TW202110869A - 修飾之病毒顆粒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於改造腺相關病毒(AAV)顆粒的組成物以及方法，該等AAV顆粒包含非靈長類AAV、遠親AAV或其組合的衣殼。據此改造的AAV可以是一種用以治療有需要的患者之可行的基因療法平台，且可能尤其適用於牽涉到現有治療性AAV顆粒由於其對現有治療性AAV顆粒的抗體效價為高之現有治療方式所排除的患者。

Description

修飾之病毒顆粒及其用途
本文的揭示內容是有關於製造以及使用重組AAV顆粒的方法，該等重組AAV顆粒包含非靈長類動物AAV及/或遠親AAV之衣殼蛋白。
就各種慢性和遺傳性疾病的潛在治療來說，將基因遞送至特定目標細胞已成為現代醫學中最為重要的技術之一。迄今為止，由於缺乏理想的基因遞送載體，基因治療的臨床應用進展受到了限制。
理想中，基因遞送載體要能夠：(1)將遺傳物質穩定地引入期望的細胞中、(2)避免將遺傳物質引入非目標細胞中，以及(3)避免被患者的免疫系統(例如，患者的抗體)中和。儘管目前一些非病原性載體已經上市，但這些載體轉導特定細胞還有保持不被宿主免疫反應注意到的能力仍不甚理想。
例如，基於腺相關病毒(AAV)而分離自靈長類(特別是人類)的病毒顆粒(例如AAV血清型AAV2、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9)已成為許多研究的焦點，因為AAV能夠在活體內轉導一個廣泛範圍的靈長類物種與組織而沒有毒性或致病性的證據。(Muzyczka, et al. (1992)Current Topics in Microbiology and Immunology , 158:97-129)。此外，AAV安全地轉導有絲分裂後組織。雖然這個病毒偶爾可能併入宿主染色體中，但它只會罕見地併入人類19號染色體的安全港基因座(safe-harbor locus)中且只有在以反式提供複製(Rep)蛋白時。AAV基因體在受感染細胞中迅速環化並串聯，且以穩定的游離基因體(episomal)狀態存在於受感染細胞中，以提供其有效負載(payload)的長期穩定表現。
此外，已在近幾年實現操作和重定向靈長類AAV感染特定細胞。許多在靶向基因治療中使用病毒顆粒的發展可概括為病毒顆粒的非重組型(非遺傳)或重組型(遺傳)修飾，其導致病毒顆粒的假型(pseudotyping)，擴增及/或天然向性的重靶向。(在Nicklin and Baker (2002)Curr. Gene Ther. 2:273-93；Verheiji and Rottier (2012)Advances Virol 2012:1-15中回顧)。
在直接重組靶向方法中，將靶向配體直接插入或偶聯至病毒衣殼，即蛋白質病毒衣殼基因被修飾成表現包含異源性靶向配體的衣殼蛋白。然後，靶向配體重定向(例如結合)偏好或專門在目標細胞上表現的受體或標記。(Stachler et al. (2006)Gene Ther . 13:926–931；White et al. (2004)Circulation 109:513–519；也參見Park et al., (2007)Frontiers in Bioscience 13:2653–59；Girod et al. (1999)Nature Medicine 5:1052–56；Grifman et al. (2001)Molecular Therapy 3:964–75；Shi et al. (2001)Human Gene Therapy 12:1697–1711；Shi and Bartlett (2003)Molecular Therapy 7:515–525)。
在間接重組方法中，用異源性「支架」修飾病毒衣殼，然後將其連接至包括靶向配體的銜接子(adaptor)。銜接子結合至支架和目標細胞。(Arnold et al. (2006)Mol. Ther . 5:125-132；Ponnazhagen et al. (2002)J. Virol . 76:12900–907；也參見WO 97/05266)。支架，諸如(1)結合至抗體銜接子之Fc的Fc結合分子(例如Fc受體，蛋白A等)、(2)結合至生物素化銜接子的(鏈)抗生物素蛋白、(3)結合至與(鏈)抗生物素蛋白融合之銜接子的生物素、(4)可用於偵測及/或分離病毒顆粒的可偵測標籤，被能夠非共價結合可偵測標籤和標靶分子的雙特異性銜接子結合，以及近來的(5)形成異肽鍵的蛋白：蛋白結合對，已經描述了用於各種病毒顆粒。(參見，例如Gigout et al. (2005)Molecular Therapy 11:856–865；Stachler et al. (2008)Molecular Therapy 16:1467–1473；Quetglas et al. (2010)Virus Research 153:179–196；Ohno et al. (1997)Nature Biotechnology 15:763–767；Klimstra et al. (2005)Virology 338:9–21)。
