SEQ ID NO:28之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含SEQ ID NO:30之序列的第二內含子元件；(c)包含SEQ ID NO:28之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含SEQ ID NO:31之序列的第二內含子元件；或(d)包含SEQ ID NO:28之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含SEQ ID NO:32之序列的第二內含子元件。
在某些實施例中，本文所揭示之聚核苷酸包含與選自由SEQ ID NO:79-116組成之群的序列至少85%一致之序列。在某些實施例中，本文所揭示之聚核苷酸包含選自由SEQ ID NO:79-116組成之群的序列。
前述聚核苷酸適用於有效同時表現兩個編碼序列。因此，在前述實施例中之各者之某些實施例中，聚核苷酸進一步包含：位於反向互補hAAT啟動子序列或第一內含子元件之5′的反向互補第一編碼序列；及位於該第二內含子元件之該TTR啟動子序列之3′的第二編碼序列。
在前述實施例中之各者之某些實施例中，該聚核苷酸進一步包含：位於反向互補第一編碼序列之5′的反向互補第一聚腺苷酸化序列；及/或位於第二編碼序列之3′的第二聚腺苷酸化序列。任何聚腺苷酸化序列可用作本文所揭示之聚核苷酸中之第一及/或第二聚腺苷酸化序列。舉例而言，在某些實施例中，反向互補第一聚腺苷酸化序列包含與SEQ ID NO:33、34或35至少85%一致之序列，視情況其中反向互補第一聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:33、34或35，視情況其中反向互補第一聚腺苷酸化序列之序列由SEQ ID NO:33、34或35組成；及/或第二聚腺苷酸化序列包含與SEQ ID NO:33、34或35至少85%一致之序列，視情況其中第二聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:33、34或35，視情況其中第二聚腺苷酸化序列之序列由SEQ ID NO:33、34或35組成。
在某些實施例中，本文所揭示之經分離聚核苷酸自5′至3′包含：(a)包含與SEQ ID NO:33至少85%一致之序列的反向互補第一聚腺苷酸化序列；反向互補第一編碼序列；與選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列至少85%一致之核酸序列；第二編碼序列；及包含與SEQ ID NO:35至少85%一致之序列的第二聚腺苷酸化序列；或(b)包含與SEQ ID NO:34至少85%一致之序列的反向互補第一聚腺苷酸化序列；反向互補第一編碼序列；與選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列至少85%一致之核酸序列；第二編碼序列；及包含與SEQ ID NO:35至少85%一致之序列的第二聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，本文所揭示之經分離聚核苷酸自5′至3′包含：(a)包含SEQ ID NO:33之序列的反向互補第一聚腺苷酸化序列；反向互補第一編碼序列；選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；第二編碼序列；及包含SEQ ID NO:35之序列的第二聚腺苷酸化序列；或(b)包含SEQ ID NO:34之序列的反向互補第一聚腺苷酸化序列；反向互補第一編碼序列；選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；第二編碼序列；及包含SEQ ID NO:35之序列的第二聚腺苷酸化序列。
任何兩個編碼序列可使用本文所揭示之聚核苷酸表現。在某些實施例中，第一及第二編碼序列編碼異源多聚體蛋白質之兩個多肽鏈，例如抗體或T細胞受體之兩個不同多肽鏈。在某些實施例中，第一編碼序列編碼抗體重鏈或其抗原結合片段，且第二編碼序列編碼抗體輕鏈或其抗原結合片段。在某些實施例中，第一編碼序列編碼抗體輕鏈或其抗原結合片段，且第二編碼序列編碼抗體重鏈或其抗原結合片段。
任何抗體或其抗原結合片段可使用本文所揭示之聚核苷酸表現。適合抗體包括但不限於莫羅單抗(muromonab)-cd3、依法利珠單抗(efalizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、達利珠單抗(daclizumab)、奈巴庫單抗(nebacumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、依決洛單抗(edrecolomab)、阿昔單抗(abciximab)、利妥昔單抗(rituximab)、巴利昔單抗(basiliximab)、帕利珠單抗(palivizumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、阿達木單抗(adalimumab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、奧馬珠單抗(omalizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、那他珠單抗(natalizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、雷珠單抗(ranibizumab)、依庫珠單抗(eculizumab)、賽妥珠單抗(certolizumab)、烏司奴單抗(ustekinumab)、卡那單抗(canakinumab)、戈利木單抗(golimumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、托珠單抗(tocilizumab)、地諾單抗(denosumab)、貝利單抗(belimumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、維布妥昔單抗(brentuximab vedotin)、帕妥株單抗(pertuzumab)、雷昔庫單抗(raxibacumab)、奧比妥珠單抗(obinutuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、博納吐單抗(blinatumomab)、納武單抗(nivolumab)、帕博利珠單抗(pembrolizumab)、依達賽珠單抗(idarucizumab)、耐昔妥珠單抗(necitumumab)、地努圖希單抗(dinutuximab)、蘇金單抗(secukinumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、阿莫羅布單抗(alirocumab)、依洛尤單抗(evolocumab)、達雷妥尤單抗(daratumumab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、依奇珠單抗(ixekizumab)、瑞替珠單抗(reslizumab)、奧拉單抗(olaratumab)、貝洛托舒單抗(bezlotoxumab)、阿替利珠單抗(atezolizumab)、奧托薩昔單抗(obiltoxaximab)、奧英妥珠單抗(inotuzumab ozogamicin)、柏達魯單抗(brodalumab)、古塞庫單抗(guselkumab)、度普利尤單抗(dupilumab)、賽瑞單抗(sarilumab)、阿維單抗(avelumab)、奧瑞珠單抗(ocrelizumab)、艾美賽珠單抗(emicizumab)、貝那珠單抗(benralizumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab ozogamicin)、德瓦魯單抗(durvalumab)、布洛舒單抗(burosumab)、厄瑞努單抗(erenumab)、伽奈珠單抗(galcanezumab)、拉那魯單抗(lanadelumab)、莫格利珠單抗(mogamulizumab)、替拉珠單抗(tildrakizumab)、西米普利單抗(cemiplimab)、瑞瑪奈珠單抗(fremanezumab)、依庫珠單抗(ravulizumab)、依瑪魯單抗(emapalumab)、伊巴珠單抗(ibalizumab)、美妥莫單抗(moxetumomab)、卡帕珠單抗(caplacizumab)、羅莫單抗(romosozumab)、瑞莎珠單抗(risankizumab)、泊洛妥珠單抗(polatuzumab)、艾普奈珠單抗(eptinezumab)、樂利單抗(leronlimab)、戈沙妥珠單抗(sacituzumab)、布西珠單抗(brolucizumab)、艾薩妥昔單抗(isatuximab)及替妥木單抗(teprotumumab)。在某些實施例中，抗體重鏈包含SEQ ID NO:178之胺基酸序列，及/或及/或輕鏈包含SEQ ID NO:179之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一及/或第二編碼序列包含已經最佳化以改善表現、改善聚核苷酸穩定性及/或降低免疫原性的編碼序列。
在某些實施例中，第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:180-199組成之群的核酸序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:180-199組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列及第二編碼序列分別包含SEQ ID NO:181及200、191及209、193及211、195及213、197及215或199及217中所闡述之核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列及第一編碼序列分別包含SEQ ID NO:181及200、191及209、193及211、195及213、197及215或199及217中所闡述之核酸序列。
在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:180之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:181之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:182之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:183之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:184之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:185之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:186之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:187之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:188之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:189之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:190之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:191之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:192之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:193之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:194之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:195之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:196之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:197之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:198之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列包含選自SEQ ID NO:199之序列，且第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:180之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:181之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:182之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:183之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:184之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:185之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:186之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:187之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:188之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:189之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:190之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:191之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:192之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:193之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:194之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:195之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:196之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:197之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:198之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。在某些實施例中，第二編碼序列包含選自SEQ ID NO:199之序列，且第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列。
在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:181之反向互補序列；SEQ ID NO:168之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:174；SEQ ID NO:200；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:193之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:211；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:195之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:213；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:197之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:215；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:199之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:217；及SEQ ID NO:35。
