CN117051045A - 向性修饰的重组病毒载体及其用于将遗传材料靶向引入人细胞内的用途 - Google Patents

向性修饰的重组病毒载体及其用于将遗传材料靶向引入人细胞内的用途 Download PDF

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Abstract

本文提供的是用于用多特异性结合分子例如双特异性抗体，例如在体内重靶向重组病毒衣壳蛋白/衣壳/载体的组合物和方法，所述多特异性结合分子特异性结合由衣壳蛋白展示的异源表位、以及在目的细胞上表达的蛋白质，用于目的核苷酸的靶向递送。

Description

向性修饰的重组病毒载体及其用于将遗传材料靶向引入人细 胞内的用途
相关申请的交叉引用
本申请是申请号为201880042990.1、申请日为2018年06月27日、发明名称为“向性修饰的重组病毒载体及其用于将遗传材料靶向引入人细胞内的用途”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为PCT/US2018/039874的国家阶段申请，该国际申请要求于2017年06月27日提交的美国临时申请序列号62/525,704的优先权和权益。
技术领域
本文的公开内容总体上涉及向性修饰的重组病毒载体，以及包含其的组合物，其可用于将遗传材料靶向引入细胞和/或组织内。
背景技术
将基因递送到特定的靶细胞已成为现代医学中用于诊断和治疗各种慢性疾病和遗传疾病的最重要技术之一。迄今为止，基因治疗在临床应用中的进展已受到缺乏理想的基因递送媒介物的限制。为了达到治疗成功，基因递送媒介物必须能够转导靶细胞，同时避免非靶细胞的转导。具体地，当病毒的天然向性不能满足即时治疗需要时，需要其中天然向性被消除或缩小并且成功地改造了所需向性的重组病毒载体。(Buchholz等人)
近年来，在载体开发中的大多数进展已使用以下来达到：裸露病毒(例如，包含由不含衣壳的病毒衣壳蛋白形成的衣壳的病毒(例如，脂质双层))，例如腺相关病毒(AAV)和腺病毒(Ad)，以及有包膜病毒(例如，关于其衣壳被脂质双层包围的病毒)，例如逆转录病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒。基于AAV的载体已成为许多研究的重点，因为AAV是无包膜病毒，其仅为轻度免疫原性的，但能够在体内转导广泛范围的物种和组织，而无毒性的证据。
AAV是小的、无包膜的、单链DNA病毒。AAV基因组为4.7kb，并且特征在于两个反向末端重复(ITR)，以及分别编码Rep蛋白和Cap蛋白的两个开放读码框。这两个ITR是AAV复制、包装和整合所必需的唯一顺式元件。Rep读码框编码分子量为78kD、68kD、52kD和40kD的四种蛋白质。这些蛋白质主要在调节AAV复制和AAV整合到宿主细胞的染色体内起作用。Cap读码框编码分子量为83-85kD(VP1)、72-73kD(VP2)和61-62kD(VP3)的三种结构(衣壳)病毒蛋白(VP)。AAV病毒粒子中超过80％的总蛋白质包含VP3；在成熟病毒粒子中，VP1、VP2和VP3以大约1:1:10的相对丰度发现。在体外，这三种蛋白质自发地组装成病毒体样结构，例如病毒衣壳。因此，看起来受感染细胞中病毒衣壳的形成不依赖于病毒DNA合成进行(由Kotin等人(1994)Hum.Gene Ther.5:793综述)。
在所有已知的AAV血清型中，AAV2可能是最充分表征的血清型，因为它的感染性克隆是首个制备的。(Samulski等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:2077-2081)。随后，还确定了AAV3A、AAV3B、AAV4和AAV6的完整序列。(Rutledge等人(1998)J.Virol.72:309-319；Chiorini等人(1997)J.Virol.71:6823-6833；S.Muramatsu等人(1996)Virol.221:208-217)。一般地，所有AAV在核苷酸序列上共享超过80％的同一性。
AAV是用于人基因治疗的有希望的载体，因为与其它病毒载体不同，AAV并未显示与任何已知的人疾病相关，并且一般不被视为致病性的。(Muzyczka等人(1992)CurrentTopics in Microbiology and Immunology158:97-129)。此外，AAV安全地以相对低的免疫原性转导有丝分裂后组织，并且如果Rep蛋白以反式形式供应，则能够以位点特异性方式整合到宿主染色体内，并且整合到组织培养细胞中19号染色体内。(Kotin等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2211-2215；Samulski等人(1991)EMBO J.10(12):3941-3950；Balague等人(1997)J.Virol.71:3299-3306；Surosky等人(1997)J.Virol.71:7951-7959)。AAV的整合基因组已显示允许在许多组织中的长期基因表达，所述组织包括肌肉、肝和大脑(Fisher(1997)Nature Med.3(3):306-312；Snyder等人(1997)Nature Genetics16:270-276；Xiao等人(1997)Experimental Neurology 144:113-124；Xiao等人(1996)J.Virol.70(11):8098-8108)。
许多病毒，包括AAV，经由病毒/配体:细胞/受体相互作用感染细胞，最终导致病毒被受感染细胞的内吞。这种配体:受体相互作用是病毒载体研究的重点，例如，可以进行操纵，以将病毒的天然向性从天然允许由野生型病毒感染的细胞重定向到靶细胞，例如经由通过靶细胞表达的受体。
理论上，将载体重靶向任何细胞表面蛋白或标记物应该导致由靶细胞的感染，因为大多数细胞表面受体或标记物涉及或组成性的(例如，用于再循环)或配体诱导的(例如，受体介导的)内吞途径。这些受体在网格蛋白包被的小窝中聚簇，经由网格蛋白包被的囊泡进入细胞，通过在其中分选受体的酸化内体，然后再循环到细胞表面，变得在细胞内贮存，或在溶酶体中降解。像这样，用于重靶向病毒载体的平台经常旨在消除病毒载体的天然向性，并且将病毒载体重定向至单独或主要由靶细胞表达的受体或标记物。在使用病毒载体的靶向基因治疗中的许多进展可以概括为病毒载体的非重组(非遗传)或重组(遗传)修饰，其导致病毒载体的天然向性的假分型、扩展和/或重靶向。(在Nicklin和Baker(2002)Curr.Gene Ther.2:273-93；Verheiji和Rottier(2012)Advances Virol 2012:1-15综述)。
非遗传方法通常利用衔接子，其识别野生型(未经修饰的)病毒表面蛋白和靶细胞两者。可溶性假受体(对于野生型病毒)、聚合物例如聚乙二醇、以及抗体或其一部分已用作衔接子的病毒结合结构域，而天然肽或维生素配体、以及抗体及其一部分已用于上述衔接子的细胞结合结构域。用这种方法，可以在载体:衔接子复合物与靶细胞的表面上表达的蛋白质，例如细胞表面蛋白结合后，实现病毒载体对靶细胞的重靶向。
此类方法已用于AAV(Bartlett等人(1999)Nat.Biotechnol.74:2777-2785)、腺病毒(Hemminki等人(2001)Cancer Res.61:6377-81；vanBeusechem等人(2003)Gene Therapy10:1982-1991；Einfeld,等人(2001)J.Virol.75:11284-91；Glasgow等人(2009)PLOS One4:e8355)、疱疹病毒(Nakano等人(2005)Mol.Ther.11:617-24)、以及副粘病毒(Bian等人(2005)Cancer Gene Ther.12:295-303；Bian等人(2005)Int.J.Oncol.29:1359-69)、冠状病毒(Haijema等人(2003)J.Virol.77:4528-43]8；Wurdinger等人(2005)Gene Therapy12:1394-1404)。
更流行的方法已是病毒衣壳蛋白的重组基因修饰，并且因此是病毒衣壳的表面的重组基因修饰。在间接重组方法中，病毒衣壳用异源“支架”进行修饰，所述异源“支架”然后连接至衔接子。衔接子与支架和靶细胞结合。(Arnold等人(2006)Mol.Ther.5:125-132；Ponnazhagen等人(2002)J.Virol.76:12900-907；还参见WO 97/05266)支架，例如(1)Fc结合分子(例如Fc受体、蛋白A等)，其与抗体衔接子的Fc结合，(2)(链霉)抗生物素蛋白，其与生物素化的衔接子结合，(3)生物素，其与融合至(链霉)抗生物素蛋白的衔接子结合，和(4)蛋白质:蛋白质结合对，其形成等距肽键，例如结合SpyTagged衔接子的SpyCatcher已掺入以下内：Ad(Pereboeva等人(2007)Gene Therapy 14:627-637；Park等人(2008)Biochemical and BiophysicalResearch Communications 366:769-774；Henning等人(2002)Human GeneTherapy 13:1427-1439；Banerjee等人(2011)Bioorganic andMedicinalChemistry Letters 21:4985-4988)、AAV(Gigout等人(2005)MolecularTherapy11:856-865；Stachler等人(2008)Molecular Therapy 16:1467-1473)、以及披膜病毒(Quetglas等人(2010)Virus Research 153:179-196；Ohno等人(1997)NatureBiotechnology 15:763-767；Klimstra等人(2005)Virology 338:9-21)。
在直接重组靶向方法中，将靶向配体直接插入病毒衣壳内或偶联至病毒衣壳，即，修饰蛋白质病毒衣壳以表达异源靶向配体。配体随后重定向或结合优先地或专一地在靶细胞上表达的受体或标记物。(Stachler等人(2006)Gene Ther.13:926-931；White等人(2004)Circulation 109:513-519.)。直接重组方法已用于AAV(Park等人，(2007)Frontiers in Bioscience13:2653-59；Girod等人(1999)Nature Medicine 5:1052-56；Grifman等人(2001)Molecular Therapy 3:964-75；Shi等人(2001)Human GeneTherapy12:1697-1711；Shi和Bartlett(2003)Molecular Therapy 7:515-525)、逆转录病毒(Dalba等人Current Gene Therapy 5:655-667；Tai和Kasahara(2008)Frontiers inBioscience 13:3083-3095；Russell和Cosset(1999)Journal of Gene Medicine 1:300-311；Erlwein等人(2002)Virology 302:333-341；Chadwick等人(1999)Journal ofMolecular Biology 285:485-494；Pizzato等人(2001)Gene Therapy 8:1088-1096)、痘病毒(Guse等人(2011)Expert Opinion on Biological Therapy 11:595-608；Galmiche等人(1997)Journal of General Virology 78:3019-3027；Paul等人(2007)Viral Immunology20:664-671)、副粘病毒(Nakamura和Russell(2004)Expert Opinion on BiologicalTherapy4:1685-1692；Hammond等人(2001)Journal of Virology 75:2087-2096；Galanis(2010)Clinical Pharmacology and Therapeutics 88:620-625；Blechacz和Russell(2008)Current Gene Therapy 8:162-175；Russell和Peng(2009)Current Topics inMicrobiology and Immunology 330:213-241)、以及疱疹病毒(Shah和Breakefield(2006)Current Gene Therapy 6:361-370；Campadelli-Fiume等人(2011)Reviews in MedicalVirology 21:213-226)。
三种方法各自具有优点和缺点。直接重组方法的主要优点是病毒载体的特异性是病毒基因组固有的，并且可以在复制时得到维持。然而，对于这种和间接重组方法，基因修饰病毒的能力要求维持衣壳的结构，并且将靶向配体或支架放置在耐受且适当地展示靶向配体或支架的位置，因此限制了可以使用的适当配体或支架储库。像这样，重组重靶向方法受到可用作靶向配体的天然存在的分子的限制，导致掺入其它结合配体，例如抗体或其一部分。非重组衔接子平台和重组衔接子平台两者在所使用的衔接子的灵活性方面均为有利的。然而，用这两种组分系统难以达到最佳的转导效率。
本文提供的是病毒重靶向策略，其通过将异源表位插入病毒衣壳内，解决了先前重组重靶向策略中固有的问题。本发明的重组病毒衣壳显示出减少至消除的天然向性，其在与多特异性，任选地双特异性结合分子组合时恢复且重定向，所述结合分子包含特异性结合异源表位的抗体互补位例如Fv，以及特异性结合靶细胞的重靶向配体，特别地在一定的病毒载体:多特异性结合分子比率内。
发明内容
本文公开的是重组病毒衣壳蛋白，包含重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳，包含被重组病毒衣壳封装的目的核苷酸的病毒载体；其中所述衣壳蛋白、衣壳和病毒载体经基因修饰为包含(展示)异源表位，其中所述异源表位(其一部分或与病毒衣壳蛋白组合)与抗体互补位形成结合对，并且其中所述重组病毒衣壳蛋白/衣壳/载体还可以包含在涉及受体结合(例如病毒衣壳蛋白/衣壳/载体的(天然)向性)的氨基酸位置处的突变、插入或缺失，使得重组病毒衣壳蛋白或包含重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳具有减少至消除的(天然)向性(例如，在不存在多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，具有的转导效率小于缺少异源表位的参考病毒衣壳蛋白/衣壳/载体的转导效率，或者在不存在多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，具有无法检测的转导效率)。重组病毒衣壳蛋白/衣壳/载体的此类减少至消除的(天然)向性可以在适当的多特异性，任选地双特异性结合部分的存在下得到增强或恢复。相应地，还描述的是包含以下的组合物：(1)具有包含本文所述的重组衣壳蛋白的衣壳的重组病毒载体，以及(2)包含抗体互补位和靶向配体的多特异性，任选地双特异性结合分子，包括包含一定病毒载体:多特异性结合分子比率的组合物；本文还描述的是其将遗传材料导向和/或引入靶细胞的用途。还描述的是重靶向重组病毒载体的方法，例如用于将目的核苷酸靶向递送至靶细胞的方法，其包括使重组病毒载体与多特异性，任选地双特异性结合分子接触，并且还描述了制备重组病毒整体的方法。
本文描述的是重组病毒衣壳蛋白，其包含对于所述衣壳蛋白是异源的表位，其中所述表位或其一部分特异性结合抗体互补位，并且其中例如在不存在多特异性，任选地双特异性结合部分的情况下，所述重组病毒衣壳蛋白或包含所述重组病毒衣壳的病毒衣壳具有减少至消除的天然向性。
在一些实施例中，通过重组病毒衣壳蛋白插入(展示)异源表位，使得与缺少异源表位的参考病毒衣壳相比，异源表位的插入和/或展示减少或消除了病毒衣壳的(天然)向性，例如病毒衣壳包含突变，所述突变包含在氨基酸位置处的表位插入和/或在氨基酸位置处氨基酸由表位的取代，其中例如在不存在多特异性，任选地双特异性结合部分的情况下，所述突变减少或消除了衣壳蛋白的(天然)向性。在一些实施例中，通过病毒衣壳蛋白插入(展示)异源表位，使得例如在不存在多特异性，任选地双特异性结合部分的情况下，与缺少异源表位的参考病毒衣壳相比，插入和/或展示部分地减少了重组病毒衣壳的(天然)向性，并且所述病毒衣壳还包含进一步的突变(例如，除异源表位的插入外的取代、缺失、插入)，与缺少突变的参考病毒衣壳相比，例如在不存在多特异性，任选地双特异性结合部分的情况下，所述突变进一步减少和/或消除了重组病毒衣壳或包含其的重组病毒载体的(天然)向性。
一般地，本文所述的重组病毒衣壳蛋白可以源自衣壳基因，例如由经修饰为表达表位的衣壳基因编码，和/或是一般感染人细胞的经基因修饰的无包膜病毒，或一般感染人细胞的无包膜病毒的血清型，例如腺病毒、腺相关病毒等。在一些实施例中，本文所述的重组病毒衣壳蛋白源自AAV衣壳基因，例如由经修饰为表达表位的衣壳基因编码，和/或是感染灵长类动物的AAV血清型的经基因修饰的腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，任选地其中所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV2、AAV6、AAV8或AAV9衣壳基因，例如，是经基因修饰的AAV2衣壳蛋白、经基因修饰的AAV6衣壳蛋白、经基因修饰的AAV8衣壳蛋白、或经基因修饰的AAV9衣壳蛋白。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV2衣壳基因，例如由经修饰为表达表位的AAV2衣壳基因编码，和/或是经基因修饰的AAV2 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，关于其野生型AAV2 VP1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1所示。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV6衣壳基因，例如由经修饰为表达表位的AAV6衣壳基因编码，和/或是经基因修饰的AAV6VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，关于其野生型AAV6 VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV8衣壳基因，例如由经修饰为表达表位的AAV8衣壳基因编码，和/或是经基因修饰的AAV8 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，关于其野生型AAVVP1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:21所示。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV9衣壳基因，例如由经修饰为表达表位的AAV9衣壳基因编码，和/或是经基因修饰的AAV9VP1、VP2或VP3衣壳蛋白，关于其AAV9 VP1的野生型氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5所示。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV2衣壳基因，例如由经修饰为表达表位的AAV2衣壳基因编码，和/或是AAV2经基因修饰的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV6衣壳基因，例如由经修饰为表达表位的AAV6衣壳基因编码，和/或是AAV6经基因修饰的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV8衣壳基因，例如由经修饰为表达表位的AAV8衣壳基因编码，和/或是AAV8经基因修饰的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV9衣壳基因，例如由经修饰为表达表位的AAV9衣壳基因编码，和/或是AAV9经基因修饰的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。
在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自，例如由经修饰为表达表位的嵌合AAV衣壳基因编码，其中所述嵌合AAV衣壳基因包含多个核酸序列，其中所述多个核酸序列各自编码不同AAV血清型的衣壳蛋白的一部分，并且其中所述多个核酸序列一起编码嵌合AAV衣壳蛋白。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自嵌合AAV2衣壳基因。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自嵌合AAV6衣壳基因。在一些实施例中，病毒衣壳蛋白源自嵌合AAV8衣壳基因。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自嵌合AAV9衣壳基因。
一般地，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白包含插入重组衣壳蛋白内和/或由重组衣壳蛋白展示的异源表位，使得与分别缺乏异源表位的参考衣壳或包含参考衣壳的衣壳相比，异源表位本身减少和/或消除了重组衣壳蛋白或包含其的衣壳的天然向性。在一些实施例中，异源表位插入涉及野生型参考衣壳蛋白的天然向性的衣壳蛋白区域内(在其中展示)，例如涉及细胞靶向的衣壳蛋白区域。在一些实施例中，异源表位插入Ad纤维蛋白的结节结构域内和/或由其展示。在一些实施例中，异源表位插入Ad纤维蛋白的HI环和/或由其显示。在一些实施例中，异源表位插入和/或展示在AAV衣壳蛋白的肝素结合位点中。在一些实施例中，异源表位插入和/或展示在AAV2衣壳蛋白的肝素结合位点中。在一些实施例中，异源表位插入和/或展示在AAV6衣壳蛋白的肝素结合位点中。在一些实施例中，异源表位插入和/或展示在AAV8衣壳蛋白的肝素结合位点中。在一些实施例中，异源表位插入和/或展示在AAV9衣壳蛋白的肝素结合位点中。在一些实施例中，(i)病毒衣壳蛋白源自AAV2衣壳基因，并且表位在AAV2 VP1衣壳蛋白的位置I453或I587、和/或在AAV2 VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置之后插入，和/或替换在AAV2 VP1衣壳蛋白的位置I453或I587处的氨基酸、和/或在AAV2 VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置处的氨基酸；(ii)病毒衣壳蛋白源自AAV6衣壳基因，并且表位在AAV6 VP1衣壳蛋白的位置I585、和/或在AAV6 VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置之后插入，和/或替换在AAV6 VP1衣壳蛋白的位置I585处的氨基酸、和/或在AAV6VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置处的氨基酸；(iii)病毒衣壳源自AAV8衣壳基因，并且表位在AAV8 VP1衣壳蛋白的位置I590、和/或在AAV8 VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置之后插入，和/或替换在AAV8 VP1衣壳蛋白的位置I590处的氨基酸、和/或在AAV8 VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置处的氨基酸，或(iv)病毒衣壳蛋白源自AAV9衣壳基因，并且表位在AAV9 VP1衣壳蛋白的位置I453或I589、和/或在AAV9 VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置之后插入，和/或替换在AAV9 VP1衣壳蛋白的位置I453或I589处的氨基酸、和/或在AAV9 VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置处的氨基酸。在一些实施例中，异源表位紧跟在氨基酸之后插入(例如，融合至其C末端)，所述氨基酸选自AAV2衣壳蛋白VP1的G453(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置，或者感染人的不同AAV例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应氨基酸)、AAV2衣壳蛋白VP1的N587(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置，或者感染人的不同AAV例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应氨基酸)、AAV6衣壳蛋白VP1的Q585(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置，或者感染人的不同AAV例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应氨基酸)、AAV8衣壳蛋白VP1的N590(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置，或者感染人的不同AAV例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应氨基酸)、AAV9衣壳蛋白VP1的G453(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置，或者感染人的不同AAV例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应氨基酸)、或AAV9衣壳蛋白VP1的A589(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置，或者感染人的不同AAV例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应氨基酸)。在一些实施例中，异源表位紧跟在AAV2衣壳蛋白VP1的G453(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置，或者感染人的不同AAV例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应氨基酸)之后插入(例如，融合至其C末端)。在一些实施例中，异源表位紧跟在AAV2衣壳蛋白VP1的N587(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置，或者感染人的不同AAV例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应氨基酸)之后插入(例如，融合至其C末端)。在一些实施例中，异源表位紧跟在AAV6衣壳蛋白VP1的Q585(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置，或者感染人的不同AAV例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应氨基酸)之后插入(例如，融合至其C末端)。在一些实施例中，异源表位紧跟在AAV8衣壳蛋白VP1的N590(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置，或者感染人的不同AAV例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应氨基酸)之后插入(例如，融合至其C末端)。在一些实施例中，异源表位紧跟在AAV9衣壳蛋白VP1的G453(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置，或者感染人的不同AAV例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应氨基酸)之后插入(例如，融合至其C末端)。在一些实施例中，异源表位紧跟在AAV9衣壳蛋白VP1的A589(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应位置，或者感染人的不同AAV例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的相应氨基酸)之后插入(例如，融合至其C末端)。在一些实施例中，异源表位插入和/或展示在AAV2 VP1衣壳蛋白的氨基酸N587和R588之间(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳的相应位置)。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包含重组病毒衣壳的病毒载体和/或包含重组病毒衣壳的组合物包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包含重组病毒衣壳的病毒载体和/或包含重组病毒衣壳的组合物包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包含重组病毒衣壳的病毒载体和/或包含重组病毒衣壳的组合物包含由如SEQ ID NO:25所示的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包含重组病毒衣壳的病毒载体和/或包含重组病毒衣壳的组合物包含由如SEQ ID NO:26所示的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包含重组病毒衣壳的病毒载体和/或包含重组病毒衣壳的组合物包含由如SEQ ID NO:27所示的核酸序列编码的氨基酸序列。
在一些实施例中，除异源表位之外，如本文所述的重组衣壳蛋白还包含第二种和不同的突变。例如，在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白可以是经基因修饰的AAV2衣壳蛋白，包含异源表位，并且还可以包含突变，例如R585A和/或R588A突变。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV2衣壳基因，例如是经基因修饰的AAV2 VP1衣壳蛋白，包含紧跟在AAV2 VP1蛋白的G453之后插入(例如，融合至其C末端)的异源表位，并且还包含选自R585A和/或R5889A的突变。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV 2衣壳基因，例如是经基因修饰的AAV2 VP1衣壳蛋白，包含紧跟在AAV2 VP1蛋白的N587之后插入(例如，融合至其C末端)的异源表位，并且还包含选自R585A和/或R588A的突变。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV9衣壳基因，例如是经基因修饰的AAV9 VP1衣壳蛋白，包含紧跟在AAV9 VP1蛋白的G453之后插入(例如，融合至其C末端)的异源表位，并且还包含W503A突变。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV9衣壳基因，例如是经基因修饰的AAV9 VP1衣壳蛋白，包含紧跟在AAV9 VP1衣壳蛋白的A589之后插入(例如，融合至其C末端)的异源表位，并且还包含W503A突变。