儘管有了提供能定向AAV感染的進展，但是由於存在對抗AAV衣殼的中和抗體(NAb)，經重靶向的AAV作為基因遞送載體仍然不理想。在兒童體內存在有AAV NAb暗示著AAV感染發生在生命早期(Calcedo et al. (2011)ASGCT ；Huser et al. (2017)J. Virol . 91:e02137-16)。已經證實，在生命早期因為AAV感染所產生的抗體會抵銷後續使用的一個AAV基因治療載體(衍生自AAV)，其會被那些先前存在的抗體識別並中和。(Hurlbut et al. (2010)Mol. Ther. 18:1983-94；Jiang et al. (2006)Blood 108:3321-8；Manno et al. (2006)Nat. Med. 12:342-7；Scallan et al. (2006)Blood 107:1810-7；Wang et al. (2010)Mol. Ther. 18:126-34)。此外，對AAV血清型存在中和抗體效價具有臨床重要性，因為具有高效價的患者被認為不適合任何牽涉到該血清型的治療。(Jeune et al. (2013)Hum Gene Ther Methods 24:59-67)。
因此，仍然需要一種非致病性的病毒系統，其適於將感興趣的核酸靶向轉移到各種目標細胞，並在需要治療的患者體內克服先前存在的抗體所設下的障礙。
本文描述的是一種可以同時減輕與先前和當前腺相關病毒(AAV)顆粒治療方法有關之若干問題的策略。在不希望受到理論囿限的情況下，可以預期，大部分人類缺乏針對AAV的預先存在的NAb，而人類先前對AAV的暴露為低。但是，這種AAV血清型被成功操作以用作能夠靶向和感染特定細胞及/或在人類群體中逃過由任何預先存在的抗體引起之交叉反應的基因治療載體仍是未知。
本文顯示，非靈長類動物物種的AAV衣殼蛋白可以被修飾成允許將感興趣核苷酸靶向引入不同動物物種的哺乳動物細胞。此外，本文顯示的證據是，經過這樣修飾的非靈長類動物AAV顆粒比在人類群體中所發現之當前AAV治療方式(其基於經充分特徵鑑定的人類AAV血清型)更不會被預先存在的抗體所識別及/或偵測到。因此，本文描述重組AAV病毒顆粒，其能夠感染選定細胞且更能夠逃過被預先存在的抗體中和。
本文描述的是重組AAV病毒顆粒，其包含(i)包含AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的AAV衣殼，以及(ii)被包裝在AAV衣殼內之包含AAV反向末端重複(ITR)序列的核酸序列， 其中下列至少一者： a)    AAV VP1衣殼蛋白， b)   AAV VP1衣殼蛋白的任何部分， c)    AAV VP2衣殼蛋白， d)   AAV VP2衣殼蛋白的任何部分， e)    AAV VP3衣殼蛋白，及 f)    AAV VP3衣殼蛋白的任何部分， 包含與非靈長類動物AAV或其部分、或遠親AAV或其部分之衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， 其中 I.  AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白中的至少一者包含選自由以下組成之群的修飾： (a)  蛋白：蛋白結合對的第一成員，其中該蛋白：蛋白結合對指導AAV病毒顆粒的向性， (b)  可偵測標籤， (c)  點突變，較佳地其中該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或產生可偵測標籤， (d)  嵌合胺基酸序列，及 (e)  (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合，及/或 II. ITR序列或其部分，其包含與第二AAV或其部分的ITR序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的核酸序列，其中第二AAV與非靈長類動物AAV或遠親AAV不同，以及 其中重組AAV病毒顆粒能夠感染哺乳動物宿主，較佳靈長類宿主。
在一些具體例中，重組AAV病毒顆粒包含(i)包含AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的AAV衣殼，及(ii)被包裝在AAV衣殼內的包含AAV反向末端重複(ITR)序列的核酸序列， 其中下列至少一者： a)    AAV VP1衣殼蛋白， b)   AAV VP2衣殼蛋白，及 c)    AAV VP3衣殼蛋白， 包含與非靈長類動物AAV或遠親AAV之衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， 其中 I.  AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白中的至少一者包含選自由以下組成之群的修飾： (a)  蛋白：蛋白結合對的第一成員，其中該蛋白：蛋白結合對指導AAV病毒顆粒的向性， (b)  可偵測標籤， (c)  點突變，較佳地其中該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或產生可偵測標籤， (d)  嵌合胺基酸序列，及 (e)  (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合，及/或 II. ITR序列或其部分，其包含與第二AAV或其部分的ITR序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的核酸序列，其中第二AAV與非靈長類動物AAV或遠親AAV不同，以及 其中重組AAV病毒顆粒能夠感染哺乳動物宿主，較佳靈長類宿主。
