BR112019027854A2 - proteínas de capsídeo viral recombinante, ácido nucleico isolado, vetor viral recombinante, composição, métodos de direcionamento do vetor viral recombinante de interesse a uma célula alvo, de distribuição de um nucleotídeo de interesse a uma célula alvo, de inativação de uma proteína do capsídeo viral e de produção de um vetor viral, célula empacotadora para produzir um vetor viral, e, molécula e proteína de ligação. - Google Patents

proteínas de capsídeo viral recombinante, ácido nucleico isolado, vetor viral recombinante, composição, métodos de direcionamento do vetor viral recombinante de interesse a uma célula alvo, de distribuição de um nucleotídeo de interesse a uma célula alvo, de inativação de uma proteína do capsídeo viral e de produção de um vetor viral, célula empacotadora para produzir um vetor viral, e, molécula e proteína de ligação. Download PDF

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Abstract

são fornecidas neste documento composições e métodos para o redirecionamento de proteínas do capsídeo viral recombinantes/capsídeos/vetores, por exemplo, in vivo, com uma molécula de ligação multiespecífica, tal como um anticorpo biespecífico, que se liga especificamente a um epítopo heterólogo exibido pela proteína do capsídeo e uma proteína expressa na célula de interesse para a distribuição direcionada de um nucleotídeo de interesse.

Description

1 / 138 PROTEÍNAS DE CAPSÍDEO VIRAL RECOMBINANTE, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR VIRAL RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO, MÉTODOS DE DIRECIONAMENTO DO VETOR VIRAL RECOMBINANTE DE INTERESSE A UMA CÉLULA ALVO, DE
DISTRIBUIÇÃO DE UM NUCLEOTÍDEO DE INTERESSE A UMA CÉLULA ALVO, DE INATIVAÇÃO DE UMA PROTEÍNA DO CAPSÍDEO VIRAL E DE PRODUÇÃO DE UM VETOR VIRAL, CÉLULA EMPACOTADORA PARA PRODUZIR UM VETOR VIRAL, E, MOLÉCULA E PROTEÍNA DE LIGAÇÃO REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADO COMO UM ARQUIVO DE TEXTO VIA REDE EFS
[001] A listagem de sequência, escrita no arquivo 10335WO01_ST25.txt com 88 kilobytes, foi criada em 27 de junho de 2018 e está incorporada neste documento por referência.
CAMPO TÉCNICO
[002] A divulgação neste documento refere-se geralmente a vetores virais recombinantes modificados por tropismo e composições que compreendem o mesmo, útil para a introdução direcionada de material genético em células e/ou tecidos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003] A distribuição de genes em células alvo específicas se tornou uma das tecnologias mais importantes na medicina moderna para diagnóstico e terapia genética de uma variedade de doenças crônicas e genéticas. Até o momento, o progresso na aplicação clínica da terapia genética foi limitado pela falta de veículos de distribuição de genes ideais. Para alcançar o sucesso terapêutico, os veículos de distribuição de genes devem ser capazes de transduzir células alvo enquanto evitam a transdução das células não alvo. Especificamente, quando o tropismo nativo do vírus não atende às necessidades terapêuticas instantâneas, há uma necessidade de vetores virais
2 / 138 recombinantes em que o tropismo natural é removido ou diminuído e o tropismo desejado é manipulado com sucesso. (Buchholz et al.,)
[004] Nos últimos anos, a maior parte do progresso no desenvolvimento do vetor foi alcançada usando vírus nus (por exemplo, vírus que compreendem um capsídeo formado por proteínas do capsídeo viral sem um envelope (por exemplo, bicamada lipídica)), tais como vírus adeno- associados (AAVs) e adenovírus (Ads), bem como vírus envelopados (por exemplo, vírus para os quais o capsídeo é rodeado por uma bicamada lipídica) como retrovírus, lentivírus e vírus herpes simplex. Os vetores baseados em AAV têm sido o foco de muita pesquisa, já que os AAVs são vírus não envelopados que são apenas levemente imunogênicos, mas capazes de transduzir uma ampla gama de espécies e tecidos in vivo sem evidência de toxicidade.
[005] AAVs são vírus de DNA pequenos, não envelopados e de fita simples. O genoma de AAV tem 4,7 kb e é caracterizado por duas repetições terminais invertidas (ITR) e duas estruturas de leitura abertas que codificam as proteínas Rep e Cap proteínas, respectivamente. Os dois ITRs são os únicos elementos cis essenciais para replicação, embalagem e integração de AAV. A estrutura de leitura do representante codifica quatro proteínas de peso molecular 78 Kd, 68 Kd, 52 Kd e 40 Kd. Essas proteínas funcionam principalmente na regulação de replicação e integração de AAV do AAV nos cromossomos de uma célula hospedeira. A estrutura de leitura de Cap codifica três proteínas virais (VP) estruturais (capsídeas) com pesos moleculares de 83-85 kD (VP1), 72-73 kD (VP2) e 61-62 kD (VP3). Mais de 80% das proteínas totais em vírion AAV compreendem VP3; em vírions maduros VP1, VP2 e VP3 são encontradas em abundância relativa de aproximadamente 1:1:10. In vitro, as três proteínas se montam espontaneamente em estruturas tipo vírion, por exemplo, capsídeos virais. Parece, portanto, que a formação de capsídeos virais em células infectadas procede independente da síntese de
3 / 138 DNA viral (revisada por Kotin et al. (1994) Hum. Gene Ther. 5:793).
[006] Entre todos os sorotipos de AAV conhecidos, AAV2 é talvez o sorotipo mais bem caracterizado, porque seu clone infeccioso foi o primeiro feito. (Samulski et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 79:2077-2081). Posteriormente, as sequências completas para AAV3A, AAV3B, AAV4 e AAV6 também foram determinadas. (Rutledge et al. (1998) J. Virol. 72:309- 319; Chiorini et al. (1997) J. Virol. 71:6823-6833; S. Muramatsu et al. (1996) Virol. 221:208-217). Geralmente, todos os AAVs compartilham mais de 80% de identidade na sequência de nucleotídeos.
[007] O AAV é um vetor promissor para a terapia genética humana, uma vez que, ao contrário de outros vetores virais, os AAVs não demonstraram estar associados a qualquer doença humana conhecida e geralmente não são considerados patogênicos. (Muzyczka et al. (1992)Current Topics in Microbiology and Immunology 158:97-129). Além disso, o AAV transporta com segurança os tecidos pós-mitóticos com imunogenicidade relativamente baixa e é capaz de integrar nos cromossomos hospedeiros de forma sítio-específica e em células cultivadas em tecido no cromossomo 19 se as proteínas Rep forem fornecidas em trans. (Kotin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87:2211-2215; Samulski et al. (1991) EMBO J. 10(12):3941-3950; Balague et al. (1997) J. Virol. 71:3299-3306; Surosky et al. (1997) J. Virol. 71:7951-7959). Os genomas integrados de AAV mostraram-se permitir a expressão de genes em longo prazo em vários tecidos, incluindo, músculo, fígado e cérebro (Fisher (1997)Nature Med. 3(3):306-312; Snyder et al. (1997)Nature Genetics 16:270-276; Xiao et al. (1997) Experimental Neurology 144:113-124; Xiao et al. (1996)J. Virol. 70(11):8098-8108).
[008] Diversos vírus, incluindo AAVs, infectam células através de uma interação de vírus/ligante:célula/receptor, resultando finalmente em endocitose do vírus pela célula infectada. Esta interação de ligante:receptor é
4 / 138 o foco da maior parte da pesquisa sobre vetores virais, por exemplo, pode ser manipulada para redirecionar um tropismo natural de vírus a partir de uma célula naturalmente permissiva a infecção pelo vírus do tipo selvagem a uma célula alvo, por exemplo, através de um receptor expresso pela célula alvo.
[009] Teoricamente, o redirecionamento de um vetor em direção a qualquer proteína ou marcador de superfície celular deve resultar em infecção por uma célula alvo à medida que a maioria dos receptores ou marcadores de superfície celular estão envolvidos nas vias de endocitose, constitutiva (por exemplo, para reciclagem) ou induzida por ligante (por exemplo, mediada por receptor). Esses receptores agrupam-se em poços revestidos com clatrina, entram na célula através de vesículas revestidas com clatrina, passam através de um endossoma acidificado em que os receptores são classificados e, então, reciclaram-se à superfície celular, tornam-se armazenados intracelularmente, ou são degradados em lisossomas. Como tal, as plataformas para redirecionamento de vetores virais geralmente buscam remover o tropismo natural do vetor viral e redirecionar o vetor viral a um receptor ou marcador expresso somente ou primariamente pela célula alvo. Muitos dos avanços na terapia de gene direcionada usando vetores virais podem ser resumidos como modificação não recombinatória (não genética) ou recombinatória (genética) do vetor viral, o que resulta na pseudotipagem, expansão e/ou redirecionamento do tropismo natural do vetor viral. (Resenhado em Nicklin e Baker (2002) Curr. Gene Ther. 2:273-93; Verheiji e Rottier (2012) Advances Virol 2012:1-15).
[0010] Abordagens não genéticas normalmente utilizam um adaptador, que reconhece tanto uma proteína de superfície do vírus do tipo selvagem (não modificada) quanto uma célula alvo. Pseudorreceptores solúveis (para o vírus do tipo selvagem), polímeros como polietilenoglicol e anticorpos ou porções deles, foram usados como o domínio de ligação a vírus dos adaptadores, enquanto peptídeo natural ou ligantes de vitamina, e
5 / 138 anticorpos e porções deles foram usados para o domínio de ligação celular dos adaptadores descritos acima. Com esta abordagem, o redirecionamento do vetor viral a uma célula alvo pode ser realizado mediante ligação do complexo vetor:adaptador a uma proteína expressa na superfície da célula alvo, por exemplo, uma proteína de superfície celular.
[0011] Tal abordagem foi usada para AAV (Bartlett et al. (1999)Nat. Biotechnol. 74: 2777-2785), adenovírus (Hemminki et al. (2001) Cancer Res. 61: 6377–81; van Beusechem et al. (2003) Gene Therapy 10:1982–1991; Einfeld, et al. (2001) J. Virol. 75:11284–91; Glasgow et al. (2009)PLOS One 4:e8355), herpesvírus (Nakano et al. (2005) Mol. Ther. 11:617-24), e paramixovírus (Bian et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12:295-303; Bian et al. (2005) Int. J. Oncol. 29:1359-69), coronavírus (Haijema et al. (2003) J. Virol. 77:4528–43]8; Wurdinger et al. (2005) Gene Therapy 12:1394–1404).
[0012] Uma abordagem mais popular tem sido a modificação genética recombinatória das proteínas de capsídeo virais e, assim, a superfície do capsídeo viral. Em abordagens recombinantes indiretas, um capsídeo viral é modificado com um "andaime" heterólogo, que então se liga a um adaptador. O adaptador se liga ao andaime e à célula alvo. (Arnold et al. (2006) Mol. Ther. 5:125-132; Ponnazhagen et al. (2002) J. Virol. 76:12900–907; consulte também WO 97/05266) Andaimes, tais como (1) moléculas de ligação Fc (por exemplo, receptores Fc, Proteína A, etc.), que se ligam ao Fc de adaptadores de anticorpo, (2) (estrept)avidina, que se liga a adaptadores biotinilados, (3) biotina, que se liga a adaptadores fundidos com (estrept)avidina, e (4) pares de ligação a proteína:proteína que formam ligações peptídicas isométricas, tais como o SpyCatcher, que se liga a um adaptador de SpyTag, que se liga a ligações peptídicas isométricas, tais como o SpyCatcher, que se liga a um adaptador de SpyTag, que se liga a um adaptador de SpyTag (Pereboeva et al. (2007) Gene Therapy 14: 627–637; Park et al. (2008) Biochemical and Biophysical Research Communications 366: 769–774; Henning et al. (2002)
6 / 138 Human Gene Therapy 13:1427–1439; Banerjee et al. (2011) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 21:4985–4988), AAV (Gigout et al. (2005) Molecular Therapy 11:856–865; Stachler et al. (2008) Molecular Therapy 16:1467–1473), e togavírus (Quetglas et al. (2010) Virus Research 153:179– 196; Ohno et al. (1997) Nature Biotechnology 15:763–767; Klimstra et al. (2005) Virology 338:9–21).
[0013] Em uma abordagem de direcionamento recombinatória direta, um ligante de direcionamento é inserido diretamente em, ou acoplado a, um capsídeo viral, isto é, capsídeos virais de proteína são modificados para expressar um ligante de direcionamento heterólogo. O ligante então redireciona, por exemplo, se liga, a um receptor ou marcador preferencialmente ou exclusivamente expresso em uma célula alvo. (Stachler et al. - (2006) Gene Ther. 13:926–931; White et al. (2004) Circulation 109:513–519). Abordagens recombinantes diretas foram usadas em AAV (Park et al., (2007) Frontiers in Bioscience 13:2653–59; Girod et al. (1999) Nature Medicine 5:1052–56; Grifman et al. (2001) Molecular Therapy 3:964– 75; Shi et al. (2001) Human Gene Therapy 12:1697–1711; Shi e Bartlett (2003) Molecular Therapy 7:515–525), retrovírus (Dalba et al.Current Gene Therapy 5:655–667; Tai e Kasahara (2008) Frontiers in Bioscience 13:3083-3095; Russell e Cosset (1999) Journal of Gene Medicine 1:300–311; Erlwein et al. (2002) Virology 302:333–341; Chadwick et al. (1999) Journal of Molecular Biology 285:485–494; Pizzato et al. (2001)Gene Therapy 8:1088–1096), poxvírus (Guse et al. (2011) Expert Opinion on Biological Therapy 11:595–608; Galmiche et al. (1997) Journal of General Virology 78:3019–3027; Paul et al. (2007) Viral Immunology 20:664–671), paramixovírus (Nakamura e Russell (2004) Expert Opinion on Biological Therapy 4:1685–1692; Hammond et al. (2001) Journal of Virology 75:2087– 2096; Galanis (2010) Clinical Pharmacology and Therapeutics 88:620–625; Blechacz e Russell (2008)Current Gene Therapy 8:162–175; Russell e Peng
7 / 138 (2009) Current Topics in Microbiology and Immunology 330:213–241), e herpesvirus (Shah e Breakefield (2006) Current Gene Therapy 6:361-370; Campadelli-Fiume et al. (2011) Reviews in Medical Virology 21:213–226).
[0014] Cada uma das três abordagens tem vantagens e desvantagens. Uma vantagem principal de uma abordagem recombinatória direta é a especificidade do vetor viral é inerente ao genoma viral e pode ser mantida após a replicação. No entanto, para esta e abordagens recombinantes indiretas, a capacidade de modificar geneticamente o vírus requer que a estrutura do capsídeo seja mantida e o ligante ou andaime de direcionamento seja colocado em uma posição que tolerará e exibirá adequadamente o ligante ou andaime de direcionamento, limitando assim o repertório de ligantes ou andaimes apropriados que podem ser usados. Como tal, os métodos de redirecionamento recombinatório são limitados por moléculas naturalmente existentes úteis como ligantes de direcionamento, levando à incorporação de outros ligantes de ligação, tais como anticorpos ou porções destes. Tanto as plataformas de adaptador não recombinatório quanto recombinatório são vantajosas na flexibilidade do adaptador usado. No entanto, as eficiências de transdução ideais são difíceis de alcançar com esses sistemas de dois componentes.
[0015] É fornecida neste documento uma estratégia de redirecionamento viral que resolve os problemas inerentes em estratégias de redirecionamento recombinatórias anteriores ao inserir um epítopo heterólogo em um capsídeo viral. O capsídeo viral recombinante instantâneo exibe redução do tropismo natural reduzido, que é restaurado e redirecionado após a combinação com uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, compreendendo um parátopo de anticorpo, por exemplo, Fv, que se liga especificamente ao epítopo heterólogo e um ligante de redirecionamento que se liga especificamente a uma célula alvo, particularmente dentro de certas razões de molécula de ligação de vetor
8 / 138 viral:multiespecíficas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0016] São divulgadas neste documento proteínas do capsídeo viral recombinantes, os capsídeos virais compreendendo as proteínas do capsídeo viral recombinantes, vetores virais compreendendo um nucleotídeo de interesse encapsulado pelo capsídeo viral recombinante; em que as referidas proteínas do capsídeo, os capsídeos e os vetores virais são geneticamente modificados para compreender (exibir) um epítopo heterólogo, em que o epítopo heterólogo (porção deste ou em combinação com a proteína do capsídeo viral) forma um par de ligação com um parátopo de anticorpo, e em que a(o) proteína do capsídeo viral recombinante/capsídeo/vetor pode compreender adicionalmente uma mutação, inserção ou deleção em uma posição de aminoácido envolvida com ligação de receptor; por exemplo, o tropismo (natural) da(o) proteína/capsídeo/vetor viral, tal como a proteína do capsídeo viral recombinante ou um capsídeo viral compreendendo a proteína do capsídeo viral recombinante tem um tropismo (natural) reduzido ou anulado (por exemplo, tem, na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, uma eficiência de transdução que é menor do que a eficiência de transdução de uma(um) proteína/capsídeo/vetor que não possui epítopo heterólogo ou uma eficiência de transdução indetectável na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica). Tal tropismo (natural) reduzido ou anulado da proteína do capsídeo viral recombinante/capsídeo/vetor pode ser potencializado ou restaurado na presença de uma fração de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica apropriada. Em conformidade, são descritas também composições compreendendo (1) os vetores virais recombinantes com um capsídeo compreendendo uma proteína do capsídeo recombinante descrita neste documento e (2) uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica compreendendo um parátopo de
9 / 138 anticorpo e um ligante de direcionamento, incluindo as composições compreendendo certas razões de vetor viral:molécula de ligação multiespecífica; e usos das mesmas para direcionar e/ou introduzir material genético a uma célula alvo são também descritas neste documento. São descritos também métodos de redirecionamento de um vetor viral recombinante, por exemplo, para a distribuição direcionada de um nucleotídeo de interesse para uma célula alvo, compreendendo o contato do vetor viral recombinante com uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, e métodos de produção do vetor viral recombinante, também são descritos.
[0017] São descritas neste documento proteínas do capsídeo viral recombinantes compreendendo um epítopo que é heterólogo à proteína do capsídeo, em que o epítopo ou porção deste se liga especificamente a um parátopo de anticorpo, e em que a proteína do capsídeo viral recombinante ou um capsídeo viral que compreende o capsídeo viral recombinante tem um tropismo natural reduzido a anulado, por exemplo, na ausência de uma porção de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica.
[0018] Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido (exibido) pela proteína do capsídeo viral recombinante de modo que a inserção e/ou exibição do epítopo heterólogo reduz ou anula o tropismo (natural) do capsídeo viral em comparação com um capsídeo viral de referência que não possui o epítopo heterólogo, por exemplo, o capsídeo viral compreende uma mutação que compreende uma inserção do epítopo na posição de aminoácido e/ou uma substituição de um aminoácido com o epítopo na posição de aminoácido, em que a mutação reduz ou anula o tropismo (natural) da proteína do capsídeo, por exemplo, na ausência de uma porção de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido (exibido) pela proteína do capsídeo viral de modo que a inserção e/ou exibição reduz parcialmente o
10 / 138 tropismo (natural) do capsídeo viral recombinante comparado com um capsídeo viral de referência que não possui epítopo heterólogo, por exemplo, na ausência de uma fração de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, e o capsídeo viral compreende adicionalmente uma mutação adicional (por exemplo, uma substituição, deleção, inserção que não a inserção de um epítopo heterólogo) que reduz adicionalmente e/ou anula o tropismo (natural) do capsídeo viral recombinante ou vetores virais recombinantes compreendendo o mesmo, por exemplo, na ausência de uma fração de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, em comparação com um capsídeo viral de referência que não possui a mutação.
[0019] Geralmente, as proteínas do capsídeo descritas neste documento podem ser derivadas de um gene do capsídeo, por exemplo, é codificado por um gene do capsídeo modificado para expressar o epítopo e/ou é geneticamente modificado, vírus não envelopado geralmente infectam células humanas ou sorotipos de vírus não envelopados que geralmente infectam células humanas, por exemplo, adenovírus, vírus adeno-associados, etc. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante descrita neste documento é derivada de um gene do capsídeo de AAV, por exemplo, é codificada por um gene do capsídeo modificado para expressar o epítopo e/ou é uma proteína do capsídeo do vírus adeno-associado geneticamente modificada (AAV) de um sorotipo de AAV que infecta primatas, opcionalmente em que o AAV é selecionado dentre o grupo que consiste em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um AAV2, AAV6, AAV8, ou gene do capsídeo de AAV9, por exemplo, é uma proteína do capsídeo de AAV2 geneticamente modificada, uma proteína do capsídeo de AAV6 geneticamente modificada, uma proteína do capsídeo de AAV8 geneticamente modificada, ou uma proteína do capsídeo de AAV9 geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a
11 / 138 proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV2, por exemplo, é codificada por um gene do capsídeo de AAV2 modificado para expressar o epítopo e/ou é uma proteína do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV2 geneticamente modificada, para a qual a sequência de aminoácidos de uma proteína VP1 do tipo selvagem de AAV2 é estabelecida, respectivamente, como SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV6, por exemplo, é codificada por um gene do capsídeo de AAV6 modificado para expressar o epítopo e/ou é uma proteína do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV6 geneticamente modificada, para as quais as sequências de aminoácidos VP1 do tipo selvagem de AAV6 são estabelecidas como SEQ ID NO:3. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV8, por exemplo, é codificada por um gene do capsídeo de AAV8 modificado para expressar o epítopo e/ou é uma proteína do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV8 geneticamente modificada, para a qual a sequência de aminoácidos de uma proteína VP1 do tipo selvagem de AAV é estabelecida, respectivamente, como SEQ ID NO:21. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV9, por exemplo, é codificada por um gene do capsídeo de AAV9 modificado para expressar o epítopo e/ou é uma proteína do capsídeo VP1, VP2 ou VP3 de AAV9 geneticamente modificada, para a qual a sequência de aminoácidos de VP1 do tipo selvagem de AAV9 é estabelecida, respectivamente, como SEQ ID NO:5. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV2, por exemplo, é codificada por um gene do capsídeo de AAV2 modificado para expressar o epítopo e/ou é uma proteína do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV2 geneticamente modificada.
Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV6, por
12 / 138 exemplo, é codificada por um gene do capsídeo de AAV6 modificado para expressar o epítopo e/ou é uma proteína do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV6 geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV8, por exemplo, é codificada por um gene do capsídeo de AAV8 modificado para expressar o epítopo e/ou é uma proteína do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV8 geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV9, por exemplo, é codificada por um gene do capsídeo de AAV9 modificado para expressar o epítopo e/ou é uma proteína do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV9 geneticamente modificada.
[0020] Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de, por exemplo, é codificada por um gene do capsídeo de AAV quimérico modificado para expressar o epítopo, em que o gene do capsídeo de AAV quimérico compreende uma pluralidade de sequências de ácido nucleico, em que cada uma da pluralidade de sequências de ácido nucleico codifica uma porção de uma proteína do capsídeo de um sorotipo de AAV diferente, e em que a pluralidade de sequências de ácido nucleico juntas codifica uma proteína do capsídeo de AAV quimérica. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV2 quimérico. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV6 quimérico. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é derivada de um gene do capsídeo de AAV8 quimérico. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV9 quimérico.
[0021] Geralmente, uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrita neste documento, compreende um epítopo heterólogo inserido e/ou exibido pela proteína do capsídeo recombinante de modo que o
13 / 138 epítopo heterólogo sozinho reduz e/ou anula o tropismo natural da proteína do capsídeo recombinante ou capsídeo que compreende o mesmo, em comparação com um capsídeo de referência sem epítopo ou capsídeo heterólogo que compreende o capsídeo de referência, respectivamente.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido em (exibido em) uma região da proteína do capsídeo envolvida com o tropismo natural da proteína do capsídeo de referência do tipo selvagem, por exemplo, uma região da proteína do capsídeo envolvida com direcionamento celular.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido em e/ou exibido por um domínio knob de uma proteína de fibra Ad.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido em e/ou exibido pela alça HI de uma proteína de fibra Ad.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido em e/ou exibido no sítio de ligação à heparina de uma proteína do capsídeo de AAV.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido em e/ou exibido no sítio de ligação à heparina de uma proteína do capsídeo de AAV2. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido em e/ou exibido no sítio de ligação à heparina de uma proteína do capsídeo de AAV6. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido em e/ou exibido no sítio de ligação à heparina de uma proteína do capsídeo de AAV8. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido em e/ou exibido no sítio de ligação à heparina de uma proteína do capsídeo de AAV9. Em algumas modalidades, (i) a proteína do capsídeo viral é derivada de um gene do capsídeo de AAV2 e o epítopo é inserido após e/ou substitui um aminoácido na posição I453 ou I587 da proteína do capsídeo VP1 de AAV2 e/ou aminoácidos nas posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 de AAV2, (ii) a proteína do capsídeo viral é derivada de um gene do capsídeo de AAV6 e o epítopo é inserido após e/ou substitui um aminoácido na posição I585 da proteína do capsídeo VP1 de AAV6 e/ou aminoácidos nas posições correspondentes das proteínas VP2 de AAV6 e/ou
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VP3; (iii) o capsídeo viral é derivado de um gene do capsídeo de AAV8 e o epítopo é inserido após e/ou substitui um aminoácido na posição I590 da proteína do capsídeo VP1 de AAV8 e/ou aminoácidos nas posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 de AAV8, ou (iv) a proteína do capsídeo viral é derivada de um gene do capsídeo viral de AAV9 e o epítopo é inserido após e/ou substitui um aminoácido na posição I453 ou I589 da proteína do capsídeo VP1 de AAV9 e/ou aminoácidos nas posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 de AAV9. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido imediatamente após (por exemplo, é fundido ao terminal C de) um aminoácido selecionado dentre o grupo que consiste em G453 de proteína do capsídeo VP1 de AAV2 (ou posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 codificadas a partir do gene do capsídeo ou os aminoácidos correspondentes de proteínas do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de um AAV diferente que infecta humanos, por exemplo, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9). N587 de proteínas do capsídeo VP1 de AAV2 (ou posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 codificadas a partir do mesmo gene do capsídeo ou os aminoácidos correspondentes das proteínas do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de um AAV diferente que infecta humanos, por exemplo, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9). Q585 de proteína do capsídeo VP1 de AAV6 (ou posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 codificadas a partir do mesmo gene do capsídeo ou os aminoácidos correspondentes de proteínas do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de um AAV diferente que infecta humanos, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8 e/ou AAV9), N590 de proteína do capsídeo VP1 de AAV8 (ou posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 codificadas a partir do mesmo gene do capsídeo, ou os aminoácidos correspondentes de proteínas do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de um AAV diferente que infecta humano, por exemplo,
15 / 138 proteínas do capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 e AAV9). G453 de proteína do capsídeo VP1 de AAV9 (ou posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 codificadas a partir do mesmo gene do capsídeo, ou os aminoácidos correspondentes de proteínas do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de um AAV diferente que infecta humanos, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 e AAV8) ou A589 de proteína do capsídeo VP1 de AAV9 (ou posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 codificadas a partir do mesmo gene do capsídeo ou os aminoácidos correspondentes de proteínas do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de um AAV diferente que infecta humanos, por exemplo, AAV1, AAV2, AAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 e AAV8). Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido imediatamente após (por exemplo, é fundido ao terminal C de) G453 da proteína do capsídeo VP1 de AAV2 (ou posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 codificadas a partir do mesmo gene do capsídeo, ou os aminoácidos correspondentes de proteínas do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de um AAV diferente que infecta seres humanos, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9). Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido imediatamente após (por exemplo, é fundido ao terminal C de) N587 da proteína do capsídeo VP1 de AAV2 (ou posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 codificadas a partir do mesmo gene do capsídeo, ou os aminoácidos correspondentes de proteínas do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de um AAV diferente que infecta seres humanos, por exemplo, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9). Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido imediatamente após (por exemplo, é fundido ao terminal C de Q585 da proteína do capsídeo VP1 de AAV6 (ou posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 codificadas a partir do mesmo gene do capsídeo, ou os aminoácidos correspondentes de proteínas do capsídeo VP1,
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VP2 e/ou VP3 de um AAV diferente que infecta seres humanos, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8 e AAV9). Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido imediatamente após (por exemplo, é fundido ao terminal C de) N590 da proteína do capsídeo VP1 de AAV8 (ou posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 codificadas a partir do mesmo gene do capsídeo, ou os aminoácidos correspondentes de proteínas do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de um AAV diferente que infecta seres humanos, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 e AAV9). Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido imediatamente após (por exemplo, é fundido ao terminal C de) G453 da proteína do capsídeo VP1 de AAV9 (ou posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 codificadas a partir do mesmo gene do capsídeo, ou os aminoácidos correspondentes de proteínas do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de um AAV diferente que infecta seres humanos, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 e AAV8). Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido imediatamente após (por exemplo, é fundido ao terminal C de) A589 da proteína do capsídeo VP1 de AAV9 (ou posições correspondentes das proteínas do capsídeo VP2 e/ou VP3 codificadas a partir do mesmo gene do capsídeo, ou os aminoácidos correspondentes de proteínas do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de um AAV diferente que infecta seres humanos, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 e AAV8). Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido e/ou exibido entre os aminoácidos N587 e R588 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2 (ou posições correspondentes dos capsídeos VP2 e/ou VP3 codificados a partir do mesmo gene do capsídeo). Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, vetor viral compreendendo um capsídeo viral recombinante e/ou composições compreendendo um capsídeo viral recombinante compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:2.
17 / 138 Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, vetor viral compreendendo um capsídeo viral recombinante e/ou composições compreendendo um capsídeo viral recombinante compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, vetor viral compreendendo um capsídeo viral recombinante e/ou composições compreendendo um capsídeo viral recombinante compreende uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida como SEQ ID NO:25. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, vetor viral compreendendo um capsídeo viral recombinante e/ou composições compreendendo um capsídeo viral recombinante compreende uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida como SEQ ID NO:26. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, vetor viral compreendendo um capsídeo viral recombinante e/ou composições compreendendo um capsídeo viral recombinante compreende uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida como SEQ ID NO:27.
[0022] Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo recombinante, conforme descrita neste documento, compreende uma segunda mutação e uma mutação diferente, além do epítopo heterólogo. Por exemplo, em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrita neste documento, pode ser uma proteína do capsídeo de AAV2 geneticamente modificada, compreender um epítopo heterólogo e pode compreender adicionalmente uma mutação, por exemplo, uma mutação R585A e/ou R588A. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV2, por exemplo, é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2 geneticamente modificada, compreende um epítopo heterólogo inserido imediatamente após (por exemplo, fundido ao terminal C de) G453 da proteína VP1 de AAV2 e
18 / 138 compreende adicionalmente uma mutação selecionada dentre o grupo que consiste em R585A e/ou R5889A. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV 2, por exemplo, é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2 geneticamente modificada, compreende um epítopo heterólogo inserido imediatamente após (por exemplo, fundido ao terminal C de) N587 da proteína VP1 de AAV2 e compreende adicionalmente uma mutação selecionada dentre o grupo que consiste em R585A e/ou R588A. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV9, por exemplo, é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9 geneticamente modificada, compreende um epítopo heterólogo inserido imediatamente após (por exemplo, fundido ao terminal C de) G453 da proteína VP1 de AAV9 e compreende adicionalmente uma mutação W503A. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV9, por exemplo, é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9 geneticamente modificada, compreende um epítopo heterólogo inserido imediatamente após (por exemplo, fundido ao terminal C de) A589 da proteína do capsídeo VP1 de AAV9 e compreende adicionalmente uma mutação W503A.