一般地，重组病毒衣壳蛋白和/或包含重组病毒衣壳的病毒载体包含长度为至少一个氨基酸的异源表位。在一些实施例中，异源表位可以为长度约5个氨基酸至约35个氨基酸，并且与抗体互补位例如免疫球蛋白可变结构域形成结合对。在一些实施例中，异源表位包含长度至少10个氨基酸。在一些实施例中，异源表位包含亲和标签。在一些实施例中，异源表位和/或亲和标签不与免疫球蛋白恒定结构域形成结合对。在一些实施例中，异源表位和/或亲和标签不与金属离子，例如Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等形成结合对。在一些实施例中，异源表位并非选自链霉抗生物素蛋白、Strep II、HA、L14、4C-RGD、LH和蛋白A的多肽。在一些实施例中，亲和标签选自FLAG(SEQ ID NO:7)、HA(SEQ ID NO:8)和c-myc(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:6)。在一些实施例中，异源表位包含c-myc(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:6)。
在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白是经基因修饰的AAV2 VP1衣壳蛋白，并且包含异源表位，所述异源表位包含紧跟在AAV2 VP1衣壳蛋白的G453之后插入(例如融合到其C末端)的序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白(i)源自AAV2衣壳基因，例如是经基因修饰的AAV2 VP1衣壳蛋白，(ii)包含异源表位，所述异源表位包含序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)，并且紧跟在AAV2 VP1衣壳蛋白的G453之后插入(例如融合到其C末端)，并且(iii)还包含选自R585A和/或R5889A的突变。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白是经基因修饰的AAV2 VP1衣壳蛋白，并且包含异源表位，所述异源表位包含紧跟在AAV2VP1衣壳蛋白的N587之后插入(例如融合到其C末端)的序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白(i)源自AAV2衣壳基因，例如是经基因修饰的AAV2VP1衣壳蛋白，(ii)包含异源表位，所述异源表位包含序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)，并且紧跟在AAV2 VP1衣壳蛋白的N587之后插入(例如融合到其C末端)，并且(iii)还包含选自R585A和/或R588A的突变。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白(i)源自AAV6衣壳基因，例如是经基因修饰的AAV6 VP1衣壳蛋白，(ii)包含异源表位，所述异源表位包含序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)，并且紧跟在AAV6 VP1衣壳蛋白的Q585之后插入(例如融合到其C末端)。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白是经基因修饰的AAV8 VP1衣壳蛋白，并且包含异源表位，所述异源表位包含紧跟在AAV8 VP1衣壳蛋白的N590之后插入(例如融合到其C末端)的序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白是经基因修饰的AAV9 VP1衣壳蛋白，并且包含异源表位，所述异源表位包含紧跟在AAV9 VP1衣壳蛋白的G453之后插入(例如融合到其C末端)的序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白(i)源自AAV9衣壳基因，例如是经基因修饰的AAV9 VP1衣壳蛋白，(ii)包含异源表位，所述异源表位包含序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)，并且紧跟在AAV9 VP1衣壳蛋白的G453之后插入(例如融合到其C末端)，并且(iii)还包含W503A突变。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白是经基因修饰的AAV9 VP1衣壳蛋白，并且包含异源表位，所述异源表位包含紧跟在AAV9 VP1衣壳蛋白的A589之后插入(例如融合到其C末端)的序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白(i)源自AAV9衣壳基因，例如是经基因修饰的AAV9 VP1衣壳蛋白，(ii)包含异源表位，所述异源表位包含序列EQKLISEEDL(SEQ IDNO:6)，并且紧跟在AAV9 VP1衣壳蛋白的A589之后插入(例如融合到其C末端)，并且(iii)还包含W503A突变。
在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含侧翼为和/或可操作地连接至AAV VP1衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸的氨基酸序列EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含侧翼为和/或可操作地连接至AAV2 VP1衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸的氨基酸序列EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含在AAV2 VP1衣壳蛋白的I587处插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含在AAV2 VP1衣壳蛋白的N587和R588之间插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)，例如包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含侧翼为和/或可操作地连接至AAV6 VP1衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸的氨基酸序列EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含在AAV6 VP1衣壳蛋白的I585处插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含在AAV6 VP1衣壳蛋白的Q585和S586之间插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)，例如包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含侧翼为和/或可操作地连接至AAV8 VP1衣壳的至少5个邻接氨基酸的氨基酸序列EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含在AAV8 VP1衣壳蛋白的I590处插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含在AAV8 VP1衣壳蛋白的N590和T591之间插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)，例如包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含侧翼为和/或可操作地连接至AAV9 VP1衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸的氨基酸序列EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含在AAV9 VP1衣壳蛋白的I453处插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含在AAV9 VP1衣壳蛋白的G453和S454之间插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)，例如包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含在AAV9 VP1衣壳蛋白的I589处插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含在AAV9 VP1衣壳蛋白的A589和Q590之间插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)，例如包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，异源表位包含亲和标签和一个或多个接头。在一些实施例中，异源表位包含侧翼为接头的亲和标签，例如异源表位从N末端到C末端包含第一接头、亲和标签和第二接头。在一些实施例中，第一接头和第二接头各自独立地是长度至少1个氨基酸的多肽。在一些实施例中，如本文所述的异源表位，例如单独或者与一个或多个接头组合的亲和标签为长度约5个氨基酸至约35个氨基酸。在一些实施例中，第一接头和第二接头具有等同的长度和/或包含等同的氨基酸序列。
一般地，在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳(例如包含参考病毒衣壳蛋白的衣壳，例如与重组病毒衣壳蛋白等同但缺乏异源表位的病毒衣壳蛋白)的那种相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳具有减少至消除的天然向性，例如具有减少的能力或不能靶向且结合天然允许转导的参考细胞。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳显示出至少10％的转导效率降低。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳显示出至少20％的转导效率降低。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳显示出至少30％的转导效率降低。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳显示出至少40％的转导效率降低。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳显示出至少50％的转导效率降低。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳显示出至少60％的转导效率降低。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳显示出至少70％的转导效率降低。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳显示出至少75％的转导效率降低。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳显示出至少80％的转导效率降低。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳显示出至少85％的转导效率降低。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳显示出至少90％的转导效率降低。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳显示出至少95％的转导效率降低。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，与参考病毒衣壳相比，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳显示出至少99％的转导效率降低。在一些实施例中，并且在不存在适当的多特异性，任选地双特异性结合分子的情况下，通过包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳的对照细胞的转导被消除，例如无法检测。
在一些实施例中，包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳是嵌合衣壳，例如包括以一定比率的包含异源表位的重组病毒衣壳蛋白、以及不包含异源表位的参考衣壳蛋白。在一些实施例中，参考衣壳蛋白是野生型参考衣壳蛋白，因为它包含与重组病毒衣壳蛋白具有相同血清型的野生型衣壳蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中，参考衣壳蛋白是对照参考衣壳蛋白，因为它包含重组病毒衣壳蛋白的氨基酸序列，除了对照参考衣壳蛋白缺乏异源表位之外。在一些实施例中，参考衣壳蛋白是突变的野生型参考蛋白，因为它包含的氨基酸序列基本上等同于野生型衣壳蛋白的氨基酸序列，所述野生型衣壳蛋白具有与重组病毒衣壳蛋白相同的血清型，但具有减少野生型衣壳蛋白的向性的突变(例如，氨基酸序列的插入、嵌合等)。在一些实施例中，本文所述的组合物包含以下，或本文所述的方法组合以下：比率范围为1:1至1:15的重组病毒衣壳蛋白和参考衣壳蛋白。在一些实施例中，该比率是1:2。在一些实施例中，该比率是1:3。在一些实施例中，该比率是1:4。在一些实施例中，该比率是1:5。在一些实施例中，该比率是1:6。在一些实施例中，该比率是1:7。在一些实施例中，该比率是1:8。在一些实施例中，该比率是1:9。在一些实施例中，该比率是1:10。在一些实施例中，该比率是1:11。在一些实施例中，该比率是1:12。在一些实施例中，该比率是1:13。在一些实施例中，该比率是1:14。在一些实施例中，该比率是1:15。
本文还公开的是编码本文所述的重组病毒衣壳蛋白的核酸，包含此类核酸(例如，其可以用于制备重组病毒衣壳的方法中)和/或重组病毒衣壳蛋白的组合物(例如，基本上由重组病毒衣壳蛋白组成的组合物，仅包含被包含本文所述的病毒衣壳蛋白的衣壳封装的病毒载体的组合物，包含此类病毒载体和多特异性，任选地双特异性结合分子的组合物(例如，以一定的病毒载体与多特异性，任选地双特异性结合分子(分子:分子)比率)，包含此类病毒载体、重靶向部分和药学可接受的载体的组合物等)。在一些实施例中，如本文所述的核酸包含编码EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的核苷酸序列、以及编码腺病毒或腺相关病毒衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸的核苷酸序列。
在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码侧翼为和/或可操作地连接至AAV2 VP1衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸的氨基酸序列EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在AAV2 VP1衣壳蛋白的I587处插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在AAV2VP1衣壳蛋白的N587和R588之间插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)，例如，在一些实施例中，如本文所述的核酸编码的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码侧翼为和/或可操作地连接至AAV6 VP1衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸的氨基酸序列EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在AAV6 VP1衣壳蛋白的I585处插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在AAV6VP1衣壳蛋白的Q585和S586之间插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)，例如，在一些实施例中，如本文所述的核酸编码的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码侧翼为和/或可操作地连接至AAV8 VP1衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸的氨基酸序列EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在AAV8 VP1衣壳蛋白的I590处插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在AAV8VP1衣壳蛋白的N590和T591之间插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)，例如，在一些实施例中，如本文所述的核酸编码的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码侧翼为和/或可操作地连接至AAV9 VP1衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸的氨基酸序列EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在AAV9 VP1衣壳蛋白的I453处插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在AAV9VP1衣壳蛋白的G453和S454之间插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)，例如，在一些实施例中，如本文所述的核酸编码的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在AAV9 VP1衣壳蛋白的I589处插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在AAV9 VP1衣壳蛋白的A589和Q590之间插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)，例如，在一些实施例中，如本文所述的核酸编码的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
一般地，如本文所述的重组病毒载体包含病毒衣壳，所述病毒衣壳包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述病毒衣壳封装目的核苷酸。在一些实施例中，目的核苷酸处于选自病毒启动子、细菌启动子、哺乳动物启动子、禽类启动子、鱼类启动子、昆虫启动子及其任何组合的启动子的控制下。在一些实施例中，目的核苷酸处于非人启动子的控制下。在一些实施例中，启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施例中，启动子是EF1α启动子。
一般地，目的核苷酸可以是一种或多种基因，其可以编码可检测标记物，例如报道分子或治疗性多肽。在一些实施例中，目的核苷酸是报道基因。在一些实施例中，目的核苷酸是报道基因，其编码选自绿色荧光蛋白、荧光素酶、β-半乳糖苷酶等的可检测标记物。在一些实施例中，可检测标记物是绿色荧光蛋白。在其它实施例中，目的核苷酸选自自杀基因、编码抗体或其片段的核苷酸、编码CRISPR/Cas系统或其一部分的核苷酸、编码反义RNA的核苷酸、编码siRNA的核苷酸、分泌性酶等。在一个实施例中，目的核苷酸编码多结构域治疗剂，例如包含提供两种不同功能的至少两个结构域的蛋白质。
本文所述的组合物一般包含病毒载体，所述病毒载体包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白，例如包括包含重组病毒衣壳蛋白的衣壳，其中所述衣壳封装目的核苷酸。在一些实施例中，本文所述的组合物包含(1)具有衣壳的病毒载体，所述衣壳包含经基因修饰为包含异源表位的重组病毒衣壳蛋白，(2)多特异性，任选地双特异性结合分子，其包含(i)特异性结合表位的抗体互补位和(ii)特异性结合受体的重靶向配体，以及任选地(3)药学可接受的载体。
如本文所述的抗体互补位一般最低限度包含特异性识别异源表位的互补决定区(CDR)，例如重链和/或轻链可变结构域的CDR3区。在一些实施例中，多特异性，任选地双特异性结合分子包含抗体(或其一部分)，其包含特异性结合异源表位的抗体互补位。例如，多特异性，任选地双特异性结合分子可以包含单结构域重链可变区或单结构域轻链可变区，其中所述单结构域重链可变区或单结构域轻链可变区包含特异性结合异源表位的抗体互补位。在一些实施例中，多特异性，任选地双特异性结合分子可以包含Fv区，例如，多特异性，任选地双特异性结合分子可以包含scFv，其包含特异性结合异源表位的抗体互补位。在一些实施例中，多特异性，任选地双特异性结合分子包含抗体(或其一部分)，其包含特异性结合异源表位的抗体互补位，其中所述抗体(或其一部分)还包含一个或多个抗体恒定结构域(例如，重链恒定结构域(例如，CH1、铰链、CH2、CH3、CH4等)和/或轻链恒定结构域(例如，CL)，其中所述一个或多个抗体恒定结构域不与异源表位结合。
除特异性结合插入重组病毒衣壳蛋白内/由重组病毒衣壳蛋白展示的异源表位的互补位(例如，包含互补位的抗体或其一部分)之外，如本文所述的多特异性，任选地双特异性结合分子还包含重靶向配体。在一些实施例中，重靶向配体特异性结合珠表面上的受体(例如，用于分离和/或纯化如本文所述的重组病毒衣壳蛋白)。在一些实施例中，重靶向配体特异性结合在哺乳动物(例如人)真核细胞例如靶细胞的表面上表达的细胞表面蛋白，例如受体、细胞表面标记物等。在一些实施例中，重靶向配体结合(人)肝细胞、(人)脑细胞、(人)T细胞、(人)肾细胞、(人)肠细胞、(人)胰腺细胞、(人)癌细胞和/或被异源病原体感染的(人)细胞。在一些实施例中，重靶向配体结合(人)肝细胞特异性标记物、(人)脑细胞特异性标记物、(人)T细胞特异性标记物、(人)肾细胞特异性标记物、(人)肠细胞特异性标记物、(人)胰腺细胞特异性标记物、(人)肿瘤细胞特异性标记物和/或致病性表位。
在一些实施例中，重靶向配体结合由(人)肝细胞表达的受体，例如脱唾液酸糖蛋白受体，例如hASGR1。在一些实施例中，重靶向配体结合由(人)神经元细胞表达的受体，例如GABA、转铁蛋白等。在一些实施例中，重靶向配体结合由(人)T细胞表达的受体，例如CD3，例如CD3ε。在一些实施例中，重靶向配体结合由(人)造血干细胞表达的受体，例如CD34。在一些实施例中，重靶向配体结合由(人)肾细胞表达的受体。在一些实施例中，重靶向配体结合由(人)肌肉细胞表达的受体，例如整联蛋白。在一些实施例中，重靶向配体结合由(人)癌细胞表达的受体，例如肿瘤相关抗原，例如亲脂蛋白(adipophilin)、AIM-2、ALDH1A1、α-辅肌动蛋白-4、甲胎蛋白(“AFP”)、ARTC1、B-RAF、BAGE-1、BCLX(L)、BCR-ABL融合蛋白b3a2、β-连环蛋白、BING-4、CA-125、CALCA、癌胚抗原(“CEA”)、CASP-5、CASP-8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA-1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白-A1、dek-can融合蛋白、DKK1、EFTUD2、延伸因子2、ENAH(hMena)、Ep-CAM、EpCAM、EphA3、上皮肿瘤抗原(“ETA”)、ETV6-AML1融合蛋白、EZH2、E6、E7、FGF5、FLT3-ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE-1,2,8、GAGE-3,4,5,6,7、GAS7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GnTV、gp100/Pme117、GPNMB、HAUS3、Hepsin、HER-2/neu、HERV-K-MEL、HLA-A11、HLA-A2、HLA-DOB、hsp70-2、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧基酯酶、K-ras、激肽释放酶4、KIF20A、KK-LC-1、KKLC1、KM-HN-1、KMHN1也称为CCDC110、LAGE-1、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、Lengsin、M-CSF、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-C1、MAGE-C2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm-2、ME1、Melan-A/MART-1、Meloe、Midkine、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、粘蛋白、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、I类肌球蛋白、N-raw、NA88-A、neo-PAP、NFYC、NY-BR-1、NY-ESO-1/LAGE-2、OA1、OGT、OS-9、P多肽、p53、PAP、PAX5、PBF、pml-RARα融合蛋白、多态性上皮粘蛋白(“PEM”)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY-MEL-1、RAGE-1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、分泌素(secernin)1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX-2、SSX-4、STEAP1、存活素、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、TAG-1、TAG-2、端粒酶、TGF-βRII、TPBG、TRAG-3、磷酸丙糖异构酶、TRP-1/gp75、TRP-2、TRP2-INT2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“TYR”)、VEGF、WT1、XAGE-lb/GAGED2a、Kras、NY-ESO1、MAGE-A3、HPV E2、HPV E6、HPV E7、WT-1抗原(在淋巴瘤及其它实体瘤中)、ErbB受体、Melan A[MART1]、gp 100、酪氨酸酶、TRP-1/gp 75和TRP-2(在黑色素瘤中)；MAGE-1和MAGE-3(在膀胱癌、头颈癌和非小细胞癌中)；HPV EG和E7蛋白(在宫颈癌中)；粘蛋白[MUC-1](在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和前列腺癌中)；前列腺特异性抗原[PSA](在前列腺癌中)；癌胚抗原[CEA](在结肠癌、乳腺癌和胃肠癌中)，以及此类共享的肿瘤特异性抗原如MAGE-2、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-10、MAGE-12、BAGE-1、CAGE-1,2,8、CAGE-3TO 7、LAGE-1、NY-ESO-1/LAGE-2、NA-88、GnTV、TRP2-INT2等。在一些实施例中，重靶向配体结合E6和/或E7。在一些实施例中，重靶向配体结合Her2。在一些实施例中，重靶向配体结合人胰高血糖素受体(hGCGR)。在一些实施例中，重靶向配体结合人外核苷三磷酸二磷酸水解酶3(hENTPD3)。
在一些实施例中，互补位(例如，抗体或其一部分)和重靶向配体彼此直接融合。在一些实施例中，特异性结合异源表位的互补位(例如抗体或其一部分)和重靶向配体彼此共价连接。
在一些实施例中，多特异性结合分子是双特异性结合分子，例如包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的抗体，其中所述第一抗原结合结构域包含特异性结合异源表位的互补位，所述异源表位插入重组病毒衣壳蛋白内或由重组病毒衣壳蛋白展示，并且所述第二抗原结合结构域特异性结合由靶细胞表达的细胞表面蛋白。在一些实施例中，双特异性结合分子是包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域包含特异性结合异源表位的互补位，所述异源表位插入重组病毒衣壳蛋白内或由重组病毒衣壳蛋白展示，并且所述第二抗原结合结构域特异性结合由靶细胞表达的受体，其中所述第一抗原结合结构域可操作地连接至包含第一CH3结构域的第一重链区域，其中所述第二抗原结合结构域可操作地连接至包含第二CH3结构域的第二重链区域，其中所述第一Ig CH3结构域和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异减少双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施例中，第一Ig CH3结构域结合蛋白A，而第二Ig CH3结构域含有减少或消除蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(按照IMGT外显子编号；按照EU编号的H435R)。第二CH3结构域还可以包含Y96F修饰(按照IMGT；按照EU的Y436F)。在第二CH3结构域内可能发现的进一步修饰包括：在IgG1抗体的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按照IMGT；按照EU的D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N和V82I(IMGT；按照EU的N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按照IMGT；按照EU的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一些实施例中，多特异性结合分子是双特异性结合分子，例如包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域结合由如本文所述的重组病毒衣壳蛋白展示的亲和标签，并且其中所述第二抗原结合结构域结合在靶细胞的表面上表达的受体。在一些实施例中，多特异性结合分子是双特异性结合分子，例如包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域结合由如本文所述的重组病毒衣壳蛋白展示的氨基酸序列EQKLISEEDL(SEQ IDNO:6)，其中所述第二抗原结合结构域结合在靶细胞的表面上表达的受体。在一些实施例中，多特异性结合分子是双特异性结合分子，例如包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域结合由如本文所述的重组病毒衣壳蛋白展示的氨基酸序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)，其中所述第二抗原结合结构域结合hASGR1。在一些实施例中，多特异性结合分子是双特异性结合分子，例如包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域结合由如本文所述的重组病毒衣壳蛋白展示的氨基酸序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)，其中所述第二抗原结合结构域结合CD3蛋白，例如CD3ε。在一些实施例中，多特异性结合分子是双特异性结合分子，例如包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域结合由如本文所述的重组病毒衣壳蛋白展示的氨基酸序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)，其中所述第二抗原结合结构域结合整联蛋白。在一些实施例中，多特异性结合分子是双特异性结合分子，例如包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域结合由如本文所述的重组病毒衣壳蛋白展示的氨基酸序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)，其中所述第二抗原结合结构域结合整联蛋白，例如hGCGR。在一些实施例中，多特异性结合分子是双特异性结合分子，例如包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域结合由如本文所述的重组病毒衣壳蛋白展示的氨基酸序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)，其中所述第二抗原结合结构域结合ENTPD3。
