JP7372154B2 - 遺伝物質をヒト細胞に標的化して導入するための指向性改変組換えウイルスベクターおよびその使用 - Google Patents

遺伝物質をヒト細胞に標的化して導入するための指向性改変組換えウイルスベクターおよびその使用 Download PDF

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Description

配列表の参照
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ファイル１０３３５ＷＯ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔに記述されている配列表は、８８キロバイトであり、２０１８年６月２７日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書の開示は、概して、遺伝物質を細胞および／または組織に標的化して導入するために有用な、指向性改変組換えウイルスベクターおよびそれを含む組成物に関する。
特定の標的細胞への遺伝子の送達は、多様な慢性疾患および遺伝疾患の診断および遺伝子療法のための現代医学における最も重要な技術のうちの１つとなっている。現在のところ、理想的な遺伝子送達媒体を欠くために、遺伝子療法の臨床適用における進展が制限されている。治療的な成功を達成するためには、遺伝子送達媒体は、非標的細胞への形質導入を回避しながら、標的細胞への形質導入が可能でなければならない。具体的には、ウイルスの天然指向性が火急の治療的ニーズを満たしていないときに、天然指向性が削除または軽減され、所望の指向性が首尾よく作製されている組換えウイルスベクターが必要である。（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，）
近年では、ベクター開発の大部分の進展は、レトロウイルス、レンチウイルス、および単純ヘルペスウイルスなどのエンベロープウイルス（例えば、キャプシドが脂質二重層によって囲まれているウイルス）のみならず、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびアデノウイルス（Ａｄ）などのネイキッドウイルス（例えば、エンベロープ（例えば、脂質二重層）を有さないウイルスキャプシドタンパク質によって形成されるキャプシドを含むウイルス）を使用して達成されている。ＡＡＶは、穏やかな免疫原性でしかないが、明白な毒性なしに広範囲の種および組織を生体内に形質導入することが可能な非エンベロープウイルスであるため、ＡＡＶ系ベクターは多くの研究の焦点となっている。
ＡＡＶは、小さな非エンベロープ性の一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶゲノムは、４．７ｋｂであり、それぞれ、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）、およびＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレームを特徴とする。２つのＩＴＲは、ＡＡＶ複製、パッケージング、および統合に必要不可欠な唯一のシスエレメントである。Ｒｅｐリーディングフレームは、分子量７８ｋＤ、６８ｋＤ、５２ｋＤ、および４０ｋＤの４つのタンパク質をコードする。これらのタンパク質は、主にＡＡＶ複製を調節し、宿主細胞の染色体へのＡＡＶの統合で機能する。Ｃａｐリーディングフレームは、８３～８５ｋＤ（ＶＰ１）、７２～７３ｋＤ（ＶＰ２）、および６１～６２ｋＤ（ＶＰ３）の分子量を有する３つの構造（キャプシド）ウイルスタンパク質（ＶＰ）をコードする。ＡＡＶビリオンにおける総タンパク質のうちの８０％以上は、ＶＰ３で構成され、成熟ビリオンにおいて、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、およそ１：１：１０の相対的存在量で見出されている。生体外で、３つのタンパク質は、ビリオン様構造、例えばウイルスキャプシドへと自然発生的に集合する。したがって、感染細胞におけるウイルスキャプシド形成は、ウイルスＤＮＡ合成とは無関係に進行するように思われる（Ｋｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：７９３によって検証されている）。
すべての既知のＡＡＶセロタイプの中でも特に、ＡＡＶ２は、その感染クローンが最初に作製されたため、おそらく最も良好に特徴付けられたセロタイプである。（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：２０７７－２０８１）。その後、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４およびＡＡＶ６の全配列も決定されている。（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９－３１９、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３－６８３３、Ｓ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．２２１：２０８－２１７）。概して、すべてのＡＡＶは、ヌクレオチド配列において８０％を超える同一性を共有している。
ＡＡＶは、他のウイルスベクターとは異なり、ＡＡＶが任意の既知のヒト疾患と関連することが示されておらず、概して病原性とはみなされていないため、ヒト遺伝子療法のための有望なベクターである。（Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１５８：９７－１２９）。さらに、ＡＡＶは、有糸分裂後の組織を比較的低い免疫原性で安全に形質導入し、部位特異的な様式で宿主染色体に、およびＲｅｐタンパク質がトランスで供給された場合に、染色体１９で組織培養細胞に、統合することが可能である。（Ｋｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２１１－２２１５、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０（１２）：３９４１－３９５０、Ｂａｌａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３２９９－３３０６、Ｓｕｒｏｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７９５１－７９５９）。ＡＡＶの統合ゲノムは、筋肉、肝臓、および脳を含む多数の組織における長期遺伝子発現を可能にすることが示されている（Ｆｉｓｈｅｒ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３（３）：３０６－３１２、Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１６：２７０－２７６、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ１４４：１１３－１２４、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１１）：８０９８－８１０８）。
ＡＡＶを含む多数のウイルスは、最終的に感染細胞によるウイルスのエンドサイトーシスをもたらす、ウイルス／リガンド：細胞／受容体の相互作用を介して細胞に感染する。このリガンド：受容体相互作用は、ウイルスベクター研究の大部分の焦点であり、例えば、標的細胞によって発現された受容体を介した、例えば野生型ウイルスによる標的細胞への感染に対して天然に許容状態である細胞から、ウイルスの天然指向性を再配向させるように操作することができる。
大部分の細胞表面受容体またはマーカーが、恒常的である（例えば、再生使用のため）か、またはリガンドに誘導される（例えば、受容体に媒介される）かのいずれかでエンドサイトーシスの経路に関与するため、理論上、任意の細胞表面タンパク質またはマーカーに向かうベクターの再標的化は、標的細胞による感染をもたらすはずである。これら受容体は、クラスリン被覆ピット中で塊状になり、クラスリン被覆小胞を介して細胞に進入し、受容体が分類される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面に再生使用されるか、細胞内で貯蔵されるか、またはリソソーム中で分解されるかのいずれかである。このように、ウイルスベクターを再標的化するためのプラットフォームは、多くの場合、ウイルスベクターの天然指向性を削除し、標的細胞単独でまたは主に標的細胞によって発現される受容体またはマーカーにウイルスベクターを再配向さあせることを目的としている。ウイルスベクターを使用した標的化遺伝子療法の進歩のうちの多くは、ウイルスベクターの天然指向性のシュードタイピング、拡張、および／または再標的化がもたらされる、ウイルスベクターの非組換え（非遺伝子）または組換え（遺伝子）改変として要約することができる。（Ｎｉｃｋｌｉｎ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２７３－９３、Ｖｅｒｈｅｉｊｉ ａｎｄ Ｒｏｔｔｉｅｒ（２０１２）Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｖｉｒｏｌ２０１２：１－１５において検証されている）。
非遺伝的手法は、典型的には、野生型（非改変型）ウイルス表面タンパク質および標的細胞の両方を認識するアダプターを利用する。可溶性疑似受容体（野生型ウイルス）、ポリエチレングリコールなどのポリマー、および抗体またはその一部分が、アダプターのウイルス結合ドメインとして使用されてきたが、天然ペプチドまたはビタミンリガンド、ならびに抗体およびその一部分は、上述のアダプターの細胞結合ドメインに使用されてきた。この手法では、標的細胞へのウイルスベクターの再標的化は、ベクター：アダプター複合体が、標的細胞の表面上に発現されたタンパク質（例えば、細胞表面タンパク質）に結合すると達成することができる。
かかる手法は、ＡＡＶ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７７－２７８５）、アデノウイルス（Ｈｅｍｍｉｎｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：６３７７－８１、ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１０：１９８２－１９９１、Ｅｉｎｆｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１２８４－９１、Ｇｌａｓｇｏｗ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬＯＳ Ｏｎｅ４：ｅ８３５５）、ヘルペスウイルス（Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：６１７－２４）、およびパラミキソウイルス（Ｂｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：２９５－３０３、Ｂｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２９：１３５９－６９）、コロナウイルス（Ｈａｉｊｅｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４５２８－４３］８、Ｗｕｒｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１２：１３９４－１４０４）に使用されている。
より一般的な手法は、ウイルスキャプシドタンパク質、したがってウイルスキャプシドの表面の組換え遺伝子改変である。間接的な組換え手法では、ウイルスキャプシドは、その後アダプターに連結される異種「足場」を用いて改変される。アダプターは、足場および標的細胞に結合する。（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：１２５－１３２、Ｐｏｎｎａｚｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１２９００－９０７、ＷＯ９７／０５２６６も参照されたい）。（１）抗体アダプターのＦｃに結合するＦｃ結合分子（例えば、Ｆｃ受容体、プロテインＡなど）、（２）ビオチン標識化アダプターに結合する（ストレプト）アビジン、（３）（ストレプト）アビジンに融合するアダプターに結合するビオチン、および（４）Ｓｐｙ標識化アダプターに結合するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒなどの等長ペプチド結合を形成するタンパク質：タンパク質結合対、などの足場が、Ａｄに組み込まれている（Ｐｅｒｅｂｏｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１４：６２７－６３７、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ３６６：７６９－７７４、Ｈｅｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１３：１４２７－１４３９、Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ２１：４９８５－４９８８）、ＡＡＶ（Ｇｉｇｏｕｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ１１：８５６－８６５、Ｓｔａｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ１６：１４６７－１４７３）、およびトガウイルス（Ｑｕｅｔｇｌａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１５３：１７９－１９６、Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５：７６３－７６７、Ｋｌｉｍｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３３８：９－２１）。
直接的な組換え標的化手法では、標的化リガンドは、ウイルスキャプシドに直接挿入されるか、またはウイルスキャプシドに連結されて、すなわち、タンパク質ウイルスキャプシドが改変されて異種標的リガンドを発現する。次いで、リガンドは、標的細胞上で優先的にまたは標的細胞上でのみ発現される受容体またはマーカーを再配向、例えば結合する。（Ｓｔａｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：９２６－９３１、Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１０９：５１３－５１９．）。直接的な組換え手法は、ＡＡＶ（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ１３：２６５３－５９、Ｇｉｒｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ５：１０５２－５６、Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ３：９６４－７５、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１２：１６９７－１７１１、Ｓｈｉ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ７：５１５－５２５）、レトロウイルス（Ｄａｌｂａ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ５：６５５－６６７、Ｔａｉ ａｎｄ Ｋａｓａｈａｒａ（２００８）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ１３：３０８３－３０９５、Ｒｕｓｓｅｌｌ ａｎｄ Ｃｏｓｓｅｔ（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１：３００－３１１、Ｅｒｌｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３０２：３３３－３４１、Ｃｈａｄｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２８５：４８５－４９４、Ｐｉｚｚａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ８：１０８８－１０９６）、ポックスウイルス（Ｇｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ１１：５９５－６０８、Ｇａｌｍｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７８：３０１９－３０２７、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２０：６６４－６７１）、パラミキソウイルス（Ｎａｋａｍｕｒａ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ４：１６８５－１６９２、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５：２０８７－２０９６、Ｇａｌａｎｉｓ（２０１０）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ８８：６２０－６２５、Ｂｌｅｃｈａｃｚ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ８：１６２－１７５、Ｒｕｓｓｅｌｌ ａｎｄ Ｐｅｎｇ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３３０：２１３－２４１）、およびヘルペスウイルス（Ｓｈａｈ ａｎｄ Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ６：３６１－３７０、Ｃａｍｐａｄｅｌｌｉ－Ｆｉｕｍｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２１：２１３－２２６）で使用されている。
３つの手法の各々は、利点および欠点を有する。直接的な組換え手法の主な利点は、ウイルスベクターの特異性がウイルスゲノムに固有であり、複製の際に特異性が維持されることである。しかしながら、この組換え手法および間接的な組換え手法では、ウイルスを遺伝子改変する能力は、キャプシド構造の維持、および標的化リガンドまたは足場を許容し適切に提示するであろう位置に標的化リガンドまたは足場が置かれることを必要とし、したがって使用することができる適切なリガンドまたは足場のレパートリーが制限される。このように、組換え再標的化方法は、抗体またはその一部分などの他の結合リガンドの組み込みにつながる、標的化リガンドとして有用な天然に存在する分子によって制限される。非組換えおよび組換えアダプタープラットフォームの両方は、使用されるアダプターの柔軟性において有利である。しかしながら、これらの２つの構成要素系では、最適な形質導入効率の達成は困難である。
異種エピトープをウイルスキャプシドに挿入することによる、従来の組換え再標的化方策に固有の問題を解決するウイルス再標的化方策が、本明細書で提供される。本組換えウイルスキャプシドは、特にウイルスベクター：多重特異性結合分子のある特定の比率以内で、異種エピトープに特異的結合するＦｖなどの抗体パラトープと標的細胞に特異的に結合する再標的化リガンドとを含む多重特異性、任意選択的に二重特異性の結合分子と組み合わせられると、復元および再配向される天然指向性の減少または無効化を呈する。
国際公開第９７／０５２６６号
Ｋｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：７９３ Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：２０７７－２０８１ Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９－３１９ Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３－６８３３ Ｓ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．２２１：２０８－２１７
本明細書で開示されるのは、組換えウイルスキャプシドタンパク質であって、ウイルスキャプシドが、組換えウイルスキャプシドタンパク質と、組換えウイルスキャプシドによって封入されている対象ヌクレオチドを含むウイルスベクターと、を含み、当該キャプシドタンパク質、キャプシド、およびウイルスベクターが、異種エピトープを含む（提示する）ように遺伝子改変されており、異種エピトープ（その一部分またはウイルスキャプシドタンパク質と組み合わせられている）が、抗体パラトープと結合対を形成し、組換えウイルスキャプシドタンパク質または組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドが、低減または無効化された（天然）指向性を有するように、組換えウイルスキャプシドタンパク質／キャプシド／ベクターが、受容体結合に関与するアミノ酸位置での、例えばウイルスキャプシドタンパク質／キャプシド／ベクターの（天然）指向性の変異、挿入、または欠失をさらに含み得る（例えば、多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、異種エピトープを欠く標準ウイルスキャプシドタンパク質／キャプシド／ベクターの形質導入効率よりも低い形質導入効率、または多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で検出不能な形質導入効率を有する）、組換えウイルスキャプシドタンパク質である。かかる組換えウイルスキャプシドタンパク質／キャプシド／ベクターの減少または無効化された（天然）指向性は、適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合部分の存在下で、向上または復元することができる。したがって、ウイルスベクター：多重特異性結合分子のある特定の比率を含む組成物を含む、（１）本明細書に記載の組換えキャプシドタンパク質を含むキャプシドを有する組換えウイルスベクターと、（２）抗体パラトープおよび標的化リガンドを含む多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子と、を含む組成物についても記載されており、標的細胞に遺伝物質を配向および／または導入するためのその使用についても本明細書に記載している。また、例えば、標的細胞に標的化して対象ヌクレオチドを送達するために、組換えウイルスベクターを再標的化する方法であって、多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子に組換えウイルスベクターを接触させることを含む方法についても記載されており、組換えウイルスベクターを作製する方法についても記載されている。
本明細書に記載されるのは、エピトープを含む組換えウイルスキャプシドタンパク質であって、エピトープが、キャプシドタンパク質とは異種であり、エピトープまたはその一部分が、抗体パラトープに特異的に結合し、組換えウイルスキャプシドタンパク質、または組換えウイルスキャプシドを含むウイルスキャプシドが、例えば多重特異性、任意選択的に二重特異性結合部分の非存在下で減少または無効化された天然指向性を有する、組換えウイルスキャプシドタンパク質である。
いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入および／または提示が、異種エピトープを欠く標準ウイルスキャプシドと比較して、ウイルスキャプシドの（天然）指向性を減少または無効化する、例えば、ウイルスキャプシドが、アミノ酸位置でのエピトープの挿入、および／またはアミノ酸位置でアミノ酸のエピトープへの置換を含む変異を含むように、異種エピトープは、組換えウイルスキャプシドタンパク質に挿入（提示）され、変異によって、例えば、多重特異性、任意選択的に二重特異性結合部分の非存在下で、キャプシドタンパク質の（天然）指向性が減少または無効化される。いくつかの実施形態では、挿入および／または提示が、例えば多重特異性、任意選択的に二重特異性結合部分の非存在下で、異種エピトープを欠く標準ウイルスキャプシドと比較して、組換えウイルスキャプシドの（天然）指向性を部分的に減少させるように、異種エピトープがウイルスキャプシドタンパク質に挿入（提示）され、ウイルスキャプシドは、例えば変異を欠く標準ウイルスキャプシドと比較して、多重特異性、任意選択的に二重特異性結合部分の非存在下で、組換えウイルスキャプシドまたはそれを含む組換えウイルスベクターの（天然）指向性をさらに減少および／または無効化するさらなる変異（例えば異種エピトープの挿入以外の置換、欠失、挿入）をさらに含む。
概して、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、キャプシド遺伝子に由来し得、例えばエピトープを発現するように改変されたキャプシド遺伝子によってコードされ、かつ／または遺伝子改変された、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどの、概してヒト細胞に感染する非エンベロープウイルス、または概してヒト細胞に感染する非エンベロープウイルスのセロタイプである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶキャプシド遺伝子に由来し、例えば、エピトープを発現するように改変されたキャプシド遺伝子によってコードされ、かつ／または霊長類に感染する遺伝子改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質のＡＡＶセロタイプであり、任意選択的に、ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ２キャプシドタンパク質、遺伝子改変ＡＡＶ６キャプシドタンパク質、遺伝子改変ＡＡＶ８キャプシドタンパク質、または遺伝子改変ＡＡＶ９キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来し、例えば、エピトープを発現するように改変されたＡＡＶ２キャプシド遺伝子によってコードされ、かつ／または野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１としてそれぞれ表される、遺伝子改変ＡＡＶ２ ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ６キャプシド遺伝子に由来し、例えば、エピトープを発現するように改変されたＡＡＶ６キャプシド遺伝子によってコードされ、かつ／または野生型ＡＡＶ６ ＶＰ１のアミノ酸配列が配列番号３として表される、遺伝子改変ＡＡＶ６ ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ８キャプシド遺伝子に由来し、例えば、エピトープを発現するように改変されたＡＡＶ８キャプシド遺伝子によってコードされ、かつ／または野生型ＡＡＶ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２１としてそれぞれ表される、遺伝子改変ＡＡＶ８ ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、例えば、エピトープを発現するように改変されたＡＡＶ９キャプシド遺伝子によってコードされ、かつ／またはＡＡＶ９ ＶＰ１の野生型アミノ酸配列が配列番号５としてそれぞれ表される、遺伝子改変ＡＡＶ９ ＶＰ１、ＶＰ２もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来し、例えば、エピトープを発現するように改変されたＡＡＶ２キャプシド遺伝子によってコードされ、かつ／またはＡＡＶ２の遺伝子改変ＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ６キャプシド遺伝子に由来し、例えば、エピトープを発現するように改変されたＡＡＶ６キャプシド遺伝子によってコードされ、かつ／またはＡＡＶ６の遺伝子改変ＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ８キャプシド遺伝子に由来し、例えば、エピトープを発現するように改変されたＡＡＶ８キャプシド遺伝子によってコードされ、かつ／またはＡＡＶ８の遺伝子改変ＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、例えば、エピトープを発現するように改変されたＡＡＶ９キャプシド遺伝子によってコードされ、かつ／またはＡＡＶ９の遺伝子改変ＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質である。
いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、エピトープを発現するように改変されたキメラＡＡＶキャプシド遺伝子に由来する、例えば改変されたキメラＡＡＶキャプシド遺伝子によってコードされ、キメラＡＡＶキャプシド遺伝子が、複数の核酸配列を含み、複数の核酸配列の各々が、異なるＡＡＶセロタイプのキャプシドタンパク質の一部分をコードし、複数の核酸配列が、一緒になってキメラＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、キメラＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、キメラＡＡＶ６キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドタンパク質は、キメラＡＡＶ８キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、キメラＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来する。
概して、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、標準キャプシドを含む、異種エピトープまたはキャプシドを欠く標準キャプシドと比較して、異種エピトープ自体がそれぞれ、組換えキャプシドタンパク質またはそれを含むキャプシドの天然指向性を減少および／または無効化するように、組換えキャプシドタンパク質に挿入され、かつ／または組換えキャプシドタンパク質によって提示されている異種エピトープを含む。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、野生型標準キャプシドタンパク質の天然指向性に関与するキャプシドタンパク質の領域、例えば、細胞標的化に関与するキャプシドタンパク質の領域に、挿入（提示）されている。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、Ａｄファイバータンパク質のノブドメインに挿入され、かつ／またはノブドメインによって提示されている。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、Ａｄファイバータンパク質のＨＩループに挿入され、かつ／またはＨＩループによって提示されている。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶキャプシドタンパク質のヘパリン結合部位に挿入され、かつ／またはヘパリン結合部位によって提示されている。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のヘパリン結合部位に挿入され、かつ／またはヘパリン結合部位によって提示されている。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ６キャプシドタンパク質のヘパリン結合部位に挿入され、かつ／またはヘパリン結合部位によって提示されている。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質のヘパリン結合部位に挿入され、かつ／またはヘパリン結合部位によって提示されている。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のヘパリン結合部位に挿入され、かつ／またはヘパリン結合部位によって提示されている。いくつかの実施形態では、（ｉ）ウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来し、エピトープは、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質の位置Ｉ４５３またはＩ５８７のアミノ酸、ならびに／またはＡＡＶ２ ＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸の後に挿入され、かつ／またはそのアミノ酸を置き換え、（ｉｉ）ウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ６キャプシド遺伝子に由来し、エピトープは、ＡＡＶ６ ＶＰ１キャプシドタンパク質の位置Ｉ５８５のアミノ酸、ならびに／またはＡＡＶ６ ＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸の後に挿入され、かつ／またはそのアミノ酸を置き換え、（ｉｉｉ）ウイルスキャプシドは、ＡＡＶ８キャプシド遺伝子に由来し、エピトープは、ＡＡＶ８ ＶＰ１キャプシドタンパク質の位置Ｉ５９０のアミノ酸、ならびに／またはＡＡＶ８ ＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸の後に挿入され、かつ／またはそのアミノ酸を置き換え、あるいは（ｉｖ）ウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、エピトープは、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質の位置Ｉ４５３またはＩ５８９のアミノ酸、ならびに／またはＡＡＶ９ ＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸の後に挿入され、かつ／またはそのアミノ酸を置き換える。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１のＧ４５３（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置の、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１のＮ５８７（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置の、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）、ＡＡＶ６キャプシドタンパク質ＶＰ１のＱ５８５（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置の、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質ＶＰ１のＮ５９０（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置の、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１のＧ４５３（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置の、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ８のＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）、またはＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１のＡ５８９（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置の、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ８のＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）からなる群から選択されるアミノ酸の直後に挿入されている（例えばＣ末端に融合されている）。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１のＧ４５３（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置の、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）の直後に挿入されている（例えばＣ末端に融合されている）。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１のＮ５８７（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置の、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）の直後に挿入されている（例えばＣ末端に融合されている）。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ６キャプシドタンパク質ＶＰ１のＱ５８５（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置の、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）の直後に挿入されている（例えばＣ末端に融合されている）。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質ＶＰ１のＮ５９０（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置の、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）の直後に挿入されている（例えばＣ末端に融合されている）。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１のＧ４５３（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置の、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ８のＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）の直後に挿入されている（例えばＣ末端に融合されている）。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１のＡ５８９（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置の、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ８のＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）の直後に挿入されている（例えばＣ末端に融合されている）。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質の（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドの対応する位置の）アミノ酸Ｎ５８７とＲ５８８との間に挿入され、かつ／またはＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質によって提示される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号４として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２５として表される核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２６として表される核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２７として表される核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えキャプシドタンパク質は、異種エピトープに加えて、第２の異なる変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、遺伝子改変ＡＡＶ２キャプシドタンパク質であり得、異種エピトープを含み、変異、例えば、Ｒ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａ変異をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、ＡＡＶ２ ＶＰ１タンパク質のＧ４５３の直後に挿入されている（例えば、Ｇ４５３のＣ末端に融合されている）異種エピトープを含み、Ｒ５８５Ａおよび／またはＲ５８８９Ａからなる群から選択される変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、ＡＡＶ２ ＶＰ１タンパク質のＮ５８７の直後に挿入されている（例えば、Ｎ５８７のＣ末端に融合されている）異種エピトープを含み、Ｒ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａからなる群から選択される変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、ＡＡＶ９ ＶＰ１タンパク質のＧ４５３の直後に挿入されている（例えば、Ｇ４５３のＣ末端に融合されている）異種エピトープを含み、Ｗ５０３Ａ変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、ＡＡＶ９ ＶＰ１タンパク質のＡ５８９の直後に挿入されている（例えば、Ａ５８９のＣ末端に融合されている）異種エピトープを含み、Ｗ５０３Ａ変異をさらに含む。
概して、組換えウイルスキャプシドタンパク質および／または組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクターは、少なくとも１アミノ酸長である異種エピトープを含む。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、約５アミノ酸長～約３５アミノ酸長であり得、抗体パラトープ（例えば、免疫グロブリン可変ドメイン）と結合対を形成する。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、少なくとも１０アミノ酸長を含む。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、親和性タグを含む。いくつかの実施形態では、異種エピトープおよび／または親和性タグは、免疫グロブリン定常ドメインと結合対を形成しない。いくつかの実施形態では、異種エピトープおよび／または親和性タグは、金属イオン、例えばＮｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋などと結合対を形成しない。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ストレプトアビジン、Ｓｔｒｅｐ ＩＩ、ＨＡ、Ｌ１４、４Ｃ－ＲＧＤ、ＬＨ、およびプロテインＡからなる群から選択されるポリペプチドではない。いくつかの実施形態では、親和性タグは、ＦＬＡＧ（配列番号７）、ＨＡ（配列番号８）およびｃ－ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号６）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ｃ－ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号６）を含む。
いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、遺伝子改変ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＧ４５３の直後に挿入されている（例えば、Ｇ４５３のＣ末端に融合されている）配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）を含む異種エピトープを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、（ｉ）ＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、（ｉｉ）配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）を含み、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＧ４５３の直後に挿入されている（例えば、Ｇ４５３のＣ末端に融合されている）異種エピトープを含み、（ｉｉｉ）Ｒ５８５Ａおよび／またはＲ５８８９Ａからなる群から選択される変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、遺伝子改変ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＮ５８７の直後に挿入されている（例えば、Ｎ５８７のＣ末端に融合されている）配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）を含む異種エピトープを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、（ｉ）ＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、（ｉｉ）配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）を含み、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＮ５８７の直後に挿入されている（例えば、Ｎ５８７のＣ末端に融合されている）異種エピトープを含み、（ｉｉｉ）Ｒ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａからなる群から選択される変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、（ｉ）ＡＡＶ６キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ６ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、（ｉｉ）配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）を含み、ＡＡＶ６ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＱ５８５の直後に挿入されている（例えば、Ｑ５８５のＣ末端に融合されている）異種エピトープを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、遺伝子改変ＡＡＶ８ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、ＡＡＶ８ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＮ５９０の直後に挿入されている（例えば、Ｎ５９０のＣ末端に融合されている）配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）を含む異種エピトープを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、遺伝子改変ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＧ４５３の直後に挿入されている（例えば、Ｇ４５３のＣ末端に融合されている）配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）を含む異種エピトープを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、（ｉ）ＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、（ｉｉ）配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）を含み、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＧ４５３の直後に挿入されている（例えば、Ｇ４５３のＣ末端に融合されている）異種エピトープを含み、（ｉｉｉ）Ｗ５０３Ａ変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、遺伝子改変ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＡ５８９の直後に挿入されている（例えば、Ａ５８９のＣ末端に融合されている）配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）を含む異種エピトープを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、（ｉ）ＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、（ｉｉ）配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）を含み、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＡ５８９の直後に挿入されている（例えば、Ａ５８９のＣ末端に融合されている）異種エピトープを含み、（ｉｉｉ）Ｗ５０３Ａ変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ ＶＰ１キャプシドタンパク質の少なくとも５つの連続アミノ酸に隣接し、かつ／または操作可能に連結されているアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質の少なくとも５つの連続アミノ酸に隣接し、かつ／または操作可能に連結されているアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＩ５８７に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＮ５８７とＲ５８８との間に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含み、例えば、配列番号２として表されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ６ ＶＰ１キャプシドタンパク質の少なくとも５つの連続アミノ酸に隣接し、かつ／または操作可能に連結されているアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ６ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＩ５８５に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ６ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＱ５８５とＳ５８６との間に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含み、例えば、配列番号４として表されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ８ ＶＰ１キャプシドの少なくとも５つの連続アミノ酸に隣接し、かつ／または操作可能に連結されているアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ８ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＩ５９０に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ８ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＮ５９０とＴ５９１との間に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含み、例えば、配列番号２５として表されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質の少なくとも５つの連続アミノ酸に隣接し、かつ／または操作可能に連結されているアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＩ４５３に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＧ４５３とＳ４５４との間に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含み、例えば、配列番号２６として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＩ５８９に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＡ５８９とＱ５９０との間に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含み、例えば、配列番号２７として表されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、異種エピトープは、親和性タグおよび１つ以上のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、リンカーが隣接する親和性タグを含み、例えば、異種エピトープは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のリンカー、親和性タグ、および第２のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、各々独立した、少なくとも１アミノ酸長のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の異種エピトープ、例えば、親和性タグ自体、または１つ以上のリンカーと組み合わせた親和性タグは、約５アミノ酸長～約３５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、同一の長さであり、かつ／または同一のアミノ酸配列を含む。
概して、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、減少または無効化された天然指向性を有し、標準ウイルスキャプシド、例えば標準ウイルスキャプシドタンパク質を含むキャプシド、例えば組換えウイルスキャプシドタンパク質と同一であるが異種エピトープを欠くウイルスキャプシドタンパク質のものと比較して、形質導入に対して天然に許容状態である標準細胞を標的化および結合する能力が、例えば減少しているか、あるいは不可能である。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、標準ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも１０％低下した形質導入効率を呈する。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、標準ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも２０％低下した形質導入効率を呈する。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、標準ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも３０％低下した形質導入効率を呈する。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、標準ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも４０％低下した形質導入効率を呈する。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、標準ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも５０％低下した形質導入効率を呈する。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、標準ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも６０％低下した形質導入効率を呈する。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、標準ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも７０％低下した形質導入効率を呈する。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、標準ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも７５％低下した形質導入効率を呈する。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、標準ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも８０％低下した形質導入効率を呈する。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、標準ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも８５％低下した形質導入効率を呈する。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、標準ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも９０％低下した形質導入効率を呈する。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、標準ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも９５％低下した形質導入効率を呈する。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドは、標準ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも９９％低下した形質導入効率を呈する。いくつかの実施形態では、および適切な多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子の非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドによる、対照細胞の形質導入は、無効化される、例えば検出不能である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、モザイクキャプシドであり、例えば、ある特定の比率で、異種エピトープを含む組換えウイルスキャプシドタンパク質と、異種エピトープを含まない標準キャプシドタンパク質とを含む。いくつかの実施形態では、標準キャプシドタンパク質は、組換えウイルスキャプシドタンパク質と同じセロタイプを有する野生型キャプシドタンパク質のアミノ酸配列を含むという点で、野生型標準キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、標準キャプシドタンパク質は、対照標準キャプシドタンパク質が異種エピトープを欠くことを除いて、組換えウイルスキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を含むという点で、対照標準キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、標準キャプシドタンパク質は、野生型のキャプシドタンパク質の指向性を減少させる変異（例えば、アミノ酸配列の挿入、キメラ化など）を除いて、組換えウイルスキャプシドタンパク質と同じセロタイプを有する野生型キャプシドタンパク質のものと実質的に同一のアミノ酸配列を含むという点で、変異野生型標準タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、組換えウイルスキャプシドタンパク質と、標準キャプシドタンパク質とを、１：１～１：１５の範囲の比率で含むか、あるいは本明細書に記載の方法は、このように組み合わせる。いくつかの実施形態では、比率は１：２である。いくつかの実施形態では、比率は１：３である。いくつかの実施形態では、比率は１：４である。いくつかの実施形態では、比率は１：５である。いくつかの実施形態では、比率は１：６である。いくつかの実施形態では、比率は１：７である。いくつかの実施形態では、比率は１：８である。いくつかの実施形態では、比率は１：９である。いくつかの実施形態では、比率は１：１０である。いくつかの実施形態では、比率は１：１１である。いくつかの実施形態では、比率は１：１２である。いくつかの実施形態では、比率は１：１３である。いくつかの実施形態では、比率は１：１４である。いくつかの実施形態では、比率は１：１５である。
また、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示の組換えウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸、（例えば、組換えウイルスキャプシドを作製する方法に使用され得る）かかる核酸、および／または組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組成物（例えば、組換えウイルスキャプシドタンパク質から本質的になる組成物、本明細書に記載のウイルスキャプシドタンパク質を含むキャプシドによって封入されているウイルスベクターのみを含む組成物、（例えば、ウイルスベクター対多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子（分子：分子）のある特定の比率で）かかるウイルスベクターと多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子とを含む組成物、かかるウイルスベクター、再標的化分子、および薬学的に許容可能な担体などを含む組成物）である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、およびアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスキャプシドタンパク質の少なくとも５つの連続アミノ酸をコードするヌクレオチド配列とを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質の少なくとも５つの連続アミノ酸に隣接し、かつ／または操作可能に連結されているアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＩ５８７に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＮ５８７とＲ５８８との間に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含み、例えば、いくつかの実施形態では、記載の核酸は、配列番号２として表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ６ ＶＰ１キャプシドタンパク質の少なくとも５つの連続アミノ酸に隣接し、かつ／または操作可能に連結されているアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ６ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＩ５８５に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ６ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＱ５８５とＳ５８６との間に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含み、例えば、いくつかの実施形態では、記載の核酸は、配列番号４として表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ８ ＶＰ１キャプシドタンパク質の少なくとも５つの連続アミノ酸に隣接し、かつ／または操作可能に連結されているアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ８ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＩ５９０に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ８ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＮ５９０とＴ５９１との間に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含み、例えば、いくつかの実施形態では、記載の核酸は、配列番号２５として表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質の少なくとも５つの連続アミノ酸に隣接し、かつ／または操作可能に連結されているアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＩ４５３に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＧ４５３とＳ４５４との間に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含み、例えば、いくつかの実施形態では、記載の核酸は、配列番号２６として表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＩ５８９に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＡ５８９とＱ５９０との間に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）をコードするヌクレオチド配列を含み、例えば、いくつかの実施形態では、記載の核酸は、配列番号２７として表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
概して、本明細書に記載の組換えウイルスベクターは、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドを含み、ウイルスキャプシドは、対象ヌクレオチドを封入している。いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、哺乳類プロモーター、鳥類プロモーター、魚プロモーター、昆虫プロモーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、非ヒトプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターである。
概して、対象ヌクレオチドは、１つ以上の遺伝子であってもよく、これは検出可能なマーカー、例えば、レポーター、または治療ポリペプチドをコードしてもよい。いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、レポーター遺伝子である。いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼなどからなる群から選択される検出可能なマーカーをコードするレポーター遺伝子である。いくつかの実施形態では、検出可能なマーカーは、緑色蛍光タンパク質である。他の実施形態では、対象ヌクレオチドは、自殺遺伝子、抗体またはその断片をコードするヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはそれらの一部分（複数可）をコードするヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド、ｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド、分泌酵素などからなる群選択される。一実施形態では、対象ヌクレオチドは、マルチドメイン治療用のタンパク質、例えば、２つの別個の機能を提供する少なくとも２つのドメインを含むタンパク質をコードする。
本明細書に記載の組成物は、概して、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターを含み、例えば、キャプシドが対象ヌクレオチドを封入している、組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むキャプシドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、（１）異種エピトープを含むように遺伝子改変された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むキャプシドを有するウイルスベクターと、（２）（ｉ）エピトープに特異的に結合する抗体パラトープ、および（ｉｉ）受容体に特異的に結合する再標的化リガンドを含む、多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子と、任意選択的に、（３）薬学的に許容可能な担体と、を含む。
本明細書に記載の抗体パラトープは、概して、異種エピトープを特異的に認識する相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３領域を最小限で含む。いくつかの実施形態では、多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子は、異種エピトープに特異的に結合する抗体パラトープを含む抗体（またはその一部分）を含む。例えば、多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子は、単一ドメイン重鎖可変領域または単一ドメイン軽鎖可変領域を含み得、単一ドメイン重鎖可変領域または単一ドメイン軽鎖可変領域が、異種エピトープに特異的に結合する抗体パラトープを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子は、Ｆｖ領域を含み得、例えば、多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子は、異種エピトープに特異的に結合する抗体パラトープを含む、ｓｃＦｖを含み得る。いくつかの実施形態では、多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子は、異種エピトープに特異的結合する抗体パラトープを含む抗体（またはその一部分）を含み、抗体（またはその一部分）が、さらに１つ以上の抗体定常ドメイン（例えば、重鎖定常ドメイン（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４など）、および／または軽鎖定常ドメイン（例えばＣＬ）を含み、１つ以上の抗体定常ドメインが、異種エピトープに結合しない。
本明細書に記載の多重特異性、任意選択的に二重特異性結合分子は、組換えウイルスキャプシドタンパク質に挿入／提示されている異種エピトープに特異的結合するパラトープ（例えば、パラトープを含む抗体またはその一部分）に加えて、再標的化リガンドをさらに含む。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（例えば、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質の単離および／または精製のための）ビーズの表面上の受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、哺乳類（例えば、ヒト）真核細胞、例えば、標的細胞の表面上に発現される、細胞表面タンパク質、例えば、受容体、細胞表面マーカーなどに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）肝細胞、（ヒト）脳細胞、（ヒト）Ｔ細胞、（ヒト）腎細胞、（ヒト）腸細胞、（ヒト）膵細胞、（ヒト）癌細胞、および／または異種病原体に感染した（ヒト）細胞に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）肝細胞特異性マーカー、（ヒト）脳細胞特異性マーカー、（ヒト）Ｔ細胞特異性マーカー、（ヒト）腎細胞特異性マーカー、（ヒト）腸細胞特異性マーカー、（ヒト）膵細胞特異性マーカー、（ヒト）腫瘍細胞特異性マーカー、および／または病原性エピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）肝細胞によって発現される受容体、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体、例えば、ｈＡＳＧＲ１に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）神経細胞によって発現される受容体、例えば、ＧＡＢＡ、トランスフェリンなどに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）Ｔ細胞によって発現される受容体、例えば、ＣＤ３、例えば、ＣＤ３εに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）造血幹細胞によって発現される受容体、例えば、ＣＤ３４に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）腎細胞によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）筋細胞によって発現される受容体、例えばインテグリンなどに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）癌細胞によって発現される受容体、例えば腫瘍関連抗原、例えば、アジポフィリン、ＡＩＭ－２、ＡＬＤＨ１Ａ１、アルファ－アクチン－４、アルファ－フェトタンパク質（「ＡＦＰ」）、ＡＲＴＣ１、Ｂ－ＲＡＦ、ＢＡＧＥ－１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合タンパク質ｂ３ａ２、ベータ－カテニン、ＢＩＮＧ－４、ＣＡ－１２５、ＣＡＬＣＡ、癌胎児性抗原（“ＣＥＡ”）、ＣＡＳＰ－５、ＣＡＳＰ－８、ＣＤ２７４、ＣＤ４５、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ－１、ＣＰＳＦ、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＣＴＡＧ１、ＣＴＡＧ２、サイクリンＤ１、サイクリン－Ａ１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＤＫＫ１、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、上皮癌抗原（“ＥＴＡ”）、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１融合タンパク質、ＥＺＨ２、Ｅ６、Ｅ７、ＦＧＦ５、ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＦＮ１、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＧＡＧＥ－１，２，８、ＧＡＧＥ－３，４，５，６，７、ＧＡＳ７、グリピカン－３、ＧｎＴＶ、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、ヘプシン、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＨＬＡ－Ａ１１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ｈｓｐ７０－２、ＩＤＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２、腸カルボキシルエステラーゼ、Ｋ－ｒａｓ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、ＫＫ－ＬＣ－１、ＫＫＬＣ１、ＫＭ－ＨＮ－１、ＣＣＤＣ１１０としても知られているＫＭＨＮ１、ＬＡＧＥ－１、ＬＤＬＲ－フコシルトランフエェラーゼＡＳ融合タンパク質、Ｌｅｎｇｓｉｎ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、リンゴ酸酵素、マンマグロビン－Ａ、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＣ１Ｒ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ－２、ＭＥ１、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、Ｍｅｌｏｅ、ミッドカイン、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ムチン、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシン、ミオシンクラスＩ、Ｎ－ｒａｗ、ＮＡ８８－Ａ、ｎｅｏ－ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－２、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ－９、Ｐポリペプチド、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ｐｍｌ－ＲＡＲアルファ融合タンパク質、多型上皮ムチン（“ＰＥＭ”）、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３８／ＮＹ－ＭＥＬ－１、ＲＡＧＥ－１、ＲＢＡＦ６００、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＧＥ、セクレニン１、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＯＸ１０、Ｓｐ１７、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ－２、ＳＳＸ－４、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＳＹＴ－ＳＳＸ１または－ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡＧ－１、ＴＡＧ－２、テロメラーゼ、ＴＧＦ－ベータＲＩＩ、ＴＰＢＧ、ＴＲＡＧ－３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ－１／ｇｐ７５、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ２－ＩＮＴ２、チロシナーゼ、チロシナーゼ（“ＴＹＲ”）、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＸＡＧＥ－ｌｂ／ＧＡＧＥＤ２ａ、Ｋｒａｓ、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＨＰＶ Ｅ２、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＷＴ－１抗原（リンパ腫および他の固形癌における）、ＥｒｂＢ受容体、メランＡ［ＭＡＲＴ１］、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１／ｇｐ７５、およびＴＲＰ－２（黒色腫における）；ＭＡＧＥ－１およびＭＡＧＥ－３（膀胱、頭頚部、および非小細胞癌腫における）；ＨＰＶ ＥＧおよびＥ７タンパク質（子宮頸癌における）；ムチン［ＭＵＣ－１］（乳癌、膵癌、結腸癌、および前立腺癌における）；前立腺特異性抗原［ＰＳＡ］（前立腺癌における）；癌胎児性抗原［ＣＥＡ］（大腸癌、乳癌、および消化器癌における）、ならびにＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－６、ＭＡＧＥ－１０、ＭＡＧＥ－１２、ＢＡＧＥ－１、ＣＡＧＥ－１，２，８、ＣＡＧＥ－３ ＴＯ ７、ＬＡＧＥ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－２、ＮＡ－８８、ＧｎＴＶ、ＴＲＰ２－ＩＮＴ２としてかかる共有腫瘍特異性抗原（ｓｈａｒｅｄ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ）などに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、Ｅ６および／またはＥ７に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、Ｈｅｒ２に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧＣＧＲ）に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、ヒトエクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ３（ｈＥＮＴＰＤ３）に結合する。
いくつかの実施形態では、パラトープ（例えば、抗体またはその一部分）および再標的化リガンドは、互いに直接融合している。いくつかの実施形態では、異種エピトープに特異的結合するパラトープ（例えば、抗体またはその一部分）、および再標的化リガンドは、互いに共有結合している。
いくつかの実施形態では、多重特異性結合分子は、二重特異性結合分子、例えば、第１および第２の抗原結合ドメインを含む抗体であり、第１の抗原結合ドメインが、組換えウイルスキャプシドタンパク質に挿入／提示されている異種エピトープに特異的結合するパラトープを含み、第２の抗原結合ドメインが、標的細胞によって発現される細胞表面タンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性結合分子は、第１および第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体であり、第１の抗体結合ドメインが、組換えウイルスキャプシドタンパク質に挿入／提示されている異種エピトープに特異的結合するパラトープを含み、第２の抗原結合ドメインが、標的細胞によって発現される受容体に特異的に結合し、第１の抗原結合ドメインが、第１のＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖領域に操作可能に連結され、第２の抗体結合ドメインが、第２のＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖領域に操作可能に連結され、第１および第２のＩｇ ＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸で互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の差異が、アミノ酸の差異を欠く二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合を減少させる。一実施形態では、第１のＩｇ ＣＨ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる、ＥＵナンバリングではＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を減少または無効にする変異を含有する。第２のＣＨ３ドメインはさらに、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＹ４３６Ｆ）を含んでもよい。第２のＣＨ３ドメイン内に見出され得るさらなる改変としては、以下が挙げられる：ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ、ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）。
いくつかの実施形態では、多重特異性結合分子は、二重特異性結合分子、例えば、第１および第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体であり、第１の抗原結合ドメインが、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質によって提示される親和性タグに結合し、第２の抗原結合ドメインが、標的細胞の表面上に発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、多重特異性結合分子は、二重特異性結合分子、例えば、第１および第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体であり、第１の抗原結合ドメインが、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質によって提示されるアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）に結合し、第２の抗原結合ドメインが、標的細胞の表面上で発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、多重特異性結合分子は、二重特異性結合分子、例えば、第１および第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体であり、第１の抗原結合ドメインが、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質によって提示されるアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）に結合し、第２の抗原結合ドメインが、ｈＡＳＧＲ１に結合する。いくつかの実施形態では、多重特異性結合分子は、二重特異性結合分子、例えば、第１および第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体であり、第１の抗原結合ドメインが、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質によって提示されるアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）に結合し、第２の抗原結合ドメインが、ＣＤ３タンパク質、例えばＣＤ３εに結合する。いくつかの実施形態では、多重特異性結合分子は、二重特異性結合分子、例えば、第１および第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体であり、第１の抗原結合ドメインが、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質によって提示されるアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）に結合し、第２の抗原結合ドメインが、インテグリンに結合する。いくつかの実施形態では、多重特異性結合分子は、二重特異性結合分子、例えば、第１および第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体であり、第１の抗原結合ドメインが、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質によって提示されるアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）に結合し、第２の抗原結合ドメインが、インテグリン、例えばｈＧＣＧＲに結合する。いくつかの実施形態では、多重特異性結合分子は、二重特異性結合分子、例えば、第１および第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体であり、第１の抗原結合ドメインが、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質によって提示されるアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）に結合し、第２の抗原結合ドメインが、ＥＮＴＰＤ３に結合する。
また、組換えウイルスキャプシドタンパク質、それを含むウイルスベクター、組成物などを作製および使用する方法が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルスを再配向させて、標的細胞に診断／治療カーゴを送達する方法は、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスベクター、例えば異種エピトープを提示する組換えウイルスキャプシドを含むキャプシドを含むウイルスベクターを、二重特異性結合分子と組み合わせることを含み、二重特異性結合分子が、（ｉ）エピトープに特異的に結合する抗体パラトープ、および（ｉｉ）受容体に特異的に結合する再標的化リガンドを含む。かかる方法は、組換えウイルスベクターを生成する第１の工程として、例えば、ウイルスベクターの生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することを含み得、パッケージング細胞が、エピトープを含むキャプシドタンパク質をコードするプラスミドを含む。標的細胞に診断／治療カーゴを送達するとき、本明細書に記載の方法は、異種エピトープを提示する組換えウイルスキャプシドを含むキャプシドを含むウイルスベクターと、多重特異性結合分子との組み合わせを標的細胞に接触させることを含み得、多重特異性結合分子が、ｉ）エピトープに特異的に結合する抗体パラトープ、および（ｉｉ）標的細胞によって発現される受容体に特異的に結合する再標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は生体外にある。他の実施形態では、標的細胞は、対象、例えばヒトの生体内にある。
いくつかの実施形態では、標準ウイルスベクターのものと同様のウイルスベクターの形質導入効率を復元する分子：分子の比率で、本明細書に記載の組換えキャプシドタンパク質を含むキャプシドで封入されている対象ヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターと、多重特異性結合分子とを、本明細書に記載の組成物は含むか、あるいは本明細書に記載の方法は組み合わせる。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：０．５～１：１００の範囲である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：４～１：２０の範囲である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対二重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：８～１：１５の範囲である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：４である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：８である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：１５である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：２０である。