[0023] Geralmente, uma proteína do capsídeo viral recombinante e/ou um vetor viral que compreende o capsídeo viral recombinante compreende um epítopo heterólogo que tem pelo menos um aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo pode estar entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 35 aminoácidos de comprimento e que forma um par de ligação com um parátopo de anticorpo, por exemplo, um domínio variável de imunoglobulina. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo compreende pelo menos 10 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo compreende um marcador de afinidade. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo e/ou marcador de afinidade
19 / 138 não forma um par de ligação com um domínio constante de imunoglobulina. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo e/ou o marcador de afinidade não formam um par de ligação com um íon metálico, por exemplo, Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+, etc. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo não é um polipeptídeo selecionado dentre o grupo que consiste em estreptavidina, Strep II, HA, L14, 4C-RGD, LH e Proteína A. Em algumas modalidades, a etiqueta de afinidade é selecionada dentre o grupo que consiste em FLAG (SEQ ID NO:7), HA (SEQ ID NO:8) e c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO:6). Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo compreende c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO:6).
[0024] Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2 geneticamente modificada e compreende um epítopo heterólogo compreendendo a sequência EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) inserida imediatamente após (por exemplo, fundida ao terminal C de) G453 da proteína do capsídeo VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante (i) é derivada de um gene do capsídeo de AAV2, por exemplo, é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2 geneticamente modificada, (ii) compreende um epítopo heterólogo que compreende a sequência EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) e é inserida imediatamente após (por exemplo, fundida ao terminal C de) G453 da proteína do capsídeo VP1 de AAV2, e (iii) compreende adicionalmente uma mutação selecionada dentre o grupo que consiste em R585A e/ou R5889A. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2 geneticamente modificada e compreende um epítopo heterólogo compreendendo a sequência EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) inserida imediatamente após (por exemplo, fundida ao terminal C de) N587 da proteína do capsídeo VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante (i) é derivada de um gene do capsídeo de AAV2, por exemplo, é uma proteína do
20 / 138 capsídeo VP1 de AAV2 geneticamente modificada, (ii) compreende um epítopo heterólogo que compreende a sequência EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) e é inserido imediatamente após (por exemplo, fundido ao terminal C de) N587 da proteína do capsídeo VP1 de AAV2, e (iii) compreende adicionalmente uma mutação selecionada dentre o grupo que consiste em R585A e/ou R588A.
Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante (i) é derivada de um gene do capsídeo de AAV6, por exemplo, é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV6, (ii) compreende um epítopo heterólogo que compreende a sequência EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) e é inserida imediatamente após (por exemplo, fundida ao terminal C de) Q585 da proteína do capsídeo VP1 de AAV6. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV8 geneticamente modificada e compreende um epítopo heterólogo compreendendo a sequência EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) inserida imediatamente após (por exemplo, fundida ao terminal C de) N590 da proteína do capsídeo VP1 de AAV8. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9 geneticamente modificada e compreende um epítopo heterólogo compreendendo a sequência EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) inserida imediatamente após (por exemplo, fundida ao terminal C de) G453 da proteína do capsídeo VP1 de AAV9. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante (i) é derivada de um gene do capsídeo de AAV9, por exemplo, é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9 geneticamente modificada, (ii) compreende um epítopo que compreende a sequência EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) e é inserida imediatamente após (por exemplo, fundida ao terminal C de) G453 da proteína do capsídeo VP1 de AAV9 e (iii) compreende adicionalmente uma mutação W503A.
Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9 geneticamente modificada e compreende
21 / 138 um epítopo heterólogo compreendendo a sequência EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) inserida imediatamente após (por exemplo, fundida ao terminal C de) A589 da proteína do capsídeo VP1 de AAV9. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante (i) é derivada de um gene do capsídeo de AAV9, por exemplo, é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9 geneticamente modificada, (ii) compreende um epítopo heterólogo que compreende a sequência EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) e é inserida imediatamente após (por exemplo, fundida ao terminal C de) A589 da proteína do capsídeo VP1 de AAV9 e (iii) compreende adicionalmente uma mutação W503A.
[0025] Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante conforme descrito neste documento compreende a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por e/ou operacionalmente ligada a pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante conforme descrito neste documento compreende a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por e/ou operacionalmente ligada a pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante conforme descrito neste documento compreende EQKLISEEDL (estabelecido como SEQ ID NO:6) inserido em I587 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante conforme descrito neste documento compreende EQKLISEEDL (estabelecido como SEQ ID NO:6) inserido entre N587 e R588 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2, por exemplo, compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO: 2.
[0026] Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante conforme descrito neste documento compreende a sequência de aminoácidos
22 / 138 EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por e/ou operacionalmente ligada a pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV6. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante conforme descrito neste documento compreende EQKLISEEDL (estabelecido como SEQ ID NO:6) inserido em I585 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV6. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante conforme descrito neste documento compreende EQKLISEEDL (estabelecido como SEQ ID NO:6) inserido entre Q585 e S586 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV6, por exemplo, compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO: 4.
[0027] Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante conforme descrito neste documento compreende a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por e/ou operacionalmente ligada a pelo menos 5 aminoácidos contíguos de um capsídeo VP1 de AAV8. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante compreende EQKLISEEDL (estabelecido como SEQ ID NO:6) inserido em I590 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV8. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante como compreende EQKLISEEDL (estabelecido como SEQ ID NO:6) inserido entre N590 e T591 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV8, por exemplo, compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:25.
[0028] Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante conforme descrito neste documento compreende a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por e/ou operacionalmente ligada a pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante compreende EQKLISEEDL (estabelecido como SEQ ID NO:6) inserido em I453 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante compreende
23 / 138 EQKLISEEDL (estabelecido como SEQ ID NO:6) inserido entre G453 e S454 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9, por exemplo, compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:26. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante compreende EQKLISEEDL (estabelecido como SEQ ID NO:6) inserido em I589 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante compreende EQKLISEEDL (estabelecido como SEQ ID NO:6) inserido entre A589 e Q590 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9, por exemplo, compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:27.
[0029] Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo compreende um marcador de afinidade e um ou mais ligantes peptídicos. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo compreende um marcador de afinidade flanqueado por um ligante peptídico, por exemplo, o epítopo heterólogo compreende a partir do terminal N a até o terminal C um primeiro ligante peptídico, um marcador de afinidade e um segundo ligante peptídico. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo ligantes peptídicos são independentemente um polipeptídeo de pelo menos 1 aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, um epítopo heterólogo, conforme descrito neste documento, por exemplo, um marcador de afinidade sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos, tem entre cerca de 5 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo ligantes peptídicos são comprimentos idênticos e/ou compreendem sequências de aminoácidos idênticas.
[0030] Geralmente, na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, tem tropismo natural reduzido ou anulado, por exemplo, tem uma capacidade reduzida ou é incapaz de se direcionar e ligar
24 / 138 uma célula de referência naturalmente permissiva à transdução, por exemplo, um capsídeo que compreende uma proteína do capsídeo viral de referência, por exemplo, um capsídeo que compreende uma proteína do capsídeo viral de referência, por exemplo, uma proteína do capsídeo viral que seria idêntica à proteína do capsídeo viral recombinante, mas para a falta do epítopo heterólogo.
Em algumas modalidades, e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 10% de diminuição na eficiência de transdução em comparação com um capsídeo viral de referência.
Em algumas modalidades, e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 20% de diminuição na eficiência de transdução em comparação com um capsídeo viral de referência.
Em algumas modalidades, e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 30% de diminuição na eficiência de transdução em comparação com um capsídeo viral de referência.
Em algumas modalidades, e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 40% de diminuição na eficiência de transdução em comparação com um capsídeo viral de referência.
Em algumas modalidades, e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína
25 / 138 do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 50% de diminuição na eficiência de transdução em comparação com um capsídeo viral de referência.
Em algumas modalidades, e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 60% de diminuição na eficiência de transdução em comparação com um capsídeo viral de referência.
Em algumas modalidades, e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 70% de diminuição na eficiência de transdução em comparação com um capsídeo viral de referência.
Em algumas modalidades, e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 75% de diminuição na eficiência de transdução em comparação com um capsídeo viral de referência.
Em algumas modalidades, e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 80% de diminuição na eficiência de transdução em comparação com um capsídeo viral de referência.
Em algumas modalidades, e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 85% de diminuição na eficiência de transdução em comparação com um capsídeo viral de referência.
Em algumas
26 / 138 modalidades, e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 90% de diminuição na eficiência de transdução em comparação com um capsídeo viral de referência. Em algumas modalidades, e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 95% de diminuição na eficiência de transdução em comparação com um capsídeo viral de referência. Em algumas modalidades, e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, opcionalmente biespecífica, um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 99% de diminuição na eficiência de transdução em comparação com um capsídeo viral de referência. Em algumas modalidades e na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica,, a transdução de uma célula de controle por um capsídeo viral recombinante que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante conforme descrita neste documento é anulada, por exemplo, indetectável.
[0031] Em algumas modalidades, um capsídeo viral que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, é um capsídeo do mosaico, por exemplo, compreende uma proteína capsídeo viral recombinante que compreende um epítopo heterólogo e uma proteína do capsídeo de referência que não compreende o epítopo heterólogo em uma certa razão. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo de referência é uma proteína do capsídeo de referência do tipo selvagem, em que ela compreende uma sequência de aminoácidos de uma proteína do capsídeo do tipo selvagem com o mesmo sorotipo que a proteína
27 / 138 do capsídeo viral recombinante. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo de referência é uma proteína do capsídeo de referência de controle em que ela compreende uma sequência de aminoácidos da proteína capsídeo viral recombinante, exceto que a proteína do capsídeo de referência de controle carece do epítopo heterólogo. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo de referência é uma proteína de referência do tipo selvagem mutante na medida, em que compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à de uma proteína do capsídeo do tipo selvagem com o mesmo sorotipo que a proteína do capsídeo viral recombinante, mas para uma mutação(por exemplo, uma inserção de uma sequência de aminoácidos, quimerização, etc.) que reduz o tropismo da proteína do capsídeo do tipo selvagem. Em algumas modalidades, uma composição descrita neste documento compreende, ou um método descrito neste documento combina, uma proteína do capsídeo viral recombinante em uma razão que varia de 1:1 a 1:15. Em algumas modalidades, a razão é de 1:2. Em algumas modalidades, a razão é de 1:3. Em algumas modalidades, a razão é de 1:4. Em algumas modalidades, a razão é de 1:5. Em algumas modalidades, a razão é de 1:6. Em algumas modalidades, a razão é de 1:7. Em algumas modalidades, a razão é de 1:8. Em algumas modalidades, a razão é de 1:9. Em algumas modalidades, a razão é de 1:10. Em algumas modalidades, a razão é de 1:11. Em algumas modalidades, a razão é de 1:12. Em algumas modalidades, a razão é de 1:13. Em algumas modalidades, a razão é de 1:14. Em algumas modalidades, a razão é de 1:15.
[0032] São também divulgados neste documento ácidos nucleicos que codificam uma proteína do capsídeo viral recombinante aqui descrita, composições compreendendo tais ácidos nucleicos (por exemplo, que podem ser usados em métodos de produção de um capsídeo viral recombinante) e/ou proteínas capsídeas virais recombinantes (por exemplo, composições que consistem essencialmente em uma proteína do capsídeo viral recombinante,
28 / 138 composições compreendendo apenas vetores virais encapsulados por um capsídeo compreendendo uma proteína do capsídeo viral descrita neste documento, composições compreendendo tais vetores virais e uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica (por exemplo, em determinadas razões entre vetor e molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica (molécula:molécula)), composições compreendendo tais vetores virais, frações de redirecionamento, e um carreador farmaceuticamente aceitável, etc.). Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) e uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos 5 aminoácidos contíguos de um adenovírus ou proteína do capsídeo de vírus adeno-associado.
[0033] Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por e/ou operacionalmente ligada a pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência nucleotídica que codifica EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO:6) inserida em I587 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência nucleotídica que codifica EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO:6) inserida entre N587 e R588 de uma proteína capsídeo VP1 de AAV2, por exemplo, em algumas modalidades, um ácido nucleico conforme descrito codifica uma sequência de aminoácidos que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:2.
[0034] Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme
29 / 138 descrito neste documento, compreende uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por e/ou operacionalmente ligada a pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV6. Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência nucleotídica que codifica EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO:6) inserida em I585 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV6. Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência nucleotídica que codifica EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO:6) inserida entre Q585 e S586 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV6, por exemplo, em algumas modalidades, um ácido nucleico conforme descrito codifica uma sequência de aminoácidos que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:4.
[0035] Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por e/ou operacionalmente ligada a pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV8. Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência nucleotídica que codifica EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO:6) inserida em I590 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV8. Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO:6) inserida entre N590 e T591 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV8, por exemplo, em algumas modalidades, um ácido nucleico conforme descrito codifica uma sequência de aminoácidos que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:25.
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[0036] Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por e/ou operacionalmente ligada a pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9. Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência nucleotídica que codifica EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO:6) inserida em I453 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9. Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO:6) inserida entre G453 e S454 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9, por exemplo, em algumas modalidades, um ácido nucleico conforme descrito codifica uma sequência de aminoácidos que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:26. Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência nucleotídica que codifica EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO:6) inserida em I589 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9. Em algumas modalidades, um ácido nucleico, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO:6) inserida entre A589 e Q590 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9, por exemplo, em algumas modalidades, um ácido nucleico conforme descrito codifica uma sequência de aminoácidos que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:27.
[0037] Geralmente, os vetores virais recombinantes, conforme descritos neste documento, compreendem um capsídeo viral que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, em que o capsídeo viral encapsula um nucleotídeo de interesse.
31 / 138 Em algumas modalidades, o nucleotídeo de interesse está sob o controle de um promotor selecionado dentre o grupo que consiste em um promotor viral, um promotor bacteriano, um promotor de mamífero, um promotor aviário, um promotor de peixe, um promotor de inseto e qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, o nucleotídeo de interesse está sob o controle de um promotor não humano. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de citomegalovírus (CMV). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de EF1α.
[0038] Geralmente, um nucleotídeo de interesse pode ser um ou mais genes, que podem codificar um marcador detectável, por exemplo, repórter, ou um polipeptídeo terapêutico. Em algumas modalidades, o nucleotídeo de interesse é um gene repórter. Em algumas modalidades, o nucleotídeo de interesse é um gene repórter que codifica um marcador detectável selecionado dentre o grupo que consiste em proteína de fluorescência verde, luciferase, β- galactosidase, etc. Em algumas modalidades, o marcador detectável é proteína de fluorescência verde. Em outras modalidades, o nucleotídeo de interesse é selecionado dentre o grupo que consiste em um gene de suicídio, um nucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento deste, um nucleotídeo que codifica um sistema ou porção(ões) de CRISPR/Cas deste, um nucleotídeo que codifica RNA antisense, um nucleotídeo que codifica siRNA, uma enzima secretada, etc. Em uma modalidade, o nucleotídeo de interesse codifica um terapêutico multidomínio, por exemplo, uma proteína que compreende pelo menos dois domínios que fornecem duas funções distintas.
[0039] As composições descritas neste documento geralmente compreendem um vetor viral que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, por exemplo, compreende um capsídeo que compreende a proteína do capsídeo viral recombinante, em que o capsídeo encapsula um nucleotídeo de interesse. Em algumas modalidades, uma composição descrita neste documento compreende (1) um
32 / 138 vetor viral com um capsídeo que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante geneticamente modificada para compreender um epítopo heterólogo, (2) uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, compreendendo (i) um parátopo de anticorpo que se liga especificamente ao epítopo e (ii) um ligante de redirecionamento que se liga especificamente a um receptor e, opcionalmente (3) um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0040] Um parátopo de anticorpo conforme descrito neste documento geralmente compreende, no mínimo, uma região determinante de complementariedade (CDR) que reconhece especificamente o epítopo heterólogo, por exemplo, uma região CDR3 de um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, compreende um anticorpo (ou porção deste) que compreende o parátopo de anticorpo que se liga especificamente ao epítopo heterólogo. Por exemplo, uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, pode compreender uma região variável de cadeia pesada de domínio único ou uma região variável de cadeia leve de domínio único, em que a região variável de cadeia pesada de domínio único ou região variável de cadeia leve de domínio único compreende um parátopo de anticorpo que se liga especificamente ao epítopo heterólogo. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação multiespecífica pode compreender uma região Fv, por exemplo, uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, pode compreender um scFv, que compreende um parátopo de anticorpo que se liga especificamente ao epítopo heterólogo. Em algumas modalidades, a molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica compreende um anticorpo (ou porção deste) que compreende um parátopo de anticorpo que se liga especificamente ao epítopo heterólogo, em que o anticorpo (ou porção deste) compreende adicionalmente um ou mais domínios constantes de
33 / 138 anticorpo (por exemplo, um domínio constante de cadeia pesada (por exemplo, CH1, dobradiça, CH2, CH3, CH4, etc.) e/ou um domínio constante de cadeia leve (por exemplo, CL), em que um ou mais domínios constantes de anticorpo não se ligam ao epítopo heterólogo.
[0041] Uma molécula de ligação multiespecífica, opcionalmente biespecífica, conforme descrita neste documento, compreende adicionalmente um ligante de redirecionamento, além de um parátopo (por exemplo, um anticorpo ou porção deste que compreende o parátopo) que se liga especificamente ao epítopo heterólogo inserido/exibido por uma proteína do capsídeo viral recombinante. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga especificamente a um receptor na superfície de uma esfera (por exemplo, para isolamento e/ou purificação de uma proteína do capsídeo viral recombinante, como descrito neste documento). Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga especificamente a uma proteína de superfície celular, por exemplo, um receptor, marcador de superfície celular, etc., expresso na superfície de uma célula eucariótica (por exemplo, humana), por exemplo, uma célula alvo. Em algumas modalidades, um ligante de redirecionamento se liga a uma célula de fígado (humana), uma célula de cérebro (humana), uma célula T (humana), uma célula de rim (humana), uma célula intestinal (humana), uma célula de pâncreas (humana), uma célula cancerígena (humana) e/ou uma célula (humana) infectada com patógeno heterólogo. Em algumas modalidades, um ligante de redirecionamento se liga a um marcador específico de célula de fígado (humana), um marcador específico de célula de cérebro (humana), um marcador específico de célula T (humana), um marcador específico de célula de rim (humana), um marcador específico de célula intestinal (humana), um marcador específico de célula de pâncreas (humana), um marcador específico de célula tumoral (humana) e/ou um epítopo patogênico.
[0042] Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se
34 / 138 liga a um receptor expresso por uma célula de fígado (humana), por exemplo, um receptor de asialoglicoproteína, por exemplo, hASGR1. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso por uma célula neuronal (humana), por exemplo, GABA, transferrina, etc.
Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso por uma célula T (humana), por exemplo, CD3, por exemplo, CD3ε.
Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso por uma célula-tronco hematopoiética (humana), por exemplo, CD34. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso por uma célula renal (humana). Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso por uma célula muscular (humana), por exemplo, uma integrina.
Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso por uma célula cancerígena (humana), por exemplo, um antígeno associado a tumor, por exemplo, adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-fetoproteína ("AFP"), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusão b3a2 de BCR-ABL, beta-catenina, BING-4, CA-125, CALCA, antígeno carcinoembriônico ("CEA"), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, ciclina-A1, proteína de fusão dek-can, DKK1, EFTUD2, fator de alongamento 2, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, antígeno tumoral epitelial ("ETA"), proteína de fusão ETV6-AML1, EZH2, E6, E7, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE- 3,4,5,6,7, GAS7, glipican-3, GnTV, gp100/Pme117, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralpha2, esterase carboxil intestinal, K-ras, calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 também conhecida como CCDC110, LAGE-1, proteína de fusão LDLR- fucosiltransferaseAS, Lengsin, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-
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A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE- C1, MAGE-C2, enzima málica, mamaglonina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midkina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina, Miosina de classe I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipeptídeo P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusão pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfica ("PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NYMEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, SYT-SSX1 ou proteína de fusão -SSX2, TAG-1, TAG-2, Telomerase, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, triofosfato isomerase, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinase, tirosinase ("TYR"), VEGF, WT1, XAGE-lb/GAGED2a, Kras, NY-ESO1, MAGE-A3, HPV E2, HPV E6, HPV E7, antígeno WT-1 (em linfoma e outros tumores sólidos), receptores ErbB, Melan A [MART1], gp 100, tirosinase, TRP-1/gp 75 e TRP-2 (em melanoma); MAGE-1 e MAGE-3 (em carcinoma de bexiga, cabeça e pescoço e de células não pequenas); proteínas HPV EG e E7 (em câncer cervical); Mucina [MUC-1] (em cânceres de mama, pâncreas, cólon e próstata); antígeno específico da próstata [PSA] (em câncer de próstata); antígeno carcinoembriônico [CEA] (em cânceres de cólon, mama e gastrointestinal) e tais antígenos específicos ao tumor compartilhados como MAGE-2, MAGE-4, MAGE-6, MAGE-10, MAGE-12, BAGE-1, CAGE- 1,2,8, CAGE-3 a 7, LAGE-1, NY-ESO-1/LAGE-2, NA-88, GnTV, TRP2- INT2, etc.
Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a E6 e/ou E7. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a Her2. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga ao receptor de glucagon humano (hGCGR). Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a difosfo-hidrolase trifosfato de ectonucleosídeo humano 3 (hENTPD3).
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[0043] Em algumas modalidades, o parátopo (por exemplo, um anticorpo ou porção deste) e o ligante de redirecionamento são diretamente fundidos uns aos outros. Em algumas modalidades, o parátopo (por exemplo, um anticorpo ou porção deste) que se liga especificamente ao epítopo heterólogo e ao ligante de redirecionamento são ligados covalentemente entre si.
[0044] Em algumas modalidades, a molécula de ligação multiespecífica é uma molécula de ligação biespecífica, por exemplo, um anticorpo que compreende o primeiro e segundo domínios de ligação a antígeno, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno compreende um parátopo que se liga especificamente ao epítopo heterólogo inserido/exibido por uma proteína do capsídeo viral recombinante e o segundo domínio de ligação a antígeno se liga especificamente a uma proteína de superfície celular expressa por uma célula alvo. Em algumas modalidades, a molécula de ligação biespecífica é um anticorpo biespecífico que compreende o primeiro e o segundo domínios de ligação a antígeno, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno compreende um parátopo que se liga especificamente ao epítopo heterólogo inserido/exibido por uma proteína do capsídeo viral recombinante e o segundo domínio de ligação a antígeno se liga especificamente a um receptor expresso por uma célula alvo, em que o segundo domínio de ligação a antígeno está operacionalmente ligado a uma segunda região de cadeia pesada compreendendo um segundo domínio CH3, em que o segundo domínio de ligação a antígeno está operacionalmente ligado a uma segunda região de cadeia pesada compreendendo um segundo domínio CH3, em que o primeiro e o segundo domínio de ligação a antígeno são operacionalmente ligados a uma segunda região de cadeia pesada, em que o primeiro e o segundo domínios de ligação a antígeno CH3 diferem um do outro por pelo menos um aminoácido, e em que pelo menos uma diferença de aminoácido reduz a ligação do anticorpo biespecífico à Proteína A em
37 / 138 comparação com um anticorpo biespecífico que não possui diferença de aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 de Ig se liga à Proteína A e o segundo domínio CH3 de Ig contém uma mutação que reduz ou anula a ligação à Proteína A, tal como uma modificação H95R (por numeração de éxon IMGT; H435R por numeração EU). O segundo domínio CH3 pode compreender adicionalmente uma modificação Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Outras modificações que podem ser encontradas dentro do segundo domínio CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422I por EU) no caso de anticorpos de IgG1; N44S, K52N, e V82I (IMGT; N384S, K392N, e V422I por EU) no caso de anticorpos de IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I por EU) no caso de anticorpos de IgG4.
[0045] Em algumas modalidades, a molécula de ligação multiespecífica é uma molécula de ligação biespecífica, por exemplo, um anticorpo biespecífico compreendendo o primeiro e o segundo domínios de ligação a antígeno, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno se liga a um marcador de afinidade exibido por uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, e em que o segundo domínio de ligação a antígeno se liga a um receptor expresso na superfície de uma célula alvo. Em algumas modalidades, a molécula de ligação multiespecífica é uma molécula de ligação biespecífica, por exemplo, um anticorpo biespecífico que compreende o primeiro e segundo domínios de ligação a antígeno, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno se liga à sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) exibida por uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, e em que o segundo domínio de ligação a antígeno se liga a um receptor expresso na superfície de uma célula alvo. Em algumas modalidades, a molécula de ligação multiespecífica é uma molécula de ligação biespecífica,
38 / 138 por exemplo, um anticorpo biespecífico que compreende o primeiro e segundo domínios de ligação a antígeno, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno se liga à sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) exibida por uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, e em que o segundo domínio de ligação a antígeno se liga a hASGR1. Em algumas modalidades, a molécula de ligação multiespecífica é uma molécula de ligação biespecífica, por exemplo, um anticorpo biespecífico que compreende o primeiro e segundo domínios de ligação a antígeno, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno se liga à sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) exibida por uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, e em que o segundo domínio de ligação a antígeno se liga a uma proteína CD3, por exemplo, CD3ε.
Em algumas modalidades, a molécula de ligação multiespecífica é uma molécula de ligação biespecífica, por exemplo, um anticorpo biespecífico que compreende o primeiro e segundo domínios de ligação a antígeno, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno se liga à sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) exibida por uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, e em que o segundo domínio de ligação a antígeno se liga a uma integrina.
Em algumas modalidades, a molécula de ligação multiespecífica é uma molécula de ligação biespecífica, por exemplo, um anticorpo biespecífico que compreende o primeiro e segundo domínios de ligação a antígeno, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno se liga à sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) exibida por uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, e em que o segundo domínio de ligação a antígeno se liga a uma integrina, por exemplo, hGCGR.
Em algumas modalidades, a molécula de ligação multiespecífica é uma molécula de ligação biespecífica, por exemplo, um anticorpo biespecífico que compreende o primeiro e segundo domínios de ligação a antígeno, em que o
39 / 138 primeiro domínio de ligação a antígeno se liga à sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) exibida por uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, e em que o segundo domínio de ligação a antígeno se liga a ENTPD3.
[0046] Também são descritos neste documento métodos de fazer e usar as proteínas do capsídeo viral recombinantes, vetores virais que compreendem as mesmas, composições, etc. Em algumas modalidades, um método de redirecionamento de um vírus, por exemplo, um adenovírus, vírus adeno-associado, etc.; entrega de carga diagnóstica/terapêutica para uma célula alvo, etc. compreende a combinação de um vetor viral recombinante compreendendo uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, por exemplo, um vetor viral que compreende um capsídeo que compreende um epítopo recombinante que exibe epítopo heterólogo, em que a molécula de ligação biespecífica compreende (i) um parátopo de anticorpo que se liga especificamente ao epítopo e (ii) um ligante de redirecionamento que se liga especificamente a um receptor. Tais métodos podem incluir como uma primeira etapa produzindo um vetor viral recombinante, por exemplo, cultivando uma célula de embalagem em condições suficientes para a produção de vetores virais, em que a célula de embalagem compreende um plasmídeo que codifica a proteína do capsídeo compreendendo o epítopo. Ao fornecer carga diagnóstica/terapêutica a uma célula alvo, os métodos descritos neste documento podem compreender o contato da célula alvo com a combinação de um vetor viral compreendendo um capsídeo que compreende um capsídeo viral recombinante exibindo um epítopo heterólogo e uma molécula de ligação multiespecífica, em que a molécula de ligação multiespecífica compreende i) um anticorpo paráptico que se liga especificamente ao epítopo e (ii) um ligante de redirecionamento que se liga especificamente a um receptor expresso pela célula alvo. Em algumas modalidades, a célula alvo está in vitro. Em outras modalidades, a
40 / 138 célula alvo está in vivo em um sujeito, por exemplo, um humano.
[0047] Em algumas modalidades, uma composição descrita neste documento compreende, ou um método descrito neste documento, combina um vetor viral recombinante que compreende um nucleotídeo de interesse encapsulado com um capsídeo que compreende uma proteína do capsídeo recombinante conforme descrito neste documento e molécula de ligação multiespecífica em uma razão de molécula:molécula que restaura a eficiência de transdução do vetor viral semelhante àquele de um vetor viral de referência. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) varia de 1:0,5 a 1:100. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) varia de 1:4 a 1:20. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação biespecífica (molécula:molécula) varia de 1:8 a 1:15. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) é de 1:4. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) é de 1:8. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) é de 1:15. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) é de 1:20.
[0048] São descritos também neste documento métodos de inativação de um capsídeo viral e/ou produção de vetores virais, cujos métodos geralmente compreendem (a) inserir um ácido nucleico que codifica uma proteína heteróloga em uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do capsídeo viral para formar uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína do capsídeo geneticamente modificada que compreende proteína heteróloga e/ou (b) cultura de uma célula de empacotamento em
41 / 138 condições suficientes para a produção de vetores virais, em que a célula de empacotamento compreende a sequência nucleotídica. Em algumas modalidades, a célula empacotadora compreende ainda um plasmídeo auxiliar e/ou um plasmídeo de transferência compreendendo um nucleotídeo de interesse. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda isolar vetores de vírus adeno-associados autocomplementares do sobrenadante de cultura. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda lisar a célula empacotadora e isolar vetores de vírus adeno-associados de fita única do lisado celular. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda (a) remover debris celulares, (b) tratar o sobrenadante contendo vetores virais com DNase I e MgCl2, (c) concentrar vetores virais, (d) purificar os vetores virais e (e) qualquer combinação de (a)-(d). Também é fornecido neste documento um vetor viral feito de acordo com o método descrito neste documento, e célula de empacotamento útil para produzir um vetor viral conforme descrito neste documento, por exemplo, células de empacotamento que compreendem um plasmídeo que codifica uma proteína do capsídeo recombinante descrita.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0049] A patente ou documento de pedido contém pelo menos uma figura executada em cores. Cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com figura(s) colorida(s) serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[0050] A Figura 1 fornece imagens de microscopia de imunofluorescência (painel superior) ou histogramas obtidos a partir da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) (painel inferior) avaliação da expressão de fluorescência verde (GFP) por células HepG2 incubadas com (A) apenas vetores virais scAAV2-CMV-eGFP do tipo selvagem; (B) apenas vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP; vetores virais scAAV2-N587Myc misturados com anticorpos anti-myc-ASGR1
42 / 138 biespecíficos nas seguintes razões: (C) 1:0,5, (D) 1:1, (E) 1:2, (F) 1:4, (G) 1:8, (H) 1:15, (I) 1:20, (J) 1:50, ou (K) 1:100; (L) ou vetores virais sCaAV-N587Myc misturados com anticorpo anti-myc monoespecífico em uma razão de 1:8.