在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:209之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:191；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:200之反向互補序列；SEQ ID NO:174之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:168；SEQ ID NO:181；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:209之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:191；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:211之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:193；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:213之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:195；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:215之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:197；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，經分離聚核苷酸自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:217之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:199；及SEQ ID NO:35。
在某些實施例中，第一編碼序列及/或第二編碼序列包含訊息序列。可導引自哺乳動物細胞分泌多肽的任何訊息序列為適合的。在某些實施例中，訊息序列包含SEQ ID NO:167或173之胺基酸序列。在某些實施例中，第一編碼序列及/或第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:168-172及174-177組成之群的核酸序列。
在某些實施例中，本發明提供聚核苷酸，其自5′至3′包含以下：SEQ ID NO:168及SEQ ID NO:180-217中之任一者；SEQ ID NO:169及SEQ ID NO:180-217中之任一者；SEQ ID NO:170及SEQ ID NO:180-217中之任一者；SEQ ID NO:171及SEQ ID NO:180-217中之任一者；SEQ ID NO:172及SEQ ID NO:180-217中之任一者；SEQ ID NO:174及SEQ ID NO:180-217中之任一者；SEQ ID NO:175及SEQ ID NO:180-217中之任一者；SEQ ID NO:176及SEQ ID NO:180-217中之任一者；或SEQ ID NO:177及SEQ ID NO:180-217中之任一者。
在某些實施例中，本發明提供一種聚核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO:19、29-31、44-59、117-140、168-172、174-177及180-217組成之群的核酸序列。
在某些實施例中，本發明提供聚核苷酸，其包含由與SEQ ID NO:21或22至少85%一致之序列組成的hAAT啟動子序列，視情況其中hAAT啟動子序列由SEQ ID NO:21或22組成。
在某些實施例中，本發明提供聚核苷酸，其包含含有SEQ ID NO:19之hAAT啟動子序列，視情況其中hAAT啟動子序列由SEQ ID NO:19組成。
在某些實施例中，聚核苷酸包含於rAAV基因體內，rAAV基因體包含5′反向末端重複(5′ ITR)序列及3′反向末端重複(3′ ITR)序列。任何5′及3′ AAV ITR序列可用於rAAV基因體中。在某些實施例中，5′ ITR核酸序列與SEQ ID NO:165中所闡述之核酸序列至少85%一致，及/或3′ ITR核酸序列與SEQ ID NO:166中所闡述之核酸序列至少85%一致。在某些實施例中，5′ ITR核酸序列包含SEQ ID NO:165中所闡述之核酸序列，及/或3′ ITR核酸序列包含SEQ ID NO:166中所闡述之核酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體包含與SEQ ID NO:141-164中所闡述之核酸序列至少85%的核酸序列，或其互補序列。例示性rAAV基因體闡述於本文表1中。表1中存在於rAAV基因體中之任一者中的個別序列元件(例如，hAAT啟動子序列、hHCR序列等)可為連續的或可具有插入於序列元件之間的額外核苷酸。在某些實施例中，至少2個(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個)個別序列元件為連續的。在某些實施例中，所有個別序列元件均為連續的。
在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:181之反向互補序列；SEQ ID NO:168之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:174；SEQ ID NO:200；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:181之反向互補序列；SEQ ID NO:168之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:174；SEQ ID NO:200；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:181之反向互補序列；SEQ ID NO:168之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:174；SEQ ID NO:200；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:181之反向互補序列；SEQ ID NO:168之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:174；SEQ ID NO:200；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:181之反向互補序列；SEQ ID NO:168之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:174；SEQ ID NO:200；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:181之反向互補序列；SEQ ID NO:168之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:174；SEQ ID NO:200；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:193之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:211；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:195之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:213；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:197之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:215；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:199之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:217；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:181之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:200；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。在某些實施例中，rAAV基因體自5′至3′包含：SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35。
在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO:141-164中所闡述之核酸序列，或其互補序列。在某些實施例中，rAAV基因體為單股rAAV基因體。在某些實施例中，rAAV基因體為自互補rAAV基因體。 表 1 ：例示性 rAAV 基因體
基因體 主要序列元件之 SEQ ID NO ( 右至左 =5′ 至 3′)(RC表示給定SEQ ID NO中之序列之反向互補序列) 基因體序列減去 ITR 全基因體序列
E1-100 34 181之RC 168之RC 28 17 25 27 218 32 174 200 35 - 219
E24 34 181之RC 168之RC 28 17 25 無 26 32 174 200 35 117 141
E27 34 181之RC 168之RC 28 17 22 無 26 32 174 200 35 118 142
E28 34 181之RC 168之RC 28 17 23 無 26 32 174 200 35 119 143
E31 34 181之RC 168之RC 28 20 22 無 26 32 174 200 35 120 144
E32 34 181之RC 168之RC 28 20 23 無 26 32 174 200 35 121 145
E37 34 181之RC 168之RC 28 17 25 27 26 32 174 200 35 122 146
E40 34 191之RC 172之RC 28 17 22 無 26 32 177 209 35 123 147
E41 34 193之RC 172之RC 28 17 22 無 26 32 177 211 35 124 148
E42 34 195之RC 172之RC 28 17 22 無 26 32 177 213 35 125 149
E43 34 197之RC 172之RC 28 17 22 無 26 32 177 215 35 126 150
E44 34 199之RC 172之RC 28 17 22 無 26 32 177 217 35 127 151
E45 34 191之RC 172之RC 28 17 25 無 26 32 177 209 35 128 152
E46 34 191之RC 172之RC 28 17 23 無 26 32 177 209 35 129 153
E47 34 191之RC 172之RC 28 20 22 無 26 32 177 209 35 130 154
E48 34 191之RC 172之RC 28 20 23 無 26 32 177 209 35 131 155
E49 33 191之RC 172之RC 28 18 22 無 26 31 177 209 35 132 156
E50 33 191之RC 172之RC 28 17 22 無 26 31 177 209 35 133 157
E51 33 191之RC 172之RC 28 17 22 無 26 32 177 209 35 134 158
E52 34 191之RC 172之RC 28 17 22 無 26 29 177 209 35 135 159
E53 33 191之RC 172之RC 28 17 22 無 26 29 177 209 35 136 160
E54 34 181之RC 168之RC 28 17 25 無 26 32 177 200 35 137 161
E55 33 191之RC 172之RC 28 17 22 27 26 29 177 209 35 138 162
E56 34 191之RC 172之RC 28 17 25 27 26 29 177 209 35 139 163
E57 34 191之RC 172之RC 28 20 22 27 26 29 177 209 35 140 164
E97 220 191之RC 172之RC 28 17 22 無 26 29 177 209 35 221 222
本文所揭示之聚核苷酸或rAAV基因體可為雙股或單股。在某些實施例中，本發明提供一種聚核苷酸，其為如前述實施例中任一項之聚核苷酸之互補序列。
在某些實施例中，本發明提供包含如前述實施例中任一項之經分離聚核苷酸或rAAV基因體的核酸載體。可容納如前述實施例中任一項之聚核苷酸或rAAV基因體的任何核酸載體為適合的。在某些實施例中，核酸載體為質體、病毒或DNA最小載體。適合的DNA最小載體包括(但不限於)直鏈共價閉合DNA (例如 ，微串DNA)、直鏈共價封閉啞鈴狀DNA (例如 ，狗骨頭DNA、啞鈴DNA)、微環、Nanoplasmids™、簡約免疫學定義之基因表現(MIDGE)載體及熟習此項技術者已知之其他載體。DNA最小載體及其產生方法描述於 例如美國專利申請案第20100233814號、第20120282283號、第20130216562號、第20150218565號、第20150218586號、第20160008488號、第20160215296號、第20160355827號、第20190185924號、第20200277624號及第20210010021號中，其皆以全文引用之方式併入本文中。 III. 腺相關病毒組合物
在另一態樣中，本發明提供一種rAAV，其包含：包含AAV衣殼蛋白之AAV衣殼；及本文所揭示之rAAV基因體。
任何衣殼蛋白可用於本文所揭示之rAAV中，包括但不限於AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAV-DJ、AAV-LK03、NP59、VOY101、VOY201、VOY701、VOY801、VOY1101、AAVPHP.N、AAVPHP.A、AAVPHP.B、PHP.B2、PHP.B3、G2A3、G2B4、G2B5及PHP.S。
舉例而言，在某些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸203-736之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在某些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸203-736之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，其中：該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸206的胺基酸為C；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸296的胺基酸為H；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸312的胺基酸為Q；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸346的胺基酸為A；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸464的胺基酸為N；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸468的胺基酸為S；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸501的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸590的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸681的胺基酸為M；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸687的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸690的胺基酸為K；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸706的胺基酸為C；或該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸718的胺基酸為G。