また、本明細書に記載されているのは、ウイルスキャプシドを不活性化する方法、および／またはウイルスベクターを生成する方法であり、方法は、概して、（ａ）ウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸配列に、異種タンパク質をコードする核酸を挿入して、異種タンパク質を含む遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を形成すること、および／または（ｂ）ウイルスベクターを生成するのに十分な条件下でパッケージング細胞を培養することであって、パッケージング細胞が、ヌクレオチド配列を含む、培養すること、を含む。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、ヘルパープラスミドおよび／または対象ヌクレオチドを含む伝達プラスミドをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、培養上清から自己相補的アデノ随伴ウイルスベクターを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、パッケージング細胞を溶解することと、一本鎖アデノ随伴ウイルスベクターを細胞溶解物から単離することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）細胞片を除去することと、（ｂ）ＤＮａｓｅ ＩおよびＭｇＣｌ２を用いて、ウイルスベクターを含有する上清を処理することと、（ｃ）ウイルスベクターを濃縮することと、（ｄ）ウイルスベクターを精製することと、（ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちの任意の組み合わせと、をさらに含む。また、本明細書に記載の方法に従って作製されたウイルスベクター、および本明細書に記載のウイルスベクターを生成するのに有用なパッケージング細胞、例えば、記載の組換えキャプシドタンパク質をコードするプラスミドを含むパッケージング細胞が本明細書に提供されている。
特定の態様では例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
エピトープを含む組換えウイルスキャプシドタンパク質であって、前記エピトープが、前記キャプシドタンパク質とは異種であり、
前記異種エピトープまたはその一部分が、抗体パラトープに特異的に結合し、
前記ウイルスキャプシドタンパク質が、減少または無効化された天然指向性を有する組換えウイルスキャプシドを形成する、組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目２）
前記エピトープが、少なくとも１アミノ酸長である、項目１に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目３）
前記組換えウイルスキャプシドタンパク質が、減少または無効化されたウイルスキャプシドを形成するように、前記ウイルスキャプシドの前記天然指向性に関与するアミノ酸位置での置換、挿入、または欠失を含む、項目１または項目２に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目４）
前記ウイルスキャプシドタンパク質が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド遺伝子に由来し、任意選択的に、前記異種エピトープが、ＡＡＶ２のＩ５８７、ＡＡＶ６のＩ５８５、ＡＡＶ８のＩ５９０、ＡＡＶ９のＩ４５３、ＡＡＶ９のＩ５８９、および霊長類に感染するＡＡＶセロタイプの任意の対応するアミノ酸からなる群から選択される位置に挿入され、任意選択的に、前記霊長類に感染するＡＡＶセロタイプが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群から選択される、項目１～３に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目５）
前記アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ２である、項目４に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目６）
前記アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ６である、項目４に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目７）
前記アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ８である、項目４に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目８）
前記アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ９である、項目４に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目９）
（ｉ）前記ウイルスキャプシドタンパク質が、遺伝子改変ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、前記エピトープが、位置Ｉ４５３またはＩ５８７のアミノ酸の後に挿入され、かつ／またはそのアミノ酸を置き換え、
（ｉｉ）前記ウイルスキャプシドタンパク質が、遺伝子改変ＡＡＶ６ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、前記エピトープが、位置Ｉ５８５のアミノ酸の後に挿入され、かつ／またはそのアミノ酸を置き換え、
（ｉｉｉ）前記ウイルスキャプシドが、遺伝子改変ＡＡＶ８ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、前記エピトープが、位置Ｉ５９０のアミノ酸の後に挿入され、かつ／またはそのアミノ酸を置き換え、
（ｉｖ）前記ウイルスキャプシドタンパク質が、遺伝子改変ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、前記エピトープが、位置Ｉ４５３またはＩ５８９のアミノ酸の後に挿入され、かつ／またはそのアミノ酸を置き換える、項目１～８のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目１０）
前記ウイルスキャプシドタンパク質が、前記ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸Ｎ５８７とＲ５８８との間に並ぶ、前記エピトープを発現するように改変されたＡＡＶ２キャプシド遺伝子によってコードされる、項目１～９のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目１１）
前記ウイルスキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ６キャプシド遺伝子に由来し、前記エピトープが、アミノ酸Ｑ５８５の直後に挿入されている、項目１～９のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目１２）
前記ウイルスキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ８キャプシド遺伝子に由来し、前記エピトープが、前記ＡＡＶ８ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸Ｎ５９０の直後に挿入されている、項目１～９のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目１３）
前記ウイルスキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、前記エピトープが、前記ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質の位置Ｇ４５３またはＡ５８９のアミノ酸の後で前記キャプシドタンパク質に挿入され、かつ／またはそのアミノ酸を置き換え、前記キャプシドタンパク質が、追加の変異をさらに含む、項目１～９のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目１４）
前記追加の変異が、Ｗ５０３Ａである、項目１３に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目１５）
前記エピトープが、アミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを含み、前記アミノ酸配列またはその一部分が、前記抗体パラトープに特異的に、および任意選択的に結合する、項目１～１４のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目１６）
前記エピトープが、アミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを含み、前記アミノ酸配列またはその一部分が、前記抗体パラトープに特異的に結合し、
前記アミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬが、ＡＡＶキャプシドタンパク質の少なくとも５つの連続アミノ酸に隣接し、かつ操作可能に連結されている、項目１～１５のいずれかに記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目１７）
前記ウイルスキャプシドタンパク質が、配列番号２として表されるアミノ酸配列、配列番号４として表されるアミノ酸配列、配列番号２５として表されるアミノ酸配列、配列番号２６として表されるアミノ酸配列、または配列番号２７として表されるアミノ酸配列を含む、項目１６に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目１８）
前記組換えウイルスキャプシドタンパク質、または前記組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドが、前記抗体パラトープを含む多重特異性結合分子の非存在下で、標的細胞に感染することができず、任意選択的に、前記抗体パラトープを含む多重特異性結合分子の非存在下で、前記ウイルスキャプシドタンパク質、または前記組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドの形質導入効率が、
（ｉ）少なくとも１０％減少されるか、
（ｉｉ）少なくとも２０％減少されるか、
（ｉｉｉ）少なくとも３０％減少されるか、
（ｉｖ）少なくとも４０％減少されるか、
（ｖ）少なくとも５０％減少されるか、
（ｖｉ）少なくとも６０％減少されるか、
（ｖｉｉ）少なくとも７０％減少されるか、
（ｖｉｉｉ）少なくとも８０％減少されるか、
（ｉｘ）少なくとも９０％減少されるか、あるいは
（ｘ）無効化される、項目１～１７のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
（項目１９）
項目１～１８のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
（項目２０）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号２として表されるアミノ酸配列、配列番号４として表されるアミノ酸配列、配列番号２５として表されるアミノ酸配列、配列番号２６として表されるアミノ酸配列、または配列番号２７として表されるアミノ酸配列を含む、組換えウイルスキャプシドタンパク質をコードする、項目１９に記載の単離核酸。
（項目２１）
項目２０に記載の組換えウイルスキャプシドによって封入された対象ヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターであって、任意選択的に、前記組換えウイルスキャプシドが、モザイクキャプシドである、組換えウイルスベクター。
（項目２２）
前記対象ヌクレオチドが、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、哺乳類プロモーター、鳥類プロモーター、魚プロモーター、昆虫プロモーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、項目２１に記載の組換えウイルスベクター。
（項目２３）
前記対象ヌクレオチドが、非ヒトプロモーターの制御下にある、項目２２に記載の組換えウイルスベクター。
（項目２４）
前記対象ヌクレオチドが、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している、項目２３に記載の組換えウイルスベクター。
（項目２５）
前記対象ヌクレオチドが、レポーター遺伝子である、項目２１～２４のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
（項目２６）
前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質をコードする、項目２５に記載の組換えウイルスベクター。
（項目２７）
前記対象ヌクレオチドが、自殺遺伝子、抗体またはその断片をコードするヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはその一部分（複数可）をコードするヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド、ｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目２１～２４のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
（項目２８）
（ａ）項目２１～２７のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクターと、（ｂ）エピトープに特異的に結合する抗体パラトープを含む多重特異性結合分子と、を含む組成物であって、任意選択的に、多重特異性結合分子が、標的細胞上で発現された受容体に特異的に結合する再標的化リガンドをさらに含み、前記多重特異性結合分子が、任意選択的に二重特異性結合分子である、組成物。
（項目２９）
前記ウイルスベクターおよび前記多重特異性結合分子が、１：４の比率で存在する、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
前記抗体パラトープが、Ｆｖドメインである、項目２８または２９に記載の組成物。
（項目３１）
前記Ｆｖドメインが、重鎖定常ドメインに直接融合されている、項目３０に記載の組成物。
（項目３２）
前記再標的化リガンドが、抗体またはその一部分である、項目２８～３１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３３）
前記多重特異性結合分子が、二重特異性抗体であり、
前記パラトープおよび前記再標的化リガンドが、第１および第２の重鎖定常ドメインに融合されている別個のＦｖドメインを各々含む、項目２８～３２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３４）
前記第１および第２の重鎖が、異なる結合親和性でプロテインＡに結合する、項目３３に記載の組成物。
（項目３５）
前記多重特異性結合分子が、二重特異性抗体であり、
前記再標的化リガンドが、２つの同一の免疫グロブリン重鎖および２つの同一の軽鎖を含む四量体抗体構造を備え、
異種エピトープに結合する前記パラトープが、一方もしくは両方の重鎖のＣ末端もしくはＮ末端に、かつ／または一方もしくは両方の重鎖のＣ末端もしくはＮ末端に付加されている、項目２８～３２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３６）
前記パラトープがｓｃＦｖであり、任意選択的に、前記ｓｃＦｖが、配列番号３７として表されるアミノ酸配列を含む、項目３５に記載の組成物。
（項目３７）
前記異種エピトープが、アミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬまたはその一部分を含み、前記抗体パラトープが、前記アミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬまたはその一部分に特異的に結合する、項目２８～３６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３８）
前記再標的化リガンドが、細胞表面マーカーである細胞表面タンパク質に特異的に結合する、項目２８～３７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３９）
前記細胞表面マーカーが、アシアロ糖タンパク質１（ＡＳＧＲ１）である、項目３８に記載の組成物。
（項目４０）
前記細胞表面マーカーが、ＣＤ３である、項目３８に記載の組成物。
（項目４１）
前記細胞表面マーカーが、ＥＮＴＰＤ３である、項目３８に記載の組成物。
（項目４２）
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、項目２８～４１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４３）
項目２１～２７のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクターを標的細胞に配向させる方法であって、
前記組換えウイルスベクターを多重特異性結合分子と接触させることを含み、
前記多重特異性結合分子が、（ｉ）エピトープに特異的に結合する抗体パラトープ、および（ｉｉ）前記標的細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する再標的化リガンドを含む、方法。
（項目４４）
前記標的細胞が、生体内にある、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記接触させることが、エクスビボで実施される、項目４３または項目４４に記載の方法。
（項目４６）
細胞表面タンパク質を発現している標的細胞に対象ヌクレオチドを送達する方法であって、前記標的細胞を項目２８～４２のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含み、前記多重特異性結合分子が、前記細胞表面タンパク質に結合する再標的化リガンドを含む、方法。
（項目４７）
前記標的細胞が、生体外にある、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記標的細胞が、対象の生体内にある、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記対象が、ヒトである、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記標的細胞が、ヒト細胞である、項目４６～４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記標的細胞が、肝細胞、脳細胞、Ｔ細胞、腎細胞、腸細胞、膵細胞、癌細胞、および異種病原体に感染した細胞からなる群から選択される、項目４６～５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記標的細胞が、ヒト肝細胞である、項目４６～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記細胞表面タンパク質が、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１（ｈＡＳＧＲ１）である、項目４６～５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記標的細胞が、ヒトＴ細胞である、項目４６～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記細胞表面タンパク質が、ＣＤ３である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記細胞表面タンパク質が、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧＣＧＲ）である、項目４６～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記標的細胞が、腸細胞である、項目４６～５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記標的細胞が、膵細胞である、項目４６～５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記細胞表面タンパク質が、ＥＮＴＰＤ３である、項目５７および５８に記載の方法。
（項目６０）
ウイルスキャプシドタンパク質を不活性化する方法であって、
（ａ）異種エピトープをコードする核酸を、ウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸配列に挿入して、前記異種エピトープを含む遺伝子改変されたキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を形成することと、
（ｂ）ウイルスベクターの生成に十分な条件下で、パッケージング細胞を培養することであって、前記パッケージング細胞が、前記ヌクレオチド配列を含む、培養することと、を含む、方法。
（項目６１）
ウイルスベクターを生成する方法であって、ウイルスベクターの生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することを含み、前記パッケージング細胞が、項目１～１８のいずれか一項に記載の組換えキャプシドタンパク質をコードするプラスミドを含む、方法。
（項目６２）
前記パッケージング細胞が、ヘルパープラスミド、および／または対象ヌクレオチドを含む伝達プラスミドをさらに含む、項目６０または項目６１に記載の方法。
（項目６３）
培養上清から自己相補的アデノ随伴ウイルスベクターを単離することをさらに含む、項目６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記パッケージング細胞を溶解することと、一本鎖アデノ随伴ウイルスベクターを前記細胞溶解物から単離することと、をさらに含む、項目６０～６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
ａ．細胞片を除去することと、
ｂ．ＤＮａｓｅ ＩおよびＭｇＣｌ２を用いて、ウイルスベクターを含有する前記上清を処理することと、
ｃ．ウイルスベクターを濃縮することと、
ｄ．前記ウイルスベクターを精製することと、
ｅ．ａ～ｄのうちの任意の組み合わせと、をさらに含む、項目６０～６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
項目６０～６５のいずれか一項に記載の方法に従って作製される、ウイルスベクター。
（項目６７）
項目１～１８のいずれか一項に記載のキャプシドタンパク質をコードするプラスミドを含むウイルスベクターを生成するための、パッケージング細胞。
（項目６８）
配列番号６に結合するパラトープを含む結合分子であって、前記パラトープが、配列番号２８として表される前記核酸配列によってコードされる、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３配列の前記ｓｃＦｖを含む、結合分子。
（項目６９）
前記抗体パラトープが、Ｆｖドメインである、項目６８に記載の結合分子。
（項目７０）
前記Ｆｖドメインが、重鎖定常ドメインに直接融合されている、項目６９に記載の結合分子。
（項目７１）
前記結合分子が、二重特異性抗体であり、再標的化リガンドをさらに含み、
前記パラトープおよび前記再標的化リガンドが、第１および第２の重鎖定常ドメインに融合されている別個のＦｖドメインを各々含む、項目６８～７０のいずれか一項に記載の結合分子。
（項目７２）
前記第１および第２の重鎖が、異なる結合親和性でプロテインＡに結合する、項目７１に記載の結合タンパク質。
（項目７３）
前記結合分子が、二重特異性抗体であり、再標的化リガンドをさらに含み、
前記再標的化リガンドが、２つの同一の免疫グロブリン重鎖および２つの同一の軽鎖を含む四量体抗体構造を備え、
前記パラトープが、一方もしくは両方の重鎖のＣ末端もしくはＮ末端に、かつ／または一方もしくは両方の重鎖のＣ末端もしくはＮ末端に、付加されている、項目６８または６９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
（項目７４）
前記パラトープがｓｃＦｖであり、任意選択的に、前記ｓｃＦｖが、配列番号３７として表されるアミノ酸配列を含む、項目７３に記載の結合タンパク質。
（項目７５）
抗体またはその一部分である再標的化リガンドをさらに含む、項目６９～７２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
（項目７６）
前記再標的化リガンドが、細胞表面マーカーである細胞表面タンパク質に特異的に結合する、項目７５に記載の結合タンパク質。
（項目７７）
前記細胞表面マーカーが、アシアロ糖タンパク質１（ＡＳＧＲ１）である、項目７６に記載の結合タンパク質。
（項目７８）
前記細胞表面マーカーが、ＣＤ３である、項目７６に記載の結合タンパク質。
（項目７９）
前記細胞表面マーカーが、ＧＣＧＲである、項目７６に記載の結合タンパク質。
（項目８０）
前記細胞表面マーカーが、ＥＮＴＰＤ３である、項目７６に記載の結合タンパク質。
（項目８１）
（ａ）項目２１～２７のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクターと、（ｂ）項目６８～８１のいずれか一項に記載の結合タンパク質と、を含む、組成物。
（項目８２）
前記ウイルスベクターおよび前記多重特異性結合分子が、１：４の比率で存在する、項目８１に記載の組成物。
（項目８３）
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、項目８１または項目８２に記載の組成物。
本特許または本出願は、色付きで作成された少なくとも１つの図面を含有する。色付きの図面（複数可）を伴う本特許または本特許出願公開の写しは、要求により、および必要な料金を支払うことにより、当局に提供されるであろう。
（Ａ）野生型ｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターのみ、（Ｂ）ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｈｒＧＦＰウイルスベクターのみ、次の比率で二重特異性抗Ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と混合されたｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクター：（Ｃ）１：０．５、（Ｄ）１：１、（Ｅ）１：２、（Ｆ）１：４、（Ｇ）１：８、（Ｈ）１：１５、（Ｉ）１：２０、（Ｊ）１：５０、もしくは（Ｋ）１：１００、（Ｌ）、または１：８の比率で、単一特異性抗Ｍｙｃ抗体と混合されたｓｃＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクター、と培養されたＨｅｐＧ２細胞による、緑色蛍光（ＧＦＰ）発現を評価する、免疫蛍光顕微鏡画像（上部パネル）、または蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）から得たヒストグラム（下部パネル）を提供する。 同上。 同上。 同上。 野生型ｓｃＡＡＶ２ウイルスベクターのみ（ｉ）、ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターのみ（ｉｉ）、次の比率で二重特異性抗Ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と混合されたｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクター：１：０．５（ｉｉｉ）、１：１（ｉｖ）、１：２（ｖ）、１：４（ｖｉ）、１：８（ｖｉｉ）、１：１５（ｖｉｉｉ）、１：２０（ｉｘ）、もしくは１：１００（ｘ）、または１：８の比率で無関係な二重特異性抗Ｍｙｃ－ＧＣＧＲ抗体と混合されたｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクター（ｘｉｉ）、と培養された２９Ｔ３－ｈＡＳＧＲ１細胞による、緑色蛍光（ＧＦＰ）発現を評価する、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）から得たドットプロットを提供する。１：８の比率で二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と混合されたｓｃＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクターと培養された２９Ｔ３細胞によるＧＦＰ発現（ｘｉ）も、示されている。各実験では、２ｘ１０５細胞、および５×１０９ウイルスベクターを使用した。 同上。 非改変ＡＡＶ９－ＣＡＧＧ－ＧＦＰウイルスベクターのみ（ｉ）、ＡＡＶ９－Ａ５８９Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクターのみ（ｉｉ）、次の比率で二重特異性抗Ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と混合されたＡＡＶ９－Ａ５８９Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクター：１：１（ｉｉｉ）、１：２（ｉｖ）、１：４（ｖ）、１：８（ｖｉ）、１：２０（ｖｉｉ）、１：５０（ｖｉｉｉ）、もしくは１：１００（ｉｘ）、と培養された２９Ｔ３－ｈＡＳＧＲ１細胞による、緑色蛍光（ＧＦＰ）発現を評価する、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）評価から得たヒストグラムを提供する。各実験では、２ｘ１０５細胞、および１×１０１０ウイルスベクター（ｑＰＣＲによる滴定）を使用した。 同上。 ０ｎＭ（Ｃ）、５０ｎＭ（Ｄ）、１０ｎＭ（Ｅ）、２ｎＭ（Ｆ）、０．４ｎＭ（Ｇ）、０．０８ｎＭ（Ｈ）、０．０１６ｎＭ（Ｉ）、または０．００３２ｎＭ（Ｊ）の濃度で、二価抗ＡＳＧＲ１抗体と事前に培養された２９Ｔ３－ｈＡＳＧＲ１細胞による緑色蛍光（ＧＦＰ）発現、およびその後１：８の比率で二重特異性抗Ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と混合されたｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターを用いて感染させた（Ｌ）２９Ｔ３－ｈＡＳＧＲ１細胞による緑色蛍光（ＧＦＰ）発現を評価する、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）から得た、ドットプロットを提供する。野生型ｓｃＡＡＶウイルスベクターのみ（Ａ）、またはｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターのみ（Ｂ）と培養した２９３Ｔ３－ｈＡＳＧＲ１細胞は、対照として機能する。各実験では、２ｘ１０５細胞、および５ｘ１０９ウイルスベクター（ｑＰＣＲによる滴定）を使用した。 同上。 野生型ｓｃＡＡＶウイルスベクターのみ（Ａ）、ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターのみ（Ｂ）と培養されるか、あるいはその後１ｘ１０９（Ｃ）、２ｘ１０９（Ｄ）、４ｘ１０９（Ｅ）、８ｘ１０９（Ｆ）、２ｘ１０１０（Ｇ）、１ｘ１０１１（Ｈ）、１ｘ１０１２（Ｉ）の二重特異性抗Ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体、続いて１ｘ１０９のｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターと連続して培養された、２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞による緑色蛍光（ＧＦＰ）発現を評価する、免疫蛍光顕微鏡画像を提供する。また、１ｘ１０１１抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体分子、続いて１ｘ１０９のｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターと連続して培養された２９３Ｔ細胞（Ｊ）、および１ｘ１０１１の無関係な二重特異性抗Ｍｙｃ－ＧＣＧＲ抗体分子、続いて１ｘ１０９のｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターと連続して培養された、２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞（Ｋ）の免疫蛍光顕微鏡画像が示されている。 野生型ｓｓＡＡＶウイルスベクターのみ（Ａ）、ｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｈｒＧＦＰウイルスベクターのみ（Ｂ）、次の比率で二重特異性抗Ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と混合されたｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｈｒＧＦＰウイルスベクター：１：１（Ｃ）、１：２（Ｄ）、１：４（Ｅ）、１：８（Ｆ）、１：２０（Ｇ）、１：１００（Ｈ）、１：１０００（Ｉ）、または１：８の比率で無関係な二重特異性抗ｍｙｃ－ＧＣＧＲ抗体と混合されたｓｓＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクター（Ｋ）と培養された、２９Ｔ３－ｈＡＳＧＲ１細胞による緑色蛍光（ＧＦＰ）発現を評価する、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）から得たドットプロットを提供する。１：８の比率で二重特異性抗Ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と混合されたｓｓＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクターと培養された２９Ｔ３細胞によるＧＦＰ発現（Ｊ）も、示されている。各実験では、２ｘ１０５細胞、および５×１０９ウイルスベクターを使用した。 同上。 野生型ｓｓＡＡＶＰウイルスベクターのみ（Ａ）、ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターのみ（Ｂ）、次の比率で二重特異性抗－Ｍｙｃ－ＧＣＧＲ抗体と混合されたｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクター：１：０．５（Ｃ）、１：１（Ｄ）、１：２（Ｅ）、１：４（Ｆ）、１：８（Ｇ）、１：１５（Ｈ）、１：２０（Ｉ）、１：５０（Ｊ）、もしくは１：１００（Ｋ）、または１：８の比率で無関係な単一特異性抗Ｍｙｃ抗体（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）と混合されたｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクター（Ｌ）と培養された２９Ｔ３－ｈＧＣＧＲ細胞による緑色蛍光（ＧＦＰ）発現を評価する、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）から得たドットプロットを提供する。各実験では、２ｘ１０５細胞、および５×１０９ウイルスベクターを使用した。 同上。 Ｊｕｒｋａｔ細胞単独（Ａ）、または野生型ｓｃＡＡＶ６－ＥＦ１－ｅＧＦＰウイルスベクターのみ（Ｂ）、ＡＡＶ６－Ｑ５８５Ｍｙｃ－ＥＦ１ａ－ｅＧＦＰウイルスベクターのみ（Ｃ）、次の比率で二重特異性抗－Ｍｙｃ－ＣＤ３抗体と混合されたＡＡＶ６－Ｑ５８５Ｍｙｃ－ＥＦ１ａ－ｅＧＦＰウイルスベクター：１：１（Ｄ）、１：５（Ｅ）、１：１０（Ｆ）、１：１００、または（Ｇ）、１：１０００（Ｈ）、と培養されたＪｕｒｋａｔ細胞による緑色蛍光（ＧＦＰ）発現を評価する、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）から得たドットプロットを提供する。各実験では、２ｘ１０５細胞、および１ｘ１０９ウイルスベクターを使用した。 同上。 肝臓の免疫蛍光顕微鏡画像を提供する。 脾臓の免疫蛍光顕微鏡画像を提供する。 腎臓の免疫蛍光顕微鏡画像を提供する。すべての試料は、１ｘ１０１１の野生型ｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ（ｉ、ｖ）、生理食塩水（ｉｉ、ｖｉ）、１ｘ１０１１のｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクター単独（ｉｉｉ、ｖｉｉ）、または二重特異性抗－ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体を含むｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクター（ｉｖ、ｖｉｉｉ）を静脈注射した１０日後に、肝細胞によってヒトＡＳＧＲ１を発現するように遺伝形質転換して改変されたＣ５７ＢＬ／６マウス（ｉ～ｉｖ）、または野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｖ～ｖｉｉｉ）から採取する。 ２．１８ｘ１０１１の野生型ｓｓＡＡＶ２－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰ（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）、生理食塩水（Ａ、Ｄ）、２．１８ｘ１０１１のｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクター単独（Ｇ～Ｉ、Ｊ～Ｌ）、または二重特異性抗－ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体を含むｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクター（Ｍ～Ｏ、Ｐ～Ｒ）を静脈注射した４週間後に、肝細胞上にヒトＡＳＧＲ１を発現するように遺伝形質転換して改変されたＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｄ～Ｆ、Ｊ～Ｌ、Ｐ～Ｒ）、または野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ａ～Ｃ、Ｇ～Ｉ、Ｍ～Ｏ）から採取した肝臓試料の免疫蛍光顕微鏡画像を提供する。各画像は、１匹のマウスを表している。 同上。 同上。 （Ａ）野生型ＡＡＶ９、（Ｂ）２５０ｎＭのＮａＣｌ、（Ｃ）二重特異性抗ｍｙｃ－ｈＣＤ３抗体と組み合わせたＡＡＶ９－Ａ５８９ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子、または（Ｄ）二重特異性抗－ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と組み合わせたＡＡＶ９－Ａ５８９ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を静脈注射した１０日後、肝細胞によってヒトＡＳＧＲ１を発現するように遺伝形質転換して改変されたＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した肝臓試料の免疫蛍光顕微鏡画像を提供する。 本発明のいくつかの実施形態において有用な、図解的な、正確な縮尺ではない、非限定的な例としての多重特異性結合分子のフォーマットを提供する。 （Ａ）＿野生型ＡＡＶ８ウイルスベクターのみ、（Ｃ）ＡＡ８－Ｎ５９０－ｍｙｃウイルスベクターのみ、または次の比率で二重特異性抗ｈＡＳＧＲ１－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ二重特異性分子と混合されたｐＡＡＶ ＲＣ８ Ｎ５９０ｍｙｃウイルスベクター：（Ｄ）１：１、（Ｅ）１：２、（Ｆ）１：４、（Ｇ）１：８、（Ｈ）１：１２、（Ｉ）１：１５、（Ｊ）１：５０、もしくは（Ｋ）１：１００、と培養された２９Ｔ３－ｈＡＳＧＲ１細胞による緑色蛍光（ＧＦＰ）発現を評価する、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）から得たドットプロットを提供する。模擬トランスフェクトされた２９Ｔ３－ｈＡＳＧＲ１細胞によるＧＦＰ発現（Ｂ）も、示されている。各実験では、２ｘ１０５細胞、および１ｘ１０９ウイルスベクターを使用した。 同上。 （Ａ）～（Ｃ）野生型ＡＡＶ８、（Ｄ）～（Ｆ）ＡＡ８－Ｎ５９０－ｍｙｃウイルスベクターおよび対照二重特異性結合分子、または（Ｇ）～（Ｉ）抗ｈＡＳＧＲ１－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ二重特異性結合分子と組み合わせたＡＡＶ８ Ｎ５９０ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を静脈注射した１０日後、肝細胞によってヒトＡＳＧＲ１を発現するように遺伝形質転換して改変されたＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した肝臓試料の、免疫蛍光顕微鏡画像を提供する。 （Ａ）野生型ＡＡＶ２ウイルスベクターのみ、（Ｂ）ＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクターのみ、または次の比率で二重特異性抗ｈＥＮＴＰＤ３－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ二重特異性分子と混合されたＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクター：（Ｃ）１：１、（Ｄ）１：２、（Ｅ）１：４、（Ｆ）１：８、（Ｇ）１：２０、（Ｈ）１：５０、（Ｉ）１：１００、もしくは（Ｋ）１：２００、と培養された２９Ｔ３－ｈ ＥＮＴＰＤ３細胞による緑色蛍光（ＧＦＰ）発現を評価する、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）から得たドットプロットを提供する。各実験では、２ｘ１０５細胞、および１ｘ１０９ウイルスベクターを使用した 同上。 肝臓試料の免疫蛍光顕微鏡画像を提供する。 腸試料の免疫蛍光顕微鏡画像を提供する。 膵臓試料の蛍光顕微鏡画像を提供する。すべての試料は、ＰＢＳ（１５Ａ（ｉ）、１５Ｂ（ｉ）、および１５Ｃ（ｉ））、５ｘ１０１１の野生型ＡＡＶ９（１５Ａ（ｉｉ）、１５Ｂ（ｉｉ）、および１５Ｃ（ｉｉ））、１ｘ１０３の無関係な二重特異性ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ結合タンパク質を含む５ｘ１０１１のＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクター（１５Ａ（ｉｉｉ）、１５Ｂ（ｉｉｉ）、および１５Ｃ（ｉｉｉ））、または１ｘ１０１３の二重特異性ｈＥＮＴＰＤ３－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ結合タンパク質を含む５ｘ１０１１のＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクター（１５Ａ（ｉｖ）、１５Ｂ（ｉｖ）、および１５Ｃ（ｉｖ））を静脈注射した１０日後、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスから採取する。