[0051] A Figura 2A fornece lotes de ponto obtidos a partir da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) avaliando a expressão de fluorescência verde (GFP) por células 29T3-hASGR1 incubadas com vetores virais scAAV2 do tipo selvagem apenas (i), apenas vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (ii), vetores virais scAAV2-N587Myc- CMV-eGFP misturados com anticorpos anti-myc-ASGR1 biespecíficos nas seguintes razões: 1:0,5 (iii), 1:1 (iv), 1:2 (v), 1:4 (vi), 1:8 (vii), 1:15 (viii), 1:20 (ix), ou 1:100 (x), ou vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP misturados com anticorpo anti-myc-GCGR irrelevante em uma razão de 1:8 (xii). A expressão de GFP por células 29T3 incubadas com vetores virais sCaAV-N587Myc misturados com anticorpos anti-myc-ASGR1 biespecíficos em uma razão de 1:8 também é mostrada (xi). Para cada experimento, 2x105 células e 5x109 vetores virais foram usados.
[0052] A Figura 2B fornece histogramas obtidos a partir da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) avaliando a expressão de fluorescência verde (GFP) por células 29T3-hASGR1 incubadas com vetores virais de AAV9-CAGG-GFP não modificados apenas, (i) vetores virais de AAV9- A589Myc -CAGG-eGFP apenas (ii), vetores virais de AAV9- A589Myc -CAGG-eGFP misturados com anticorpos anti-myc- ASGR1 biespecíficos nas seguintes razões: 1:1 (iii), 1:2 (iv), 1:4 (v), 1:8 (vi), 1:20 (vii), 1:50 (viii) ou 1:100 (ix). Para cada experimento, 2x105 células e 1x1010 vetores virais (titulados por qPCR) foram usados.
[0053] A Figura 3 fornece lotes de ponto obtidos a partir da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) avaliando a expressão de fluorescência verde (GFP) por células 29T3-hASGR1 pré-incubadas com
43 / 138 anticorpo anti-ASGR1 bivalente a uma concentração de 0 nM (C), 50 nM (D), 10 nM (E), 2 nM (F), 0,4 nM (G), 0,08 nM (H), 0,016 nM (I) ou 0,0032 nM (J) e posteriormente infectados com vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV- eGFP misturados com anticorpos anti-myc-ASGR1 biespecíficos em uma razão de 1:8 (L). 293T3-hASGR1 células incubadas com apenas vetores virais scAAV do tipo selvagem (A) ou apenas vetores virais scAAV2- N587Myc-CMV-eGFP (B) servem como controles. Para cada experimento, 2x105 células e 5x109 vetores virais (conforme titulado por qPCR) foram usados.
[0054] A Figura 4 fornece imagens de microscopia de imunofluorescência avaliando a expressão de fluorescência verde (GFP) por células 293T-hASGR1 incubadas com vetores virais scAAV do tipo selvagem apenas (A), apenas vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (B), ou incubada sequencialmente com 1x109 (C), 2x109(D), 4x109(E), 8x109 (F), 2x1010 (G), 1x1011 (H), 1x1012 (I) anticorpos anti-myc-ASGR1 biespecíficos seguidos por 1x109 vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP. Também são mostradas imagens de microscopia de imunofluorescência de 293T células sequencialmente incubadas com 1x1011 moléculas de anticorpo anti- myc-ASGR1 seguido por 1x109 vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV- eGFP (J), e células 293T-hASGR1 sequencialmente incubadas com 1x1011 moléculas de anticorpo anti-myc-GCGR biespecíficas irrelevantes seguido por 1x109 vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (K).
[0055] A Figura 5 fornece lotes de ponto obtidos a partir da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) avaliando a expressão de fluorescência verde (GFP) por células 29T3-hASGR1 incubadas com vetores virais ssAAV do tipo selvagem apenas (A), apenas vetores virais ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP (B), vetores virais ssAAV2-N587Myc- CMV-hrGFP misturados com anticorpos anti-myc-ASGR1 biespecíficos nas seguintes razões: 1:1 (C), 1:2 (D), 1:4 (E), 1:8 (F), 1:20 (G), 1:100 (H),
44 / 138 1:1000 (I), ou vetores virais ssAAV-N587Myc misturados com anticorpo anti-myc-GCGR irrelevante em uma razão de 1:8 (K). A expressão de GFP por células 29T3 incubadas com vetores virais ssAAV-N587Myc misturados com anticorpos anti-myc-ASGR1 biespecíficos em uma razão de 1:8 também é mostrada (J). Para cada experimento, 2x105 células e 5x109 vetores virais foram usados.
[0056] A Figura 6 fornece lotes de ponto obtidos a partir da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) avaliando a expressão de fluorescência verde (GFP) por células 29T3-hGCGR incubadas com apenas vetores virais scAAV do tipo selvagem (A), apenas vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (B), vetores virais scAAV2-N587Myc- CMV-eGFP misturados com anticorpos anti-myc-GCGR biespecíficos nas seguintes razões: 1:0,5 (C), 1:1 (D), 1:2 (E), 1:4 (F), 1:8 (G), 1:15 (H), 1:20 (I), 1:50 (J) ou 1:100 (K), ou vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP misturados com um anticorpo anti-myc monoespecífico irrelevante (Regeneron Pharmaceuticals, Tarrytown, NY) em uma razão de 1:8 (L). Para cada experimento, 2x105 células e 5x109 vetores virais foram usados.
[0057] A Figura 7 fornece lotes de pontos obtidos a partir da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) avaliando a expressão de fluorescência verde (GFP) por células Jurkat sozinhas (A) ou células Jurkat incubadas com vetores virais sCaAV6-EF1-eGFP do tipo selvagem apenas (B), vetores virais AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP apenas (C), vetores virais AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP misturados com anticorpos anti-myc-CD3 biespecíficos nas seguintes razões: 1:1 (D), 1:5 (E), 1:10 (F), 1:100 ou (G), 1:1000 (H). Para cada experimento, 2x105 células e 1x109 vetores virais foram usados.
[0058] A Figura 8A fornece imagens de microscopia de imunofluorescência do fígado. A Figura 8B fornece imagens de microscopia de imunofluorescência do baço. A Figura 8C fornece imagens de
45 / 138 microscopia de fluorescência do rim. Todas as amostras são retiradas de camundongos C57BL/6 transgenicamente modificados para expressar ASGR1 humano por células hepáticas (i-iv) ou camundongos C57BL/6 do tipo selvagem (v-viii) dez dias após a injeção intravenosa com 1x1011 scAAV2- CMV-eGFP tipo selvagem (i, v), solução salina (ii, vi), 1x1011 vetores virais scAAV2-N587myc-CMV-eGFP sozinhos (iii, vii), ou vetores virais scAAV2- N587myc-CMV-eGFP com anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico (iv, viii).
[0059] A Figura 9 fornece imagens de microscopia de fluorescência de amostras de fígado tiradas de camundongos C57BL/6 transgenicamente modificados para expressar ASGR1 humano em células hepáticas (D-F, J-L, P-R) ou camundongos C57BL/6 do tipo selvagem (A-C, G-I, M-O) quatro semanas após a injeção intravenosa com 2,18x1011 ssAAV2-CAGG-eGFP do tipo selvagem (B, C, E, F), solução salina (A, D), 2,18x1011 vetores virais ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP sozinhos (G-I, J-L), ou vetores virais ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP com anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico (M-O, P-R). Cada imagem representa um camundongo.
[0060] A Figura 10 fornece imagens de microscopia de imunofluorescência de amostras de fígado tiradas de camundongos C57BL/6 transgenicamente modificados para expressar ASGR1 humano por células de fígado dez dias após injeção intravenosa com (A) AAV9 do tipo selvagem, (B) 250 nM de NaCl (C) partículas virais de AAV9-A589myc-CAGG-eGFP em combinação com anticorpo anti-myc-hCD3 biespecífico, ou (D) partículas virais de AAV9-A589myc-CAGG-eGFP em combinação com anticorpo anti- myc-ASGR1 biespecífico.
[0061] A Figura 11 fornece formatos de molécula de ligação multiespecífica exemplificativos não limitativos úteis em algumas modalidades da invenção.
[0062] A Figura 12 fornece lotes de ponto obtidos a partir da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) avaliando a expressão
46 / 138 de fluorescência verde (GFP) por células 29T3-hASGR1 incubadas com (A)__ somente vetores virais AAV8 do tipo selvagem, (C) vetores virais AA8-N590-myc apenas, ou vetores virais pAAV RC8 N590myc misturados com moléculas biespecíficas anti-hASGR1-Igg4-Fc/anti-myc biespecíficas nas seguintes razões (D) 1:1, (E) 1:2, (F) 1:4, (G) 1:8, (A) 1:12, (I) 1:15, (J) 1:50, ou (K) 1:100. A expressão de GFP por células 29T3-hASGR1 transfectadas também é mostrada (B). Para cada experimento, 2x105 células e 1x109 vetores virais foram usados.
[0063] A Figura 13 fornece imagens microscópicas de imunofluorescência de amostras de fígado tiradas de camundongos C57BL/6 transgenicamente modificados para expressar ASGR1 humano por células de fígado dez dias após injeção intravenosa com vetores virais (A)-(C) de AAV8 do tipo selvagem, (D)-(F) AA8-N590-myc e molécula de ligação biespecífica de controle ou (G)-(I) partículas virais N590myc-CAGG-eGFP de AAV8 em combinação com moléculas de ligação biespecíficas anti-hASGR1-IgG4- Fc/anti-myc.
[0064] A Figura 14 fornece lotes de ponto obtidos a partir da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) avaliando a expressão de fluorescência verde (GFP) por células 29T3-h ENTPD3 incubadas com (A) vetores virais de AAV2 do tipo selvagem apenas, (B) vetores virais AAV2- N587Myc-CAGG-eGFP apenas, ou vetores virais AAV2-N587Myc-CAGG- eGFP misturados com moléculas biespecíficas anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti- myc biespecíficas nas seguintes razões (C) 1:1, (D) 1:2, (E) 1:4, (F) 1:8, (G) 1:20, (H) 1:50, (I) 1:100, ou (K) 1:200. Para cada experimento, 2x105 células e 1x109 vetores virais foram usados
[0065] A Figura 15A fornece imagens microscópicas de imunofluorescência de amostras de fígado, a Figura 15B fornece imagens microscópicas de imunofluorescência das amostras do intestino, e a Figura 15C fornece imagens microscópicas de imunofluorescência de amostras de
47 / 138 pâncreas. Todas as amostras são retiradas de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem dez dias após injeção intravenosa com PBS (15A(i), 15B(i) e 15C(i)), 5x1011 AAV9 do tipo selvagem (15A(ii), 15B(ii), e 15C(ii)), 5x1011 vetores virais AAV2-N587myc-CAGG-eGFP com 1x103 proteínas de ligação a Igg4-Fc/anti-myc biespecíficas irrelevantes (15A(iii), 15B(iii), e 15C(iii)), ou 5x1011 vetores virais AAV2-N587myc-CAGG-eGFP com 1x1013 proteínas de ligação a hENTPD3-Igg4-Fc/anti-myc biespecíficas (15A (iv), 15B (iv) e 15C (iv)).
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0066] Um problema comum com as abordagens do adaptador usando capsídeos virais não modificados ou capsídeos virais modificados por andaime tem sido a eficiência de transdução do substrato dos capsídeos modificados. (Grifman et al. (2001) Mol. Ther. 3:964-75). Por exemplo, Curiel et al. descrevem a geração e caracterização de vetor adenoviral recombinante contendo fibras com uma sequência RGD-4C geneticamente incorporada dentro da alça HI do domínio knob terminal carbóxi e demonstra a utilidade da alça HI do nó de fibra como um sítio ideal para incorporação de ligantes de peptídeo curto. Vide, por exemplo,, Patente U.S. nº 7,297,542; vide também Beatty e Curiel (2012) Adv. Cancer. Res. 115:39-67. Da mesma forma, a inserção de peptídeos ligantes em proteínas do capsídeo de AAV resultou em capsídeos que foram capazes de exibir o ligante na superfície do capsídeo e mediam a transdução através da interação do ligante com seu receptor, direcionando o tropismo viral por modificações do capsídeo genéticas (Girod et al. (1999) Nat. Med. 5(9):1052-6, 1438 (errata incluída) (1999); Grifman et al. (2001) Mol. Ther. 3(6):964-75; Nicklin et al. (2001) Mol. Ther. 4(3):174-81; Shi et al. (2001) Hum Gene Ther. 17(3):353-61 (2006); Wu et al. (2000)J. Virol. 74(18):8635-47). Em particular, demonstrou- se que a inserção de um motivo de Arg-Gly-Asp (RGD) de ligação de integrina no sítio de inserção I-587 dos vetores virais AAV ativados VP1 de
48 / 138 proteína do capsídeo de AAV para transduzir células via αvβ1 integrinas (Girod et al. (1999) supra). Em contraste, embora a inserção do peptídeo 14- aminoácido L14 após o aminoácido R447 (I-447) levou a capsídeos ainda reconhecidos pelo anticorpo sensível à conformação A20, tais vetores virais recombinantes foram incapazes de transduzir as células que expressam o receptor L-14, (Girod et al., 1999; cf Wu et al. (2000) (relatando a inserção de um peptídeo de hemaglutinina (HA) na posição I-447e a transdução bem sucedida das células que expressam peptídeo HA). A inserção de um epítopo Myc entre T448 e N449 foi reconhecida por um anticorpo anti-myc e, portanto, estava presente na superfície do capsídeo, mas levou a vetores virais inativados. (Grifman et al., 2001). Em contraste, o redirecionamento bem sucedido foi novamente relatado para a inserção de um motivo NGR após N587, mas não a inserção do c-myc após N587. (Grifman et al., 2001). A Patente U.S. nº 9,624,274 descreve I-453 de uma proteína do capsídeo de AAV como um sítio de inserção adequado para um epítopo heterólogo. Embora esses estudos demonstrem a inserção bem-sucedida e exibição de um peptídeo heterólogo, por exemplo, epítopo, por proteínas do capsídeo de AAV, nenhum desses estudos fornece qualquer expectativa de que uma molécula de ligação multiespecífica, por exemplo, uma molécula de ligação biespecífica tal como um anticorpo biespecífico, que se liga especificamente ao peptídeo heterólogo e a uma proteína de superfície celular, pode retardar os vetores virais modificados em direção às células que expressam a proteína de superfície celular e restaurar suas eficiências de transdução.
[0067] São divulgadas neste documento proteínas do capsídeo viral recombinantes que são modificadas com um epítopo heterólogo, que pode ser usado em conexão com uma molécula de ligação multiespecífica que compreende um parátopo, por exemplo, domínio Fv, que se liga especificamente ao epítopo e um ligante que se liga a um receptor expresso na superfície de uma célula alvo. Conforme mostrado neste documento, os
49 / 138 vetores virais em contato com capsídeos formados com proteínas do capsídeo descritas neste documento com uma molécula de ligação multiespecífica em certas razões restaura a eficiência de transdução do capsídeo viral para níveis comparáveis ao vírus do tipo selvagem, vide, por exemplo,, Exemplo 2. Geralmente, as proteínas do capsídeo modificadas com epítopos heterólogos, conforme descrito neste documento, podem ser derivadas de um vírus não envelopado, tal como, mas não limitado a, adenovírus (Ad) e vírus adeno- associado (AAV).
[0068] Embora a invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referência a uma série de modalidades, seria entendido por aqueles versados na técnica que alterações na forma e detalhes podem ser feitas às várias modalidades divulgadas neste documento sem se afastar do espírito e escopo da invenção e que as várias modalidades divulgadas neste documento não se destinam a agir como limitações no escopo das reivindicações.
[0069] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, alguns métodos e materiais preferenciais são agora descritos. Todas as publicações citadas neste documento são incorporadas neste documento por referência em sua integralidade. Salvo definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. Definições
[0070] Salvo definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence.
[0071] As formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem referências plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Portanto, por
50 / 138 exemplo, uma referência a "um método" inclui um ou mais métodos e/ou etapas do tipo descrito neste documento e/ou que ficará evidente para aqueles versados na técnica após leitura desta divulgação.
[0072] O termo "anticorpo" inclui moléculas de imunoglobulina que compreendem quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende um domínio variável de cadeia pesada (V-H) e uma região constante de cadeia pesada (CH). A região constante de cadeia pesada compreende pelo menos três domínios, CH1, CH2, CH3 e opcionalmente CH4. Cada cadeia leve compreende um domínio variável de cadeia leve (CH) e uma região constante de cadeia leve (CL). Os domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve podem ser ainda subdivididos em regiões de hipervariabilidade, regiões determinantes de complementariedade (CDR) denominadas, interespaçadas com as regiões que não mais conservadas, regiões de framework denominadas (FR). Cada domínio variável de cadeia pesada e leve compreende três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDRs de cadeia pesada podem ser abreviadas como HCDR1, HCDR2 e HCDR3; CDRs de cadeia leve podem ser observadas como LCDR1, LCDR2 e LCDR3. As estruturas de anticorpos tetramérica típicas compreendem dois domínios de ligação a antígeno idênticos, cada um dos quais formados pela associação dos domínios VH e VL e cada um dos quais juntamente com os respectivos domínios CH e CL formam a região Fv do anticorpo. Os anticorpos de domínio único compreendem um único domínio de ligação a antígeno, por exemplo, um VH ou um VL. O termo "anticorpo" engloba anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos de F(ab′), Fvs ligados a dissulfeto (sdFv),
51 / 138 intrabodies, minibodies, diabodies e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para TCR específico ao antígeno) e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos acima. Os termos “anticorpo” e “anticorpos” também se referem a diabodies covalentes, tais como aqueles divulgados em Pedido de Patente U.S. Pub. 2007/0004909 e Ig- DARTS, tais como aqueles divulgados em Pedido de Patente U.S. de Patente U.S. 2009/0060910. Os anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente ativos de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação a antígeno. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse.
[0073] O domínio de ligação a antígeno de um anticorpo, por exemplo, a parte de um anticorpo que reconhece e se liga ao epítopo de um antígeno, também é referido como um "parátopo". É uma pequena região (de 5 a 10 aminoácidos) de uma região Fv de um anticorpo, parte do fragmento de ligação a antígeno (região Fab) e pode conter partes das cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo. Um parátopo se liga especificamente a um epítopo quando o parátopo se liga ao epítopo com uma alta afinidade. O termo anticorpo de "alta afinidade" refere-se a um anticorpo que tem um KD em relação ao seu epítopo alvo em cerca de 10-9 M ou inferior (por exemplo, cerca de 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, ou cerca de 1 x 10-12 M). Em uma modalidade, KD é medido pela ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, BIACORE™; em outra modalidade, KD é medido por ELISA.
[0074] A frase "região determinante de complementariedade", ou o termo "CDR", inclui uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácido nucleico de genes de imunoglobulina de um organismo que normalmente (isto é, em um animal de tipo selvagem) aparece entre duas regiões de framework em uma região variável de uma cadeia leve ou pesada
52 / 138 de uma molécula de imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo ou um receptor de célula T). Uma CDR pode ser codificada, por exemplo, por uma sequência de linhagem germinativa ou por uma sequência rearranjada ou não rearranjada, e, por exemplo, por uma célula B ou célula T madura ou não exposta. Uma CDR pode ser um mutante somático (por exemplo, variar de uma sequência codificada na linhagem germinativa de um animal), humanizado e/ou modificado com substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Em algumas circunstâncias (por exemplo, para uma CDR3), as CDRs podem ser codificadas por duas ou mais sequências (por exemplo, sequências de linhagem germinativa) que não são contíguas (por exemplo, em uma sequência de ácido nucleico não rearranjada) mas são contíguas em uma sequência de ácido nucleico de célula B, por exemplo, como o resultado de splicing ou ligação das sequências (por exemplo, recombinação V-D-J para formar uma CDR3 de cadeia pesada).
[0075] Um "epítopo" é a parte de uma macromolécula que é reconhecida pelo sistema imune, especificamente por anticorpos, células B ou células T citotóxicas. Embora os epítopos geralmente sejam considerados derivados de proteínas não próprias, as sequências derivadas do hospedeiro que podem ser reconhecidas também são classificadas como epítopos. Os epítopos têm um comprimento de pelo menos 4 aminoácidos, preferencialmente de 4 a 30 aminoácidos, mais preferencialmente de 5 a 20 aminoácidos, especialmente de 5 a 15 aminoácidos. Os epítopos podem ser lineares ou tridimensionais formados normalmente por aminoácidos que são distantes uns dos outros na estrutura proteica primária, mas se tornam intimamente relacionados em uma estrutura secundária e/ou terciária. Os epítopos que são especificamente reconhecidos pelas células B são referidos como epítopos de células B.
[0076] A expressão "Repetição terminal invertida" ou "ITR" inclui sequências de ácido nucleico simétricas no genoma de vírus adeno-associados
53 / 138 necessários para replicação eficiente. As sequências de ITR estão localizadas em cada extremidade do genoma de DNA de AAV. Os ITRs servem como as origens de replicação para síntese de DNA viral e são componentes cis essenciais para gerar vetores que integram AAV.
[0077] A expressão " cadeia leve " inclui uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina de qualquer organismo e, exceto se especificado em contrário, inclui cadeias humanas κ e λ e leves e um VpreB, bem como cadeias leves substitutas. Os domínios variáveis de cadeia leve normalmente incluem três CDRs de cadeia leve e quatro regiões de framework (FR), salvo se especificado de outro modo. Geralmente, uma cadeia leve de comprimento total inclui, do terminal amino ao terminal carboxila, um domínio variável que inclui FR1-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 e uma região constante de cadeia leve. Um domínio variável de cadeia leve é codificado por uma sequência de gene de região variável de cadeia leve, que geralmente compreende segmentos de gene de VL e JL derivados de um repertório de segmentos de gene de V e J presentes na linhagem germinativa. As sequências, localizações e nomenclatura para segmentos de cadeia leve V e J para vários organismos podem ser encontrados no banco de dados IMGT, www.imgt.org. Cadeias leves incluem aquelas que, por exemplo, ligam não seletivamente um primeiro ou um segundo epítopo seletivamente ligado pela proteína de ligação ao epítopo em que aparecem. As cadeias leves também incluem aquelas que ligam e reconhecem, ou auxiliam a cadeia pesada ou outra cadeia leve com ligação e reconhecimento de um ou mais epítopos ligados seletivamente pela proteína de ligação ao epítopo em que aparecem. As cadeias leves comuns ou universais incluem aquelas derivadas de um gene Vκ1-39Jκ humano ou um gene Vκ3-20Jκ humano e incluem versões somaticamente mutadas (por exemplo, maturadas por afinidade) dos mesmos. Os segmentos VL humanos exemplificativos incluem um segmento de gene Vκ1-39 humano, um segmento de gene Vκ3-20 humano, um segmento de
54 / 138 gene Vλ1-40 humano, um segmento de gene Vλ1-44 humano, um segmento de gene Vλ2-8 humano, um segmento de gene Vλ2-14 humano e um segmento de gene Vλ3-21 humano, e incluem versões somaticamente mutadas (por exemplo, maturadas por afinidade) dos mesmos. As cadeias leves podem ser feitas de modo que compreendam um domínio variável de um organismo (por exemplo, humano ou de roedor, por exemplo, rato ou camundongo; ou de aves, por exemplo, galinha) e uma região constante do mesmo organismo ou de um organismo diferente (por exemplo, humano ou de roedor, por exemplo, rato ou camundongo; ou de aves, por exemplo, frango).
[0078] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" inclui estar dentro de uma faixa estatisticamente significativa de um valor. Tal faixa pode estar dentro de uma ordem de magnitude, preferencialmente dentro de 50%, mais preferencialmente dentro de 20%, ainda mais preferencialmente dentro de 10% e ainda mais preferencialmente dentro de 5% de um dado valor ou faixa. A variação permitida abrangida pelo termo "cerca de" ou "aproximadamente" depende do sistema específico em estudo e pode ser facilmente apreciada por aquele versado na técnica.
[0079] O termo "marcador de afinidade" inclui uma sequência de polipeptídeo que é um membro de um par de ligação específico, por exemplo, que se liga especificamente a outra sequência de polipeptídeo, por exemplo, um parátopo de anticorpo, com alta afinidade. Os marcadores de afinidade exemplificativos e não limitativos incluem marcador de hexa-histidina, marcador FLAG, marcador de Strep II, marcador de peptídeo de ligação a estreptavidina (SBP), peptídeo de ligação a calmodulina (CBP), glutiona S- transferase (GST), proteína de ligação a maltose (MBP), S-tag e marcador c- Myc. (Revisado em Zhao et al. (2013) J. Analytical Meth. Chem. 1-8; incorporado neste documento por referência).
[0080] O termo "proteína do capsídeo" inclui uma proteína que é parte do capsídeo do vírus. Para vírus adeno-associados, as proteínas do capsídeo
55 / 138 são geralmente referidas como VP1, VP2 e/ou VP3, e cada uma é codificada por um único gene cap.
Para AAV, as três proteínas do capsídeo de AAV são produzidas de uma forma sobreposta a partir da estrutura de leitura aberta cap (ORF) via splicing alternativo de mRNA e/ou uso de códon de iniciação translacional alternativo, embora todas as três proteínas usem um códon de parada comum.
Warrington et al. (2004) J.
Virol. 78:6595, incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
VP1 de AAV2 é geralmente traduzido a partir de um códon de partida ATG (aminoácido M1) em um mRNA de 2,4 kb, enquanto que VP2 e VP3 de AAV2 surgem de um mRNA de 2,3 kb menor, usando um códon de partida de ACG mais fraco para produção de VP2 (aminoácido T138) e tradução de leitura para o próximo códon de ATG disponível (aminoácido M203) para a produção da proteína do capsídeo mais abundante, VP3. Warrington, supra Rutledge et al.. (1998) J.
Virol. 72:309-19, incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
As sequências de aminoácidos das proteínas do capsídeo de vírus adeno-associados são bem conhecidas na técnica e geralmente conservadas, particularmente nos dependoparvovírus.
Vide, Rutledge et al., supra.
Por exemplo, Rutledge et al. (1998), supra, fornece os alinhamentos da sequência de aminoácidos da Figura 4B para as proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3 de AAV2, AAV3, AAV4 e AAV6, em que os sítios de partida para cada uma das proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3 são indicados pelas setas e os domínios variáveis estão em caixas.
Consequentemente, embora as posições de aminoácido fornecidas neste documento possam ser fornecidas em relação à proteína do capsídeo VP1 das posições de AAV e de aminoácido fornecidas neste documento que não são adicionalmente especificadas, referem-se à sequência de AAV2 da proteína de revestimento principal VP1 estabelecida como SEQ ID NO:1, aquele versado na técnica seria capaz de respectivamente e facilmente determinar a posição desse mesmo aminoácido dentro da proteína do capsídeo VP2 e/ou VP3 de AAV e a posição
56 / 138 correspondente de aminoácidos entre diferentes sorotipos. Além disso, aquele versado na técnica seria capaz de trocar domínios entre proteínas do capsídeo de sorotipos de AAV diferentes para a formação de uma "proteína do capsídeo quimérica".
[0081] A troca de domínio entre dois construtos de proteína do capsídeo de AAV para a geração de uma "proteína do capsídeo de AAV quimérica" foi descrita, vide, por exemplo, Shen et al. (2007) Mol. Therapy 15(11):1955-1962, incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Uma "proteína do capsídeo de AAV quimérica" inclui uma proteína do capsídeo de AAV que compreende sequências de aminoácidos, por exemplo, domínios, de dois ou mais sorotipos de AAV diferentes e que é capaz de formar e/ou formar uma partícula do capsídeo/viral semelhante a AAV. Uma proteína do capsídeo de AAV quimérica é codificada por um gene do capsídeo de AAV quimérico, por exemplo, um nucleotídeo compreendendo uma pluralidade, por exemplo, pelo menos duas sequências de ácido nucleico, cada uma das quais a pluralidade é idêntica a uma porção de um gene do capsídeo que codifica uma proteína do capsídeo de sorotipos de AAV distintos, e em que a pluralidade em conjunto codifica uma proteína do capsídeo de AAV funcional. Referência a uma proteína do capsídeo quimérica em relação a um sorotipo de AAV específico indica que a proteína do capsídeo compreende um ou mais domínios de uma proteína do capsídeo deste sorotipo e um ou mais domínios de uma proteína do capsídeo de um sorotipo diferente. Por exemplo, uma proteína do capsídeo quimérica de AAV2 inclui uma proteína do capsídeo compreendendo um ou mais domínios de uma proteína do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV2 e um ou mais domínios de uma proteína do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de um AAV diferente.
[0082] Um "capsídeo do mosaico" compreende pelo menos dois conjuntos de proteínas VP1, VP2 e/ou VP3, cada um deles cujo conjunto é
57 / 138 codificado por um gene cap diferente.
[0083] Em algumas modalidades, um capsídeo do mosaico descrito neste documento compreende as proteínas VP1, VP2 e/ou VP3 recombinantes codificadas por um gene cap geneticamente modificado com uma inserção de uma sequência de ácido nucleico que codifica um epítopo heterólogo e compreende adicionalmente proteínas VP1, VP2 e/ou VP3 codificadas por um gene cap de referência, por exemplo, um gene cap de referência do tipo selvagem que codifica as proteínas VP1, VP2 e/ou VP3 do tipo selvagem do mesmo sorotipo de AAV que as proteínas VP1, VP2 e/ou VP3 recombinantes, um gene cap de referência de controle que codifica as proteínas VP1, VP2 e/ou VP3 idênticas às proteínas VP1, VP2 e VP3 recombinantes, mas para a ausência do epítopo heterólogo, um gene cap do tipo selvagem mutante que codifica as proteínas VP1, VP2 e/ou VP3 do tipo selvagem do mesmo sorotipo de AAV que as proteínas VP1, VP2 e/ou VP3 recombinantes, mas para uma mutação (por exemplo, inserção, substituição, deleção), cuja mutação reduz preferencialmente o tropismo das proteínas VP1, VP2 e VP3 do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo de referência é uma proteína de referência quimérica compreendendo pelo menos um domínio de proteínas VP1, VP2 e/ou VP3 do mesmo sorotipo de AAV que as proteínas VP1, VP2 e/ou VP3 recombinante. Em algumas modalidades, o gene cap de referência codifica uma proteína VP1, VP2 e/ou VP3 quimérica.