在一些具體例中，重組AAV病毒顆粒包含(i)包含AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的AAV衣殼，以及(ii)被包裝在AAV衣殼內之包含AAV反向末端重複(ITR)序列的核酸序列， 其中下列至少一者： a.    AAV VP1衣殼蛋白的任何部分， b.    AAV VP2衣殼蛋白的任何部分，及 c.    AAV VP3衣殼蛋白的任何部分， 包含與非靈長類動物AAV或其部分、或遠親AAV或其部分之衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， 其中 I.  AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白中的至少一者包含選自由以下組成之群的修飾： (a)  蛋白：蛋白結合對的第一成員，其中該蛋白：蛋白結合對指導AAV病毒顆粒的向性， (b)  可偵測標籤， (c)  點突變，較佳地其中該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或產生可偵測標籤， (d)  嵌合胺基酸序列，及 (e)  (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合，及/或 II. ITR序列或其部分，其包含與第二AAV或其部分的ITR序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的核酸序列，其中第二AAV與非靈長類動物AAV或遠親AAV不同，以及 其中重組AAV病毒顆粒能夠感染哺乳動物宿主，較佳靈長類宿主。
在一些重組AAV病毒顆粒具體例中，重組病毒顆粒包含(i)包含AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的AAV衣殼，以及(ii)被包裝在AAV衣殼內之包含AAV反向末端重複(ITR)序列的核酸序列，其中AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP1衣殼蛋白的任何部分、AAV VP2衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白的任何部分、AAV VP3衣殼蛋白，以及AAV VP3衣殼蛋白的任何部分中的至少一者包含與非靈長類動物AAV或其部分之衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中AAV VP1，VP2和VP3衣殼蛋白中的至少一者包含選自由以下組成之群的修飾： (a)  蛋白：蛋白結合對的第一成員，其中該蛋白：蛋白結合對指導AAV病毒顆粒的向性， (b)  可偵測標籤， (c)  點突變，較佳地其中該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或產生可偵測標籤， (d)  嵌合胺基酸序列，及 (e)  (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合， 其中整個ITR序列或ITR序列的一部分包含與非靈長類動物AAV的ITR具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的核酸序列，視情況其中該ITR序列包含嵌合核酸序列，且其中與非靈長類AAV或其部分的ITR具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)之嵌合核酸序列的一部分可操作地連接至與第二AAV或其部分的ITR具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的嵌合核酸序列的一部分，其中該第二AAV與非靈長類動物AAV不同，且其中該重組AAV病毒顆粒能夠感染哺乳動物宿主，較佳靈長類宿主。
在一些具體例中，重組AAV病毒顆粒包含(i)包含AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的AAV衣殼，以及(ii)被包裝在AAV衣殼內之包含AAV反向末端重複(ITR)序列的核酸序列，其中AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP1衣殼蛋白的任何部分、AAV VP2衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白的任何部分、AAV VP3衣殼蛋白，以及AAV VP3衣殼蛋白的任何部分中的至少一者包含與非靈長類動物AAV或其一部分之衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， 其中該ITR序列或其部分包含與第二AAV或其部分的ITR序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的核酸序列，其中該第二AAV與非靈長類動物AAV不同， 其中該重組AAV病毒顆粒能夠感染哺乳動物宿主，較佳靈長類宿主，且 視情況其中AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白中的至少一者包含選自由以下組成之群的修飾： (a)  蛋白：蛋白結合對的第一成員，其中該蛋白：蛋白結合對指導AAV病毒顆粒的向性， (b)  可偵測標籤， (c)  點突變，較佳地其中該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或產生可偵測標籤，及 (d)  (a)-(c)的任何組合。