本文还描述的是制备和使用重组病毒衣壳蛋白，包含其的病毒载体，组合物等的方法。在一些实施例中，重定向病毒例如腺病毒、腺相关病毒等；将诊断/治疗性货物递送至靶细胞等的方法，包括将包含如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒载体，例如包括包含展示异源表位的重组病毒衣壳的衣壳的病毒载体，与双特异性结合分子组合，其中所述双特异性结合分子包含(i)特异性结合表位的抗体互补位和(ii)特异性结合受体的重靶向配体。此类方法可以包括产生重组病毒载体作为第一步，例如，在足以产生病毒载体的条件下培养包装细胞，其中所述包装细胞包含编码包含表位的衣壳蛋白的质粒。当将诊断/治疗性货物递送至靶细胞时，本文所述的方法可以包括使靶细胞与病毒载体和多特异性结合分子的组合接触，所述病毒载体包含衣壳，所述衣壳包含展示异源表位的重组病毒衣壳，其中所述多特异性结合分子包含i)特异性结合表位的抗体互补位，以及(ii)特异性结合由靶细胞表达的受体的重靶向配体。在一些实施例中，靶细胞在体外。在其它实施例中，靶细胞在受试者例如人体内。
在一些实施例中，本文所述的组合物包含重组病毒载体和多特异性结合分子，或本文所述的方法组合重组病毒载体和多特异性结合分子，所述重组病毒载体包含被衣壳封装的目的核苷酸，所述衣壳包含如本文所述的重组衣壳蛋白，其分子:分子比率将病毒载体的转导效率恢复至与参考病毒载体相似的比率。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率范围为1:0.5至1:100。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率范围为1:4至1:20。在一些实施例中，重组病毒载体与双特异性结合分子(分子:分子)的比率范围为1:8至1:15。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率为1:4。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率为1:8。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率为1:15。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率为1:20。
本文还描述的是灭活病毒衣壳和/或产生病毒载体的方法，所述方法一般包括(a)将编码异源蛋白的核酸插入编码病毒衣壳蛋白的核酸序列内，以形成编码包含异源蛋白的经基因修饰的衣壳蛋白的核苷酸序列，和/或(b)在足以产生病毒载体的条件下培养包装细胞，其中所述包装细胞包含核苷酸序列。在一些实施例中，包装细胞还包括包含目的核苷酸的辅助质粒和/或转移质粒。在一些实施例中，该方法还包括从培养上清液中分离自互补的腺相关病毒载体。在一些实施例中，该方法还包括裂解包装细胞，并且从细胞裂解产物中分离单链腺相关病毒载体。在一些实施例中，该方法还包括(a)清除细胞碎片，(b)用DNA酶I和MgCl2处理含有病毒载体的上清液，(c)浓缩病毒载体，(d)纯化病毒载体，和(e)(a)-(d)的任何组合。本文还提供的是根据本文所述的方法制备的病毒载体，以及可用于产生如本文所述的病毒载体的包装细胞，例如，包含编码所述重组衣壳蛋白的质粒的包装细胞。
附图说明
专利或申请文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要费用后，由专利局提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1提供了免疫荧光显微镜检查图像(上图)或从荧光激活细胞分选(FACS)获得的直方图(下图)，其评估通过与以下一起温育的HepG2细胞的绿色荧光(GFP)表达：(A)仅野生型scAAV2-CMV-eGFP病毒载体；(B)仅scAAV2 N587Myc-CMV-hrGFP病毒载体；以下述比率与双特异性抗Myc-ASGR1抗体混合的scAAV2 N587Myc病毒载体：(C)1:0.5、(D)1:1、(E)1:2、(F)1:4、(G)1:8、(H)1:15、(I)1:20、(J)1:50或(K)1:100；(L)或以1:8的比率与单特异性抗Myc抗体混合的scAAV N587Myc病毒载体。
图2A提供了从荧光激活细胞分选(FACS)获得的点图，所述荧光激活细胞分选评估通过与以下一起温育的29T3-hASGR1细胞的绿色荧光(GFP)表达：仅野生型scAAV2病毒载体(i)，仅scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体(ii)，以下述比率与双特异性抗Myc-ASGR1抗体混合的scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体：1:0.5(iii)、1:1(iv)、1:2(v)、1:4(vi)、1:8(vii)、1:15(viii)、1:20(ix)或1:100(x)，或以1:8的比率与无关的双特异性抗Myc-GCGR抗体混合的scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体(xii)。还显示了通过与scAAV N587Myc病毒载体一起温育的29T3细胞的GFP表达，所述scAAV N587Myc病毒载体以1:8的比率与双特异性抗Myc-ASGR1抗体混合(xi)。对于每个实验，使用2x105细胞和5x109病毒载体。
图2B提供了从荧光激活细胞分选(FACS)获得的直方图，所述荧光激活细胞分选评估通过与以下一起温育的29T3-hASGR1细胞的绿色荧光(GFP)表达：仅未经修饰的AAV9-CAGG-GFP病毒载体(i)，仅AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP病毒载体(ii)，以下述比率与双特异性抗Myc-ASGR1抗体混合的AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP病毒载体：1:1(iii)、1:2(iv)、1:4(v)、1:8(vi)、1:20(vii)、1:50(viii)或1:100(ix)。对于每个实验，使用2x105细胞和1x1010病毒载体(通过qPCR滴定)。
图3提供了从荧光激活细胞分选(FACS)获得的点图，所述荧光激活细胞分选评估通过29T3-hASGR1细胞的绿色荧光(GFP)表达，所述29T3-hASGR1细胞与浓度为0nM(C)、50nM(D)、10nM(E)、2nM(F)、0.4nM(G)、0.08nM(H)、0.016nM(I)或0.0032nM(J)的二价抗ASGR1抗体一起预温育，并且随后用以1:8的比率与双特异性抗Myc-ASGR1抗体混合的scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体进行感染(L)。与仅野生型scAAV病毒载体(A)或仅scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体(B)一起温育的293T3-hASGR1细胞充当对照。对于每个实验，使用2x105细胞和5x109病毒载体(如通过qPCR滴定的)。
图4提供了评估通过29T3-hASGR1细胞的绿色荧光(GFP)表达的免疫荧光显微镜检查图像，所述29T3-hASGR1细胞与仅野生型scAAV病毒载体(A)、仅scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体(B)一起温育，或者与1x109(C)、2x109(D)、4x109(E)、8x109(F)、2x1010(G)、1x1011(H)、1x1012(I)双特异性抗Myc-ASGR1抗体，随后为1x109 scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体一起序贯温育。还显示的是与1x1011抗myc-ASGR1抗体分子，随后为1x109 scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体一起序贯温育的293T细胞(J)，以及与1x1011无关的双特异性抗Myc-GCGR抗体分子，随后为1x109scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体一起序贯温育的293T-hASGR1细胞(K)的免疫荧光显微镜检查图像。
图5提供了从荧光激活细胞分选(FACS)获得的点图，所述荧光激活细胞分选评估通过与以下一起温育的29T3-hASGR1细胞的绿色荧光(GFP)表达：仅野生型ssAAV病毒载体(A)，仅ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP病毒载体(B)，以下述比率与双特异性抗Myc-ASGR1抗体混合的ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP病毒载体：1:1(C)、1:2(D)、1:4(E)、1:8(F)、1:20(G)、1:100(H)、1:1000(I)，或以1:8的比率与无关的双特异性抗Myc-GCGR抗体混合的ssAAVN587Myc病毒载体(K)。还显示了通过与ssAAV N587Myc病毒载体一起温育的29T3细胞的GFP表达，所述ssAAV N587Myc病毒载体以1:8的比率与双特异性抗Myc-ASGR1抗体混合(J)。对于每个实验，使用2x105细胞和5x109病毒载体。
图6提供了从荧光激活细胞分选(FACS)获得的点图，所述荧光激活细胞分选评估通过与以下一起温育的29T3-hGCGR细胞的绿色荧光(GFP)表达：仅野生型scAAV病毒载体(A)，仅scAAV2 N587Myc-CMV-eGFP病毒载体(B)，以下述比率与双特异性抗Myc-GCGR抗体混合的scAAV2 N587Myc-CMV-eGFP病毒载体：1:0.5(C)、1:1(D)、1:2(E)、1:4(F)、1:8(G)、1:15(H)、1:20(I)、1:50(J)或1:100(K)，或以1:8的比率与无关的单特异性抗Myc抗体(Regeneron Pharmaceuticals,Tarrytown,NY)混合的scAAV2N587Myc-CMV-eGFP病毒载体(L)。对于每个实验，使用2x105细胞和5x109病毒载体。
图7提供了从荧光激活细胞分选(FACS)获得的点图，所述荧光激活细胞分选评估通过单独的Jurkat细胞(A)或与以下一起温育的Jurkat细胞(B)的绿色荧光(GFP)表达：仅野生型scAAV6-EF1-eGFP病毒载体(B)，仅AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP病毒载体(C)，以下述比率与双特异性抗Myc-CD3抗体混合的AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP病毒载体：1:1(D)、1:5(E)、1:10(F)、1:100(G)或1:1000(H)。对于每个实验，使用2x105细胞和1x109病毒载体。
图8A提供了肝的免疫荧光显微镜检查图像。图8B提供了脾的免疫荧光显微镜检查图像。图8C提供了肾的免疫荧光显微镜检查图像。所有样品都取自用以下静脉注射后十天，经转基因修饰为通过肝细胞表达人ASGR1的C57BL/6小鼠(i-iv)或野生型C57BL/6小鼠(v-viii)：1x1011野生型scAAV2-CMV-eGFP(i,v)，盐水(ii,vi)，单独的1x1011 scAAV2-N587myc-CMV-eGFP病毒载体，或具有双特异性抗myc ASGR1抗体的scAAV2-N587myc-CMV-eGFP病毒载体(iv,viii)。
图9提供了肝样品的免疫荧光显微镜检查图像，所述肝样品取自用以下静脉注射后四周，经转基因修饰为在肝细胞上表达人ASGR1的C57BL/6小鼠(D-F,J-L,P-R)或野生型C57BL/6小鼠(A-C,G-I,M-O)：2.18x1011野生型ssAAV2-CAGG-eGFP(B,C,E,F)、盐水(A,D)、单独的2.18x1011 ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP病毒载体(G-I,J-L)、或具有双特异性抗myc-ASGR1抗体的ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP病毒载体(M-O,P-R)。每个图像代表一只小鼠。
图10提供了肝样品的免疫荧光显微镜检查图像，所述肝样品取自用以下静脉注射后十天，经转基因修饰为通过肝细胞表达人ASGR1的C57BL/6小鼠：(A)野生型AAV9、(B)250nM NaCl、(C)与双特异性抗myc hCD3抗体组合的AAV9 A589myc-CAGG-eGFP病毒颗粒、或(D)与双特异性抗myc ASGR1抗体组合的AAV9 A589myc-CAGG-eGFP病毒颗粒。
图11提供了在本发明的一些实施例中有用的说明性、并非按比例的和非限制性的示例性多特异性结合分子形式。
图12提供了从荧光激活细胞分选(FACS)获得的点图，所述荧光激活细胞分选评估通过与以下一起温育的29T3-hASGR1细胞的绿色荧光(GFP)表达：(A)_仅野生型AAV8病毒载体，(C)仅AA8-N590-myc病毒载体，或以下述比率与双特异性抗hASGR1-IgG4-Fc/抗myc双特异性分子混合的pAAV RC8 N590myc病毒载体：(D)1:1、(E)1:2、(F)1:4、(G)1:8、(H)1:12、(I)1:15、(J)1:50或(K)1:100。还显示了通过模拟转染的29T3-hASGR1细胞的GFP表达(B)。对于每个实验，使用2x105细胞和1x109病毒载体。
图13提供了肝样品的免疫荧光显微镜检查图像，所述肝样品取自用以下静脉注射后十天，经转基因修饰为通过肝细胞表达人ASGR1的C57BL/6小鼠：(A)-(C)野生型AAV8、(D)-(F)AA8-N590-myc病毒载体和对照双特异性结合分子、或(G)-(I)与抗hASGR1-IgG4-Fc/抗myc双特异性结合分子组合的AAV8 N590myc-CAGG-eGFP病毒颗粒。
图14提供了从荧光激活细胞分选(FACS)获得的点图，所述荧光激活细胞分选评估通过与以下一起温育的29T3-h ENTPD3细胞的绿色荧光(GFP)表达：(A)仅野生型AAV2病毒载体，(B)仅AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP病毒载体，或以下述比率与双特异性抗hENTPD3-IgG4-Fc/抗myc双特异性分子混合的AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP病毒载体：(C)1:1、(D)1:2、(E)1:4、(F)1:8、(G)1:20、(H)1:50、(I)1:100或(K)1:200。对于每个实验，使用2x105细胞和1x109病毒载体。
图15A提供了肝样品的免疫荧光显微镜检查图像，图15B提供了肠样品的免疫荧光显微镜检查图像，且图15C提供了胰腺样品的免疫荧光显微镜检查图像。所有样品都取自用以下静脉注射后十天的野生型C57BL/6小鼠：PBS(15A(i)、15B(i)和15C(i))、5x1011野生型AAV9(15A(ii)、15B(ii)和15C(ii))、具有1x103无关的双特异性IgG4-Fc/抗myc结合蛋白的5x1011 AAV2-N587myc-CAGG-eGFP病毒载体(15A(iii)、15B(iii)和15C(iii))、或具有1x1013双特异性hENTPD3-IgG4-Fc/抗myc结合蛋白的5x1011 AAV2-N587myc-CAGG-eGFP病毒载体(15A(iv)、15B(iv)和15C(iv))。
具体实施方式
利用未经修饰的病毒衣壳或经支架修饰的病毒衣壳的衔接子方法的常见问题已是经修饰衣壳的亚最佳转导效率。(Grifman等人(2001)Mol.Ther.3:964-75)。例如，Curiel等人描述了重组腺病毒载体的生成和表征，所述重组腺病毒载体含有具有RGD-4C序列的纤维，所述RGD-4C序列遗传掺入羧基末端结节结构域的HI环内，并且证实纤维结节的HI环作为用于掺入短肽配体的最佳位点的效用。参见例如，美国专利号7,297,542；还参见Beatty和Curiel(2012)Adv.Cancer.Res.115:39-67。类似地，将配体肽插入AAV衣壳蛋白内导致衣壳，所述衣壳能够在衣壳的表面上展示配体，并且通过配体与其受体的相互作用介导转导，从而通过遗传衣壳修饰来重定向病毒向性(Girod等人(1999)Nat.Med.5(9):1052-6,1438(包括勘误)(1999)；Grifman等人(2001)Mol.Ther.3(6):964-75；Nicklin等人(2001)Mol.Ther.4(3):174-81；Shi等人(2001)Hum Gene Ther.17(3):353-61(2006)；Wu等人(2000)J.Virol.74(18):8635-47)。特别地，已证实在AAV衣壳蛋白VP1的插入位点I-587处插入结合整联蛋白的Arg-Gly-Asp(RGD)基序，使得AAV病毒载体能够经由αvβ1整联蛋白转导细胞(Girod等人(1999)，同上)。相比之下，尽管在氨基酸R447(I-447)之后插入14氨基酸肽L14导致衣壳仍被构象敏感性抗体A20识别，但此类重组病毒载体不能转导表达L-14受体的细胞(Girod等人，1999；参照Wu等人(2000)(报道血凝素(HA)肽在位置I-447处的插入和表达HA肽的细胞的成功转导)。Myc表位在T448和N449之间的插入被抗Myc抗体识别，并且因此存在于衣壳的表面上，但导致灭活的病毒载体。(Grifman等人，2001)。相比之下，再次对于NGR基序在N587之后的插入，而不是c-myc在N587之后的插入报道了成功重靶向。(Grifman等人，2001)。美国专利号9,624,274描述了AAV衣壳蛋白的I-453作为用于异源表位的合适插入位点。尽管这些研究证实异源肽例如表位通过AAV衣壳蛋白的成功插入和展示，但这些研究无一提供了以下的任何期望：特异性结合异源肽和细胞表面蛋白的多特异性结合分子，例如双特异性结合分子，例如双特异性抗体，可以将经修饰的病毒载体重靶向表达细胞表面蛋白的细胞，并且恢复其转导效率。
本文公开的是用异源表位修饰的重组病毒衣壳蛋白，其可以与多特异性结合分子结合使用，所述多特异性结合分子包含特异性结合表位的互补位例如Fv结构域、以及结合在靶细胞的表面上表达的受体的配体。如本文所示，使具有由本文所述的衣壳蛋白形成的衣壳的病毒载体与多特异性结合分子以一定比率接触，将病毒衣壳的转导效率恢复到与野生型病毒可比较的水平，参见例如实例2。一般地，如本文所述的用异源表位修饰的衣壳蛋白可以源自无包膜病毒，例如但不限于腺病毒(Ad)和腺相关病毒(AAV)。
尽管本发明已参考许多实施例特别显示且描述，但本领域技术人员将理解，可以对本文公开的各种实施例做出形式和细节上的改变，而不脱离本发明的精神和范围，并且本文公开的各种实施例并不预期充当关于权利要求的范围的限制。
尽管现在描述了一些优选方法和材料，但与本文描述的那些相似或等价的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中。本文引用的所有出版物都以引用的方式并入本文以整体描述。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物。因此，例如，对“一种方法”的提及包括本文所述类型，和/或在阅读本公开内容后，对于本领域技术人员将变得显而易见的一种或多种方法和/或步骤。
术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含通过二硫键相互连接的四条多肽链：两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变结构域(VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含至少三个结构域，CH1、CH2、CH3和任选的CH4。每条轻链包含轻链可变结构域(CH)和轻链恒定区(CL)。重链可变结构域和轻链可变结构域还可以细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更保守的、称为构架区(FR)的区域。每个重链可变结构域和轻链可变结构域包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可以缩写为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可以缩写为LCDR1、LCDR2和LCDR3。通常的四聚体抗体结构包含两个等同的抗原结合结构域，其各自通过VH和VL结构域的结合形成，并且其各自与分别的CH和CL结构域一起形成抗体Fv区。单结构域抗体包含单个抗原结合结构域，例如，VH或VL。术语“抗体”涵盖单克隆抗体、多特异性(例如双特异性)抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab′)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、微抗体、双抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对抗原特异性TCR的抗Id抗体)、以及上述任一种的表位结合片段。术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”也指共价双抗体，例如在美国专利申请公开2007/0004909中公开的那些，以及Ig-DARTS，例如在美国专利申请公开2009/0060910中公开的那些。抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以具有任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
抗体的抗原结合结构域，例如识别并结合抗原表位的抗体部分，也被称为“互补位”。它是抗体Fv区的小区域(具有5至10个氨基酸)，抗原结合片段的部分(Fab区)，并且可能含有抗体重链和/或轻链的部分。当互补位以高亲和力结合表位时，互补位特异性结合表位。术语“高亲和力”抗体指具有关于其靶表位约10-9M或更低(例如，约1x10-9M、1x10-10M、1x10-11M或约1x10-12M)的KD。在一个实施例中，通过表面等离振子共振例如BIACORETM来测量KD；在另一个实施例中，通过ELISA来测量KD。
短语“互补决定区”或术语“CDR”包括由生物的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，其通常(即，在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如抗体或T细胞受体)的轻链或重链可变区中的两个构架区之间。CDR可以由例如种系序列或者重排序列或未重排序列，并且例如由幼稚或成熟的B细胞或T细胞编码。CDR可以进行体细胞突变(例如，不同于动物的种系中编码的序列)，进行人源化和/或用氨基酸取代、添加或缺失进行修饰。在一些情况下(例如，对于CDR3)，CDR可以由两个或更多个序列(例如，种系序列)编码，所述两个或更多个序列并非邻接的(例如，在未重排的核酸序列中)，但例如由于剪接或连接序列(例如，V-D-J重组以形成重链CDR3)，在B细胞核酸序列中是邻接的。
“表位”是大分子的部分，其被免疫系统识别，特别是被抗体、B细胞或细胞毒性T细胞识别。尽管通常认为表位源自非自身蛋白，但源自宿主的可以被识别的序列也被分类为表位。表位具有至少4个氨基酸，优选4至30个氨基酸，更优选5至20个氨基酸，特别是5至15个氨基酸的长度。表位可以是线性的或三维的，所述三维表位通常由在一级蛋白质结构中彼此远离，但在二级结构和/或三级结构中变得紧密相关的氨基酸形成。被B细胞特异性识别的表位称为B细胞表位。
短语“反向末端重复”或“ITR”包括有效复制所需的腺相关病毒的基因组中的对称核酸序列。ITR序列位于AAV DNA基因组的每个末端处。ITR充当病毒DNA合成的复制起点，并且是用于生成AAV整合载体的必需顺式组分。
短语“轻链”包括来自任何生物的免疫球蛋白轻链序列，并且除非另有说明，否则包括人κ和λ轻链和VpreB以及替代轻链。除非另有说明，否则轻链可变结构域通常包括三个轻链CDR和四个构架(FR)区。一般地，全长轻链从氨基末端到羧基末端包括可变结构域和轻链恒定区，所述可变结构域包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。轻链可变结构域由轻链可变区基因序列编码，所述轻链可变区基因序列一般包含源自种系中存在的V和J区段储库的VL和JL区段。关于各种生物的V和J轻链区段的序列、位置和命名法可以在IMGT数据库www.imgt.org中找到。轻链包括例如不选择性结合第一表位或第二表位的那些，所述第一表位或第二表位被它们在其中出现的表位结合蛋白选择性结合。轻链还包括这样的轻链，其结合且识别或者帮助重链或另一条轻链结合且识别，被它们在其中出现的表位结合蛋白选择性结合的一个或多个表位。共同轻链或通用轻链包括源自人Vκ1-39Jκ基因或人Vκ3-20Jκ基因的那些，并且包括其体细胞突变的(例如亲和力成熟的)形式。示例性的人VL区段包括人Vκ1-39基因区段、人Vκ3-20基因区段、人Vλ1-40基因区段、人Vλ1-44基因区段、人V2-8基因片段、人V2-14基因片段和人V3-21基因片段，并且包括其体细胞突变的(例如亲和力成熟的)形式。可以制备轻链，其包含来自一种生物(例如人或啮齿类动物，例如大鼠或小鼠；或鸟类，例如鸡)的可变结构域、以及来自相同或不同生物(例如人或啮齿类动物，例如大鼠或小鼠；或鸟类，例如鸡)的恒定区。
术语“约”或“大约”包括在值的统计上有意义的范围内。此类范围可以在给定值或范围的一个数量级内，优选在50％内，更优选在20％内，还更优选在10％内，且甚至更优选在5％内。由术语“约”或“大约”所涵盖的容许变化取决于所研究的特定系统，并且可以由本领域普通技术人员容易地了解。
术语“亲和标签”包括其为特异性结合对的成员的多肽序列，例如，其以高亲和力特异性结合另一种多肽序列，例如抗体互补位。示例性和非限制性亲和标签包括六组氨酸标签、FLAG标签、Strep II标签、链霉抗生物素蛋白结合肽(SBP)标签、钙调蛋白结合肽(CBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、S标签、HA标签和c-Myc标签。(在Zhao等人(2013)J.Analytical Meth.Chem.1-8；中综述；所述参考文献以引用的方式并入本文)。
术语“衣壳蛋白”包括其为病毒衣壳的部分的蛋白质。对于腺相关病毒，衣壳蛋白一般称为VP1、VP2和/或VP3，并且各自由单个cap基因编码。对于AAV，这三种AAV衣壳蛋白经由交替的mRNA剪接和/或交替的翻译起始密码子使用，以重叠的方式由cap开放读码框(ORF)产生，尽管所有三种蛋白质都使用共同的终止密码子。Warrington等人(2004)J.Virol.78:6595，以引用的方式整体并入本文。AAV2的VP1一般从2.4-kb mRNA上的ATG起始密码子(氨基酸M1)翻译，而AAV2的VP2和VP3起于较小的2.3-kb mRNA，使用较弱的ACG起始密码子用于产生VP2(氨基酸T138)，并且通读翻译到下一个可用的ATG密码子(氨基酸M203)用于产生最丰富的衣壳蛋白VP3。Warrington，同上；Rutledge等人(1998)J.Virol.72:309-19，以引用的方式整体并入本文。腺相关病毒的衣壳蛋白的氨基酸序列是本领域众所周知的，并且一般是保守的，特别依赖于细小病毒。参见Rutledge等人，同上。例如，Rutledge等人(1998)，同上，在图4B处提供了关于AAV2、AAV3、AAV4和AAV6的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的氨基酸序列比对，其中关于VP1、VP2和VP3衣壳蛋白各自的起始位点通过箭头指示，并且可变结构域被框出。相应地，尽管本文提供的氨基酸位置可以关于AAV的VP1衣壳蛋白提供，并且未进一步指定的本文提供的氨基酸位置指如SEQ ID NO:1所示的主要外壳蛋白VP1的AAV2序列，技术人员能够分别地且容易地确定相同氨基酸在AAV的VP2和/或VP3衣壳蛋白内的位置，以及氨基酸在不同血清型中的相应位置。另外，技术人员能够在不同AAV血清型的衣壳蛋白之间交换结构域，用于形成“嵌合衣壳蛋白”。
用于生成“嵌合AAV衣壳蛋白”的两个AAV衣壳蛋白构建体之间的结构域交换已得到描述，参见例如Shen等人(2007)Mol.Therapy 15(11):1955-1962，其以引用的方式整体并入本文。“嵌合AAV衣壳蛋白”包括AAV衣壳蛋白，其包含来自两种或更多种不同AAV血清型的氨基酸序列，例如结构域，并且能够形成和/或形成AAV样病毒衣壳/病毒颗粒。嵌合AAV衣壳蛋白由嵌合AAV衣壳基因，例如包含多个(例如至少两个)核酸序列的核苷酸编码，所述多个各自与编码不同AAV血清型的衣壳蛋白的衣壳基因的一部分等同，并且所述多个一起编码功能性嵌合AAV衣壳蛋白。提及与特定AAV血清型有关的嵌合衣壳蛋白指示：该衣壳蛋白包含来自该血清型的衣壳蛋白的一个或多个结构域，以及来自不同血清型的衣壳蛋白的一个或多个结构域。例如，AAV2嵌合衣壳蛋白包括包含以下的衣壳蛋白：AAV2VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的一个或多个结构域，以及不同AAV的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的一个或多个结构域。
“嵌合衣壳”包含至少两组VP1、VP2和/或VP3蛋白，其中每组由不同的cap基因编码。
在一些实施例中，本文所述的嵌合衣壳包含由cap基因编码重组VP1、VP2和/或VP3蛋白，所述cap基因通过插入编码异源表位的核酸序列进行基因修饰，并且还包含由参考cap基因编码的VP1、VP2和/或VP3蛋白，所述参考cap基因例如编码与重组VP1、VP2和/或VP3蛋白具有相同AAV血清型的野生型VP1、VP2和/或VP3蛋白的野生型参考cap基因，编码与重组VP1、VP2和VP3蛋白等同，但不存在异源表位的VP1、VP2和/或VP3蛋白的对照参考cap基因，编码与重组VP1、VP2和/或VP3蛋白具有相同AAV血清型，但具有突变(例如，插入、取代、缺失)的基本上野生型的VP1、VP2和/或VP3蛋白的突变野生型参考cap基因，所述突变优选减少野生型VP1、VP2和VP3蛋白的向性。在一些实施例中，参考衣壳蛋白是嵌合参考蛋白，其包含与重组VP1、VP2和/或VP3蛋白具有相同AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3蛋白的至少一个结构域。在一些实施例中，参考cap基因编码嵌合VP1、VP2和/或VP3蛋白。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任何生物的免疫球蛋白重链序列，包括免疫球蛋白重链恒定区序列。除非另有说明，否则重链可变结构域包括三个重链CDR和四个FR区。重链的片段包括CDR、CDR和FR及其组合。通常的重链在可变结构域之后具有(从N末端到C末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域。重链的功能片段包括这样的片段，其能够特异性识别表位(例如，用在微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的KD识别表位)，并且能够由细胞表达且分泌，并且包含至少一个CDR。重链可变结构域由可变区核苷酸序列编码，所述可变区核苷酸序列一般包含源自种系中存在的VH、DH和JH区段储库的VH、DH和JH区段。关于各种生物的V、D和J重链区段的序列、位置和命名法可以在IMGT数据库中找到，所述IMGT数据库可经由互联网在万维网(www)上的URL“imgt.org”处访问。