[0084] A frase "cadeia pesada" ou "cadeia pesada de imunoglobulina" inclui uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina, de qualquer organismo. Os domínios variáveis de cadeia pesada incluem três CDRs de cadeia pesada e quatro regiões FR, salvo se especificado em contrário. Os fragmentos de cadeias pesadas incluem CDRs, CDRs e FRs e suas combinações. Uma cadeia pesada típica tem, seguindo o domínio
58 / 138 variável (N-terminal a C-terminal), um domínio CH1, uma dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. Um fragmento funcional de uma cadeia pesada inclui um fragmento que é capaz de reconhecer especificamente um epítopo (por exemplo, reconhecendo o epítopo com um KD em faixa micromolar, nanomolar ou picomolar), que é capaz de expressar e secretar a partir de uma célula e que compreende pelo menos uma CDR. Os domínios variáveis de cadeia pesada são codificado por uma sequência de nucleotídeo de região variável, que geralmente compreende segmentos de VH, DH e JH derivados de um repertório de segmentos VH, DH e JH presentes na linhagem germinativa. As sequências, localizações e nomenclatura para segmentos de cadeia pesada V, D e J para vários organismos podem ser encontrados no banco de dados IMGT, que é acessível através da internet na "world wide web" (www) na URL "imgt.org".
[0085] O termo "anticorpo apenas de cadeia pesada", "proteína de ligação a antígeno de cadeia pesada apenas", "proteína de ligação a antígeno de domínio único", "proteína de ligação de domínio único" ou semelhantes refere-se a uma molécula de imunoglobulina monomérica ou homodimérica compreendendo uma cadeia semelhante a imunoglobulina compreendendo um domínio variável operacionalmente ligado a uma região constante de cadeia pesada, que é incapaz de associar-se a uma cadeia leve devido à região constante de cadeia pesada tipicamente carecer de um domínio CH1 funcional. Nesse sentido, o termo "anticorpo apenas de cadeia pesada", "proteína de ligação a antígeno de cadeia pesada", "proteína de ligação a antígeno de domínio único", "proteína de ligação de domínio único" ou similares englobam (i) uma proteína de ligação a antígeno de domínio único monomérico compreendendo uma da cadeia semelhante a imunoglobulina compreendendo um domínio variável operacionalmente ligado a uma região constante de cadeia pesada sem um domínio CH1 funcional, ou (ii) uma proteína de ligação a antígeno de domínio único homodimérico
59 / 138 compreendendo duas cadeias semelhantes a imunoglobulina, cada uma das quais compreendendo um domínio variável operacionalmente ligado a uma região constante de cadeia pesada que não possui um domínio CH1 funcional. Em vários aspectos, uma proteína de ligação a antígeno de domínio único homodimérico compreende duas cadeias tipo imunoglobulina idênticas, cada uma das quais compreendendo um domínio variável idêntico operacionalmente ligado a uma região constante de cadeia pesada idêntica que não possui um domínio CH1 funcional. Além disso, cada cadeia tipo imunoglobulina de uma proteína de ligação a antígeno de domínio único compreende um domínio variável, que pode ser derivado de segmentos de gene de região variável de cadeia pesada (por exemplo, VH, DH, JH), segmentos de gene de cadeia leve (por exemplo, VL, JL), ou uma combinação destes, ligada a uma região constante de cadeia pesada (CH) sequência de gene compreendendo uma deleção ou mutação de inativação em uma sequência codificadora de CH1 (e, opcionalmente, uma região articulada) de um gene da região constante de cadeia pesada, por exemplo, IgG, IgA, IgE, IgD ou uma combinação destes. Uma proteína de ligação a antígeno de domínio único compreendendo um domínio variável derivado de segmentos de gene de cadeia pesada pode ser referida como um "anticorpo de domínio único VH" ou "proteína de ligação a antígeno de domínio único VH", vide, por exemplo, Patente U.S. nº 8,754,287, Publicações de Patente U.S. nº 20140289876; 20150197553; 20150197554; 20150197555; 20150196015; 20150197556 e 20150197557, cada uma das quais é incorporada por referência em sua totalidade. Uma proteína de ligação a antígeno de domínio único compreendendo um domínio variável derivado de segmentos de gene de cadeia leve pode ser referida como uma "proteína de ligação a antígeno de domínio único VL", vide, por exemplo, Publicação U.S. nº 20150289489, incorporada por referência na sua totalidade.
[0086] A expressão "cadeia leve" inclui uma sequência de cadeia leve
60 / 138 de imunoglobulina de qualquer organismo, e salvo se especificado de outro modo, inclui cadeias leves kappa (κ) e lambda (λ) e um VpreB, bem como cadeias leves substitutas. Os domínios variáveis de cadeia leve normalmente incluem três CDRs de cadeia leve e quatro regiões de framework (FR), salvo se especificado de outro modo. Geralmente, uma cadeia leve completa inclui, a partir do terminal amino ao terminal carboxila, um domínio variável que inclui FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 e uma sequência de aminoácidos de região constante de cadeia leve. Os domínios variáveis de cadeia leve são codificados pela sequência de região variável de cadeia leve, que geralmente compreende segmentos de gene VL de cadeia leve e JL de cadeia leve, derivados de um repertório de segmentos de gene V e J de cadeia leve presentes na linhagem germinativa. As sequências, localizações e nomenclatura para segmentos de gene V e J de cadeia leve para vários organismos podem ser encontrados no banco de dados IMGT, que é acessível através da internet na "world wide web" (www) na URL "imgt.org". Cadeias leves incluem aquelas que, por exemplo, ligam não seletivamente um primeiro ou um segundo epítopo seletivamente ligado pela proteína de ligação ao epítopo em que aparecem. As cadeias leves também incluem aquelas que ligam e reconhecem, ou auxiliam a cadeia pesada com ligação e reconhecimento de um ou mais epítopos ligados seletivamente pela proteína de ligação ao epítopo em que aparecem. As cadeias leves também incluem aquelas que ligam e reconhecem, ou auxiliam a cadeia pesada com ligação e reconhecimento de um ou mais epítopos ligados seletivamente pela proteína de ligação ao epítopo em que aparecem. As cadeias leves comuns ou universais incluem aquelas derivadas de um gene Vκ1-39Jκ5 humano ou um gene Vκ3-20Jκ1 humano e incluem versões somaticamente mutadas (por exemplo, maturadas por afinidade) dos mesmos.
[0087] A expressão "operacionalmente ligada", conforme usada neste documento, inclui uma justaposição física (por exemplo, no espaço
61 / 138 tridimensional) de componentes ou elementos que interagem, direta ou indiretamente um com o outro, ou coordenados uns com os outros para participar em um evento biológico, que justaposição atinge ou permite tal interação e/ou coordenação.
Para dar apenas um exemplo, uma sequência de controle (por exemplo, uma sequência de controle de expressão) em um ácido nucleico é referida como estando "operacionalmente ligada" a uma sequência codificadora quando está localizada em relação à sequência codificadora de modo que sua presença ou ausência impacte a expressão e/ou a atividade da sequência codificadora.
Em muitas modalidades, "ligação operável" envolve ligação covalente de componentes ou elementos relevantes um com o outro.
Os versados na técnica apreciarão prontamente, no entanto, que em algumas modalidades, a ligação covalente não é necessária para alcançar a ligação operável eficaz.
Por exemplo, em algumas modalidades, as sequências de controle de ácido nucleico que estão operacionalmente ligadas a sequências codificantes que controlam são contíguas ao nucleotídeo de interesse.
Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, uma ou mais dessas sequências de controle atuam em trans ou a uma distância para controlar uma sequência codificante de interesse.
Em algumas modalidades, o termo "sequência de controle de expressão", conforme usado neste documento, refere-se a sequências polinucleotídicas, que são necessárias e/ou suficientes para efetuar a expressão e o processamento de sequências codificantes às quais elas estão ligadas.
Em algumas modalidades, as sequências de controle de expressão podem ser ou compreender iniciação da transcrição adequada, terminação, sequências de promotor e/ou potenciador; sinais de processamento de RNA eficientes, tais como sinais de splicing e poliadenilação; sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático; sequências que melhoram a eficiência da tradução (por exemplo, sequência consenso de Kozak); sequências que melhoram a estabilidade da proteína; e/ou, em algumas modalidades, sequências que aumentam a secreção de
62 / 138 proteínas. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências de controle são preferencialmente ou exclusivamente ativas em uma célula ou organismo hospedeiro específico, ou tipo destes. Para dar um exemplo, em procariontes, sequências de controle normalmente incluem promotor, sítio de ligação ribossomal e sequência de terminação de transcrição; em eucariotas, em muitas modalidades, estas sequências de controle incluem promotores, potenciadores e/ou sequências de terminação de transcrição. Os versados na técnica irão apreciar do contexto que, em muitas modalidades, o termo "sequências de controle" refere-se aos componentes cuja presença é essencial para expressão e processamento e, em algumas modalidades, inclui componentes cuja presença é vantajosa para a expressão (incluindo, por exemplo, sequências líderes, sequências de direcionamento e/ou sequências de parceiros de fusão).
[0088] O termo "proteína do capsídeo recombinante" inclui uma proteína do capsídeo que tem pelo menos uma mutação em comparação com a proteína do capsídeo correspondente do vírus do tipo selvagem, que pode ser um vírus de referência e/ou controle para estudo comparativo. Uma proteína do capsídeo recombinante inclui uma proteína do capsídeo que compreende um epítopo heterólogo, que pode ser inserido em e/ou exibido pela proteína do capsídeo. "Heterólogo" neste contexto significa heterólogo em comparação com o vírus, a partir do qual a proteína do capsídeo é derivada. Os aminoácidos inseridos podem simplesmente ser inseridos entre dois aminoácidos determinados da proteína do capsídeo. Uma inserção de aminoácidos também pode ir com uma exclusão de aminoácidos determinados da proteína do capsídeo no sítio de inserção, por exemplo, 1 ou mais aminoácidos de proteína do capsídeo são substituídos por 5 ou mais aminoácidos heterólogos).
[0089] Os termos "molécula de ligação multiespecífica" e "molécula de ligação biespecífica" e semelhantes geralmente e respectivamente referem-
63 / 138 se a uma molécula de ligação que compreende pelo menos dois e apenas dois componentes de ligação não idênticos, com cada componente de ligação ligando especificamente um epítopo diferente - em duas moléculas diferentes (por exemplo, epítopos diferentes em dois imunógenos diferentes) ou na mesma molécula (por exemplo, epítopos diferentes no mesmo imunógeno). Geralmente, um dos componentes de ligação de uma molécula de ligação biespecífica neste documento se liga especificamente a um epítopo heterólogo exibido por uma proteína do capsídeo viral e o segundo componente de ligação é específico para uma proteína, por exemplo, um marcador de superfície celular, expressa primariamente e/ou preferencialmente por uma célula alvo, por exemplo, um marcador de célula T (por exemplo, CD3, CD28, etc.). As moléculas de ligação biespecíficas podem ser produzidas, por exemplo, pela combinação de componentes de ligação que reconhecem epítopos diferentes do mesmo imunógeno.
Por exemplo, as sequências de ácido nucleico que codificam componentes de ligação (por exemplo, sequências variáveis de cadeia leve ou pesada) que reconhecem epítopos diferentes podem ser fundidas a sequências de ácido nucleico que codificam as mesmas regiões constantes de cadeia pesada ou diferentes, as mesmas regiões constantes de cadeia leve ou diferentes ou, respectivamente, uma região constante de cadeia pesada e uma região constante de cadeia leve, e tais sequências podem ser expressas em uma célula como uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífico em um formato que é semelhante a uma estrutura de Fab, estrutura de scFab, uma estrutura de diabody, uma estrutura de scFv, uma estrutura de scFv-Fc, uma estrutura de scFv-zíper, uma estrutura tetramérica semelhante a um anticorpo típico que inclui uma cadeia leve universal cognata, uma estrutura tetramérica compreendendo um anticorpo bivalente típico que inclui a cadeia leve universal cognata e/ou um componente de ligação adicional (por exemplo, scFv, scFv-zíper, scFab, etc.) anexados a uma ou a ambas as cadeias pesadas (por exemplo, no terminal N
64 / 138 e/ou terminal C) e/ou a uma ou ambas as cadeias leves (por exemplo, no terminal N e/ou terminal C). Os vários formatos de moléculas de ligação multiespecíficas, particularmente biespecíficas são bem conhecidos, vide, por exemplo, Brinkmann e Konterman (2017) Mabs 9:182-212, incorporados neste documento por referência em sua totalidade.
[0090] Uma molécula de ligação multiespecífica exemplificativa tem duas cadeias pesadas, cada uma tendo CDRs de cadeia pesada, seguida por um domínio CH1 (N-terminal a C-terminal), uma dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3, e uma cadeia leve de imunoglobulina que ou não confere especificidade de ligação ao epítopo, mas que pode associar-se com cada cadeia pesada (por exemplo, cadeia leve comum), ou que pode associar-se com cada cadeia pesada e que pode ligar um ou mais dos epítopos ligados pelas regiões de ligação ao epítopo de cadeia pesada ou que pode associar-se com cada cadeia pesada e possibilitar a ligação de uma ou ambas as cadeias pesadas a um ou ambos os epítopos. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação multiespecífica compreende: (1) um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina operacionalmente ligado a uma primeira região constante de cadeia pesada compreendendo uma primeira sequência de aminoácidos CH3 de uma IgG humana selecionada dentre IgG1, IgG2, IgG4 e uma combinação destas; e (2) um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, em que o segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina é operacionalmente ligado a uma segunda região constante de cadeia pesada compreendendo uma segunda sequência de aminoácidos CH3 da IgG humana selecionada dentre IgG1, IgG2, IgG4 e uma combinação destas, em que o primeiro e ou segundo domínios variáveis de cadeia pesada (com ou sem uma cadeia leve cognata) se liga a um epítopo heterólogo, conforme descrito neste documento, e o outro domínio variável de cadeia pesada (com ou sem uma cadeia leve cognata) se liga a um receptor em uma célula alvo, e em que a primeira região constante de cadeia pesada associa-se
65 / 138 com a segunda região de cadeia constante de forma a fornecer isolamento facilitado da proteína de ligação multiespecífica, por exemplo, em que a primeira e a segunda regiões constantes de cadeia pesada formam um formato knob-into-hole (KIH) ou em que a segunda sequência de aminoácidos CH3 compreende uma modificação que reduz ou elimina a ligação da segunda sequência de aminoácidos CH3 à Proteína A (vide, por exemplo, Patente U.S. nº 8,586,713, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, uma molécula de ligação multiespecífica compreende: (1) um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina operacionalmente ligado a uma primeira região constante de cadeia pesada compreendendo uma primeira sequência de aminoácidos CH3 de uma IgG humana selecionada dentre IgG1, IgG2, IgG4 e uma combinação destas; e (2) um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, em que o segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina é operacionalmente ligado a uma segunda região constante de cadeia pesada compreendendo uma segunda sequência de aminoácidos CH3 da IgG humana selecionada dentre IgG1, IgG2, IgG4 e uma combinação destas, em que o primeiro e o segundo domínios variáveis de cadeia pesada (com ou sem uma cadeia leve cognata) se liga aos mesmos antígenos ou diferentes, em que a primeira e a segunda regiões constantes de cadeia pesada são modificadas para compreender adicionalmente um domínio de ligação adicional (por exemplo, um scFv ou Fv que se liga a um epítopo heterólogo, conforme descrito neste documento, por exemplo, em que o domínio de ligação adicional é anexado ao terminal C ou terminal N de uma das ou ambas as cadeias pesadas), e em que a primeira região constante de cadeia pesada associa-se com a segunda região de cadeia constante de forma a fornecer isolamento facilitado da proteína de ligação multiespecífica, por exemplo, em que a primeira e a segunda regiões constantes de cadeia pesada formam um formato knobs-into-holes (KIH) ou em que a segunda sequência de
66 / 138 aminoácidos CH3 compreende uma modificação que reduz ou elimina a ligação da segunda sequência de aminoácidos CH3 à Proteína A. Em algumas modalidades, nas quais a segunda sequência de aminoácidos CH3 compreende ligação à Proteína A reduzida ou eliminada, a sequência de aminoácidos CH3 compreende uma modificação H95R (por numeração de éxon IMGT; H435R por numeração EU). Em uma modalidade, a segunda sequência de aminoácidos CH3 compreende adicionalmente uma modificação Y96F (por numeração de éxon IMGT; H436F por EU). Em outra modalidade, a segunda sequência de aminoácidos CH3 compreende uma modificação H95R (por numeração de éxon IMGT; H435R por numeração EU) e uma modificação Y96F (por numeração de éxon IMGT; H436F por EU). Em algumas modalidades, a segunda sequência de aminoácidos CH3 é de uma IgG1 humana modificada e compreende adicionalmente uma mutação selecionada dentre o grupo que consiste em D16E, L18M, N44S, K52N, V57M e V82I (IMGT; D356E, L38M, N384S, K392N, V397M e V422I por EU). Em algumas modalidades, a segunda sequência de aminoácidos CH3 é de uma IgG2 humana modificada e compreende adicionalmente uma mutação selecionada dentre o grupo que consiste em N44S, K52N e V82I (IMGT: N384S, K392N e V422I por EU). Em algumas modalidades, a segunda sequência de aminoácidos CH3 é de uma IgG4 humana modificada e compreende adicionalmente uma mutação selecionada dentre o grupo que consiste em Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q e V82I (IMGT: Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q e V422I por EU). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de região constante de cadeia pesada é uma sequência de aminoácidos de região constante não humana, e a sequência de aminoácidos de região constante de cadeia pesada compreende um ou mais dentre qualquer um dos tipos de modificações descritos acima.
[0091] Em várias modalidades, os domínios Fc são modificados para
67 / 138 ter uma ligação de receptor Fc alterada que, por sua vez, afeta a função efetora. Em algumas modalidades, uma região constante de cadeia pesada (CH) manipulada, que inclui o domínio Fc, é quimérica. Portanto, uma região CH quimérica combina os domínios CH derivados de mais do que um isotipo de imunoglobulina. Por exemplo, uma região CH quimérica compreende parte ou todo um domínio CH2 derivado de uma molécula de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana, combinada com parte ou todo um domínio CH3 derivado de uma molécula IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. Em algumas modalidades, uma região CH quimérica contém uma região de dobradiça quimérica. Por exemplo, uma dobradiça quimérica pode compreender uma sequência de aminoácidos de "dobradiça superior" (resíduos de aminoácido a partir da posição 216 à posição 227 de acordo com a numeração EU; resíduos d aminoácidos a partir da posição 226 à posição 240 d acordo com a numeração de Kabat) derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana, combinada com uma sequência de "dobradiça inferior" (resíduos de aminoácido a partir da posição 228 à posição 236 de acordo com a numeração da EU; posições de aminoácido a partir da posição 241 à posição 249 de acordo com a numeração de Kabat) derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. Em algumas modalidades, a região de dobradiça quimérica compreende resíduos de aminoácido derivados de uma IgG1 humana ou de uma ligação superior de IgG4 humana e resíduos de aminoácido derivados de uma dobradiça inferior de IgG2 humana.
[0092] Em algumas modalidades, o domínio Fc pode ser manipulado para ativar todas, algumas ou nenhuma das funções efetoras Fc normais, sem afetar as propriedades farmacocinéticas desejadas da proteína contendo Fc (por exemplo, anticorpo). Para exemplos de proteínas compreendendo regiões CH quiméricas e tendo funções efetoras alteradas, vide WO2014022540, que é incorporado neste documento em sua totalidade.
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[0093] O termo "células alvo" inclui quaisquer células em que a expressão de um nucleotídeo de interesse é desejada. Preferencialmente, células alvo exibem uma proteína, por exemplo, um receptor, em sua superfície que permite que a célula seja direcionada com um ligante de redirecionamento, conforme descrito abaixo. Preferencialmente, a proteína alvo, por exemplo, o receptor é específico para a célula alvo, por exemplo, é um "marcador específico de célula", "antígeno específico de célula", ou semelhantes. O termo "marcador específico de célula", "antígeno específico de célula", "marcador específico de órgão", "marcador específico de tecido" ou semelhantes refere-se a e inclui aquelas proteínas para as quais a expressão é enriquecida pela célula, tecido e/ou órgão para o qual é um marcador específico. "Enriquecido" no contexto de expressão de proteína refere-se e inclui expressão ou superexpressão da proteína/tecido/proteína específica de órgão primariamente, preferencialmente, ou exclusivamente pela célula/tecido/órgão para o qual a proteína é um marcador específico, embora esse marcador também possa ser expresso por outras células/tecidos/ou órgãos em níveis mínimos. O Atlas de Proteína Humana pode ser usado para determinar se uma proteína é um marcador específico de célula/tecido/órgão e também fornece um repositório de proteínas específicas de célula/tecido/órgão. Vide, www.proteinatlas.org; vide também Uhlen et al. (2010) Nat. Biotech. 28:1248-50, incorporado neste documento em sua totalidade por referência.
[0094] O termo "transdução" ou "infecção" ou semelhante refere-se à introdução de um ácido nucleico em uma célula alvo por um vetor viral. A eficiência do termo em relação à transdução ou semelhante, por exemplo, "eficiência de transdução" refere-se à fração (por exemplo, porcentagem) de células que expressam um nucleotídeo de interesse após incubação com um número definido de vetores virais compreendendo o nucleotídeo de interesse. Os métodos bem conhecidos para determinar a eficiência de transdução
69 / 138 incluem a separação celular ativada por fluorescência de células transfectadas com um gene repórter fluorescente, PCR para expressão do nucleotídeo de interesse, etc.
[0095] O termo "tipo selvagem", conforme usado neste documento, inclui uma entidade com uma estrutura e/ou atividade conforme encontrado na natureza em um estado ou contexto "normal" (em contraste com mutante, doente, alterado, etc.). Os versados na técnica apreciarão que vetores virais do tipo selvagem, por exemplo, proteínas do capsídeo do tipo selvagem, podem ser usados como vetor viral de referência em estudos comparativos. Geralmente, uma proteína do capsídeo viral/capsídeo/vetor de referência são idênticos à proteína do capsídeo viral/capsídeo/vetor de teste mas para a mudança para a qual o efeito deve ser testado. Por exemplo, para determinar o efeito, por exemplo, na eficiência de transdução, de inserir um epítopo heterólogo em um vetor viral de teste, as eficiências de transdução do vetor viral de teste (na ausência ou presença de uma molécula de ligação multiespecífica apropriada) podem ser comparadas com as eficiências de transdução de um vetor viral de referência (na ausência ou presença de uma molécula de ligação multiespecífica apropriada, se necessário) que é idêntica ao vetor viral de teste em todas as instâncias (por exemplo, mutações adicionais, nucleotídeo de interesse, números de vetores virais e células alvo, etc.) exceto pela presença de um epítopo heterólogo. Proteínas do Capsídeo Viral Recombinantes e Vetores Virais e Ácidos Nucleicos
[0096] Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrita neste documento, é uma proteína do capsídeo Ad, por exemplo, uma proteína do capsídeo de um sorotipo Ad selecionado dentre o grupo que consiste em Ad1, Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6 e Ad7. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo Ad2. Em algumas modalidades, uma
70 / 138 proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo Ad5. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral Ad recombinante, conforme descrita neste documento, compreende um epítopo heterólogo em um domínio de proteína de fibra, por exemplo, no terminal carbóxi da proteína de fibra, knob de fibra e/ou alça HI do knob de fibra.
[0097] Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante descrita neste documento é derivada de um gene do capsídeo de vírus adeno-associado (AAV), por exemplo, é uma proteína do capsídeo geneticamente modificada de um sorotipo de AAV selecionado dentre o grupo que consiste em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV2, um gene do capsídeo de AAV6, um gene do capsídeo de AAV8 ou um gene do capsídeo de AAV9. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV2, por exemplo, é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2 geneticamente modificada, a sequência de aminoácidos para o tipo selvagem do qual é estabelecida respectivamente como SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV8, por exemplo, é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV8 geneticamente modificada, a sequência de aminoácidos para o tipo selvagem do qual é estabelecida como SEQ ID NO:21. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV9, por exemplo, é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9 geneticamente modificada, a sequência de aminoácidos para o tipo selvagem do qual é estabelecida respectivamente como SEQ ID NO:5. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral recombinante é derivada de um gene do capsídeo de AAV6, por exemplo, é uma proteína do capsídeo VP1 geneticamente modificada de AAV6. Em algumas modalidades, um epítopo heterólogo é
71 / 138 inserido em I-453 de uma proteína do capsídeo de AAV9.
[0098] Geralmente, uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, compreende um epítopo heterólogo inserido e/ou exibido pela proteína do capsídeo de modo que o epítopo heterólogo reduz e/ou anula o tropismo natural da proteína do capsídeo ou capsídeo que compreende o mesmo. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido em uma região da proteína do capsídeo envolvida com o tropismo natural da proteína do capsídeo de referência do tipo selvagem, por exemplo, uma região da proteína do capsídeo envolvida com o receptor celular. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido em e/ou exibido por um domínio knob de uma proteína de fibra Ad. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido em e/ou exibido pela alça HI de uma proteína de fibra Ad. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido após uma posição de aminoácido selecionada dentre o grupo que consiste em G453 da proteína do capsídeo VP1 de AAV2, N587 da proteína do capsídeo VP1 de AAV2, Q585 da proteína do capsídeo VP1 de AAV6, G453 da proteína do capsídeo VP1 de AAV9 e A589 da proteína do capsídeo VP1 de AAV9. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é inserido e/ou exibido entre os aminoácidos N587 e R588 de um capsídeo VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, vetor viral compreendendo um capsídeo viral recombinante e/ou composições compreendendo um capsídeo viral recombinante compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, vetor viral compreendendo um capsídeo viral recombinante e/ou composições compreendendo um capsídeo viral recombinante compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, vetor viral compreendendo um capsídeo viral recombinante e/ou composições compreendendo um capsídeo viral recombinante compreende uma sequência
72 / 138 de aminoácidos codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida como SEQ ID NO:25. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, vetor viral compreendendo um capsídeo viral recombinante e/ou composições compreendendo um capsídeo viral recombinante compreende uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida como SEQ ID NO:26. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, vetor viral compreendendo um capsídeo viral recombinante e/ou composições compreendendo um capsídeo viral recombinante compreende uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida como SEQ ID NO:27. Os sítios de inserção adicionais adequados identificados usando AAV2 são bem conhecidos na técnica (Wu et al. (2000)J. Virol. 74:8635-8647) e incluem I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713 e I-716. Uma proteína do capsídeo de vírus recombinante, conforme descrita neste documento, pode ser uma proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo um epítopo heterólogo inserido em uma posição selecionada dentre o grupo que consiste em I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I- 459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713, I-716 e uma combinação destes. Os sítios de inserção adicionais adequados identificados usando sorotipos de AAV adicionais são bem conhecidos e incluem I-587 (AAV1), I-589 (AAV1), I-585 (AAV3), I-585 (AAV4) e I-585 (AAV5). Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo de vírus recombinante, conforme descrita neste documento, pode ser uma proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo um epítopo heterólogo inserido em uma posição selecionada dentre o grupo de -587 (AAV1), I-589 (AAV1), I-585 (AAV3), I-585 (AAV4), I-585 (AAV5) e uma combinação destes.
[0099] A nomenclatura usada I-### refere-se ao sítio de inserção com
73 / 138 ### nomeando o número de aminoácidos em relação à proteína VP1 de uma proteína do capsídeo de AAV, no entanto, tal inserção pode estar localizada diretamente de modo N- ou C-terminal, preferencialmente C-terminal de um aminoácido na sequência de 5 aminoácidos N- ou C-terminal do dado aminoácido, preferencialmente 3, mais preferencialmente 2, especialmente 1 aminoácido(s) N- ou C-terminal do dado aminoácido. Adicionalmente, as posições referidas neste documento são relativas à proteína VP1 codificada por um gene do capsídeo de AAV e posições correspondentes (e mutações respectivas) podem ser facilmente identificadas para as proteínas do capsídeo VP2 e VP3 que codificam pelo gene do capsídeo através da realização de um alinhamento sequencial das proteínas VP1, VP2 e VP3 que codificam pelo gene do capsídeo de AAV de referência.
[00100] Consequentemente, uma inserção na posição correspondente do ácido nucleico codificante de um desses sítios do gene cap leva a uma inserção em VP1, VP2 e/ou VP3, conforme as proteínas do capsídeo são codificadas pela sobreposição de estruturas de leitura do mesmo gene com códons de iniciação escalonados. Portanto, para AAV2, por exemplo, de acordo com esta nomenclatura, as inserções entre os aminoácidos 1 e 138 são apenas inseridas em VP1, as inserções entre 138 e 203 são inseridas em VP1 e VP2 e as inserções entre 203 e o terminal C são inseridas em VP1, VP2 e VP3, que é, obviamente, também o caso para o sítio de inserção I-587. Portanto, a presente invenção engloba genes estruturais de AAV com inserções correspondentes nas proteínas VP1, VP2 e/ou VP3.
[00101] Além disso, devido à alta conservação de pelo menos grandes extensões e do grande membro de membro familiar estreitamente relacionado, os sítios de inserção correspondentes para AAV diferentes do AAV enumerado podem ser identificados através da realização de um alinhamento de aminoácido ou pela comparação das estruturas do capsídeo. Vide, por exemplo,, Rutledge et al.. (1998) J. Virol. 72:309-19 e A Patente U.S. nº
74 / 138 9,624,274 para exemplos de alinhamentos de proteínas do capsídeo de AAV diferentes, cada uma das quais é incorporada neste documento por referência na sua totalidade.
[00102] Em algumas composições divulgadas neste documento que consistem no capsídeo viral recombinante (por exemplo, na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica), a proteína do capsídeo viral recombinante é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2 com um epítopo heterólogo é inserida em um sítio I587, em que o epítopo heterólogo não compreende um motivo Arg-Gly-Asp (RGD), um motivo NGR ou c-myc. Em algumas composições divulgadas neste documento que consistem no capsídeo viral recombinante (por exemplo, na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica), a proteína do capsídeo viral recombinante é uma proteína do capsídeo VP1 com um epítopo heterólogo e é inserida entre T448 e N449, em que o epítopo heterólogo não compreende c-myc. Em algumas composições divulgadas neste documento que consistem no capsídeo viral recombinante (por exemplo, na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica), a proteína do capsídeo viral recombinante é uma proteína do capsídeo VP1 com um epítopo heterólogo e é inserida em um sítio I-447, em que o epítopo heterólogo não compreende L14 ou HA.
[00103] Em algumas composições compreendendo o capsídeo viral recombinante (por exemplo, compreendendo adicionalmente uma molécula de ligação multiespecífica), a proteína do capsídeo viral recombinante é uma proteína do capsídeo VP1 com um epítopo heterólogo e é inserida em um sítio I587, em que o epítopo heterólogo compreende um motivo Arg-Gly-Asp (RGD), um motivo NGR ou um c-myc. Em algumas composições divulgadas neste documento que compreendem o capsídeo viral recombinante (por exemplo, compreendendo adicionalmente uma molécula de ligação multiespecífica), o capsídeo viral é um capsídeo VP1, o epítopo heterólogo compreende c-myc e o epítopo heterólogo é inserido entre T448 e N449 ou
75 / 138 entre N587 e R588. Em algumas composições divulgadas neste documento que compreendem o capsídeo viral recombinante (por exemplo, compreendendo adicionalmente uma molécula de ligação multiespecífica), a proteína do capsídeo viral recombinante é uma proteína do capsídeo VP1 com um epítopo heterólogo é inserida em um sítio I-447, em que o epítopo heterólogo compreende L14 ou HA. Em algumas composições divulgadas neste documento que compreendem o capsídeo viral recombinante (por exemplo, na presença de uma molécula de ligação multiespecífica), a proteína do capsídeo viral recombinante é uma proteína do capsídeo VP1 com um epítopo heterólogo é inserida entre T448 e N449, em que o epítopo heterólogo compreende c-myc. A Patente U.S. nº 9,624,274 descreve I-453 de uma proteína do capsídeo de AAV como um sítio de inserção adequado para um epítopo heterólogo.