在一些具體例中，重組AAV病毒顆粒包含(i)包含AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的AAV衣殼，以及(ii)被包裝在AAV衣殼內之包含AAV反向末端重複序列(ITR)的核酸序列，其中AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP1衣殼蛋白的任何部分、AAV VP2衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白的任何部分、AAV VP3衣殼蛋白，以及AAV VP3衣殼蛋白的任何部分中的至少一者包含含有下列的嵌合胺基酸序列：(A)具有與非靈長類動物AAV衣殼蛋白或其部分之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，其可操作地連接至(B)與第二AAV衣殼蛋白或其部分之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，其中該第二AAV與非靈長類動物AAV不同，其中該重組AAV病毒顆粒能夠感染哺乳動物宿主，較佳靈長類宿主，且視情況其中包含嵌合胺基酸序列之AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP1衣殼蛋白的任何部分、AAV VP2衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白的任何部分、AAV VP3衣殼蛋白，以及AAV VP3衣殼蛋白的任何部分中的至少一者進一步包含選自由以下組成之群的修飾： (a)  蛋白：蛋白結合對的第一成員， (b)  可偵測標籤，及 (c)  (a)與(b)的組合。
在一些重組AAV病毒顆粒具體例中，重組病毒顆粒包含(i)包含AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的AAV衣殼，以及(ii)被包裝在AAV衣殼內之包含AAV反向末端重複(ITR)序列的核酸序列，其中AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP1衣殼蛋白的任何部分、AAV VP2衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白的任何部分、AAV VP3衣殼蛋白，以及AAV VP3衣殼蛋白的任何部分中的至少一者包含與遠親AAV或其一部分之衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中AAV VP1、AAV VP2以及AAV VP3衣殼蛋白中的至少一者包含選自由以下組成之群的修飾： (a)  蛋白：蛋白結合對的第一成員，其中該蛋白：蛋白結合對指導AAV病毒顆粒的向性， (b)  可偵測標籤， (c)  點突變，較佳地其中該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或產生可偵測標籤， (d)  嵌合胺基酸序列，及 (e)  (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合， 其中整個ITR序列或ITR序列的部分包含與遠親AAV的ITR具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的核酸序列，視情況其中該ITR序列包含嵌合核酸序列，且其中與遠親AAV或其部分的ITR具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)之嵌合核酸序列的部分可操作地連接至與第二AAV或其部分之ITR具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的嵌合核酸序列的部分，其中該第二AAV與遠親AAV不同，且其中該重組AAV病毒顆粒能夠感染哺乳動物宿主，較佳靈長類宿主。
在一些具體例中，重組AAV病毒顆粒包含(i)包含AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的AAV衣殼，以及(ii)被包裝在AAV衣殼內之包含AAV反向末端重複(ITR)序列的核酸序列，其中AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP1衣殼蛋白的任何部分、AAV VP2衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白的任何部分、AAV VP3衣殼蛋白，以及AAV VP3衣殼蛋白的任何部分中的至少一者包含與遠親AAV或其部分之衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， 其中該ITR序列或其部分包含與第二AAV或其部分的ITR序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的核酸序列，其中第二AAV與遠親AAV不同， 其中該重組AAV病毒顆粒能夠感染哺乳動物宿主，較佳靈長類宿主，且 視情況其中AAV VP1、VP2與VP3衣殼蛋白中的至少一者包含選自由以下組成之群的修飾： (a)  蛋白：蛋白結合對的第一成員，其中該蛋白：蛋白結合對指導AAV病毒顆粒的向性， (b)  可偵測標籤， (c)  點突變，較佳地其中該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或產生可偵測標籤，及 (d)  (a)-(c)的任何組合。