在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸626的胺基酸為G，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸718的胺基酸為G。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸296的胺基酸為H，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸464的胺基酸為N，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸681的胺基酸為M。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸687的胺基酸為R。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸346的胺基酸為A，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸501的胺基酸為I，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸706的胺基酸為C。在某些實施例中，該衣殼蛋白包含SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸203-736的胺基酸序列。
舉例而言，在某些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸138-736之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在某些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸138-736之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，其中：該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸151的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸160的胺基酸為D；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸206的胺基酸為C；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸296的胺基酸為H；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸312的胺基酸為Q；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸346的胺基酸為A；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸464的胺基酸為N；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸468的胺基酸為S；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸501的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸590的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸626的胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸681的胺基酸為M；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸687的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸690的胺基酸為K；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸706的胺基酸為C；或該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸718胺基酸為G。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸626的胺基酸為G，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸718的胺基酸為G。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸296的胺基酸為H，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸464的胺基酸為N，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸681的胺基酸為M。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸687的胺基酸為R。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸346的胺基酸為A，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸501的胺基酸為I，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸706的胺基酸為C。在某些實施例中，該衣殼蛋白包含SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸138-736的胺基酸序列。
舉例而言，在某些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸1-736之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在某些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸1-736之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，其中：該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸2的胺基酸為T；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸65的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸68的胺基酸為V；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸77的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸119的胺基酸為L；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸151的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸160的胺基酸為D；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸206的胺基酸為C；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸296的胺基酸為H；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸312的胺基酸為Q；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸346的胺基酸為A；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸464的胺基酸為N；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸468的胺基酸為S；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸501的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸590的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸626的胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸681的胺基酸為M；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸687的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸690的胺基酸為K；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸706的胺基酸為C；或該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸718的胺基酸為G。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸2的胺基酸為T，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸312的胺基酸為Q。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸65的胺基酸為I，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸626的胺基酸為Y。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸77的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸690的胺基酸為K。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸119的胺基酸為L，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸468的胺基酸為S。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸626的胺基酸為G，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸718的胺基酸為G。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸296的胺基酸為H，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸464的胺基酸為N，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸681的胺基酸為M。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸687的胺基酸為R。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸346的胺基酸為A，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R。在某些實施例中，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸501的胺基酸為I，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸706的胺基酸為C。在某些實施例中，該衣殼蛋白包含SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸1-736的胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含：
(a) AAV衣殼，其包含以下中之一或多者：(i)包含與SEQ ID NO:15之胺基酸203-736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含與SEQ ID NO:15之胺基酸138-736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含與SEQ ID NO:15之胺基酸1-736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含：(a) AAV衣殼，其包含以下中之一或多者：(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含：(a) AAV衣殼，其包含以下中之兩者或更多者：(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含：(a) AAV衣殼，其包含(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含：
(a) AAV衣殼，其包含以下中之一或多者：(i)包含與SEQ ID NO:13之胺基酸203-736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含與SEQ ID NO:13之胺基酸138-736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含與SEQ ID NO:13之胺基酸1-736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含：(a) AAV衣殼，其包含以下中之一或多者：(i)包含SEQ ID NO:13之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含：(a) AAV衣殼，其包含以下中之兩者或更多者：(i)包含SEQ ID NO:13之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含：(a) AAV衣殼，其包含：(i)包含SEQ ID NO:13之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含如本文所揭示之聚核苷酸、rAAV基因體或rAAV以及醫藥學上可接受之賦形劑、佐劑、稀釋劑、媒劑或載劑，或其組合。「醫藥學上可接受之載劑」包括當與組合物之活性成分組合時允許該成分保留生物活性且不引起破壞性生理反應(諸如不希望的免疫反應)的任何物質。醫藥學上可接受之載劑包括水、磷酸鹽緩衝鹽水、乳液(諸如油/水乳液)及潤濕劑。包含此類載劑之組合物係藉由熟知的習知方法調配，諸如以下中所闡述之彼等：Remington’s Pharmaceutical Sciences, 當前版, Mack Publishing Co., Easton Pa. 18042, USA; A. Gennaro (2000) 「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」, 第20版, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel等人, 第7版, Lippincott, Williams, & Wilkins; 及Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe等人, 第3版 Amer. Pharmaceutical Assoc. IV. 使用方法
在另一態樣中，本發明提供用於在細胞中表現異源多聚體蛋白質(例如，抗體)的方法。該方法通常包含將如本文所揭示之聚核苷酸或rAAV基因體引入細胞中，或用如本文所揭示之rAAV轉導細胞。
本文所揭示之方法可應用於其中需要異源多聚體蛋白質(例如，抗體)之表現的任何哺乳動物細胞，包括但不限於肝細胞(例如，人類肝細胞)。
在某些實施例中，細胞係在哺乳動物個體中，且聚核苷酸、rAAV基因體或rAAV係以有效引起異源多聚體蛋白質(例如，抗體)在個體中表現之量向個體投與。因此，在某些實施例中，本發明提供一種治療患有將得益於特異性結合治療目標之抗體之表現及分泌的疾病或病症之個體的方法，該方法通常包含向個體投與有效量的如本文所揭示之聚核苷酸、rAAV基因體或rAAV。