[00104] Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo anula o tropismo natural do vetor viral, por exemplo, a transdução de uma célula naturalmente permissiva à infecção por vetores virais de referência do tipo selvagem e/ou uma célula alvo é indetectável na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica apropriada. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo reduz o tropismo natural do vetor viral, por exemplo, em comparação com a transdução de uma célula naturalmente permissiva para infeção por vetores virais de referência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo reduz o tropismo natural do vetor viral em pelo menos 5%. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo reduz o tropismo natural do vetor viral em pelo menos 5%. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo reduz o tropismo natural do vetor viral em pelo menos 10%. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo reduz o tropismo natural do vetor viral em pelo menos 20%. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo
76 / 138 reduz o tropismo natural do vetor viral em pelo menos 30%. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo reduz o tropismo natural do vetor viral em pelo menos 40%. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo reduz o tropismo natural do vetor viral em pelo menos 50%. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo reduz o tropismo natural do vetor viral em pelo menos 60%. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo reduz o tropismo natural do vetor viral em pelo menos 70%. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo reduz o tropismo natural do vetor viral em pelo menos 80%. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo reduz o tropismo natural do vetor viral em pelo menos 90%. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo reduz o tropismo natural do vetor viral em pelo menos 95%. Em algumas modalidades, a inserção (exibição) do epítopo heterólogo reduz o tropismo natural do vetor viral em pelo menos 90%. Nestas modalidades, em que a inserção (exibição) do epítopo heterólogo não anula o tropismo natural dos capsídeos virais recombinantes, o tropismo natural de tais capsídeos virais recombinantes pode ser anulado por uma segunda mutação e mutação diferente. Por exemplo, em uma modalidade, uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrita neste documento pode ser derivada de um gene do capsídeo de AAV9, compreender um epítopo heterólogo e pode compreender adicionalmente uma mutação, por exemplo, uma mutação W503A.
[00105] Este retrodirecionamento do vírus de sua célula hospedeira natural é importante especialmente se a administração sistêmica versus local ou local-regional dos vetores virais for pretendida, uma vez que a absorção dos vetores virais pelas células hospedeiras naturais limita a dose eficaz dos vetores virais. No caso de HSPG de AAV2 e AAV6 é relatado como sendo o receptor primário para a absorção viral em um grande número de células,
77 / 138 especialmente células hepáticas. Para atividade de ligação a HSPG de AAV2 depende de um grupo de 5 aminoácidos básicos, R484, R487, R585, R588 e K532 (Kern et al., (2003) J Virol. 77(20):11072-81). Recentemente foi relatado que a substituição de aminoácido de lisina-para-glutamato K531E leva à supressão da capacidade de AAV6 de se ligar a heparina ou HSPG ((Wu et al., 2006) J. of Virology 80(22):11393-11397). Em conformidade, as mutações pontuais preferenciais são aquelas que reduzem a atividade de transdução do vetor viral para uma determinada célula alvo mediada pelo receptor natural em pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 80%, especialmente pelo menos 95%, no caso de HSPG como receptor primário a ligação dos vetores virais ao HSPG.
[00106] Consequentemente, outras mutações preferenciais para vetores virais de ligação a HSPG são aquelas mutações que destroem ou substituem um aminoácido básico, tal como R, K ou H, preferencialmente R ou K que está envolvido na ligação de HSPG do respectivo vírus, por um aminoácido não básico como A, D, G, Q, S e T, preferencialmente, A ou um aminoácido que está presente na posição correspondente de um sorotipo de AAV diferente, mas altamente conservado, carecendo de tal aminoácido básico nesta posição. Consequentemente, as substituições de aminoácido preferenciais são R484A, R487A, R487G, K532A, K532D, R585A, R585S, R585Q, R585A ou R588T, especialmente R585A e/ou R588A para AAV2 e K531A ou K531E para AAV6. Uma modalidade especialmente preferencial da invenção são tais mutantes de proteína do capsídeo de AAV2 que contêm adicionalmente as duas mutações pontuais R585A e R588A, uma vez que essas duas mutações pontuais são suficientes para abdicar a atividade de ligação de HSPG em grande extensão. Essas mutações pontuais permitem um direcionamento eficiente de células que expressam HSPG que, para fins de direcionamento, aumentam a especificidade do respectivo vírus mutante para sua nova célula alvo.
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[00107] Uma modalidade da presente invenção é uma estrutura multimérica que compreende uma proteína do capsídeo viral recombinante da presente invenção. Uma estrutura multimérica compreende pelo menos 5, preferencialmente pelo menos 10, mais preferencialmente pelo menos 30, mais preferencialmente pelo menos 60 proteínas do capsídeo viral recombinantes compreendendo um epítopo heterólogo, conforme descrito neste documento. Eles podem formar capsídeos virais regulares (partículas virais vazias) ou vetores virais (capsídeos encapsulando um nucleotídeo de interesse). A formação de vetores virais capazes de embalar um genoma viral é um recurso altamente preferencial para uso dos capsídeos virais recombinantes descritos neste documento como vetores virais.
[00108] Uma modalidade da presente invenção é um ácido nucleico que codifica uma proteína do capsídeo, conforme descrito acima. O ácido nucleico é preferencialmente um vetor que compreende a sequência de ácido nucleico reivindicada. Os ácidos nucleicos, especialmente vetores são necessários para expressar de forma recombinante as proteínas do capsídeo desta invenção.
[00109] Uma modalidade adicional da presente invenção é o uso de pelo menos uma proteína do capsídeo viral recombinante e/ou um ácido nucleico que codifica a mesma, preferencialmente pelo menos uma estrutura multimérica (por exemplo, vetor viral) para a fabricação e uso como um vetor de transferência de gene. Epítopos Heterólogos
[00110] Geralmente, uma proteína do capsídeo viral recombinante e/ou um vetor viral que compreende o capsídeo viral recombinante compreende um epítopo heterólogo, que permite o redirecionamento do vetor viral, por exemplo, através de uma molécula de ligação multiespecífica. Em algumas modalidades, um epítopo heterólogo é um epítopo de célula B, por exemplo, está entre cerca de 1 aminoácido e cerca de 35 aminoácidos de comprimento e
79 / 138 forma um par de ligação com um parátopo de anticorpo, por exemplo, um domínio variável de imunoglobulina. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo compreende um marcador de afinidade.
[00111] Um grande número de identificações é conhecido na técnica. (Vide, por exemplo: Nilsson et al. (1997) "Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of recombinant proteins" Protein Expression and Purification 11: 1-16, Terpe et al. (2003) "Overview of tag protein fusions: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems" Applied Microbiology and Biotechnology 60:523-533 e referências destes). Os marcadores de afinidade incluem, mas não estão limitados a, um marcador de poli-histidina (por exemplo, um marcador His-6, His-8 ou His- 10) que se liga a cátions divalentes imobilizados (por exemplo, Ni2+), uma fração de biotina (por exemplo, em uma sequência de polipeptídeo biotinilado in vivo) que se liga a avidina imobilizada, uma sequência de GST (glutationa S-transferase) que se liga a glutationa imobilizada, um marcador de S que se liga à proteína S imobilizada, um antígeno que se liga a um anticorpo imobilizado ou domínio ou fragmento deste (incluindo, por exemplo, T7, myc, FLAG e marcadores de B que se ligam a anticorpos correspondentes), um marcador de FLASH (um marcador de alta afinidade que se acopla a frações baseadas em arsênico específicas), um receptor ou domínio de receptor que se liga a um ligante imobilizado (ou vice versa), proteína A ou um derivado deste (por exemplo, Z) que se liga a IgG imobilizada, proteína de ligação a maltose (MBP) que se liga a amilose imobilizada, uma proteína de ligação a albumina que se liga a albumina imobilizada, um domínio de ligação a quitina que se liga a quitina imobilizada, um peptídeo de ligação a calmodulina que se liga a calmodulina imobilizada e um domínio de ligação a celulose que se liga a celulose imobilizada. Outro marcador exemplificativo é um SNAP-tag, comercialmente disponível por Covalys (www.covalys.com). Em algumas modalidades, um epítopo heterólogo divulgado neste documento
80 / 138 compreende um marcador de afinidade reconhecida apenas por um parátopo de anticorpo. Em algumas modalidades, um epítopo heterólogo divulgado neste documento compreende um marcador de afinidade reconhecida por um parátopo de anticorpo e outros pares de ligação específicos.
[00112] Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo e/ou marcador de afinidade não forma um par de ligação com um domínio constante de imunoglobulina. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo e/ou o marcador de afinidade não formam um par de ligação com um íon metálico, por exemplo, Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+, etc. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo não é um polipeptídeo selecionado dentre o grupo que consiste em estreptavidina, Strep II, HA, L14, 4C-RGD, LH e Proteína A.
[00113] Em algumas modalidades, o marcador de afinidade é selecionado dentre o grupo que consiste em FLAG (SEQ ID NO:7), HA (SEQ ID NO:8) e c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO:6). Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo é c-myc.
[00114] Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante conforme descrito neste documento compreende a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por e/ou operacionalmente ligada a pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante conforme descrito neste documento compreende a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por e/ou operacionalmente ligada a pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, conforme descrito neste documento, compreende EQKLISEEDL (estabelecida como SEQ ID NO: 6) inserida entre N587 e R588 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrita neste documento, compreende uma sequência de
81 / 138 aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo viral recombinante, conforme descrita neste documento, compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, vetor viral compreendendo um capsídeo viral recombinante e/ou composições compreendendo um capsídeo viral recombinante compreende uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida como SEQ ID NO:25. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, vetor viral compreendendo um capsídeo viral recombinante e/ou composições compreendendo um capsídeo viral recombinante compreende uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida como SEQ ID NO:26. Em algumas modalidades, um capsídeo viral recombinante, vetor viral compreendendo um capsídeo viral recombinante e/ou composições compreendendo um capsídeo viral recombinante compreende uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida como SEQ ID NO:27.
[00115] Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo compreende um marcador de afinidade e um ou mais ligantes peptídicos. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo compreende um marcador de afinidade flanqueado por um ligante peptídico, por exemplo, o epítopo heterólogo compreende a partir do terminal N a até o terminal C um primeiro ligante peptídico, um marcador de afinidade e um segundo ligante peptídico. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo ligantes peptídicos têm, cada um, independentemente pelo menos um aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo ligantes peptídicos são idênticos.
[00116] Geralmente, um epítopo heterólogo, conforme descrito neste documento, por exemplo, um marcador de afinidade sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos, tem entre cerca de 5
82 / 138 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem pelo menos 5 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 6 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 7 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 8 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 9 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 10 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 11 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 12 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 13 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 14 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 15 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 16 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 17 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 18 aminoácidos de comprimento.
Em
83 / 138 algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 19 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 20 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 21 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 22 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 23 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 24 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 25 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 26 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 27 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 28 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 29 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 30 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 31 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 32 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com
84 / 138 um ou mais ligantes peptídicos) tem 33 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 34 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o epítopo heterólogo (sozinho ou em combinação com um ou mais ligantes peptídicos) tem 35 aminoácidos de comprimento. Frações de redirecionamento
[00117] Um vetor viral, conforme descrito neste documento, tem capacidades de transdução de reduzidas a anuladas na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica, especificamente uma molécula de ligação multiespecífica compreendendo (i) um parátopo de anticorpo que se liga especificamente ao epítopo e (ii) um ligante de redirecionamento que se liga especificamente a um receptor, que pode ser conjugado à superfície de uma esfera (por exemplo, para purificação) ou expressa por uma célula alvo. Nesse sentido, uma molécula de ligação multiespecífica compreendendo (i) um parátopo de anticorpo que se liga especificamente ao epítopo e (ii) um ligante de redirecionamento que se liga especificamente a um receptor redireciona o vetor viral. Tal "redirecionamento" pode incluir um cenário em que o vetor viral do tipo selvagem direciona várias células dentro de um tecido e/ou vários órgãos dentro de um organismo, cujo amplo direcionamento do tecido ou órgãos é de reduzida a anulada por inserção do epítopo heterólogo, e cujo redirecionamento à células mais específicas no tecido ou órgão mais específico no organismo é alcançado com a molécula de ligação multiespecífica. Tal redirecionamento também pode incluir um cenário em que o vetor viral do tipo selvagem direciona um tecido, cujo direcionamento do tecido é de reduzido a anulado pela inserção do epítopo heterólogo, e cujo redirecionamento a um tecido completamente diferente é obtido com a molécula de ligação multiespecífica. Um parátopo de anticorpo conforme descrito neste documento geralmente compreende, no mínimo, uma região determinante de complementariedade (CDR) que reconhece
85 / 138 especificamente o epítopo heterólogo, por exemplo, uma região CDR3 de um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação multiespecífica compreende um anticorpo (ou porção da mesma) que compreende o parátopo de anticorpo que se liga especificamente ao epítopo heterólogo. Por exemplo, uma molécula de ligação multiespecífica pode compreender uma região variável de cadeia pesada de domínio único ou uma região variável de cadeia leve de domínio único, em que a região variável de cadeia pesada de domínio único ou região variável de cadeia leve de domínio único compreende um parátopo de anticorpo que se liga especificamente ao epítopo heterólogo. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação multiespecífica pode compreender uma região Fv, por exemplo, uma molécula de ligação multiespecífica pode compreender um scFv, que compreende um parátopo de anticorpo que se liga especificamente ao epítopo heterólogo. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação multiespecífica conforme descrita neste documento compreende um parátopo de anticorpo que se liga especificamente a c-myc.
[00118] Em algumas modalidades, uma molécula de ligação multiespecífica conforme descrita neste documento compreende um parátopo de anticorpo que se liga especificamente a c-myc, cujo parátopo compreende o scFv, os domínios variáveis de cadeia pesada e leve do scFv e/ou o conjunto de sequência de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2- LCDR3, codificado pela sequência de ácido nucleico estabelecida como SEQ ID NO:28, por exemplo, o scFv que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:37. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação multiespecífica conforme descrita neste documento compreende um Fv ou scFv codificado pela sequência de ácido nucleico estabelecida como SEQ ID NO:28.
[00119] Consequentemente, a presente invenção inclui como anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos e proteínas de
86 / 138 ligação multiespecíficas que se ligam especificamente a c-myc, em que os anticorpos, fragmentos de anticorpos e proteínas de ligação multiespecíficas compreendem um parátopo que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que compreende a SEQ ID NO:29 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) que compreende a SEQ ID NO:30. A presente invenção inclui também anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos e/ou proteínas de ligação multiespecíficas que compreendem um parátopo que se liga especificamente a c-Myc, em que o parátopo compreende uma região de determinação de complementariedade de cadeia pesada 1 (HCDR1) compreendendo SEQ ID NO:31, uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:32, uma HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:33, uma região de determinação de complementariedade de cadeia leve 1 (LCDR1) compreendendo SEQ ID NO:34, uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:35, e uma LCDR3 compreendendo uma SEQ ID NO:36.
[00120] A presente invenção fornece anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos e/ou proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo um parátopo que compreende um HCVR que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:29, ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência à mesma.
[00121] A presente invenção fornece anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos e/ou proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo um parátopo compreendendo uma LCVR que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:30, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência à mesma.
[00122] A presente invenção fornece anticorpos, fragmentos de ligação
87 / 138 a antígeno dos mesmos e/ou proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo um parátopo que compreende um par de sequência de aminoácidos HCVR e LCVR (HCVR/LCVR) que compreende a sequência de aminoácidos HCVR estabelecida como SEQ ID NO:29 pareada com a sequência de aminoácidos LCVR estabelecida como SEQ ID NO:30. Em algumas modalidades, o par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR é selecionado do grupo constituído por SEQ ID NOs: 29/30.
[00123] A presente invenção fornece anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos e/ou proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo um parátopo que compreende uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:31 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[00124] A presente invenção fornece anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos e/ou proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo um parátopo que compreende uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:32, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[00125] A presente invenção fornece anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos e/ou proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo um parátopo que compreende uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:33, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[00126] A presente invenção fornece anticorpos, fragmentos de ligação
88 / 138 a antígeno dos mesmos e/ou proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo um parátopo que compreende uma cadeia leve CDR1 (LCDR1) que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:34, ou uma sequência substancialmente semelhante a ela com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[00127] A presente invenção fornece anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos e/ou proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo um parátopo que compreende uma cadeia leve CDR2 (LCDR2) que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:35, ou uma sequência substancialmente semelhante a ela com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[00128] A presente invenção fornece anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos e/ou proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo um parátopo que compreende uma cadeia leve CDR3 (LCDR3) que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:36, ou uma sequência substancialmente semelhante a ela com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[00129] A presente invenção fornece anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos e/ou proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo um parátopo que compreende um par de sequência de aminoácidos HCDR3 e LCDR3 (HCDR3/LCDR3) que compreende o aminoácido HCDR3 estabelecido como SEQ ID NO:33 pareado com a sequência de aminoácidos LCDR3 estabelecida como SEQ ID NO:36. Em algumas modalidades, o par de sequência de aminoácidos HCDR3/LCDR3 é estabelecido como SEQ ID NOs: 33/36.
[00130] A presente invenção fornece anticorpos, fragmentos de ligação
89 / 138 a antígeno dos mesmos e/ou proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo um parátopo que compreende um conjunto de seis CDRs (ou seja, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) codificado pela sequência nucleotídica estabelecida como SEQ ID NO:28. Em determinadas modalidades, o conjunto de sequências de aminoácidos HCDR1-HCDR2- HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 é estabelecido como SEQ ID NOs: 31-32- 33-34-35-36.
[00131] Em uma modalidade relacionada, a presente invenção fornece anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos e/ou proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo um parátopo que compreende um conjunto de seis CDRs (ou seja, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2- LCDR3) contido em um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR estabelecida como SEQ ID NOs:29/30. Métodos e técnicas para identificar CDRs dentro das sequências de aminoácidos HCVR e LCVR são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para identificar CDRs dentro das sequências de aminoácidos HCVR e/ou LCVR especificadas divulgadas neste documento. As convenções exemplares que podem ser usadas para identificar os limites das CDRs incluem, por exemplo, a definição de Kabat, a definição de Chothia e a definição de AbM. Em termos gerais, a definição de Kabat baseia-se na variabilidade da sequência, a definição de Chothia baseia-se na localização das regiões de loop estrutural e a definição AbM é um comprometimento entre as abordagens de Kabat e Chothia. Ver, por exemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927- 948 (1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:9268-9272 (1989). Bancos de dados públicos também estão disponíveis para identificar sequências CDR dentro de um anticorpo.
[00132] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos anti-myc ou porções dos mesmos.
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[00133] Uma molécula de ligação multiespecífica, conforme descrita neste documento, compreende ainda um ligante de redirecionamento, além de um parátopo (por exemplo, um anticorpo ou porção do mesmo) que se liga especificamente ao epítopo heterólogo inserido/exibido por uma proteína do capsídeo viral recombinante. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a uma proteína expressa na superfície de uma célula, por exemplo, uma proteína de superfície celular em uma célula eucariótica (humana), por exemplo, uma célula alvo. Há um grande número de proteínas de superfície celular apropriadas, por exemplo, receptores de superfície celular, que podem ser direcionadas por um ligante de redirecionamento, e para os quais um ligante de redirecionamento, por exemplo, anticorpos ou porções dos mesmos, já estão disponíveis. Tais estruturas incluem, mas não estão limitadas a: os Antígenos Principais de Histocompatibilidade de classe I e classe II; receptores para uma variedade de citocinas (por exemplo, receptores para IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33, etc.), hormônios de crescimento específicos de um tipo celular, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator de crescimento estimulante de colônias, fatores de crescimento endoteliais, fatores de crescimento epidermais, fatores de crescimento de fibroblasto, fator neurotrófico derivado da glia, fatores de crescimento da glia, gro-beta/mip 2, fatores de crescimento de hepatócitos, fatores de crescimento semelhantes à insulina, interferons (α-IFN, β-IFN, γIFN, IFN consenso), interleucinas (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL- 14), fator de crescimento de queratinócito, fatores inibidores de leucemia, fator de ativação quimiotático de macrófago/monócito, fator de crescimento nervoso, proteína ativadora de neutrófilo 2, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de célula tronco, fator de transformação do crescimento, fatores de necrose tumoral, fator de crescimento endotelial vascular, lipoproteínas, incluindo outro receptores transmembranares tipo 1 ou
91 / 138 adicional como PRLR, receptores acoplados à proteína G, canais iônicos tais como Nav1,7, ASIC1 ou ASIC2; moléculas de adesão celular; moléculas de transporte para metabólitos tais como aminoácidos; receptores de antígeno de linfócitos T e B (por exemplo, receptores de célula B e proteínas associadas (por exemplo, CD19, CD20, etc.) e receptores de célula T e proteínas associadas (por exemplo, CD3, CD4, CD8, etc.); uma proteína tetraspanina (por exemplo, CD63). Um capsídeo viral recombinante descrito neste documento permite a infecção específica de um tipo de célula através do emprego de uma molécula de ligação multiespecífica compreendendo um ligante de redirecionamento que se liga a antígenos de superfície celular de diferenciação como alvos para o complexo de vetor viral.
[00134] Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a uma proteína expressa principalmente (por exemplo, unicamente) por células hepáticas (humanas), isto é, um marcador específico do fígado. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a uma proteína expressa principalmente (por exemplo, unicamente) por células cerebrais (humanas), um marcador específico de células cerebrais. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a uma proteína expressa principalmente (por exemplo, unicamente) por células hematopoiéticas (humanas), isto é, um marcador específico de célula hematopoiética. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a uma proteína expressa principalmente (por exemplo, unicamente) por células T (humanas), isto é, um marcador específico de células T. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a uma proteína expressa principalmente (por exemplo, unicamente) por células B (humanas), isto é, um marcador específico de células B. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a uma proteína expressa principalmente (por exemplo, unicamente) por células dendríticas (humanas), isto é, um marcador específico de célula dendrítica. Em algumas modalidades, o ligante de
92 / 138 redirecionamento se liga a uma proteína expressa principalmente (por exemplo, unicamente) por macrófagos (humanos), isto é, um marcador específico de macrófagos.
Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a uma proteína expressa principalmente (por exemplo, unicamente) por células NK (humanas), isto é, um marcador específico de célula NK.
Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a uma proteína expressa principalmente (por exemplo, unicamente) por células renais (humanas), isto é, um marcador específico do rim.
Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso principalmente (por exemplo, unicamente) por células pancreáticas (humanas), isto é, um marcador específico do pâncreas.
Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso principalmente (por exemplo, unicamente) por células intestinais (humanas), isto é, um marcador específico do intestino.
Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a uma proteína expressa principalmente (por exemplo, unicamente) por uma célula cancerosa (humana), isto é, um antígeno associado ao tumor.
Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a uma proteína expressa principalmente (por exemplo, unicamente) por células (humanas) infectadas com o patógeno heterólogo.
Proteínas que (1) são especificamente expressas por, ou para as quais a expressão é enriquecida em, uma célula/tecido/órgão e (2) são reconhecidas por uma proteína de ligação a antígeno útil como um ligante de redirecionamento, conforme descrito neste documento são bem conhecidas e também podem ser encontradas em www.proteinatlas.org ver também Uhlen et al. (2010) Nat.
Biotech. 28:1248-50, incorporado neste documento em sua totalidade por referência.
A Tabela 1 abaixo fornece marcadores específicos de órgãos exemplares e não limitantes para as quais proteínas de ligação a antígeno, que podem ser úteis como ligantes de redirecionamento, estão disponíveis e as células/tecido/órgão expressando tais marcadores.
93 / 138 Tabela 1: Exemplos de marcadores específicos de tecido Tecido Marcadores específicos de tecido Fígado Subfamília B do cassete de ligação ATP; membros 11 (ABCB11) Alanina-glicoxilato aminotransferase (AGXT) Álcool desidrogenase 1A, classe I (ADH1A) Álcool desidrogenase 4 (classe II) polipeptídeo pi (ADH4) Componente amiloide P, soro (APCS) Angiopoietina semelhante a 3 (ANGPTL3) Apolipoproteína; C1, C2 (APOC1, APOC2) APOC4-APOC2 Receptor de asialoglicoproteína 1 (ASGR1) Receptor de asialoglicoproteína 2 (ASGR2) Ácido biliar-CoA: aminoácido N-acetiltransferase (BAAT) Cadeia beta de complemento C8 (C8B) Fator de coagulação II, trombina (F2) Citocromo P450 família 1 subfamília A membro 2 CYP1A2 Lectina de ligação a manose 2 (MBL2) Membro da família transportadora de ânion orgânico de carreador solúvel 1B3 (SLCO1B3) Paraoxonase 3 (PON3) Receptor de transferrina 2 (RLT2) Urocanato hidratase 1 (UROC 1) Intestino Proteína de ligação a ácido graxo 6 (FABP6) Pâncreas CUB e zona pelúcida semelhante a domínios 1 (CUZD1) Protease, serina 2 (PRSS2) Protease, serina 3 (PRSS3)
[00135] Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso por uma célula de fígado (humana), por exemplo, um receptor de asialoglicoproteína, por exemplo, hASGR1. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso por uma célula (humana) de cérebro. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso por uma célula T (humana), por exemplo, CD3, por exemplo, CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso por uma célula renal (humana). Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso por uma célula muscular (humana), por exemplo, uma integrina. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um receptor expresso por uma célula cancerosa (humana), por exemplo, um antígeno associado ao tumor, por exemplo, E6 e E7. Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga ao receptor de glucagon humano (hGCGR). Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga ao ENTPD3 humano.
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[00136] Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a um antígeno associado ao tumor expresso por uma célula tumoral. Exemplos não limitantes de antígenos associados ao tumor específicos incluem, por exemplo, adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa- fetoproteína ("AFP"), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusão BCR-ABL b3a2, beta-catenina, BING-4, CA-125, CALCA, antígeno carcinoembrionário ("CEA"), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, Ciclina-A1, proteína de fusão dek-can, DKK1, EFTUD2, fator de alongamento 2, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, antígeno de tumor epitelial ("ETA"), proteína de fusão ETV6-AML1, EZH2, E6, E7, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE- 3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pme117, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, carboxil esterase intestinal, K-ras, calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 também conhecido como CCDC110, LAGE-1, proteína de fusão LDLR- fucosiltransferaseAS, Lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MGE- A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE- C1, MAGE-C2, enzima málica, mamaglobina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midkine, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, miosina, miosina classe I, N-raw, NA88, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipeptídeo P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusão pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfica ("PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secerina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, proteína de fusão SYT- SSX1 ou -SSX2, TAG-1, TAG-2, Telomerase, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-
95 / 138 3, Trioasefosfato isomerase, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinase, tirosinase ("TYR"), VEGF, WT1, XAGE-lb/GAGED2a, Kras, NY-ESO1, MAGE-A3, HPV E2, HPV E6, HPV E7, antígeno WT-1 (em linfoma e outros tumores sólidos), receptores ErbB, Melano A [MART1], gp 100, tirosinase, TRP-1/gp 75, e TRP-2 (em melanoma); MAGE-1 e MAGE-3 (em carcinoma de bexiga, cabeça e pescoço e de célula não-pequena); proteínas HPV EG e E7 (em câncer cervical); Mucina [MUC-1] (em cânceres de mama, pâncreas, cólon e próstata); antígeno específico da próstata [PSA] (em câncer de próstata); antígeno carcinoembrionário [CEA] (em cânceres de cólon, mama e gastrointestinais) e tais antígenos específicos de tumores compartilhados como MAGE-2, MAGE-4, MAGE-6, MAGE-10, MAGE-12, BAGE-1, CAGE-1,2,8, CAGE-3 A 7, LAGE-1, NY-ESO-1/LAGE-2, NA-88, GnTV, TRP2-INT2. Em algumas modalidades, o antígeno associado ao tumor é ErbB2/Her2. Em algumas modalidades, o antígeno associado ao tumor é E6 e/ou E7.
[00137] Em algumas modalidades, o ligante de redirecionamento se liga a marcadores CD associados à resposta imune, por exemplo, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, etc. Em algumas modalidades, o marcador CD é CD3.
[00138] Em certas modalidades exemplares, a molécula de ligação multiespecífica é um anticorpo biespecífico. Cada domínio de ligação a antígeno de um anticorpo biespecífico compreende um domínio variável de cadeia pesada (HCVR) e um domínio variável de cadeia leve (LCVR). No contexto de uma molécula de ligação a antígeno biespecífica compreendendo um primeiro e um segundo domínio de ligação a antígeno (por exemplo, um anticorpo biespecífico), as CDRs do primeiro domínio de ligação a antígeno podem ser designados com o prefixo "A1" e as CDRs do segundo domínio de ligação a antígeno podem ser designados com o prefixo "A2". Assim, as CDRs do primeiro domínio de ligação a antígeno podem ser referidas neste documento como A1-HCDR1, A1-HCDR2 e A1-HCDR3; e as CDRs do
96 / 138 segundo domínio de ligação a antígeno podem ser referidos neste documento como A2-HCDR1, A2-HCDR2 e A2-HCDR3.
[00139] O primeiro domínio de ligação a antígeno e o segundo domínio de ligação a antígeno podem ser direta ou indiretamente conectados um ao outro para formar uma molécula de ligação a antígeno biespecífica da presente invenção. Alternativamente, o primeiro domínio de ligação a antígeno e o segundo domínio de ligação a antígeno podem, cada um, ser conectados a um domínio de multimerização separado. A associação de um domínio de multimerização com outro domínio de multimerização facilita a associação entre os dois domínios de ligação a antígeno, formando assim uma molécula de ligação a antígeno biespecífica. Conforme usado neste documento, um "domínio de multimerização" é qualquer macromolécula, proteína, polipeptídeo, peptídeo ou aminoácido que tenha a capacidade de se associar a um segundo domínio de multimerização de estrutura ou constituição igual ou semelhante. Por exemplo, um componente de multimerização pode ser um polipeptídeo que compreende um domínio CH3 de imunoglobulina. Um exemplo não limitante de um componente de multimerização é uma porção Fc de uma imunoglobulina (compreendendo um domínio CH2-CH3), por exemplo, um domínio Fc de uma IgG selecionada dentre os isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, bem como qualquer alotipo dentro de cada grupo de isotipo.
[00140] Moléculas de ligação a antígeno biespecíficas da presente invenção tipicamente compreenderão dois domínios de multimerização, por exemplo, dois domínios Fc que são cada um individualmente parte de uma cadeia pesada de anticorpo separada. O primeiro e o segundo domínios de multimerização podem ser do mesmo isotipo IgG, tal como, por exemplo, IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. Alternativamente, o primeiro e o segundo domínios de multimerização podem ser de isotipos de IgG diferentes, tais como, por exemplo, IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, etc.