非改変ウイルスキャプシドまたは足場改変ウイルスキャプシドを利用するアダプター手法を用いる一般的な問題は、改変キャプシドの最適以下の形質導入効率である。（Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：９６４－７５）。例えば、Ｃｕｒｉｅｌらは、カルボキシ末端ノブドメインのＨＩループ内にＲＧＤ－４Ｃ配列が遺伝学的に組み込まれたファイバーを含有する組換えアデノウイルスベクターの生成および特徴評価について記載しており、短いペプチドリガンドを組み込むための最適な部位としてファイバーノブのＨＩループの有用性を実証している。例えば、米国特許第７，２９７，５４２号を参照し、またＢｅａｔｔｙ ａｎｄ Ｃｕｒｉｅｌ（２０１２）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１５：３９－６７も参照されたい。同様に、ＡＡＶキャプシドタンパク質へのリガンドペプチドの挿入により、キャプシドの表面上にリガンドを提示し、その受容体とリガンドとの相互作用を通じて形質導入を媒介することが可能であり、それによって遺伝子改変キャプシドによるウイルス指向性を再配向させるキャプシドがもたらされた（Ｇｉｒｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（９）：１０５２－６，１４３８（ｅｒｒａｔａ ｉｎｃｌｕｄｅｄ）（１９９９）、Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３（６）：９６４－７５、Ｎｉｃｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４（３）：１７４－８１、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７（３）：３５３－６１（２００６）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１８）：８６３５－４７）。具体的には、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１の挿入部位Ｉ－５８７にインテグリン結合Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフを挿入することにより、αｖβ１インテグリンを介してＡＡＶウイルスベクターを細胞に形質導入することを可能にすることが実証されている（Ｇｉｒｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）上記）。対照的に、アミノ酸Ｒ４４７（Ｉ－４４７）の後の１４－アミノ酸ペプチドＬ１４の挿入は、コンフォメーション高感度抗体（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）Ａ２０によってまだ認識されるキャプシドをもたらしたが、かかる組換えウイルスベクターは、Ｌ－１４受容体を発現する細胞に形質導入することができなかった（Ｇｉｒｏｄ ｅｔ ａｌ．１９９９、参照Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）（位置Ｉ－４４７でヘマグルチニン（ＨＡ）ペプチドの挿入、およびＨＡペプチドを発現する細胞への形質導入の成功が報告されている）。Ｔ４４８とＮ４４９との間のＭｙｃエピトープの挿入は、抗ｍｙｃ抗体によって認識され、したがってキャプシド表面上に存在したが、不活性化ウイルスベクターをもたらした。（Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。対照的に、Ｎ５８７後のＮＧＲモチーフの挿入による再標的化の成功が再び報告されたが、Ｎ５８７後のｃ－ｍｙｃの挿入はなかった。（Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。米国特許第９，６２４，２７４号は、異種エピトープの好適な挿入部位としてのＡＡＶキャプシドタンパク質のＩ－４５３について記載している。これらの研究は、ＡＡＶキャプシドタンパク質による、異種ペプチド、例えばエピトープの挿入および提示の成功を実証しているが、異種ペプチドおよび細胞表面タンパク質に特異的に結合する多重特異性結合分子、例えば二重特異性抗体などの二重特異性結合分子が、細胞表面タンパク質を発現している細胞に改変ウイルスベクターを再標的化し、それらの形質導入効率を復元することができるという見込みを、これらの研究のうちのいずれも提供していない。
本明細書に開示されているのは、パラトープ、例えばエピトープに特異的に結合するＦｖドメインと、標的細胞の表面上に発現される受容体に結合するリガンドとを含む、多重特異性結合分子と関連して使用することができる、異種エピトープで改変された組換えウイルスキャプシドタンパク質である。本明細書に示されるように、ある特定の比率で、多重特異性結合分子と、本明細書に記載のキャプシドタンパク質で形成されているキャプシドを有するウイルスベクターとを接触させることにより、野生型ウイルスに匹敵するレベルまで、ウイルスキャプシドの形質導入効率を復元する（例えば、実施例２参照）。概して、本明細書に記載の異種エピトープで改変されたキャプシドタンパク質は、限定されないが、アデノウイルス（Ａｄ）およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの非エンベロープウイルスに由来し得る。
本発明は、多数の実施形態を参照して具体的に示され、記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示の様々な実施形態に対して、形式および詳細が変更され得、本明細書に開示の様々な実施形態は、特許請求の範囲を限定するように機能することを意図しないことを当業者は理解するであろう。
本明細書に記載の方法および材料と同様または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、いくつかの好ましい方法および材料を以下記載する。本明細書で引用されるすべての出版物は、その記載全体が参照により本明細書に組み込まれる。別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
用語の定義
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で別途明確に指示されない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば、「１つの方法」への言及は、本明細書に記載され、かつ／または当業者には本開示の閲読により明らかになるであろう種類の１つ以上の方法および／または工程を含む。
「抗体」という用語には、４つのポリペプチド鎖（ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖）を含む、免疫グロブリン分子が含まれる。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（Ｖ－Ｈ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、少なくとも３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および任意選択的にＣＨ４を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＣＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。重鎖および軽鎖可変ドメインはさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的な領域に差し込まれている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができる。各重鎖および軽鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含み、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序で配列される。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３として省略され得、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３として省略され得る）。典型的な四量体抗体構造は、２つの同一の抗原結合ドメインを含み、各々が、ＶＨとＶＬとの会合により形成され、各々が、それぞれのＣＨおよびＣＬドメインと一緒になって抗体Ｆｖ領域を形成している。単一ドメイン抗体は、単一の抗原結合ドメイン、例えば、ＶＨまたはＶＬを含む。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単一鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単一鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、ミニボディ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば抗原特異的ＴＣＲに対する抗ＩＤ抗体を含む）、および上記のうちのいずれかのエピトープ結合断片を包含する。「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語はまた、米国特許出願公開第２００７／０００４９０９号に開示のものなどの共有ダイアボディ（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、および米国特許出願公開第２００９／００６０９１０号に開示のものなどのＩｇ－ＤＡＲＴＳを指す。抗体としては、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち抗原結合部位を含有する分子が挙げられる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
抗体の抗原結合ドメイン、例えば、抗原のエピトープを認識し結合する抗体の一部はまた、「パラトープ」と称される。抗体のＦｖ領域の（５～１０アミノ酸の）小さな領域、すなわち抗原結合断片（Ｆａｂ領域）の一部であり、抗体の重鎖および／または軽鎖の部分を含有し得る。パラトープは、パラトープが高親和性でエピトープに結合するとき、エピトープに特異的に結合する。「高親和性」抗体という用語は、その標的エピトープに対して約１０－９Ｍ以下（例えば、約１ｘ１０－９Ｍ、１ｘ１０－１０Ｍ、１ｘ１０－１１Ｍ、または約１ｘ１０－１２Ｍ）のＫＤを有する抗体を指す。一実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって測定され、別の実施形態では、ＫＤは、ＥＬＩＳＡによって測定される。
「相補性決定領域」という語句または「ＣＤＲ」という用語は、生物体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、通常（すなわち、野生型動物では）、免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域における２つのフレームワーク領域の間に見られる。ＣＤＲは、例えば生殖細胞系の配列または再構成配列もしくは非再構成配列によって、例えば、ナイーヴＢ細胞もしくは成熟Ｂ細胞、またはＴ細胞によってコードされ得る。ＣＤＲは、体細胞変異され（例えば動物生殖細胞系でコードされた配列と異なり）、ヒト化され、および／またはアミノ酸置換、付加、もしくは欠失で改変され得る。一部の環境下（例えば、ＣＤＲ３に関して）では、ＣＤＲは、２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系配列）によってコードされ得、その２つ以上の配列は（例えば、非再構成核酸配列においては）連続していないが、例えば、配列のスプライシングまたは接続（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するためのＶ－Ｄ－Ｊ再構成）の結果として、Ｂ細胞核酸配列では連続している。
「エピトープ」は、免疫系によって、特に抗体、Ｂ細胞、または細胞毒性Ｔ細胞によって認識されるマクロ分子の一部である。エピトープは通常、非自己タンパク質に由来すると考えられるが、認識され得る宿主由来の配列もエピトープとして分類される。エピトープは、少なくとも４アミノ酸長、好ましくは４～３０アミノ酸長、より好ましくは５～２０アミノ酸長、特に５～１５アミノ酸長を有する。エピトープは、一次タンパク質構造において互いに離れているが、二次構造および／または三次構造ではより近接した関係になるアミノ酸によって典型的には形成される、直線状または三次元状であり得る。Ｂ細胞によって特異的に認識されるエピトープは、Ｂ細胞エピトープと称される。
「逆位末端反復」または「ＩＴＲ」という語句は、効率的な複製に必要なアデノ随伴ウイルスのゲノム中の対称核酸配列を含む。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ＤＮＡゲノムの各末端に位置する。ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡ合成のための複製の起源として機能し、ＡＡＶ統合ベクターを生成するための必須シス構成要素である。
「軽鎖」という語句は、任意の生物体由来の免疫グロブリン軽鎖配列を含み、別段の規定がない限り、代替軽鎖のみならず、ヒトκ軽鎖およびλ軽鎖、ならびにＶｐｒｅＢを含む。軽鎖可変ドメインは、典型的には、別段の規定がない限り、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。概して、完全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含む可変ドメイン、および軽鎖定常領域を含む。軽鎖可変ドメインは、軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされ、概して、生殖細胞系に存在するＶセグメントおよびＪセグメントのレパートリーに由来するＶＬセグメントおよびＪＬセグメントを含む。様々な生物体のＶ軽鎖セグメントおよびＪ軽鎖セグメントの配列、位置、および命名は、ＩＭＧＴデータベース、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで見ることができる。軽鎖は、例えば、軽鎖に現れるエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される第１または第２のエピトープのいずれにも選択的に結合しない軽鎖を含む。軽鎖はまた、軽鎖に現れるエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される１つ以上のエピトープの結合および認識により、重鎖または別の軽鎖に結合および認識するか、またはこれを補助するものを含む。一般的な軽鎖または汎用的な軽鎖は、ヒトＶκ１～３９Ｊκ遺伝子またはヒトＶκ３～２０Ｊκ遺伝子に由来する軽鎖を含み、それらの体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンを含む。例示的なヒトＶＬセグメントは、ヒトＶκ１～３９遺伝子セグメント、ヒトＶκ３～２０遺伝子セグメント、ヒトＶλ１～４０遺伝子セグメント、ヒトＶλ１～４４遺伝子セグメント、ヒトＶλ２～８遺伝子セグメント、ヒトＶλ２～１４遺伝子セグメント、およびヒトＶλ３～２１遺伝子セグメントを含み、それらの体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンを含む。１つの生物体（例えば、ヒトもしくは齧歯類、例えば、ラットもしくはマウス、または鳥類、例えばニワトリ）からの可変ドメインと、同じかまたは異なる生物体（例えば、ヒトもしくは齧歯類、例えばラットももしくはマウス、または鳥類、例えばニワトリ）からの定常領域とを含む軽鎖を作製することができる。
「約」または「およそ」という用語は、統計的に有意の値の範囲内であることを含む。かかる範囲は、所与の値または範囲の１０倍以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、なおより好ましくは１０％以内、さらにより好ましくは５％以内であり得る。「約」または「およそ」という用語によって包含される許容可能な変動は、研究中の特定の系に依存し、当業者によって容易に理解され得る。
「親和性タグ」という用語は、例えば、別のポリペプチド配列、例えば高親和性を有する抗体パラトープと特異的に結合する、特定の結合対のメンバーであるポリペプチド配列を含む。例示的および非限定的親和性タグは、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＳｔｒｅｐＩＩタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）タグ、カルタチオン結合ペプチド（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、ＨＡタグ、およびｃ－Ｍｙｃタグを含む。（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈ．Ｃｈｅｍ．１－８において検証され、参照により本明細書に組み込まれる）。
「キャプシドタンパク質」という用語は、ウイルスのキャプシドの一部であるタンパク質を含む。アデノ随伴ウイルスでは、キャプシドタンパク質は、概して、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３と称され、各々単一のｃａｐ遺伝子によってコードされる。ＡＡＶでは、３つのＡＡＶキャプシドタンパク質は、代替的なｍＲＮＡスプライシングおよび／または代替的な翻訳開始コドンの使用を介したｃａｐオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から重複した様式で生成されるが、３つのタンパク質すべてが共通の終止コドンを使用する。Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６５９５、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ２のＶＰ１は、概して２．４ｋｂのｍＲＮＡ上のＡＴＧ開始コドン（アミノ酸Ｍ１）から翻訳されるが、ＡＡＶ２のＶＰ２およびＶＰ３は、より小さい２．３ｋｂのｍＲＮＡから生じ、ＶＰ２生成にはより弱いＡＣＧ開始コドン（アミノ酸Ｔ１３８）、および最も豊富なキャプシドメタンタンパク質であるＶＰ３の生成には次に利用可能なＡＴＧコドン（アミノ酸Ｍ２０３）へのリードスルー翻訳が使用される。Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，上記、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９－１９、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。アデノ随伴ウイルスのキャプシドタンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で周知であり、概して、具体的にはデペンドパルボウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）に保存されている。Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい。例えば、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、上記は、図４ＢのＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、およびＡＡＶ６のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３キャプシドタンパク質のアミノ酸配列アラインメントを提供し、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３キャプシドタンパク質の各々の開始部位は、矢印で示され、可変ドメインは枠で囲まれている。したがって、本明細書に提供されているアミノ酸位置は、ＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質に関係して提供され得、さらに明記されない本明細書に提供されているアミノ酸位置は、配列番号１として表される主要な外被タンパク質ＶＰ１のＡＡＶ２配列を指すが、当業者であれば、ＡＡＶのＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質内の同じアミノ酸の位置、および異なるセロタイプのうちのアミノ酸の対応する位置をそれぞれ容易に決定することが可能であろう。加えて、当業者であれば、「キメラキャプシドタンパク質」の形成のために、異なるＡＡＶセロタイプのキャプシドタンパク質間のドメインを交換することが可能であろう。
「キメラＡＡＶキャプシドタンパク質」の生成のための２つのＡＡＶキャプシドタンパク質構築物間のドメイン交換について記載されており、例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ１５（１１）：１９５５－１９６２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。「キメラＡＡＶキャプシドタンパク質」は、アミノ酸配列、例えば、２つ以上の異なるＡＡＶセロタイプ由来のドメインを含み、ＡＡＶ様ウイルスキャプシド／ウイルス粒子を形成することが可能であり、かつ／または形成する、ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。キメラＡＡＶキャプシドタンパク質は、キメラＡＡＶキャプシド遺伝子、例えば、複数の、例えば少なくとも２つの核酸配列を含むヌクレオチドよってコードされ、その複数の各々は、別個のＡＡＶセロタイプのキャプシドタンパク質をコードするキャプシド遺伝子の一部分と同一であり、その複数は一緒に、機能的キメラＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする。特定のＡＡＶセロタイプに関係するキメラキャプシドタンパク質についての参考文献は、キャプシドタンパク質が、そのセロタイプのキャプシドタンパク質由来の１つ以上のドメイン、および異なるセロタイプのキャプシドタンパク質由来の１つ以上のドメインを含むことを示している。例えば、ＡＡＶ２キメラキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２ ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の１つ以上のドメインと、異なるＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の１つ以上のドメインとを含む、キャプシドタンパク質を含む。
「モザイクキャプシド」は、少なくとも２組のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質を含み、その各組は、異なるｃａｐ遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のモザイクキャプシドは、異種エピトープをコードする核酸配列を挿入して遺伝子改変されたｃａｐ遺伝子によってコードされる組換えＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質を含み、標準ｃａｐ遺伝子、例えば組換えＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質と同じＡＡＶセロタイプの野生型ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質をコードする野生型標準ｃａｐ遺伝子、組換えＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質と同一であるが異種エピトープが非存在のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質をコードする標準ｃａｐ遺伝子、組換えＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質と変異（例えば、挿入、置換、欠失）（この変異は、好ましくは、野生型ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質の指向性を減少させる）以外実質的に同じであるＡＡＶセロタイプの野生型ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質をコードする変異野生型標準ｃａｐ遺伝子、によってコードされるＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、標準キャプシドタンパク質は、組換えＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質と同じＡＡＶセロタイプのＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質の少なくとも１つのドメインを含むキメラ標準タンパク質である。いくつかの実施形態では、標準ｃａｐ遺伝子は、キメラＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質をコードする。
「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という語句は、任意の生物体由来の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖配列を含む。重鎖可変ドメインは、別段の規定がない限り、３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域を含む。重鎖の断片は、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにそれらの組み合わせを含む。典型的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端に向かって）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能性断片は、エピトープを特異的に認識する（例えば、マイクロモル、ナノモル、またはピコモル範囲のＫＤを有するエピトープを認識する）ことが可能であり、細胞から発現および分泌可能であり、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片を含む。重鎖可変ドメインは、可変領域ヌクレオチド配列によってコードされ、概して、生殖系細胞に存在するＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントのレパートリー由来の、ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントを含む。様々な生物体のＶ重鎖セグメント、Ｄ重鎖セグメント、およびＪ重鎖セグメントの配列、位置、および命名は、ＩＭＧＴデータベースで見ることができ、これは、インターネットを介してＵＲＬが「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ」の世界的なウェブ（ｗｗｗ）でアクセス可能である。
「重鎖のみの抗体」、「重鎖のみの抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン結合タンパク質」、などの用語は、重鎖定常領域に操作可能に連結されている可変ドメインを含む可変領域を含む免疫グロブリン様鎖を含む単量体またはホモ二量体の免疫グロブリン分子を指し、これは重鎖定常領域が、典型的には機能的ＣＨ１ドメインを欠くために軽鎖と会合不可能である。したがって、「重鎖のみの抗体」、「重鎖のみの抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン結合タンパク質」、などの用語は、（ｉ）機能的ＣＨ１つのドメインを欠く重鎖定常領域に操作可能に連結されている可変ドメインを含む免疫グロブリン様鎖のうちの１つを含む単量体単一ドメイン抗原結合タンパク質、または（ｉｉ）２つの免疫グロブリン様鎖を含み、各々が機能的ＣＨ１ドメインを欠く重鎖定常領域に操作可能に連結されている可変ドメインを含む、ホモ二量体単一ドメイン抗原結合タンパク質、の両方を包含する。様々な態様では、ホモ二量体単一ドメイン抗原結合タンパク質は、２つの同一の免疫グロブリン様鎖を含み、各々が機能的ＣＨ１ドメインを欠く同一の重鎖定常領域に操作可能に連結されている同一の可変ドメインを含む。加えて、単一ドメイン抗原結合タンパク質の各免疫グロブリン様鎖は、可変ドメインを含み、これは、重鎖可変領域遺伝子セグメント（例えば、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ）、軽鎖遺伝子セグメント（例えば、ＶＬ、ＪＬ）、またはそれらの組み合わせに由来し得、重鎖定常領域（および任意選択的にヒンジ領域）の遺伝子の配列、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはそれらの組み合わせをコードするＣＨ１における欠失変異または不活性化変異を含む重鎖定常領域（ＣＨ）遺伝子配列に連結し得る。重鎖遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む単一ドメイン抗原結合タンパク質は、「ＶＨ単一ドメイン抗体」または「ＶＨ単一ドメイン抗体結合タンパク質」と称され得、例えば、米国特許第８，７５４，２８７号、米国特許公開第２０１４／０２８９８７６号、同第２０１５／０１９７５５３号、同第２０１５／０１９７５５４号、同第２０１５／０１９７５５５号、同第２０１５／０１９６０１５号、同第２０１５／０１９７５５６号、同第２０１５／０１９７５５７号（それらの各々は、それらの全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。軽鎖遺伝子セグメント由来の可変ドメインを含む単一ドメイン抗原結合タンパク質は、「ＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質」と称され得、例えば、米国公開第２０１５／０２８９４８９号（その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。
「軽鎖」という語句は、任意の生物体由来の免疫グロブリン軽鎖配列を含み、別段の規定がない限り、代替軽鎖のみならず、ヒトカッパ（κ）軽鎖およびラムダ（λ）軽鎖、ならびにＶｐｒｅＢを含む。軽鎖可変ドメインは、典型的には、別段の規定がない限り、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。概して、完全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含む可変ドメイン、および軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む。軽鎖可変ドメインは、軽鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされ、概して、生殖系細胞に存在する軽鎖ＶおよびＪ遺伝子セグメントのレパートリーに由来する、軽鎖ＶＬおよび軽鎖ＪＬセグメントを含む。様々な生物体の軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ遺伝子セグメントの配列、位置、および命名は、ＩＭＧＴデータベースで見ることができ、これは、インターネットを介してＵＲＬが「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ」の世界的なウェブ（ｗｗｗ）でアクセス可能である。軽鎖は、例えば、軽鎖に現れるエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される第１または第２のエピトープのいずれにも選択的に結合しない軽鎖を含む。軽鎖はまた、軽鎖に現れるエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される１つ以上のエピトープの結合および認識により、重鎖に結合および認識するか、またはこれを補助するものを含む。軽鎖はまた、軽鎖に現れるエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される１つ以上のエピトープの結合および認識により、重鎖に結合および認識するか、またはこれを補助するものを含む。一般的な軽鎖または汎用的な軽鎖は、ヒトＶκ１～３９Ｊκ５遺伝子またはヒトＶκ３～２０Ｊκ１遺伝子由来の軽鎖を含み、それらの体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンを含む。
「操作可能に連結されている」という語句は、本明細書で使用される場合、互いに直接的または間接的に相互作用する、あるいは生物学的事象に関わるように互いに配置される、構成要素または要素の物理的な並置（例えば、三次元的空間における）を含み、この並置は、かかる相互作用および／または配置を達成または可能にする。一例を挙げると、核酸中の制御配列（例えば、発現制御配列）は、コード配列の発現および／または活性に対してその存在または非存在が影響を与えるように、コード配列に位置すると、コード配列に「操作可能に連結されている」と言われる。多くの実施形態では、「操作可能な連結」は、互いに関連する構成要素または要素の共有結合を含む。しかしながら、当業者であれば、いくつかの実施形態では、共有結合は、効果的な操作可能な連結を達成するのに必要ではないことを容易に理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、核酸制御配列が制御するコード配列と操作可能に連結されている核酸制御配列は、対象ヌクレオチドと連続している。代替的にまたは加えて、いくつかの実施形態では、１つ以上のかかる制御配列は、トランスで、または対象のコード配列を制御するための距離で機能する。いくつかの実施形態では、「発現制御配列」という用語は、本明細書で使用される場合、それらが連結されているコード配列の発現および処理に影響を与えるのに必要なおよび／または十分なポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡ処理シグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を向上する配列（例えばコザックコンセンサス配列）、タンパク質安定性を向上する配列、ならびに／またはいくつかの実施形態では、タンパク質分泌を向上する配列であり得るか、あるいはこれらを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の制御配列は、特定の宿主細胞もしくは生物体、またはそれらのタイプで優先的にまたはそれらでのみ活性である。一例を挙げると、原核生物では、制御配列は、典型的には、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、真核生物では、多くの実施形態では、制御配列は、典型的には、プロモーター、エンハンサー、および／または転写終結配列を含む。当業者であれば、多くの実施形態で、「制御配列」という用語は、その存在が発現および処理に不可欠な構成要素を指し、いくつかの実施形態で、その存在が発現に有利である構成要素（例えば、リーダー配列、標的化配列、および／または融合パートナー配列を含む）を含むことをその文脈から理解するであろう。
「組換えキャプシドタンパク質」という用語は、比較研究のための標準ウイルスおよび／または対照ウイルスでありうる野生型ウイルスの対応するキャプシドタンパク質と比較して、少なくとも１つの変異を有するキャプシドタンパク質を含む。組換えキャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質に挿入され得、かつ／またはキャプシドタンパク質によって提示され得る異種エピトープを含む、キャプシドタンパク質を含む。この文脈における「異種」とは、キャプシドタンパク質が由来するウイルスと比較して異種であることを意味する。挿入されるアミノ酸は、キャプシドタンパク質の２つの所与のアミノ酸の間に単に挿入され得る。アミノ酸の挿入はまた、挿入部位におけるキャプシドタンパク質の所与のアミノ酸の欠失を伴う場合があり、例えば、１つ以上のキャプシドタンパク質アミノ酸は、５つ以上の異種アミノ酸によって置換される）。
「多重特異性結合分子」および「二重特異性結合分子」などの用語は、概してかつそれぞれ、少なくとも２つのおよび２つのみの非同一の結合構成要素を含む結合分子を指し、各結合構成要素が、異なるエピトープ－２つの異なる分子（例えば、２つの異なる免疫原上の異なるエピトープ）、または同じ分子（例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ）、のいずれかに特異的に結合する。概して、本明細書において二重特異性結合分子の結合構成要素のうちの１つは、ウイルスキャプシドタンパク質によって提示される異種エピトープに特異的に結合し、第２の結合構成要素は、標的細胞、例えば、Ｔ細胞マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８など）によって主におよび／または優先的に発現されるタンパク質、例えば細胞表面マーカーに特異的である。二重特異性結合分子は、例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する結合構成要素を組み合わせることによって作製され得る。例えば、異なるエピトープを認識する結合構成要素（例えば、軽鎖または重鎖可変配列）をコードする核酸配列は、同じかもしくは異なる重鎖定常領域（複数）、同じかもしくは異なる軽鎖定常領域（複数）、または１つの重鎖定常領域および１つの軽鎖定常領域それぞれをコードする核酸配列に融合され得、かかる配列は、Ｆａｂ構造、ｓｃＦａｂ構造、ダイアボディ構造、ｓｃＦｖ構造、ｓｃＦｖ－Ｆｃ構造、ｓｃＦｖ－ジッパー構造、同属の汎用的な軽鎖を含む典型的な抗体と同様の四量体構造、同属の汎用的な軽鎖を含む典型的な二価抗体を含む四量体構造、および／または重鎖のうちの一方もしくは両方（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端）もしくは軽鎖のうちの一方もしくは両方（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端）に付加されている追加の結合構成要素（例えばｓｃＦＶ、ｓｃＦＶ－ジッパー構造、ｓｃＦａｂなど）と同様のフォーマットの多重特異性抗原結合タンパク質として細胞内に発現され得る。多重特異性、具体的には二重特異性結合分子の様々なフォーマットは周知であり、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎ（２０１７）Ｍａｂｓ ９：１８２－２１２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
例示的な多重特異性分子は、重鎖ＣＤＲ、続いて（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを各々有する２つの重鎖と、エピトープ結合特異性を付与しないが各重鎖と会合することができる免疫グロブリン軽鎖（例えば、一般的な軽鎖）か、または各重鎖と会合することができ重鎖エピトープ結合領域によって結合されるエピトープのうちの１つ以上に結合することができる免疫グロブリン軽鎖か、または各重鎖と会合することができ重鎖のうちの一方もしくは両方をエピトープのうちの一方もしくは両方に結合可能な免疫グロブリン軽鎖のいずれかと、を有する。いくつかの実施形態では、多重特異性結合分子は、（１）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびそれらの組み合わせから選択されるヒトＩｇＧの第１のＣＨ３アミノ酸配列を含む、第１の重鎖定常領域に操作可能に連結されている免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、ならびに（２）免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびそれらの組み合わせから選択されるヒトＩｇＧの第２のＣＨ３アミノ酸配列を含む第２の重鎖定常領域に操作可能に連結されており、第１または第２の重鎖可変ドメイン（同族の軽鎖の有無にかかわらず）が、本明細書に記載の異種エピトープに結合し、他の重鎖可変ドメイン（同族の軽鎖の有無にかかわらず）が、標的細胞上の受容体に結合し、第１の重鎖定常領域が、多重特異性結合タンパク質の容易な単離を提供する様式で、第２の定常鎖領域と会合し、例えば第１および第２の重鎖定常領域が、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）（ＫＩＨ）フォーマットを形成するか、あるいは第２のＣＨ３アミノ酸配列が、第２のＣＨ３アミノ酸配列のプロテインＡへの結合を減少させるかあるいは排除する改変を含む（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，７１３号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、多重特異性結合分子は、（１）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびそれらの組み合わせから選択されるヒトＩｇＧの第１のＣＨ３アミノ酸配列を含む、第１の重鎖定常領域に操作可能に連結されている免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、ならびに（２）免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびそれらの組み合わせから選択されるヒトＩｇＧの第２のＣＨ３アミノ酸配列を含む第２の重鎖定常領域に操作可能に連結されており、第１および第２の重鎖可変ドメイン（同族の軽鎖の有無にかかわらず）が、同じかまたは異なる抗原に結合し、第１または第２の重鎖定常領域が、追加の結合ドメインをさらに含むように改変され（例えば、本明細書に記載の異種エピトープに結合するｓｃＦＶまたはＦｖ、例えば、追加の結合ドメインが、一方または両方の重鎖のＣ末端またはＮ末端に付加されている）、第１の重鎖定常領域が、多重特異性結合タンパク質の容易な単離を提供する様式で、第２の定常鎖領域と会合し、例えば第１および第２の重鎖定常領域が、ノブイントゥホール（ＫＩＨ）フォーマットを形成するか、あるいは第２のＣＨ３アミノ酸配列が、第２のＣＨ３アミノ酸配列のプロテインＡへの結合を減少させるかあるいは排除する改変を含む。第２のＣＨ３アミノ酸配列が減少または排除されたプロテインＡへの結合を含むいくつかの実施形態では、第２のＣＨ３アミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる、ＥＵナンバリングではＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第２のＣＨ３アミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴエクソン番号による、ＥＵではＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第２のＣＨ３アミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソンナンバリング、ＥＵナンバリングではＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴエクソンナンバリング、ＥＵではＨ４３６Ｆ）の両方を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３アミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１由来であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３アミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２由来であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３アミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４由来であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域アミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上述の改変の種類のうちのいずれか１つ以上を含む。
さまざまな実施形態では、Ｆｃドメインは、変更されたＦｃ受容体結合を有するように改変され、その結果エフェクター機能に影響を与える。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインを含む作製された重鎖定常領域（ＣＨ）は、キメラである。このように、キメラＣＨ領域は、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプに由来するＣＨドメインを組み合わせる。例えば、キメラＣＨ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部またはすべてと組み合わせられた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部またはすべてを含む。いくつかの実施形態では、キメラＣＨ領域は、キメラヒンジ領域を含有する。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵナンバリングによる位置２１６～２２７のアミノ酸残基、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置２２６～２４０のアミノ酸残基）と、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵナンバリングによる位置２２８～２３６のアミノ酸残基、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置２４１～２４９のアミノ酸位置）との組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトＩｇＧ２下部ヒンジに由来するアミノ酸残基とを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ含有タンパク質（例えば、抗体）の所望の薬物動態特性に影響を与えることなく、正常なＦｃエフェクター機能のうちのすべて、一部を活性化するように、あるいはいずれをも活性化しないように作製され得る。キメラＣＨ領域を含み、変更されたエフェクター機能を有するタンパク質の例については、その全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／０２２５４０を参照されたい。