在某些實施例中，抗體特異性結合於C5且疾病或病症為C5介導之疾病。因此，在某些實施例中，本發明提供一種治療有需要之個體之C5介導之疾病的方法，該方法包含向個體投與有效量的如本文所揭示之聚核苷酸、rAAV基因體或rAAV。個體可為人類個體或人類肝臟細胞(例如，人類肝細胞)已移植至其中之嚙齒動物個體(例如，小鼠)。任何C5介導之疾病可使用本文所揭示之方法治療。適合的C5介導之疾病包括但不限於陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、視神經脊髓炎譜系病症(NMOSD)、非典型性溶血性尿毒性症候群(aHUS)、重症肌無力、造血幹細胞移植-移植物相關血栓性微血管病(HSCT-TMA)、補體介導之血栓性微血管病(CM-TMA)、格林-巴利症候群、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、原發性進行性多發性硬化症(PPMS)、多灶性運動神經病變伴傳導阻滯、抗體介導之腎臟排斥反應、C3腎小球病變、視神經脊髓炎譜系病症(NMOSD)、年齡相關之黃斑變性(AMD)、AQP4 IgG陽性視神經脊髓炎、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、類風濕性關節炎(RA)、皮肌炎、特發性膜性腎小球病變、脫髓鞘神經病變、補體過度活化、血管病性血栓形成、蛋白質丟失性腸病(CHAPLE)症候群、地圖狀萎縮(GA)、哮喘、增殖性腎炎及敗血症。
在某些實施例中，前述方法中所使用之rAAV包含：
(a) AAV衣殼，其包含以下中之一或多者：(i)包含與SEQ ID NO:15之胺基酸203-736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含與SEQ ID NO:15之胺基酸138-736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含與SEQ ID NO:15之胺基酸1-736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，前述方法中所使用之rAAV包含：(a) AAV衣殼，其包含以下中之一或多者：(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，前述方法中所使用之rAAV包含：(a) AAV衣殼，其包含以下中之兩者或更多者：(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，前述方法中所使用之rAAV包含：(a) AAV衣殼，其包含(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含：
(a) AAV衣殼，其包含以下中之一或多者：(i)包含與SEQ ID NO:13之胺基酸203-736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含與SEQ ID NO:13之胺基酸138-736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含與SEQ ID NO:13之胺基酸1-736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，前述方法中所使用之rAAV包含：(a) AAV衣殼，其包含以下中之一或多者：(i)包含SEQ ID NO:13之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，前述方法中所使用之rAAV包含：(a) AAV衣殼，其包含以下中之兩者或更多者：(i)包含SEQ ID NO:13之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
在某些實施例中，前述方法中所使用之rAAV包含：(a) AAV衣殼，其包含：(i)包含SEQ ID NO:13之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，(ii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白，及(iii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及(b) rAAV基因體，其包含SEQ ID NO:117-164中所闡述之序列中之任一者。
可藉由任何適當途徑向個體投與本文中所揭示之AAV組合物，包括但不限於靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、鼻內、局部或皮內途徑。在某些實施例中，組合物經調配以用於經由靜脈內注射或皮下注射來投與。 V.  AAV 封裝系統
在另一態樣中，本發明提供用於重組製備本文所揭示之重組腺相關病毒(rAAV)的封裝系統。此類封裝系統通常包含：第一核苷酸，其編碼一或多種AAV Rep蛋白；第二核苷酸，其編碼如本文所揭示之AAV中之任一者之衣殼蛋白；及第三核苷酸序列，其包含如本文所揭示rAAV基因體中之任一者，其中封裝系統可在用於將rAAV基因體圍封於衣殼中以形成AAV之細胞中操作。
在某些實施例中，封裝系統包含含有編碼一或多種AAV Rep蛋白之第一核苷酸序列及編碼AAV衣殼蛋白之第二核苷酸序列的第一載體，及包含含有rAAV基因體之第三核苷酸序列的第二載體。如於如本文所描述之封裝系統之情形下使用，「載體」係指一種核酸分子，其為用於將核酸引入細胞中之媒劑(例如質體、病毒、黏質體、人工染色體等)。
任何AAV Rep蛋白均可在本文所揭示之封裝系統中使用。在封裝系統之某些實施例中，Rep核苷酸序列編碼AAV2 Rep蛋白。適合的AAV2 Rep蛋白包括但不限於Rep 78/68或Rep 68/52。
在封裝系統之某些實施例中，封裝系統更包含了包含有一或多個輔助病毒基因之第四核苷酸序列。在封裝系統之某些實施例中，封裝系統更包含第三載體，例如輔助病毒載體，其包含含有一或多個輔助病毒基因之第四核苷酸序列。第三載體可為獨立第三載體、與第一載體整合在一起或與第二載體整合在一起。
在封裝系統之某些實施例中，輔助病毒選自由以下組成之群：腺病毒、疱疹病毒(包括單純疱疹病毒(HSV))、痘病毒(諸如牛痘病毒)、巨細胞病毒(CMV)及桿狀病毒。在封裝系統之某些實施例中，其中輔助病毒為腺病毒，腺病毒基因體包含一或多個選自由以下組成之群的腺病毒RNA基因：E1、E2、E4及VA。在封裝系統之某些實施例中，其中輔助病毒為HSV，HSV基因體包含選自由以下組成之群的HSV基因中之一或多者：UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22及UL30/UL42。
在封裝系統之某些實施例中，第一、第二及/或第三載體含於一或多種質體內。在某些實施例中，第一載體及第三載體含於第一質體內。在某些實施例中，第二載體及第三載體含於第二質體內。
在封裝系統之某些實施例中，第一、第二及/或第三載體含於一或多種重組輔助病毒內。在某些實施例中，第一載體及第三載體含於重組輔助病毒內。在某些實施例中，第二載體及第三載體含於重組輔助病毒內。
在另一態樣中，本發明提供一種用於重組製備如本文所描述之AAV的方法，其中該方法包含在可操作以將rAAV基因體包裹於衣殼中以形成如本文所描述之rAAV的條件下，以如本文所描述之封裝系統轉染或轉導細胞。用於重組製備rAAV之例示性方法包括短暫轉染(例如用一或多種轉染質體，其含有如本文所描述之第一、第二及視情況第三載體)、病毒感染(例如用一或多種重組輔助病毒，諸如腺病毒、痘病毒(諸如牛痘病毒)、疱疹病毒(包括HSV、巨細胞病毒或桿狀病毒，其含有如本文所描述之第一、第二及視情況第三載體)及穩定的生產細胞株轉染或感染(例如用穩定生產細胞，諸如哺乳動物或昆蟲細胞，其含有如本文所描述之編碼一或多種AAV Rep蛋白之Rep核苷酸序列及/或編碼一或多種AAV衣殼蛋白之Cap核苷酸序列，且其中如本文所描述之rAAV基因體以質體或重組輔助病毒形式遞送)。
因此，本發明提供一種用於製備重組AAV (rAAV)之封裝系統，其中封裝系統包含編碼一或多種AAV Rep蛋白之第一核苷酸序列；編碼本文所描述之AAV中之任一者之衣殼蛋白的第二核苷酸序列；包含本文中所描述之AAV中之任一者之rAAV基因體序列的第三核苷酸序列；及視情況選用之包含一或多個輔助病毒基因之第四核苷酸序列。 VI. 實例
以下實例證實使用包含本文所揭示之新穎雙向雙重啟動子表現系統之rAAV載體有效且持續表現個體中之抗體(例如，抗C5抗體)。提供此等實例作為說明，而非作為限制。 實例1：評估單一及雙重啟動子載體設計之效能
設計三種不同表現抗C5抗體之rAAV載體(Ab-02、Ab-03及Ab-04)，且測定此等載體在NOD-SCID小鼠之血清中實現抗C5抗體之有效及持續表現的能力。
載體Ab-02使用單一肝特異性啟動子來驅動抗體重鏈及輕鏈之表現。特定言之，Ab02自5′至3′包含以下基因元件：包含肝特異性LP1啟動子之轉錄調控元件；編碼可操作地連接至抗C5抗體重鏈之人類IgG2訊息序列的編碼序列；編碼2A核糖體跳躍肽之核酸序列；編碼可操作地連接至抗C5抗體輕鏈之Igκ訊息序列的編碼序列；及SV40晚期聚腺苷酸化序列。此載體之核酸序列闡述於SEQ ID NO:73中。
載體Ab-03使用兩個串聯肝特異性啟動子來驅動抗體重鏈及輕鏈之表現。特定言之，Ab03自5′至3′包含以下基因元件：包含肝特異性LP1啟動子之轉錄調控元件；編碼可操作地連接至抗C5抗體重鏈之人類IgG2訊息序列的編碼序列；牛生長激素聚腺苷酸化信號；包含肝特異性DnG啟動子之轉錄調控元件；編碼可操作地連接至抗C5抗體輕鏈之Igκ訊息序列的編碼序列；及SV40晚期聚腺苷酸化序列。此載體之核酸序列闡述於SEQ ID NO:74中。
載體Ab-04使用肝特異性雙向雙重啟動子系統來驅動抗體重鏈及輕鏈之表現。特定言之，Ab04自5′至3′包含以下基因元件：反向互補牛生長激素聚腺苷酸化訊息；編碼可操作地連接至抗C5抗體重鏈之人類IgG2訊息序列之反向互補編碼序列；包含肝特異性LP1啟動子之反向互補轉錄調控元件；兔β血球蛋白聚腺苷酸化序列；包含肝特異性DnG啟動子之轉錄調控元件；編碼可操作地連接至抗C5抗體輕鏈之Igκ訊息序列的編碼序列；及SV40晚期聚腺苷酸化序列。此載體之核酸序列闡述於SEQ ID NO:75中。
前述構築體中之各者封裝於AAVHSC15及AAVHSC17衣殼中且一1e13 vg/kg之劑量投與至雄性NOD-SCID小鼠。根據製造商說明書，在1、3、5、7、9、13及16週(3隻小鼠/時間點)之後收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA (來自Abcam之SIMPLESTEP ELISA ®套組)來量測抗體含量。
如圖1中所展示，封裝於AAVHSC15或AAVHSC17衣殼中之雙向雙重啟動子構築體(Ab04)產生比單一啟動子構築體(Ab04)或串聯雙重啟動子構築體(Ab03)更高的血清IgG含量。 實例2：雙向雙重啟動子載體
鑒於雙向雙重啟動子載體Ab-04相對於載體Ab-02及Ab-03展現出優良的血清抗體表現量，設計25個替代雙向雙重啟動子載體以致力於進一步最佳化抗體表現且降低免疫原性。此等載體中存在之主要基因元件之序列闡述於本文中之表1中。此等載體中之各者自5′至3′包含：反向互補第一聚腺苷酸化序列；抗體輕鏈之反向互補編碼序列；內含子元件；反向互補hAAT啟動子序列；hHCR1序列或互補反向hHCR1序列；TTR啟動子序列；內含子元件；抗體重鏈之編碼序列；及第二聚腺苷酸化序列。在某些載體中，rBG-pA序列插入於hHCR1序列與TTR啟動子序列之間。 實例3：人源化抗C5抗體在小鼠中之 活體內表現
在NOD-SCID小鼠(NOD.CB-17-Prkdcscid/J小鼠；傑克遜實驗室(The Jackson Laboratory)，Bar Harbor, ME, USA)中 活體內評估表1中所闡述之19種載體設計之抗C5抗體表現及功能活性。選擇免疫功能不全模型，因為人源化抗體具有在小鼠中誘發抗藥物抗體之潛力。選擇NOD-SCID小鼠，因為其缺乏內源性鼠類C5，因為其攜帶HC0對偶基因。內源性C5之不存在允許使用 離體溶血分析精確量測抗C5抗體之功能活性。
為評估足夠高含量之抗C5抗體是否可在生物體之血清中表現，對NOD-SCID小鼠以1e13 vg/kg靜脈內給藥載體E1-100、E40、E41、E42、E43、E44、E45、E46、E47、E48、E49、E50、E51、E52、E53、E54、E55、E56及E57 (各自封裝於AAVHSC13衣殼中)中之各者或調配物緩衝液對照(FB)。在1、3、5、7、9、11及12週時(5隻小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量，如實例1中所描述。在12週之後藉由液滴式數位PCR (ddPCR)使用對所有19種載體共用且不存在於鼠類基因體中之引子探針組測定此等小鼠之肝臟中的載體基因體複本數。
如FIG2A及圖2B中所展示，可在治療後1週偵測抗體含量。所有載體引起血清中抗C5抗體之含量隨時間推移升高及持續。此外，與參考構築體E1-100相比，許多構築體展示改善之抗體含量，其中一些構築體實現毫克濃度之抗體。如圖3中所展示，此等小鼠之肝臟中每微克基因體DNA的載體基因體之數目在所有組中係相當的。 實例4：載體化抗C5抗體表現對 離體溶血之影響
陣發性夜間血紅素尿(PNH)的特徵是紅血球破壞(溶血性貧血)、血栓(血栓形成)及骨髓功能受損。為確定由本文所描述之載體表現的抗C5抗體是否將有效減少溶血性貧血，使用在第1週及第3週所有構築體及在第12週所選擇構築體之經典補體路徑起始的 離體溶血分析評估經轉導抗C5抗體之功能活性。
簡言之，將含有人類C5之人類血清與獲自已用AAVHSC13封裝之C5Ab治療之NOD-SCID小鼠的血清混合。在治療後1週、3週及12週收集小鼠血清。將人類血清及小鼠血清與經活化綿羊紅血細胞(RBC)混合。用於NOD-SCID研究之 離體溶血分析量測由正常人類血清誘導的補體介導之經活化綿羊RBC之溶解的抑制，該正常人類血清與來自經載體處理之動物或經調配物緩衝液處理之對照的NOD-SCID血清等份組合。特定言之，在96孔V形底盤中，將明膠佛羅那緩衝液(Gelatin Veronal buffer) (GVBS, Sigma，目錄號G6514)在各孔中與小鼠血清混合(有或無EDTA)。接著將10%正常人類血清(NHS, Sigma，目錄號H4522)之溶液添加至所有孔中。接著將盤在37℃下培育30分鐘。接著將1 mL抗體敏化之綿羊RBC (Complement Technology, Inc.，目錄號：B200、B201及B202)之等分試樣添加至各孔中且振盪約30分鐘。接著將盤以1000 g離心5分鐘。將上清液移至新盤中且在412 nm及615 nm下讀取。接著自412 nm值減去615 nm值以獲得最終讀數。在所有所報導的溶血%值中，在用100%紅細胞溶解對照標準化之後報導所有樣本(包括僅調配物緩衝液或經AAVHSC處理之樣本)之溶血%
如圖4中所展示，早在投與後1週藉由來自經rAAV處理之動物的血清消除RBC溶血，且在3週之後未觀測到溶血。 實例5：載體最佳化
為使抗C5抗體在血清中之持續表現最大化，使本文所揭示之雙向雙重啟動子構築體相對於實例1中所描述之Ab04構築體中所使用的設計最佳化。評估十九個構築體，各自具有對載體元件之修飾以使效能最佳化。此等最佳化包括：TTR及hAAT啟動子序列之長度；hHCR1序列之長度及方向性；內含子元件之使用；聚腺苷酸化序列之使用；及編碼及非編碼區中之CPG含量。就抗體表現之動力學以及血清中之總體穩態抗體含量而言，鑑別出引起載體效能之實質性改善的變化。參考載體E1-100含有與Ab04相同的雙向雙重啟動子設計，且用作所有其他載體設計之參考載體。當以1e13 vg/kg(＞800 µg/mL)給藥時，E1-100穩健地表現抗C5 mAb。如前述實例中所描述進行所有分析。 (A) 肝特異性啟動子之背對背置放對 TTR 啟動子中單獨增強子元件之需求的影響
為確定雙向雙重啟動子單元中之兩個啟動子中之各者是否需要其自身的單獨增強子元件，將載體E54與E1-100進行比較。相對於E1-100，E54中之TTR啟動子序列缺乏增強子元件且長度增加(與E1-100中之170個鹼基相比，202個鹼基)。如FIG5中所展示，E54載體中之雙向雙重啟動子單元產生與E1-100載體類似的血清IgG表現。此結果證實，在雙向雙重啟動子之情形中，不需要用於TTR啟動子之單獨增強子元件。 (B) 無 CpG 有效負載密碼子最佳化對 IgG 表現之影響
傳統的密碼子最佳化通常採用最常用的密碼子及雙密碼子序列來驅動高轉殖基因表現，且經常產生具有高CPG含量之序列。在載體E1-100及E54之情況下，抗體重鏈編碼序列含有55個CpG，而輕鏈編碼序列含有33個CpG。已在臨床前及臨床試驗中展示高CPG含量誘導免疫介導之TLR9活化，此可引起轉殖基因表現之持久性損失。然而，自轉殖基因移除CpGs通常需要使用以更低頻率使用之密碼子，其具有損害表現量之潛力。