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[00141] Em certas modalidades, o domínio de multimerização é um fragmento Fc ou uma sequência de aminoácidos de 1 a cerca de 200 aminoácidos de comprimento contendo pelo menos um resíduo de cisteína. Em outras modalidades, o domínio de multimerização é um resíduo de cisteína, ou um peptídeo curto contendo cisteína. Outros domínios de multimerização incluem peptídeos ou polipeptídeos que compreendem ou consistem em um zíper de leucina, um motivo hélice-alça, ou um motivo em super-hélice.
[00142] Qualquer formato ou tecnologia de anticorpo biespecífico pode ser usado para produzir as moléculas de ligação a antígeno biespecíficas da presente invenção. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo possuindo uma primeira especificidade de ligação a antígeno pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, pelo acoplamento químico, fusão genética, associação não-covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo possuindo uma segunda especificidade de ligação a antígeno para produzir uma molécula de ligação a antígeno biespecífica. Formatos biespecíficos exemplares que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem, sem limitação, por exemplo, formatos biespecíficos com base em scFv ou diabody, fusões de IgG-scFv, domínio variável duplo (DVD)-Ig, Quadroma, "knobs-into-holes", cadeia leve comum (por exemplo, cadeia leve comum com "knobs-into-holes", etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)corpo, zíper de leucina, Duobody, IgG1/IgG2, Fab (DAF)-IgG de ação dupla, e formatos biespecíficos Mab2 (ver, por exemplo, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, e referências citadas nele, para uma revisão dos formatos descritos anteriormente; ver também Brinkmann e Konterman (2017) mAbs 9:182-212; cada um dos quais é incorporado por referência em sua totalidade).
[00143] A presente invenção também inclui moléculas de ligação a antígeno biespecíficas compreendendo um primeiro domínio CH3 e um
98 / 138 segundo domínio CH3 de Ig, em que o primeiro e o segundo domínios CH3 de Ig diferem um do outro por pelo menos um aminoácido, e em que pelo menos uma diferença de aminoácido reduz a ligação do anticorpo biespecífico à Proteína A em comparação com um anticorpo biespecífico sem a diferença de aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 de Ig se liga à Proteína A e o segundo domínio CH3 de Ig contém uma mutação que reduz ou anula a ligação à Proteína A, tal como uma modificação H95R (por numeração de éxon IMGT; H435R por numeração EU). O segundo CH3 pode compreender ainda uma modificação Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Outras modificações que podem ser encontradas dentro do segundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422I por EU) no caso de anticorpos de IgG1; N44S, K52N, e V82I (IMGT; N384S, K392N, e V422I por EU) no caso de anticorpos de IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I por EU) no caso de anticorpos de IgG4, ver, por exemplo, WO 2010/151792.
[00144] Em certas modalidades, o domínio Fc pode ser quimérico, combinando sequências Fc derivadas de mais de um isotipo de imunoglobulina. Por exemplo, um domínio Fc quimérico pode compreender parte ou toda a sequência CH2 derivada de uma região CH2 de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana, e parte ou toda uma sequência CH3 derivada de uma IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. Um domínio Fc quimérico também pode conter uma região de dobradiça quimérica. Por exemplo, uma dobradiça quimérica pode compreender uma sequência de "dobradiça superior", derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana, combinada com uma sequência de "dobradiça inferior", derivada de uma região de dobradiça IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. Um exemplo particular de um domínio Fc quimérico que pode ser incluído em qualquer uma das moléculas de ligação a antígeno
99 / 138 estabelecidas neste documento compreende, do terminal N ao C: [IgG4 CH1] - [dobradiça superior de IgG4] - [dobradiça inferior de IgG2] - [IgG4 CH2] - [IgG4 CH3]. Outro exemplo de um domínio Fc quimérico que pode ser incluído em qualquer uma das moléculas de ligação a antígeno estabelecidas neste documento compreende, do terminal N ao C: [IgG1 CH1] - [dobradiça superior de IgG1] - [dobradiça inferior de IgG2] - [IgG4 CH2] - [IgG1 CH3]. Estes e outros exemplos de domínios Fc quiméricos que podem ser incluídos em qualquer uma das moléculas de ligação a antígeno da presente invenção são descritos no Pedido PCT nº WO2014/022540, incorporado por referência em sua totalidade. Domínios Fc quiméricos tendo esses arranjos estruturais gerais e variantes dos mesmos podem ter uma ligação de receptor Fc alterada que, por sua vez, afeta a função efetora de Fc. Métodos de Uso e Fabricação
[00145] Uma modalidade adicional das proteínas do capsídeo viral recombinantes descritas neste documento é seu uso para a distribuição de um nucleotídeo de interesse, por exemplo, um gene repórter ou um gene terapêutico, a uma célula alvo. Geralmente, um nucleotídeo de interesse pode ser um plasmídeo de transferência, que pode geralmente compreender sequências de repetição de terminal invertido (ITR) 5' e 3' flanqueando o(s) gene(s) repórter ou gene(s) terapêutico(s) (que podem estar sob o controle de um promotor viral ou não viral, quando englobados dentro de um vetor AAV. Em uma modalidade, um nucleotídeo de interesse é um plasmídeo de transferência que compreende de 5' a 3': um 5' ITR, um promotor, um gene (por exemplo, um gene repórter e/ou terapêutico) e um 3’ITR.
[00146] Exemplos não limitantes de promotores úteis incluem, por exemplo, promotor de citomegalovírus (CMV), o promotor do vírus formador de foco no baço (SFFV), o promotor do fator de alongamento 1 alfa (EF1a) (o promotor EFla de 1,2 kb ou o promotor EFla de 0,2 kb), o promotor quimérico EF 1 a/IF4 e o promotor da fosforoglicerato quinase (PGK). Um
100 / 138 potencializador interno também pode estar presente no construto viral para aumentar a expressão do gene de interesse. Por exemplo, o potenciador de CMV (Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. 169:13, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade) pode ser utilizado. Em algumas modalidades, o potenciador de CMV pode ser usado em combinação com o promotor 13-actina de galinha.
[00147] Uma variedade de genes repórter (ou frações detectáveis) pode ser encapsulada em uma estrutura multimérica compreendendo as proteínas do capsídeo viral recombinantes descritas neste documento. Genes repórter exemplares incluem, por exemplo, β-galactosidase (gene lacZ codificado), Proteína Verde Fluorescente (GFP), Proteína Verde Fluorescente melhorada (eGFP), MmGFP, Proteína Azul Fluorescente (BFP), Proteína Azul Fluorescente melhorada (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Proteína Amarela Fluorescente (YFP), Proteína Amarela Fluorescente melhorada (eYFP), Emerald, CyPet, Proteína Ciano Fluorescente (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferase, fosfatase alcalina, ou uma combinação destes. Os métodos descritos neste documento demonstram a construção de vetores de direcionamento que empregam o uso de um gene repórter que codifica a proteína verde fluorescente, no entanto, os versados na técnica mediante leitura desta divulgação entenderão que os animais não humanos descritos neste documento podem ser gerados na ausência de um gene repórter ou com qualquer gene repórter conhecido na técnica.
[00148] Uma variedade de genes terapêuticos também pode ser encapsulada em uma estrutura multimérica que compreende as proteínas do capsídeo viral recombinantes descritas neste documento, por exemplo, como parte de um vetor de transferência. Exemplos não limitantes de um gene terapêutico incluem aqueles que codificam uma toxina (por exemplo, um gene suicida), um anticorpo terapêutico ou fragmento do mesmo, um sistema
101 / 138 CRISPR/Cas ou porções do mesmo, RNA antisense, siRNA, shRNA, etc.
[00149] Uma modalidade adicional da presente invenção é um processo para a preparação de uma proteína do capsídeo recombinante, o método compreendendo as etapas de: expressar um ácido nucleico que codifica a proteína do capsídeo recombinante sob condições adequadas, e isolar a proteína do capsídeo expressa da etapa a).
[00150] Modalidades adicionais da presente invenção é um método para alterar o tropismo de um vírus, o método compreendendo as etapas de: (a) inserir um ácido nucleico que codifica um epítopo heterólogo em uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do capsídeo viral para formar uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína do capsídeo geneticamente modificada que compreende epítopo heterólogo e/ou (b) cultivar uma célula empacotadora em condições suficientes para a produção de vetores virais, em que a célula empacotadora compreende a sequência nucleotídica. Uma modalidade adicional da presente invenção é um método para exibir um epítopo heterólogo na superfície de uma proteína do capsídeo, o método compreendendo as etapas de: a) expressar o ácido nucleico de acordo com esta invenção sob condições adequadas e b) isolar a proteína do capsídeo expressa da etapa a).
[00151] Em algumas modalidades, a célula empacotadora compreende ainda um plasmídeo auxiliar e/ou um plasmídeo de transferência compreendendo um nucleotídeo de interesse. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda isolar vetores de vírus adeno-associados autocomplementares do sobrenadante de cultura. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda lisar a célula empacotadora e isolar vetores de vírus adeno-associados de fita única do lisado celular. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda (a) remover debris celulares, (b) tratar o sobrenadante contendo vetores virais com DNase I e MgCl2, (c)
102 / 138 concentrar vetores virais, (d) purificar os vetores virais e (e) qualquer combinação de (a)-(d).
[00152] As células empacotadoras úteis para a produção dos vetores virais descritas neste documento incluem, por exemplo, células animais permissivas para o vírus, ou células modificadas de modo a serem permissivas para o vírus; ou o construto de célula empacotadora, por exemplo, com o uso de um agente de transformação tal como fosfato de cálcio. Exemplos não limitantes de linhagens celulares empacotadoras úteis para produzir vetores virais descritos neste documento incluem, por exemplo, células renais embrionárias humanas 293 (HEK-293) (por exemplo, American Type Culture Collection [ATCC] Nº CRL-1573), células HEK-293 que contêm o antígeno- T grande SV40 (HEK-293T ou 293T), células HEK293T/17, linhagem celular de sarcoma humano HT-1080 (CCL-121), linhagem celular semelhante a linfoblasto Raj i (CCL-86), linhagem celular tipo epitelial de glioblastoma- astrocitoma U87-MG (HTB-14), linhagem celular T-linfoma HuT78 (TIB- 161), células NIH/3T3, células de ovário de hamster chinês (CHO) (por exemplo, ATCC Nº CRL9618, CCL61, CRL9096), células HeLa (por exemplo, ATCC Nº CCL-2), células Vero, células NIH 3T3 (por exemplo, ATCC Nº CLR-1658), células Huh-7, células BHK (por exemplo ATCC Nº CCL10), células PC12 (ATCC Nº CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC Nº CRL1651), células RATI, células L de camundongo (ATCC Nº CCLI.3), células HLHepG2, células CAP, células CAP-T e semelhantes.
[00153] Células L929, o sistema de célula de empacotamento viral FLY descrito em Cosset et al (1995) J Virol 69,7430-7436, células NS0 (mieloma murino), células amnióticas humanas (por exemplo, CAP, CAP-T), células de levedura (incluindo, mas não limitadas a, S. cerevisiae, Pichia pastoris), células vegetais (incluindo, mas não limitadas a, NTl, BY-2 de tabaco), células de inseto (incluindo, mas não limitadas a, SF9, S2, SF21, Tni (por exemplo High 5)), ou células bacterianas (incluindo, mas não limitadas
103 / 138 a, E. coli).
[00154] Para células e sistemas empacotadores adicionais, técnicas de empacotamento e vetores para empacotamento do genoma do ácido nucleico no vetor viral pseudotipado ver, por exemplo, Polo, et al, Proc Natl Acad Sci USA, (1999) 96:4598-4603. Os métodos de empacotamento incluem o uso de células empacotadoras que expressam permanentemente os componentes virais ou a transfecção transitória de células com plasmídeos.
[00155] Modalidades adicionais incluem métodos de redirecionamento de um vírus e/ou distribuição de um gene repórter ou terapêutico a uma célula alvo, o método compreendendo um método para transdução de células in vitro ou in vivo, o método compreendendo as etapas de: colocar a célula alvo em contato com a combinação de um vetor viral compreendendo um capsídeo que compreende um capsídeo viral recombinante que exibe um epítopo heterólogo e uma molécula de ligação multiespecífica, em que a molécula de ligação multiespecífica compreende i) um parátopo de anticorpo que se liga especificamente ao epítopo e (ii) um ligante de redirecionamento que se liga especificamente a um receptor expresso pela célula alvo. Em algumas modalidades, uma composição descrita neste documento compreende, ou um método descrito neste documento, combina um vetor viral recombinante e molécula de ligação multiespecífica em uma razão de molécula:molécula que restaura a eficiência de transdução do vetor viral similar àquele de um vetor viral de controle do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) varia de 1:0,5 a 1:100. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) varia de 1:4 a 1:20. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) varia de 1:8 a 1:15. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica
104 / 138 (molécula:molécula) é de 1:4. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) é de 1:8. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) é de 1:15. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) é de 1:20. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) é menor que 1:100. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) é menor que 1:50. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) é menor que 1:20. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) é menor que 1:15. Em algumas modalidades, a razão de vetor viral recombinante para molécula de ligação multiespecífica (molécula:molécula) é menor que 1:10.
[00156] Em algumas modalidades, a célula alvo está in vitro. Em outras modalidades, a célula alvo está in vivo em um sujeito, por exemplo, um humano. Células Alvo
[00157] Uma ampla variedade de células pode ser direcionada a fim de distribuir um nucleotídeo de interesse usando um vetor viral recombinante, conforme divulgado neste documento. As células alvo serão geralmente escolhidas com base no nucleotídeo de interesse e no efeito desejado.
[00158] Em algumas modalidades, um nucleotídeo de interesse pode ser distribuído para permitir que uma célula alvo produza uma proteína que compensa uma deficiência em um organismo, tal como uma deficiência enzimática, ou deficiência imune, tal como imunodeficiência combinada
105 / 138 grave ligada a X. Assim, em algumas modalidades, as células que normalmente produziriam a proteína no animal são direcionadas. Em outras modalidades, as células na área em que uma proteína seria mais benéfica são direcionadas.
[00159] Em outras modalidades, um nucleotídeo de interesse, tal como um gene que codifica um siRNA, pode inibir a expressão de um gene específico em uma célula alvo. O nucleotídeo de interesse pode, por exemplo, inibir a expressão de um gene envolvido em um ciclo de vida de patógeno. Assim, as células suscetíveis à infecção do patógeno ou infectadas com o patógeno podem ser direcionadas. Em outras modalidades, um nucleotídeo de interesse pode inibir a expressão de um gene que é responsável pela produção de uma toxina em uma célula alvo.
[00160] Em outras modalidades, um nucleotídeo de interesse pode codificar uma proteína tóxica que mata as células em que é expressa. Neste caso, células tumorais ou outras células indesejadas podem ser direcionadas.
[00161] Em ainda outras modalidades, um nucleotídeo de interesse que codifica uma proteína a ser coletada, tal como uma proteína terapêutica pode ser usada e células que são capazes de produzir e secretar a proteína são direcionadas.
[00162] Uma vez que uma população específica de células alvo é identificada em que a expressão de um nucleotídeo de interesse é desejada, um receptor alvo é selecionado que é especificamente expresso nessa população de células alvo. O receptor alvo pode ser expresso exclusivamente nessa população de células ou em maior extensão nessa população de células ao invés de outras populações de células. Quanto mais específico for a expressão, mais especificamente a distribuição pode ser direcionada às células alvo. Dependendo do contexto, a quantidade desejada de especificidade do marcador (e, portanto, da distribuição do gene) pode variar. Por exemplo, para introdução de um gene tóxico, uma alta especificidade é mais preferencial
106 / 138 para evitar eliminar células não alvo. Para a expressão de uma proteína para colheita ou expressão de um produto secretado onde é desejado um impacto global, menos especificidade do marcador pode ser necessária.
[00163] Conforme discutido acima, o receptor alvo pode ser qualquer receptor para o qual um ligante de redirecionamento pode ser identificado ou criado. Preferencialmente, o receptor alvo é um peptídeo ou polipeptídeo, tal como um receptor. No entanto, em outras modalidades, o receptor alvo pode ser um carboidrato ou outra molécula que pode ser reconhecida por um parceiro de ligação. Se um parceiro de ligação, por exemplo, ligante, para o receptor alvo já for conhecido, ele pode ser usado como a molécula de afinidade. No entanto, se uma molécula de ligação não for conhecida, os anticorpos para o receptor alvo podem ser gerados usando procedimentos padrão. Os anticorpos podem então ser usados como um ligante de redirecionamento como parte da molécula de ligação multiespecífica.
[00164] Assim, as células alvo podem ser escolhidas com base em uma variedade de fatores, incluindo, por exemplo, (1) a aplicação específica (por exemplo, terapia, expressão de uma proteína a ser coletada e conferindo resistência a doença) e (2) expressão de um marcador com a quantidade desejada de especificidade.
[00165] As células alvo não são limitadas de nenhuma forma e incluem células de linhagem germinativa e linhagens celulares e células somáticas e linhagens celulares. Células alvo podem ser células-tronco derivadas de qualquer origem. Quando as células alvo são células de linhagem germinativa, as células alvo são preferencialmente selecionadas do grupo consistindo em embriões de célula única e células-tronco embrionárias (ES). Composições farmacêuticas, formas de dosagem e administração
[00166] Uma modalidade adicional fornece um medicamento que compreende pelo menos uma proteína do capsídeo viral recombinante e uma molécula de ligação multiespecífica apropriada de acordo com esta invenção
107 / 138 e/ou um ácido nucleico de acordo com esta invenção, preferencialmente pelo menos uma estrutura multimérica de acordo com esta invenção. Preferencialmente, tal medicamento é útil como um vetor de transferência de gene.
[00167] São divulgadas neste documento também composições farmacêuticas que compreendem os vetores virais descritos neste documento e um carreador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Além disso, são divulgadas neste documento formas de dosagem farmacêuticas compreendendo o vetor viral descrito neste documento.
[00168] Conforme discutido neste documento, os vetores virais descritos neste documento podem ser usados para várias aplicações terapêuticas (in vivo e ex vivo) e como ferramentas de pesquisa.
[00169] As composições farmacêuticas com base nos vetores virais divulgados neste documento podem ser formuladas de qualquer maneira convencional usando um ou mais carreadores e/ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. O vetor viral pode ser formulado para administração por, por exemplo, injeção, inalação ou isolamento (através da boca ou do nariz) ou por administração oral, bucal, parenteral ou retal, ou por administração diretamente a um tumor.
[00170] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para uma variedade de modos de administração, incluindo administração sistêmica, tópica ou localizada. Técnicas e formulações podem ser encontradas, por exemplo, em Remrnington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. Para administração sistêmica, a injeção é preferida, incluindo intramuscular, intravenosa, intraperitoneal e subcutânea. Para efeitos de injeção, as composições farmacêuticas podem ser formuladas em soluções líquidas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank ou solução de Ringer. Além disso, as composições farmacêuticas podem ser formuladas na forma sólida e redissolvidas ou
108 / 138 suspensas imediatamente antes da utilização. As formas liofilizadas da composição farmacêutica também são adequadas.
[00171] Para administração oral, as composições farmacêuticas podem assumir a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparadas por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); enchimentos (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou glicolato de amido de sódio); ou agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os comprimidos também podem ser revestidos por métodos bem conhecidos na técnica. Preparações líquidas para administração oral podem assumir a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou podem ser apresentadas como um produto seco para a constituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas comestíveis); agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações também podem conter sais de tampão, aromatizantes, corantes e agentes edulcorantes, conforme apropriado.
[00172] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para administração parenteral por injeção, por exemplo, por injeção em bolus ou infusão contínua. Formulações para injeção podem ser apresentadas em uma forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de doses múltiplas, com um conservante opcionalmente adicionado. As
109 / 138 composições farmacêuticas podem ainda ser formuladas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter outros agentes incluindo agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.
[00173] Além disso, as composições farmacêuticas também podem ser formuladas como uma preparação de depósito. Essas formulações de ação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo, por via subcutânea ou intramuscular) ou por injeção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos apropriados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados moderadamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel. Outros sistemas de distribuição adequados incluem microesferas que oferecem a possibilidade de distribuição local não invasiva de fármacos durante um período prolongado de tempo. Esta tecnologia pode incluir microesferas com um tamanho pré- capilar, que podem ser injetadas através de um cateter coronário em qualquer parte selecionada de um órgão sem causar inflamação ou isquemia. O terapêutico administrado é então lentamente liberados das microesferas e absorvido pelas células circundantes presentes no tecido selecionado.
[00174] A administração sistêmica também pode ser por meios transmucosais ou transdérmicos. Para administração transmucosal ou transdérmica, penetrantes adequados à barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para administração transmucosal, sais biliares e derivados de ácido fusídico. Além disso, detergentes podem ser usados para facilitar a permeação. A administração de transmucosal pode ocorrer usando sprays ou supositórios nasais. Para administração tópica, o vetor viral descrito neste documento pode ser formulado em pomadas, unguento, géis ou cremes conforme geralmente conhecido na técnica. Uma solução de lavagem também pode ser usada localmente para tratar uma lesão ou inflamação a fim de
110 / 138 acelerar a cicatrização.
[00175] Formas farmacêuticas adequadas para uso injetável podem incluir soluções ou dispersões aquosas estéreis; formulações incluindo óleo de gergelim, óleo de amendoim ou propilenoglicol aquoso; e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida. Deve ser estável sob as condições de fabricação e certos parâmetros de armazenamento (por exemplo, refrigeração e congelamento) e deve ser preservado contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos.
[00176] Se as formulações divulgadas neste documento são usadas como um terapêutico para reforçar uma resposta imune em um sujeito, um agente terapêutico pode ser formulado em uma composição em uma forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amina livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares. Sais formados com os grupos carboxilícos livres também podem ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, sódio, potássio, amônia, cálcio ou hidróxidos férricos, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e similares.
[00177] Um carreador também pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietilenoglicol líquido e similares), misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho do vetor viral necessário no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser causada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos conhecidos na técnica. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares
111 / 138 ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida pelo uso nas composições dos agentes que atrasam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00178] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando os compostos ativos ou construtos na quantidade necessária no solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados acima, conforme exigido, seguido por esterilização filtrada.
[00179] Após a formulação, as soluções podem ser administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade conforme for terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como o tipo de soluções injetáveis descritas acima, mas cápsulas de liberação lenta ou micropartículas ou microesferas e semelhantes também podem ser empregadas.
[00180] Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada se necessário e o diluente líquido ser primeiramente tornado isotônico com solução salina ou glicose suficiente. Essas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração intravenosa, intratumoral, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Neste contexto, meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão conhecidos pelos versados na técnica à luz da presente divulgação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 ml de solução isotônica de NaCl e adicionada a 1000 ml de fluido de hipodermóclise ou injetada no local de infusão proposto.
[00181] A pessoa responsável pela administração, em qualquer caso, determinará a dose apropriada para o sujeito individual. Por exemplo, pode ser administrado a um sujeito vetores virais descritos neste documento diariamente ou semanalmente por um período de tempo ou mensalmente, bi anualmente ou anualmente dependendo da necessidade ou exposição a um
112 / 138 organismo patogênico ou a uma condição do sujeito (por exemplo, câncer).
[00182] Além dos compostos formulados para administração parenteral, tais como injeção intravenosa, intratumoral, intradérmica ou intramuscular, outras formas farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, comprimidos ou outros sólidos para administração oral; formulações lipossomais; cápsulas de liberação temporária; biodegradáveis e qualquer outra forma usada atualmente.
[00183] Também pode-se usar soluções intranasal ou inaláveis ou sprays, aerossóis ou inaladores. Soluções nasais podem ser soluções aquosas projetadas para serem administradas às passagens nasais em gotas ou sprays. Soluções nasais podem ser preparadas de modo que sejam semelhantes em muitos aspectos às secreções nasais. Assim, as soluções nasais aquosas geralmente são isotônicas e ligeiramente tamponadas para manter um pH de 5,5 a 7,5. Além disso, conservantes antimicrobianos semelhantes aos usados em preparações oftálmicas e estabilizadores de fármaco apropriados, se necessário, podem ser incluídos na formulação. Várias preparações nasais comerciais são conhecidas e podem incluir, por exemplo, antibióticos e anti- histamínicos e são usados para profilaxia de asma.
[00184] Formulações orais podem incluir excipientes como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e similares. Estas composições assumem a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação sustentada ou pós. Em determinadas modalidades definidas, as composições farmacêuticas orais incluirão um diluente inerte ou carreador comestível assimilável, ou podem ser colocadas em cápsula de gelatina dura ou de cobertura mole, ou podem ser comprimidas em comprimidos, ou podem ser incorporadas diretamente com o alimento da dieta. Para administração terapêutica oral, os compostos ativos podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de comprimidos
113 / 138 ingeríveis, comprimidos bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers e similares.
[00185] Os comprimidos, pastilhas, pílulas, cápsulas e similares também podem conter o seguinte: um ligante, como goma tragacanto, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes, tais como fosfato dicálcico; um agente desintegrante, tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e similares; um lubrificante, tal como estearato de magnésio; e um agente edulcorante, tal como sacarose, lactose ou sacarina podem ser adicionados ou um aromatizante, como hortelã, o óleo de gualtéria ou aromatizante de cereja. Quando a forma da unidade de dosagem é uma cápsula, ela pode conter, além dos materiais do tipo acima, um carreador líquido. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com goma-laca, açúcar ou ambos. Um xarope de elixir pode conter os compostos ativos de sacarose como agente edulcorante, metil e propilparabenos como conservantes, um corante e aromatizante, tal como sabor cereja ou laranja.
[00186] Outras modalidades divulgadas neste documento podem abranger kits para uso com os métodos e composições. Kits também podem incluir um recipiente adequado, por exemplo, frascos, tubos, tubos mini- ou microcentrífuga, tubo de ensaio, cantil, garrafa, seringa ou outro recipiente. Onde um componente ou agente adicional é fornecido, o kit pode conter um ou mais recipientes adicionais nos quais este agente ou componente pode ser colocado. Os kits deste documento também incluirão tipicamente um meio para conter os vetores virais e quaisquer outros recipientes de reagente em confinamento vedados para venda comercial. Tais recipientes podem incluir recipientes de plástico injetados ou moldados por sopro nos quais os frascos desejados são retidos. Opcionalmente, um ou mais agentes ativos adicionais, tais como, por exemplo, agentes anti-inflamatórios, agentes antivirais, agentes
114 / 138 antifúngicos ou antibacterianos ou agentes antitumorais podem ser necessários para composições descritas.
[00187] As faixas de dose e a frequência de administração podem variar dependendo da natureza dos vetores virais e da condição médica, bem como dos parâmetros de um paciente específico e da via de administração usada. Em algumas modalidades, as composições de vetor viral podem ser administradas a um sujeito em uma dose variando de cerca de 1x105 unidades formadoras de placa (ufp) a cerca de 1x1015 ufp, dependendo do modo de administração, a via de administração, a natureza da doença e condição do sujeito. Em alguns casos, as composições de vetor viral podem ser administradas em uma dose que varia de cerca de 1x108 ufp a cerca de 1x1015 ufp, ou de cerca de 1x1010 ufp a cerca de 1x1015 ufp, ou de cerca de 1x108 ufp a cerca de 1x1012 ufp. Uma dose mais precisa também pode depender do sujeito em que a mesma está sendo administrada. Por exemplo, uma dose mais baixa pode ser necessária se o sujeito for jovem e uma dose mais elevada pode ser necessária se o sujeito for um sujeito humano adulto. Em certas modalidades, uma dose mais precisa pode depender do peso do sujeito. Em certas modalidades, por exemplo, um sujeito humano jovem pode receber de cerca de 1x108 ufp a cerca de 1x1010 ufp, enquanto um sujeito adulto pode receber uma dose de cerca de 1x1010 ufp a cerca de 1x1012 ufp.
[00188] As composições divulgadas neste documento podem ser administradas por qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, as composições podem incluir administração a um sujeito por via intravenosa, intratumoral, intradérmica, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniana, intra-articular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarretal, tópica, intratumoral, intramuscular, intratecal, subcutânea, subconjuntival, intravesicular, via mucosas, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, local, por inalação, por injeção, por infusão, por infusão contínua, por perfusão localizada, através
115 / 138 de um cateter, lavagem, em um creme, ou uma composição lipídica.
[00189] Qualquer método conhecido por aquele versado na técnica pode ser usado para produção em grande escala de vetores virais, células empacotadoras e construtos de vetor descritos neste documento. Por exemplo, os estoques de sementes de mestres e de trabalho podem ser preparados sob condições de GMP em CEFs primários qualificados ou por outros métodos. As células empacotadoras podem ser plaqueadas em cantis de grande área de superfície, cultivadas até quase atingir a confluência e vetores virais podem ser purificados. As células podem ser colhidas e vetores virais liberados no meio de cultura isolado e purificado, ou vetores virais intracelulares liberados pela ruptura mecânica (os debris celulares podem ser removidos por filtração de profundidade de poros grandes e DNA de célula hospedeira digerido com endonuclease). Os vetores virais podem ser subsequentemente purificados e concentrados por filtração de fluxo tangencial, seguido por diafiltração. O volume concentrado resultante pode ser formulado por diluição com um tampão contendo estabilizadores, colocado em frascos e liofilizado. Composições e formulações podem ser armazenadas para uso posterior. Para uso, vetores virais liofilizados podem ser reconstituídos pela adição de diluente.
[00190] Certos agentes adicionais usados nas terapias de combinação podem ser formulados e administrados por qualquer meio conhecido na técnica.
[00191] Composições conforme as divulgadas neste documento também podem incluir adjuvantes, tais como sais de alumínio e outros adjuvantes minerais, agentes tensoativos, derivados bacterianos, veículos e citocinas. Adjuvantes também podem ter propriedades de imunomodulação antagonistas. Por exemplo, adjuvantes podem estimular a imunidade Th1 ou Th2. Composições e métodos conforme divulgados neste documento também podem incluir terapia adjuvante.
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EXEMPLOS
[00192] Os exemplos a seguir são fornecidos para fins ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o escopo da invenção. Exemplo 1: Produção de vetores de vírus adeno-associados com um epítopo heterólogo
[00193] As proteínas do capsídeo de AAV são modificadas para conter um dos vários epítopos heterólogos: FLAG, c-myc, hexahistidina, etc. usando PCR para gerar um plasmídeo que codifica uma proteína do capsídeo recombinante. Brevemente, a sequência que codifica FLAG, c-myc ou hexahistidina é inserida na estrutura após o códon que codifica N587 de uma proteína do capsídeo de AAV2, Q585 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV6, N590 de uma proteína VP1 do capsídeo de AAV8, A589 de uma proteína VP1 do capsídeo de AAV9, ou G453 de uma proteína VP1 do capsídeo de AAV9.