「標的細胞」という用語は、対象ヌクレオチドの発現が望ましい任意の細胞を含む。好ましくは、標的細胞は、以下に記載のように、再標的化リガンドを用いて細胞を標的化することを可能にするタンパク質、例えば受容体をそれらの表面上に呈する。標的化されたタンパク質、例えば、受容体は、標的細胞に特異的である、例えば「細胞特異性マーカー」、「細胞特異性抗原」などであることが好ましい。「細胞特異性マーカー」、「細胞特異抗原」、「器官特異性マーカー」、「組織特異性マーカー」、などの用語は、細胞、組織、および／または器官の特異性マーカーである、その発現が細胞、組織、および／または器官によって濃縮されたそれらのタンパク質を含む。タンパク質発現の文脈での「濃縮された」とは、主に、優先的に、または単にそのタンパク質が特異性マーカーである細胞／組織／器官による、細胞／組織／器官に特異的なタンパク質の発現または過剰発現を指しかつ含むが、かかるマーカーは、他の細胞／組織／または器官によっても最小限レベルで発現され得る。Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓは、タンパク質が細胞／組織／器官特異性マーカーであるかどうかを決定ために使用することができ、細胞／組織／器官特異的タンパク質のリポジトリも提供する。（参照ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ、また参照Ｕｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１２４８－５０（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
「形質導入」または「感染」などの用語は、ウイルスベクターによる標的細胞への核酸の導入を指す。形質導入などに関係する効率、例えば、「形質導入効率」という用語は、対象ヌクレオチドを含むウイルスベクターの組数との培養後に、対象ヌクレオチドを発現する細胞の画分（例えば、パーセンテージ）を指す。形質導入効率を決定する周知の方法は、蛍光レポーター遺伝子を用いて形質導入された細胞の蛍光活性化セルソーティング、対象ヌクレオチドの発現用のＰＣＲなどを含む。
「野生型」という用語は、本明細書で使用される場合、（変異体、病気、変更などに対して）「正常」な状態または状況で自然界に見られる構造および／または活性を有する実在物を含む。当業者であれば、野生型ウイルスベクター、例えば、野生型キャプシドタンパク質が、比較研究における標準ウイルスベクターとして使用され得ることを理解するであろう。概して、標準ウイルスキャプシドタンパク質／キャプシド／ベクターは、効果が試験される変化以外、試験ウイルスキャプシドタンパク質／キャプシド／ベクターと同一である。例えば、試験ウイルスベクターに異種エピトープを挿入する効果、例えば形質導入効率を決定するために、（適切な多重特異性結合分子の非存在下または存在下での）試験ウイルスベクターの形質導入効率は、異種エピトープの存在を除き、すべての場合（例えば、追加の変異、対象ヌクレオチド、ウイルスベクターおよび標的細胞の数など）で試験ウイルスベクターと同一である標準ウイルスベクターの形質導入効率と（必要であれば適切な多重特異性結合分子の非存在下または存在下で）比較することができる。
組換えウイルスキャプシドタンパク質およびウイルスベクター、ならびに核酸
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ａｄキャプシドタンパク質、例えば、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ６、およびＡｄ７からなる群から選択されるＡｄセロタイプのキャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ａｄ２キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ａｄ５キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＡｄウイルスキャプシドタンパク質は、ファイバータンパク質ドメイン中に、例えば、ファイバータンパク質、ファイバーノブ、および／またはファイバーノブのＨＩループのカルボキシ末端に、異種エピトープを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド遺伝子に由来し、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択されるＡＡＶセロタイプの遺伝子改変キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシド遺伝子、ＡＡＶ６キャプシド遺伝子、ＡＡＶ８キャプシド遺伝子、またはＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、その野生型のアミノ酸配列は、配列番号１としてそれぞれ表される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ８キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ８ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、その野生型のアミノ酸配列は、配列番号２１として表される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、その野生型のアミノ酸配列は、配列番号５としてそれぞれ表される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ６キャプシド遺伝子に由来し、例えば、ＡＡＶ６の遺伝子改変ＶＰ１キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のＩ－４５３に挿入されている。
概して、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、異種エピトープがキャプシドタンパク質またはそれを含むキャプシドの天然指向性を減少させ、かつ／または無効にするように、キャプシドタンパク質に挿入され、かつ／またはキャプシドタンパク質によって提示される異種エピトープを含む。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、野生型標準キャプシドタンパク質の天然指向性に関与するキャプシドタンパク質の領域、例えば、細胞受容体に関与するキャプシドタンパク質の領域に、挿入されている。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、Ａｄファイバータンパク質のノブドメインに挿入され、かつ／またはノブドメインによって提示されている。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、Ａｄファイバータンパク質のＨＩループに挿入され、かつ／またはＨＩループによって提示されている。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１のＧ４５３、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１のＮ５８７、ＡＡＶ６キャプシドタンパク質ＶＰ１のＱ５８５、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１のＧ４５３、およびＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１のＡ５８９からなる群から選択されるアミノ酸位置の後に挿入されている。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドのアミノ酸Ｎ５８７とＲ５８８との間に挿入され、かつ／またはそこに提示されている。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号４として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２５として表される核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２６として表される核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２７として表される核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。ＡＡＶ２を使用することによって同定される追加の好適な挿入部位は、当該技術分野で周知であり（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８６３５－８６４７）、Ｉ－１、Ｉ－３４、Ｉ－１３８、Ｉ－１３９、Ｉ－１６１、Ｉ－２６１、Ｉ－２６６、Ｉ－３８１、Ｉ－４４７、Ｉ－４４８、Ｉ－４５９、Ｉ－４７１、Ｉ－５２０、Ｉ－５３４、Ｉ－５７０、Ｉ－５７３、Ｉ－５８４、Ｉ－５８７、Ｉ－５８８、Ｉ－５９１、Ｉ－６５７、Ｉ－６６４、Ｉ－７１３、およびＩ－７１６を含む。本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ｉ－１、Ｉ－３４、Ｉ－１３８、Ｉ－１３９、Ｉ－１６１、Ｉ－２６１、Ｉ－２６６、Ｉ－３８１、Ｉ－４４７、Ｉ－４４８、Ｉ－４５９、Ｉ－４７１、Ｉ－５２０、Ｉ－５３４、Ｉ－５７０、Ｉ－５７３、Ｉ－５８４、Ｉ－５８７、Ｉ－５８８、Ｉ－５９１、Ｉ－６５７、Ｉ－６６４、Ｉ－７１３、Ｉ－７１６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に挿入される特異性エピトープを含む、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質であり得る。追加のＡＡＶセロタイプを使用することにより同定される追加の好適な挿入部位は、周知であり、Ｉ－５８７（ＡＡＶ１）、Ｉ－５８９（ＡＡＶ１）、Ｉ－５８５（ＡＡＶ３）、Ｉ－５８５（ＡＡＶ４）、およびＩ－５８５（ＡＡＶ５）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ｉ－５８７（ＡＡＶ１）、Ｉ－５８９（ＡＡＶ１）、Ｉ－５８５（ＡＡＶ３）、Ｉ－５８５（ＡＡＶ４）、Ｉ－５８５（ＡＡＶ５）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に挿入される異種エピトープを含む、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質であり得る。
本明細書で使用される命名Ｉ－＃＃＃は、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＶＰ１タンパク質に対するアミノ酸数を＃＃＃に命名する挿入部位を指すが、かかる挿入は、直接Ｎ末端もしくはＣ末端に、好ましくは所与のアミノ酸のうちの５つのアミノ酸の配列中のＮ末端またはＣ末端のうちの１つのアミノ酸のＣ末端に、好ましくは３つ、より好ましくは２つ、特に１つのアミノ酸（複数可）のＮ末端またはＣ末端に位置し得る。加えて、本明細書で言及される位置は、ＡＡＶキャプシド遺伝子によってコードされるＶＰ１タンパク質に対するものであり、対応する位置（およびその変異）は、標準ＡＡＶキャプシド遺伝子によってコードされるＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質の配列アラインメントを実施することによって、キャプシド遺伝子によってコードされるＶＰ２およびＶＰ３キャプシドタンパク質を容易に同定することができる。
したがって、キャプシドタンパク質がコードされる際に、開始コドンをずらした同じ遺伝子のリーディングフレームを重ねることによって、ｃａｐ遺伝子のこれらの部位のうちの１つをコードする核酸の対応する位置への挿入は、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３への挿入につながる。したがって、例えば、ＡＡＶ２では、この命名によると、アミノ酸１～１３８の挿入はＶＰ１にのみ挿入され、１３８～２０３の挿入は、ＶＰ１およびＶＰ２に挿入され、２０３～Ｃ末端の挿入は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３に挿入され、これは当然のことながら、挿入部位Ｉ－５８７についても当てはまる。したがって、本発明は、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質における対応する挿入を有するＡＡＶの構造遺伝子を包含する。
加えて、密接に関連するファミリーメンバーのうちの、少なくとも広範囲の大部分のメンバーが高度に保存されていることに起因して、列挙されているＡＡＶ以外のＡＡＶへの対応する挿入部位は、アミノ酸アラインメントを実施することによって、またはキャプシド構造の比較によって同定することができる。例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９～１９、および異なるＡＡＶキャプシドタンパク質の例示的なアラインメントでは米国特許第９，６２４，２７４号を参照されたい。
（例えば、多重特異性結合分子の非存在下での）組換えウイルスキャプシドからなる本明細書に開示のいくつかの組成物では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ｉ５８７部位に異種エピトープを挿入されているＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１であり、異種エピトープは、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフ、ＮＧＲモチーフ、またはｃ－ｍｙｃを含まない。（例えば、多重特異性結合分子の非存在下での）組換えウイルスキャプシドからなる本明細書に開示のいくつかの組成物では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ｔ４４８とＮ４４９との間に異種エピトープを挿入されているＶＰ１キャプシドタンパク質であり、異種エピトープはｃ－ｍｙｃを含まない。（例えば、多重特異性結合分子の非存在下での）組換えウイルスキャプシドからなる本明細書に開示のいくつかの組成物では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ｉ－４４７部位に異種エピトープを挿入されているＶＰ１キャプシドタンパク質であり、異種エピトープは、Ｌ１４またはＨＡを含まない。
（例えば、多重特異性結合分子をさらに含む）組換えウイルスキャプシドを含むいくつかの組成物では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ｉ５８７部位に異種エピトープを挿入されているＶＰ１キャプシドタンパク質であり、異種エピトープは、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフ、ＮＧＲモチーフ、またはｃ－ｍｙｃを含む。（例えば、多重特異性結合分子をさらに含む）組換えウイルスキャプシドを含む本明細書に開示のいくつかの組成物では、ウイルスキャプシドは、ＶＰ１キャプシドであり、異種エピトープはｃ－ｍｙｃを含み、異種エピトープは、Ｔ４４８とＮ４４９との間、またはＮ５８７とＲ５８８との間に挿入されている。（例えば、多重特異性結合分子をさらに含む）組換えウイルスキャプシドを含む本明細書に開示のいくつかの組成物では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ｉ－４４７部位に異種エピトープを挿入されているＶＰ１キャプシドタンパク質であり、異種エピトープは、Ｌ１４またはＨＡを含む。（例えば、多重特異性結合分子の存在下での）組換えウイルスキャプシドを含む本明細書に開示のいくつかの組成物では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ｔ４４８とＮ４４９との間に異種エピトープを挿入されているＶＰ１キャプシドタンパク質であり、異種エピトープはｃ－ｍｙｃを含む。米国特許第９，６２４，２７４号は、異種エピトープの好適な挿入部位としてのＡＡＶキャプシドタンパク質のＩ－４５３について記載している。
いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を無効化し、例えば、野生型標準ウイルスベクターおよび／または標的細胞による感染に対して天然に許容状態である細胞の形質導入は、適切な多重特異性結合分子の非存在下では検出不能である。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、例えば、野生型標準ウイルスベクターによる感染に対して天然に許容状態である細胞の形質導入と比較して、ウイルスベクターの天然指向性を減少させる。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも５％減少させる。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも５％減少させる。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも１０％減少させる。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも２０％減少させる。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも３０％減少させる。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも４０％減少させる。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも５０％減少させる。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも６０％減少させる。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも７０％減少させる。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも８０％減少させる。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも９０％減少させる。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも９５％減少させる。いくつかの実施形態では、異種エピトープの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも９０％減少させる。異種エピトープの挿入（提示）が、組換えウイルスキャプシドの天然指向性を無効化しないこれらの実施形態では、かかる組換えウイルスキャプシドの天然指向性は、第２の異なる変異によって無効化され得る。例えば、一実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し得、異種エピトープを含み、変異、例えばＷ５０３Ａ変異をさらに含み得る。
特に、ウイルスベクターの全身投与対局所的または局所領域的投与が意図されている場合、天然宿主細胞によるウイルスベクターの取り込みによって、ウイルスベクターの有効用量が制限されるため、ウイルスをその天然宿主細胞から非標的化することは重要である。ＡＡＶ２およびＡＡＶ６の場合、ＨＳＰＧは、多数の細胞、特に肝細胞におけるウイルス取り込みのための主な受容体であると報告されている。ＡＡＶ２については、ＨＳＰＧ結合活性は、５つの基本アミノ酸、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｒ５８５、Ｒ５８８、およびＫ５３２の群に依存している（Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７７（２０）：１１０７２－８１）。近年、リシンからグルタミン酸へのアミノ酸置換Ｋ５３１Ｅは、ヘパリンまたはＨＳＰＧに結合するＡＡＶ６の能力の抑制につながると報告された（（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．、２００６）Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８０（２２）：１１３９３－１１３９７）。したがって、好ましい点変異は、天然受容体によって媒介される所与の標的細胞へのウイルスベクターの形質導入活性を、ＨＳＰＧが主な受容体である場合ウイルスベクターのＨＳＰＧへの結合を、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９５％減少させるものである。
結果として、ＨＳＰＧ結合ウイルスベクターに好ましいさらなる変異は、それぞれのウイルスのＨＳＰＧ結合に関与する、Ｒ、Ｋ、またはＨ、好ましくはＲまたはＫなどの塩基性アミノ酸を、なくすか、あるいはＡ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、およびＴなどの非塩基性アミノ酸、好ましくはＡ、または異なるが高度に保存されている、この位置のかかる塩基性アミノ酸を欠くＡＡＶセロタイプの対応する位置に存在するアミノ酸によって置き換える変異である。結果として、好ましいアミノ酸置換は、Ｒ４８４Ａ、Ｒ４８７Ａ、Ｒ４８７Ｇ、Ｋ５３２Ａ、Ｋ５３２Ｄ、Ｒ５８５Ａ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８５Ｑ、Ｒ５８５Ａ、またはＲ５８８Ｔ、特にＡＡＶ２ではＲ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａ、ならびにＡＡＶ６ではＫ５３１ＡまたはＫ５３１Ｅである。本発明の特に好ましい一実施形態は、２つの点変異Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを追加で含有する、かかるＡＡＶ２のキャプシドタンパク質変異であり、これらの２つの点変異は、大幅にＨＳＰＧ結合活性を削除するのに十分である。これらの点変異は、標的化目的では、ＨＳＰＧ発現細胞からの効率的な非標的化を可能にし、その新しい標的細胞へのそれぞれの変異体ウイルスの特異性を増加させる。
本発明の一実施形態は、本発明の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む多量体構造である。多量体構造は、本明細書に記載の異種エピトープを含む、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも３０個、最も好ましくは少なくとも６０個の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む。それらは、普通のウイルスキャプシド（空のウイルス粒子）、またはウイルスベクター（対象ヌクレオチドを封入するキャプシド）を形成することができる。ウイルスゲノムをパッケージングすることが可能なウイルスベクターの形成は、本明細書にウイルスベクターとして記載の組換えウイルスキャプシドの使用に非常に好ましい特色である。
本発明の一実施形態は、上述のキャプシドタンパク質をコードする核酸である。好ましくは、核酸は、特許請求の範囲の核酸配列を含むベクターである。核酸、特にベクターは、本発明のキャプシドタンパク質を組換え発現するために必要である。
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つの組換えウイルスキャプシドタンパク質および／またはそれをコードする核酸の使用、好ましくは遺伝子伝達ベクター（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ）として製造および使用するための少なくとも１つの多量体構造（例えば、ウイルスベクター）である。
異種エピトープ
概して、組換えウイルスキャプシドタンパク質および／または組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクターは、例えば多重特異性結合分子を介したウイルスベクターの再標的化を可能にする異種エピトープを含む。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、Ｂ細胞エピトープであり、例えば、約１アミノ酸長～約３５アミノ酸長であり、抗体パラトープ、例えば、免疫グロブリン可変ドメインと結合対を形成する。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、親和性タグを含む。
多数のタグが、当該技術分野で既知である。（例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｕｓｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １１：１－１６、Ｔｅｒｐｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｉｏｎｓ：Ｆｒｏｍ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｔｏ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６０：５２３－５３３、および参考文献を参照されたい）。親和性タグとしては、限定されないが、固定化二価カチオン（例えば、Ｎｉ２＋）に結合するポリヒスチジンタグ（例えば、Ｈｉｓ－６、Ｈｉｓ－８、またはＨｉｓ－１０タグ）、（例えば、生体内でビオチン化ポリペプチド配列上の）固定化アビジンに結合するビオチン部分、固定化グルタチオンに結合するＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）配列、固定化Ｓタンパク質に結合するＳタグ、固定化抗体もしくはドメインまたはそれらの断片に結合する抗原（例えば、対応する抗体に結合するＴ７、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、およびＢタグを含む）、ＦＬＡＳＨタグ（特定のヒ素系部分に連結する高親和性タグ）、固定化リガンドに結合する受容体または受容体ドメイン（またはその逆）、固定化ＩｇＧに結合するプロテインＡまたはその誘導体（例えばＺ）、固定化アミロースに結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、固定化アルブミンに結合するアルブミン結合タンパク質、固定化キチンに結合するキチン結合ドメイン、固定化カルモジュリンに結合するカルモジュリン結合ペプチド、および固定化セルロースに結合するセルロース結合ドメイン、が挙げられる。別の例示的なタグは、Ｃｏｖａｌｙｓから市販されているＳＮＡＰ－タグである（ｗｗｗ．ｃｏｖａｌｙｓ．ｃｏｍ）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の異種エピトープは、抗体パラトープによってのみ認識される親和性タグを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の異種エピトープは、抗体パラトープおよび他の特異的結合対によって認識される親和性タグを含む。
いくつかの実施形態では、異種エピトープおよび／または親和性タグは、免疫グロブリン定常ドメインと結合対を形成しない。いくつかの実施形態では、異種エピトープおよび／または親和性タグは、金属イオン、例えばＮｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋などと結合対を形成しない。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ストレプトアビジン、ＳｔｒｅｐＩＩ、ＨＡ、Ｌ１４、４Ｃ－ＲＧＤ、ＬＨ、およびプロテインＡからなる群から選択されるポリペプチドではない。
いくつかの実施形態では、親和性タグは、ＦＬＡＧ（配列番号７）、ＨＡ（配列番号８）、およびｃ－ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号６）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、ｃ－ｍｙｃである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ ＶＰ１キャプシドタンパク質の少なくとも５つの連続アミノ酸に隣接し、かつ／または操作可能に連結されているアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え不可欠キャプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質の少なくとも５つの連続アミノ酸に隣接し、かつ／または操作可能に連結されているアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＮ５８７とＲ５８８との間に挿入されているＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、配列番号２として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、配列番号４として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２５として表される核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２６として表される核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２７として表される核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、異種エピトープは、親和性タグおよび１つ以上のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、異種エピトープは、リンカーが隣接する親和性タグを含み、例えば、異種エピトープは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のリンカー、親和性タグ、および第２のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、各々独立して、少なくとも１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、同一である。
概して、本明細書に記載の異種エピトープ、例えば、親和性タグ自体、または１つ以上のリンカーと組み合わせた親和性タグは、約５アミノ酸長～約３５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、少なくとも５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、１１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、１２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、１３アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、１４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、１５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、１６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、１７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、１８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、１９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、２０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、２１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、２２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、２３アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、２４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、２５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、２６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、２７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、２８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、２９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、３０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、３１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、３２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、３３アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、３４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種エピトープ（それ自体、または１つ以上のリンカーとの組み合わせ）は、３５アミノ酸長である。
再標的化部分
本明細書に記載のウイルスベクターは、多重特異性結合分子、具体的には（ｉ）エピトープに特異的に結合する抗体パラトープと、（ｉｉ）（例えば精製のための）ビーズの表面にコンジュゲートされ得る、または標的細胞によって発現され得る受容体に特異的に結合する再標的化リガンドと、を含む多重特異性結合分子の不在下で、形質導入能力を減少または無効化している。したがって、（ｉ）エピトープに特異的に結合する抗体パラトープと、（ｉｉ）受容体に特異的に結合する再標的化リガンドと、を含む多重特異性結合分子は、ウイルスベクターを再標的化する。かかる「再標的化」または「再配向」は、野生型ウイルスベクターが組織内および／または生物体内のいくつかの器官内のいくつかの細胞を標的化し、異種エピトープの挿入により、組織または器官を幅広く標的化することが減少または無効化され、生物体内の組織またはより具体的な器官のより具体的な細胞に再標的化することが、多重特異性結合分子を用いて達成される、シナリオを含み得る。かかる再標的化または再配向はまた、野生型ウイルスベクターが組織を標的化し、異種エピトープの挿入により、組織の標的化が減少または無効化され、完全に異なる組織に再標的化することが、多重特異性結合分子を用いて達成される、シナリオを含み得る。本明細書に記載の抗体パラトープは、概して、異種エピトープを特異的に認識する相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３領域を最小限で含む。いくつかの実施形態では、多重特異性結合分子は、異種エピトープに特異的結合する抗体パラトープを含む抗体（またはその一部分）を含む。例えば、多重特異性結合分子は、単一ドメイン重鎖可変領域または単一ドメイン軽鎖可変領域を含み得、単一ドメイン重鎖可変領域または単一ドメイン軽鎖可変領域は、異種エピトープに特異的結合する抗体パラトープを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性結合分子は、Ｆｖ領域を含み得、例えば、多重特異性結合分子は、異種エピトープに特異的結合する抗体パラトープを含む、ｓｃＦｖを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合分子は、ｃ－ｍｙｃに特異的に結合する抗体パラトープを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合分子は、ｃ－ｍｙｃに特異的に結合する抗体パラトープを含み、パラトープは、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖可変ドメイン、ならびに／または配列番号２８として表される核酸配列によってコードされるＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列の組、例えば配列番号３７として表されるアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合分子は、配列番号２８として表される核酸配列によってコードされるＦｖまたはｓＣｆｖを含む。
したがって、本発明は、ｃ－ｍｙｃに特異的に結合する抗体として、抗体の抗原結合断片、および多重特異性結合タンパク質を含み、抗体、抗体の断片、および多重特異性結合タンパク質が、配列番号２９を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および配列番号３０を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含むパラトープを含む。本発明はまた、ｃ－Ｍｙｃに特異的に結合するパラトープを含む、抗体、抗体の抗原結合断片、および／または多重特異性結合タンパク質を含み、パラトープが、配列番号３１を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号３２を含むＨＣＤＲ２、配列番号３３を含むＨＣＤＲ３、配列番号３４を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号３５を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３６を含むＬＣＤＲ３を含む。
本発明は、配列番号２９として表されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含むＨＣＶＲを含むパラトープを含む、抗体、その抗原結合断片、および／または多重特異性結合タンパク質を提供する。
本発明は、配列番号３０として表されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含むＬＣＶＲを含むパラトープを含む、抗体、その抗原結合断片、および／または多重特異性結合タンパク質を提供する。
本発明は、配列番号３０として表されるＬＣＶＲアミノ酸配列と対をなす配列番号２９として表されるＨＣＶＲアミノ酸配列を含む、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を含むパラトープを含む、抗体、その抗原結合断片、および／または多重特異性結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２９／３０からなる群から選択される。
本発明は、配列番号３１として表されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含むパラトープを含む、抗体、その抗原結合断片、および／または多重特異性結合タンパク質を提供する。
本発明は、配列番号３２として表されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含むパラトープを含む、抗体、その抗原結合断片、および／または多重特異性結合タンパク質を提供する。
本発明は、配列番号３３として表されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含むパラトープを含む、抗体、その抗原結合断片、および／または多重特異性結合タンパク質を提供する。
本発明は、配列番号３４として表されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含むパラトープを含む、抗体、その抗原結合断片、および／または多重特異性結合タンパク質を提供する。
本発明は、配列番号３５として表されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含むパラトープを含む、抗体、その抗原結合断片、および／または多重特異性結合タンパク質を提供する。
本発明は、配列番号３６として表されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含むパラトープを含む、抗体、その抗原結合断片、および／または多重特異性結合タンパク質を提供する。
本発明は、配列番号３６として表されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列と対をなす配列番号３３として表されるＨＣＤＲ３アミノ酸を含む、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列対を含むパラトープを含む、抗体、その抗原結合断片、および／または多重特異性結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号３３／３６として表される。
本発明は、配列番号２８として表されるヌクレオチド配列によってコードされる６つのＣＤＲの組（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含むパラトープを含む、抗体、その抗原結合断片、および／または多重特異性結合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列組は、配列番号３１－３２－３３－３４－３５－３６として表される。
関連する実施形態では、本発明は、配列番号２９／３０として表されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含有される６つのＣＤＲの組（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含むパラトープを含む、抗体、その抗原結合断片、および／または多重特異性結合タンパク質を提供する。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技法は当該技術分野で周知であり、本明細書に開示の特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用することができる例示的な慣習としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が挙げられる。一般的な条件では、Ｋａｂａｔ定義は配列変動性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ手法との間の折衷物である。例えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）、およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照されたい。パブリックデータベースもまた、抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
本発明はまた、抗ｍｙｃ抗体またはその部分をコードする核酸分子を提供する。
本明細書に記載の多重特異性結合分子は、組換えウイルスキャプシドタンパク質に挿入／提示されている異種エピトープに特異的結合するパラトープ（例えば、抗体またはその一部分）に加えて、再標的化リガンドをさらに含む。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、細胞の表面上に発現されるタンパク質、例えば、（ヒト）真核細胞（例えば標的細胞）上の細胞表面タンパク質に結合する。再標的化リガンドによって標的化され得る、細胞表面タンパク質、例えば好適な細胞表面受容体は多数存在し、そのための再標的化リガンド、例えば抗体またはそれらの一部分が既に利用可能である。かかる構造としては、クラスＩおよびクラスＩＩの主要組織適合性抗原、多様なサイトカインの受容体（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－２２、ＩＬ－２５、ＩＬ－３３などの受容体）、細胞型特異性成長ホルモン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＴＮＦ）、コロニー刺激成長因子、内皮増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経膠由来神経栄養因子、グリア細胞増殖因子、ｇｒｏ－ベータ／ｍｉｐ ２、肝細胞増殖因子、インスリン様成長因子、インターフェロン（α－ＩＦＮ、β－ＩＦＮ、γＩＦＮ、コンセンサスＩＦＮ）、インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４）、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、マクロファージ／単球走化性活性化因子、神経成長因子、好中球活性化タンパク質２、血小板由来増殖因子、幹細胞因子、形質転換増殖因子、腫瘍壊死因子、血管内皮成長因子、リポタンパク質（ＰＲＬＲなどのさらなるまたは他のタイプ１膜貫通受容体、ＧＣＧＲなどのＧ－タンパク質結合受容体、Ｎａｖ１．７、ＡＳＩＣ１、またはＡＳＩＣ２などのイオンチャネルを含む）、細胞接着分子、アミノ酸などの代謝物質の輸送分子、Ｂリンパ球またはＴリンパ球の光源受容体（例えば、Ｂ細胞受容体および関連するタンパク質（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０など）、ならびにＴ細胞受容体および関連するタンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８など）、テトラスパニンタンパク質（例えば、ＣＤ６３）が含まれるがこれらに限定されない。本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ウイルスベクター複合体の標的として分化細胞表面抗原に結合する再標的化リガンドを含む多重特異性結合分子を用いることによって、細胞型の特異的感染を可能にする。
いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）肝細胞によって（例えば単独で）主に発現されるタンパク質、すなわち肝臓特異性マーカーに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）脳細胞によって（例えば単独で）主に発現されるタンパク質、脳細胞特異性マーカーに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）造血細胞によって（例えば単独で）主に発現されるタンパク質、すなわち造血細胞特異性マーカーに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）Ｔ細胞によって（例えば単独で）主に発現されるタンパク質、すなわちＴ細胞特異性マーカーに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）Ｂ細胞によって（例えば単独で）主に発現されるタンパク質、すなわち、Ｂ細胞特異性マーカーに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）樹状細胞によって（例えば単独で）主に発現されるタンパク質、すなわち樹状細胞特異性マーカーに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）マクロファージによって（例えば単独で）主に発現されるタンパク質、すなわちマクロファージ特異性マーカーに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）ＮＫ細胞によって（例えば単独で）主に発現されるタンパク質、すなわちＮＫ細胞特異性マーカーに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）腎肝細胞によって（例えば単独で）主に発現されるタンパク質、すなわち腎臓特異性マーカーに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）膵肝細胞によって（例えば単独で）主に発現されるタンパク質、すなわち膵臓特異性マーカーに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）腸細胞によって（例えば単独で）主に発現されるタンパク質、すなわち腸特異性マーカーに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）癌細胞、すなわち腫瘍関連抗原（例えば単独で）によって主に発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、主に異種病原体に感染している（ヒト）細胞（例えば単独で）によって発現されるタンパク質に結合する。（１）細胞／組織／器官によって特異的に発現されるか、またはその発現が細胞／組織／器官中に濃縮され、（２）本明細書に記載の再標的化リガンドとして有用な抗原結合タンパク質によって認識される、タンパク質は周知であり、ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇでも見ることができ、またＵｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１２４８－５０（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））を参照されたい。以下の表１は、再標的化リガンドとして有用であり得る抗原結合タンパク質に利用可能である例示的かつ非限定的な器官特異性マーカー、およびかかるマーカーを発現する細胞／組織／器官を提供している。
いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）肝細胞によって発現される受容体、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体、例えば、ｈＡＳＧＲ１に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）脳細胞によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）Ｔ細胞によって発現される受容体、例えば、ＣＤ３、例えば、ＣＤ３εに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）腎細胞によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）筋細胞によって発現される受容体、例えばインテグリンなどに結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、（ヒト）がん細胞によって発現される受容体、例えば腫瘍関連抗原、例えば、Ｅ６およびＥ７に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧＣＧＲ）に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、ヒトＥＮＴＰＤ３に結合する。
いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、腫瘍細胞によって発現される腫瘍関連抗原に結合する。特異的な腫瘍関連抗原の非限定的な例としては、例えば、アジポフィリン、ＡＩＭ－２、ＡＬＤＨ１Ａ１、アルファ－アクチン－４、アルファ－フェトタンパク質（「ＡＦＰ」）、ＡＲＴＣ１、Ｂ－ＲＡＦ、ＢＡＧＥ－１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合タンパク質ｂ３ａ２、ベータ－カテニン、ＢＩＮＧ－４、ＣＡ－１２５、ＣＡＬＣＡ、癌胎児性抗原（“ＣＥＡ”）、ＣＡＳＰ－５、ＣＡＳＰ－８、ＣＤ２７４、ＣＤ４５、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ－１、ＣＰＳＦ、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＣＴＡＧ１、ＣＴＡＧ２、サイクリンＤ１、サイクリン－Ａ１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＤＫＫ１、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、上皮癌抗原（“ＥＴＡ”）、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１融合タンパク質、ＥＺＨ２、Ｅ６、Ｅ７、ＦＧＦ５、ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＦＮ１、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＧＡＧＥ－１，２，８、ＧＡＧＥ－３，４，５，６，７、ＧＡＳ７、グリピカン－３、ＧｎＴＶ、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、ヘプシン、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＨＬＡ－Ａ１１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ｈｓｐ７０－２、ＩＤＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２、腸カルボキシルエステラーゼ、Ｋ－ｒａｓ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、ＫＫ－ＬＣ－１、ＫＫＬＣ１、ＫＭ－ＨＮ－１、ＣＣＤＣ１１０としても知られているＫＭＨＮ１、ＬＡＧＥ－１、ＬＤＬＲ－フコシルトランフエェラーゼＡＳ融合タンパク質、Ｌｅｎｇｓｉｎ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、リンゴ酸酵素、マンマグロビン－Ａ、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＣ１Ｒ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ－２、ＭＥ１、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、Ｍｅｌｏｅ、ミッドカイン、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ムチン、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシン、ミオシンクラスＩ、Ｎ－ｒａｗ、ＮＡ８８－Ａ、ｎｅｏ－ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－２、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ－９、Ｐポリペプチド、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ｐｍｌ－ＲＡＲアルファ融合タンパク質、多型上皮ムチン（“ＰＥＭ”）、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３８／ＮＹ－ＭＥＬ－１、ＲＡＧＥ－１、ＲＢＡＦ６００、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＧＥ、セクレニン１、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＯＸ１０、Ｓｐ１７、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ－２、ＳＳＸ－４、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＳＹＴ－ＳＳＸ１または－ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡＧ－１、ＴＡＧ－２、テロメラーゼ、ＴＧＦ－ベータＲＩＩ、ＴＰＢＧ、ＴＲＡＧ－３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ－１／ｇｐ７５、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ２－ＩＮＴ２、チロシナーゼ、チロシナーゼ（“ＴＹＲ”）、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＸＡＧＥ－ｌｂ／ＧＡＧＥＤ２ａ、Ｋｒａｓ、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＨＰＶ Ｅ２、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＷＴ－１抗原（リンパ腫および他の固形癌における）、ＥｒｂＢ受容体、メランＡ［ＭＡＲＴ１］、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１／ｇｐ７５、およびＴＲＰ－２（黒色腫における）；ＭＡＧＥ－１およびＭＡＧＥ－３（膀胱、頭頚部、および非小細胞癌腫における）；ＨＰＶ ＥＧおよびＥ７タンパク質（子宮頸癌における）；ムチン［ＭＵＣ－１］（乳癌、膵癌、結腸癌、および前立腺癌における）；前立腺特異性抗原［ＰＳＡ］（前立腺癌における）；癌胎児性抗原［ＣＥＡ］（大腸癌、乳癌、および消化器癌における）、ならびにＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－６、ＭＡＧＥ－１０、ＭＡＧＥ－１２、ＢＡＧＥ－１、ＣＡＧＥ－１，２，８、ＣＡＧＥ－３ ＴＯ ７、ＬＡＧＥ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－２、ＮＡ－８８、ＧｎＴＶ、ＴＲＰ２－ＩＮＴ２としてかかる共有腫瘍特異性抗原に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＥｒＢｂ２／Ｈｅｒ２である。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、Ｅ６および／またはＥ７である。
いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、免疫応答に関連するＣＤマーカー、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０などに結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤマーカーは、ＣＤ３である。
ある特定の例示的な実施形態では、多重特異性結合分子は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体の各抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）を含む。第１および第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）の文脈において、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、接頭辞「Ａ１」を伴って示され得、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは、接頭辞「Ａ２」を伴って示され得る。したがって、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書ではＡ１－ＨＣＤＲ１、Ａ１－ＨＣＤＲ２、およびＡ１－ＨＣＤＲ３と称され得、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書ではＡ２－ＨＣＤＲ１、Ａ２－ＨＣＤＲ２、およびＡ２－ＨＣＤＲ３と称され得る。
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、互いに直接的または間接的に接続されて、本発明の二重特異性抗原結合分子を形成し得る。あるいは、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、各々別個の多量体形成ドメイン（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）に接続されてもよい。１つの多量体形成ドメインと別の多量体形成ドメインとの会合は、２つの抗原結合ドメイン間の会合を促進し、それによって二重特異性抗原結合分子を形成する。本明細書で使用される場合、「多量体形成ドメイン」は、同じかまたは同様の構造または構成の第２の多量体形成ドメインと会合する能力を有する、任意の巨大分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体形成ドメインは、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体形成構成要素の非限定的な例は、各アイソタイプグループ内の任意のアロタイプのみならず、（ＣＨ２～ＣＨ３ドメインを含む）免疫グロブリンのＦｃ部分、例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択されるＩｇＧのＦｃドメインである。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、典型的には、２つの多量体形成ドメイン、例えば、個別の抗体重鎖の各々個々の部分である２つのＦｃドメインを含むであろう。第１および第２の多量体形成ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４などの同じＩｇＧアイソタイプのものであってもよい。あるいは、第１および第２の多量体形成ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４などの異なるＩｇＧアイソタイプのものであってもよい。
ある特定の実施形態では、多量体形成ドメインは、Ｆｃ断片、または少なくとも１つのシステイン残基を含有する１～約２００のアミノ酸長のアミノ酸配列である。他の実施形態では、多量体形成ドメインは、システイン残基、または短いシステイン含有ペプチドである。他の多量体形成ドメインとしては、ロイシンジッパー、ヘリックスループモチーフ、またはコイルドコイルモチーフを含むか、またはこれらからなるペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。
本発明の二重特異性抗原結合分子を作製するために、任意の二重特異性抗体フォーマットまたは技術を使用してもよい。例えば、第１の抗原結合特異性を有する抗体またはその断片は、第２の結合特異性を有する別の抗体または抗体断片などの１つ以上の他の分子実在物に、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、または非共有会合、またはその逆により）機能的に連結して、二重特異性抗原結合分子を生成することができる。本発明の文脈で使用され得る特定の例示的な二重特異性フォーマットとしては、非限定的に、例えば、ｓｃＦｖ系またはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ、ノブイントゥホール、一般的な軽鎖（例えば、ノブイントゥホールを有する一般的な軽鎖）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）抗体、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマットが挙げられる（前述のフォーマットの考察では、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２、ｍＡｂｓ ４：６、１－１１およびそこで引用される参考文献を参照し、またＢｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎ（２０１７）ｍＡｂｓ ９：１８２－２１２も参照されたい（それらの各々全体が参照により組み込まれる））。
本発明はまた、第１のＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ ＣＨ３ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含み、第１および第２のＩｇ ＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸で互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の差異が、アミノ酸の差異を欠く二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合を減少させる。一実施形態では、第１のＩｇ ＣＨ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる、ＥＵナンバリングではＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を減少または無効にする変異を含有する。第２のＣＨ３はさらに、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＹ４３６Ｆ）を含んでもよい。第２のＣＨ３に見出され得るさらなる改変としては、以下が挙げられる：ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ、ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）、例えばＷＯ２０１０／１５１７９２を参照されたい。
ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプに由来するＦｃ配列を組み合わせたキメラであってもよい。例えば、キメラＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域に由来するＣＨ２配列の一部またはすべて、およびヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４に由来するＣＨ３配列の一部またはすべてを含み得る。キメラＦｃドメインはまた、キメラヒンジ領域を含有し得る。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列と組み合わせられたヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」配列を含み得る。本明細書に表される抗原結合分子のうちのいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの特定の例は、Ｎ－末端からＣ末端に向かって［ＩｇＧ４ ＣＨ１］－［ＩｇＧ４上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ ＣＨ２］－［ＩｇＧ４ ＣＨ３］を含む。本明細書に表される抗原結合分子のうちのいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの別の例は、Ｎ－末端からＣ末端に向かって［ＩｇＧ１ ＣＨ１］－［ＩｇＧ１上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ ＣＨ２］－［ＩｇＧ１ ＣＨ３］を含む。本発明の抗原結合分子のうちのいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインのこれらの例および他の例は、参照によりその全体が組み込まれるＰＣＴ出願第ＷＯ２０１４／０２２５４０号に記載されている。これらの一般的な構造的配置を有するキメラＦｃドメインおよびその変異体は、変化したＦｃ受容体結合を有し得、その結果Ｆｃエフェクター機能に影響を与える。
使用および作製方法
本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質のさらなる実施形態は、対象ヌクレオチド、例えば、レポーター遺伝子または治療遺伝子を標的細胞に送達するためのそれらの使用である。概して、対象ヌクレオチドは、レポーター遺伝子（複数可）または治療遺伝子（複数可）に隣接する５’および３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を概して含み得る伝達プラスミドであってもよい（ＡＡＶベクター内に包含されるとき、ウイルスプロモーターまたは非ウイルスプロモーターの制御下にあり得る。一実施形態では、対象ヌクレオチドは、５’から３’に向かって、５’ＩＴＲ、プロモーター、遺伝子（例えば、レポーターおよび／または治療遺伝子）、および３’ＩＴＲを含む伝達プラスミドである。
有用なプロモーターの非限定的な例としては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、脾臓焦点形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター（１．２ｋｂ ＥＦｌａプロモーター、または０．２ｋｂ ＥＦｌａプロモーター）、キメラＥＦ １ａ／ＩＦ４－プロモーター、およびホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。内部エンハンサーはまた、対象遺伝子の発現を増加させるためにウイルス構築物中に存在し得る。例えば、ＣＭＶエンハンサーを使用することができる（Ｋａｒａｓｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ＣＭＶエンハンサーは、ニワトリ１３－アクチンプロモーターと組み合わせて使用することができる。
多様なレポーター遺伝子（または検出可能部分）を、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む多量体構造に封入することができる。レポーター遺伝子の例としては、例えば、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子にコードされる）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ＭｍＧＦＰ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。本明細書に記載の方法は、緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子の使用を用いる標的化ベクターの構築を実証するが、本開示の閲読時に当業者であれば、本明細書に記載の非ヒト動物は、レポーター遺伝子の非存在下で、または当該技術分野で既知の任意のレポーター遺伝子を用いて生成することができることを理解するであろう。
多様な治療遺伝子を、例えば、伝達ベクターの一部として、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む多量体構造に封入することができる。治療遺伝子の非限定的な例としては、毒素（例えば、自殺遺伝子）、治療抗体またはその断片、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはその一部分（複数可）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどをコードするものが挙げられる。
本発明のさらなる実施形態は、組換えキャプシドタンパク質の調製のためのプロセスであり、方法は、
ａ）好適な条件下で組換えキャプシドタンパク質をコードする核酸を発現する工程と、
ｂ）工程ａ）の発現されたキャプシドタンパク質を単離する工程と、を含む。
本発明のさらなる実施形態は、ウイルスの指向性を変化させるための方法であって、（ａ）異種エピトープをコードする核酸を、ウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸配列に挿入して、異種エピトープを含む遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を形成する工程、および／または（ｂ）ウイルスベクターの生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養する工程であって、パッケージング細胞が、核酸配列を含む、パッケージング細胞を培養する工程、を含む、方法である。本発明のさらなる実施形態は、キャプシドタンパク質の表面上に異種エピトープを提示するための方法であって、ａ）好適な条件下で本発明による核酸を発現する工程と、ｂ）工程ａ）の発現されたキャプシドタンパク質を単離する工程と、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、ヘルパープラスミドおよび／または対象ヌクレオチドを含む伝達プラスミドをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、培養上清から自己相補的アデノ随伴ウイルスベクターを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、パッケージング細胞を溶解することと、一本鎖アデノ随伴ウイルスベクターを細胞溶解物から単離することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）細胞片を除去することと、（ｂ）ＤＮａｓｅ ＩおよびＭｇＣｌ２を用いて、ウイルスベクターを含有する上清を処理することと、（ｃ）ウイルスベクターを濃縮することと、（ｄ）ウイルスベクターを精製することと、（ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちの任意の組み合わせと、をさらに含む。
本明細書に記載のウイルスベクターの生成に有用なパッケージング細胞としては、例えば、ウイルスに対して許容状態の動物細胞、もしくはウイルスに対して許容状態になるように改変された細胞、または例えば、リン酸カルシウムなどの形質転換剤の使用によるパッケージング細胞構築物が挙げられる。本明細書に記載のウイルスベクターの生成に有用なパッケージング細胞株の非限定的な例としては、例えば、ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ－２９３）細胞（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関［ＡＴＣＣ］番号ＣＲＬ－１５７３）、ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ－抗原を含有するＨＥＫ－２９３細胞（ＨＥＫ－２９３Ｔまたは２９３Ｔ）、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞、ヒト肉腫細胞株ＨＴ－１０８０（ＣＣＬ－１２１）、リンパ芽球様細胞株ラージー（ＣＣＬ－８６）、上皮神経膠芽腫－星状細胞腫様細胞株Ｕ８７－ＭＧ（ＨＴＢ－１４）、Ｔ－リンパ腫細胞株ＨｕＴ７８（ＴＩＢ－１６１）、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、ＨｅＬａ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－２）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴＩ細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＣＡＰ細胞、ＣＡＰ－Ｔ細胞などが挙げられる。
Ｌ９２９細胞、Ｃｏｓｓｅｔ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９，７４３０－７４３６に概説されているＦＬＹウイルスパッケージング細胞系、ＮＳ０（マウス骨髄腫）細胞、ヒト羊膜細胞（例えば、ＣＡＰ、ＣＡＰ－Ｔ）、酵母細胞（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを含むがこれらに限定されない）、植物細胞（タバコＮＴｌ、ＢＹ－２を含むがこれらに限定されない）、昆虫細胞（ＳＦ９、Ｓ２、ＳＦ２１、Ｔｎｉ（例えば、Ｈｉｇｈ５）を含むがこれらに限定されない）、または細菌細胞（（Ｅ．ｃｏｌｉを含むがこれに限定されない）。
さらなるパッケージング細胞および系、核酸ゲノムをシュードタイプ化ウイルスベクターにパッケージングするためのパッケージング技法およびベクターについては、例えば、Ｐｏｌｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，（１９９９）９６：４５９８－４６０３を参照されたい。パッケージングの方法は、ウイルス成分を永久的に発現するパッケージング細胞を使用すること、または細胞をプラスミドで過渡的にトランスフェクトすることを含む。
さらなる実施形態は、ウイルスを再配向する方法、および／またはレポーターもしくは治療遺伝子を標的細胞に送達する方法を含み、方法は、細胞を生体外または生体内で形質導入するための方法を含み、異種エピトープを提示する組換えウイルスキャプシドを含むキャプシドを含むウイルスベクターと、多重特異性結合分子との組み合わせを標的細胞に接触させる工程を含み、多重特異性結合分子が、ｉ）エピトープに特異的に結合する抗体パラトープ、および（ｉｉ）標的細胞によって発現される受容体に特異的に結合する再標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、野生型対照ウイルスベクターのものと同様のウイルスベクターの形質導入効率を復元する分子：分子の比率で、組換えウイルスベクターと、多重特異性結合分子とを、本明細書に記載の組成物は含むか、あるいは本明細書に記載の方法は組み合わせる。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：０．５～１：１００の範囲である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：４～１：２０の範囲である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：８～１：１５の範囲である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：４である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：８である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：１５である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：２０である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：１００未満である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：５０未満である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：２０未満である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：１５未満である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクター対多重特異性結合分子の比率（分子：分子）は、１：１０未満である。
いくつかの実施形態では、標的細胞は生体外にある。他の実施形態では、標的細胞は、対象、例えばヒトの生体内にある。
標的細胞
本明細書に開示の組換えウイルスベクターを使用して、対象ヌクレオチドを送達するために、多種多様な細胞を標的化することができる。標的細胞は、概して、対象ヌクレオチドおよび所望の効果に基づいて選択されるであろう。
いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドを送達して、酵素欠損症、またはＸ連結されている重症複合免疫不全などの免疫欠損症などの生物体の欠損を埋め合わせるタンパク質を、標的細胞が産生することを可能にすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、通常は動物中でタンパク質を産生するであろう細胞が標的化される。他の実施形態では、タンパク質が最も有益である領域内の細胞が標的化される。
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡをコードする遺伝子などの対象ヌクレオチドは、標的細胞中の特定の遺伝子の発現を阻害することができる。対象ヌクレオチドは、例えば、病原体ライフサイクルに関与する遺伝子の発現を阻害し得る。したがって、病原体から感染しやすいか、あるいは病原体に感染した細胞が標的化され得る。他の実施形態では、対象ヌクレオチドは、標的細胞中の毒素の産生を担う遺伝子の発現を阻害し得る。
他の実施形態では、対象ヌクレオチドは、毒性タンパク質を発現する細胞を殺傷する毒性タンパク質をコードし得る。この場合、腫瘍細胞または他の不要な細胞が標的化され得る。
なお他の実施形態では、治療用タンパク質などの収集されるタンパク質をコードする対象ヌクレオチドを使用し、タンパク質を産生および分泌することが可能な細胞を標的化してもよい。
対象ヌクレオチドの発現が望ましい標的細胞の特定の集団が同定されると、その標的細胞の集団上で特異的に発現される標的受容体が選択される。標的受容体は、細胞の集団に対してのみか、または他の細胞の集団に対するよりもその細胞の集団に対してより高い程度に発現され得る。発現が特異的であるほど、送達が標的細胞に対してより特異的に配向され得る。文脈に応じて、マーカーの（およびしたがって、遺伝子送達の）特異性の所望の量は変化し得る。例えば、毒性遺伝子を導入するために、非標的細胞の殺傷を回避するように高い特異性が最も好ましい。採取用のタンパク質の発現、または包括的な影響が望ましい分泌生成物の発現のために、より低いマーカー特異性が必要とされる場合がある。
上記のように、標的受容体は、再標的化リガンドを同定または作製することができる任意の受容体であり得る。好ましくは、標的受容体は、受容体などのペプチドまたはポリペプチドである。しかしながら、他の実施形態では、標的受容体は、結合パートナーによって認識され得る炭水化物または他の分子であり得る。標的受容体の結合パートナー、例えば、リガンドが既知の場合、親和性分子として使用してもよい。しかしながら、結合分子が不明である場合、標準的な手順を使用して標的受容体に対する抗体を生成することができる。そのときは、多重特異性結合分子の一部として、抗体を再標的化リガンドとして使用することができる。
したがって、標的細胞は、例えば、（１）特定の用途（例えば、治療、収集されるタンパク質の発現、および疾患抵抗の付与）、および（２）所望の量の特異性を有するマーカーの発現、を含む多様な因子に基づいて選択され得る。
標的細胞は、いかなる方法でも限定されず、生殖系細胞および細胞株、ならびに体細胞および細胞株の両方を含む。標的細胞は、いずれかの起源に由来する幹細胞であり得る。標的細胞が生殖系細胞であるとき、標的細胞は、好ましくは、単細胞胚および胚幹細胞（ＥＳ）からなる群から選択される。
医薬組成物、剤形、および投与
さらなる実施形態は、本発明による少なくとも１つの組換えウイルスキャプシドタンパク質および適切な多重特異性結合分子、ならびに／または本発明による核酸、好ましくは本発明による少なくとも１つの多量体構造を含む、医薬品を提供する。かかる医薬品は、有用な遺伝子伝達ベクターであることが好ましい。
また、本明細書に記載のウイルスベクター、ならびに薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含む、医薬組成物も本明細書に開示されている。加えて、本明細書に記載のウイルスベクターを含む医薬剤形が本明細書に開示されている。
本明細書で考察されるように、本明細書に記載のウイルスベクターは、様々な治療用途（生体内およびエクスビボ）に、および研究ツールとして使用することができる。
本明細書に開示のウイルスベクターに基づく医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容可能な担体および／または賦形剤を使用する、任意の従来的な様式で製剤化され得る。ウイルスベクターは、投与するために、例えば、注射、（口または鼻のいずれかを通した）吸入、もしくは隔離によって、または経口、口腔内、非経口、もしくは直腸内投与によって、または腫瘍に直接投与することによって処方され得る。
医薬組成物は、全身投与、局所投与、または局在化投与を含む、多様な投与モード用に製剤化され得る。技法および製剤は、例えば、Ｒｅｍｒｎｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見ることができる。全身投与については、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む、注射が好ましい。注射のために、医薬組成物は、好ましくは、ハンク溶液またはリンガー溶液などの生理学的に適合性のある緩衝液で、液体溶液中に製剤化され得る。加えて、医薬組成物は、固体形態で製剤化され得、使用直前に再溶解または懸濁され得る。医薬組成物の凍結乾燥形態も好適である。
経口投与のために、医薬組成物は、結合剤（例えば、アルファ－化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容可能な賦形剤と共に従来的な手段によって調製される、例えば、錠剤またはカプセルの形態をとることができる。錠剤はまた、当該技術分野で周知の方法によってコーティングされ得る。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態をとり得るか、あるいは使用前に水または他の好適な媒体を含む構成を用いる乾燥生成物として提示され得る。かかる液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性媒体（例えば、ａｔｉｏｎｄ油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）、および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル－ｐ－ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの薬学的に許容可能な添加剤を用いる従来的な手段によって調製され得る。調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を含有してもよい。
医薬組成物は、注射によって、例えば、ボーラス注射または連続点滴によって、非経口投与用に製剤化することができる。注射用の製剤は、任意選択的に防腐剤を添加して、例えば、アンプルまたは多用量容器内で単位剤形で提示することができる。医薬組成物は、油性媒体または水性媒体中に懸濁液、溶液、または乳濁液としてさらに製剤化することができ、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤を含む、他の薬剤を含有し得る。
加えて、医薬組成物は、デポ剤として製剤化することもできる。これらの長時間作用する製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、化合物は、好適な高分子もしくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤化され得る。他の好適な送達系としては、長期間にわたる薬物の局所的な非浸潤性送達の可能性を提供するマイクロスフェアが挙げられる。この技術は、炎症または虚血を引き起こすことなく、冠動脈カテーテルを介して器官の任意の選択される部分に注射することができる前毛細血管サイズを有する、マイクロスフェアを含み得る。投与された治療薬は、マイクロスフェアから徐々に放出され、選択される組織中に存在する周囲細胞によって吸収される。
全身投与は、経粘膜的手段または経皮的手段によっても可能である。経粘膜的投与または経皮的投与については、浸透するバリアに対して適切な浸透剤が製剤中に使用される。かかる浸透剤は、概して、当該技術分野で既知であり、例えば経粘膜的投与用に、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。加えて、洗剤を使用して浸透を促進してもよい。経粘膜的投与は、鼻腔内噴霧または座薬を使用して行ってもよい。局所投与のために、本明細書に記載のウイルスベクターは、当該技術分野で概して既知の、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化することができる。治癒を加速させるために、洗浄溶液を局所的に使用して損傷または炎症を治療することもできる。
注射可能な使用に好適な医薬品形態としては、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤；滅菌注射溶溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を挙げることができる。すべての場合において、医薬品形態は、滅菌される必要があり、かつ流体である必要がある。また、製造条件およびある特定の保存パラメータ（例えば、冷却および凍結）の条件下で安定している必要があり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存される必要がある。
本明細書に開示される製剤が対象における免疫応答を促進する治療剤として使用される場合、治療剤は、中性または塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容可能な塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）であって、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸などで形成される、酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基などにも由来し得る。
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆の使用によって、分散の場合は必要なウイルスベクターの大きさの維持によって、かつ界面活性剤の使用の場合によって維持することができる。微生物の活動の防止は、当該技術分野で既知の様々な抗細菌剤および抗真菌剤によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる薬剤の組成物、例えば、アルミニウムモノステアリン酸およびゼラチン使用によってもたらされ得る。
滅菌注射可能な溶液は、必要に応じて、上記に列挙されている様々な他の成分を用いて、活性化合物または構築物を適切な溶媒中に必要な量で組み込むことによって調製することができ、その後に濾過滅菌を行う。
処方の際、溶液は、投与製剤と適合する様式で、および療上有効な量で投与され得る。製剤は、上記に記載の注射可能な溶液のタイプなど、多様な剤形で容易に投与されるが、徐放性カプセルまたはマイクロ粒子およびマイクロスフェアなども用いることができる。
水溶液中での非経口投与のために、例えば、必要に応じて溶液を好適に緩衝化し、最初に液体希釈剤を十分な生理食塩水またはグルコースと等張させるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に好適である。この文脈では、用いることができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者には分かるであろう。例えば、１ｍｌの等張性ＮＡｃｌ溶液中に１回分の用量を溶解し、１０００ｍｌの皮下注入流体に添加するか、または提案される点滴部位に注射することができる。
投与に責任を有する人物は、いずれの場合でも、個々の対象に対する適切な用量を決定するであろう。例えば、対象は、病原性微生物に対する、または対象の条件（例えば、癌）に対する必要性もしくは曝露に応じて、ある期間の間毎日もしくは毎週、または月１回、年２回、もしくは年１回、本明細書に記載のウイルスベクターを投与され得る。