在一些具體例中，重組AAV病毒顆粒包含(i)包含AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的AAV衣殼，以及(ii)被包裝在AAV衣殼內之包含AAV反向末端重複(ITR)序列的核酸序列，其中AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP1衣殼蛋白的任何部分、AAV VP2衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白的任何部分、AAV VP3衣殼蛋白，以及AAV VP3衣殼蛋白的任何部分中的至少一者包含含有下列的嵌合胺基酸序列：(A)與遠親AAV衣殼蛋白或其部分之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，其可操作地連接至(B)與第二AAV衣殼蛋白或其部分之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，其中該第二AAV與遠親AAV不同，且其中該重組AAV病毒顆粒能夠感染哺乳動物宿主，較佳靈長類宿主，且視情況其中包含嵌合胺基酸序列之AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP1衣殼蛋白的任何部分、AAV VP2衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白的任何部分、AAV VP3衣殼蛋白，以及AAV VP3衣殼蛋白的任何部分中的至少一者進一步包含選自由以下組成之群的修飾： (a) 蛋白：蛋白結合對的第一成員， (b)       可偵測標籤，及 (c) (a)和(b)的組合。
在本發明的一些具體例中，AAV病毒顆粒包含AAV衣殼，其中該AAV衣殼中的至少一個AAV衣殼蛋白(例如AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白及/或AAV VP3衣殼蛋白)包含選自由以下組成之群的衣殼蛋白的至少一部分胺基酸序列：非靈長類AAV的衣殼蛋白、遠親AAV的衣殼蛋白，及其組合，且其中該AAV衣殼中的至少一個AAV衣殼蛋白被修飾成包含(a)蛋白：蛋白結合對的至少第一成員、(b)可偵測標籤、(c)點突變、(d)包含另一(例如第二) AAV衣殼蛋白之一部分胺基酸序列的嵌合胺基酸序列，該另一AAV衣殼蛋白可操作地連接至選自由非靈長類動物AAV的衣殼蛋白、遠親AAV的衣殼蛋白或其組合組成之群之衣殼蛋白的該胺基酸序列，以及(a)、(b)、(c)和(d)之任何組合。在本發明的一些具體例中，AAV病毒顆粒包含AAV衣殼，其中該AAV衣殼或其部分的至少一個AAV衣殼蛋白(例如AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白及/或AAV VP3衣殼蛋白)與選自由以下組成之群的衣殼蛋白具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)：非靈長類動物AAV的衣殼蛋白、非靈長類動物AAV的一部分衣殼蛋白、遠親AAV的衣殼蛋白、遠親AAV的一部分衣殼蛋白，及其組合，且其中該AAV衣殼中的至少一個AAV衣殼蛋白被修飾成包含(a)蛋白：蛋白結合對的至少第一成員、(b)可偵測標籤、(c)點突變、(d)包含另一(例如第二) AAV衣殼蛋白之一部分胺基酸序列的嵌合胺基酸序列，該另一AAV衣殼蛋白可操作地連接至選自由非靈長類動物AAV的衣殼蛋白、遠親AAV的衣殼蛋白或其組合組成之群的衣殼蛋白的該胺基酸序列，以及(e) (a)、(b)、(c)和(d)之任何組合。在本發明的一些具體例中，AAV病毒顆粒包含AAV衣殼，其中該AAV衣殼的至少一個AAV衣殼蛋白(例如AAV VP1衣殼蛋白，AAV VP2衣殼蛋白及/或AAV VP3衣殼蛋白)包含非靈長類動物AAV之衣殼蛋白的至少一部分胺基酸序列(例如，其中該至少一個AAV衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之衣殼蛋白具有顯著序列同一性，例如至少95%序列同一性的胺基酸序列)，其中該AAV衣殼的至少一個AAV衣殼蛋白被修飾成包含(a)蛋白：蛋白結合對的至少第一成員、(b)可偵測標籤、(c)點突變、(d)包含另一(例如第二) AAV衣殼蛋白之一部分胺基酸序列的嵌合胺基酸序列，該另一AAV衣殼蛋白可操作地連接至非靈長類動物AAV的衣殼的胺基酸序列，以及(e) (a)、(b)、(c)和(d)之任何組合。