為減少CpG而不損害轉殖基因表現，進行密碼子最佳化，且使用一系列五個構築體評估編碼序列之表現。構築體中之各者在用於抗體編碼序列及訊息肽編碼序列之密碼子最佳化方面不同，但在載體設計及載體元件方面在其他方面相同。此等構築體包括載體E40、E41、E42、E43及E44。在NOD-SCID小鼠中隨時間推移評估編碼序列密碼子最佳化對抗C5抗體表現之影響。如圖6中所展示，針對減少的CPG含量最佳化的載體構築體產生抗C5抗體表現之兩倍增加，如藉由IgG表現所測定。值得注意地，無CPG密碼子最佳化E40構築體在第12週時相較於E41、E42及E43載體構築體產生最高IgG血清含量。
在相同研究中，將無CPG最佳化密碼子載體(E45)之IgG表現與僅針對高IgG表現選擇之具有高CPG含量的構築體(E54)之IgG表現進行比較。如圖7中所展示，含有與E54相同之載體設計但具有來自載體E40之轉殖基因密碼子最佳化的載體E45表現得與載體E54同樣好。此等結果指示，出人意料地，不需要高CPG含量來驅動強抗體表現。 (C)hAAT 啟動子大小及序列及 hHCR1 增強子大小及方向性對 IgG 表現之影響
為評估hAAT啟動子大小、hHCR1增強子大小及hHCR1增強子方向性對IgG表現之影響，評估E40、E45、E46、E47及E48載體中之轉殖基因表現。
藉由比較以下來測定hAAT啟動子長度之影響：E40、E45及E46載體，其中之各者具有含255個鹼基對之hAAT啟動子序列；及E47及E48載體，其中之各者具有新穎的含180個鹼基對之hAAT啟動子序列。
藉由比較以下來測定hHCR1增強子長度之影響：E45載體，其含有192個鹼基對hHCR1增強子序列；及E40、E46、E47及E48載體，其中之各者具有含314鹼基對之hHCR1增強子序列。
藉由比較以下來測定方向性之影響：E40及E47載體(其中之各者具有呈正向定向之hHCR1增強子序列)；及E45、E46及E48載體(其中之各者具有呈反向定向之hHCR1增強子序列)。所有五種此等構築體含有相同內含子元件、聚腺苷酸化序列及密碼子最佳化編碼序列。
如圖8中所展示，載體E45、E46及E48中之各者在小鼠血清中展現類似的IgG表現量，從而證實新穎的180個鹼基最小hAAT啟動子與較長255個鹼基hAAT序列同樣有效支持抗體表現。圖8中之資料亦證實：192個鹼基hHCR1增強子序列增強表現至與314個鹼基hHCR1增強子序列類似的程度；hHCR1增強子序列均在正向及反向定向上起作用，其中正向定向比反向定向產生更多的IgG表現。 (D)TTR 啟動子之新穎嵌合內含子對 IgG 表現之影響
評估將內含子置放於TTR啟動子序列之下游之轉殖基因表現的影響。引入MVM內含子以及嵌合β血球蛋白內含子，且評估轉殖基因表現。本文所使用之嵌合β血球蛋白內含子先前已在8週研究中藉由申請人鑑別以產生轉殖基因表現之改善。然而，序列在內含子、填充元件或相鄰限制酶內含有大量CpG (總計10個CpG)。因此，使用 電腦模擬公開可用之軟體來預測剪接，啟動子序列經最佳化以移除內含子及填充序列內之大多數CpG (僅保留2個CpG)。
評估具有相同載體設計但其不同之處在於其含有MVM內含子(例如 ，載體E40及E51)或具有減少之CpG之新穎嵌合β血球蛋白內含子(例如 ，載體E52及E53)的構築體對，以驅動抗體輕鏈表現。如圖9A及圖9B中所展示，相較於含有MVM內含子之構築體，具有減少之CpG的載體構築體在較早時間點處產生增加的抗體表現且在較短時間內達至抗體表現之穩態含量(載體E40相比於E51)。 (E) CpG 之進一步減少對 IgG 表現的影響
為評估載體設計之非編碼區內的CpG之數目之其他變化是否對轉殖基因表現具有影響，進一步減少內含子及啟動子區內的CpG之數目，且量測IgG含量。使用含有嵌合β血球蛋白內含子之載體，包括經最佳化以完全消除CPG含量之新穎嵌合β血球蛋白內含子。將E53載體(含有具有2個CpG之嵌合β血球蛋白內含子)與E50載體(含有具有0個CpG之新穎嵌合β血球蛋白內含子)進行比較。如圖10中所展示，在E50中自嵌合β血球蛋白內含子移除其餘2個CpG具有良好耐受性且不損害IgG表現。
另外，評估移除其他非編碼區內之CpG對轉殖基因表現的影響以便確定藉由保守取代置換其餘CpG是否破壞轉錄結合位點。將使用E50載體(含有所有10個CpG)之IgG表現與E49載體(含有6個CpG)之IgG表現進行比較。如圖10中所展示，移除hAAT啟動子內之4個CpG具有良好耐受性且不影響IgG之表現。 (F) 將聚腺苷酸化序列引入雙向雙重啟動子單元中對 IgG 表現之影響
評估將兔β血球蛋白聚腺苷酸化(rBG-pA)序列置放於本文所揭示之雙向雙重啟動子單元中之兩個啟動子之間的作用。發現IgG表現之速率以及穩態IgG表現量在雙向啟動子單元內之含有rBG-pA之構築體中顯著增加。
藉由比較三對載體(E51相比於E55；參見圖11A)、(E45相比於E56；參見圖11B)及(E47相比於E57；參見圖11C)來證實用MVM內含子取代新穎CPG減少之嵌合內含子(上文所描述)及添加rBG-pA填充物之組合作用。此等載體對中之各者含有不同的雙向雙重啟動子設計，但是在各對內，其他載體元件為相同的。在圖11A、圖.11B及圖11C中，具有MVM內含子之載體之IgG表現量以白色圓圈表示(E51、E45、E47)，含有CPG減少之嵌合β血球蛋白內含子的載體以灰色三角形展示(E53)，且含有rBG-pA以及CPG減少之嵌合β血球蛋白內含子的載體以黑色正方形展示(E55、E56及E57)。
如圖11A、圖11B及圖11C中所展示，在TTR啟動子之5′添加rBG-pA引起血清IgG產生速率之進一步增強，從而使得穩態IgG含量增加。 (G) 聚腺苷酸化序列對 IgG 表現之影響
聚腺苷酸化序列可調控mRNA穩定性及總體抗體表現量。因此，藉由將含有新穎的合成聚腺苷酸化序列(Syn-pA)之載體與含有牛生長激素聚腺苷酸化序列(bGH-pA)之載體進行比較來評估聚腺苷酸化序列對總體IgG表現之影響。特定言之，比較E40及E52載體(含有bGH-pA)及E51及E53載體(含有Syn-pA)。此等載體對中之各者僅在重鏈之聚腺苷酸化序列方面不同。
在相同實驗內，亦評定用於TTR啟動子之內含子對IgG表現之影響。將E40及E51載體(含有MVM內含子)與E52及E53載體(含有經修飾之具有減少之CpG的嵌合β血球蛋白內含子)進行比較。
如圖12A及圖12B中所展示，與針對含有MVM內含子之構築體(E40及E51載體)使用Syn-pA之表現相比，使用具有bGH-pA之載體的IgG表現存在統計學上顯著的增加。然而，Syn-pA及bGH-pA在TTR啟動子之5′在含有經修飾之具有減少之CpG的嵌合β血球蛋白內含子的構築體(E52及E53載體)中類似地表現。
在單獨的實驗中，評估移除聚腺苷酸化序列內之CpG對轉殖基因表現之影響。對C57BL/6J小鼠以3e12 vg/kg靜脈內給藥有載體E52或E97 (各自封裝於AAVHSC13衣殼中)。E97載體實質上類似於E52載體，不同之處在於E97含有其中2個CpG經移除之新穎bGH聚腺苷酸化序列(參見表1)。在給藥後1、3及5週(5隻小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。如圖12C中所展示，移除bGH聚腺苷酸化序列內之2個CpG具有良好耐受性且不影響抗C5抗體之表現。 實例6：最佳化載體之持久性及劑量反應研究
為研究雙向雙重啟動子載體之投與劑量與抗C5抗體表現量及功能活性之間的關係，對NOD-SCID小鼠以3e11、3e12、1e13、3e13及1e14 vg/kg靜脈內給藥有載體E55(封裝於AAVHSC13衣殼中)或調配物緩衝液對照(媒劑)。5隻雄性小鼠在各組中給藥。在1、3、5、7、9、11、13及15週時自各小鼠收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量，如實例1中所描述。在4及16週時自各小鼠收集終末血清樣本。
如圖13A中所展示，可在治療後1週以所測試之所有劑量偵測抗體含量。對於接受3e11至3e13 vg/kg E55載體之劑量組達成持續抗體含量，其中抗C5抗體濃度在第1週至第5週穩定增加且在其後達至平穩段。將穩態抗C5抗體濃度(CSS)測定為各劑量組在第5週至第16週之間的血清抗C5抗體含量之平均值，至多3e13 vg/kg，且發現在CSS與劑量含量之間的線性相關性。對於1e14 vg/kg劑量組，第1週達成超藥理學抗C5抗體含量(＞20 mg/mL)，隨後第9-16週減少及穩定至與3e13 vg/kg劑量組相比類似的抗體含量。
如實例4中所描述，在第1、3、5及16週時進行功能性 離體溶血分析，以測定防止 離體溶血之劑量且確定血清抗C5抗體之含量與 離體溶血之間的相關性。如圖13B中所展示，早在治療後1週藉由自來自所有經治療動物之血清消除RBC溶血。
在4及16週時藉由液滴式數位PCR (ddPCR)使用靶向對E55載體具有特異性之區域且不存在於鼠類基因體中的引子探針組來測定經治療小鼠之肝臟中的載體基因體複本數。如圖13C中所展示，觀測到VG濃度之劑量依賴性增加，以及對於除1e14 vg/kg以外的所有劑量在第4週達成穩定VG含量，其中第16週觀測到VG之減少，從而與抗C5抗體CSS及轉錄物之損失相關聯(亦參見圖13D及圖13E)。
在治療後4至16週測定游離衍生之密碼子最佳化重鏈(CO-HC)及密碼子最佳化輕鏈(CO-LC)轉錄物之含量及重鏈與輕鏈比率(HC:LC)。量測管家內源性轉錄物(Gps1 mRNA)以確保適當的cDNA轉化率及相等負載，且將含量與劑量及載體基因體複本數相關聯。如圖13D及圖13E中所展示，分別觀測到CO-HC及CO-LC轉錄物之劑量依賴性增加，以及對於除1e14 vg/kg以外的所有劑量在第4週達成穩定轉錄物含量，從而與如上所測定之VG含量相關聯。所有HC:LC比率平均值在0.6至1內，從而指示重鏈及輕鏈轉錄物之含量類似(圖13F)。 實例7：人源化肝臟模型中最佳化載體之 活體內表現
為評估人源化肝臟模型中雙向雙重啟動子載體之功能活性及持久性，使用具有基因型 Fah -/- Rag2 -/- Il2rg -/-之C57BL/6J小鼠(通常被稱為FRG®基因剔除小鼠(在本文中稱作「HuLiv」小鼠))進行四週研究。小鼠為免疫缺陷的且缺乏酪胺酸分解酶延胡索醯基乙醯乙酸水解酶(Fah)。移除保護性藥物2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲醯基)-1,3-環己二酮(NTBC)，以誘導小鼠肝細胞消融。接著將小鼠植入人類肝細胞，且投與表現尿激酶的腺病毒以增進人類肝細胞重新生長。使用適當的CuRx™尼替西農(Nitisinone) (20-0026)及SMX/TMP抗生素(20-0037)的預防性治療方案在該動物的整個生命中持續植入。得到的HuLiv小鼠肝臟重新生長＞70%的人類肝細胞。此等HuLiv小鼠進一步描述於Azuma等人 (Nature Biotechnology. 25(8): 903-910 (2007))中。
在靜脈內給藥有3e12、1e13及3e13 vg/kg載體E55 (封裝於AAVHSC13衣殼中)或調配物緩衝液對照(媒劑)之HuLiv小鼠中量測抗C5抗體表現量及功能活性。5隻雄性小鼠在各組中給藥。在研究時段內，劑量組中無一者經歷顯著的移植人類肝細胞損失或顯著的體重損失。在1及3週時自各小鼠收集血清樣本，且使用IgG-特異性ELISA來量測抗體含量，如實例1中所描述。在4週時自各小鼠收集終末血清樣本。如圖14A中所展示，封裝於AAVHSC13衣殼中之E55能夠成功地轉導人類肝細胞且在所測試之所有劑量下在治療後1週產生可偵測的抗C5抗體含量。圖14B展示由人類肝細胞 活體內產生之抗C5抗體為功能性的，藉由完整抑制 離體溶血來證實。
在4週時藉由液滴式數位PCR (ddPCR)使用靶向對E55載體具有特異性之區域且不存在於鼠類基因體中的引子探針組來測定經治療小鼠之肝臟中的載體基因體複本數。如圖14C中所展示，觀測到VG濃度之劑量依賴性增加。
在治療後4週測定游離衍生之密碼子最佳化重鏈(CO-HC)及密碼子最佳化輕鏈(CO-LC)轉錄物之含量及重鏈與輕鏈比率(HC:LC)。量測管家內源性轉錄物(Gps1 mRNA)以確保適當的cDNA轉化率及相等負載，且將含量與劑量及載體基因體複本數相關聯。如圖14D中所展示，觀測到CO-HC及CO-LC轉錄物之劑量依賴性增加。對於所有劑量，HC:LC比率平均值為約0.9，從而指示重鏈及輕鏈轉錄物之含量類似(圖14E)。 實例8：免疫勝任小鼠中經最佳化載體之 活體內表現
為研究免疫勝任模型中雙向雙重啟動子載體之長期持久性，用單一1e13 vg/kg劑量之載體E55 (封裝於AAVHSC13衣殼(AAVHSC13-E55))或調配物緩衝液(媒劑)作為對照治療C57BL/6J小鼠。研究兩個組：一個組在1及3週時自各小鼠收集血清樣本，且在4週時收集終末血清樣本(4週組)；且第二組每月收集血清樣本，其中在26週時收集終末血清樣本(26週組)。13隻雄性及雌性小鼠在各組中給藥。圖15A展示在治療後20週外之兩組小鼠中量測的抗C5抗體表現量。如所展示，可在治療後1週偵測到抗C5抗體表現，且與雌性小鼠相比，雄性小鼠表現高含量之抗C5抗體。治療後20週觀測到兩個性別之持久抗C5抗體表現，從而表明藉由載體化遞送的有效負載之耐受性。 圖15B展示對於各性別，VG濃度在整個研究持續時間期間(26週)中穩定，其中治療後4週與26週之間的VG濃度無統計學差異。相同性別之動物的VG濃度在4週與26週之間相當，從而指示隨時間推移VG未損失。與雌性小鼠相比，VG濃度在雄性小鼠中更大。 *    *     *
本發明之範疇不受本文所描述之特定實施例限制。實際上，根據前文描述及附圖，除所描述之修改之外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將變得顯而易見。此類修改意欲屬於所附申請專利範圍之範疇內。
無
圖 1為展示投與單一1e13 vg/kg劑量之所指示表現抗C5抗體之rAAV載體(在各情況下封裝於AAVHSC15衣殼或AAVHSC17衣殼中)或緩衝液對照的NOD-SCID小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。Ab-02使用單一啟動子來驅動抗體重鏈及輕鏈之表現，Ab-03使用兩個串聯啟動子來驅動抗體重鏈及輕鏈之表現，且Ab-04使用雙向雙重啟動子系統來驅動抗體重鏈及輕鏈之表現。在1、3、5、7、9、13及16週時(3隻小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。載體Ab-02、Ab-03及Ab-04詳細描述於實例1中。
圖 2A 及圖 2B為展示投與單一1e13 vg/kg劑量之所指示表現抗C5抗體之rAAV載體(在各情況下封裝於AAVHSC13衣殼中)或緩衝液對照(CTR)的NOD-SCID小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。在1、3、5、7、9、11及12週時(5隻小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。用於此等實驗中之rAAV載體之細節闡述於表1中。
圖 3為展示在投與單一1e13 vg/kg劑量之所指示表現抗C5抗體之rAAV載體(在各情況下封裝於AAVHSC13衣殼中)或緩衝液對照(FB)之後12週NOD-SCID小鼠之肝臟中每微克基因體DNA的載體基因體之數目。藉由液滴式數位PCR (ddPCR)使用對所有載體共用且不存在於鼠類基因體中之引子探針組來測定載體基因體之數目。用於此等實驗中之rAAV載體之細節闡述於表1中。
圖 4為展示測試來自投與單一1e13 vg/kg劑量之所指示表現抗C5抗體之rAAV載體(在各情況下封裝於AAVHSC13衣殼中)或緩衝液對照(FB)的NOD-SCID小鼠之血清的血清抑制C5介導之綿羊紅血球溶血之能力的 離體溶血分析之結果的圖式。使用在1、3及12週時收集之血清樣本進行 離體溶血分析。
圖 5為展示投與單一1e13 vg/kg劑量之所指示表現抗C5抗體之rAAV載體(在各情況下封裝於AAVHSC13衣殼中)或緩衝液對照的NOD-SCID小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。在1、3、5、7、9、11及12週時(5隻小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。用於此等實驗中之rAAV載體之細節闡述於表1中。
圖 6為展示投與單一1e13 vg/kg劑量之所指示表現抗C5抗體之rAAV載體(在各情況下封裝於AAVHSC13衣殼中)或緩衝液對照的NOD-SCID小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。在1、3、5、7、9、11及12週時(5隻小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。用於此等實驗中之rAAV載體之細節闡述於表1中。
圖 7為展示投與單一1e13 vg/kg劑量之所指示表現抗C5抗體之rAAV載體(在各情況下封裝於AAVHSC13衣殼中)或緩衝液對照的NOD-SCID小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。在1、3、5、7、9、11及12週時(5隻小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。用於此等實驗中之rAAV載體之細節闡述於表1中。