静脈内、腫瘍内、皮下、または筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化される化合物に加えて、他の薬学的に許容可能な形態には、例えば、経口投与のための錠剤または他の固体、リポソーム製剤、徐放性カプセル、生分解性形態、および現在使用されている任意の他の形態が含まれる。
また、鼻腔内もしくは吸入可能な溶液もしくは噴霧、エアロゾル、または吸入剤も使用し得る。鼻腔溶液は、ドロップまたは噴霧中の鼻腔通路に投与するように設計された水溶液であり得る。鼻腔溶液は、鼻の分泌に多くの点で類似しているように調製され得る。したがって、水性の鼻腔溶液は、通常、等張性であり、わずかに緩衝化されて、ｐＨ５．５～７．５を維持する。加えて、必要に応じて、眼科調製物および適切な薬物安定剤に使用されるものと類似した抗菌防腐剤を製剤に含めることができる。様々な市販の鼻腔調製物が知られており、例えば、抗生物質および抗ヒスタミン剤を含むことができ、喘息予防のために使用される。
経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムとしての賦形剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、または粉末の形態をとる。ある特定の定義された実施形態では、経口医薬組成物は、不活性希釈剤または同化可能な食用担体を含むか、または硬質もしくは軟質のシェルゼラチンカプセルで囲まれ得るか、または錠剤に圧縮され得るか、または食事の食品により直接組み込まれ得る。経口治療投与のために、活性化合物は、賦形剤により組み込まれ得、摂取性錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハなどの形態で使用され得る。
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどはまた、以下：トラガントゴム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンとしての結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、およびスクロース、ラクトース、もしくはサッカリンなどの甘味剤、またはハッカ油、イチャクソウの油、もしくはチェリー香味料などの香味剤を含有し得る。投薬単位形態がカプセルである場合、上記のタイプの材料に加えて、液体担体が含有され得る。様々な他の材料が被覆として、または別様に、投薬単位の物理的形態を変更するために存在し得る。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルは、シェラック、糖、またはそれらの両方で被覆され得る。エリキシル剤のシロップは、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、染料、ならびにチェリーまたはオレンジ風味などの香味剤を含有し得る。
本明細書に開示されるさらなる実施形態は、方法および組成物と併用するためのキットに関する場合がある。キットはまた、好適な容器、例えば、バイアル、チューブ、ミニチューブもしくはマイクロチューブ、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器も含み得る。追加の構成要素または薬剤が提供されるとき、キットは、この薬剤または構成要素が配置され得る１つ以上の追加の容器を収容し得る。本明細書のキットとしてはまた、典型的には、ウイルスベクターを収容するための手段、および市販のしっかり密封される任意の他の試薬容器が挙げられる。かかる容器としては、所望のバイアルが保持される注射器またはブロー成形プラスチック容器を挙げることができる。任意選択的に、記載の組成物には、例えば、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗真菌もしくは抗細菌剤、または抗腫瘍剤などの１つ以上の追加の活性剤が必要な場合がある。
用量範囲および投与頻度は、ウイルスベクターの性質、および特定の患者の医学的状態ならびにパラメータ、および使用される投与経路に応じて変化し得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクター組成物は、投与モード、投与経路、対象の疾患の性質および状態に応じて、約１×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）～約１×１０１５ｐｆｕの範囲の用量で対象に投与することができる。いくつかの場合では、ウイルスベクター組成物は、約１×１０８ｐｆｕ～約１×１０１５ｐｆｕ、または約１×１０１０ｐｆｕ～約１×１０１５ｐｆｕ、または約１×１０８ｐｆｕ～約１×１０１２ｐｆｕの範囲の用量で投与することができる。より正確な用量もまた、投与される対象に応じ得る。例えば、対象が若年である場合、低用量を必要とし得、対象が成人ヒト対象である場合、より高い用量を必要とし得る。ある特定の実施形態では、より正確な用量は、対象の重量に応じ得る。ある特定の実施形態では、例えば、若年ヒト対象は、約１×１０８ｐｆｕ～約１×１０１０ｐｆｕを受領することができるが、成人ヒト対象は、約１×１０１０ｐｆｕ～約１×１０１２ｐｆｕの用量を受領することができる。
本明細書に開示の組成物は、当該技術分野で既知の任意の手段によって投与され得る。例えば、組成物は、静脈内、腫瘍内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、腟内、直腸内、局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、腫瘍内、筋肉内、髄腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍下、眼球内、経口的、局所的（ｌｏｃａｌｌｙ）に、吸入、注射、点滴、連続点滴、局所的灌流によって、カテーテル、洗浄を介して、クリーム中で、または脂質組成物中で、対象に投与することを含み得る。
当業者に既知の任意の方法は、本明細書に記載のウイルスベクター、パッケージング細胞、およびベクター構築物の大規模生成に使用され得る。例えば、マスターシードおよびワーキングシード在庫は、必要条件を満たした初代ＣＥＦにおいてＧＭＰ条件下で、または他の方法によって調製され得る。パッケージング細胞を大きな表面積のフラスコ上にプレーティングし、ほぼ集密まで増殖させ、ウイルスベクターを精製してもよい。細胞を採取し、培養培地に放出したウイルスベクターを単離および精製するか、あるいは細胞内ウイルスベクターを機械的に崩壊させることによって放出してもよい（細胞破片は、大細孔深層濾過（ｌａｒｇｅ－ｐｏｒｅ ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって、かつ宿主細胞ＤＮＡをエンドヌクレアーゼで消化させることによって除去することができる）。その後、ウイルスウイルスベクターを、タンジェンシャルフロー濾過によって精製および濃縮し、続いて透析ろ過してもよい。得られた濃縮バルクは、安定化剤を含有する緩衝液で希釈し、バイアルに充填し、凍結乾燥させることによって製剤化することができる。組成物および製剤は、後の使用のために保存されうる。使用するために、凍結乾燥ウイルスベクターは、希釈剤を添加することによって再構成されてもよい。
併用療法で使用されるある特定の追加の薬剤は、当技術分野で既知の任意の手段によって製剤化および投与することができる。
本明細書に開示の組成物は、アルミニウム塩および他の鉱物アジュバント、張力活性剤（ｔｅｎｓｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ）、細菌誘導体、媒体、およびサイトカインなどのアジュバントも含み得る。アジュバントはまた、拮抗免疫調節特性を有してもよい。例えば、アジュバントは、Ｔｈ１またはＴｈ２免疫性を刺激することができる。本明細書に開示の組成物および方法はまた、アジュバント療法を含み得る。
以下の実施例は、説明目的のみに提供され、本発明の範囲を制限することを意図していない。
実施例１：異種エピトープを含むアデノ随伴ウイルスベクターの生成
ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＰＣＲを使用して、ＦＬＡＧ、ｃ－ｍｙｃ、ヘキサヒスチジンなどのいくつかの異種エピトープのうちの１つを含有するように改変して、組換えキャプシドタンパク質をコードするプラスミドを生成する。簡潔に述べると、コドンがＡＡＶ２キャプシドタンパク質のＮ５８７、ＡＡＶ６ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＱ５８５、ＡＡＶ８ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＮ５９０、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＡ５８９、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＧ４５３をコードした後、ＦＬＡＧ、ｃ－ｍｙｃ、またはヘキサヒスチジンをコードする配列をフレームに挿入する。
アデノ随伴ウイルス生成は、ＨＥＫ２９３細胞を用いたトリプルトランスフェクション方法（例えば、Ｅｒｉｋ Ａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｍ．Ｍｅｔｚｇｅｒ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１６；３（２））を参照のこと）を使用して実施する。細胞は、適切なベクター：
ヘルパープラスミド、ｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｃａｔ＃２４００７４）；
例えば、ｐＡＡＶ ＲＣ２／６／９（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ＃ＶＰＫ－４２６）、ｐＡＡＶ ＲＣ８、ｐＡＡＶ ＲＣ２－Ｎ５８７ｍｙｃ、ｐＡＡＶ ＲＣ２／６－Ｑ５８５ｍｙｃ、ｐＡＡＶＲＣ８－Ｎ５９０ｍｙｃ、ｐＡＡＶ ＲＣ９－Ａ５８９ｍｙｃなどの、野生型または改変ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子（ｐＡＡＶ ＲＣ２（Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ＃ＶＰＫ－４２２）をコードするプラスミド；および
対象ヌクレオチドと、例えば、ｐｓｃＡＡＶ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ、ｐＡＡＶ－ＣＭＶＧＦＰ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃａｔ＃２４００７４）、ｐＡＡＶ－ＥＦ１ａ－ｅＧＦＰ、またはｐＡＡＶ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰなどのＡＡＶ ＩＴＲ配列をコードするプラスミド
を用いる、ＰＥＦｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）媒介性トランスフェクションの１日前にプレーティングする。
トランスフェクション７２時間後に、培地を収集し、細胞を緩衝液［５０ＭｍのＴｒｉｓ－Ｈｃｌ、１５０ＭｍのＮａＣｌ、および０．５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ｄ６７５０－１００Ｇ）］中で溶解する。次に、培地および細胞溶解物の両方が０．５Ｕ／μｌの最終濃度になるまで、ベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加し、その後３７℃で６０分間培養する。細胞溶解物を、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。細胞溶解物および培地を一緒に組み合わせ、最終濃度８％でＰＥＧ８０００（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｃａｔ＃Ｐ４３４０）で沈殿させる。ペレットを４００ＭｍのＮａｃｌ中に再懸濁し、１００００ｇで１０分間遠心分離する。上清中のウイルスを、１４９，０００ｇで３時間の超遠心分離によってペレット化し、ｑＰＣＲによってタイトレーションする。
ＡＡＶゲノムをタイトレーションするためのｑＰＣＲでは、ＡＡＶ試料を３７℃で１時間ＤＮａｓｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃ＥＮ０５２５）で処理し、ＤＮＡ抽出物Ａｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ＃４４０３３１９）を使用して溶解する。プライマーをＡＡＶ２ ＩＴＲに直接使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してキャプシド形成ウイルスゲノムを定量化する。ＡＡＶ２ ＩＴＲプライマーの配列は、５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’（正方向ＩＴＲ、配列番号９）および５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’（逆方向ＩＴＲ、配列番号１０）（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒｅｔ ａｌ．，２０１２）であり、それぞれ、ＡＡＶの左側内部逆位反復（ＩＴＲ）配列、およびＡＡＶの右側内部逆位反復（ＩＴＲ）配列に由来する。ＡＡＶ２ ＩＴＲプローブの配列は、５’－６－ＦＡＭ－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ－ＴＡＭＲＡ－３’（配列番号１１）（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ Ｃ．，Ｈａａｓｅ Ｍ．，Ｍｕｅｔｈｅｒ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３，１８－２８）である。１０分間９５°Ｃの活性化工程の後、９５℃で１５秒間、および６０℃で３０秒間の２工程のＰＣＲサイクルを４０サイクル実施する。ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃４３０４４３７）をｑＰＣＲに使用した。ＤＮＡプラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｃａｔ＃２４００７４）は、絶対力価を決定するための基準として使用する。
ｃ－ｍｙｃエピトープが中に生成されたキャプシドを含むアデノ随伴ウイルスベクター。本実施例では、ｃ－ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号６）を、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸Ｎ５８７とＲ５８８との間、またはＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸Ａ５８９とＱ５９０との間に挿入した、すなわち、ｃ－ｍｙｃエピトープをコードするヌクレオチド配列（ＧＡＡ ＣＡＡ ＡＡＡ ＣＴＣ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＴＧ、配列番号１２）を、プラスミドｐＡＡＶ ＲＣ２（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）またはプラスミドｐＡＡＶ ＲＣ２／９に挿入し、それぞれの改変ｐＡＡＶ ＲＣ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ ｐＡＡＶ ＲＣ９－Ａ５８９Ｍｙｃプラスミドの各々を使用して、減少または無効化された指向性を有するＡＡＶウイルスベクターの改変キャプシドタンパク質をコードした。
ｐＡＡＶ ＲＣ２－Ｎ５８７Ｍｙｃを作製するために、（５’から３’に向かって）ＢｓｉＷ１制限部位、ｐＡＡＶ ＲＣ２の位置３０５０と３７７３との間のヌクレオチド配列、およびｃ－ｍｙｃエピトープオーバーハングヌクレオチド配列を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物、ならびに（５’から３’に向かって）ｃ－ｍｙｃエピトープオーバーハングヌクレオチド配列、ｐＡＡＶ ＲＣ２の位置３７７４～４３７０の間のヌクレオチド配列、およびＰｍｅ１制限部位を含む第２のＰＣＲ生成物を、表２に表されているプライマーを使用して作製した。ＢｓｉＷ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｒ０５５３Ｌ）およびＰｍｅ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｒ０５６０Ｌ）を用いてｐＡＡＶ ＲＣ２を消化させることによって、ｐＡＡＶ ＲＣ２－Ｎ５８７Ｍｙｃプラスミド（すなわち、ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸Ｎ５８７とＲ５８８との間にｃ－ｍｙｃエピトープをコードするように改変されたｐＡＡＶ ＲＣ２プラスミド）を作製し、（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２：５１－９に記載のようにライゲーション独立クローニングを介して、２つのＰＣＲ生成物を挿入した。
ｐＡＡＶ ＲＣ２／６－Ｑ５８５Ｍｙｃを作製するために、３７５７と３７５８との間に挿入されるｃ－ｍｙｃエピトープ配列を有するｐＡＡＶ ＲＣ２／６の位置３７００および３９４０を含むｇｂｌｏｃｋＤＮＡ断片を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）から注文した。ＭｓｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ＃Ｒ０５３４Ｌ）およびＡｆｌＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ＃Ｒ０５２０Ｌ）を用いて消化させたｐＡＡＶ ＲＣ２／６にｇｂｌｏｃｋ断片を、（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２：５１－９に記載のように、ライゲーション独立クローニングを介して挿入することにより、ｐＡＡＶ ＲＣ２／６－Ｑ５８５Ｍｙｃプラスミドを作製した。
ｐＡＡＶ ＲＣ９－Ａ５８９Ｍｙｃを作製するために、（５’から３’に向かって）ＢｓｉＷ１制限部位、ｐＡＡＶ ＲＣ９の位置３０５２と３７７９との間のヌクレオチド配列、およびｃ－ｍｙｃエピトープオーバーハングヌクレオチド配列を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物、ならびに（５’から３’に向かって）ｃ－ｍｙｃエピトープオーバーハングヌクレオチド配列、ｐＡＡＶ ＲＣ９の位置３７７９～４４０４の間のヌクレオチド配列、およびＰｍｅ１制限部位を含む第２のＰＣＲ生成物を、表２に表されているプライマーを使用して作製した。
ＢｓｉＷ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｒ０５５３Ｌ）およびＰｍｅ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｒ０５６０Ｌ）を用いてｐＡＡＶ ＲＣ９を消化させることによって、ｐＡＡＶ ＲＣ９－Ａ５８９Ｍｙｃプラスミド（すなわち、ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸Ａ５８９とＱ５９０との間にｃ－ｍｙｃエピトープをコードするように改変されたｐＡＡＶ ＲＣ２／９プラスミド）を作製し、（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２：５１－９に記載のようにライゲーション独立クローニングを介して、２つのＰＣＲ生成物を挿入した。
ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用して、ＧＦＰ断片をｐｓｃＡＡＶ ＭＣＳベクター（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ＃ＶＰＫ－４３０）に導入することによってｐｓｃＡＡＶ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰを生成した。Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）からのデノボ合成によって、ｐＡＡＶ－ＥＦ１ａ－ｅＧＦＰプラスミドおよびｐＡＡＶ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰを作製した。
実施例２：ＡＡＶウイルスベクターの生体外での抗体媒介性再標的化
ＨｅｐＧ２は、ヒト肝癌細胞株であり、肝臓特異性マーカーであるアシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）を発現する。ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｈｒＧＦＰウイルスベクターが、ＨｅｐＧ２に感染し得るかどうかを試験するために、例えばｃ－ｍｙｃおよびＡＳＧＲ１（抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体）の両方を認識する二重特異性抗体を介して、異なる比率（１：０．５、１：１、１：２、１：４、１：８、１：１５、１：２０、１：５０、または１：１００）のウイルスゲノム（５ｅ９ウイルスゲノム）の数対抗体分子の数の、ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰと二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体とを含む混合物を室温で３０分間培養し、次いでＨｅｐＧ２細胞を添加した。対照として、ＨｅｐＧ２細胞をまた、野生型ｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターのみ、ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターのみ、または単一特異性抗ｍｙｃ抗体（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）を１：８の比率で含むｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターと培養した。感染３日後、感染ＨｅｐＧ２細胞によるＧＦＰ発現を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって確認した（図１）。ＧＦＰ発現はまた、野生型ｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰと培養したとき、および１：８の比率のｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターと二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と培養したときに、ＨｅｐＧ２細胞に匹敵するパーセンテージで検出された（それぞれ４４．６％および４４．１％、図１Ａおよび１Ｇ、上部および下部パネル）。ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターとより高いまたはより低い二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）との混合物と培養されたＨｅｐＧ２細胞でのＦＡＣＳによって、より低いＧＦＰ発現を検出した（図１Ｃ、下部パネル）。加えて、抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体の非存在下でｓｃＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰに感染したＨｅｐＧ２細胞、またはｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰおよび単一特異性抗ｍｙｃ抗体と培養したＨｅｐＧ２細胞では、ＧＦＰを検出しなかった。
同様に、細胞表面上にヒト（ｈ）ＡＳＧＲ１を発現するように遺伝子改変された２９３Ｔ細胞である－２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞を、異なる比率（１：０．５、１：１、１：２、１：４、１：８、１：１５、１：２０、または１：１００）のウイルスゲノム対抗体分子の数の、ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰと二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体とを含む混合物と培養した。（ｈＡＳＧＲ１を発現しない）野生型２９３Ｔ細胞を、１：８の比率のｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰと二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体との混合物と培養し、２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞を、（ａ）野生型ｓｃＡＡＶウイルスベクターのみ、（ｂ）ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターのみ、または（ｃ）対照として機能する、ｃ－ｍｙｃおよび２９３Ｔ細胞によって発現されないグルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）を認識する無関係な二重特異性抗ｍｙｃ－ＧＣＧＲ抗体を１：８の比率で含むｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクター、と培養した。感染３日後、２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１または２９３Ｔ細胞を、ヒト抗－ｈＡＳＧＲ１抗体（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）、続いてＡＰＣコンジュゲートヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｃａｔ＃１０９－１３６－０９８，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で染色し、ＦＡＣＳによってＧＦＰ発現を分析した。２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞（図２Ａｉ～２Ａｘおよび２Ａｘｉｉ）の表面上ではｈＡＳＧＲ１発現を検出したが、２９３Ｔ細胞（図２Ａｘｉ）では検出しなかった。１：０．５、１：１、１：２、１：４、１：８、１：１５、１：２０、および１：５０の比率のｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰと二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体との混合物と培養後、野生型ｓｃＡＡＶと培養した２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞（５６．７％）に匹敵するレベルで、ＧＦＰ陽性２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞を検出した（５６．９％～６８．３％）（（図２Ａｉおよび２Ａｉｉｉ～２Ａｉｘ）。ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰと二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体の１：１００の比率は、感染性が減少した（図２Ａｘ）。ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ単独との培養、または無関係な二重特異性抗ｍｙｃ－ＧＣＧＲ抗体を含むｓｃＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃとの培養は、２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞によるＧＦＰ発現を生じなかった（図２Ａｉｉおよび２Ａｘｉｉ）。
同様の実験では、２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞を、未改変ＡＡＶ９－ＣＡＧＧ－ＧＦＰウイルスベクターのみ、ＡＡＶ９－Ａ５８９Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクターのみ、または異なる比率で二重特異性抗Ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と混合したＡＡＶ９－Ａ５８９Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクターと培養した細胞と培養した。感染３日後、ＧＦＰ発現をＦＡＣＳにより分析した。１：１、１：２、１：４、１：８、１：２０、１：５０、および１：１００の比率のＡＡＶ９－Ａ５８９Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰと二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体との混合物と培養後、野生型ＡＡＶ９－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰと培養した２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞（９．７２％）に匹敵するレベルで、ＧＦＰ陽性２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞を検出した（４１．１％～９１％）（図２Ｂ（ｉ）および図２Ｂ（ｉｉｉ）～（ｉｘ）。ＡＡＶ９－Ａ５８９Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰ単独との培養は、２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞によるＧＦＰ発現を生じなかった（図２Ｂ（ｉｉ））。
二価抗ｈＡＳＧＲ１抗体（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）の２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞の感染を阻害する能力を試験した。２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞を、室温で１時間、異なる濃度で二価抗ｈＡＳＧＲ１抗体と培養し、その後、１：８の比率のｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰと二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体とを含む混合物と培養した。感染３日後、細胞を固定し、上述のＦＡＣＳにより分析した。図３は、ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰの進入が、二価抗ｈＡＳＧＲ１抗体によって用量依存的な様式で阻害され得ることを示すデータを提供している。
二重特異性抗体および改変ＡＡＶの連続的な投与が、改変ＡＡＶの抗体媒介性再標的化をもたらすことができるかどうかを決定するために、異なる数の二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体分子（１ｘ１０９～１ｘ１０１２の範囲の分子）を２ｘ１０５の２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞に１時間添加し、その後１ｘ１０９のｓｃＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクターを添加した。対照としては、（１）野生型ｓｃＡＡＶのみと、すなわち抗体の非存在下で培養した２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞、（２）１ｘ１０１１の無関係な二重特異性抗ｍｙｃ－ＧＣＧＲ抗体分子および１ｘ１０９のｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターと連続して培養した２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞、ならびに（３）１ｘ１０１１の二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体分子および１ｘ１０９のｓｃＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクターと連続して培養した、ｈＡＳＧＲ１を発現しない２９３Ｔ細胞が挙げられた。感染２日後、感染２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞によるＧＦＰ発現を、顕微鏡によって視覚化した（図４）。２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞によるＧＦＰ発現は、野生型ｓｃＡＡＶのみと培養後、およびすべての濃度の抗ＡＳＧＲ１抗体分子およびｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰと連続して培養後で観察された（図４Ａ、４Ｃ～４Ｉ）。ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰのみと培養後の２９Ｔ３－ｈＡＳＧＲ１細胞（図４Ｂ）、抗ｍｙｃ－ｈＡＳＧＲ１抗体およびｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターと連続して培養した後の、ＡＳＧＲ１を発現しない２９３Ｔ細胞（図４Ｊ）、または無関係な二重特異性抗ｍｙｃ－ＧＣＧＲ抗体およびｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターと連続して培養した後の２９Ｔ３－ｈＡＳＧＲ１細胞（図４Ｋ）では、ＧＦＰを検出しなかった。
本明細書に記載されるように、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）の指向性は、（１）例えば、キャプシドタンパク質の改変、例えばｃ－ｍｙｃエピトープの挿入によって不活性化され得、任意選択的に、（２）二重特異性抗体を使用して、例えば、ｃ－ｍｙｃエピトープ、および標的細胞によって発現されるリガンドを認識する二重特異性抗体を用いて再配向され得る。一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）の指向性が同様に（１）減少または無効化することができるかどうか、および任意選択的に（２）再配向され得るかどうかを決定するために、２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞を、二重特異性抗ｍｙｃ－ｈＡＳＧＲ１抗体の非存在下、または異なるウイルスベクター：抗体の比率（１：０、１：１、１：２、１：４、１：８、１：２０、１：１００、または１：１０００）で二重特異性抗ｍｙｃ－ｈＡＳＧＲ１抗体の存在下で、実施例１に記載のように生成したｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｈｒＧＦＰウイルスベクターと培養した。対照としては、野生型ｓｓＡＡＶと培養した２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞、１：８のウイルスベクター：抗体の比率のｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｈｒＧＦＰウイルスベクターおよび無関係な二重特異性抗ｍｙｃ－ＧＣＧＲ抗体と培養した２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞、ならびに１：８のウイルスベクター：抗体の比率のｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｈｒＧＦＰウイルスベクターおよび二重特異性抗ｍｙｃ－ｈＡＳＧＲ１抗体と培養した（ｈＡＳＧＲ１を発現しない）２９３Ｔ細胞が挙げられた。感染３日後、細胞を固定し、ＧＦＰ発現をＦＡＣＳによって検出した（図５）。野生型ｓｓＡＡＶと培養した２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞、およびすべての比率のｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｈｒＧＦＰウイルスベクターと二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体との混合物と培養した２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞で、ＧＦＰ発現を検出した（図５Ａ、５Ｃ～５Ｉ）。ｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｈｒＧＦＰウイルスベクターおよび二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と培養した２９Ｔ３細胞によるＧＦＰ発現（図５Ｊ）、またはｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｈｒＧＦＰウイルスベクターのみと培養した、もしくはｓｓＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクターおよび無関係な二重特異性抗ｍｙｃ－ＧＣＧＲ二重特異性抗体と培養した２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞によるＧＦＰ発現（図５Ｂ、５Ｋ）は観察されなかった。
ヒト（ｈ）グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）は、通常２９３Ｔ細胞によって発現されない。しかしながら、２９３Ｔ－ｈＧＣＧＲは、細胞表面上にｈＧＣＧＲを発現するように遺伝子改変された、安定な２９３Ｔ細胞株である。ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターの再標的化が、ｈＧＣＧＲ受容体を介した二重特異性抗ｍｙｃ－ＧＣＧＲ抗体によって媒介され得るかどうかを試験するために、２９３Ｔ－ｈＧＣＧＲ細胞を、異なる比率のｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ：二重特異性抗ｍｙｃ－ＧＣＧＲ抗体を含む異なる混合物と培養した。ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターを、２９３Ｔ－ｈＧＣＧＲ細胞に添加する３０分前に室温で、１：０．５、１：１、１：２、１：４、１：８、１：１５、１：２０、１：５０、または１：１００の比率で二重特異性抗ｍｙｃ－ＧＣＧＲ抗体と混合した。感染３日後、感染２９３Ｔ－ｈＣＧＣＲ細胞によるＧＦＰ発現を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって確認した（図６）。野生型ｓｃＡＡＶと培養後（図６Ａ）、または１：０．５、１：１、１：２、１：４、１：８、１：１５、１：２０、１：５０、および１：１００の比率のｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ／二重特異性抗ｍｙｃ－ＧＣＧＲ抗体と培養後（図６Ｃ～６Ｋ）に、顕著なパーセンテージのＧＦＰ陽性細胞を検出した。ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクター単独、または単一特異性抗ｍｙｃ抗体を含むｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターと培養した２９３Ｔ－ｈＧＣＧＲ細胞では、ＧＦＰは検出しなかった（それぞれ図６Ｂおよび６Ｌ）。
Ｊｕｒｋａｔは、ヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株であり、ヒト（ｈ）ＣＤ３を発現する。ＡＡＶ６－Ｑ５８５Ｍｙｃ－ＥＦ１ａ－ｅＧＦＰウイルスベクターの再標的化が、ｈＣＤ３受容体を介した二重特異性抗ｍｙｃ－ＣＤ３抗体によって媒介され得るかどうかを試験するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、異なる比率のＡＡＶ６－Ｑ５８５Ｍｙｃ－ＥＦ１ａ－ｅＧＦＰ：二重特異性抗ｍｙｃ－ＣＤ３抗体を含む異なる混合物と培養した。ＡＡＶ６－Ｑ５８５Ｍｙｃ－ＥＦ１ａ－ｅＧＦＰウイルスベクターを、Ｊｕｒｋａｔ細胞に添加する３０分前に室温で、１：１、１：５、１：１０、１：１００、１：１０００の比率で、二重特異性抗ｍｙｃ－ＣＤ３抗体と混合した。感染３日後、感染Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＧＦＰ発現を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって確認した（図７）。野生型ＡＡＶ６－ＥＦ１ａ－ｅＧＦＰと培養後（図７Ｂ）、または１：１、１：５、１：１０、および１：１００の比率のＡＡＶ６－Ｑ５８５Ｍｙｃ－ＥＦ１ａ－ｅＧＦＰ／二重特異性抗ｍｙｃ－ＣＤ３抗体と培養後（図７Ｄ～７Ｇ）、顕著なパーセンテージのＧＦＰ陽性細胞を検出した。ＡＡＶ６－Ｑ５８５Ｍｙｃ－ＥＦ１ａ－ｅＧＦＰウイルスベクターと培養したＪｕｒｋａｔ細胞では、ＧＦＰは検出しなかった（図７Ｃ）。
本実施例に記載されているのは、ｓｃＡＡＶ２、またはｃ－ｍｙｃエピトープがＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸Ｎ５８７とＲ５８８との間に挿入されている遺伝子改変ｓｓＡＡＶ２（ｓｃＡＡＶ－Ｎ５８７ｍｙｃまたはｓｓＡＡＶ－Ｎ５８７ｍｙｃ）、Ｑ５８５とＳ５８６との間にｃ－ｍｙｃエピトープが挿入されているＡＡＶ６、および野生型ＡＡＶに通常感染した感染細胞を含むＡＡＶ９の不活性化によって実証された、いくつかの自己相補的（ｓｃ）または一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶセロタイプの天然指向性の不活性化である（図１Ａ～１Ｂ、２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、４Ａ～４Ｂ、５Ａ～５Ｂ、６Ａ～６Ｂ、および７）。加えて、本実施例で実証されているのは、ｃ－ｍｙｃエピトープおよび標的細胞によって発現される第２のリガンド（例えばｈＡＳＧＲ１、ｈＧＣＧＲ、またはｈＣＤ３）を認識する二重特異性抗体の、改変ＡＡＶの指向性を再標的化する能力、およびリガンド特異的様式でシュードタイプ化ＡＡＶによる標的細胞の感染を媒介する能力である（図１～７）。さらに、本実施例は、遺伝子改変ｓｃ－またはｓｓ－ＡＡＶ、および二重特異性抗体の同時投与が、感染に必要ではないこと、すなわち、連続投与が、遺伝子改変ｓｃ－またはｓｓ－ＡＡＶの生体外での再標的化に十分であることを実証している（図４）。
実施例３：改変ウイルスベクターの生体内での抗体媒介性再配向
異なる多重特異性結合分子フォーマットを用いるウイルスベクターの肝臓への再標的化
二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体が、ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターを生体内でｈＡＳＧＲ１を発現する肝細胞に再標的化させることができるかどうかを決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６で肝細胞がｈＡＳＧＲ１をバックグラウンド発現するように遺伝子改変されたマウス、および対照野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１ｘ１０１１（ｑＰＣＲによるタイトレーション）の野生型ｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ単独、またはウイルスゲノム対抗体分子が１：８の比率で、二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１と組み合わせたｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターを血管内に注射した。対照としては、生理食塩水［２５０ＭｍのＮａｃｌ］、またはｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクター単独を注射したマウスが挙げられた。注射１０日後、マウスを屠殺し、４％のＰＦＡで経心腔的灌流を行った。肝臓、腎臓、および心臓の器官を収集し、１５％のスクロース、続いて３０％のスクロース中で脱水した。次いで、器官をスライド上で低温切片にし、ニワトリ抗ＥＧＦＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）およびＡｌｅｘａ－４８８コンジュゲート抗ニワトリ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で染色した。（図８Ａ～８Ｃ）。肝臓にＡＳＧＲ１を発現するように改変され、野生型ｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ、または二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と組み合わせたｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰを注射した遺伝形質転換動物からの肝臓（図８Ａ（ｉ）および８Ａ（ｉｖ））、ならびに野生型ｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰを注射した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの肝臓（図８Ａ（ｖ））では、ＧＦＰ陽性細胞を検出した。生理食塩水、またはｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクター単独を注射したすべての脾臓もしくは腎臓試料（図８Ｂおよび８Ｃ）、またはすべての動物からの肝臓、脾臓、もしくは腎臓試料（図８Ａ（ｉｉ、ｉｉｉ、ｖｉ、ｖｉｉ））、二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と組み合わせたｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰを注射した野生型Ｃ５７ＢＬ／６動物から採取した肝臓試料（図８Ａ（ｖｉｉｉ））ではＧＦＰを検知しなかった。要約すると、ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターと二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体との組み合わせは、ｈＡＳＧＲ１を発現する（肝）細胞のみに感染し、これは、ｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ｅＧＦＰウイルスベクターが、キャプシドタンパク質の改変によって不活性化されたこと、例えばｓｃＡＡＶウイルスベクターの天然指向性が、例えばｃ－ｍｙｃエピトープを用いて減少または無効化することができたこと、かかるウイルスベクターは、例えば二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体によって、例えば生体内で肝細胞に特異的に再活性化、例えば特異的に再標的化することができたことを強く提示している。