在本發明的一些具體例中，AAV病毒顆粒包含AAV衣殼，其中該AAV衣殼的至少一個AAV衣殼蛋白(例如AAV VP1衣殼蛋白，AAV VP2衣殼蛋白及/或AAV VP3衣殼蛋白)包含遠親AAV之衣殼蛋白的至少一部分胺基酸序列(例如，其中該至少一個AAV衣殼蛋白包含與遠親AAV之衣殼蛋白具有顯著序列同一性，例如至少95%序列同一性的胺基酸序列)，其中該AAV衣殼的至少一個AAV衣殼蛋白被修飾成包含(a)蛋白：蛋白結合對的至少第一成員、(b)可偵測標籤、(c)點突變、(d)包含另一(例如第二) AAV衣殼蛋白之一部分胺基酸序列的嵌合胺基酸序列，該另一AAV衣殼蛋白可操作地連接至遠親AAV的衣殼蛋白的該胺基酸序列，以及(e) (a)、(b)，(c)和(d)之任何組合。
在本發明的一些具體例中，AAV病毒顆粒包含(A)至少一個AAV衣殼蛋白(例如AAV VP1衣殼蛋白，AAV VP2衣殼蛋白及/或AAV VP3衣殼蛋白)，其包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列：(i)非靈長類動物AAV之衣殼蛋白的胺基酸序列、(ii)遠親靈長類AAV之衣殼蛋白的胺基酸序列，及(iii)其組合的胺基酸序列；以及(B) AAV基因體，包含感興趣核苷酸與另一(例如第二) AAV之至少一部分ITR序列的AAV ITR，其中該另一AAV與非靈長類動物AAV不同且與遠親靈長類AAV也不同。
在本發明的一些具體例中，AAV病毒顆粒包含(A)至少一個AAV衣殼蛋白(例如AAV VP1衣殼蛋白，AAV VP2衣殼蛋白及/或AAV VP3衣殼蛋白)，其包含與非靈長類動物AAV之衣殼蛋白的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列，以及(B) AAV基因體，其包含感興趣核苷酸與另一(例如第二) AAV之至少一部分ITR序列的AAV ITR，其中該另一AAV與非靈長類動物AAV不同。
在本發明的一些具體例中，AAV病毒顆粒包含(A)至少一個AAV衣殼蛋白(例如AAV VP1衣殼蛋白，AAV VP2衣殼蛋白及/或AAV VP3衣殼蛋白)，其包含與遠親AAV之衣殼蛋白的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列，以及(B) AAV基因體，其包含感興趣核苷酸與另一(例如第二) AAV之至少一部分ITR序列的AAV ITR，其中該另一AAV與遠親靈長類AAV不同。
在本發明的一些AAV病毒顆粒具體例中，包含與非靈長類動物AAV之衣殼蛋白、遠親AAV之衣殼蛋白或其組合的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)之胺基酸序列的衣殼蛋白被修飾成包含(a)蛋白：蛋白結合對的至少第一成員、(b)可偵測標籤，(c)點突變。
在本發明的一些AAV病毒顆粒具體例中，包含與非靈長類動物AAV之衣殼蛋白、遠親AAV之衣殼蛋白或其組合的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)之胺基酸序列的衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列及/或遠親AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列。在一些具體例中，包含與非靈長類動物AAV之衣殼蛋白、遠親AAV之衣殼蛋白或其組合的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)之胺基酸序列的衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP2衣殼蛋白的胺基酸序列及/或遠親AAV之VP2衣殼蛋白的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列。在一些具體例中，包含與非靈長類動物AAV之衣殼蛋白、遠親AAV之衣殼蛋白或其組合的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)之胺基酸序列的衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP1衣殼蛋白的胺基酸序列及/或遠親AAV之VP1衣殼蛋白的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列。
在本發明的一些AAV病毒顆粒具體例中，該顆粒的衣殼包含(i) VP1衣殼蛋白，其為(a)嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中該嵌合VP1衣殼蛋白包含另一(例如第二) AAV的VP1-特有區(VP1-u)，其可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP1/VP2共有區和VP3區，或(b)非靈長類AAV或遠親AAV的VP1衣殼蛋白；(ii)VP2衣殼蛋白，其為(a)嵌合AAV VP2衣殼蛋白，視情況其中該嵌合VP2衣殼蛋白包含另一(例如第二) AAV的VP1/VP2共有區，其可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP3區，或(b)非靈長類AAV或遠親AAV的VP2衣殼蛋白；以及(iii)非靈長類AAV或遠親AAV的VP3衣殼蛋白。