圖 8為展示投與單一1e13 vg/kg劑量之所指示表現抗C5抗體之rAAV載體(在各情況下封裝於AAVHSC13衣殼中)的NOD-SCID小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。在1、3、5、7、9、11及12週時(5隻小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。用於此等實驗中之rAAV載體之細節闡述於表1中。
圖 9A 及圖 9B為展示投與單一1e13 vg/kg劑量之所指示表現抗C5抗體之rAAV載體(在各情況下封裝於AAVHSC13衣殼中)的NOD-SCID小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。在1、3、5、7、9、11及12週時(5隻小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。用於此等實驗中之rAAV載體之細節闡述於表1中。
圖 10為展示投與單一1e13 vg/kg劑量之所指示表現抗C5抗體之rAAV載體(在各情況下封裝於AAVHSC13衣殼中)的NOD-SCID小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。在1、3、5、7、9、11及12週時(5隻小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。用於此等實驗中之rAAV載體之細節闡述於表1中。
圖 11A 、圖 11B 及圖 11C為展示投與單一1e13 vg/kg劑量之所指示表現抗C5抗體之rAAV載體(在各情況下封裝於AAVHSC13衣殼中)的NOD-SCID小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。在1、3、5、7、9、11及12週時(5隻小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。用於此等實驗中之rAAV載體之細節闡述於表1中。
圖 12A 及圖 12B為展示投與單一1e13 vg/kg劑量之所指示表現抗C5抗體之rAAV載體(在各情況下封裝於AAVHSC13衣殼中)的NOD-SCID小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。在1、3、5、7、9、11及12週時(5隻小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。 圖 12C為展示投與單一3e12 vg/kg劑量之所指示表現抗C5抗體之rAAV載體(在各情況下封裝於AAVHSC13衣殼中)的C57BL/6J小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。在1、3及5週時(5隻小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。用於此等實驗中之rAAV載體之細節闡述於表1中。
圖 13A為展示投與3e11、3e12、1e13、3e13及1e14 vg/kg之載體E55 (封裝於AAVHSC13衣殼中)或調配物緩衝液對照(媒劑)的NOD-SCID小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。在1、3、5、7、9、11、13及15週時(5隻雄性小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。在4及16週時自各小鼠收集終末血清樣本。 圖 13B為展示測試來自經治療小鼠之血清抑制C5介導之綿羊紅血球溶血之能力的 離體溶血分析之結果的圖式。使用在1、3、5及16週時收集之血清樣本進行 離體溶血分析。 圖 13C為展示在經治療小鼠之肝臟中每微克基因體DNA的載體基因體之數目的圖式，如藉由液滴式數位PCR (ddPCR)使用對E55載體共用且不存在於鼠類基因體中之引子探針組所測定。 圖 13D 及圖 13E分別為展示在經治療動物中每微克cDNA的經密碼子最佳化重鏈(CO-HC)及經密碼子最佳化輕鏈(CO-LC)之轉錄物之數目，且 圖 13F為展示重鏈與輕鏈轉錄物之比率的圖式。在圖13C至圖13E中，****指示p＜0.0001時之統計學顯著性，其中使用混合效應模型及西達克氏多重比較檢驗(Sidak’s multiple comparison test)對組均值進行統計學分析。在圖3F中，在給藥後4週與16週之間觀測到3e12 vg/kg (**：p＜0.01)及1e14 vg/kg (****：p＜0.0001)之統計學差異，其中使用混合效應模型及西達克氏多重比較檢驗對組均值進行統計學分析。
圖 14A為展示投與3e12、1e13及3e13 vg/kg之載體E55 (封裝於AAVHSC13衣殼中)或調配物緩衝液對照(媒劑)的NOD-SCID小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。在1及3週時(5隻雄性小鼠/時間點)收集血清樣本，且使用人類IgG-特異性ELISA來量測抗體含量。在4週時收集終末血清樣本。 圖 14B為展示測試來自經治療小鼠之血清抑制C5介導之綿羊紅血球溶血之能力的 離體溶血分析之結果的圖式。使用在1、3及4週時收集之血清樣本進行 離體溶血分析。 圖 14C為展示在經治療小鼠之肝臟中每微克基因體DNA的載體基因體之數目的圖式，如藉由液滴式數位PCR (ddPCR)使用對E55載體共用且不存在於鼠類基因體中之引子探針組所測定。 圖 14D為展示在經治療動物中每微克cDNA的經密碼子最佳化重鏈(CO-HC)及經密碼子最佳化輕鏈(CO-LC)之轉錄物之數目的圖式，且 圖 14E為展示重鏈與輕鏈轉錄物之比率的圖式。
圖 15A為展示用單一1e13 vg/kg劑量之載體E55 (封裝於AAVHSC13衣殼(AAVHSC13-E55)中)或用調配物緩衝液(媒劑)作為對照治療的C57BL/6J小鼠之血清中抗C5抗體濃度的圖式。在1及3週時自4週組中之小鼠中收集血清樣本，其中在4週時收集終末血清樣本，且每月自26週組中之小鼠收集血清樣本，其中在26週時收集終末血清樣本。13隻雄性(M)及雌性(F)小鼠在各組中給藥。 圖 15B為展示在治療後4及26週，在經治療小鼠之肝臟中每微克基因體DNA的載體基因體之數目的圖式，如藉由液滴式數位PCR (ddPCR)所測定。使用單向ANOVA及西達克氏多重比較檢驗對組均值進行統計學分析。**指示p=0.0014時之統計學顯著性，且****指示p＜0.0001時之統計學顯著性。
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Claims (86)

  1. 一種經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含： (a)反向互補人類α1-抗胰蛋白酶(hAAT)啟動子序列，及人類肝臟控制區1 (hHCR1)序列； (b)與SEQ ID NO:17至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:22至少85%一致之hHCR1序列； (c)與SEQ ID NO:17至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:23至少85%一致之反向互補hHCR1序列； (d)與SEQ ID NO:18至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:22至少85%一致之hHCR1序列； (e)與SEQ ID NO:18至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:23至少85%一致之反向互補hHCR1序列； (f)與SEQ ID NO:20至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:22至少85%一致之hHCR1序列； (g)與SEQ ID NO:20至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:23至少85%一致之反向互補hHCR1序列； (h)與SEQ ID NO:17至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:24至少85%一致之hHCR1序列； (i)與SEQ ID NO:18至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:24至少85%一致之hHCR1序列； (j)與SEQ ID NO:18至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:25至少85%一致之反向互補hHCR1序列； (k)與SEQ ID NO:20至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:24至少85%一致之hHCR1序列；或 (l)與SEQ ID NO:20至少85%一致之反向互補hAAT啟動子序列，及與SEQ ID NO:25至少85%一致之反向互補hHCR1序列。
  2. 如請求項1之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含： (a)由SEQ ID NO:17組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:22組成之hHCR1序列； (b)由SEQ ID NO:17組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:23組成之反向互補hHCR1序列； (c)由SEQ ID NO:18組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:22組成之hHCR1序列； (d)由SEQ ID NO:18組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:23組成之反向互補hHCR1序列； (e)由SEQ ID NO:20組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:22組成之hHCR1序列； (f)由SEQ ID NO:20組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:23組成之反向互補hHCR1序列； (g)由SEQ ID NO:17組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:24組成之hHCR1序列； (h)由SEQ ID NO:18組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:24組成之hHCR1序列； (i)由SEQ ID NO:18組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:25組成之反向互補hHCR1序列； (j)由SEQ ID NO:20組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:24組成之hHCR1序列；或 (k)由SEQ ID NO:20組成之反向互補hAAT啟動子序列，及由SEQ ID NO:25組成之反向互補hHCR1序列。
  3. 如請求項2之經分離聚核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO:36-40及72組成之群的序列。
  4. 如前述請求項中任一項之經分離聚核苷酸，其進一步包含位於該hHCR1序列或該反向互補hHCR1序列之3′的甲狀腺素運載蛋白(TTR)啟動子序列。
  5. 如請求項4之經分離聚核苷酸，其中該TTR啟動子序列包含與SEQ ID NO:26至少85%一致之核酸序列，視情況該TTR啟動子序列包含SEQ ID NO:26，視情況該TTR啟動子序列由SEQ ID NO:26組成。
  6. 一種經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含： (a)與SEQ ID NO:22至少85%一致之hHCR1序列，及與SEQ ID NO:26至少85%一致之TTR啟動子序列； (b)與SEQ ID NO:23至少85%一致之反向互補hHCR1序列，及與SEQ ID NO:26至少85%一致之TTR啟動子序列；(c)與SEQ ID NO:24至少85%一致之hHCR1序列，及與SEQ ID NO:26至少85%一致之TTR啟動子序列；或 (d)與SEQ ID NO:25至少85%一致之反向互補hHCR1序列，及與SEQ ID NO:26至少85%一致之TTR啟動子序列。
  7. 如請求項6之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含： (a)由SEQ ID NO:22組成之hHCR1序列，及由SEQ ID NO:26組成之TTR啟動子序列； (b)由SEQ ID NO:23組成之反向互補hHCR1序列，及由SEQ ID NO:26組成之TTR啟動子序列；或 (c)由SEQ ID NO:24組成之hHCR1序列，及由SEQ ID NO:26組成之TTR啟動子序列； (d)由SEQ ID NO:25組成之反向互補hHCR1序列，及由SEQ ID NO:26組成之TTR啟動子序列。
  8. 如請求項6之經分離聚核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO:41-43組成之群的序列。
  9. 如請求項4至7中任一項之經分離聚核苷酸，其進一步包含插入於該hHCR1序列或該反向互補hHCR1序列與該TTR啟動子序列之間的聚腺苷酸化序列或其反向互補序列。
  10. 如請求項9之經分離聚核苷酸，其中該聚腺苷酸化序列為β血球蛋白聚腺苷酸化(BGpA)序列。
  11. 如請求項10之經分離聚核苷酸，其中該BGpA序列包含與SEQ ID NO:27至少85%一致之序列，視情況其中該BGpA序列包含SEQ ID NO:27，視情況其中該BGpA序列由SEQ ID NO:27組成。
  12. 如請求項4至11中任一項之經分離聚核苷酸，其包含與選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的序列至少85%一致之序列。
  13. 如請求項12之經分離聚核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的序列。
  14. 如前述請求項中任一項之經分離聚核苷酸，其進一步包含位於該反向互補hAAT啟動子序列之5′的第一內含子元件。
  15. 如請求項4至14中任一項之經分離聚核苷酸，其進一步包含位於該TTR啟動子序列之3′的第二內含子元件。
  16. 如請求項14或15之經分離聚核苷酸，其中該第一內含子元件及/或該第二內含子元件為嵌合內含子元件。
  17. 如請求項14至16中任一項之經分離聚核苷酸，其中該第一內含子元件包含與SEQ ID NO:28、29、30、31或32至少85%一致之序列，視情況其中該第一內含子元件包含SEQ ID NO:28、29、30、31或32，視情況其中該第一內含子元件之序列由SEQ ID NO:28、29、30、31或32組成。
  18. 如請求項15至17中任一項之經分離聚核苷酸，其中該第二內含子元件包含與SEQ ID NO:28、29、30、31或32至少85%一致之序列，視情況其中該第二內含子元件包含SEQ ID NO:28、29、30、31或32，視情況其中該第二內含子元件之序列由SEQ ID NO:28、29、30、31或32組成。
  19. 如請求項15至18中任一項之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含： (a)包含與SEQ ID NO:28至少85%一致之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含與SEQ ID NO:29至少85%一致之序列的第二內含子元件； (b)包含與SEQ ID NO:28至少85%一致之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含與SEQ ID NO:30至少85%一致之序列的第二內含子元件； (c)包含與SEQ ID NO:28至少85%一致之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含與SEQ ID NO:31至少85%一致之序列的第二內含子元件；或 (d)包含與SEQ ID NO:28至少85%一致之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含與SEQ ID NO:32至少85%一致之序列的第二內含子元件。