同様に、二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体が、ｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクターを生体内でｈＡＳＧＲ１を発現する肝細胞に再標的化させることができるかどうかを決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６で肝細胞がｈＡＳＧＲ１をバックグラウンド発現するように遺伝子改変されたマウス、および対照野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２．１８ｘ１０１１（ｑＰＣＲによるタイトレーション）の野生型ｓｓＡＡＶ２－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰ単独、またはウイルスゲノム対抗体分子が１：４の比率で、二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１と組み合わせたｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクターを血管内に注射した。対照としては、ＰＢＳ、またはｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクター単独を注射したマウスが挙げられた。注射４週間後、マウスを屠殺し、４％のＰＦＡで経心腔的灌流を行った。肝臓、腎臓、および心臓の器官を収集し、１５％のスクロース、続いて３０％のスクロース中で脱水した。次いで、器官をスライド上で低温切片にし、ニワトリ抗ＥＧＦＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）およびＡｌｅｘａ－４８８コンジュゲート抗ニワトリ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で染色した。肝臓にＡＳＧＲ１を発現するように改変され、野生型ｓｓＡＡＶ２－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰ、または二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と組み合わせたｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰを注射した遺伝形質転換動物からの肝臓（図９Ｅ～９Ｆ、９Ｐ～９Ｒ）、および野生型ｓｓＡＡＶ２－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰを注射した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの肝臓（図９Ｂ～９Ｃ）では、ＧＦＰ陽性細胞を検出した。驚くべきことに、二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と組み合わせたｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰの感染効率は、ＷＴ ｓｓＡＡＶ２－ＣＡＧＧ－ＧＦＰ（図９Ｅ～９Ｆ、９Ｐ～９Ｒ）よりも非常に高い。生理食塩水、またはｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクター単独を注射したすべての動物からの肝臓試料（図９Ａ、９Ｄ、９Ｇ～９Ｌ））、または二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と組み合わせたｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰを注射した野生型Ｃ５７ＢＬ／６動物から採取した肝臓試料（図９Ｍ～９Ｏ）ではＧＦＰを検知しなかったか、あるいはかろうじて検出した。要約すると、ｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクターと二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体との組み合わせは、ｈＡＳＧＲ１を発現する（肝）細胞のみに感染し、これは、ｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスベクターが、キャプシドタンパク質の改変によって不活性化されたこと、例えばｓｃＡＡＶウイルスベクターの天然指向性が、例えばｃ－ｍｙｃエピトープを用いて減少または無効化することができたこと、かかるウイルスベクターは、例えば二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体によって、例えば生体内で肝細胞に特異的に再活性化、例えば特異的に再標的化することができたことを強く提示している。
シュードタイプＡＡＶ９ウイルスベクターを用いたさらなる実験を、Ｃ５７ＢＬ／６で肝細胞がｈＡＳＧＲ１を発現するように遺伝子改変されたマウスで実施した。これらのマウスに、１ｘ１０１１（ｑＰＣＲによるタイトレーション）の野生型ＡＡＶ９－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰ、またはウイルスゲノム対抗体分子が１：１００の比率で、二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と組み合わせたＡＡＶ９－Ａ５８９ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を注射した。対照としては、ＰＢＳ、または無関連な二重特異性抗ｍｙｃ－ｈＣＤ３抗体と組み合わせたＡＡＶ９－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を注射したマウスが挙げられた。注射４週間後、マウスを屠殺した。肝臓を、１０％のホルマリンで固定し、ＧＦＰ染色のためにＨｉｓｔｏＷｉｚ Ｉｎｃ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）に送った。野生型ＡＡＶ９－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰ、または二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体と組み合わせたＡＡＶ９－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を注射した動物からの肝臓では、ＧＦＰ陽性細胞を検出した（図１０Ａおよび１０Ｄ）。生理食塩水、または二重特異性抗ｍｙｃ－ｈＣＤ３抗体と組み合わせたＡＡＶ９－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を注射した動物からのすべての肝臓試料では、それぞれＧＦＰを検出しなかったか、あるいはかろうじて検出した（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。要約すると、ＡＡＶ２と同様に、ＡＡＶ９の天然指向性は、キャプシドタンパク質の改変によって、例えばｃ－ｍｙｃエピトープの挿入によって減少または無効化することができ、かかる改変ウイルスベクター、例えばＡＡＶ９－Ａ５８９ｍｙｃは、対応する二重特異性抗エピトープ細胞特異性マーカー結合タンパク質、例えば肝細胞に対する二重特異性抗ｍｙｃ－ＡＳＧＲ１抗体を使用して特定の細胞型に再標的化することができる。
抗ｈＡＳＧＲ１ ＩｇＧ４ノブイントゥホールＦｃフォーマットに付加された抗ｍｙｃ ｓｃＦｃ
様々な多重特異性結合分子フォーマットが、ＡＡＶ感染を媒介することができるかどうかを決定するために、抗ｍｙｃ ｓｃＦｖを、ノブイントゥホール抗－ｈＡＳＧＲ１ ＩｇＧ４抗体の１つの鎖のＣ末端に融合した（図１１Ａ参照）。具体的には、抗ｈＡＳＧＲ１ステルスノブＩｇＧ４重鎖をコードするｐＲＧ７０７８の１４５９～１４７８および１４７９～１４９８と同種のアームに隣接する抗ｍｙｃ ｓｃＦｖ（配列番号２８）をコードするｇｂｌｏｃｋを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｋｏｋｉｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から得た。配列番号２８によってコードされるｓｃＦｖ（配列番号３７）のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列（ＡＡ）をコードするヌクレオチド配列（ＮＡ）は、表３に提供されている。
ｇｂｌｏｃｋを、抗ｈＡＳＧＲ１ステルスノブＩｇＧ４重鎖をコードするｐＲＧ７０７８にクローニングして、抗ｈＡＳＧＲ１ステルスノブＩｇＧ４抗ｍｙｃ ｓｃＦｖ融合ペプチドをコードするｐＲＧ７０７８、「抗ｈＡＳＧＲ１－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ二重特異性」を作製した。ｃ－ｍｙｃを用いて改変されたｐＲＧ７０７８プラスミド、未改変ｐＲＧ７０７８抗ｈＡＳＧＲ１ ＩｇＧ４ステルスホールスター、および抗体軽鎖を含有するプラスミドを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｃａｔ＃３１９８５０７０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と培養した。トランスフェクト４日後、培地を収集し、プロテインＡカラム（ｃａｔ＃８９９４８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して抗ｈＡＳＧＲ１－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ二重特異性結合分子を精製した。
シュードタイプＡＡＶ８ウイルスベクターを作製するために、ｐＡＡＶ ＲＣ８ Ｎ５９０ｍｙｃ、ＡＡＶ８のＶＰ１キャプシドタンパク質のＮ５９０とＴ５９１との間に挿入されたｃ－ｍｙｃエピトープ（配列番号２２）を含むｇｂｌｏｃｋを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｋｏｋｉｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から注文した。ｐＡＡＶ ＲＣ８プラスミド（配列番号２３）を、Ｍｌｕ１およびＳｂｆ１酵素で消化させ、ＳＬＩＣを使用してｇｂｌｏｃｋをベクターにクローニングしてｐＡＡＶ ＲＣ８ Ｎ５９０ｍｙｃ（配列番号２４）を作製した。
細胞表面上にヒト（ｈ）ＡＳＧＲ１を発現するように遺伝子改変された２９３Ｔ細胞である－２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞を、異なる比率（１：０、１：１、１：２、１：４、１：８、１：１２、１：１５、１：５０、または１：１００）のＡＡＶ８－Ｎ５９０Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰ対－ｈＡＳＧＲ１－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ二重特異性結合分子分子、またはＡＡＶ８－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルスゲノムを含むいずれかの混合物と培養した。感染３日後、ＧＦＰ発現をＦＡＣＳにより分析した。１：１、１：２、１：４、１：８、１：１２、１：１５、１：５０、または１：１００の比率のＡＡＶ８－Ｎ５９０Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰと抗ｈＡＳＧＲ１－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ二重特異性分子との混合物と培養後、野生型ＡＡＶ８－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰと培養した２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞（４６．１％）（図１２Ａ）に匹敵する、ＧＦＰ陽性２９３Ｔ－ｈＡＳＧＲ１細胞を検出した（２．１２％～２２．２％、図１２Ｄ～１２Ｋ））。疑似感染細胞（図１２Ｂ）、またはＡＡＶ８－Ｎ５９０Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰ単独との培養のいずれも、２９３Ｔ ｈＡＳＧＲ１細胞によるＧＦＰ発現を生じなかった（図１２Ｃ）。
抗ｈＡＳＧＲ１－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ二重特異性結合タンパク質が、ＡＡＶ８ Ｎ５９０ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を、生体内でｈＡＳＧＲ１を発現する肝細胞に再標的化させることができるかどうかを判断するために、Ｃ５７ＢＬ／６で肝細胞がｈＡＳＧＲ１をバックグラウンド発現するように遺伝子改変されたマウスに、１ｘ１０１１（ｑＰＣＲによるタイトレーション）の野生型ＡＡＶ８－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰ、またはウイルスゲノム対結合タンパク質分子が１：１２の比率で、抗ｈＡＳＧＲ１－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ二重特異性結合分子と組み合わせたＡＡＶ８ Ｎ５９０ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を血管内に注射した。対照動物に、抗ｈＡＳＧＲ１－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ二重特異性結合分子と同様のフォーマットを有する無関係な抗ｈＣＤ３ｘ抗ｍｙｃ二重特異性結合分子と組み合わせたＡＡＶ８ Ｎ５９０ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を注射した。注射３週間後、マウスを屠殺し、４％のＰＦＡで経心腔的灌流を行った。肝臓、腎臓、および心臓の器官を収集し、１５％のスクロース、続いて３０％のスクロース中で脱水した。次いで、器官をスライド上で低温切片にし、ニワトリ抗ＥＧＦＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）およびＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗ニワトリ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で染色した。野生型ＡＡＶ８－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰ（図１３Ａ～１３Ｃ）、または抗ｈＡＳＧＲ１－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ二重特異性結合分子と組み合わせたＡＡＶ８ Ｎ５９０ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を注射した動物からの肝臓では、ＧＦＰ陽性細胞を検出した（図１３Ｇ～１３Ｉ）。無関係な抗ｈＣＤ３／ｍｙｃ結合タンパク質と組み合わせたＡＡＶ８ Ｎ５９０ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を注射した動物からの肝臓試料では、ＧＦＰを検出しなかったか、あるいはかろうじて検出した（図１３Ｄ～１３Ｆ）。要約すると、エピトープ標識化ＡＡＶ８、例えばＡＡＶ８－Ｎ５９０ｍｙｃは、エピトープに特異的に結合する二重特異性結合分子と、標的細胞タイプによって発現される細胞特異性マーカーとを使用して、特定の細胞型に再標的化することができる。
ウイルスベクターの腸および／または膵臓への再標的化
細胞表面上にヒトエクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ３（ｈＥＮＴＰＤ３）を発現するように遺伝子改変された２９３Ｔ細胞（「２９３Ｔ－ＥＮＴＰＤ３」）を、ＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰまたはＡＡＶ２－ＣＡＧＧ－ＧＦＰウイルスゲノムと、ノブイントゥホール抗ｈＥＮＴＰＤ３ ＩｇＧ４抗体（抗ｈＥＮＴＰＤ３－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ）の１つの鎖のＣ末端に抗ｍｙｃ ｓｃＦｖを融合することによって形成した二重特異性結合分子とを異なる比率（１：０、１：１、１：２、１：４、１：８、１：２０、１：５０、１：１００、または１：２００）で含む混合物と培養した。感染３日後、ＧＦＰ発現をＦＡＣＳにより分析した。ＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰと抗ｈＥＮＴＰＤ３－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃとの混合物と培養後、野生型ＡＡＶ２－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰと培養した２９３Ｔ－ＥＮＴＰＤ３細胞（６６％）（図１４Ａ）に匹敵するレベルの、ＧＦＰ陽性２９３Ｔ－ＥＮＴＰＤ３細胞を検出した（１．４８％～１６％、図１４Ｃ～１４Ｊ）。ＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰ単独との培養は、２９３Ｔ－ＥＮＴＰＤ３細胞による非常に低いレベルのＧＦＰ発現を生じた（図１４Ｂ）。
ＥＮＴＰＤ３が腸の粘膜で発現されると判断された（データ示さず）。抗ｈＥＮＴＰＤ３－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ結合タンパク質が、ＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を、生体内でＥＮＴＰＤ３を発現する腸細胞に再標的化させることができるかどうかを判断するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５ｘ１０１１（ｑＰＣＲによるタイトレーション）の、ウイルスゲノム対結合タンパク質分子が１：２０の比率で、抗ｈＥＮＴＰＤ３－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ結合タンパク質と組み合わせたＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を血管内に注射した。対照マウスに、ＰＢＳ、野生型ＡＡＶ９、または無関係な結合タンパク質分子と組み合わせたＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を注射した。注射３週間後、マウスを屠殺した。肝臓、腸、および膵臓を、１０％のホルマリンで固定し、ＧＦＰ染色のためにＨｉｓｔｏＷｉｚ Ｉｎｃ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）に送った。野生型ＡＡＶ９（図１５Ｂ（ｉｉ））を注射したマウスではＧＦＰ陽性細胞を検出したが、ＰＢＳ、または無関係な結合分子と組み合わせたＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子、または抗－ｈＥＮＴＰＤ３－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ結合タンパク質（それぞれ図１５Ａ（ｉｉｉ）～１５Ａ（ｉｖ））を注射したマウスからの肝臓では検出されず、ｈＥＮＴＰＤ３－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ結合タンパク質を同時注射したときでさえも、ＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃウイルスベクターがＥＮＴＰＤ３陰性肝細胞に感染しないことを示している。ｈＥＮＴＰＤ３－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ結合タンパク質と組み合わせた、野生型ＡＡＶ９またはＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を注射したマウスの腸内でのみ、ＧＦＰを検出した（図１５Ｂ（ｉ）～１５Ｂ（ｉｖ））。抗ｈＥＮＴＰＤ３－ＩｇＧ４－Ｆｃ／抗ｍｙｃ結合タンパク質と組み合わせたＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を注射したマウスの膵島では、ＧＦＰを検出した。（図１５Ｃ（ｉｖ））。ＷＴ ＡＡＶ９は、膵臓の島細胞と非島細胞との両方を感染させた（図１５Ｃ（ｉｉ））。生理食塩水、または無関係な結合タンパク質と組み合わせたＡＡＶ２－Ｎ５８７ｍｙｃ－ＣＡＧＧ－ｅＧＦＰウイルス粒子を注射したマウスからの膵臓試料では、ＧＦＰを検出しなかった。（図７Ｃ（ｉ）および７Ｃ（ｉｉｉ））。要約すると、ＡＡＶの天然指向性は、異種エピトープを挿入することにより減少または無効化することができ、エピトープタグ、および再標的化される細胞または組織によって発現されるマーカーに結合する多重特異性結合タンパク質を使用して、同じかまたは異なる細胞に再標的化することができる。
本実施例は、アデノ随伴ウイルスベクターのいくつかの異なるセロタイプを、本明細書に記載の異種エピトープ（例えばｃ－ｍｙｃ）を用いて遺伝子改変して感染性を不活性化することができ、異種エピトープ（例えばｃ－ｍｙｃ）と、標的細胞によって発現されるマーカーとの両方を認識する（二重特異性フォーマットにかかわらず）二重特異性抗体を使用して、ウイルスベクターを再標的化して、対象ヌクレオチドに送達することができることを実証している。
実施例４：特定の細胞に治療カーゴを送達するための遺伝子改変ＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクターの使用
本実施例は、１つ以上の自殺遺伝子、生物学的治療剤（例えば、抗体）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系、ｓｈＲＮＡなどの治療カーゴを、標的細胞型に特異的に送達するＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクターの能力を実証する。具体的には、本実施例は、標的リガンドを発現する細胞への自殺遺伝子、抗体コード配列、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系の送達について記載している。
標的化リガンドを発現する細胞への自殺遺伝子の送達
自殺遺伝子を特定の細胞に送達するｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクターの能力を試験するために、ＨＥＲ２＋乳癌の異種移植ヌードマウスモデル（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１７：５５９－５７０）に記載）を使用する。
ウイルスベクター：レポーターＥＧＦＰ遺伝子を担持するｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７ＭｙｃまたはｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクター（ｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃ－ＥＧＦＰまたはｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７ＭｙｃＥＧＦＰ）を、実施例１に記載のように精製する。自殺遺伝子（ＳＧ）を担持するｓｃＡＡＶ２－Ｎ５８７ＭｙｃまたはｓｓＡＡＶ２－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクターは、同様に生成する。簡潔に述べると、上述のように、（１）ｐＡｄヘルパー、および（２）ｐＡＡＶ ＲＣ２（野生型キャプシドをコードする）、またはｐＡＡＶ ＲＣ２－Ｎ５８７Ｍｙｃベクター（ｃ－ｍｙｃエピトープで改変されたキャプシドをコードする）、および（３）自殺遺伝子、例えばシトシンデアミナーゼ遺伝子、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を担持するｐＡＡＶベクターを用いて、プロモーター、例えばＣＭＶの制御下で２９３Ｔ１７細胞をトランスフェクトする。ｓｓＡＡＶ－Ｎ５８７ＭｙｃＳＧまたはｓｃＡＡＶ－Ｎ５８７ＳＧウイルスベクターを、実施例１に記載のように単離およびタイトレーションする。
細胞株：ＢＴ４７４乳癌、ＳＫ－ＢＲ－３乳癌、およびＣａｌｕ－３肺癌細胞株は、ＨＥＲ２陽性ヒト腫瘍細胞株である（Ｂｕｎｎ Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７：３２３９－３２５０、Ｐｅｇｒａｍ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１８：２２４１－２２５１、Ｓｐｉｒｉｄｏｎ ＣＩ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：１７２０－１７３０）。Ａ－６７３横紋筋肉腫およびＨｅＬａ子宮頸癌は、ＨＥＲ２陰性ヒト腫瘍細胞株であり、ＢＥＡＳ－２ｂは、不死化気管支上皮ＨＥＲ２陰性細胞株である（Ｊｉａ ＬＴ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：３２５７－３２６２、Ｋｅｒｎ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ９：４４８－４５４、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｒａｍｉｒｅｚ Ａ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．２００３、１４１：１３８－１４２）。これらの細胞株のうちのすべては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、ＡＴＣＣによって推奨される培地で維持する。
マウス：メスヌードマウス、生後６～８週間を入手し、特定の病原体のない条件下で飼育する。０日目のマウスに、同時に（１）１０７のＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、Ｃａｌｕ－３、Ａ－６７３、またはＨｅＬａ腫瘍細胞を右脇腹に皮下注射し、（２）二重特異性抗ｍｙｃ－ＨＥＲ２抗体、およびレポーター（例えば、ＥＧＦＰ）または自殺遺伝子を担持するｓｓ－またはｓｃＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクターを静脈内に処置する。未処理の動物（腫瘍細胞のみを注射した動物）、レポーターもしくは自殺遺伝子を担持する野生型ｓｓ－もしくはｓｃＡＡＶウイルスベクターを注射した動物、二重特異性抗ｍｙｃ－ＨＥＲ２抗体のみを注射した動物、またはレポーターもしくは自殺遺伝子のみを担持するｓｓ－もしくはｓｃＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクターを注射した動物が、対照として機能する。すべての動物は、注射および処置１日後に適切なプロドラッグを用いて処置する。各腫瘍のサイズは、キャリパーを使用して週２回測定し、腫瘍体積は、長さ×幅２×０．５２として計算する。病的状態、腫瘍潰瘍化、腫瘍直径１５ｍｍ、または腫瘍体積１０００ｍｍ３になると、マウスを屠殺し、屠殺した日を死亡日として記録する。野生型ｓｓ－もしくはｓｃＡＡＶ、またはレポーター遺伝子を担持するｓｓ－もしくはｓｃＡＡＶ－Ｎ５８７Ｍｙｃウイルスベクターを注射した動物の肝臓、脾臓、腎臓、および腫瘍を固定し、レポーター遺伝子発現を可視化する。
自殺誘導遺伝子の標的化送達が説明されているが（Ｚａｒｏｇｏｕｌｉｄｉｓ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｎｄｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１６８４９）、本実施例は、異種エピトープ、例えばｃ－ｍｙｃを含む本明細書に記載のウイルスベクター、ならびに標的化リガンドおよび異種エピトープに特異的に結合する二重特異性抗体を使用して、標的化ＨＥＲ２リガンドを発現する細胞への自殺遺伝子の送達を説明する。追加の実験では、本明細書に記載の異種エピトープを含むウイルスベクター、ならびに異種エピトープ（例えばｃ－ｍｙｃ）および標的受容体に特異的に結合する二重特異性抗体を使用して、自殺遺伝子が、１つ以上の他の標的リガンドを発現する別の細胞型に送達される。標的化に好適な受容体の例示的かつ非限定的な例としては、ウイルスベクターのエンドサイトーシスを媒介する受容体、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（Ｑｉｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．３１６：３１－３８）、および血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（Ｌｅｎｇ Ａ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．３２：１１０３－１１１１、Ｌｉｕ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．９１：７４５－７５２）が挙げられる。標的化され得る追加の受容体としては、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）Ｈｅｉｍｂｅｒｇｅｒ ＡＢ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．９：１０８７－１０９８）、白血球分化抗原４４（ＣＤ４４）（Ｈｅｉｄｅｒ ＫＨ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５３：５６７－５７９）、白血球分化抗原１３３（ＣＤ１３３ 別名ＡＣ１３３）（Ｚｈａｎｇ ＳＳ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＢＭＣ Ｍｅｄ．；１０：８５）、葉酸受容体（ＦＲ）（Ｄｕａｒｔｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ１４９（３）：２６４－７２）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）または白血球分化抗原７１（ＣＤ７１）（Ｈａｂａｓｈｙ ＨＯ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．１１９（２）：２８３－９３）、ムチン（Ｔｏｒｒｅｓ ＭＰ，ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２０１２；１８（１７）：２４７２－８１）、ステージ特異的胎児性抗原４（ＳＳＥＡ－４）（Ｍａｌｅｃｋｉ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．２（５））、腫瘍抵抗性抗原１－６０（ＴＲＡ－１－６０）（Ｍａｌｅｃｋｉ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｊ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．３：１３４）が挙げられる。

Claims (43)

  1. （ａ）対象ヌクレオチドを封入するウイルスキャプシドを含む組換えウイルスベクターであって、
    前記ウイルスキャプシドが、異種エピトープを含むように改変された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含み、
    前記組換えウイルスキャプシドタンパク質が、前記異種エピトープを発現するように改変されたＡＡＶキャプシド遺伝子に由来する、組換えウイルスベクターと、
    （ｂ）前記組換えウイルスキャプシドタンパク質に含まれる前記異種エピトープに特異的に結合する抗体パラトープと、標的細胞上で発現された受容体に特異的に結合する再標的化リガンドとを含む多重特異性結合分子と、
    を含む組成物であって、前記ウイルスキャプシドが、前記多重特異性結合分子と組み合わせられる前には、天然指向性の減少または無効化を呈しており、前記ウイルスキャプシドの前記指向性は、前記ウイルスキャプシドと前記多重特異性結合分子とが組み合わせられると前記標的細胞に対して復元および再配向され、前記受容体は標的細胞によって特異的に発現されるか、または非標的細胞よりも前記標的細胞上で濃縮されている、組成物。
  2. 前記組換えウイルスキャプシドタンパク質が、前記異種エピトープに加えて変異をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記異種エピトープが挿入されることにより、前記挿入が、標準キャプシドと比較して、前記ウイルスキャプシドの前記天然指向性を部分的に減少させ、前記ウイルスキャプシドが、前記異種エピトープの挿入に加えて変異（例えば、前記異種エピトープの挿入以外の置換、欠失、挿入）をさらに含み、前記変異が、前記組換えウイルスキャプシドまたはそれを含む組換えウイルスベクターの（天然）指向性をさらに減少および／または無効化する、請求項１または２に記載の組成物。
  4. （ｉ）前記異種エピトープが、親和性タグおよび任意のリンカーを含む、および／または
    （ｉｉ）前記組換えウイルスキャプシドが、ＡＡＶキャプシドタンパク質の少なくとも５つの連続アミノ酸に隣接し、かつ／または操作可能に連結されているアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６として表される）を含む、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記親和性タグが、免疫グロブリン定常ドメインまたは金属イオンと結合対を形成しない、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記異種エピトープが、アミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）またはその一部分を含み、前記抗体パラトープが、前記アミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬまたはその一部分に特異的に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記対象ヌクレオチドが、
    （ｉ）ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、哺乳類プロモーター、鳥類プロモーター、魚プロモーター、昆虫プロモーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるプロモーターの制御下にあり；任意選択的に、前記対象ヌクレオチドが、非ヒトプロモーターの制御下にある；あるいは
    （ｉｉ）非ヒトプロモーターの制御下にあり、かつＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している；あるいは
    （ｉｉｉ）レポーター遺伝子であり、任意選択的に、前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質をコードするか、または、自殺遺伝子、抗体またはその断片をコードするヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはその一部分（複数可）をコードするヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド、ｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、
    請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記多重特異性結合分子が二重特異性結合分子である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記ウイルスベクターおよび前記多重特異性結合分子が、１：４の比率で存在する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記抗体パラトープが、Ｆｖドメインである、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記Ｆｖドメインが、重鎖定常ドメインに直接融合されている、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記再標的化リガンドが、抗体またはその一部分である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記多重特異性結合分子が、二重特異性抗体であり、
    前記パラトープおよび前記再標的化リガンドが、第１および第２の重鎖定常ドメインに融合されている別個のＦｖドメインを各々含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記第１および第２の重鎖が、異なる結合親和性でプロテインＡに結合する、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記多重特異性結合分子が、二重特異性抗体であり、
    前記再標的化リガンドが、２つの同一の免疫グロブリン重鎖および２つの同一の軽鎖を含む四量体抗体構造を備え、
    異種エピトープに特異的に結合する前記パラトープが、一方もしくは両方の重鎖のＣ末端もしくはＮ末端に、かつ／または一方もしくは両方の軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に付加されている、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記パラトープがｓｃＦｖであり、任意選択的に、前記ｓｃＦｖが、配列番号３７として表されるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択され、および／または、前記異種エピトープが、ＡＡＶ２のＩ４５３、ＡＡＶ２のＩ５８７、ＡＡＶ６のＩ５８５、ＡＡＶ８のＩ５９０、ＡＡＶ９のＩ４５３、ＡＡＶ９のＩ５８９、および霊長類に感染するＡＡＶセロタイプの任意の対応するアミノ酸からなる群から選択される位置の後に挿入され、かつ／または、そのアミノ酸を置き換える、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記ウイルスキャプシドが、ある特定の比率で前記異種エピトープを含まない標準キャプシドタンパク質を含むモザイクキャプシドである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記組換えウイルスキャプシドタンパク質が、前記異種エピトープを発現するように改変されたキメラキャプシド遺伝子に由来し、前記キメラＡＡＶキャプシド遺伝子が複数の核酸配列を含み、前記複数の核酸配列の各々が、異なるＡＡＶセロタイプのキャプシドタンパク質の一部分をコードし、前記複数の核酸配列が一緒になってキメラＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記再標的化リガンドが、哺乳類またはヒトの細胞表面上に発現される受容体に結合する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記受容体が、アシアロ糖タンパク質１（ＡＳＧＲ１）である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記受容体が、ＣＤ３である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記受容体が、ＥＮＴＰＤ３である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記受容体がトランスフェリン受容体である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 組換えウイルスベクターを、細胞表面タンパク質を発現する標的細胞に配向させるための請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物であって、前記標的細胞が前記組成物と接触させられ、前記多重特異性結合分子が、前記細胞表面タンパク質に特異的に結合する再標的化リガンドを含む、組成物。
  26. 前記標的細胞が、生体内にある、請求項２５に記載の組成物。
  27. 細胞表面タンパク質を発現している標的細胞に対象ヌクレオチドを送達するための請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物であって、前記標的細胞が前記組成物と接触させられ、前記多重特異性結合分子が、前記細胞表面タンパク質に結合する再標的化リガンドを含む、組成物。
  28. 前記標的細胞が、生体外にある、請求項２７に記載の組成物。
  29. 前記標的細胞が、対象の生体内にある、請求項２７に記載の組成物。
  30. 前記対象が、ヒトである、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記標的細胞が、ヒト細胞である、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記標的細胞が、神経細胞、肝細胞、脳細胞、Ｔ細胞、腎細胞、腸細胞、膵細胞、癌細胞、筋肉細胞、および異種病原体に感染した細胞からなる群から選択される、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記標的細胞が、ヒト肝細胞である、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 前記細胞表面タンパク質が、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体１（ｈＡＳＧＲ１）である、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記標的細胞が、ヒトＴ細胞である、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 前記細胞表面タンパク質が、ＣＤ３である、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記細胞表面タンパク質が、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧＣＧＲ）である、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 前記標的細胞が、腸細胞である、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 前記標的細胞が、膵細胞である、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 前記細胞表面タンパク質が、ＥＮＴＰＤ３である、請求項３８および３９に記載の組成物。
  41. 前記標的細胞が筋肉細胞である、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  42. 前記標的細胞が神経細胞である、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 前記細胞表面タンパク質がトランスフェリン受容体である、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の組成物。
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