术语“仅重链抗体”、“仅重链抗原结合蛋白”、“单结构域抗原结合蛋白”、“单结构域结合蛋白”等等指包含免疫球蛋白样链的单体或同型二聚体免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白样链包含与重链恒定区可操作地连接的可变结构域，所述重链恒定区不能与轻链结合，因为该重链恒定区通常缺乏功能性CH1结构域。相应地，术语“仅重链抗体”、“仅重链抗原结合蛋白”、“单结构域抗原结合蛋白”、“单结构域结合蛋白”等等涵盖以下两者：(i)包含免疫球蛋白样链之一的单体单结构域抗原结合蛋白，所述免疫球蛋白样链包含与缺乏功能性CH1结构域的重链恒定区可操作连接的可变结构域，或(ii)包含两条免疫球蛋白样链的同型二聚体单结构域抗原结合蛋白，所述免疫球蛋白样链各自包含与缺乏功能性CH1结构域的重链恒定区可操作连接的可变结构域。在各个方面，同型二聚体单结构域抗原结合蛋白包含两条等同的免疫球蛋白样链，所述免疫球蛋白样链各自包含与缺乏功能性CH1结构域的等同重链恒定区可操作连接的等同可变结构域。另外，单结构域抗原结合蛋白的每条免疫球蛋白样链包含与重链恒定区(CH)基因序列连接的可变结构域，所述可变结构域可以源自重链可变区基因区段(例如，VH、DH、JH)、轻链基因区段(例如，VL、JL)或其组合，所述重链恒定区(CH)基因序列包含在重链恒定区基因(例如IgG、IgA、IgE、IgD或其组合)的CH1编码序列(以及任选地铰链区)中的缺失或灭活突变。包含源自重链基因区段的可变结构域的单结构域抗原结合蛋白可以被称为“VH单结构域抗体”或“VH单结构域抗原结合蛋白”，参见例如，美国专利号8,754,287；美国专利公开号20140289876；20150197553；20150197554；20150197555；20150196015；20150197556和20150197557，所述专利各自以引用的方式整体并入。包含源自轻链基因区段的可变结构域的单结构域抗原结合蛋白可以被称为或“VL单结构域抗原结合蛋白”，参见例如美国公开号20150289489，其以引用的方式整体并入。
短语“轻链”包括来自任何生物的免疫球蛋白轻链序列，并且除非另有说明，否则包括人kappa(κ)和lambda(λ)轻链和VpreB以及替代轻链。除非另有说明，否则轻链可变结构域通常包括三个轻链CDR和四个构架(FR)区。一般地，全长轻链从氨基末端到羧基末端包括可变结构域和轻链恒定区，所述可变结构域包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4和轻链恒定区氨基酸序列。轻链可变结构域由轻链可变区核苷酸序列编码，所述轻链可变区核苷酸序列一般包含源自种系中存在的轻链V和J基因区段储库的轻链VL和轻链JL基因区段。关于各种生物的轻链V和J基因区段的序列、位置和命名法可以在IMGT数据库中找到，所述IMGT数据库可经由互联网在万维网(www)上的URL“imgt.org”处访问。轻链包括例如不选择性结合第一表位或第二表位的那些，所述第一表位或第二表位被它们在其中出现的表位结合蛋白选择性结合。轻链还包括这样的轻链，其结合且识别或帮助重链结合且识别，被它们在其中出现的表位结合蛋白选择性结合的一个或多个表位。轻链还包括这样的轻链，其结合且识别或帮助重链结合且识别，被它们在其中出现的表位结合蛋白选择性结合的一个或多个表位。共同轻链或通用轻链包括源自人Vκ1-39Jκ5基因或人Vκ3-20Jκ1基因的那些，并且包括其体细胞突变的(例如亲和力成熟的)形式。
如本文使用的，短语“可操作地连接”包括组分或元件的物理并列(例如，在三维空间中)，所述组分或元件彼此直接或间接相互作用，或以其它方式彼此协调以参与生物事件，所述并列达到或允许此类相互作用和/或协调。仅举一个例子，当核酸中的控制序列(例如，表达控制序列)相对于编码序列这样定位，使得它的存在或不存在影响编码序列的表达和/或活性时，它被说成“可操作地连接”至编码序列。在许多实施例中，“可操作的连接”涉及相关组分或元件彼此的共价连接。然而，本领域技术人员将容易了解，在一些实施例中，不需要共价连接来达到有效的可操作连接。例如，在一些实施例中，与它们控制的编码序列可操作连接的核酸控制序列与目的核苷酸邻接。可替代地或另外地，在一些实施例中，一种或多种此类控制序列反式或在一段距离处起作用，以控制目的编码序列。在一些实施例中，如本文使用的术语“表达控制序列”指对实现它们与之连接的编码序列的表达和加工是必需和/或足够的多核苷酸序列。在一些实施例中，表达控制序列可以是或包含适当的转录起始、终止、启动子和/或增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和多聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和/或，在一些实施例中，增强蛋白质分泌的序列。在一些实施例中，一种或多种控制序列优先地或专一地在特定宿主细胞或生物或其类型中具有活性。仅举一个例子，在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，在许多实施例中，控制序列通常包括启动子、增强子和/或转录终止序列。本领域普通技术人员根据上下文中将了解，在许多实施例中，术语“控制序列”指其存在对于表达和加工是必需的组分，并且在一些实施例中，包括其存在对于表达是有利的组分(包括例如前导序列、靶向序列和/或融合配偶体序列)。
术语“重组衣壳蛋白”包括与野生型病毒的相应衣壳蛋白相比，具有至少一个突变的衣壳蛋白，所述野生型病毒可以是用于比较研究的参考和/或对照病毒。重组衣壳蛋白包括包含异源表位的衣壳蛋白，所述异源表位可以插入衣壳蛋白内和/或由衣壳蛋白展示。在这个背景下的“异源”意指与衣壳蛋白源自其的病毒相比是异源的。插入的氨基酸可以简单地插入衣壳蛋白的两个给定氨基酸之间。氨基酸的插入也可以与衣壳蛋白的给定氨基酸在插入位点处的缺失一起进行，例如，1个或更多个衣壳蛋白氨基酸被5个或更多个异源氨基酸取代)。
术语“多特异性结合分子”和“双特异性结合分子”等等一般且分别指包含至少两个和仅两个非等同的结合组分的结合分子，其中每个结合组分特异性结合不同的表位—或在两个不同的分子上(例如，在两个不同免疫原上的不同表位)，或在相同的分子上(例如，在相同免疫原上的不同表位)。一般地，本文双特异性结合分子的结合组分之一特异性结合由病毒衣壳蛋白展示的异源表位，并且第二结合组分对于主要地和/或优先地由靶细胞表达的蛋白质，例如细胞表面标记物，例如T细胞标记物(例如CD3、CD28等)是特异性的。可以例如通过组合识别相同免疫原的不同表位的结合组分来制备双特异性结合分子。例如，可以将编码识别不同表位的结合组分的核酸序列(例如，轻链或重链可变序列)融合至编码相同或不同重链恒定区、相同或不同轻链恒定区、或分别地重链恒定区和轻链恒定区的核酸序列，并且此类序列可以作为多特异性抗原结合蛋白在细胞中表达，其形式类似于Fab结构、scFab结构、双抗体结构、scFv结构、scFv-Fc结构、scFv-拉链结构、类似于包括同源通用轻链的通常抗体的四聚体结构、包含通常二价抗体的四聚体结构，所述二价抗体包括同源通用轻链和/或附加到一条或两条重链(例如，在N末端和/或C末端处)和/或一条或两条轻链(例如，在N末端和/或C末端处)的另外结合组分(例如，scFv、scFv-拉链、scFab等)。多特异性，特别是双特异性结合分子的各种形式是众所周知的，参见例如Brinkmann和Konterman(2017)mAbs 9:182-212，其以引用的方式整体并入本文。
示例性的多特异性结合分子具有两条重链以及免疫球蛋白轻链，所述重链各自具有重链CDR，随后为(N末端至C末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域，所述免疫球蛋白轻链或者不赋予表位结合特异性，但可以与每条重链结合(例如，共同轻链)，或者可以与每条重链结合，并且可以结合被重链表位结合区结合的一个或多个表位，或者可以与每条重链结合，并且使得一条或两条重链能够与一个或两个表位结合。在一些实施例中，多特异性结合分子包含：(1)可操作地连接至第一重链恒定区的免疫球蛋白重链可变结构域，所述第一重链恒定区包含选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人IgG的第一CH3氨基酸序列，以及(2)免疫球蛋白重链可变结构域，其中所述第二免疫球蛋白重链可变结构域可操作地连接至第二重链恒定区，所述第二重链恒定区包含选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人IgG的第二CH3氨基酸序列，其中所述第一重链可变结构域或第二重链可变结构域(具有或不具有同源轻链)结合如本文所述的异源表位，而另一个重链可变结构域(具有或不具有同源轻链)结合靶细胞上的受体，并且其中所述第一重链恒定区以提供多特异性结合蛋白的更容易分离的方式与第二恒定链区结合，例如其中所述第一重链恒定区和第二重链恒定区形成旋钮进洞(knobs-into-hole)(KIH)形式，或其中所述第二CH3氨基酸序列包含修饰，所述修饰减少或消除第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合(参见例如，美国专利号8,586,713，其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施例中，多特异性结合分子包含：(1)可操作地连接至第一重链恒定区的免疫球蛋白重链可变结构域，所述第一重链恒定区包含选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人IgG的第一CH3氨基酸序列，以及(2)免疫球蛋白重链可变结构域，其中所述第二免疫球蛋白重链可变结构域可操作地连接至第二重链恒定区，所述第二重链恒定区包含选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人IgG的第二CH3氨基酸序列，其中所述第一重链可变结构域和第二重链可变结构域(具有或不具有同源轻链)结合相同或不同的抗原，其中所述第一重链恒定区或第二重链恒定区经修饰为还包含另外的结合结构域(例如，与如本文所述的异源表位结合的scFv或Fv，例如其中所述另外的结合结构域被附加到一条或两条重链的C末端或N末端)，并且其中所述第一重链恒定区以提供多特异性结合蛋白的更容易分离的方式与第二恒定链区结合，例如其中所述第一重链恒定区和第二重链恒定区形成旋钮进洞(KIH)形式，或其中所述第二CH3氨基酸序列包含修饰，所述修饰减少或消除第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合。在其中第二CH3氨基酸序列包含减少或消除的与蛋白A的结合的一些实施例中，第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(按照IMGT外显子编号；按照EU编号的H435R)。在一个实施例中，第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(按照IMGT外显子编号；按照EU的H436F)。在另一个实施例中，第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(按照IMGT外显子编号；按照EU编号的H435R)和Y96F修饰(按照IMGT外显子编号；按照EU的H436F)两者。在一些实施例中，第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人IgG1，并且还包含选自D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；按照EU的D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)的突变。在一些实施例中，第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人IgG2，并且还包含选自N44S、K52N和V82I(IMGT：按照EU的N384S、K392N和V422I)的突变。在一些实施例中，第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人IgG4，并且还包含选自Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT：按照EU的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)的突变。在一些实施例中，重链恒定区氨基酸序列是非人恒定区氨基酸序列，并且重链恒定区氨基酸序列包含上述修饰类型的任何一种或多种。
在各种实施例中，Fc结构域经修饰为具有改变的Fc受体结合，其依次又影响效应子功能。在一些实施例中，包括Fc结构域的经改造的重链恒定区(CH)是嵌合的。像这样，嵌合的CH区组合源自多于一种免疫球蛋白同种型的CH结构域。例如，嵌合CH区包含源自人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的CH2结构域的部分或全部，其与源自人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的CH3结构域的部分或全部组合。在一些实施例中，嵌合CH区含有嵌合铰链区。例如，嵌合铰链可以包含源自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”氨基酸序列(根据EU编号从位置216到227的氨基酸残基；根据Kabat编号从位置226到240的氨基酸残基)，其与源自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列(根据EU编号从位置228到236的氨基酸残基；根据Kabat编号从位置241到249的氨基酸残基)组合。在一些实施例中，嵌合铰链区包含源自人IgG1或人IgG4上铰链的氨基酸残基、以及源自人IgG2下铰链的氨基酸残基。
在一些实施例中，Fc结构域可以进行改造，以激活正常Fc效应子功能的全部、一些或无一，而不影响含Fc蛋白的(例如抗体的)所需药代动力学特性。关于包含嵌合CH区且具有改变的效应子功能的蛋白质的例子，参见整体并入本文的WO2014022540。
术语“靶细胞”包括其中需要目的核苷酸表达的任何细胞。优选地，靶细胞在其表面上显示出蛋白质例如受体，所述蛋白质允许细胞用重靶向配体进行靶向，如下所述。优选地，靶蛋白例如受体对于靶细胞是特异性的，例如是“细胞特异性标记物”、“细胞特异性抗原”等等。术语“细胞特异性标记物”、“细胞特异性抗原”、“器官特异性标记物”、“组织特异性标记物”等等指这样的蛋白质并且包括这样的蛋白质，关于所述蛋白质的表达被它对于其为特异性标记物的细胞、组织和/或器官富集。在蛋白质表达的上下文中，“富集”指以下并且包括以下：细胞/组织/器官的特异性蛋白质主要地、优先地或唯一地由蛋白质对于其为特异性标记物的细胞/组织/器官的表达或过表达，尽管此类标记物也可以由其它细胞/组织/器官以最低水平表达。人类蛋白质图谱(Human Protein Atlas)可以用于确定蛋白质是否为细胞/组织/器官特异性标记物，并且还提供了细胞/组织/器官特异性蛋白质的储库。参见，www.proteinatlas.org；还参见Uhlen等人(2010)Nat.Biotech.28:1248-50，其以引用的方式整体并入本文。
术语“转导”或“感染”等指通过病毒载体将核酸引入靶细胞内。与转导等等有关的术语效率，例如“转导效率”指在与设定数目的包含目的核苷酸的病毒载体一起温育后，表达目的核苷酸的细胞级分(例如百分比)。确定转导效率的众所周知的方法包括用荧光报道基因转导的细胞的荧光激活细胞分选，用于目的核苷酸表达的PCR等。
如本文使用的，术语“野生型”包括具有如在自然界中在“正常”(与突变型、患病的、改变的等形成对比)状态或背景下发现的结构和/或活性的实体。本领域普通技术人员将了解，野生型病毒载体，例如野生型衣壳蛋白，可以在比较研究中用作参考病毒载体。一般地，参考病毒衣壳蛋白/衣壳/载体与测试病毒衣壳蛋白/衣壳/载体等同，但具有对于其待测试效应的改变。例如，为了确定例如将异源表位插入测试病毒载体内对转导效率的作用，测试病毒载体的转导效率(在适当的多特异性结合分子的不存在或存在下)可以与参考病毒载体的转导效率(需要时，在适当的多特异性结合分子的不存在或存在下)进行比较，所述参考病毒载体在每种情况下均与测试病毒载体等同(例如，另外的突变、目的核苷酸、病毒载体和靶细胞的数目等)，除了存在异源表位之外。
重组病毒衣壳蛋白以及病毒载体和核酸
在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白是Ad衣壳蛋白，例如选自Ad1、Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad6和Ad7的Ad血清型的衣壳蛋白。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自Ad2衣壳基因。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自Ad5衣壳基因。在一些实施例中，如本文所述的重组Ad病毒衣壳蛋白包含在纤维蛋白结构域中，例如在纤维蛋白的羧基末端、纤维结节和/或纤维结节的HI环处的异源表位。
在一些实施例中，本文所述的重组病毒衣壳蛋白源自腺相关病毒(AAV)衣壳基因，例如，是选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9的AAV血清型的经基因修饰的衣壳蛋白。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV2衣壳基因、AAV6衣壳基因、AAV8衣壳基因或AAV9衣壳基因。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV2衣壳基因，例如是经基因修饰的AAV2 VP1衣壳蛋白，关于其野生型的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1所示。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV8衣壳基因，例如是经基因修饰的AAV8 VP1衣壳蛋白，关于其野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV9衣壳基因，例如是经基因修饰的AAV9 VP1衣壳蛋白，关于其野生型的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5所示。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白源自AAV6衣壳基因，例如是AAV6的经基因修饰的VP1衣壳蛋白。在一些实施例中，将异源表位插入AAV9衣壳蛋白的I-453内。
一般地，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白包含插入衣壳蛋白内和/或由衣壳蛋白展示的异源表位，使得异源表位减少和/或消除了衣壳蛋白或包含其的衣壳的天然向性。在一些实施例中，异源表位插入涉及野生型参考衣壳蛋白的天然向性的衣壳蛋白区域内，例如涉及细胞受体的衣壳蛋白区域。在一些实施例中，异源表位插入Ad纤维蛋白的结节结构域内和/或由其展示。在一些实施例中，异源表位插入Ad纤维蛋白的HI环和/或由其显示。在一些实施例中，异源表位插入选自以下的氨基酸位置之后：AAV2衣壳蛋白VP1的G453、AAV2衣壳蛋白VP1的N587、AAV6衣壳蛋白VP1的Q585、AAV9衣壳蛋白VP1的G453和AAV9衣壳蛋白VP1的A589。在一些实施例中，异源表位插入和/或展示在AAV2 VP1衣壳的氨基酸N587和R588之间。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包含重组病毒衣壳的病毒载体和/或包含重组病毒衣壳的组合物包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包含重组病毒衣壳的病毒载体和/或包含重组病毒衣壳的组合物包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包含重组病毒衣壳的病毒载体和/或包含重组病毒衣壳的组合物包含由如SEQ ID NO:25所示的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包含重组病毒衣壳的病毒载体和/或包含重组病毒衣壳的组合物包含由如SEQ ID NO:26所示的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包含重组病毒衣壳的病毒载体和/或包含重组病毒衣壳的组合物包含由如SEQ IDNO:27所示的核酸序列编码的氨基酸序列。通过使用AAV2鉴定的另外的合适插入位点是本领域众所周知的(Wu等人(2000)J.Virol.74:8635-8647)，并且包括I-1、I-34、I-138、I-139、I-161、I 261、I-266、I-381、I-447、I-448、I-459、I-471、I-520、I-534、I-570、I-573、I-584、I-587、I-588、I 591、I-657、I-664、I-713和I-716。如本文所述的重组病毒衣壳蛋白可以是AAV2衣壳蛋白，其包含插入选自以下的位置内的异源表位：I-1、I-34、I-138、I-139、I-161、I 261、I-266、I-381、I-447、I-448、I-459、I-471、I-520、I-534、I-570、I-573、I-584、I-587、I-588、I 591、I-657、I-664、I-713、I-716及其组合。通过使用另外的AAV血清型鉴定的另外的合适插入位点是众所周知的，并且包括I-587(AAV1)、I-589(AAV1)、I-585(AAV3)、I-585(AAV4)和I-585(AAV5)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白可以是AAV2衣壳蛋白，其包含插入选自以下的位置内的异源表位：I-587(AAV1)、I-589(AAV1)、I-585(AAV3)、I-585(AAV4)、I-585(AAV5)及其组合。
本文使用的命名法I-###指相对于AAV衣壳蛋白的VP1蛋白，具有###命名氨基酸编号的插入位点，然而，此类插入可以直接位于给定氨基酸的5个氨基酸的N末端或C末端，优选给定氨基酸的3个，更优选2个，尤其是1个氨基酸的N末端或C末端的序列中的一个氨基酸的N末端或C末端，优选C末端。另外，本文所提及的位置相对于由AAV衣壳基因编码的VP1蛋白，并且通过执行由参考AAV衣壳基因编码的VP1、VP2和VP3蛋白的序列比对，对于由衣壳基因编码的VP2和VP3衣壳蛋白可以容易地鉴定相应位置(及其突变)。
相应地，由于衣壳蛋白由具有交错起始密码子的相同基因的重叠读码框编码，cap基因的这些位点之一的编码核酸的相应位置内的插入导致插入VP1、VP2和/或VP3内。因此，对于AAV2，例如，根据这个命名法，氨基酸1和138之间的插入仅插入VP1内，138和203之间的插入被插入VP1和VP2内，并且203和C末端之间的插入被插入VP1、VP2和VP3内，这当然也是关于插入位点I-587的情况。因此，本发明涵盖在VP1、VP2和/或VP3蛋白中具有相应插入的AAV的结构基因。
另外，由于至少大段的高度保守和紧密相关的家族成员的大成员，可以通过执行氨基酸比对或通过比较衣壳结构，来鉴定除列举的AAV外的关于AAV的相应插入位点。关于不同AAV衣壳蛋白的示例性比对，参见例如，Rutledge等人(1998)J.Virol.72:309-19和美国专利号9,624,274，所述参考文献各自以引用的方式整体并入本文。
在本文公开的由重组病毒衣壳组成的一些组合物中(例如，在不存在多特异性结合分子的情况下)，重组病毒衣壳蛋白是具有在I587位点处插入的异源表位的AAV2衣壳蛋白VP1，其中所述异源表位不包含Arg-Gly-Asp(RGD)基序、NGR基序或c-myc。在本文公开的由重组病毒衣壳组成的一些组合物中(例如，在不存在多特异性结合分子的情况下)，重组病毒衣壳蛋白是具有在T448和N449之间插入的异源表位的VP1衣壳蛋白，其中所述异源表位不包含c-myc。在本文公开的由重组病毒衣壳组成的一些组合物中(例如，在不存在多特异性结合分子的情况下)，重组病毒衣壳蛋白是具有在I-447位点处插入的异源表位的VP1衣壳蛋白，其中所述异源表位不包含L14或HA。
在包含重组病毒衣壳(例如，还包含多特异性结合分子)的一些组合物中，重组病毒衣壳蛋白是具有在I587位点处插入的异源表位的VP1衣壳蛋白，其中所述异源表位包含Arg-Gly-Asp(RGD)基序、NGR基序或c-myc。在本文公开的包含重组病毒衣壳(例如，还包含多特异性结合分子)的一些组合物中，病毒衣壳是VP1衣壳，异源表位包含c-myc，并且异源表位插入在T448和N449之间或在N587和R588之间。在本文公开的包含重组病毒衣壳(例如，还包含多特异性结合分子)的一些组合物中，重组病毒衣壳蛋白是具有在I-447位点处插入的异源表位的VP1衣壳蛋白，其中所述异源表位包含L14或HA。在本文公开的包含重组病毒衣壳的一些组合物中(例如，在多特异性结合分子的存在下)，重组病毒衣壳蛋白是具有在T448和N449之间插入的异源表位的VP1衣壳蛋白，其中所述异源表位包含c-myc。美国专利号9,624,274描述了AAV衣壳蛋白的I-453作为用于异源表位的合适插入位点。
在一些实施例中，异源表位的插入(展示)消除了病毒载体的天然向性，例如，在不存在适当的多特异性结合分子的情况下，天然允许由野生型参考病毒载体感染的细胞和/或靶细胞的转导是无法检测的。在一些实施例中，例如，与天然允许由野生型参考病毒载体感染的细胞的转导相比，异源表位的插入(展示)减少了病毒载体的天然向性。在一些实施例中，异源表位的插入(展示)使病毒载体的天然向性减少至少5％。在一些实施例中，异源表位的插入(展示)使病毒载体的天然向性减少至少5％。在一些实施例中，异源表位的插入(展示)使病毒载体的天然向性减少至少10％。在一些实施例中，异源表位的插入(展示)使病毒载体的天然向性减少至少20％。在一些实施例中，异源表位的插入(展示)使病毒载体的天然向性减少至少30％。在一些实施例中，异源表位的插入(展示)使病毒载体的天然向性减少至少40％。在一些实施例中，异源表位的插入(展示)使病毒载体的天然向性减少至少50％。在一些实施例中，异源表位的插入(展示)使病毒载体的天然向性减少至少60％。在一些实施例中，异源表位的插入(展示)使病毒载体的天然向性减少至少70％。在一些实施例中，异源表位的插入(展示)使病毒载体的天然向性减少至少80％。在一些实施例中，异源表位的插入(展示)使病毒载体的天然向性减少至少90％。在一些实施例中，异源表位的插入(展示)使病毒载体的天然向性减少至少95％。在一些实施例中，异源表位的插入(展示)使病毒载体的天然向性减少至少90％。在其中异源表位的插入(展示)不消除重组病毒衣壳的天然向性的这些实施例中，此类重组病毒衣壳的天然向性可以通过第二种且不同的突变消除。例如，在一个实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白可以源自AAV9衣壳基因，包含异源表位，并且还可以包含突变，例如W503A突变。
病毒从其天然宿主细胞的这种脱靶是重要的，尤其是如果预期病毒载体的全身或局部或局部区域施用，因为病毒载体通过天然宿主细胞的摄取限制了病毒的有效剂量。在AAV2和AAV6的情况下，据报道HSPG是关于大量细胞(尤其是肝细胞)中的病毒摄取的主要受体。对于AAV2，HSPG结合活性取决于一组5个碱性氨基酸：R484、R487、R585、R588和K532(Kern等人，(2003)J Virol.77(20):11072-81)。最近，报道了赖氨酸至谷氨酸盐的氨基酸取代K531E导致AAV6结合肝素或HSPG的能力的压制((Wu等人，2006)J.of Virology 80(22):11393-11397)。相应地，在HSPG作为病毒载体与HSPG结合的主要受体的情况下，优选的点突变是这样的点突变，其使由天然受体介导的病毒载体关于给定靶细胞的转导活性减少至少50％，优选至少80％，尤其是至少95％。
因而，对于结合HSPG的病毒载体优选的进一步突变是这样的突变，其通过非碱性氨基酸，例如A、D、G、Q、S和T，优选A，或在这个位置处缺乏此类碱性氨基酸的不同但高度保守的AAV血清型的相应位置处存在的氨基酸，耗尽或替换涉及分别病毒的HSPG结合的碱性氨基酸例如R、K或H，优选R或K。因而，优选的氨基酸取代是R484A、R487A、R487G、K532A、K532D、R585A、R585S、R585Q、R585A或R588T，尤其是关于AAV2的R585A和/或R588A，以及关于AAV6的K531A或K531E。本发明的一个尤其优选的实施例是AAV2的此类衣壳蛋白突变体，其另外含有两个点突变R585A和R588A，因为这两个点突变足以在很大程度上消除HSPG结合活性。这些点突变使得能够从表达HSPG的细胞的有效脱靶，出于靶向目的，所述脱靶增加分别的突变型病毒对于其新靶细胞的特异性。
本发明的一个实施例是多聚体结构，其包含本发明的重组病毒衣壳蛋白。多聚体结构包含如至少5个，优选至少10个，更优选至少30个，最优选至少60个重组病毒衣壳蛋白，其包含如本文所述的异源表位。它们可以形成规则的病毒衣壳(空病毒颗粒)或病毒载体(封装目的核苷酸的衣壳)。能够包装病毒基因组的病毒载体的形成是本文所述的重组病毒衣壳用作病毒载体的高度优选的特征。
本发明的一个实施例是编码如上所述的衣壳蛋白的核酸。核酸优选是包含请求保护的核酸序列的载体。核酸，尤其是载体对于重组表达本发明的衣壳蛋白是必需的。
本发明的一个进一步实施例是至少一种重组病毒衣壳蛋白和/或编码其的核酸，优选至少一种多聚体结构(例如，病毒载体)，用于制造基因转移载体和作为基因转移载体使用的用途。
异源表位
一般地，重组病毒衣壳蛋白和/或包含重组病毒衣壳的病毒载体包含异源表位，其使得病毒载体例如经由多特异性结合分子能够重靶向。在一些实施例中，异源表位是B细胞表位，例如长度在约1个氨基酸至约35个氨基酸之间，并且与抗体互补位例如免疫球蛋白可变结构域形成结合对。在一些实施例中，异源表位包含亲和标签。
大量标签是本领域已知的。(参见例如：Nilsson等人(1997)"Affinity fusionstrategies for detection,purification,and immobilization of recombinantproteins"Protein Expression and Purification 11:1-16,Terpe等人(2003)"Overviewof tag protein fusions:From molecular and biochemical fundamentals tocommercial systems"Applied Microbiology and Biotechnology 60:523-533，以及其中的参考文献)。亲和标签包括但不限于结合固定化二价阳离子(例如Ni2+)的多组氨酸标签(例如His-6、His-8或His-10标签)、结合固定化抗生物素蛋白的生物素部分(例如在体内生物素化的多肽序列上)、结合固定化谷胱甘肽的GST(谷胱甘肽S-转移酶)序列、结合固定化S蛋白的S标签、结合固定化抗体或其结构域或片段的抗原(包括例如结合相应抗体的T7、myc、FLAG和B标签)、FLASH标签(与特异性基于砷的部分偶联的高亲和力标签)、结合固定化配体的受体或受体结构域(或反之亦然)、结合固定化IgG的蛋白A或其衍生物(例如Z)、结合固定化直链淀粉的麦芽糖结合蛋白(MBP)、结合固定化白蛋白的白蛋白结合蛋白、结合固定化几丁质的几丁质结合结构域、结合固定化钙调蛋白的钙调蛋白结合肽、以及结合固定化纤维素的纤维素结合结构域。另一种示例性标签是从Covalys(www.covalys.com)商购可得的SNAP标签。在一些实施例中，本文公开的异源表位包含仅被抗体互补位识别的亲和标签。在一些实施例中，本文公开的异源表位包含被抗体互补位和其它特异性结合对识别的亲和标签。