  20. 如請求項15至19中任一項之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含： (a)包含SEQ ID NO:28之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含SEQ ID NO:29之序列的第二內含子元件； (b)包含SEQ ID NO:28之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含SEQ ID NO:30之序列的第二內含子元件； (c)包含SEQ ID NO:28之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含SEQ ID NO:31之序列的第二內含子元件；或 (d)包含SEQ ID NO:28之序列的第一內含子元件；選自由SEQ ID NO:60-71及76-78組成之群的核酸序列；及包含SEQ ID NO:32之序列的第二內含子元件。
  21. 如請求項4至20中任一項之經分離聚核苷酸，其包含與選自由SEQ ID NO:79-116組成之群的序列至少85%一致之序列。
  22. 如請求項21之經分離聚核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO:79-116組成之群的序列。
  23. 如請求項4至22中任一項之經分離聚核苷酸，其進一步包含：位於該反向互補hAAT啟動子序列或該第一內含子元件之5′的反向互補第一編碼序列；及位於該第二內含子元件之該TTR啟動子序列之3′的第二編碼序列。
  24. 如請求項23之經分離聚核苷酸，其進一步包含位於該反向互補第一編碼序列之5′的反向互補第一聚腺苷酸化序列。
  25. 如請求項24之經分離聚核苷酸，其中該反向互補第一聚腺苷酸化序列包含與SEQ ID NO:33、34或35至少85%一致之序列，視情況其中該反向互補第一聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:33、34或35，視情況其中該反向互補第一聚腺苷酸化序列之序列由SEQ ID NO:33、34或35組成。
  26. 如請求項23至25中任一項之經分離聚核苷酸，其進一步包含位於該第二編碼序列之3′的第二聚腺苷酸化序列。
  27. 如請求項26之經分離聚核苷酸，其中該第二聚腺苷酸化序列包含與SEQ ID NO:33、34或35至少85%一致之序列，視情況其中該第二聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:33、34或35，視情況其中該第二聚腺苷酸化序列之序列由SEQ ID NO:33、34或35組成。
  28. 如請求項27之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含： (a)包含與SEQ ID NO:33至少85%一致之序列的反向互補第一聚腺苷酸化序列；反向互補第一編碼序列；與選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列至少85%一致之核酸序列；第二編碼序列；及包含與SEQ ID NO:35至少85%一致之序列的第二聚腺苷酸化序列；或 (b)包含與SEQ ID NO:34至少85%一致之序列的反向互補第一聚腺苷酸化序列；反向互補第一編碼序列；與選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列至少85%一致之核酸序列；第二編碼序列；及包含與SEQ ID NO:35至少85%一致之序列的第二聚腺苷酸化序列。
  29. 如請求項27之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含： (a)包含SEQ ID NO:33之序列的反向互補第一聚腺苷酸化序列；反向互補第一編碼序列；選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；第二編碼序列；及包含SEQ ID NO:35之序列的第二聚腺苷酸化序列；或 (b)包含SEQ ID NO:34之序列的反向互補第一聚腺苷酸化序列；反向互補第一編碼序列；選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；第二編碼序列；及包含SEQ ID NO:35之序列的第二聚腺苷酸化序列。
  30. 如請求項23至29中任一項之經分離聚核苷酸，其中： (a)該第一編碼序列編碼抗體重鏈或其抗原結合片段，且該第二編碼序列編碼抗體輕鏈或其抗原結合片段；或 (b)該第一編碼序列編碼抗體輕鏈或其抗原結合片段，且該第二編碼序列編碼抗體重鏈或其抗原結合片段。
  31. 如請求項30之經分離聚核苷酸，其中該抗體重鏈包含SEQ ID NO:178之胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO:179之胺基酸序列。
  32. 如請求項30之經分離聚核苷酸，其中： (a)該第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:178-199組成之群的核酸序列，且該第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列；或 (b)該第一編碼序列包含選自由SEQ ID NO:200-217組成之群的核酸序列，且該第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:178-199組成之群的核酸序列。
  33. 如請求項30之經分離聚核苷酸，其中： (a)該第一編碼序列及該第二編碼序列分別包含SEQ ID NO:200及181、191及209、193及211、195及213、197及215或199及217中所闡述之核酸序列；或 (b)該第一編碼序列及該第二編碼序列分別包含SEQ ID NO:181及200、209及191、211及193、213及195、215及197或217及199中所闡述之核酸序列。
  34. 如請求項30至33中任一項之經分離聚核苷酸，其中該第一編碼序列及/或該第二編碼序列包含訊息序列，視情況其中該訊息序列包含SEQ ID NO:167或173之胺基酸序列。
  35. 如請求項30至33中任一項之經分離聚核苷酸，其中該第一編碼序列及/或該第二編碼序列包含選自由SEQ ID NO:168-172及174-177組成之群的核酸序列。
  36. 如請求項35之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含： (a) SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35； (b) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:181之反向互補序列；SEQ ID NO:168之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:174；SEQ ID NO:200；及SEQ ID NO:35； (c) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:191之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:209；及SEQ ID NO:35； (d) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:193之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:211；及SEQ ID NO:35； (e) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:195之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:213；及SEQ ID NO:35； (f) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:197之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:215；及SEQ ID NO:35；或 (g) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:199之反向互補序列；SEQ ID NO:172之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:177；SEQ ID NO:217；及SEQ ID NO:35。
  37. 如請求項1之經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含： (a) SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:209之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:191；及SEQ ID NO:35； (b) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:200之反向互補序列；SEQ ID NO:174之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:168；SEQ ID NO:181；及SEQ ID NO:35； (c) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:209之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:191；及SEQ ID NO:35； (d) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:211之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:193；及SEQ ID NO:35； (e) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:213之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:195；及SEQ ID NO:35； (f) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:215之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:197；及SEQ ID NO:35；或 (g) SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:217之反向互補序列；SEQ ID NO:177之反向互補序列，其為選自由SEQ ID NO:60-71及76-116組成之群的核酸序列；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:199；及SEQ ID NO:35。
  38. 如請求項1至3中任一項之經分離聚核苷酸，其進一步包含位於該hHCR1序列或該反向互補hHCR1序列之3′的聚腺苷酸化序列或其反向互補序列。
  39. 如請求項38之經分離聚核苷酸，其中該聚腺苷酸化序列為β血球蛋白聚腺苷酸化(BGpA)序列，視情況其中該BGpA序列包含與SEQ ID NO:27至少85%一致之序列，視情況其中該BGpA序列包含SEQ ID NO:27，視情況其中該BGpA序列由SEQ ID NO:27組成。
  40. 一種經分離聚核苷酸，其自5′至3′包含：聚腺苷酸化序列或其反向互補序列；及TTR啟動子序列。
  41. 如請求項40之經分離聚核苷酸，其中該TTR啟動子序列包含與SEQ ID NO:26至少85%一致之核酸序列，視情況該TTR啟動子序列包含SEQ ID NO:26，視情況該TTR啟動子序列由SEQ ID NO:26組成。
  42. 如請求項40或41之經分離聚核苷酸，其中該聚腺苷酸化序列為β血球蛋白聚腺苷酸化(BGpA)序列，視情況其中該BGpA序列包含與SEQ ID NO:27至少85%一致之序列，視情況其中該BGpA序列包含SEQ ID NO:27，視情況其中該BGpA序列由SEQ ID NO:27組成。
  43. 一種經分離聚核苷酸，其包含： (a)選自由SEQ ID NO:19、29-31、44-59、117-140、168-172、174-177及180-217組成之群的核酸序列； (b)由與SEQ ID NO:21或22至少85%一致之序列組成的hAAT啟動子序列，視情況其中該hAAT啟動子序列由SEQ ID NO:21或22組成；或 (c)包含SEQ ID NO:19之hAAT啟動子序列，視情況其中該hAAT啟動子序列由SEQ ID NO:19組成。
  44. 一種聚核苷酸，其為如前述請求項中任一項之聚核苷酸之互補序列。
  45. 一種聚核苷酸，其為如前述請求項中任一項之聚核苷酸之反向互補序列。
  46. 一種重組腺相關病毒(rAAV)基因體，其包含如前述請求項中任一項之聚核苷酸。
  47. 如請求項46之rAAV基因體，其中該rAAV基因體進一步包含5′反向末端重複(5′ ITR)序列，及3′反向末端重複(3′ ITR)序列。
  48. 如請求項47之rAAV基因體，其中該5′ ITR核酸序列與SEQ ID NO:165中所闡述之核酸序列至少85%一致，及/或該3′ ITR核酸序列與SEQ ID NO:166中所闡述之核酸序列至少85%一致。
  49. 如請求項48之rAAV基因體，其中該5′ ITR核酸序列包含SEQ ID NO:165中所闡述之核酸序列，及/或該3′ ITR核酸序列包含SEQ ID NO:166中所闡述之核酸序列。
  50. 如請求項46之rAAV基因體，其中該rAAV基因體包含與SEQ ID NO:141-164中所闡述之核酸序列至少85%的核酸序列，或其互補序列。
  51. 如請求項46之rAAV基因體，其中該rAAV基因體包含SEQ ID NO:141-164中所闡述之核酸序列，或其互補序列。
  52. 如請求項46至51中任一項之rAAV基因體，其中該rAAV基因體為單股rAAV基因體。
  53. 如請求項46至51中任一項之rAAV基因體，其中該rAAV基因體為自互補rAAV基因體。
  54. 一種核酸載體，其包含如前述請求項中任一項之經分離聚核苷酸或rAAV基因體，視情況其中該核酸載體為質體、病毒或DNA最小載體。
  55. 一種rAAV，其包含：包含AAV衣殼蛋白之AAV衣殼；及如請求項46至53中任一項之rAAV基因體。
  56. 如請求項55之rAAV，其中該衣殼蛋白係選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAV-DJ、AAV-LK03、NP59、VOY101、VOY201、VOY701、VOY801、VOY1101、AAVPHP.N、AAVPHP.A、AAVPHP.B、PHP.B2、PHP.B3、G2A3、G2B4、G2B5及PHP.S。
  57. 如請求項55或56之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸203-736之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。
  58. 如請求項57之rAAV，其中：該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸206的胺基酸為C；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸296的胺基酸為H；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸312的胺基酸為Q；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸346的胺基酸為A；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸464的胺基酸為N；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸468的胺基酸為S；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸501的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸590的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸681的胺基酸為M；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸687的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸690的胺基酸為K；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸706的胺基酸為C；或該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸718的胺基酸為G。