在一些具體例中，該顆粒的衣殼包含(i)嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中該嵌合VP1衣殼蛋白包含另一(例如第二) AAV的VP1-特有區(VP1-u)，其可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP1/VP2共有區和VP3區；(ii)嵌合AAV VP2衣殼蛋白，視情況其中該嵌合VP2衣殼蛋白包含另一(例如第二) AAV的VP1/VP2共有區，其可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP3區；以及(iii)非靈長類AAV或遠親AAV的VP3衣殼蛋白。在一些具體例中，該顆粒的衣殼包含(i)嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中該嵌合VP1衣殼蛋白包含另一(例如第二) AAV的VP1-特有區(VP1-u)，其可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP1/VP2共有區和VP3區；(ii)非靈長類AAV或遠親AAV的VP2衣殼蛋白；以及(iii)非靈長類AAV或遠親AAV的VP3衣殼蛋白。在一些具體例中，該衣殼包含(i)非靈長類AAV或遠親AAV的VP1衣殼蛋白；(ii)非靈長類AAV或遠親AAV的VP2衣殼蛋白；以及(iii)非靈長類AAV或遠親AAV的VP3衣殼蛋白，且視情況其中該顆粒在衣殼內包含AAV基因體，該AAV基因體包含含有另一(例如第二) AAV之至少一部分ITR序列的AAV ITR。在一些具體例中，該另一AAV與非靈長類動物AAV不同。
在一些重組AAV病毒顆粒具體例中，(i) VP1衣殼蛋白包含(a)嵌合胺基酸序列，視情況其中該嵌合VP1衣殼蛋白之VP1特有區(VP1-u)包含一個與第二AAV的VP1-u之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中該嵌合AAV VP1衣殼之VP1/VP2共有區與VP3區包含與非靈長類動物AAV之VP1/VP2共有區和VP3區的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，或(b)與非靈長類動物AAV之VP1衣殼蛋白具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列；(ii) VP2衣殼蛋白包含(a)嵌合胺基酸序列，視情況其中該嵌合AAV VP2衣殼蛋白之VP1/VP2共有區包含一個與第二AAV的VP1/VP2共有區之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中該嵌合VP2衣殼蛋白之VP3區包含與非靈長類動物AAV之VP3區至少95%序列同一性，或(b)與非靈長類動物AAV之VP2衣殼蛋白具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列；以及(iii) VP3衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。在一些具體例中，(i) VP1衣殼蛋白包含嵌合胺基酸序列，視情況其中該嵌合AAV VP1衣殼蛋白之VP1特有區(VP1-u)包含與第二AAV的VP1-u之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中該嵌合AAV VP1衣殼之VP1/VP2共有區和VP3區包含與非靈長類動物AAV之VP1/VP2共有區和VP3區的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列；(ii) VP2衣殼蛋白包含嵌合胺基酸序列，視情況其中該嵌合AAV VP2衣殼蛋白之VP1/VP2共有區包含一個與第二AAV的VP1/VP2共有區之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中該嵌合VP2衣殼蛋白之VP3區包含與非靈長類動物AAV之VP3區至少95%序列同一性；以及(iii) VP3衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。在一些具體例中，(i) AAV VP1衣殼蛋白包含嵌合胺基酸序列，視情況其中該嵌合AAV VP1衣殼蛋白之VP1特有區(VP1-u)包含一個與第二AAV的VP1-u之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中該嵌合AAV VP1衣殼之VP1/VP2共有區和VP3區包含與非靈長類動物AAV之VP1/VP2共有區和VP3區的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列；(ii) VP2衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP2衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列；以及(iii) VP3衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。在一些具體例中，(i) VP1衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP1衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列；(ii) VP2衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP2衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列；以及(iii) VP3衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且視情況其中該顆粒在衣殼內包含AAV基因體，該AAV基因體包含含有另一(例如第二) AAV之至少一部分ITR序列的AAV ITR。在一些具體例中，該另一AAV與非靈長類動物AAV不同。