在一些实施例中，异源表位和/或亲和标签不与免疫球蛋白恒定结构域形成结合对。在一些实施例中，异源表位和/或亲和标签不与金属离子，例如Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等形成结合对。在一些实施例中，异源表位并非选自链霉抗生物素蛋白、Strep II、HA、L14、4C-RGD、LH和蛋白A的多肽。
在一些实施例中，亲和标签选自FLAG(SEQ ID NO:7)、HA(SEQ ID NO:8)和c-myc(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:6)。在一些实施例中，异源表位是c-myc。
在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含侧翼为和/或可操作地连接至AAV VP1衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸的氨基酸序列EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含侧翼为和/或可操作地连接至AAV2 VP1衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸的氨基酸序列EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳包含在AAV2 VP1衣壳蛋白的N587和R588之间插入的EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包含重组病毒衣壳的病毒载体和/或包含重组病毒衣壳的组合物包含由如SEQ ID NO:25所示的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包含重组病毒衣壳的病毒载体和/或包含重组病毒衣壳的组合物包含由如SEQ ID NO:26所示的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包含重组病毒衣壳的病毒载体和/或包含重组病毒衣壳的组合物包含由如SEQ ID NO:27所示的核酸序列编码的氨基酸序列。
在一些实施例中，异源表位包含亲和标签和一个或多个接头。在一些实施例中，异源表位包含侧翼为接头的亲和标签，例如异源表位从N末端到C末端包含第一接头、亲和标签和第二接头。在一些实施例中，第一接头和第二接头各自独立地是长度至少一个氨基酸。在一些实施例中，第一接头和第二接头是等同的。
一般地，如本文所述的异源表位，例如单独或者与一个或多个接头组合的亲和标签为长度约5个氨基酸至约35个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度至少5个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度6个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度7个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度8个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度9个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度10个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度11个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度12个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度13个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度14个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度15个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度16个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度17个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度18个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度19个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度20个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度21个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度22个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度23个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度24个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度25个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度26个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度27个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度28个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度29个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度30个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度31个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度32个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度33个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度34个氨基酸。在一些实施例中，异源表位(单独或者与一个或多个接头组合)为长度35个氨基酸。
重靶向部分
在不存在多特异性结合分子，具体地包含以下的多特异性结合分子的情况下：(i)特异性结合表位的抗体互补位和(ii)特异性结合受体的重靶向配体，所述受体可以缀合至珠的表面(例如，用于纯化)或由靶细胞表达，如本文所述的病毒载体具有减少至消除的转导能力。相应地，包含(i)特异性结合表位的抗体互补位和(ii)特异性结合受体的重靶向配体的多特异性结合分子使病毒载体重靶向。此类“重靶向”或“重定向”可以包括这样的情况：其中野生型病毒载体靶向组织内的几种细胞和/或生物内的几种器官，所述组织或器官的广泛靶向通过异源表位的插入得到减少至消除，并且用多特异性结合分子达到对组织中更特定的细胞或生物中更特定的器官的重靶向。此类重靶向或重定向也可以包括其中野生型病毒载体靶向组织的情况，所述组织的靶向通过异源表位的插入得到减少至消除，并且用多特异性结合分子达到对完全不同组织的重靶向。如本文所述的抗体互补位一般最低限度包含特异性识别异源表位的互补决定区(CDR)，例如重链和/或轻链可变结构域的CDR3区。在一些实施例中，多特异性结合分子包含抗体(或其一部分)，其包含特异性结合异源表位的抗体互补位。例如，多特异性结合分子可以包含单结构域重链可变区或单结构域轻链可变区，其中所述单结构域重链可变区或单结构域轻链可变区包含特异性结合异源表位的抗体互补位。在一些实施例中，多特异性结合分子可以包含Fv区，例如，多特异性结合分子可以包含scFv，其包含特异性结合异源表位的抗体互补位。在一些实施例中，如本文所述的多特异性结合分子包含特异性结合c-myc的抗体互补位。
在一些实施例中，如本文所述的多特异性结合分子包含特异性结合c-myc的抗体互补位，所述互补位包含scFv、scFv的重链和轻链可变结构域、和/或HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列的集合、由如SEQ ID NO:28所示的核酸序列编码，例如，包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的scFv。在一些实施例中，如本文所述的多特异性结合分子包含由如SEQ ID NO:28所示的核酸序列编码的Fv或scFv。
相应地，本发明包括特异性结合c-myc的抗体、抗体的抗原结合片段和多特异性结合蛋白，其中所述抗体、抗体片段和多特异性结合蛋白包含互补位，所述互补位包括包含SEQ ID NO:29的重链可变区(HCVR)以及包含SEQ ID NO:30的轻链可变区(LCVR)。本发明还包括抗体、抗体的抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白，其包含特异性结合c-Myc的互补位，其中所述互补位包括包含SEQ ID NO:31的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:32的HCDR2、包含SEQ ID NO:33的HCDR3、包含SEQ ID NO:34的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的LCDR2和包含SEQ ID NO:36的LCDR3。
本发明提供了包含互补位的抗体、其抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白，所述互补位包含HCVR，所述HCVR包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本发明提供了包含互补位的抗体、其抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白，所述互补位包含LCVR，所述LCVR包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本发明提供了包含互补位的抗体、其抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白，所述互补位包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，所述氨基酸序列对包含与如SEQ IDNO:30所示的LCVR氨基酸序列配对的如SEQ ID NO:29所示的HCVR氨基酸序列。在一些实施例中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自SEQ ID NO:29/30。
本发明提供了包含互补位的抗体、其抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白，所述互补位包含重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，或者其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明提供了包含互补位的抗体、其抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白，所述互补位包含重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，或者其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明提供了包含互补位的抗体、其抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白，所述互补位包含重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，或者其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明提供了包含互补位的抗体、其抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白，所述互补位包含轻链CDR1(LCDR1)，所述LCDR1包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，或者其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明提供了包含互补位的抗体、其抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白，所述互补位包含轻链CDR2(LCDR2)，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，或者其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明提供了包含互补位的抗体、其抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白，所述互补位包含轻链CDR3(LCDR3)，所述LCDR3包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，或者其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明提供了包含互补位的抗体、其抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白，所述互补位包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，所述氨基酸序列对包含与如SEQID NO:36所示的LCDR3氨基酸序列配对的如SEQ ID NO:33所示的HCDR3氨基酸。在一些实施例中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对如SEQ ID NO:33/36所示。
本发明提供了包含互补位的抗体、其抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白，所述互补位包含由如SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列编码的六个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。在某些实施例中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合如SEQ ID NO:31-32-33-34-35-36所示。
在一个相关实施例中，本发明提供了包含互补位的抗体、其抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白，所述互补位包含在如SEQ ID NO:29/30所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对集合内包含的六个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域众所周知的，并且可以用于鉴定本文公开的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可以用于鉴定CDR边界的示例性惯例包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言，Kabat定义基于序列变异性，Chothia定义基于结构环区域的位置，而AbM定义是Kabat和Chothia方法之间的折衷方案。参见例如，Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"National Institutesof Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989)。公共数据库也可用于鉴定抗体内的CDR序列。
本发明还提供了编码抗myc抗体或其一部分的核酸分子。
除特异性结合插入重组病毒衣壳蛋白内/由重组病毒衣壳蛋白展示的异源表位的互补位(例如抗体或其一部分)之外，如本文所述的多特异性结合分子还包含重靶向配体。在一些实施例中，重靶向配体结合在细胞的表面上表达的蛋白质，例如在(人)真核细胞例如靶细胞上的细胞表面蛋白。存在合适的大量的细胞表面蛋白，例如细胞表面受体，其可以被重靶向配体靶向，并且关于其的重靶向配体，例如抗体或其一部分是已经可获得的。此类结构包括但不限于：I类和II类主要组织相容性抗原；关于各种细胞因子的受体(例如，关于IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-22、IL-25、IL-33等的受体)、细胞类型特异性生长激素、脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CTNF)、集落刺激性生长因子、内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经胶质源性神经营养因子、神经胶质生长因子、gro-β/mip 2、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、干扰素(α-IFN、β-IFN、γIFN、共有IFN)、白介素(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14)、角质形成细胞生长因子、白血病抑制因子、巨噬细胞/单核细胞趋化激活因子、神经生长因子、嗜中性粒细胞活化蛋白2、血小板源性生长因子、干细胞因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子、脂蛋白包括另外或其它1型跨膜受体(例如PRLR，G蛋白偶联受体例如GCGR，离子通道例如Nav1.7、ASIC1或ASIC2；细胞粘附分子；关于代谢产物例如氨基酸的转运分子；B和T淋巴细胞的抗原受体(例如B细胞受体和相关蛋白(例如CD19、CD20等)以及T细胞受体和相关蛋白(例如CD3、CD4、CD8等)；四跨膜蛋白(例如CD63)。本文所述的重组病毒衣壳通过采用多特异性结合分子允许特异性感染细胞类型，所述多特异性结合分子包含结合分化细胞表面抗原的重靶向配体作为病毒载体复合物的靶。
在一些实施例中，重靶向配体结合主要(例如，唯一地)由(人)肝细胞表达的蛋白质，即肝特异性标记物。在一些实施例中，重靶向配体结合主要(例如，唯一地)由(人)脑细胞表达的蛋白质，脑细胞特异性标记物。在一些实施例中，重靶向配体结合主要(例如，唯一地)由(人)造血细胞表达的蛋白质，即，造血细胞特异性标记物。在一些实施例中，重靶向配体结合主要(例如，唯一地)由(人)T细胞表达的蛋白质，即，T细胞特异性标记物。在一些实施例中，重靶向配体结合主要(例如，唯一地)由(人)B细胞表达的蛋白质，即，B细胞特异性标记物。在一些实施例中，重靶向配体结合主要(例如，唯一地)由(人)树突状细胞表达的蛋白质，即，树突状细胞特异性标记物。在一些实施例中，重靶向配体结合主要(例如，唯一地)由(人)巨噬细胞表达的蛋白质，即，巨噬细胞特异性标记物。在一些实施例中，重靶向配体结合主要(例如，唯一地)由(人)NK细胞表达的蛋白质，即，NK细胞特异性标记物。在一些实施例中，重靶向配体结合主要(例如，唯一地)由(人)肾细胞表达的蛋白质，即，肾特异性标记物。在一些实施例中，重靶向配体结合主要(例如，唯一地)由(人)胰腺细胞表达的受体，即，胰腺特异性标记物。在一些实施例中，重靶向配体结合主要(例如，唯一地)由(人)肠细胞表达的受体，即，肠特异性标记物。在一些实施例中，重靶向配体结合主要(例如，唯一地)由(人)癌细胞表达的蛋白质，即肿瘤相关抗原。在一些实施例中，重靶向配体结合主要(例如，唯一地)由被异源病原体感染的(人)细胞表达的蛋白质。(1)由细胞/组织/器官特异性表达、或关于其的表达在细胞/组织/器官中富集，以及(2)被如本文所述的可用作重靶向配体的抗原结合蛋白识别的蛋白质是众所周知的，并且也可以在www.proteinatlas.org处找到；还参见Uhlen等人(2010)Nat.Biotech.28:1248-50，其以引用的方式整体并入本文。下表1提供了示例性和非限制性的器官特异性标记物、以及表达此类标记物的细胞/组织/器官，关于所述标记物可获得可用作重靶向配体的抗原结合蛋白。
表1：示例性的组织特异性标记物
在一些实施例中，重靶向配体结合由(人)肝细胞表达的受体，例如脱唾液酸糖蛋白受体，例如hASGR1。在一些实施例中，重靶向配体结合由(人)脑细胞表达的受体。在一些实施例中，重靶向配体结合由(人)T细胞表达的受体，例如CD3，例如CD3ε。在一些实施例中，重靶向配体结合由(人)肾细胞表达的受体。在一些实施例中，重靶向配体结合由(人)肌肉细胞表达的受体，例如整联蛋白。在一些实施例中，重靶向配体结合由(人)癌细胞表达的受体，例如肿瘤相关抗原，例如E6和E7。在一些实施例中，重靶向配体结合人胰高血糖素受体(hGCGR)。在一些实施例中，重靶向配体结合人ENTPD3。
在一些实施例中、重靶向配体结合由肿瘤细胞表达的肿瘤相关抗原。特异性肿瘤相关抗原的非限制性来自包括例如亲脂蛋白、AIM-2、ALDH1A1、α-辅肌动蛋白-4、甲胎蛋白(“AFP”)、ARTC1、B-RAF、BAGE-1、BCLX(L)、BCR-ABL融合蛋白b3a2、β-连环蛋白、BING-4、CA-125、CALCA、癌胚抗原(“CEA”)、CASP-5、CASP-8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA-1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白-A1、dek-can融合蛋白、DKK1、EFTUD2、延伸因子2、ENAH(hMena)、Ep-CAM、EpCAM、EphA3、上皮肿瘤抗原(“ETA”)、ETV6-AML1融合蛋白、EZH2、E6、E7、FGF5、FLT3-ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE-1,2,8、GAGE-3,4,5,6,7、GAS7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GnTV、gp100/Pme117、GPNMB、HAUS3、Hepsin、HER-2/neu、HERV-K-MEL、HLA-A11、HLA-A2、HLA-DOB、hsp70-2、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧基酯酶、K-ras、激肽释放酶4、KIF20A、KK-LC-1、KKLC1、KM-HN-1、KMHN1也称为CCDC110、LAGE-1、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、Lengsin、M-CSF、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-C1、MAGE-C2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm-2、ME1、Melan-A/MART-1、Meloe、Midkine、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、粘蛋白、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、I类肌球蛋白、N-raw、NA88-A、neo-PAP、NFYC、NY-BR-1、NY-ESO-1/LAGE-2、OA1、OGT、OS-9、P多肽、p53、PAP、PAX5、PBF、pml-RARα融合蛋白、多态性上皮粘蛋白(“PEM”)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY-MEL-1、RAGE-1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、分泌素1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX-2、SSX-4、STEAP1、存活素、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、TAG-1、TAG-2、端粒酶、TGF-βRII、TPBG、TRAG-3、磷酸丙糖异构酶、TRP-1/gp75、TRP-2、TRP2-INT2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“TYR”)、VEGF、WT1、XAGE-lb/GAGED2a、Kras、NY-ESO1、MAGE-A3、HPV E2、HPV E6、HPV E7、WT-1抗原(在淋巴瘤及其它实体瘤中)、ErbB受体、Melan A[MART1]、gp 100、酪氨酸酶、TRP-1/gp 75和TRP-2(在黑色素瘤中)；MAGE-1和MAGE-3(在膀胱癌、头颈癌和非小细胞癌中)；HPV EG和E7蛋白(在宫颈癌中)；粘蛋白[MUC-1](在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和前列腺癌中)；前列腺特异性抗原[PSA](在前列腺癌中)；癌胚抗原[CEA](在结肠癌、乳腺癌和胃肠癌中)，以及此类共享的肿瘤特异性抗原如MAGE-2、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-10、MAGE-12、BAGE-1、CAGE-1,2,8、CAGE-3TO 7、LAGE-1、NY-ESO-1/LAGE-2、NA-88、GnTV、TRP2-INT2。在一些实施例中，肿瘤相关抗原是ErbB2/Her2。在一些实施例中，肿瘤相关抗原是E6和/或E7。
在一些实施例中，重靶向配体结合与免疫应答相关的CD标记物，例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20等。在一些实施例中，CD标记物是CD3。
在某些示例性实施例中，多特异性结合分子是双特异性抗体。双特异性抗体的每个抗原结合结构域包含重链可变结构域(HCVR)和轻链可变结构域(LCVR)。在包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体)的情况下，第一抗原结合结构域的CDR可以用前缀"A1"指名，并且第二抗原结合结构域的CDR可以用前缀"A2"指名。因此，第一抗原结合结构域的CDR在本文中可以称为A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3；并且第二抗原结合结构域的CDR在本文中可以称为A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3。
第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以彼此直接或间接连接，以形成本发明的双特异性抗原结合分子。可替代地，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以各自连接至分开的多聚结构域。一个多聚结构域与另一个多聚结构域的结合促进两个抗原结合结构域之间的结合，从而形成双特异性抗原结合分子。如本文使用的，“多聚结构域”是任何大分子、蛋白质、多肽、肽或氨基酸，其具有与相同或相似结构或构造的第二多聚结构域结合的能力。例如，多聚结构域可以是包含免疫球蛋白CH3结构域的多肽。多聚组分的非限制性例子是免疫球蛋白的Fc部分(包含CH2-CH3结构域)，例如选自同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4以及每个同种型组内的任何同种异型的IgG的Fc结构域。
本发明的双特异性抗原结合分子通常包含两个多聚结构域，例如两个Fc结构域，其各自个别地是分开的抗体重链的部分。第一多聚结构域和第二多聚结构域可以具有相同的IgG同种型，例如IgG1/IgG1、IgG2/IgG2、IgG4/IgG4。可替代地，第一多聚结构域和第二多聚结构域可以具有不同的IgG同种型，例如IgG1/IgG2、IgG1/IgG4、IgG2/IgG4等。
在某些实施例中，多聚结构域是Fc片段或长度为1至约200个氨基酸的氨基酸序列，其包含至少一个半胱氨酸残基。在其它实施例中，多聚结构域是半胱氨酸残基或含半胱氨酸的短肽。其它多聚结构域包括包含以下或由以下组成的肽或多肽：亮氨酸拉链、螺旋环基序或卷曲螺旋基序。
任何双特异性抗体形式或技术都可以用于制备本发明的双特异性抗原结合分子。例如，具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段可以与一种或多种其它分子实体，例如具有第二抗原结合特异性的另一种抗体或抗体片段功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其它方式)，以产生双特异性抗原结合分子。可以在本发明的上下文中使用的特定示例性双特异性形式包括但不限于基于scFv的或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合物、双重可变结构域(DVD)-Ig、Quadroma、旋钮进洞、共同轻链(例如具有旋钮进洞的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)抗体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性形式(关于前述形式的综述，参见例如，Klein等人2012,mAbs4:6,1-11和其中引用的参考文献；还参见Brinkmann和Konterman(2017)mAbs 9:182-212；其各自以引用的方式整体并入)。
本发明还包括包含第一Ig CH3结构域和第二Ig CH3结构域的双特异性抗原结合分子，其中所述第一Ig CH3结构域和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异减少双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施例中，第一Ig CH3结构域结合蛋白A，而第二Ig CH3结构域含有减少或消除蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(按照IMGT外显子编号；按照EU编号的H435R)。第二CH3还可以包含Y96F修饰(按照IMGT；按照EU的Y436F)。在第二CH3内可能发现的进一步修饰包括：在IgG1抗体的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按照IMGT；按照EU的D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N和V82I(IMGT；按照EU的N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按照IMGT；按照EU的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)；参见例如，WO 2010/151792。