  59. 如請求項57之rAAV，其中： (a)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為G，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸718的胺基酸為G； (b)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸296的胺基酸為H，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸464的胺基酸為N，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸681的胺基酸為M； (c)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸687的胺基酸為R； (d)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸346的胺基酸為A，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R；或 (e)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸501的胺基酸為I，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸706的胺基酸為C。
  60. 如請求項57之rAAV，其中該衣殼蛋白包含SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸203-736的胺基酸序列。
  61. 如請求項60之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白係由SEQ ID NO:16之核苷酸607-2208之核酸序列編碼。
  62. 如請求項55或56之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸138-736之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。
  63. 如請求項62之rAAV，其中：該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸151的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸160的胺基酸為D；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸206的胺基酸為C；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸296的胺基酸為H；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸312的胺基酸為Q；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸346的胺基酸為A；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸464的胺基酸為N；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸468的胺基酸為S；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸501的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸590的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸681的胺基酸為M；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸687的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸690的胺基酸為K；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸706的胺基酸為C；或該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸718的胺基酸為G。
  64. 如請求項63之rAAV，其中： (a)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為G，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸718的胺基酸為G； (b)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸296的胺基酸為H，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸464的胺基酸為N，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸681的胺基酸為M； (c)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸687的胺基酸為R； (d)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸346的胺基酸為A，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R；或 (e)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸501的胺基酸為I，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸706的胺基酸為C。
  65. 如請求項63之rAAV，其中該衣殼蛋白包含SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸138-736的胺基酸序列。
  66. 如請求項63之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白係由SEQ ID NO:16之核苷酸414-2208之核酸序列編碼。
  67. 如請求項55或56之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO:1-15中之任一者之胺基酸1-736之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。
  68. 如請求項67之rAAV，其中：該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸2的胺基酸為T；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸65的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸68的胺基酸為V；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸77的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸119的胺基酸為L；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸151的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸160的胺基酸為D；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸206的胺基酸為C；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸296的胺基酸為H；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸312的胺基酸為Q；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸346的胺基酸為A；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸464的胺基酸為N；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸468的胺基酸為S；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸501的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸590的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸681的胺基酸為M；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸687的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸690的胺基酸為K；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸706的胺基酸為C；或該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸718的胺基酸為G。
  69. 如請求項68之rAAV，其中： (a)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸2的胺基酸為T，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸312的胺基酸為Q； (b)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸65的胺基酸為I，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為Y； (c)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸77的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸690的胺基酸為K； (d)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸119的胺基酸為L，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸468的胺基酸為S； (e)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸626的胺基酸為G，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸718的胺基酸為G； (f)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸296的胺基酸為H，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸464的胺基酸為N，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸681的胺基酸為M； (g)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸687的胺基酸為R； (h)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸346的胺基酸為A，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R；或 (i)該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸501的胺基酸為I，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO:15之胺基酸706的胺基酸為C。
  70. 如請求項68之rAAV，其中該衣殼蛋白包含SEQ ID NO:1-15之胺基酸1-736的胺基酸序列。
  71. 如請求項70之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白係由SEQ ID NO:16中所闡述之核酸序列編碼。
  72. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至45中任一項之聚核苷酸、如請求項46至54中任一項之rAAV基因體或如請求項55至71中任一項之rAAV。
  73. 一種用於製備rAAV之封裝系統，其中該封裝系統包含： (a)第一核酸序列，其編碼一或多種AAV Rep蛋白； (b)第二核酸序列，其編碼如請求項55至71中任一項之rAAV之衣殼蛋白；及 (c)第三核酸序列，其包含如請求項46至53中任一項之rAAV之rAAV基因體序列。
  74. 如請求項73之封裝系統，其中該封裝系統包含含有該第一核酸序列及該第二核酸序列之第一載體，以及含有該第三核酸序列之第二載體。
  75. 如請求項73或74之封裝系統，其進一步包含含有一或多個輔助病毒基因之第四核酸序列。
  76. 如請求項75之封裝系統，其中該第四核酸序列包含於第三載體內。
  77. 如請求項75或76之封裝系統，其中該第四核酸序列包含一或多個來自選自由以下組成之群之病毒的基因：腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒及巨細胞病毒(CMV)。
  78. 如請求項73至77中任一項之封裝系統，其中該第一載體、該第二載體及/或該第三載體為質體或DNA最小載體。
  79. 一種用於重組製備rAAV之方法，該方法包含在產生該rAAV之條件下將如請求項73至78中任一項之封裝系統引入細胞中。
  80. 如請求項55至71中任一項之rAAV、如請求項1至45中任一項之聚核苷酸、如請求項46至54中任一項之rAAV基因體或如請求項72之醫藥組合物，其用作藥劑。
  81. 如請求項55至71中任一項之rAAV、如請求項1至45中任一項之聚核苷酸、如請求項46至54中任一項之rAAV基因體或如請求項72之醫藥組合物，其用於治療補體C5相關疾病。
  82. 如請求項55至71中任一項之rAAV、如請求項1至45中任一項之聚核苷酸、如請求項46至54中任一項之rAAV基因體或如請求項72之醫藥組合物，其用於治療患有補體C5相關疾病之個體的方法中，該方法包含向該個體投與有效量的該rAAV、該醫藥組合物或該聚核苷酸。
  83. 一種在個體中產生抗體之方法，該方法包含向該個體投與如請求項55至71中任一項之rAAV、如請求項1至45中任一項之聚核苷酸、如請求項46至54中任一項之rAAV基因體或如請求項72之醫藥組合物。
  84. 一種治療有需要之個體之補體C5相關疾病的方法，該方法包含向該個體投與有效量的如請求項55至71中任一項之rAAV、如請求項1至45中任一項之聚核苷酸、如請求項46至54中任一項之rAAV基因體或如請求項72之醫藥組合物。
  85. 如請求項84之方法，其中該補體C5相關疾病係選自由以下組成之群：地圖狀萎縮(geographic atrophy；GA)、格林-巴利症候群(Guillain-Barré syndrome)、重症肌無力、全身性紅斑性狼瘡(SLE)腎炎、增殖性腎炎、哮喘、類風濕性關節炎、敗血症、陣發性夜間血紅素尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria；PNH)、非典型性溶血性尿毒性症候群(aHUS)、視神經脊髓炎譜系病症(NMOSD)及年齡相關之黃斑變性(AMD)。
  86. 如請求項83至85中任一項之方法，其中該rAAV、該聚核苷酸、該rAAV基因體或該醫藥組合物係靜脈內投與。
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