[00194] A produção de vírus adeno-associado é realizada usando um método de transfecção tripla com células HEK293 (ver, por exemplo, Erik Arden e Joseph M. Metzger, J Biol Methods. 2016; 3(2)). As células são plaqueadas um dia antes da transfecção mediada por PEFpro (Polyplus transfection, New York, NY) com vetores apropriados: Um plasmídeo auxiliar, pHelper (Agilent, Cat #240074); Um plasmídeo que codifica o gene rep/cap AAV modificado ou do tipo selvagem (pAAV RC2 (Cell biolabs, Cat# VPK-422), por exemplo, pAAV RC2/6/9 (Cell biolabs, Cat# VPK-426), pAAV RC8, pAAV RC2- N587myc, pAAV RC2/6-Q585myc, pAAVRC8-N590myc, pAAV RC9- A589myc, etc.; e Um plasmídeo que codifica um nucleotídeo de interesse e sequências AAV ITR, por exemplo, pscAAV-CMV-eGFP, pAAV-CMVGFP (Agilent Cat# 240074), pAAV-EF1a-eGFP ou pAAV-CAGG-eGFP, etc.
[00195] Setenta e duas horas após a transfecção, o meio é coletado e as
117 / 138 células são lisadas em tampão [50Mm de Tris-HCl, 150Mm de NaCl e 0,5% de desoxicolato de sódio (Sigma, Cat# D6750-100G)]. Em seguida, a benzonase (Sigma, St. Louis, MO) é adicionada a lisado de meio e células a uma concentração final de 0,5 U/μl antes da incubação a 37 °C por 60 minutos. O lisado celular é centrifugado a 4000 rpm por 30 min. O lisado e meio celular são combinados e precipitados com PEG 8000 (Teknova Cat# P4340) em uma concentração final de 8%. O pélete é ressuspenso em 400Mm de NaCl e centrifugado a 10000g por 10min. Os vírus no sobrenadante são peletizados por ultracentrifugação a 149.000 g por 3 horas e titulados por qPCR.
[00196] Para que a qPCR titule genomas AAV, amostras de AAV são tratadas com DNaseI (Thermofisher Scientific, Cat #EN0525) a 37°C por uma hora e lisadas usando extrato de DNA All Reagents (Thermofisher Scientific Cat# 4403319). Genomas virais encapsulados são quantificados usando um sistema de PCR em tempo real QuantStudio 3 (Thermofisher Scientific) usando primers direcionados para os ITRs de AAV2. As sequências dos primers de ITRs de AAV2 são 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ (fwd ITR; SEQ ID NO:9) e 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′ (rev ITR; SEQ ID NO:10) (Aurnhammer et al2012), derivaram a sequência de repetição invertida interna esquerda (ITR) de AAV e a sequência de repetição invertida interna direita (ITR) de AAV, respectivamente. A sequência da sonda de ITRs de AAV2 é 5′-6-FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-TAMRA-3′ (SEQ ID NO:11) (Aurnhammer C., Haase M., Muether N., et al., 2012, Hum. Gene Ther. Methods 23, 18–28). Após uma etapa de ativação a 95°C por 10 min, um ciclo de PCR de duas etapas é executado a 95°C por 15 segundos e a 60°C por 30 segundos por 40 ciclos. A TaqMan Universal PCR Master Mix (Thermofisher Scientific, Cat #4304437) foi usada na qPCR. O plasmídeo de DNA (Agilent, Cat #240074) é usado como padrão para determinar os títulos absolutos.
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[00197] Vetores de vírus adeno-associados compreendendo um capsídeo em que epítopos c-myc foram produzidos. Neste exemplo, um epítopo c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO:6) foi inserido entre os aminoácidos N587 e R588 da proteína VP1 do capsídeo de AAV2 ou entre os aminoácidos A589 e Q590 da proteína VP1 do capsídeo de AAV9, ou seja, a sequência nucleotídica que codifica o epítopo c-myc (GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAT CTG, SEQ ID NO:12) foi inserida em um plasmídeo pAAV RC2 (Cell Biolabs Inc., San Diego, CA) ou em um plasmídeo pAAV RC2/9, e cada um dos respectivos plasmídeos pAAV RC2-N587Myc pAAV RC9-A589Myc modificados foi usado para codificar a proteína do capsídeo modificada para vetores virais AAV com um tropismo reduzido a anulado.
[00198] Para criar pAAV RC2-N587Myc, um primeiro produto de reação em cadeia de polimerase (PCR) compreendendo (de 5' a 3') um sítio de restrição de BsiW1, a sequência de nucleotídeos entre as posições 3050 e 3773 de pAAV RC2 e uma sequência de nucleotídeos de cadeia secundária de epítopos c-myc, e um segundo produto que compreende (de 5' a 3') uma sequência de nucleotídeos de cadeia secundária c-myc, a sequência de nucleotídeos entre as posições 3774 a 4370 de pAAV RC2, e um sítio de restrição de Pme1 foram criados usando os primers estabelecidos na Tabela 2. O plasmídeo pAAV RC2-N587Myc (isto é, um plasmídeo pAAV RC2 modificado para codificar o epítopo c-myc entre aminoácidos N587 e R588 da proteína do capsídeo VP1) foi criado pela digestão de pAAV RC2 com BsiW1 (New England Biolabs, R0553L) e Pme1 (New England Biolabs, R0560L), e pela inserção dos dois produtos de PCR através de clonagem independente de ligação conforme descrito em (2012) Methods Mol. Biol. 52:51-9.
[00199] Para criar pAAV RC2/6-Q585Myc, um fragmento de DNA gblock compreendendo posições de 3700 e 3940 de pAAV RC2/6 com sequência de epítopo c-myc inserida entre 3757 e 3758 foi solicitado de
119 / 138 Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). O plasmídeo pAAV RC2/6- Q585Myc foi criado por inserção do fragmento de gblock em pAAV RC2/6 digerido com MscI (New England Biolabs, Cat# R0534L) e AflII (New England Biolabs, Cat #R0520L) através da clonagem independente de ligação, conforme descrito em (2012) Methods Mol. Biol. 52:51-9.
[00200] Para criar o pAAV RC9-A589Myc, um primeiro produto de reação em cadeia da polimerase (PCR) compreendendo (de 5' a 3') um sítio de restrição BsiW1, a sequência de nucleotídeos entre as posições 3052 e 3779 de pAAV RC9 e uma sequência de nucleotídeos de cadeia secundária (“overhang”) de epítopo de c-myc e um segundo produto de PCR que compreende (de 5' a 3') uma sequência de nucleotídeos de cadeia secundária de epítopo de c-myc, a sequência de nucleotídeos entre as posições 3779 e 4404 de pAAV RC9, e um sítio de restrição de Pme1 foram criados usando os primers estabelecidos na Tabela 2.
[00201] O plasmídeo pAAV RC9-A589Myc (isto é, um plasmídeo pAAV RC2/9 modificado para codificar o epítopo c-myc entre aminoácidos A589 e Q590 da proteína do capsídeo VP1) foi criado pela digestão de pAAV RC9 com BsiW1 (New England Biolabs, R0553L) e Pme1 (New England Biolabs, R0560L), e pela inserção dos dois produtos de PCR através de clonagem independente de ligação conforme descrito em (2012) Methods Mol. Biol. 52:51-9. Tabela 2 Produto de PCR Nome do primer 5'-Sequência-3' e (SEQ ID NO:) pAAVRC2BsiWF GGAGTACCAGCTCCCGTACG1 (SEQ ID NO:13) 3050-3773
CTC TTC TGA GAT GAG TTT TTG TTC pAAVRC2-cMyc N587mycR GTTGCCTCTCTGGAGGTTG (SEQ ID NO:14) cMyc- AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG N587mycF 3774-4370 AGACAAGCAGCTACCGCAG (SEQ ID NO:15) pAAVRC2 pAAVRC2PmeR TCCGCCCGCTGTTTAAAC2 (SEQ ID NO:16) pAAVRC9-cMyc ACTCAGACTATCAGCTCCCGTACG1 (SEQ ID pAAVRC9BsiWF NO:17)
CTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTGCTTGGGCAC A589mycR TCTGGT (SEQ ID NO:18) cMyc- AAACTCATCTCAGAGAGGATCTGCAGGCGCAGA A589mycF pAAVRC9 CCGG (SEQ ID NO:19) pAAVRC9PmeR CTCCGCCCGCTGTTTAAAC2 (SEQ ID NO:20)
120 / 138 Sequências sublinhadas representam sítios de reconhecimento de enzima de restrição. 1 BsiW1 2 Pme1
[00202] pscAAV-CMV-eGFP foi produzido pela introdução do fragmento GFP no vetor pscAAV MCS (Cell Biolabs, Cat# VPK-430) usando sítio de restrição BamHI e NotI. O plasmídeo pAAV-EF1a-eGFP e pAAV- CAGG-eGFP foi feito por síntese de novo da Thermofisher Scientific (Waltham, MA) Exemplo 2: Redirecionamento mediado por anticorpos de vetores virais AAV In vitro
[00203] HepG2 é uma linhagem celular de câncer de fígado humano, que expressa o receptor 1 do marcador de asialoglicoproteína (ASGR1) específico do fígado. Para testar se os vetores virais scAAV2-N587Myc- CMV-hrGFP podem infectar células HepG2, por exemplo, através de um anticorpo biespecífico que reconhece tanto c-myc quanto ASGR1 (anticorpo anti-myc-ASGR1), as misturas compreendendo diferentes proporções do número de genomas virais (genomas virais 5e9) ao número de moléculas de anticorpos (1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:15, 1:20, 1:50 ou 1:100) de scAAV2- N587Myc-CMV-eGFP e anticorpos anti-myc-ASGR1 biespecíficos foram incubados à temperatura ambiente por meia hora, e depois adicionados à célula HepG2. Células HepG2 também foram incubadas apenas com vetores virais scAAV2-CMV-eGFP do tipo selvagem, apenas vetores virais scAAV2- N587Myc-CMV-eGFP, ou vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP com anticorpos monoespecíficos anti-myc (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY) em uma razão 1:8 como controles. Três dias após a infecção, a expressão de GFP por células HepG2 infectadas foi confirmada por separação celular ativada por fluorescência (FACS) (Figura 1). A expressão de GFP também foi detectada em uma porcentagem comparável de células HepG2 quando incubadas com scAAV2-CMV-eGFP tipo selvagem e quando incubadas com vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP e anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico em uma razão de 1:8 (44,6% e 44,1%,
121 / 138 respectivamente, Figuras 1A e 1G, painéis superior e inferior). A expressão de GFP inferior foi detectada por FACS em células HepG2 incubadas com uma mistura de vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP e anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico superior ou inferior (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY) (Figura 1C, painel inferior). Adicionalmente, GFP não foi detectado em células HepG2 infectadas com scAAV-N587Myc-CMV-eGFP na ausência de anticorpo anti-myc-ASGR1, ou em células HepG2 incubadas com scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP e anticorpo anti-myc monoespecífico.
[00204] Similarmente, as células 293T-hASGR1, que são células 29T3 geneticamente modificadas para expressar o ASGR1 humano (h) na superfície celular, foram incubadas com misturas compreendendo diferentes razões de genomas virais para o número de moléculas de anticorpo (1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:15, 1:20 ou 1:100) de scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP e anticorpo anti- myc-ASGR1 biespecífico. Células 293T do tipo selvagem (que não expressam hASGR1) incubadas com uma mistura de scAAV2-N587Myc- CMV-eGFP e anticorpo biespecífico anti-myc-ASGR1 em uma razão de 1:8, e 293T-hASGR1 células incubadas com (a) vetores virais scAAV do tipo selvagem apenas, (b) vetores virais de scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP apenas, ou (c) vetores virais de scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP com um anticorpo anti-myc-GCGR biespecífico irrelevante que reconhece c-myc e receptor de glucagon (GCGR) (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY) não expressado por células 293T em uma razão de 1:8, serviram como controles. Três dias após a infecção, células 293T-hASGR1 ou 293T foram coradas com anticorpo anti-hASGR1 humano (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY) seguido por anticorpo APC anti-humano de cabra conjugado (Jackson ImmunOresearch laboratories Inc, Cat# 109-136-098, West Grove, PA) e expressão de GFP analisada por FACS. A expressão de hASGR1 foi detectada na superfície de células 293T-hASGR1 (Figuras 2Ai-
122 / 138 2Ax e 2Axii) mas não na de células 293T (Figura 2Axi). Células 293T- hASGR1 positivas para GFP foram detectadas após incubação com scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP e misturas de anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico com razões de 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:15, 1:20 e 1:50 em níveis (56,9% a 68,3%), comparáveis a células 293T-hASGR1 incubadas com scAAV do tipo selvagem (56,7%) (Figuras 2Ai e 2Aiii-2Aix). Uma razão de 1:100 de scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP e anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico diminuiu a infectividade (Figura 2Ax). A incubação com scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP sozinho ou scAAV-N587Myc com um anticorpo anti-myc-GCGR biespecífico irrelevante não resultou na expressão de GFP por células 293T-hASGR1 (Figuras 2Aii e 2Axii).
[00205] Em um experimento similar, células 293T-hASGR1 foram incubadas com células incubadas apenas com vetores virais AAV9-CAGG- GFP não modificados, apenas vetores virais AAV9- A589Myc -CAGG-eGFP, ou vetores virais AAV9- A589Myc -CAGG-eGFP misturados com anticorpos anti-Myc-ASGR1 biespecíficos em razões diferentes. Três dias após a infecção, a expressão de GFP foi analisada por FACS. Células 293T-hASGR1 positivas para GFP foram detectadas após incubação com AAV9-A589Myc- CAGG-eGFP e misturas de anticorpo biespecífico anti-myc-ASGR1 com razões de 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:20, 1:50 e 1:100 em níveis (41,1% a 91%), comparáveis a células 293T-hASGR1 incubadas com AAV9-CAGG-eGFP do tipo selvagem (9,72%) Figura 2B(i) e Figuras 2B(iii)-(ix). A incubação com AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP sozinho não resultou na expressão de GFP por células 293T-hASGR1 (Figura 2B(ii)).
[00206] A capacidade de um anticorpo anti-hASGR1 bivalente (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY) em bloquear a infecção de células 293T-hASGR1 foi testada. As células 293T-hASGR1 foram incubadas com o anticorpo anti-hASGR1 bivalente em diferentes concentrações por 1 hora em temperatura ambiente e posteriormente
123 / 138 incubadas com uma mistura compreendendo uma razão de 1:8 de scAAV2- N587Myc-CMV-eGFP e anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico. Três dias após a infecção, as células foram fixadas e analisadas por FACS, conforme descrito acima. Figura 3 fornece dados mostrando que a entrada de scAAV2- N587Myc-CMV-eGFP pode ser bloqueada de uma forma dependente da dose pelo anticorpo anti-hASGR1 bivalente.
[00207] Para determinar se a administração sequencial de anticorpo biespecífico e o AAV modificado poderia resultar em redirecionamento mediado por anticorpos do AAV modificado, diferentes números de moléculas de anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico (variando de 1x109 a 1x1012 moléculas) foram adicionadas a 2x105 293T-hASGR1 células por uma hora, após a qual 1x109 Os vetores virais scAAV-N587Myc foram adicionados. Os controles incluíram (1) células 293T-hASGR1 incubadas apenas com scAAV de tipo selvagem, ou seja, na ausência de qualquer anticorpo, (2) células 293T-hASGR1 sequencialmente incubadas com 1x1011 moléculas de anticorpo anti-myc-GCGR biespecífico irrelevantes e 1x109 vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP e (3) células 293T, que não expressam hASGR1, sequencialmente incubadas com 1x1011 moléculas de anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico e 1x109 vetores virais scAAV- N587Myc. Dois dias após a infecção, a expressão de GFP por células 293T- hASGR1 infectadas foi visualizada por microscopia (Figura 4). A expressão de GFP por células 293T-hASGR1 foi observada após incubação apenas com scAAV do tipo selvagem e após incubação sequencial com moléculas de anticorpo anti-myc-ASGR1 em todas as concentrações e scAAV2-N587Myc- CMV-eGFP (Figuras 4A, 4C-4I). A GFP não foi detectada em células 29T3-hASGR1 após incubação apenas com scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (Figura 4B), em células 293T que não expressam ASGR1 após incubação sequencial com anticorpo anti-myc-hASGR1 e vetores virais scAAV2- N587Myc-CMV-eGFP (Figura 4J), ou em células 29T3-hASGR1 após
124 / 138 incubação sequencial com anticorpo anti-myc-GCGR biespecífico irrelevante e vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (Figura 4K).
[00208] Conforme descrito neste documento, o tropismo de AAV autocomplementar (scAAV) pode ser (1) inativado, por exemplo, pela modificação de uma proteína do capsídeo, por exemplo, pela inserção de um epítopo c-myc e, opcionalmente, (2) redirecionado usando anticorpos biespecíficos, por exemplo, com um anticorpo biespecífico que reconhece o epítopo c-myc e um ligante expresso pela célula alvo. Para determinar se o tropismo do AAV de fita única (ssAAV) pode ser similarmente (1) reduzido ou anulado e, opcionalmente, (2) redirecionado, as células 293T-hASGR1 foram incubadas com vetores virais ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP produzidos conforme descrito no Exemplo 1 na ausência ou presença de anticorpo anti-myc-hASGR1 biespecífico em razões de vetor viral:anticorpo diferentes (1:0, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:20, 1:100 ou 1:1000). Os controles incluíram células 293T-hASGR1 incubadas com células 293T-hASGR1, ssAAV de tipo selvagem incubadas com vetores virais ssAAV2-N587Myc- CMV-hrGFP e anticorpo anti-myc-GCGR biespecífico irrelevante em uma razão vetor viral:anticorpo de 1:8 e células 293T (que não expressam hASGR1) incubadas com vetores virais de ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP e anticorpo anti-myc-hASGR1 biespecífico em uma razão de vetor viral:anticorpo de 1:8. Três dias após a infecção, as células foram fixadas e a expressão de GFP detectada por FACS (Figura 5). A expressão de GFP foi detectada em células 293T-hASGR1 incubadas com ssAAV de tipo selvagem e com misturas de vetores virais ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP e anticorpos anti-myc-ASGR1 biespecíficos em todas as razões (Figuras 5A, 5C-5I). A expressão de GFP não foi observada por células 29T3 incubadas com vetores virais ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP e anticorpos anti-myc- ASGR1 biespecíficos (Figura 5J), ou por células 293T-hASGR1 incubadas apenas com vetores virais ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP, ou com vetores
125 / 138 virais ssAAV-N587Myc e anticorpo biespecífico anti-myc-GCGR biespecífico irrelevante (Figuras 5B, 5K).
[00209] O receptor de glucagon humano (h) (GCGR) não é normalmente expresso por células 293T. No entanto, 293T-hGCGR é uma linhagem de células 293T estável geneticamente modificada para expressar hGCGR na superfície celular. Para testar se o redirecionamento de vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP pode ser mediado pelo anticorpo biespecífico anti-myc-GCGR através do receptor hGCGR, células 293T-hGCGR foram incubadas com diferentes misturas compreendendo razões diferentes de scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP:anticorpo anti-myc- GCGR biespecífico. Os vetores virais scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP foram misturados com anticorpo anti-myc-GCGR biespecífico em razões de 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:15, 1:20, 1:50 ou 1:100 em temperatura ambiente por meia hora antes da adição a células 293T-hGCGR. Três dias após a infecção, a expressão de GFP por células 293T-hCGCR infectadas foi confirmada por separação celular ativada por fluorescência (FACS) (Figura 6). Uma porcentagem significativa de células positivas para GFP foi detectada após incubação com scAAV do tipo selvagem (Figura 6A) ou scAAV2-N587Myc- CMV-eGFP/anticorpo anti-myc-GCGR biespecífico na razão de 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:15, 1:20, 1:50 e 1:100 (Figuras 6C-6K). GFP não foi detectado em células 293T-hGCGR incubadas com vetores virais scAAV2-N587myc-CMV-eGFP sozinhos ou vetores virais scAAV2- N587Myc-CMV-eGFP com anticorpo anti-myc monoespecífico (Figuras 6B e 6L, respectivamente).
[00210] Jurkat é uma linhagem celular de leucemia aguda de célula T humana, que expressa CD3 humano (h). Para testar se o redirecionamento de vetores virais AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP pode ser mediado pelo anticorpo anti-myc-CD3 biespecífico através do receptor hCD3, as células Jurkat foram incubadas com diferentes misturas compreendendo diferentes razões de
126 / 138 AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP:anticorpo anti-myc-CD3 biespecífico. Os vetores virais AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP foram misturados com anticorpo anti-myc-CD3 biespecífico em razões de 1:1, 1:5, 1:10, 1:100, 1:1000 em temperatura ambiente por meia hora antes da adição às células Jurkat. Três dias após a infecção, a expressão de GFP por células Jurkat infectadas foi confirmada por separação celular ativada por fluorescência (FACS) (Figura 7). Uma porcentagem significativa de células positivas para GFP foi detectada após incubação com AAV6-EF1a-eGFP do tipo selvagem (Figura 7B) ou AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP/anticorpo anti-myc-CD3 biespecífico na razão de 1:1, 1:5, 1:10 e 1:100 (Figuras 7D-7G). GFP não foi detectado em células Jurkat incubadas com vetores virais AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP (Figuras 7C)
[00211] Descrito neste Exemplo está a inativação do tropismo natural de vários sorotipos de AAV autocomplementares (sc) ou de fita simples (ss) demonstrados pela incapacidade de scAAV2 ou ssAAV2 geneticamente modificado com um epítopo c-myc inserido entre o aminoácido N587 e R588 da proteína do capsídeo VP1 (scAAV-N587myc ou ssAAV-N587myc), AAV6 com um epítopo c-myc inserido entre Q585 e S586, e AAV9 com para infectar células normalmente infectadas por AAVs do tipo selvagem (Figuras 1A-1B, 2A-2B, 3A-3B, 4A-4B, 5A-5B, 6A-6B, e 7). Adicionalmente demonstrado neste Exemplo está a capacidade de um anticorpo biespecífico que reconhece o epítopo c-myc e um segundo ligante expresso pela célula alvo (por exemplo, hASGR1, hGCGR ou hCD3) para redirecionar o tropismo do AAV modificado e mediar a infecção da célula alvo por AAV pseudotipado de uma maneira específica ao ligante (Figuras 1-7). Além disso, este Exemplo demonstra que a administração simultânea de sc- ou ss- AAV modificado geneticamente e anticorpo biespecífico não é necessária para infecção, ou seja, a administração sequencial é suficiente para redirecionamento do sc- ou ss- AAV geneticamente modificado. in vitro
127 / 138 (Figura 4). Exemplo 3: Redirecionamento mediada por anticorpo de vetores virais modificados In Vivo Redirecionamento de vetores virais para o fígado com diferentes formatos de molécula de ligação multiespecífica
[00212] Para determinar se o anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico poderia redirecionar vetores virais scAAV2-N587myc-CMV-eGFP para células hepáticas que expressam hASGR1 in vivo, camundongos geneticamente modificados de modo que suas células hepáticas expressam hASGR1 em C57BL/6 background, e controle de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem foram injetados com 1x1011 (titulada por qPCR) de vetores virais de scAAV2-CMV-eGFP do tipo selvagem sozinhos ou scAAV2-N587myc-CMV-eGFP em combinação com anticorpo anti-myc- ASGR1 biespecífico e na razão de 1:8 de genoma viral para moléculas de anticorpo intravascularmente. Os controles incluíram camundongos injetados com solução salina [250Mm de NaCl] ou com vetor viral scAAV2-N587mic- CMV-eGFP sozinho. Dez dias após a injeção, os camundongos foram sacrificados e submetidos à perfusão transcardíaca com PFA a 4%. Órgãos como fígados, rins e coração foram coletados e desidratados em sacarose a 15% seguido por sacarose a 30%. Em seguida, os órgãos foram criosseccionados em lâminas e corados com anticorpo anti-EGFP de frango (Jackson ImmunOresearch Labs, Inc. West Grove, PA) e anticorpo secundário anti-galinha conjugado Alexa-488 (Jackson ImmunOresearch Labs, Inc. West Grove, PA). (Figuras 8A-8C). Células positivas para GFP foram detectadas nos fígados daqueles animais transgênicos modificados para expressar ASGR1 no fígado e injetados com scAAV2-CMV-eGFP do tipo selvagem ou scAAV2-N587myc-CMV-eGFP em combinação com anticorpo anti-myc- ASGR1 biespecífico (Figuras 8A(i) e 8A (iv)) e em fígados de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem injetados com scAAV2-CMV-eGFP do tipo
128 / 138 selvagem (Figura 8A(v)). A GFP não foi detectada em nenhuma amostra de baço ou rim (Figuras 8B e 8C), nem em amostras de fígado, baço ou rim de qualquer animal injetado com solução salina ou vetores virais de scAAV2- N587mic-eGFP sozinho (Figuras 8A(ii, iii, vi, vii)), nem em amostras de fígado tiradas de animais C57BL/6 do tipo selvagem injetados com scAAV2- N587myc-CMV-eGFP em combinação com anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico (Figura 8A(viii)). Em resumo, a combinação de vetores virais scAAV2-N587myc-eGFP e anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico infectou apenas aquelas células (hepáticas) que expressam hASGR1, sugerindo fortemente que o vetor viral scAAV2-CMV-eGFP foi inativado pela modificação da proteína do capsídeo, por exemplo, o tropismo natural do vetor scAAV viral poderia ser de reduzido a anulado, por exemplo, com um epítopo c-myc, e esses vetores virais poderiam ser especificamente reativados, por exemplo, especificamente redirecionados, por exemplo, para células hepáticas in vitro, por exemplo, por anticorpos anti-myc ASGR1 biespecíficos.
[00213] Similarmente, para determinar se o anticorpo anti-myc- ASGR1 biespecífico poderia redirecionar vetores virais ssAAV2-N587myc- CAGG-eGFP para células hepáticas que expressam hASGR1 in vivo, camundongos geneticamente modificados de modo que suas células hepáticas expressem hASGR1 em C57BL/6 secundário e controle de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem foram injetados com 2,18x1011 (titulada por qPCR) de vetores virais do tipo selvagem ssAAV2-CAGG-eGFP sozinho ou ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP em combinação com anticorpo anti-myc- ASGR1 biespecífico e na razão de 1:4 de genoma viral para moléculas de anticorpo intravascularmente. Os controles incluíram camundongos injetados com PBS ou com vetor viral ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP sozinho. Quatro semanas após a injeção, os camundongos foram sacrificados e submetidos à perfusão transcardíaca com PFA a 4% . Órgãos como fígados,
129 / 138 rins e coração foram coletados e desidratados em sacarose a 15% seguido por sacarose a 30%. Em seguida, os órgãos foram criosseccionados em lâminas e corados com anticorpo anti-EGFP de frango (Jackson ImmunOresearch Labs, Inc.
West Grove, PA) e anticorpo secundário anti-galinha conjugado Alexa-488 (Jackson ImmunOresearch Labs, Inc.
West Grove, PA). Células positivas para GFP foram detectadas em fígados daqueles animais transgênicos modificados para expressar ASGR1 no fígado e injetados com ssAAV2-CAGG-eGFP do tipo selvagem ou ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP em combinação com anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico (Figuras 9E- 9F, 9P-9R) e em fígados de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem injetados com ssAAV2-CAGG-eGFP do tipo selvagem (Figura 9B-9C). Surpreendentemente, a eficiência de infecção de ssAAV2-N587myc-CAGG- eGFP em combinação com anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico é muito maior do que WT ssAAV2-CAGG-GFP (Figuras 9E-9F, 9P-9R). A GFP não foi detectada ou pouco detectada em amostras de fígado de qualquer animal injetado com solução salina ou vetores virais ssAAV2-N587myc-CAGG- eGFP sozinho (Figuras 9A, 9D, 9G-9L)), nem em amostras de fígado tiradas de animais C57BL/6 do tipo selvagem injetados com ssAAV2-N587myc- CAGG-eGFP em combinação com anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico (Figura 9M-9O). Em resumo, a combinação de vetores virais ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP e anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico infectou apenas aquelas células (hepáticas) que expressam hASGR1, sugerindo fortemente que o vetor viral ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP foi inativado pela modificação da proteína do capsídeo, por exemplo, o tropismo natural do vetor viral scAAV poderia ser de reduzido a anulado, por exemplo, com um epítopo c-myc, e esses vetores virais poderiam ser especificamente reativados, por exemplo, especificamente redirecionados, por exemplo, para células hepáticas in vivo, por exemplo, por anticorpos anti-myc-ASGR1 biespecíficos.
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[00214] Experimentos adicionais com um vetor viral AAV9 pseudotipado foram realizados com camundongos geneticamente modificados de modo que suas células hepáticas expressam hASGR1 em C57BL/6 background. Esses camundongos foram injetados com 1x1011 (titulado por qPCR) de partículas virais AAV9-CAGG-eGFP do tipo selvagem ou AAV9-A589myc-CAGG-eGFP em combinação com anticorpo anti-myc- ASGR1 biespecífico na razão de 1:100 de genoma viral para moléculas de anticorpo intravascularmente. Os controles incluíram camundongos injetados com PBS ou com partículas virais AAV9-N587myc-CAGG-eGFP em combinação com anticorpo anti-myc-hCD3 biespecífico irrelevante. Quatro semanas após a injeção, os camundongos foram sacrificados. Os fígados foram fixados com formalina a 10% e enviados para a HistOwiz. Inc (Nova York, NY) para coloração por GFP. Células positivas para GFP foram detectadas nos fígados daqueles animais injetados com partículas virais AAV9-CAGG-eGFP ou AAV9-N587myc-CAGG-eGFP do tipo selvagem em combinação com anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico (Figuras 10A e 10D). A GFP não foi detectada ou pouco detectada em amostras de fígado de qualquer animal injetado com solução salina ou com partículas virais AAV9-N587myc-CAGG-eGFP em combinação com anticorpo anti-myc- hCD3 biespecífico, respectivamente (Figuras 10B e 10C). Em resumo, similarmente ao AAV2, o tropismo natural de AAV9 pode ser de reduzido a anulado pela modificação da proteína do capsídeo, por exemplo, pela inserção de um epítopo c-myc, e de modo que tal vetor viral modificado, por exemplo, AAV9-A589myc, pode ser redirecionado para tipos celulares específicos usando proteína de ligação a marcador específico de células anti-epítopo biespecíficas correspondente, por exemplo, anticorpo anti-myc-ASGR1 biespecífico para células hepáticas. Anti-myc com scFc ligado ao formato Fc "knobs-into-hole" de IgG4 anti- hASGR1
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[00215] Para determinar se vários formatos de molécula de ligação multiespecífica poderiam mediar a infecção AAV, anti-myc scFv foi fundido ao terminal C de uma cadeia de um anticorpo IgG4 anti-hASGR1 "knobs- into-holes" (ver Figura 11A). Especificamente, um gblock que codifica um anti-myc scFv (SEQ ID NO:28) flanqueado por braços homólogos para 1459- 1478 e 1479-1498 de pRG7078 codificando uma cadeia pesada de IgG4 stealth knob anti-hASGR1 foi fornecido por tecnologias de DNA integrado (Skokie, Illinois). As sequências de nucleotídeos (NA) codificando e as sequências de aminoácido (AA) de HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de scFv (SEQ ID NO:37) codificadas pela SEQ ID NO:28 são fornecidas na Tabela 3. Tabela 3: SEQ ID NOs associadas com o scFv estabelecido como SEQ ID NO:37 scFv HCVR LCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 AA 37 29 30 31 32 33 34 35 36 NA 38 39 40
[00216] O gblock foi clonado em pRG7078 que codifica uma cadeia pesada de Igg4 stealth knob anti-hASGR1 para produzir um pRG7078 que codifica um polipeptídeo de fusão de scFv anti-myc de IgG4 stealth knob anti-hASGR1 "anti-hASGR1-IgG4-Fc/anti-myc biespecífico". Foram transfectados o plasmídeo pRG7078 modificado com c-myc, stealth hole star de IgG4 anti-hASGR1 pRG7078 não-modificado e um plasmídeo contendo cadeia leve de anticorpo em células 293T, cultivadas com OPTI-MEM (Cat#31985070, Thermo Fisher). Quatro dias após a transfecção, o meio foi coletado e o anti-hASGR1-IgG4-Fc/molécula de ligação anti-myc biespecífica foi purificado usando a coluna proteína A (cat # 89948, Thermo Fisher).