在某些实施例中，Fc结构域可以是嵌合的，其组合了源自多于一种免疫球蛋白同种型的Fc序列。例如，嵌合Fc结构域可以包含源自人IgG1、人IgG2或人IgG4 CH2区的CH2序列的部分或全部，以及源自人IgG1、人IgG2或人IgG4的CH3序列的部分或全部。嵌合Fc结构域也可以含有嵌合铰链区。例如，嵌合铰链可以包含源自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”序列，其与源自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列组合。可以包括在本文所述的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的特定例子从N末端到C末端包含：[IgG4CH1]-[IgG4上铰链]-[IgG2下铰链]-[IgG4 CH2]-[IgG4 CH3]。可以包括在本文所述的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的另一个例子从N末端到C末端包含：[IgG1 CH1]-[IgG1上铰链]-[IgG2下铰链]-[IgG4 CH2]-[IgG1 CH3]。可以包括在本发明的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的这些和其它例子在PCT申请号WO2014/022540中描述，所述PCT申请以引用的方式整体并入。具有这些一般结构安排的嵌合Fc结构域及其变体可以具有改变的Fc受体结合，其依次又影响Fc效应子功能。
使用和制备方法
本文所述的重组病毒衣壳蛋白的一个进一步实施例是其用于将目的核苷酸例如报道基因或治疗基因递送至靶细胞的用途。一般地，目的核苷酸可以是转移质粒，其一般可以包含侧接报道基因或治疗基因(当涵盖在AAV载体内时，其可以处于病毒或非病毒启动子的控制下)的5'和3'反向末端重复(ITR)序列。在一个实施例中，目的核苷酸是从5'到3'包含以下的转移质粒：5’ITR、启动子、基因(例如报道基因和/或治疗基因)和3’ITR。
有用的启动子的非限制性例子包括例如巨细胞病毒(CMV)启动子、形成脾病灶病毒(SFFV)启动子、延伸因子1α(EF1a)启动子(1.2kb EFla启动子或0.2kb EFla启动子)、嵌合EF 1a/IF4-启动子和磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。内部增强子也可以存在于病毒构建物中，以增加目的基因的表达。例如，可以使用CMV增强子(Karasuyama等人1989.J.Exp.Med.169:13，其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施例中，CMV增强子可以与鸡13-肌动蛋白启动子组合使用。
各种报道基因(或可检测部分)可以封装在包含本文所述的重组病毒衣壳蛋白的多聚体结构中。示例性报道基因包括例如β-半乳糖苷酶(编码的lacZ基因)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、MmGFP、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、Emerald、CyPet、青色荧光蛋白(CFP)、Cerulean、T-Sapphire、萤光素酶、碱性磷酸酶或其组合。本文所述的方法证实采用编码绿色荧光蛋白的报道基因的靶向载体的构建，然而，阅读本公开内容后，技术人员将理解，本文所述的非人动物可以在不存在报道基因的情况下或用本领域已知的任何报道基因生成。
各种治疗基因也可以封装在包含本文中描述的重组病毒衣壳蛋白的多聚体结构中，例如作为转移载体的部分。治疗基因的非限制性例子包括编码毒素(例如自杀基因)、治疗性抗体或其片段、CRISPR/Cas系统或其一部分、反义RNA、siRNA、shRNA等的那些。
本发明的一个进一步实施例是用于制备重组衣壳蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
a)在合适的条件下表达编码重组衣壳蛋白的核酸，和
b)分离步骤a)的表达的衣壳蛋白。
本发明的进一步实施例是用于改变病毒的向性的方法，该方法包括以下步骤：(a)将编码异源表位的核酸插入编码病毒衣壳蛋白的核酸序列内，以形成编码包含异源表位的经基因修饰的衣壳蛋白的核苷酸序列，和/或(b)在足以用于产生病毒载体的条件下培养包装细胞，其中所述包装细胞包含核苷酸序列。本发明一个进一步实施例是用于在衣壳蛋白的表面上展示异源表位的方法，该方法包括以下步骤：a)在合适的条件下表达根据本发明的核酸，和b)分离步骤a)所表达的衣壳蛋白。
在一些实施例中，包装细胞还包括包含目的核苷酸的辅助质粒和/或转移质粒。在一些实施例中，该方法还包括从培养上清液中分离自互补的腺相关病毒载体。在一些实施例中，该方法还包括裂解包装细胞，并且从细胞裂解产物中分离单链腺相关病毒载体。在一些实施例中，该方法还包括(a)清除细胞碎片，(b)用DNA酶I和MgCl2处理含有病毒载体的上清液，(c)浓缩病毒载体，(d)纯化病毒载体，和(e)(a)-(d)的任何组合。
可用于生产本文所述的病毒载体的包装细胞包括例如允许病毒的动物细胞、或经修饰以便允许病毒的细胞；或包装细胞构建体，例如使用转化剂如磷酸钙。用于产生本文所述的病毒载体的包装细胞系的非限制性例子包括例如人胚肾293(HEK-293)细胞(例如美国典型培养物保藏中心[ATCC]编号CRL-1573)、含有SV40大T抗原的HEK-293细胞(HEK-293T或293T)、HEK293T/17细胞、人肉瘤细胞系HT-1080(CCL-121)、淋巴母细胞样细胞系Raj i(CCL-86)、胶质母细胞瘤-星形细胞瘤上皮样细胞系U87-MG(HTB-14)、T淋巴瘤细胞HuT78(TIB-161)、NIH/3T3细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(例如ATCC编号CRL9618、CCL61、CRL9096)、HeLa细胞(例如ATCC编号CCL-2)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如ATCC编号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如ATCC编号CCL10)、PC12细胞(ATCC编号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC编号CRL1651)、RATI细胞、小鼠L细胞(ATCC编号CCLI.3)、HLHepG2细胞、CAP细胞、CAP-T细胞等等。
L929细胞、在Cosset等人(1995)J Virol 69,7430-7436中概述的FLY病毒包装细胞系统、NS0(鼠骨髓瘤)细胞、人羊膜细胞(例如CAP、CAP-T)、酵母细胞(包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、植物细胞(包括但不限于烟草NTl、BY-2)、昆虫细胞(包括但不限于SF9、S2、SF21、Tni(例如High 5))或细菌细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli))。
关于用于将核酸基因组包装到假型病毒载体内的另外包装细胞和系统、包装技术和载体，参见例如，Polo等人，Proc Natl Acad Sci USA,(1999)96:4598-4603。包装方法包括使用永久表达病毒组分的包装细胞，或用质粒瞬时转染细胞。
进一步的实施例包括重定向病毒和/或将报道基因或治疗基因递送至靶细胞的方法，该方法包括用于在体外或体内转导细胞的方法，该方法包括以下步骤：使靶细胞与包含衣壳的病毒载体和多特异性结合分子的组合接触，所述衣壳包含展示异源表位的重组病毒衣壳，其中所述多特异性结合分子包含i)特异性结合表位的抗体互补位，以及(ii)特异性结合由靶细胞表达的受体的重靶向配体。在一些实施例中，本文所述的组合物或本文所述的方法组合重组病毒载体和多特异性结合分子，其分子:分子比率将病毒载体的转导效率恢复为类似于野生型对照病毒载体的那种。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率范围为1:0.5至1:100。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率范围为1:4至1:20。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率范围为1:8至1:15。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率为1:4。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率为1:8。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率为1:15。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率为1:20。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率小于1:100。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率小于1:50。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率小于1:20。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率小于1:15。在一些实施例中，重组病毒载体与多特异性结合分子(分子:分子)的比率小于1:10。
在一些实施例中，靶细胞在体外。在其它实施例中，靶细胞在受试者例如人体内。
靶细胞
使用如本文公开的重组病毒载体，可以靶向广泛多样的细胞，以便递送目的核苷酸。一般基于目的核苷酸和所需效应来选择靶细胞。
在一些实施例中，可以递送目的核苷酸以致使靶细胞能够产生蛋白质，所述蛋白质补足生物中的缺陷，例如酶缺陷或免疫缺陷，例如X-连锁严重联合免疫缺陷。因此，在一些实施例中，靶向正常地在动物中产生蛋白质的细胞。在其它实施例中，靶向其中蛋白质将是最有益的区域中的细胞。
在其它实施例中，目的核苷酸，例如编码siRNA的基因，可以抑制特定基因在靶细胞中的表达。目的核苷酸可以例如抑制涉及病原体生命周期的基因的表达。因此，可以靶向易受病原体感染或被病原体感染的细胞。在其它实施例中，目的核苷酸可以抑制负责在靶细胞中产生毒素的基因的表达。
在其它实施例中，目的核苷酸可以编码毒性蛋白，所述毒性蛋白杀死它在其中表达的细胞。在这种情况下，可以靶向肿瘤细胞或其它不需要的细胞。
在另外其它实施例中，可以使用编码待收集的蛋白质(例如治疗性蛋白质)的目的核苷酸，并且靶向能够产生且分泌该蛋白质的细胞。
一旦鉴定其中需要目的核苷酸表达的特定靶细胞群，就选择在该靶细胞群上特异性表达的靶受体。靶受体可以专一地在该细胞群上表达，或者在该细胞群上比在其它细胞群上表达至更大程度。表达越特异性，就可以更特异性地靶向靶细胞。取决于上下文，标记物的(以及因此基因递送的)所需特异性量可以变化。例如，为了引入毒性基因，高特异性是最优选的，以避免杀死非靶向细胞。对于用于收获的蛋白质的表达、或其中需要总体影响的分泌产物的表达，可能需要较少的标记物特异性。
如上文所讨论的，靶受体可以是对于其可以鉴定或产生重靶向配体的任何受体。优选地，靶受体是肽或多肽，例如受体。然而，在其它实施例中，靶受体可以是碳水化合物或可以被结合配偶体识别的其它分子。如果关于靶受体的结合配偶体例如配体是已经知道的，则它可以用作亲和分子。然而，如果结合分子是未知的，则可以使用标准程序生成针对靶受体的抗体。然后，抗体可以用作重靶向配体作为多特异性结合分子的部分。
因此，可以基于各种因素来选择靶细胞，所述因素包括例如(1)特定的应用(例如，疗法、待收集的蛋白质的表达以及赋予疾病抗性)和(2)具有所需特异性量的标记物的表达。
靶细胞不以任何方式受限制，并且包括种系细胞和细胞系以及体细胞和细胞系。靶细胞可以是源自任一起源的干细胞。当靶细胞是种系细胞时，靶细胞优选地选自单细胞胚胎和胚胎干细胞(ES)。
药物组合物、剂型和施用
一个进一步的实施例提供了药剂，其包含根据本发明的至少一种重组病毒衣壳蛋白和适当的多特异性结合分子和/或根据本发明的核酸，优选根据本发明的至少一种多聚体结构。优选地，此类药剂是有用的基因转移载体。
本文还公开的是包含本文所述的病毒载体和药学可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物。另外，本文公开的是包含本文所述病毒载体的药物剂型。
如本文所讨论的，本文所述的病毒载体可以用于各种治疗应用(体内和离体)，并且用作研究工具。
基于本文公开的病毒载体的药物组合物可以使用一种或多种生理学可接受的载体和/或赋形剂，以任何常规方式进行配制。病毒载体可以配制用于通过例如注射、吸入或隔离(通过口或鼻)，或通过经口、经颊、肠胃外或直肠施用，或通过直接施用于肿瘤来施用。
药物组合物可以配制用于各种施用模式，包括全身、局部或局限性施用。技术和制剂可以在例如Remrnington's Pharmaceutical Sciences,Meade Publishing Co.,Easton,Pa中找到。对于全身施用，注射是优选的，包括肌内、静脉内、腹膜内和皮下。为了注射的目的，药物组合物可以在液体溶液中，优选在生理相容的缓冲液例如汉克氏溶液或林格氏溶液中配制。另外，药物组合物可以以固体形式配制，并且紧在使用前再溶解或悬浮。药物组合物的冻干形式也是合适的。
对于经口施用，药物组合物可以采取例如片剂或胶囊的形式，所述片剂或胶囊通过常规手段用药学可接受的赋形剂制备，所述赋形剂例如粘合剂(例如预胶化的玉蜀黍淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。片剂也可以通过本领域众所周知的方法进行包被。用于经口施用的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆剂或悬浮液的形式，或者它们可以作为在使用前用水或其它合适的媒介物配制的干燥产品存在。此类液体制剂可以通过常规手段用药学可接受的添加剂制备，所述添加剂例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如ationd油、油性酯、乙醇或分馏植物油)；以及防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。适当时，这些制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
药物组合物可以配制用于通过注射，例如通过推注或连续输注的肠胃外施用。注射用制剂可以以单位剂型例如在安瓿或多剂量容器中存在，伴随任选地添加的防腐剂。药物组合物还可以配制为在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有其它试剂，包括悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
另外，药物组合物也可以配制为贮库制剂。这些长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，化合物可以与合适的聚合材料或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或配制为微溶衍生物，例如微溶盐。其它合适的递送系统包括微球，其提供了药物在延长时间段内的局部非侵入性递送的可能性。这种技术可以包括具有毛细血管前大小的微球，其可以经由冠状动脉导管注射到器官的任何选定部分内，而不引起炎症或局部缺血。所施用的治疗剂从微球中缓慢释放，并且被选定组织中存在的周围细胞吸收。
全身施用也可以通过经粘膜或经皮手段。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用对待渗透的屏障适当的渗透剂。此类渗透剂是本领域一般已知的，并且包括例如胆汁盐和夫西地酸衍生物用于经粘膜施用。另外，去污剂可以用于促进渗透。经粘膜施用可以使用鼻喷雾剂或栓剂发生。对于局部施用，如本领域一般已知的，本文所述的病毒载体可以配制成软膏、油膏、凝胶或乳膏。清洗液也可以局部用于治疗损伤或炎症，以便加速愈合。
适合于注射用途的药物形式可以包括无菌水溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须是流体。它必须在制造条件和某些贮存参数(例如冷藏和冷冻)下是稳定的，并且必须针对微生物(例如细菌和真菌)的污染作用进行防腐。
如果本文公开的制剂用作治疗剂以加强受试者中的免疫应答，则治疗剂可以配制成以中性形式或盐形式的组合物。药学可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，并且由无机酸例如盐酸或磷酸，或此类有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等形成。由游离羧基形成的盐也可以源自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及此类有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等等。
载体也可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)、其合适的混合物和植物油。适当的流动性可以例如通过以下进行维持：使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下维持所需的病毒载体大小，以及使用表面活性剂。微生物作用的预防可以通过本领域已知的各种抗细菌剂和抗真菌剂来达到。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以达到可注射组合物的吸收延长。
无菌可注射溶液可以通过以下进行制备：将活性化合物或构建体以所需量掺入具有根据需要的上文列举的各种其它成分的适当溶剂中，随后为过滤灭菌。
在配制后，可以以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效的量来施用溶液。制剂易于以各种剂型施用，例如上述可注射溶液的类型，但也可以采用缓释胶囊或微粒和微球等等。
例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，需要时，溶液应该适当地进行缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖致使等渗。这些特定的水溶液尤其适合于静脉内、肿瘤内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这个背景下，根据本公开内容，本领域技术人员将知道可以采用的无菌水性介质。例如，一个剂量可以溶解在1ml等渗NaCl溶液中，或者加入1000ml皮下输液流体中，或者在提议的输注部位处注射。
在任何情况下，负责施用的人将确定用于个体受试者的适当剂量。例如，取决于需要或对病原性生物的暴露或受试者中的状况(例如癌症)，受试者可以在每天或每周一次的基础上施用本文所述的病毒载体一段时间，或在每月、每两年或每年一次的基础上施用本文所述的病毒载体。
除配制用于肠胃外施用，例如静脉内、肿瘤内、真皮内或肌内注射的化合物之外，其它药学可接受的形式包括例如用于经口施用的片剂或其它固体；脂质体制剂；定时释放胶囊；可生物降解的和目前使用的任何其它形式。
还可以使用鼻内或可吸入溶液或喷雾剂、气溶胶或吸入剂。鼻溶液可以是设计为以滴剂或喷雾剂施用于鼻道的水溶液。鼻溶液可以这样制备，使得它们在许多方面与鼻分泌物相似。因此，鼻腔水溶液通常是等渗的，并且稍加缓冲以维持5.5至7.5的pH。另外，与眼制剂中使用的那些相似的抗微生物防腐剂，以及需要时适当的药物稳定剂，可以包括在制剂中。各种商业鼻制剂是已知的，并且可以包括例如抗生素和抗组胺药，并且用于预防哮喘。
经口制剂可以包括赋形剂，例如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或散末的形式。在某些限定实施例中，经口药物组合物将包括惰性稀释剂或可同化的可食用载体，或者它们可以被封入硬壳或软壳明胶胶囊中，或者它们可以被压缩成片剂，或者它们可以直接与饮食中的食物一起掺入。对于经口治疗性施用，活性化合物可以与赋形剂一起掺入，并且以可摄入片剂、颊片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、干胶片(wafer)等等的形式使用。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等等还可以含有下述：粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等等；润滑剂，例如硬脂酸镁；并且可以加入甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精，或者调味剂，例如薄荷、冬青油或樱桃调味料。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的材料之外，它还可以含有液体载体。各种其它材料可以作为包衣存在，或以其它方式修改剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者进行包被。酏剂糖浆可以含有活性化合物，作为甜味剂的蔗糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，染料和调味料，例如樱桃或橙色调味剂。
本文公开的进一步实施例可以涉及与方法和组合物一起使用的试剂盒。试剂盒还可以包括合适的容器，例如小瓶、管、小型或超微量离心管、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器。当提供另外的组分或试剂时，试剂盒可以含有一个或多个另外的容器，这种试剂或组分可以置于其内。本文的试剂盒通常还将包括用于在紧密约束中容纳病毒载体和任何其它试剂容器的手段，用于商业销售。此类容器可以包括将所需小瓶保留在其内的注射或吹塑塑料容器。任选地，对于所述组合物可能需要一种或多种另外的活性剂，例如抗炎剂、抗病毒剂、抗真菌剂或抗细菌剂或抗肿瘤剂。
剂量范围和施用频率可以根据病毒载体的性质和医学状况，以及具体患者的参数和所使用的施用途径而变。在一些实施例中，病毒载体组合物可以以范围为约1x105噬斑形成单位(pfu)至约1x1015 pfu的剂量施用于受试者，取决于施用模式、施用途径、疾病的性质和受试者的状况。在一些情况下，病毒载体组合物可以以范围为约1x108 pfu至约1x1015pfu、或约1x1010 pfu至约1x1015 pfu、或约1x108 pfu至约1x1012 pfu的剂量施用。更准确的剂量还可以取决于它在其中施用的受试者。例如，如果受试者是青少年，则可能需要较低的剂量，而如果受试者是成人受试者，则可能需要较高的剂量。在某些实施例中，更准确的剂量可以取决于受试者的重量。在某些实施例中，例如，青少年人受试者可以接受约1x108pfu至约1x1010pfu的剂量，而成人受试者可以接受约1x1010 pfu至约1x1012 pfu的剂量。
本文公开的组合物可以通过本领域已知的任何手段施用。例如，组合物可以包括静脉内、肿瘤内、真皮内、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、肌内、鞘内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局限性灌注、经由导管、经由灌洗、在乳膏中或在脂质组合物中施用于受试者。
本领域技术人员已知的任何方法都可以用于本文所述的病毒载体、包装细胞和载体构建体的大规模生产。例如，可以在GMP条件下、在合格的初级CEF中或通过其它方法来制备主种子和工作种子库。包装细胞可以在大表面积烧瓶上铺平板，生长至接近汇合，并且纯化病毒载体。可以收获细胞，并且分离且纯化释放到培养基内的病毒载体，或者通过机械破坏释放细胞内病毒载体(可以通过大孔深度过滤去除细胞碎片，并且用核酸内切酶消化宿主细胞DNA)。病毒病毒载体随后可以纯化，并且通过切向流过滤进行浓缩，随后为渗滤。可以通过用含有稳定剂的缓冲液稀释来配制所得到的浓缩块，填充到小瓶内且冻干。组合物和制剂可以贮存用于以后使用。为了使用，冻干的病毒载体可以通过添加稀释剂来重构。
可以通过本领域已知的任何手段来配制且施用在组合疗法中使用的某些另外试剂。
如本文公开的组合物还可以包括佐剂，例如铝盐及其它矿物质佐剂、张力活性剂、细菌衍生物、媒介物和细胞因子。佐剂也可以具有拮抗性免疫调节特性。例如，佐剂可以刺激Th1或Th2免疫。如本文公开的组合物和方法还可以包括辅助疗法。
其他实施方式：
实施方式1.一种重组病毒衣壳蛋白，其包含对于所述衣壳蛋白是异源的表位，
其中异源表位或其一部分特异性结合抗体互补位，并且
其中所述病毒衣壳蛋白形成具有减少或消除的天然向性的重组病毒衣壳。
实施方式2.根据实施方式1所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述表位长度为至少1个氨基酸。
实施方式3.根据实施方式1或实施方式2所述的重组病毒衣壳蛋白，其包含在涉及所述病毒衣壳的天然向性的氨基酸位置处的取代、插入或缺失，使得所述重组病毒衣壳蛋白形成具有减少至消除的天然向性的病毒衣壳。
实施方式4.根据实施方式1-3所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述病毒衣壳蛋白源自腺相关病毒(AAV)衣壳基因，任选地其中所述异源表位插入选自以下的位置内：AAV2的I587、AAV6的I585、AAV8的I590、AAV9的I453、AAV9的I589以及感染灵长类动物的AAV血清型的任何相应氨基酸，任选地其中感染灵长类动物的AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。
实施方式5.根据实施方式4所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述腺相关病毒是AAV2。
实施方式6.根据实施方式4所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述腺相关病毒是AAV6。
实施方式7.根据实施方式4所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述腺相关病毒是AAV8。
实施方式8.根据实施方式4所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述腺相关病毒是AAV9。
实施方式9.根据实施方式1-8中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中(i)所述病毒衣壳蛋白是经基因修饰的AAV2 VP1衣壳蛋白，并且所述表位在位置I453或I587处的氨基酸之后插入和/或替换在位置I453或I587处的氨基酸；
(ii)所述病毒衣壳蛋白是经基因修饰的AAV6 VP1衣壳蛋白，并且所述表位在位置I585处的氨基酸之后插入和/或替换在位置I585处的氨基酸；
(iii)所述病毒衣壳是经基因修饰的AAV8 VP1衣壳蛋白，并且所述表位在位置I590处的氨基酸之后插入和/或替换在位置I590处的氨基酸。
(iv)所述病毒衣壳蛋白是经基因修饰的AAV9 VP1衣壳蛋白，并且所述表位在位置I453或I589处的氨基酸之后插入和/或替换在位置I453或I589处的氨基酸。
实施方式10.根据实施方式1-9中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述病毒衣壳蛋白由经修饰为表达表位的AAV2衣壳基因编码，所述表位侧接在AAV2 VP1衣壳蛋白的氨基酸N587和R588之间。
实施方式11.根据实施方式1-9中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述病毒衣壳蛋白源自AAV6衣壳基因，并且所述表位紧跟在氨基酸Q585之后插入。
实施方式12.根据实施方式1至9中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述病毒衣壳蛋白源自AAV8衣壳基因，并且其中所述表位紧跟在所述AAV8VP1衣壳蛋白的氨基酸N590之后插入。
实施方式13.根据实施方式1-9中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述病毒衣壳蛋白源自AAV9衣壳基因，所述表位在AAV9 VP1衣壳蛋白的位置G453或A589处的氨基酸之后插入所述衣壳蛋白内，和/或替换在AAV9VP1衣壳蛋白的位置G453或A589处的氨基酸，并且其中所述衣壳蛋白还包含另外的突变。
实施方式14.根据实施方式13所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述另外的突变是W503A。
实施方式15.根据实施方式1-14中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述表位包含氨基酸序列EQKLISEEDL，所述氨基酸序列或其一部分特异性结合抗体互补位，并且任选地。
实施方式16.根据实施方式1-15中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述表位包含氨基酸序列EQKLISEEDL，所述氨基酸序列或其一部分特异性结合抗体互补位，并且
其中所述氨基酸序列EQKLISEEDL侧翼为AAV衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸并且与之可操作地连接。
实施方式17.根据实施方式16所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述病毒衣壳蛋白包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列、或如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
实施方式18.根据实施方式1至17中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中在不存在包含所述抗体互补位的多特异性结合分子的情况下，所述重组病毒衣壳蛋白或包含所述重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳不能感染靶细胞，任选地其中在不存在包含所述抗体互补位的多特异性结合分子的情况下，所述病毒衣壳蛋白或包含所述重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳的转导效率：
(i)减少至少10％，
(ii)减少至少20％，
(iii)减少至少30％，
(iv)减少至少40％，
(v)减少至少50％，
(vi)减少至少60％，
(vii)减少至少70％，
(viii)减少至少80％，
(ix)减少至少90％，或
(x)消除。
实施方式19.一种经分离的核酸，其包含编码根据实施方式1-18中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白的核苷酸序列。
实施方式20.根据实施方式19所述的经分离的核酸，其中所述核苷酸序列编码重组病毒衣壳蛋白，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列、或如SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列。
实施方式21.一种重组病毒载体，其包含被根据实施方式20所述的重组病毒衣壳封装的目的核苷酸，任选地其中所述重组病毒衣壳是嵌合衣壳。
实施方式22.根据实施方式21所述的重组病毒载体，其中所述目的核苷酸处于选自病毒启动子、细菌启动子、哺乳动物启动子、禽类启动子、鱼类启动子、昆虫启动子及其任何组合的启动子的控制下。
实施方式23.根据实施方式22所述的重组病毒载体，其中所述目的核苷酸处于非人启动子的控制下。
实施方式24.根据实施方式23所述的重组病毒载体，其中所述目的核苷酸侧翼为AAV ITR序列。
实施方式25.根据实施方式21-24中任一项所述的重组病毒载体，其中所述目的核苷酸是报道基因。
实施方式26.根据实施方式25所述的重组病毒载体，其中所述报道基因编码绿色荧光蛋白。
实施方式27.根据实施方式21-24中任一项所述的重组病毒载体，其中所述目的核苷酸选自自杀基因、编码抗体或其片段的核苷酸、编码CRISPR/Cas系统或其一部分的核苷酸、编码反义RNA的核苷酸、编码siRNA的核苷酸及其组合。
实施方式28.一种组合物，其包含(a)根据实施方式21-27中任一项所述的重组病毒载体、以及(b)包含特异性结合所述表位的抗体互补位的多特异性结合分子，任选地其中所述多特异性结合分子还包含特异性结合在靶细胞上表达的受体的重靶向配体，其中所述多特异性结合分子任选地是双特异性结合分子。
实施方式29.根据实施方式28所述的组合物，其中所述病毒载体和所述多特异性结合分子以1:4的比率存在。
实施方式30.根据实施方式28或29所述的组合物，其中所述抗体互补位是Fv结构域。
实施方式31.根据实施方式30所述的组合物，其中所述Fv结构域直接融合至重链恒定结构域。
实施方式32.根据实施方式28-31中任一项所述的组合物，其中所述重靶向配体是抗体或其一部分。
实施方式33.根据实施方式28-32中任一项所述的组合物，其中所述多特异性结合分子是双特异性抗体，并且
其中所述互补位和所述重靶向配体各自包含与第一重链恒定结构域和第二重链恒定结构域融合的不同的Fv结构域。
实施方式34.根据实施方式33所述的组合物，其中所述第一重链和第二重链以不同的结合亲和力与蛋白A结合。
实施方式35.根据实施方式28-32中任一项所述的组合物，其中所述多特异性结合分子是双特异性抗体，并且
其中所述重靶向配体包含四聚体抗体结构，所述四聚体抗体结构包含两条等同的免疫球蛋白重链和两条等同的轻链，并且
其中结合所述异源表位的所述互补位附加至一条或两条重链的C末端或N末端和/或附加至一条或两条重链的C末端或N末端。
实施方式36.根据实施方式35所述的组合物，其中所述互补位是scFv，任选地其中所述scFv包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
实施方式37.根据实施方式28-36中任一项所述的组合物，其中所述异源表位包含氨基酸序列EQKLISEEDL或其一部分，并且其中所述抗体互补位特异性结合所述氨基酸序列EQKLISEEDL或其一部分。
实施方式38.根据实施方式28-37中任一项所述的组合物，其中所述重靶向配体特异性结合为细胞表面标记物的细胞表面蛋白。
实施方式39.根据实施方式38所述的组合物，其中所述细胞表面标记物是去唾液酸糖蛋白1(ASGR1)。
实施方式40.根据实施方式38所述的组合物，其中所述细胞表面标记物是CD3。
实施方式41.根据实施方式38所述的组合物，其中所述细胞表面标记物是ENTPD3。
实施方式42.根据实施方式28-41中任一项所述的组合物，其还包含药学可接受的载体。
实施方式43.一种将根据实施方式21-27中任一项所述的重组病毒载体导向靶细胞的方法，其包括
使所述重组病毒载体与多特异性结合分子接触，
其中所述多特异性结合分子包含(i)特异性结合表位的抗体互补位、以及(ii)特异性结合在靶细胞的表面上表达的蛋白质的重靶向配体。
实施方式44.根据实施方式43所述的方法，其中所述靶细胞在体内。
实施方式45.根据实施方式43或实施方式44所述的方法，其中所述接触离体执行。
实施方式46.一种将目的核苷酸递送至表达细胞表面蛋白的靶细胞的方法，其包括使所述靶细胞与根据实施方式28-42中任一项所述的组合物接触，其中所述多特异性结合分子包含结合所述细胞表面蛋白的重靶向配体。
实施方式47.根据实施方式46所述的方法，其中所述靶细胞在体外。
实施方式48.根据实施方式46所述的方法，其中所述靶细胞在受试者体内。
实施方式49.根据实施方式48所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方式50.根据实施方式46-49中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是人细胞。
实施方式51.根据实施方式46-50中任一项所述的方法，其中所述靶细胞选自肝细胞、脑细胞、T细胞、肾细胞、肠细胞、胰腺细胞、癌细胞以及被异源病原体感染的细胞。
实施方式52.根据实施方式46-51中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是人肝细胞。
实施方式53.根据实施方式46-52中任一项所述的方法，其中所述细胞表面蛋白是人去唾液酸糖蛋白受体1(hASGR1)。
实施方式54.根据实施方式46-51中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是人T细胞。
实施方式55.根据实施方式54所述的方法，其中所述细胞表面蛋白是CD3。
实施方式56.根据实施方式46-51中任一项所述的方法，其中所述细胞表面蛋白是人胰高血糖素受体(hGCGR)。
实施方式57.根据实施方式46-50中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是肠细胞。
实施方式58.根据实施方式46-50中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是胰腺细胞。
实施方式59.根据实施方式57和58所述的方法，其中所述细胞表面蛋白是ENTPD3。
实施方式60.一种灭活病毒衣壳蛋白的方法，其包括
(a)将编码异源表位的核酸插入编码病毒衣壳蛋白的核酸序列内，以形成编码包含所述异源表位的经基因修饰的衣壳蛋白的核苷酸序列，和
(b)在足以产生病毒载体的条件下培养包装细胞，其中所述包装细胞包含所述核苷酸序列。
实施方式61.一种产生病毒载体的方法，其包括在足以产生病毒载体的条件下培养包装细胞，其中所述包装细胞包含编码根据实施方式1-18中任一项所述的重组衣壳蛋白的质粒。
实施方式62.根据实施方式60或实施方式61所述的方法，其中所述包装细胞还包括包含目的核苷酸的辅助质粒和/或转移质粒。
实施方式63.根据实施方式60-62中任一项所述的方法，其还包括从培养上清液中分离自互补的腺相关病毒载体。
实施方式64.根据实施方式60-63中任一项所述的方法，其还包括裂解所述包装细胞，并且从所述细胞裂解产物中分离单链腺相关病毒载体。
实施方式65.根据实施方式60-64中任一项所述的方法，其还包括
a.清除细胞碎片，
b.用DNA酶I和MgCl2处理含有病毒载体的上清液，
c.浓缩病毒载体，
d.纯化所述病毒载体，和
e.a.-d.的任何组合。
实施方式66.一种病毒载体，其根据实施方式60-65中任一项的方法制备。
实施方式67.一种用于产生病毒载体的包装细胞，所述病毒载体包含编码根据实施方式1-18中任一项所述的衣壳蛋白的质粒。
实施方式68.一种结合分子，其包含结合SEQ ID NO:6的互补位，其中所述互补位包含由如SEQ ID NO:28所示的核酸序列编码的scFv的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和/或LCDR3序列。
实施方式69.根据实施方式68所述的结合分子，其中所述抗体互补位是Fv结构域。
实施方式70.根据实施方式69所述的结合分子，其中所述Fv结构域直接融合至重链恒定结构域。
实施方式71.根据实施方式68-70中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子是双特异性抗体，并且还包含重靶向配体，并且
其中所述互补位和所述重靶向配体各自包含与第一重链恒定结构域和第二重链恒定结构域融合的不同的Fv结构域。
实施方式72.根据实施方式71所述的结合蛋白，其中所述第一重链和第二重链以不同的结合亲和力与蛋白A结合。
实施方式73.根据实施方式68-69中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合分子是双特异性抗体，并且还包含重靶向配体，并且
其中所述重靶向配体包含四聚体抗体结构，所述四聚体抗体结构包含两条等同的免疫球蛋白重链和两条等同的轻链，并且
其中所述互补位附加至一条或两条重链的C末端或N末端和/或附加至一条或两条重链的C末端或N末端。
实施方式74.根据实施方式73所述的结合蛋白，其中所述互补位是scFv，任选地其中所述scFv包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
实施方式75.根据实施方式69-72中任一项所述的结合蛋白，其还包含其为抗体或其一部分的重靶向配体。
实施方式76.根据实施方式75所述的结合蛋白，其中所述重靶向配体特异性结合为细胞表面标记物的细胞表面蛋白。
实施方式77.根据实施方式76所述的结合蛋白，其中所述细胞表面标记物是去唾液酸糖蛋白1(ASGR1)。
实施方式78.根据实施方式76所述的结合蛋白，其中所述细胞表面标记物是CD3。
实施方式79.根据实施方式76所述的结合蛋白，其中所述细胞表面标记物是GCGR。
实施方式80.根据实施方式76所述的结合蛋白，其中所述细胞表面标记物是ENTPD3。
实施方式81.一种组合物，其包含(a)根据实施方式21-27中任一项所述的重组病毒载体、以及(b)根据实施方式68-81中任一项所述的结合蛋白。
实施方式82.根据实施方式81所述的组合物，其中所述病毒载体和所述多特异性结合分子以1:4的比率存在。
实施方式83.根据实施方式81或实施方式82所述的组合物，其还包含药学可接受的载体。
实例
提供下述实例仅用于说明性目的，并不预期限制本发明的范围。
实例1：具有异源表位的腺相关病毒载体的产生
使用PCR修饰AAV衣壳蛋白以含有几种异源表位之一：FLAG、c-myc、六组氨酸等，以生成编码重组衣壳蛋白的质粒。简言之，将编码FLAG、c-myc或六组氨酸的序列插入框内编码以下的密码子之后：AAV2衣壳蛋白的N587、AAV6 VP1衣壳蛋白的Q585、AAV8 VP1衣壳蛋白的N590、AAV9VP1衣壳蛋白的A589、或AAV9 VP1衣壳蛋白的G453。
使用具有HEK293细胞的三重转染方法执行腺相关病毒的生产(参见例如ErikArden和Joseph M.Metzger,J Biol Methods.2016；3(2))。在用适当载体的PEFpro(Polyplus转染，New York,NY)介导的转染前一天，将细胞铺平板：
辅助质粒pHelper(Agilent，目录#240074)；
编码野生型或经修饰的AAV rep/cap基因的质粒(pAAV RC2(Cell biolabs，目录#VPK-422)，例如pAAV RC2/6/9(Cell Biolabs，目录#VPK-426)、pAAV RC8、pAAV RC2-N587myc、pAAV RC2/6-Q585myc、pAAVRC8-N590myc、pAAV RC9-A589myc等；和
编码目的核苷酸和AAV ITR序列的质粒，例如pscAAV CMV-eGFP、pAAV-CMVGFP(Agilent目录#240074)、pAAV-EF1a-eGFP或pAAV-CAGG-eGFP等。
在转染后七十二小时，收集培养基，并且将细胞在缓冲液[50mM Tris-HCl、150mMNaCl和0.5％脱氧胆酸钠(Sigma，目录#D6750-100G)]中裂解。接下来，将benzonase(Sigma,St.Louis,MO)加入培养基和细胞裂解产物两者中至0.5U/μl的最终浓度，然后在37℃下温育60分钟。将细胞裂解产物以4000rpm向下旋转30分钟。将细胞裂解液和培养基合并在一起，并且用最终浓度为8％的PEG 8000(T Teknova目录#P4340)沉淀。将团块重悬浮于400mMNaCl中，并且以10000g离心10分钟。通过以149,000g超速离心3小时，使上清液中的病毒形成团块，并且通过qPCR滴定。
对于滴定AAV基因组的qPCR，AAV样品在37℃下用DNA酶I(ThermofisherScientific，目录#EN0525)处理一小时，并且使用DNA提取物All Reagents(ThermofisherScientific目录#4403319)进行裂解。使用QuantStudio 3Real-Time PCR System(Thermofisher Scientific)，使用针对AAV2 ITR的引物，定量衣壳化的病毒基因组。AAV2ITR引物的序列是5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′(正向ITR；SEQ ID NO:9)和5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′(反向ITR；SEQ ID NO:10)(Aurnhammer等人，2012)，分别从AAV衍生出左内部反向重复(ITR)序列且从AAV衍生出右内部反向重复(ITR)序列。AAV2 ITR探针的序列是5′-6-FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-TAMRA-3′(SEQ ID NO:11)(Aurnhammer C.,Haase M.,Muether N.等人，2012,Hum.Gene Ther.Methods 23,18-28)。在95℃激活步骤10分钟后，两步PCR循环在95℃下执行15分和在60℃下执行30秒，共40个循环。在qPCR中使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Thermofisher Scientific，目录#4304437)。DNA质粒(Agilent，目录#240074)用作确定绝对滴度的标准。
产生包含其中c-myc表位的衣壳的腺相关病毒载体。在该实例中，将c-myc表位(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:6)插入在AAV2 VP1衣壳蛋白的氨基酸N587和R588之间、或在AAV9VP1衣壳蛋白的氨基酸A589和Q590之间，即，将编码c-myc表位的核苷酸序列(GAA CAA AAACTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG；SEQ ID NO:12)插入质粒pAAV RC2(Cell Biolabs,Inc.,San Diego,CA)或质粒pAAV RC2/9内，并且分别的经修饰的pAAV RC2-N587Myc pAAV RC9-A589Myc质粒各自用于编码经修饰的衣壳蛋白，用于具有减少或消除向性的AAV病毒载体。
为了产生pAAV RC2-N587Myc，使用表2中所示的引物产生包含(从5'到3')BsiW1限制位点、在pAAV RC2的位置3050和3773之间的核苷酸序列、以及c-myc表位突出端核苷酸序列的第一聚合酶链反应(PCR)产物，以及包含(从5'到3')c-myc表位突出端核苷酸序列、在pAAV RC2的位置3774至4370之间的核苷酸序列、以及Pme1限制位点的第二PCR产物。pAAVRC2 N587Myc质粒(即，经修饰为编码在VP1衣壳蛋白的氨基酸N587和R588之间的c-myc表位的pAAV RC2质粒)通过以下产生：用BsiW1(New England Biolabs,R0553L)和Pme1(NewEngland Biolabs,R0560L)消化pAAV RC2，并且经由连接依赖性克隆插入两个PCR产物，如(2012)Methods Mol.Biol.52:51-9中所述。
为了产生pAAV RC2/6-Q585Myc，从Integrated DNA Technologies(Coralville,Iowa)订购包含pAAV RC2/6的位置3700和3940的gblock DNA片段，其具有在3757和3758之间插入的c-myc-表位序列。经由连接依赖性克隆，通过将gblock片段插入用MscI(NewEngland Biolabs，目录#R0534L)和AflII(New England Biolabs，目录#R0520L)消化的pAAV RC2/6内，产生pAAV RC2/6-Q585Myc质粒，如(2012)Methods Mol.Biol.52:51-9中所述。
为了产生pAAV RC9-A589Myc，使用表2中所示的引物产生包含(从5'到3')BsiW1限制位点、在pAAV RC9的位置3052和3779之间的核苷酸序列、以及c-myc表位突出端核苷酸序列的第一聚合酶链反应(PCR)产物，以及包含(从5'到3')c-myc表位突出端核苷酸序列、在pAAV RC9的位置3779至4404之间的核苷酸序列、以及Pme1限制位点的第二PCR产物。
pAAV RC9 A589Myc质粒(即，经修饰为编码在VP1衣壳蛋白的氨基酸A589和Q590之间的c-myc表位的pAAV RC2/9质粒)通过以下产生：用BsiW1(New England Biolabs,R0553L)和Pme1(New England Biolabs,R0560L)消化pAAV RC9，并且经由连接依赖性克隆插入两个PCR产物，如(2012)Methods Mol.Biol.52:51-9中所述。
表2
通过使用BamHI和NotI限制位点，将GFP片段引入pscAAV MCS载体(Cell Biolabs，目录#VPK-430)内，产生pscAAV-CMV-eGFP。pAAV-EF1a-eGFP质粒和pAAV-CAGG-eGFP由Thermofisher Scientific(Waltham,MA)从头合成制备。
实例2：在体外抗体介导的AAV病毒载体的重靶向
HepG2是人肝癌细胞系，其表达肝特异性标记物去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)。为了测试scAAV2 N587Myc-CMV-hrGFP病毒载体是否可以例如经由识别c-myc和ASGR1两者的双特异性抗体(抗myc-ASGR1抗体)感染HepG2细胞，使包含不同比率的病毒基因组数目(5e9病毒基因组)与抗体分子数目(1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8、1:15、1:20、1:50或1:100)的scAAV2 N587Myc-CMV-eGFP和双特异性抗myc-ASGR1抗体的混合物在室温下温育半小时，然后添加到HepG2细胞中。HepG2细胞也以1:8的比率与以下一起温育作为对照：仅野生型scAAV2-CMV-eGFP病毒载体、仅scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体、或具有单特异性抗myc抗体(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.,Tarrytown,NY)的scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体。在感染三天后，通过荧光激活细胞分选(FACS)确认通过受感染的HepG2细胞的GFP表达(图1)。当与野生型scAAV2-CMV-eGFP一起温育时，以及当以1:8的比率与scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体和双特异性抗myc-ASGR1抗体一起温育时，在相当大百分比的HepG2细胞中也检测到GFP表达(图1A和1G，上图和下图，分别为44.6％和44.1％)。在与具有scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体以及较高或较低的双特异性抗myc-ASGR1抗体(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.,Tarrytown,NY)的混合物一起温育的HepG2细胞中，通过FACS检测到较低的GFP表达(图1C，下图)。另外，在不存在抗myc-ASGR1抗体的情况下，在被scAAV-N587Myc-CMV-eGFP感染的HepG2细胞中，或在与scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP和单特异性抗myc抗体一起温育的HepG2细胞中，未检测到GFP。
类似地，使293T-hASGR1细胞(其为经基因修饰为在细胞表面上表达(h)ASGR1的29T3细胞)与混合物一起温育，所述混合物包含不同比率的病毒基因组与抗体分子数目(1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8、1:15、1:20或1:100)的scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP和双特异性抗myc-ASGR1抗体。以1:8的比率与scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP和双特异性抗myc-ASGR1抗体的混合物一起温育的野生型293T细胞(其不表达hASGR1)，以及以1:8的比率与以下一起温育的293T-hASGR1细胞充当对照：(a)仅野生型scAAV病毒载体，(b)仅scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体，或(c)scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体与不由293T细胞表达的、识别c-myc和胰高血糖素受体(GCGR)的无关的双特异性抗myc-GCGR抗体(RegeneronPharmaceuticals,Inc.,Tarrytown,NY)。在感染三天后，用人抗hASGR1抗体(RegeneronPharmaceuticals,Inc.,Tarrytown,NY)，随后为APC缀合的山羊抗人抗体(JacksonImmunoResearch laboratories Inc，目录#109-136-098,West Grove,PA)染色293T-hASGR1或293T细胞，并且通过FACS分析GFP表达。在293T-hASGR1细胞(图2Ai-2Ax和2Axii)，而不是293T细胞(图2Axi)的表面上检测到hASGR1表达。在以1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8、1:15、1:20和1:50的比率与scAAV2 N587Myc-CMV-eGFP和双特异性抗myc-ASGR1抗体混合物一起温育后，检测到GFP阳性293T-hASGR1细胞，其水平(56.9％至68.3％)与和野生型scAAV一起温育的293T-hASGR1细胞(56.7％)可比较(图2Ai和2Aiii-2Aix)。scAAV2 N587Myc-CMV-eGFP和双特异性抗myc-ASGR1抗体1:100的比率降低感染性(图2Ax)。与单独的scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP或具有无关的双特异性抗myc-GCGR抗体的scAAV-N587Myc一起温育并不导致通过293T hASGR1细胞的GFP表达(图2Aii和2Axii)。
在类似的实验中，使293T-hASGR1细胞与细胞一起温育，所述细胞以不同比率与以下一起温育：仅未经修饰的AAV9-CAGG-GFP病毒载体、仅AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP病毒载体、或与双特异性抗Myc-ASGR1抗体混合的AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP病毒载体。在感染三天后，通过FACS分析GFP表达。在以1:1、1:2、1:4、1:8、1:20、1:50和1:100的比率与AAV9A589Myc-CAGG-eGFP和双特异性抗myc-ASGR1抗体混合物一起温育后，检测到GFP阳性293T-hASGR1细胞，其水平(41.1％至91％)与和野生型AAV9-CAGG-eGFP一起温育的293T-hASGR1细胞(9.72％)可比较(图2B(i)和图2B(iii)-(ix)。与单独的AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP一起温育并不导致通过293T hASGR1细胞的GFP表达(图2B(ii))
测试了二价抗hASGR1抗体(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.,Tarrytown,NY)阻断293T-hASGR1细胞感染的能力。使293T-hASGR1细胞与以不同浓度的二价抗hASGR1抗体一起在室温下温育1小时，然后与包含1:8比率的scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP和双特异性抗myc-ASGR1抗体的混合物一起温育。在感染三天后，将细胞固定，并且如上所述通过FACS分析。图3提供的数据显示scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP的进入可能以剂量依赖性的方式被二价抗hASGR1抗体阻断。
为了确定双特异性抗体和经修饰的AAV的序贯施用是否可以导致抗体介导的经修饰AAV的重靶向，将不同数目的双特异性抗myc-ASGR1抗体分子(范围为1x109至1x1012分子)加入2x105 293T hASGR1细胞中一小时，这之后加1x109 scAAV N587Myc病毒载体。对照包括(1)仅与野生型scAAV一起温育的293T-hASGR1细胞，即在不存在任何抗体的情况下，(2)与1x1011无关的双特异性抗myc-GCGR抗体分子和1x109 scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体一起序贯温育的293T-hASGR1细胞，以及(3)与1x1011双特异性抗myc-ASGR1抗体分子和1x109 scAAV-N587Myc病毒载体一起序贯温育的、不表达hASGR1的293T细胞。在感染后两天，通过显微镜检查观察通过受感染的293T-hASGR1细胞的GFP表达(图4)。在仅与野生型scAAV一起温育后、以及与以所有浓度的抗myc-ASGR1抗体分子和scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP一起序贯温育后，观察到通过293T-hASGR1细胞的GFP表达(图4A、4C-4I)。在仅与scAAV2 N587Myc-CMV-eGFP一起温育后的29T3-hASGR1细胞中(图4B)，在与抗myc-hASGR1抗体和scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP病毒载体一起序贯温育后、不表达ASGR1的293T细胞中(图4J)，或在与无关的双特异性抗myc-GCGR抗体和scAAV2 N587Myc-CMV-eGFP病毒载体一起序贯温育后的29T3 hASGR1细胞中(图4K)，未检测到GFP。
如本文所述，自互补的AAV(scAAV)的向性可以(1)例如通过衣壳蛋白的修饰，例如通过c-myc表位的插入而灭活，并且任选地，(2)使用双特异性抗体(例如，用识别c-myc表位和由靶细胞表达的配体的双特异性抗体)进行重定向。为了确定单链AAV(ssAAV)的向性是否可以类似地(1)减少或消除，以及任选地(2)重定向，在以不同病毒载体:抗体比率(1:0、1:1、1:2、1:4、1:8、1:20、1:100或1:1000)的双特异性抗myc-hASGR1抗体的不存在或存在下，使293T-hASGR1细胞与如实例1中所述产生的ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP病毒载体一起温育。对照包括与野生型ssAAV一起温育的293T-hASGR1细胞，与以1:8的病毒载体:抗体比率的ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP病毒载体和无关的双特异性抗myc-GCGR抗体一起温育的293T-hASGR1细胞，以及与以1:8的病毒载体:抗体比率的ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP病毒载体和双特异性抗myc-hASGR1抗体一起温育的293T细胞(其不表达hASGR1)。在感染三天后，将细胞固定，并且通过FACS检测GFP表达(图5)。在与野生型ssAAV，以及以所有比率的ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP病毒载体和双特异性抗myc-ASGR1抗体的混合物一起温育的293T-hASGR1细胞中检测到GFP表达(图5A、5C-5I)。通过与ssAAV2 N587Myc-CMV-hrGFP病毒载体和双特异性抗myc-ASGR1抗体一起温育的29T3细胞(图5J)，或仅与ssAAV2 N587Myc-CMV-hrGFP病毒载体一起温育的293T-hASGR1细胞，或与ssAAV N587Myc病毒载体和无关的双特异性抗myc-GCGR双特异性抗体一起温育的293T-hASGR1细胞(图5B、5K)，未观察到GFP表达。
人(h)胰高血糖素受体(GCGR)正常地不被293T细胞表达。然而，293T-hGCGR是经基因修饰为在细胞表面上表达hGCGR的稳定293T细胞系。为了测试scAAV2 N587Myc-CMV-eGFP病毒载体的重靶向是否可以通过hGCGR受体经由双特异性抗myc-GCGR抗体介导，使293T-hGCGR细胞与包含不同比率的scAAV2 N587Myc-CMV-eGFP:双特异性抗myc-GCGR抗体的不同混合物一起温育。在加入293T hGCGR细胞中之前，使scAAV2N587Myc-CMV-eGFP病毒载体以1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8、1:15、1:20、1:50或1:100的比率与双特异性抗myc-GCGR抗体在室温下混合半小时。在感染三天后，通过荧光激活细胞分选(FACS)确认通过受感染的293T-hCGCR细胞的GFP表达(图6)。与野生型scAAV(图6A)或以1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8、1:15、1:20、1:50和1:100比率的scAAV2 N587Myc-CMV-eGFP/双特异性抗myc-GCGR抗体(图6C-6K)一起温育后，检测到显著百分比的GFP阳性细胞。在与单独的scAAV2 N587myc-CMV-eGFP病毒载体、或具有单特异性抗myc抗体的scAAV2 N587Myc-CMV-eGFP病毒载体一起温育的293T-hGCGR细胞中，未检测到GFP(分别为图6B和6L)。
Jurkat是人急性T细胞白血病细胞系，其表达人(h)CD3。为了测试AAV6 Q585Myc-EF1a-eGFP病毒载体的重靶向是否可以通过hCD3受体经由双特异性抗myc-CD3抗体介导，使Jurkat细胞与包含不同比率的AAV6Q585Myc-EF1a-eGFP:双特异性抗myc-CD3抗体的不同混合物一起温育。在加入Jurkat细胞中之前，使AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP病毒载体以1:1、1:5、1:10、1:100、1:1000的比率与双特异性抗myc-CD3抗体在室温下混合半小时。在感染三天后，通过荧光激活细胞分选(FACS)确认通过受感染的Jurkat细胞的GFP表达(图7)。与野生型AAV6-EF1a-eGFP(图7B)或以1:1、1:5、1:10和1:100比率的AAV6 Q585Myc-EF1a-eGFP/双特异性抗myc-CD3抗体(图7D-7G)一起温育后，检测到显著百分比的GFP阳性细胞。在与AAV6Q585Myc-EF1a-eGFP病毒载体一起温育的Jurkat细胞中，未检测到GFP(图7C)。