[00217] Para criar um vetor viral de AAV8 pseudotipado, pAAV RC8 N590myc, um gblock com um epítopo c-myc (SEQ ID NO:22) inserido entre o N590 e T591 de uma proteína do capsídeo VP1 de AAV8 foi pedido da Integrated DNA technologies (Skokie, Illinois). O plasmídeo pAAV RC8
132 / 138 (SEQ ID NO:23) foi digerido com enzimas Mlu1 e Sbf1 e o gblock foi clonado no vetor usando SLIC para produzir pAAV RC8 N590myc (SEQ ID NO:24).
[00218] As células 293T-hASGR1, que são células 293T geneticamente modificadas para expressar o ASGR1 humano (h) na superfície celular, foram incubadas com misturas compreendendo diferentes razões de moléculas de AAV8-N590Myc-CAGG-eGFP para anti-hASGR1-IgG4- Fc/molécula de ligação anti-myc biespecíficas (1:0, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:12, 1:15, 1:50, ou 1:100) ou genomas virais AAV8-CAGG-eGFP. Três dias após a infecção, a expressão de GFP foi analisada por FACS. Células 293T- hASGR1 positivas para GFP foram detectadas após incubação com misturas de AAV8-N590Myc-CAGG-eGFP e anti-hASGR1-IgG4-Fc/moléculas de ligação anti-myc biespecíficas em razões de 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:12, 1:15, 1:50, ou 1:100 (2,12% a 22,2%; Figuras 12D-12K) comparável a células 293T-hASGR1 incubadas com AAV8-CAGG-eGFP do tipo selvagem (46,1%) (Figura 12A). Nenhuma célula não infectada (Figura 12B) nem incubação com AAV8-N590Myc-CAGG-eGFP sozinho resultou em expressão de GFP por células 293T hASGR1 (Figura 12C).
[00219] Para determinar se anti-hASGR1-IgG4-Fc/proteínas de ligação anti-myc biespecífica poderiam redirecionar as partículas virais de AAV8 N590myc-CAGG-eGFP para células hepáticas que expressam hASGR1 in vivo, camundongos geneticamente modificados de modo que suas células hepáticas expressam hASGR1 em C57BL/6 background foram injetadas intravascularmente com 1x1011 (titulado por qPCR) de partículas virais AAV8-CAGG-eGFP do tipo selvagem ou AAV8 N590myc-CAGG-eGFP em combinação com anti-hASGR1-IgG4-Fc/moléculas de ligação anti-myc biespecíficas a uma razão de 1:12 de genoma viral para moléculas de proteína de ligação. Animais de controle foram injetados com partículas virais de AAV8 N590myc-CAGG-eGFP em combinação com uma molécula de ligação
133 / 138 anti-hCD3xanti-myc biespecífica irrelevante tendo um formato semelhante à anti-hASGR1-IgG4-Fc/molécula de ligação anti-myc biespecífica. Três semanas após a injeção, os camundongos foram sacrificados e submetidos à perfusão transcardíaca com PFA a 4%. Órgãos como fígados, rins e coração foram coletados e desidratados em sacarose a 15% seguido por sacarose a 30%. Em seguida, os órgãos foram criosseccionados em lâminas e corados com anticorpo anti-EGFP de frango (Jackson ImmunOresearch Labs, Inc. West Grove, PA) e anticorpo secundário anti-galinha conjugado Alexa 488 (Jackson ImmunOresearch Labs, Inc. West Grove, PA). Células positivas para GFP foram detectadas nos fígados daqueles animais injetados com AAV8- CAGG-eGFP do tipo selvagem (Figuras 13A-13C) ou partículas virais de AAV8 N590myc-CAGG-eGFP em combinação com as anti-hASGR1-IgG4- Fc/moléculas de ligação anti-myc biespecíficas (Figuras 13G-13I). A GFP não foi detectada ou pouco detectada em amostras de fígado de qualquer animal injetado com partículas virais AAV8 N590myc-CAGG-eGFP em combinação com a anti-hCD3 irrelevante/proteína de ligação myc (Figuras 13D-13F). Em resumo, o AAV8 marcado com epítopo, por exemplo, AAV8-N590myc, pode ser redirecionado para um tipo de célula específica usando uma molécula de ligação biespecífica que se liga especificamente ao epítopo e um marcador específico celular expresso pelo tipo de célula alvo. Redirecionamento de vetores virais para o intestino e/ou pâncreas
[00220] As células 293T geneticamente modificadas para expressar a difosfohidrolase de trifosfato ectonucleosídeo humano 3(hENTPD3) na superfície celular ("293T-ENTPD3") foram incubadas com misturas compreendendo diferentes razões de genomas virais AAV2-N587Myc- CAGG-eGFP ou AAV2-CAGG-GFP e moléculas de ligação biespecíficas formadas pela fusão de anti-myc scFv ao terminal C de uma cadeia de uma anticorpo IgG4 anti-hENTPD3 "knobs into holes" (anti-hENTPD3-IgG4- Fc/anti-myc) em diferentes razões (1:0, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:20, 1:50, 1:100 ou
134 / 138 1:200). Três dias após a infecção, a expressão de GFP foi analisada por FACS. Células 293T-ENTPD3 positivas para GFP foram detectadas após incubação com misturas de AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP e anti-hENTPD3- IgG4-Fc/anti-myc em níveis (1,48% a 16%; Figuras 14C-14J) comparáveis à células 293T-ENTPD3 incubadas com AAV2-CAGG-eGFP do tipo selvagem (66%) (Figura 14A). A incubação com AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP sozinho resulta em um nível muito baixo de expressão de GFP por células 293T-ENTPD3 (Figura 14B).
[00221] Determinou-se que ENTPD3 é expresso na mucosa do intestino (dados não mostrados). Para determinar se a anti-hENTPD3-IgG4- Fc/proteína de ligação anti-myc poderia redirecionar as partículas virais AAV2-N587myc-CAGG-eGFP para células intestinais que expressam ENTPD3 in vivo, camundongos C57BL/6 foram injetados intravascularmente com 5x1011 partículas virais (titulada por qPCR) de AAV2-N587myc-CAGG- eGFP em combinação com anti-hENTPD3-IgG4-Fc/proteínas de ligação anti- myc a uma razão de 1:20 de genoma viral para moléculas de proteína de ligação. Camundongos de controle foram injetados com PBS, AAV9 do tipo selvagem, ou com partículas virais de AAV2-N587myc-CAGG-eGFP em combinação com uma molécula de proteína de ligação irrelevante. Três semanas após a injeção, os camundongos foram sacrificados. Os fígados, intestinos e pâncreas foram fixados com formalina a 10% e enviados para a HistOwiz. Inc (Nova York, NY) para coloração por GFP. Células positivas para GFP foram detectadas em camundongos injetados com AAV9 do tipo selvagem(Figura 15B(ii)), mas não em fígados de camundongos injetados com partículas virais PBS ou AAV2-N587myc-CAGG-eGFP em combinação com moléculas de ligação irrelevantes ou anti-hENTPD3-IgG4-Fc/proteínas de ligação anti-myc (Figura 15A(iii)-15A(iv), respectivamente), indicando que os vetores virais AAV2-N587myc não infectam células hepáticas ENTPD3-negativas mesmo quando co-injetadas com proteínas de ligação a
135 / 138 hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc. A GFP foi detectada nos intestinos apenas de camundongos injetados com partículas virais AAV9 ou AAV2-N587myc- CAGG-eGFP do tipo selvagem em combinação com hENTPD3-IgG4- Fc/proteínas de ligação anti-myc (Figuras 15B(i)-15B(iv)). A GFP é detectada nas ilhotas pancreáticas de um camundongo injetado com partículas virais de AAV2-N587myc-CAGG-eGFP em combinação com anti- hENTPD3-IgG4-Fc/proteínas de ligação anti-myc. (Figura 15C(iv)). AAV9 WT infectou ambas as células de ilhota e células de não-ilhotas do pâncreas (Figura 15C(ii)). A GFP não foi detectado em amostras de pâncreas de camundongos injetados com solução salina ou partículas virais de AAV2-N587myc-CAGG-eGFP em combinação com proteínas de ligação irrelevantes. (Figuras 7C(i) e 7C(iii)). Em resumo, o tropismo natural de AAV pode ser de reduzido a anulado pela inserção de um epítopo heterólogo e redirecionado para as mesmas células, ou outras células, usando proteína de ligação multiespecífica que liga a tag de epítopo e um marcador expresso pelas células ou tecidos redirecionados.
[00222] Este exemplo demonstra que vários sorotipos diferentes de vetor de vírus adeno-associado podem ser geneticamente modificados com um epítopo heterólogo (por exemplo, c-myc) conforme descrito neste documento para inativar a infecciosidade e um anticorpo biespecífico (independentemente dos formatos biespecíficos) que reconhece o epítopo heterólogo (por exemplo, c-myc) e um marcador expresso por uma célula alvo pode ser usado para redirecionar o vetor viral para distribuir um nucleotídeo de interesse. Exemplo 4: Uso de vetores virais AAV-N587Myc Geneticamente Modificados para Distribuir Carga Terapêutica à Células Específicas
[00223] Este exemplo demonstra a capacidade de vetores virais AAV- N587Myc de distribuir especificamente carga terapêutica, tal como um ou mais genes suicida, um terapêutico biológico (por exemplo, anticorpo), um
136 / 138 sistema de edição de gene CRISPR/Cas, shRNA, etc., para um tipo de célula alvo. Especificamente, este exemplo descreve a distribuição de um gene suicida, sequência codificante de anticorpo, ou um sistema de edição de gene CRISPR/Cas para células que expressam um ligante direcionado. Distribuição de um gene suicida para células expressando um ligante direcionado
[00224] Para testar a capacidade de vetores virais scAAV2-N587Myc de distribuírem um gene suicida a uma célula específica é usado um modelo de camundongo nude de xenoenxerto de câncer de mama HER2+ conforme descrito por Wang et al. ((2010) Cancer Gene Therapy 17:559-570).
[00225] Vetores virais: vetores virais scAAV2-N587Myc ou ssAAV2- N587Myc, que carregam um gene repórter EGFP (scAAV2-N587Myc-EGFP ou ssAAV2-N587MycEGFP) são gerados conforme descrito no Exemplo 1. Os vetores scAAV2-N587Myc ou ssAAV2-N587Myc que carregam um gene suicida (SG) são gerados de forma semelhante. Brevemente, as células 293T17 são transfectadas com (1) Helper pAd e (2) pAAV RC2 (codificando um capsídeo do tipo selvagem) ou vetores pAAV RC2-N587Myc (codificando um capsídeo modificado com um epítopo c-myc) conforme descrito acima, e com (3) um vetor pAAV carregando um gene suicida, por exemplo, gene de citocina deaminase, gene de timidina quinase do vírus de herpes simplex, sob o controle de um promotor, por exemplo, CMV. Os vetores virais ssAAV-N587MycSG ou scAAV-N587SG são isolados e titulados conforme descrito no Exemplo 1.
[00226] Linhagens celulares: As linhagens celulares câncer de mama BT474, câncer de mama SK-BR-3 e de câncer de pulmão Calu-3 são linhagens celulares tumorais humanas positivas para HER2 (Bunn P.A. et al., (2001) Clin Cancer Res.7:3239–3250; Pegram M, et al. (1999) Oncogene 18:2241–2251; Spiridon CI, et al., (2002) Clin Cancer Res.8:1720–1730). O rabdomiossarcoma A-673 e o câncer cervical HeLa são linhagens celulares
137 / 138 tumorais humanas negativas para HER2 e BEAS-2b é uma linhagem celular negativa para HER2 epitelial bronquial imortalizado (Jia LT et al. (2003) Cancer Res. 63:3257–3262; Kern JA, et al., (1993) Am J Respir Cell Mol Biol 9:448–454; Martinez-Ramirez A, et al., (2003) Cancer Genet Cytogenet. 2003; 141:138–142). Todas essas linhagens celulares são obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e mantidas em meio recomendado pelo ATCC.
[00227] Camundongos: Camundongos nude fêmeas, de 6 a 8 semanas de idade são obtidos e alojados sob condições específicas livre de patógenos. No dia 0, os camundongos são simultaneamente (1) injetados por via subcutânea no flanco direito com 107 células tumorais BT474, SK-BR-3, Calu-3, A-673 ou HeLa e (2) tratadas por via intravenosa com anticorpo anti- myc-HER2 biespecífico e vetores virais ss- ou scAAV-N587Myc carregando um gene repórter (por exemplo, EGFP) ou suicida. Animais não tratados (animais injetados apenas com células tumorais), animais injetados com vetores virais ss- ou scAAV do tipo selvagem carregando um gene repórter ou suicida, animais injetados com anticorpo anti-myc-HER2 biespecífico apenas, ou animais injetados com vetores virais ss- ou scAAV-N587Myc carregando apenas um gene repórter ou suicida servem como controles. Todos os animais são tratados com um pró-fármaco apropriado 1 dia após a injeção e tratamento. O tamanho de cada tumor é medido usando paquímetros 2 vezes por semana, e o volume do tumor é calculado como comprimento×largura2×0,52. Após a morbidade, ulceração do tumor, um diâmetro do tumor de 15 mm ou volume do tumor de 1000 mm3, os camundongos são sacrificados e a data de sacrifício registrada como a data de morte. Os fígados, baços, rins e tumores de animais injetados com vetores virais de vírus ss- ou scAAV ou ss- ou scAAV-N587Myc do tipo selvagem carregando um gene repórter são fixados e a expressão de gene repórter verificada.
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[00228] Embora a distribuição direcionada de genes de indução ao suicídio tenha sido descrita (Zarogoulidis P., et al. (2013) J. Genet. Syndr. Gene Ther. 4:16849), este exemplo descreve a distribuição de um gene suicida a uma célula expressando o ligante HER2 direcionado usando os vetores virais descritos neste documento compreendendo um epítopo heterólogo, por exemplo, c-myc, e um anticorpo biespecífico que se liga especificamente ao ligante direcionado e ao epítopo heterólogo. Em experimentos adicionais, um gene suicida é distribuído a outro tipo celular expressando um ou mais ligantes alvo usando um vetor viral que compreende um epítopo heterólogo conforme descrito neste documento e um anticorpo biespecífico que se liga especificamente ao epítopo heterólogo (por exemplo, c-myc) e ao receptor alvo. Exemplos explicativos e não limitantes de receptores adequados para direcionamento incluem aqueles receptores que mediam endocitose do vetor viral, por exemplo, antígeno carcino-embrionário (CEA) (Qiu Y, et al. (2012) Cancer Lett. 316:31-38) e receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR) (Leng A, et al. (2013) Biol Tumor. 32:1103–1111; Liu T, et al. (2011) Exp Mol Pathol91:745–752). Receptores adicionais que podem ser direcionados incluem: receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (Heimberger AB, et al. (2009) Expert Opin Biol Ther. 9:1087-1098), agrupamento de diferenciação 44s (CD44s) (Heider KH, et al. (2004) Cancer Immunol Immunother. 53:567–579), agrupamento de diferenciação 133 (CD133 também conhecido como AC133) (Zhang SS, et al. (2012) BMC Med. 10:85), receptor de folato (FR) (Duarte S, et al., (2011) J Control Release 149(3):264-72), receptor de transferrina (TfR) ou aglomerado de diferenciação 71 (CD71) (Habashy HO, et al., Breast Cancer Res Treat. 119(2):283-93), mucinas (Torres MP, et al., (2012) Curr Pharm Des. 2012; 18(17):2472-81), antígeno embrionário de estágio específico 4 (SSEA-4) (Malecki M., et al., (2012) J Stem Cell Res Ther. 2(5)), antígeno de resistência tumoral 1-60 (TRA-1-60) (Malecki M., et al., (2013) J Stem Cell Res Ther.3:134).

Claims (83)

1 / 13 REIVINDICAÇÕES
1. Proteína de capsídeo viral recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende um epítopo que é heterólogo à proteína do capsídeo, em que o epítopo heterólogo ou porção do mesmo se liga especificamente a um parátopo do anticorpo, e em que a proteína do capsídeo viral forma o capsídeos viral recombinante com tropismo natural reduzido ou anulado.
2. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o epítopo tem pelo menos 1 aminoácido de comprimento.
3. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende uma substituição, inserção ou deleção em uma posição de aminoácido envolvida com o tropismo natural do capsídeo viral de modo que a proteína do capsídeo viral recombinante forma um capsídeo viral com tropismo natural de reduzido a anulado.
4. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo viral é derivada do gene do capsídeo do vírus adeno- associado (AAV), opcionalmente em que o epítopo heterólogo é inserido em uma posição selecionada do grupo constituído por I587 de AAV2, I585 de AAV6, I590 de AAV8, I453 de AAV9, I589 de AAV9, e qualquer aminoácido correspondente de um sorotipo de AAV que infecta primatas, opcionalmente em que o sorotipo AAV que infecta primatas é selecionado do grupo constituído por AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9.
5. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o vírus adeno-associado é AAV2.
2 / 13
6. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o vírus adeno-associado é AAV6.
7. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o vírus adeno-associado é AAV8.
8. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o vírus adeno-associado é AAV9.
9. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que (i) a proteína do capsídeo viral é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV2 geneticamente modificada e o epítopo é inserido após e/ou substitui um aminoácido na posição I453 ou I587; (ii) a proteína do capsídeo viral é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV6 geneticamente modificada e o epítopo é inserido após e/ou substitui um aminoácido na posição I585; (iii) o capsídeo viral é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV8 geneticamente modificada e o epítopo é inserido após e/ou substitui um aminoácido na posição I590. (iv) a proteína do capsídeo viral é uma proteína do capsídeo VP1 de AAV9 geneticamente modificada e o epítopo é inserido após e/ou substitui um aminoácido na posição I453 ou I589.
10. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo viral é codificada por um gene do capsídeo de AAV2 modificado para expressar o epítopo que é flanqueado entre os aminoácidos N587 e R588 da proteína capsídeo VP1 de AAV2.
11. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com
3 / 13 qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo viral é derivada de um gene do capsídeo de AAV6, e o epítopo é inserido imediatamente após o aminoácido Q585.
12. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo viral é derivada de um gene do capsídeo de AAV8, e em que o epítopo é inserido imediatamente após o aminoácido N590 da proteína do capsídeo VP1 de AAV8.
13. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo viral é derivada de um gene do capsídeo de AAV9, o epítopo é inserido na proteína do capsídeo após e/ou substitui o aminoácido na posição G453 ou A589 da proteína do capsídeo VP1 de AAV9, e em que a proteína do capsídeo compreende ainda uma mutação adicional.
14. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a mutação adicional é W503A.
15. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que o epítopo compreende a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL, cuja sequência de aminoácidos ou uma porção da mesma se liga especificamente ao parátopo do anticorpo, e opcionalmente.
16. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o epítopo compreende a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL, cuja sequência de aminoácidos ou uma porção da mesma se liga especificamente ao parátopo do anticorpo, e em que a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL é flanqueada por e operacionalmente ligada a pelo menos 5 aminoácidos
4 / 13 contíguos de uma proteína do capsídeo de AAV.
17. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo viral compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:2, uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:4, uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:25, uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:26, ou uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:27.
18. Proteína do capsídeo viral recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo viral recombinante ou um capsídeo viral que compreende a proteína do capsídeo viral recombinante é incapaz de infectar uma célula alvo na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica compreendendo o parátopo do anticorpo, opcionalmente em que na ausência de uma molécula de ligação multiespecífica que compreende o parátopo do anticorpo, a eficiência de transdução da proteína do capsídeo viral ou um capsídeo viral que compreende a proteína do capsídeo viral recombinante é: reduzida em pelo menos 10%, reduzida em pelo menos 20%, reduzida em pelo menos 30%, reduzida em pelo menos 40%, reduzida em pelo menos 50%, reduzida em pelo menos 60%, reduzida em pelo menos 70%, reduzida em pelo menos 80%, reduzida em pelo menos 90%, ou anulada.
19. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica que codifica a proteína do capsídeo
5 / 13 viral recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
20. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica codifica a proteína do capsídeo viral recombinante que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:2, uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:4, uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:25, uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:26, ou uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:27.
21. Vetor viral recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende um nucleotídeo de interesse encapsulado pelo capsídeo viral recombinante de acordo com a reivindicação 20, opcionalmente em que o capsídeo viral recombinante é um capsídeo do mosaico.
22. Vetor viral recombinante de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo de interesse está sob o controle de um promotor selecionado do grupo constituído por um promotor viral, um promotor bacteriano, um promotor de mamífero, um promotor de aves, um promotor de peixe, um promotor de inseto e qualquer combinação destes.
23. Vetor viral recombinante de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo de interesse está sob o controle de um promotor não humano.
24. Vetor viral recombinante de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo de interesse é flanqueado por sequências ITR de AAV.
25. Vetor viral recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo de interesse é um gene repórter.
26. Vetor viral recombinante de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o gene repórter codifica a proteína verde
6 / 13 fluorescente.
27. Vetor viral recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo de interesse é selecionado do grupo consistindo em um gene suicida, um nucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento do mesmo, um nucleotídeo que codifica um sistema de CRISPR/Cas ou uma porção(s) do mesmo, um nucleotídeo que codifica RNA antisense, um nucleotídeo que codifica siRNA e uma combinação destes.
28. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende (a) o vetor viral recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 27, e (b) uma molécula de ligação multiespecífica que compreende um parátopo do anticorpo que se liga especificamente ao epítopo, opcionalmente em que a molécula de ligação multiespecífica compreende ainda um ligante de redirecionamento que se liga especificamente a um receptor expresso em uma célula alvo, em que a molécula de ligação multiespecífica é opcionalmente uma molécula de ligação biespecífica.
29. Composição de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o vetor viral e a molécula de ligação multiespecífica estão presentes em uma razão de 1:4.
30. Composição de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizada pelo fato de que o parátopo do anticorpo é um domínio Fv.
31. Composição de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o domínio Fv é diretamente fundido a um domínio constante de cadeia pesada.
32. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizada pelo fato de que o ligante de redirecionamento é um anticorpo, ou uma porção do mesmo.
33. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 32, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação
7 / 13 multiespecífica é um anticorpo biespecífico, e em que o parátopo e o ligante de redirecionamento compreendem, cada um, um domínio Fv distinto fundido a um primeiro e segundo domínio constante de cadeia pesada.
34. Composição de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a primeira e a segunda cadeias pesadas se ligam à Proteína A com afinidades de ligação diferenciais.
35. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 32, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação multiespecífica é um anticorpo biespecífico, e em que o ligante de redirecionamento compreende uma estrutura de anticorpo tetramérica que compreende duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas de imunoglobulina, e em que o parátopo que se liga ao epítopo heterólogo é anexado ao terminal C ou terminal N de uma ou de ambas as cadeias pesadas e/ou ao terminal C ou terminal N de uma ou de ambas as cadeias pesadas.
36. Composição de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o parátopo é um scFv, opcionalmente em que o scFv compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:37.
37. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, caracterizada pelo fato de que o epítopo heterólogo compreende uma sequência de aminoácidos EQKLISEEDL ou uma porção da mesma, e em que o parátopo do anticorpo se liga especificamente à sequência de aminoácidos EQKLISEEDL ou a uma porção da mesma.
38. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 37, caracterizada pelo fato de que o ligante de redirecionamento que se liga especificamente a uma proteína de superfície celular é um marcador de superfície celular.
8 / 13
39. Composição de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o marcador de superfície celular é asialoglicoproteína 1 (ASGR1).
40. Composição de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o marcador de superfície celular é CD3.
41. Composição de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o marcador de superfície celular é ENTPD3.
42. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 41, caracterizada ainda pelo fato de que compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
43. Método de direcionamento do vetor viral recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 27, a uma célula alvo, caracterizado pelo fato de que compreende contato do vetor viral recombinante com uma molécula de ligação multiespecífica, em que a molécula de ligação multiespecífica compreende (i) um parátopo do anticorpo que se liga especificamente ao epítopo e (ii) um ligante de redirecionamento que se liga especificamente a uma proteína expressa na superfície da célula alvo.
44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a célula alvo está in vivo.
45. Método de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que o referido contato é realizado ex vivo.
46. Método de distribuição de um nucleotídeo de interesse a uma célula alvo que expressa uma proteína de superfície celular, caracterizado pelo fato de que compreende pôr em contato a célula alvo com a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 28 a 42, em que a molécula de ligação multiespecífica compreende um ligante de redirecionamento que se liga à proteína de superfície celular.
9 / 13
47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a célula alvo está in vitro.
48. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a célula alvo está in vivo em um sujeito.
49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um humano.
50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 49, caracterizado pelo fato de que a célula alvo é uma célula humana.
51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 50, caracterizado pelo fato de que a célula alvo é selecionada do grupo consistindo em uma célula hepática, uma célula cerebral, uma célula T, uma célula do rim, uma célula intestinal, uma célula do pâncreas, uma célula cancerosa e uma célula infectada com patógeno heterólogo.
52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 51, caracterizado pelo fato de que a célula alvo é uma célula hepática humana.
53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 52, caracterizado pelo fato de que a proteína de superfície celular é o receptor da asialoglicoproteína humana 1 (hASGR1).
54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 51, caracterizado pelo fato de que a célula alvo é uma célula T humana.
55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a proteína da superfície celular é CD3.
56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 51, caracterizado pelo fato de que a proteína da superfície celular é o receptor de glucagon humano (hGCGR).
57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 50, caracterizado pelo fato de que a célula alvo é uma célula intestinal.
58. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações
10 / 13 46 a 50, caracterizado pelo fato de que a célula alvo é uma célula pancreática.
59. Método de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizado pelo fato de que a proteína da superfície celular é ENTPD3.
60. Método de inativação de uma proteína do capsídeo viral, caracterizado pelo fato de que compreende (a) inserir um ácido nucleico que codifica um epítopo heterólogo em uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do capsídeo viral para formar uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína do capsídeo geneticamente modificada que compreende o epítopo heterólogo, e (b) cultivar uma célula empacotadora em condições suficientes para a produção de vetores virais, em que a célula empacotadora compreende a sequência de nucleotídeos.
61. Método de produção de um vetor viral, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula empacotadora em condições suficientes para a produção de vetores virais, em que a célula empacotadora compreende um plasmídeo que codifica uma proteína do capsídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18.
62. Método de acordo com a reivindicação 60 ou61, caracterizado pelo fato de que a célula empacotadora compreende ainda um plasmídeo auxiliar e/ou um plasmídeo de transferência compreendendo um nucleotídeo de interesse.
63. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 62, caracterizado pelo fato de que compreende ainda isolar vetores de vírus adeno-associados autocomplementares do sobrenadante da cultura.
64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 63, caracterizado pelo fato de que compreende ainda lisar a célula empacotadora e isolar vetores de vírus adeno-associados de fita única do lisado celular.
11 / 13
65. Método de acordo com a reivindicação 60 a 64, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a. remoção de debris celulares, b. tratar o sobrenadante contendo vetores virais com DNase I e MgCl2, c. concentrar vetores virais, d. purificar os vetores virais, e e. qualquer combinação de a.-d.
66. Vetor viral caracterizado pelo fato de que é produzido conforme o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 60-65.
67. Célula empacotadora para produzir um vetor viral, caracterizada pelo fato de que compreende um plasmídeo codificante da proteína do capsídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a
18.
68. Molécula de ligação, caracterizada pelo fato de que compreende um parátopo que se liga a SEQ ID NO:6, em que o parátopo compreende sequências de HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e/ou LCDR3 do scFv codificado pela sequência de ácido nucleico estabelecida como SEQ ID NO:28.
69. Molécula de ligação de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que o parátopo do anticorpo é um domínio Fv.
70. Molécula de ligação de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que o domínio Fv é diretamente fundido a um domínio constante de cadeia pesada.
71. Molécula de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 70, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação é um anticorpo biespecífico e compreende ainda um ligante de redirecionamento, e em que o parátopo e o ligante de redirecionamento
12 / 13 compreendem, cada um, um domínio Fv distinto fundido a um primeiro e segundo domínio constante de cadeia pesada.
72. Proteína de ligação como definida na reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que a primeira e a segunda cadeias pesadas se ligam à Proteína A com afinidades de ligação diferenciais.
73. Proteína de ligação de acordo com a reivindicação 68 ou 69, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação é um anticorpo biespecífico e compreende ainda um ligante de redirecionamento, e em que o ligante de redirecionamento compreende uma estrutura de anticorpo tetramérica que compreende duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas de imunoglobulina, e em que o parátopo é anexado ao terminal C ou terminal N de uma ou ambas as cadeias pesadas e/ou ao terminal C ou terminal N de uma ou ambas as cadeias pesadas.
74. Proteína de ligação de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que o parátopo é um scFv, opcionalmente em que o scFv compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:37.
75. Proteína de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 72, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ligante de redirecionamento que é um anticorpo, ou uma porção do mesmo.
76. Proteína de ligação de acordo com a reivindicação 75, caracterizada pelo fato de que o ligante de redirecionamento que se liga especificamente a uma proteína de superfície celular é um marcador de superfície celular.
77. Proteína de ligação de acordo com a reivindicação 76, caracterizada pelo fato de que o marcador de superfície celular é asialoglicoproteína 1 (ASGR1).
78. Proteína de ligação de acordo com a reivindicação 76,
13 / 13 caracterizada pelo fato de que o marcador de superfície celular é CD3.
79. Proteína de ligação de acordo com a reivindicação 76, caracterizada pelo fato de que o marcador de superfície celular é GCGR.
80. Proteína de ligação de acordo com a reivindicação 76, caracterizada pelo fato de que o marcador de superfície celular é ENTPD3.
81. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende (a) o vetor viral recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 27, e (b) a proteína de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações 68 a 81.
82. Composição de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que o vetor viral e a molécula de ligação multiespecífica estão presentes em uma razão de 1:4.
83. Composição de acordo com a reivindicação 81 ou 82, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
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