在该实例中描述的是几种自互补(sc)或单链(ss)AAV血清型的天然向性灭活，其通过用在VP1衣壳蛋白的氨基酸N587和R588之间插入的c-myc表位进行基因修饰的scAAV2或ssAAV2(scAAV-N587myc或ssAAV-N587myc)、具有在Q585和S586之间插入的c-myc表位的AAV6和AAV9不能感染通常被野生型AAV感染的细胞加以证实(图1A-1B、2A-2B、3A-3B、4A-4B、5A-5B、6A-6B和7)。在该实例中还证实的是识别c-myc表位以及由靶细胞表达的第二配体(例如hASGR1、hGCGR或hCD3)的双特异性抗体重靶向经修饰的AAV的向性，并且以配体特异性方式介导通过假型AAV感染靶细胞AAV的能力(图1-7)。此外，该实例证实经基因修饰的sc-或ss-AAV和双特异性抗体的同时施用对于感染不是必需的，即序贯施用足以使经基因修饰的sc-或ss-AAV在体外重靶向(图4)。
实例3：在体内抗体介导的经修饰的病毒载体的重定向
用不同的多特异性结合分子形式将病毒载体重靶向肝
为了确定双特异性抗myc-ASGR1抗体是否可以将scAAV2 N587myc-CMV-eGFP病毒载体重靶向在体内表达hASGR1的肝细胞，用1x1011(通过qPCR滴定)单独的野生型scAAV2-CMV-eGFP，或以病毒基因组与抗体分子的1:8比率、与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的scAAV2 N587myc-CMV-eGFP病毒载体，血管内注射经基因修饰使得其肝细胞在C57BL/6背景上表达hASGR1的小鼠、以及对照野生型C57BL/6小鼠。对照包括用盐水[250mM NaCl]或单独的scAAV2 N587myc-CMV-eGFP病毒载体注射的小鼠。在注射后十天，将小鼠处死并且用4％PFA经心脏灌注。收集肝、肾和心脏的器官，并且在15％蔗糖中，随后为30％蔗糖中脱水。然后将器官在载玻片上冷冻切片，并且用鸡抗EGFP抗体(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.West Grove,PA)和Alexa-488缀合的抗鸡第二抗体(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.West Grove,PA)进行染色。(图8A-8C)。在来自经修饰为在肝中表达ASGR1，并且用野生型scAAV2-CMV-eGFP、或与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的scAAV2-N587myc-CMV-eGFP注射的那些转基因动物的肝中(图8A(i)和8A(iv))，以及在来自用野生型scAAV2-CMV-eGFP注射的野生型C57BL/6小鼠的肝中(图8A(v))，检测到GFP阳性细胞。在任何脾或肾样品中(图8B和8C)，在来自用盐水或单独的scAAV2 N587myc-CMV-eGFP病毒载体注射的任何动物的肝、脾或肾样品中(图8A(ii、iii、vi、vii))，在取自用与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的scAAV2-N587myc-CMV-eGFP注射的野生型C57BL/6动物的肝样品中(图8A(viii))，均未检测到GFP。总之，scAAV2 N587myc-CMV-eGFP病毒载体和双特异性抗myc-ASGR1抗体的组合仅感染表达hASGR1的那些(肝)细胞，强烈提示scAAV2-CMV-eGFP病毒载体通过衣壳蛋白的修饰而灭活，例如scAAV病毒载体的天然向性可以例如用c-myc表位减少至消除，并且此类病毒载体可以例如通过双特异性抗myc-ASGR1抗体特异性地再活化，例如特异性地再靶向例如至体内的肝细胞。
类似地，为了确定双特异性抗myc-ASGR1抗体是否可以将ssAAV2N587myc-CAGG-eGFP病毒载体重靶向在体内表达hASGR1的肝细胞，用2.18x1011(通过qPCR滴定)单独的野生型ssAAV2-CAGG-eGFP，或以病毒基因组与抗体分子的1:4比率、与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的ssAAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒载体，血管内注射经基因修饰使得其肝细胞在C57BL/6背景上表达hASGR1的小鼠、以及对照野生型C57BL/6小鼠。对照包括用PBS或单独的ssAAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒载体注射的小鼠。在注射后四周，将小鼠处死并且用4％PFA经心脏灌注。收集肝、肾和心脏的器官，并且在15％蔗糖中，随后为30％蔗糖中脱水。然后将器官在载玻片上冷冻切片，并且用鸡抗EGFP抗体(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.West Grove,PA)和Alexa-488缀合的抗鸡第二抗体(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.West Grove,PA)进行染色。在来自经修饰为在肝中表达ASGR1，并且用野生型ssAAV2-CAGG-eGFP、或与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP注射的那些转基因动物的肝中(图9E-9F、9P-9R)，以及在来自用野生型ssAAV2-CAGG-eGFP注射的野生型C57BL/6小鼠的肝中(图9B-9C)，检测到GFP阳性细胞。令人惊讶地，与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP的感染效率比WT ssAAV2-CAGG-GFP高得多(图9E-9F、9P-9R)。在来自用盐水或单独的ssAAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒载体注射的任何动物的肝样品中(图9A、9D、9G-9L))，在取自用与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的ssAAV2 N587myc-CAGG-eGFP注射的野生型C57BL/6动物的肝样品中(图9M-9O)，未检测到或几乎未检测到GFP。总之，ssAAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒载体和双特异性抗myc-ASGR1抗体的组合仅感染表达hASGR1的那些(肝)细胞，强烈提示ssAAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒载体通过衣壳蛋白的修饰而灭活，例如scAAV病毒载体的天然向性可以例如用c-myc表位减少至消除，并且此类病毒载体可以例如通过双特异性抗myc-ASGR1抗体特异性地再活化，例如特异性地再靶向例如至体内的肝细胞。
用经基因修饰使得其肝细胞在C57BL/6背景上表达hASGR1的小鼠执行假型AAV9病毒载体的进一步实验。用1x1011(通过qPCR滴定)野生型AAV9-CAGG-eGFP，或以病毒基因组与抗体分子的1:100比率、与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的AAV9 A589myc-CAGG-eGFP病毒载体，血管内注射这些小鼠。对照包括用PBS、或与无关的双特异性抗myc hCD3抗体组合的AAV9 N587myc-CAGG-eGFP病毒颗粒注射的小鼠。在注射后四周，处死小鼠。将肝用10％福尔马林固定，并且送至HistoWiz.Inc(New York,NY)用于GFP染色。在来自用野生型AAV9-CAGG-eGFP、或与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的AAV9 N587myc-CAGG-eGFP病毒颗粒注射的那些小鼠的肝中，检测到GFP阳性细胞(图10A和10D)。在来自分别用盐水、或与双特异性抗myc hCD3抗体组合的AAV9 N587myc-CAGG-eGFP病毒颗粒注射的任何动物的肝样品中，未检测到或几乎未检测到GFP(图10B和10C)。总之，类似于AAV2，AAV9的天然向性可以通过衣壳蛋白的修饰(例如，通过c-myc表位的插入)减少至消除，并且使用相应的双特异性抗表位-细胞特异性标记物结合蛋白，例如针对肝细胞的双特异性抗myc-ASGR1抗体，可以将此类经修饰的病毒载体例如AAV9-A589myc重靶向特异性细胞类型。
附加至抗hASGR1 IgG4旋钮进洞Fc形式的抗myc scFc
为了确定各种多特异性结合分子形式是否可以介导AAV感染，将抗myc scFv融合至旋钮进洞抗hASGR1 IgG4抗体的一条链的C末端(参见图11A)。具体地，由Integrated DNA技术(Skokie,Illinois)提供编码抗myc scFv(SEQ ID NO:28)的gblock，所述抗myc scFv侧翼为与pRG7078的1459-1478和1479-1498的同源臂，所述pRG7078编码抗hASGR1隐形旋钮IgG4重链。由SEQ ID NO:28编码的scFv(SEQ ID NO:37)的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸(AA)序列的编码核苷酸序列(NA)在表3中提供。
表3：与如SEQ ID NO:37所示的scFv相关的SEQ ID NO
将gblock克隆到编码抗hASGR1隐形旋钮IgG4重链的pRG7078内，以制备编码抗hASGR1隐形旋钮IgG4抗myc scFv融合多肽“抗hASGR1-IgG4-Fc/抗myc双特异性”的pRG7078。将用c-myc修饰的pRG7078质粒、未经修饰的pRG7078抗hASGR1 IgG4隐形洞星(stealth hole star)、以及含有抗体轻链的质粒转染到293T细胞内，并且用OPTI-MEM(目录31985070，Thermo Fisher)培养。在转染后四天，收集培养基，并且使用蛋白A柱(目录#89948，Thermo Fisher)纯化抗hASGR1-IgG4-Fc/抗myc双特异性结合分子。
为了产生假型AAV8病毒载体pAAV RC8 N590myc，从Integrated DNA技术(Skokie,Illinois)订购具有在AAV8的VP1衣壳蛋白的N590和T591之间插入的c-myc表位(SEQ IDNO:22)的gblock。用Mlu1和Sbf1酶消化pAAV RC8质粒(SEQ ID NO:23)，并且使用SLIC将gblock克隆到载体内，以制备pAAV RC8 N590myc(SEQ ID NO:24)。
使293T-hASGR1细胞(其为经基因修饰为在细胞表面上表达(h)ASGR1的293T细胞)与任一混合物一起温育，所述混合物包含不同比率的AAV8-N590Myc-CAGG-eGFP与抗hASGR1-IgG4-Fc/抗myc双特异性结合分子(1:0、1:1、1:2、1:4、1:8、1:12、1:15、1:50或1:100)或AAV8CAGG eGFP病毒基因组。在感染三天后，通过FACS分析GFP表达。在感染三天后，通过FACS分析GFP表达。在与以1:1、1:2、1:4、1:8、1:12、1:15、1:50或1:100比率的AAV8-N590Myc-CAGG-eGFP和抗hASGR1-IgG4-Fc/抗myc双特异性分子的混合物一起温育后，检测到GFP阳性293T-hASGR1细胞(2.12％至22.2％；图12D-12K)，其和与野生型AAV8-CAGG-eGFP一起温育的293T-hASGR1细胞(46.1％)可比较(图12A)。模拟感染的细胞(图12B)以及与单独的AAV8-N590Myc-CAGG-eGFP一起温育均不导致通过293T-hASGR1细胞的GFP表达(图12C)。
为了确定抗hASGR1-IgG4-Fc/抗myc双特异性结合蛋白是否可以将AAV8 N590myc-CAGG-eGFP病毒颗粒重靶向在体内表达hASGR1的肝细胞，用1x1011(通过qPCR滴定)野生型AAV8-CAGG-eGFP，或以病毒基因组与结合蛋白分子的1:12比率、与抗hASGR1-IgG4-Fc/抗myc双特异性结合分子组合的AAV8 N590myc-CAGG-eGFP病毒颗粒，血管内注射经基因修饰使得其肝细胞在C57BL/6背景上表达hASGR1的小鼠。用与无关的抗hCD3x抗myc双特异性结合分子(其具有与抗hASGR1-IgG4-Fc/抗myc双特异性结合分子相似的形式)组合的AAV8N590myc CAGG-eGFP病毒颗粒注射对照动物。在注射后三周，将小鼠处死并且用4％ PFA经心脏灌注。收集肝、肾和心脏的器官，并且在15％蔗糖中，随后为30％蔗糖中脱水。然后将器官在载玻片上冷冻切片，并且用鸡抗EGFP抗体(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.WestGrove,PA)和Alexa-488缀合的抗鸡第二抗体(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.WestGrove,PA)进行染色。在来自用野生型AAV8-CAGG-eGFP(图13A-13C)、或与抗hASGR1-IgG4-Fc/抗myc双特异性结合分子组合的AAV8 N590myc-CAGG-eGFP病毒颗粒(图13G-13I)注射的那些动物的肝中，检测到GFP阳性细胞。在来自用与无关的抗hCD3/myc结合蛋白组合的AAV8N590myc-CAGG-eGFP病毒颗粒注射的任何动物的肝样品中，未检测到或几乎未检测到GFP(图13D-13F)。总之，可以使用特异性结合表位和由靶细胞类型表达的细胞特异性标记物的双特异性结合分子，将加上表位标签的AAV8(例如，AAV8 N590myc)重靶向特异性细胞类型。
将病毒载体重靶向肠和/或胰腺
使经基因修饰为在细胞表面上表达人外核苷三磷酸二磷酸水解酶3(hENTPD3)的293T细胞(“293T-ENTPD3”)与混合物一起温育，所述混合物包含不同比率的AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP或AAV2-CAGG-GFP病毒基因组和双特异性结合分子，所述双特异性结合分子通过使抗myc scFv融合到旋钮进洞抗hENTPD3 IgG4抗体(抗hENTPD3-IgG4-Fc/抗myc)的一条链的C末端形成，以不同比率(1:0、1:1、1:2、1:4、1:8、1:20、1:50、1:100或1:200)。在感染三天后，通过FACS分析GFP表达。在与AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP和抗hENTPD3-IgG4-Fc/抗myc的混合物一起温育后，检测到GFP阳性293T-ENTPD3细胞，其水平(1.48％至16％；图14C-14J)和与野生型AAV2-CAGG-eGFP一起温育的293T-ENTPD3细胞(66％)可比较(图14A)。与单独的AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP一起温育导致通过293T ENTPD3细胞的极低水平的GFP表达(图14B)。
确定ENTPD3在肠的粘膜中表达(数据未显示)。为了确定抗hENTPD3-IgG4-Fc/抗myc结合蛋白是否可以将AAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒颗粒重靶向在体内表达ENTPD3的肠细胞，用5x1011(通过qPCR滴定)以病毒基因组与结合蛋白分子的1:20比率、与抗hENTPD3-IgG4-Fc/抗myc结合蛋白组合的AAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒颗粒，血管内注射C57BL/6小鼠。用PBS、野生型AAV9、或与无关的结合蛋白分子组合的AAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒颗粒注射对照小鼠。在注射后三周，处死小鼠。将肝、肠和胰腺用10％福尔马林固定，并且送至HistoWiz.Inc(New York,NY)用于GFP染色。在用野生型AAV9注射的小鼠中检测到GFP阳性细胞(图15B(ii))，但在来自用PBS、或者与无关的结合分子或抗hENTPD3-IgG4-Fc/抗myc结合蛋白组合的AAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒颗粒注射的小鼠的肝中未检测到(分别为图15A(iii)-15A(iv))，指示即使当用hENTPD3-IgG4-Fc/抗myc结合蛋白共注射时，AAV2N587myc病毒载体也不感染ENTPD3阴性肝细胞。仅在用野生型AAV9或与hENTPD3-IgG4-Fc/抗myc结合蛋白组合的AAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒颗粒注射的小鼠的肠中检测到GFP(图15B(i)-15B(iv))。在用与抗hENTPD3-IgG4-Fc/抗myc结合蛋白组合的AAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒颗粒注射的小鼠的胰岛中检测到GFP。(图15C(iv))。WT AAV9感染胰岛细胞和非胰岛细胞两者(图15C(ii))。在来自用盐水、或与无关的结合蛋白组合的AAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒颗粒注射的小鼠的胰腺样品中未检测到GFP。(图7C(i)和7C(iii))。总之，AAV的天然向性可以通过插入异源表位而减少至消除，并且使用结合表位标签以及由重靶向的细胞或组织表达的标记物的多特异性结合蛋白，重靶向相同细胞或其它细胞。
该实例证实，几种不同血清型的腺相关病毒载体可以用如本文所述的异源表位(例如，c-myc)进行基因修饰，以灭活传染性，并且识别异源表位(例如，c-myc)以及由靶细胞表达的标记物两者的双特异性抗体(不管双特异性形式)可以用于重靶向病毒载体，以递送目的核苷酸。
实例4：经基因修饰的AAV-N587Myc病毒载体将治疗性货物递送至特异性细胞的用 途
该实例证实了AAV-N587Myc病毒载体将治疗性货物特异性递送至靶向细胞类型的能力，所述治疗性货物例如一种或多种自杀基因、生物治疗剂(例如抗体)、CRISPR/Cas基因编辑系统、shRNA等。具体地，该实例描述了自杀基因、抗体编码序列或CRISPR/Cas基因编辑系统对表达靶向配体的细胞的递送。
自杀基因递送至表达靶向配体的细胞
为了测试scAAV2-N587Myc病毒载体将自杀基因递送至特异性细胞的能力，使用如通过Wang等人((2010)Cancer Gene Therapy 17:559-570)描述的HER2+乳腺癌的异种移植裸鼠模型。
病毒载体：如实例1所述生成携带报道EGFP基因的scAAV2-N587Myc或ssAAV2-N587Myc病毒载体(scAAV2-N587Myc-EGFP或ssAAV2-N587MycEGFP)。类似地生成携带自杀基因(SG)的scAAV2-N587Myc或ssAAV2-N587Myc病毒载体。简言之，用以下转染293T17细胞：(1)pAd Helper和(2)如上所述的pAAV RC2(编码野生型衣壳)或pAAV RC2-N587Myc载体(编码用c-myc表位修饰的衣壳)，以及(3)处于启动子例如CMV的控制下，携带自杀基因例如胞嘧啶脱氨酶基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的pAAV载体。如实例1中所述分离且滴定ssAAV-N587MycSG或scAAV N587SG病毒载体。
细胞系：BT474乳腺癌、SK-BR-3乳腺癌和Calu-3肺癌细胞系是HER2阳性的人肿瘤细胞系(Bunn P.A.等人，(2001)Clin Cancer Res.7:3239-3250；Pegram M等人(1999)Oncogene 18:2241-2251；Spiridon CI等人，(2002)Clin Cancer Res.8:1720-1730)。A-673横纹肌肉瘤和HeLa宫颈癌是HER2阴性的人肿瘤细胞系，而BEAS-2b是永生化的支气管上皮HER2阴性细胞系(Jia LT等人(2003)Cancer Res.63:3257-3262；Kern JA等人，(1993)AmJ Respir Cell Mol Biol 9:448-454；Martinez-Ramirez A等人，(2003)Cancer GenetCytogenet.2003；141:138-142)。所有这些细胞系均得自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)，并且维持在由ATCC推荐的培养基中。
小鼠：获得6至8周龄的雌性裸鼠，并且饲养在无特定病原体的条件下。在第0天时，小鼠同时(1)在右胁腹中用107BT474、SK-BR-3、Calu-3、A-673或HeLa肿瘤细胞进行皮下注射，并且(2)用双特异性抗myc-HER2抗体、以及携带报道基因(例如EGFP)或自杀基因的ss-或scAAV-N587Myc病毒载体进行静脉内治疗。充当对照的是未经治疗的动物(仅用肿瘤细胞注射的动物)，用携带报道基因或自杀基因的野生型ss-或scAAV病毒载体注射的动物，仅用双特异性抗myc-HER2抗体注射的动物，或仅用携带报道基因或自杀基因的ss-或scAAV-N587Myc病毒载体注射的动物。在注射和治疗后1天，所有动物都用适当的前药进行治疗。每周2次使用测径器测量每个肿瘤的大小，并且将肿瘤体积计算为长度×宽度2×0.52。在发病、肿瘤溃疡、肿瘤直径为15mm或肿瘤体积为1000mm3时，处死小鼠，并且将处死日期记录为死亡日期。用野生型ss-或scAAV、或者携带报道基因的ss-或scAAV-N587Myc病毒载体注射的动物的肝、脾、肾和肿瘤被固定，并且显现报道基因的表达。
尽管自杀诱导基因的靶向递送已得到描述(Zarogoulidis P.等人(2013)J.Genet.Syndr.Gene Ther.4:16849)，但该实例描述了使用包含异源表位例如c-myc的本文所述的病毒载体、以及特异性结合靶向配体和异源表位的双特异性抗体，将自杀基因递送至表达靶向HER2配体的细胞。在另外的实验中，使用如本文所述的包含异源表位的病毒载体、以及特异性结合异源表位(例如，c-myc)和靶受体的双特异性抗体，将自杀基因递送至表达一种或多种其它靶配体的另一种细胞类型。适合于靶向的受体的示例性和非限制性例子包括介导病毒载体的内吞的那些受体，例如癌胚抗原(CEA)(Qiu Y等人(2012)CancerLett.316:31-38)、以及血管内皮生长因子受体(VEGFR)(Leng A等人(2013)TumourBiol.32:1103-1111；Liu T等人(2011)Exp Mol Pathol.91:745-752)。可以靶向的另外受体包括：表皮生长因子受体(EGFR)(Heimberger AB等人(2009)Expert Opin Biol Ther.9:1087-1098)、分化簇44s(CD44s)(Heider KH等人(2004)Cancer Immunol Immunother.53:567-579)、分化簇133(CD133又名AC133)(Zhang SS等人(2012)BMC Med.；10:85)、叶酸盐受体(FR)(Duarte S等人，(2011)J Control Release149(3):264-72)、转铁蛋白受体(TfR)或分化簇71(CD71)(Habashy HO等人，Breast Cancer Res Treat.119(2):283-93)、粘蛋白(Torres MP等人，(2012)Curr Pharm Des.2012；18(17):2472-81)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)(Malecki M.等人，(2012)J Stem Cell Res Ther.2(5))、肿瘤抗性抗原1-60(TRA-1-60)(Malecki M.等人，(2013)J Stem Cell Res Ther.3:134)。

Claims (21)

1.一种组合物，其包含
(i)重组腺相关病毒(AAV)载体，其包含
封装目的核苷酸的AAV衣壳，
其中所述AAV衣壳包含经修饰以包含异源表位的重组AAV衣壳蛋白，其中所述重组AAV衣壳蛋白衍生自经修饰以表达所述异源表位的AAV衣壳基因；
(ii)多特异性结合分子，其包含
(a)特异性结合所述异源表位的抗体互补位，并且
(b)特异性结合细胞表面蛋白或标志物的重靶向配体；和任选地
(iii)药学可接受的载体,
其中所述AAV衣壳显示出:
-在不存在所述多特异性结合分子时，减少至消除的向性；和
-在与所述多特异性结合分子组合时，与参考AAV衣壳相比，改变的向性，其中所述参考AAV衣壳包含参考AAV衣壳蛋白，其与所述重组AAV衣壳蛋白等同但缺乏所述异源表位。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述重组AAV衣壳蛋白还包含除了所述异源表位之外的突变。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中
所述异源表位被插入，以使得与缺乏所述异源表位的参考AAV衣壳相比，所述插入部分地减少了所述AAV衣壳的向性，并且
所述AAV衣壳蛋白还包含除了所述异源表位的插入之外的突变(例如，取代、缺失、除了所述异源表位的插入之外的插入)，与缺乏所述突变的参考AAV衣壳相比，所述突变进一步减少和/或消除所述重组AAV衣壳的向性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中在与所述多特异性结合分子组合时所述改变的向性是指与所述参考AAV衣壳的向性相比，所述AAV衣壳的向性恢复且重定向。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中
(i)所述异源表位包含亲和标签和任选的接头，和/或
(ii)所述重组AAV衣壳蛋白包含氨基酸序列EQKLISEEDL(如SEQ ID NO:6所示)，其中所述氨基酸序列EQKLISEEDL侧翼为和/或可操作地连接至AAV衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述异源表位包含氨基酸序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)或其部分，并且其中所述抗体互补位特异性结合至所述氨基酸序列EQKLISEEDL或其部分。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述目的核苷酸是：
(i)处于选自由病毒启动子、细菌启动子、哺乳动物启动子、禽类启动子、鱼类启动子、昆虫启动子及其任何组合组成的组的启动子的控制下，任选地其中所述目的核苷酸处于非人启动子的控制下；或
(ii)处于非人启动子的控制下并且侧翼为AAV ITR序列；或
(iii)报道基因，任选地，其中所述报道基因编码绿色荧光蛋白，或选自由自杀基因、编码抗体或其片段的核苷酸、编码CRISPR/Cas系统或其部分的核苷酸、编码反义RNA的核苷酸、编码siRNA的核苷酸及其组合组成的组。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述多特异性结合分子是双特异性结合分子。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体互补位是Fv结构域，任选地其中所述Fv结构域直接融合至重链恒定结构域。
10.根据权利要求1所述的组合物，所述重靶向配体是抗体或其部分，任选地：
其中所述抗体是双特异性抗体，其中所述抗体互补位和所述重靶向配体各自包含与第一重链恒定结构域和第二重链恒定结构域融合的不同的Fv结构域，任选地其中所述第一重链和第二重链以不同的结合亲和力与蛋白A结合；或
其中所述重靶向配体包含四聚体抗体结构，所述四聚体抗体结构包含两条等同的免疫球蛋白重链和两条等同的轻链，并且其中结合所述异源表位的所述抗体互补位附加至一条或两条重链的C末端或N末端和/或附加至一条或两条重链的C末端或N末端，并且任选地其中所述抗体互补位是scFv，任选地其中所述scFv包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述细胞表面蛋白是受体，和/或其中所述重靶向配体与在哺乳动物或人细胞表面上表达的受体相结合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述AAV选自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9组成的组，和/或其中所述异源表位在选自由AAV2的I-453、AAV2的I-587、AAV6的I-585、AAV8的I-590、AAV9的I-453、AAV9的I-589以及感染灵长类动物的AAV血清型的任何相应氨基酸组成的组的位置之后插入，和/或替换所述位置。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述AVV衣壳为嵌合衣壳，其以一定比率地包含相同血清型的参考AVV衣壳蛋白，其中所述参考AVV衣壳蛋白不包含所述异源表位。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组AVV衣壳蛋白衍生自经修饰以表达所述异源表位的嵌合AAV衣壳基因，其中所述嵌合AAV衣壳基因包含多个核酸序列，其中所述多个核酸序列各自编码不同AAV血清型的衣壳蛋白的一部分，并且其中所述多个核酸序列一起编码嵌合AAV衣壳蛋白。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物在用于体内治疗或诊断的方法中的用途，其中所述方法包括递送所述目的核苷酸至表达细胞表面蛋白的靶细胞，其中所述方法包括使所述靶细胞与所述组合物接触，其中所述多特异性结合分子包含结合所述细胞表面蛋白的重靶向配体。
16.根据权利要求15所述的组合物的用途，其中：
(a)其中所述递送是向人受试者递送；或
(b)所述靶细胞是人细胞；或
(c)所述靶细胞是人神经元细胞；或
(d)所述靶细胞是人肌肉细胞；或
(e)所述靶细胞选自由肝细胞、脑细胞、T细胞、肾细胞、肠细胞、胰腺细胞、癌细胞以及被异源病原体感染的细胞组成的组。
17.根据权利要求15或16所述的组合物的用途，其中：
(a)所述靶细胞是人肝细胞，任选地其中所述重靶向配体结合所述人肝细胞表达的人去唾液酸糖蛋白受体1(hASGR1)；或
(b)所述重靶向配体结合由所述人神经元细胞表达的GABA受体；或
(c)所述重靶向配体结合由所述人神经元细胞表达的转铁蛋白受体；或
(d)所述靶细胞是人T细胞，任选地其中所述重靶向配体结合由人T细胞表达的CD3；或
(e)所述靶细胞是人T细胞，任选地其中所述重靶向配体结合由人T细胞表达的CD3ε；或
(f)所述靶细胞是人造血细胞，任选地其中所述重靶向配体结合CD34；或
(g)所述靶细胞是人癌细胞，任选地其中所述重靶向配体结合肿瘤相关抗原；或
(h)所述靶细胞是人癌细胞，任选地其中所述重靶向配体结合肿瘤相关抗原，其中所述肿瘤相关抗原为E6、E7或Her2；或
(i)所述细胞表面蛋白是人胰高血糖素受体(hGCGR)；或
(j)所述靶细胞是人肠细胞或是胰腺细胞，任选地其中所述受体是ENTPD3。
18.根据权利要求15或16所述的组合物的用途，其中：
(i)所述重靶向配体结合CD20；或
(ii)所述重靶向配体结合人胰高血糖素受体；或
(iii)所述重靶向配体特异性结合CD63或人外核苷三磷酸二磷酸水解酶3(hENTPD3)。
19.根据权利要求5(i)所述的组合物，其中所述亲和标签包含c-myc(EQKLISEEDL；SEQID NO:6)。
20.根据权利要求6所述的组合物，其中所述抗体互补位特异性结合c-myc，其中所述抗体互补位包含由如SEQ ID NO:28所示的核酸序列编码的scFv的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和/或LCDR3序列。
21.一种递送目的核苷酸至表达细胞表面蛋白的靶细胞的体外或离体方法，其中所述方法包括使所述靶细胞与根据权利要求1至14中任一项所述的组合物接触，其中所述多特异性结合分子包含结合所述细胞表面蛋白的重靶向配体。
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