在本發明的一些AAV病毒顆粒具體例中，該另一(例如第二) AAV是靈長類AAV或靈長類AAV的組合。在一些具體例中，該另一AAV選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13及其組合。在一些具體例中，該另一AAV是AAV2。
在本發明的一些AAV病毒顆粒具體例中，非靈長類動物AAV是在表2中列出的非靈長類AAV。在一些具體例中，非靈長類AAV是禽類AAV (AAAV)、海獅AAV或髭頰蜥AAV。在一些具體例中，非靈長類動物AAV是AAAV，且視情況AAAV衣殼蛋白的胺基酸序列在AAAV的VP1衣殼蛋白的位置I444或I580處包含一個修飾。在一些具體例中，非靈長類動物AAV是有鱗目AAV，例如髭頰蜥AAV，且視情況髭頰蜥AAV的胺基酸序列在髭頰蜥AAV之VP1衣殼蛋白的位置I573或I436處包含一個修飾。在一些具體例中，非靈長類動物AAV是哺乳動物AAV，例如海獅AAV，且視情況海獅AAV的胺基酸序列在海獅AAV之VP1衣殼蛋白之由I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436、I437和A565組成之群的位置處包含一個修飾。
在本發明的一些AAV病毒顆粒具體例中，蛋白：蛋白結合對選自SpyTag：SpyCatcher、SpyTag：KTag、Isopeptag：pilin C，SnoopTag：SnoopCatcher和SpyTag002：SpyCatcher002。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含c-myc，其包含如SEQ ID NO：44所示的序列。在一些具體例中，可偵測標籤包含B1表位，其包含IGTRYLTR的胺基酸序列(SEQ ID NO：45)。
在一些具體例中，本發明的AAV顆粒包含非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合的VP3衣殼蛋白，其中該VP3衣殼蛋白被修飾成包含(a)蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，視情況其中該蛋白：蛋白結合對選自由SpyTag：SpyCatcher、SpyTag：KTag、Isopeptag：pilin C，SnoopTag：SnoopCatcher和SpyTag002：SpyCatcher002組成之群；(b)可偵測標籤，視情況其中可偵測標籤包含如SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列或如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列；(c)點突變，或(d) (a)、(b)和(c)之任何組合。在一些具體例中，非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合的VP3衣殼蛋白被修飾成包含(a)至少SpyTag，其包含如SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列；及/或(b)包含如SEQ ID NO：45所示胺基酸序列的可偵測標籤。
在一些具體例中，本發明的AAV顆粒包含第一及/或第二連接子，其將蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤可操作地連接至該AAV顆粒的衣殼的衣殼蛋白。在一些具體例中，第一和第二連接子不同。在一些具體例中，第一和第二連接子相同。在一些具體例中，第一及/或第二連接子的長度為10個胺基酸。
在本發明的一些病毒顆粒具體例中，VP1、VP2和VP3衣殼蛋白中的至少一者(視情況至少VP3衣殼)被修飾成包含(a)蛋白：蛋白結合對的第一成員；(b)可偵測標籤；(c)點突變，或(d) (a)、(b)及/或(c)的任何組合。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤或點突變位於衣殼蛋白的可變區內。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員或可偵測標籤側接第一連接子及/或第二連接子。在一些具體例中，第一及/或第二連接子的長度為1-10個胺基酸。在一些具體例中，第一和第二連接子不同。在一些具體例中，第一和第二連接子相同。
在一些病毒顆粒具體例中，AAAV VP3衣殼蛋白包含一個修飾，視情況蛋白：蛋白結合對的第一成員，視情況其中該修飾在位置I444 (例如，G444)及/或I580 (例如，K580)處。在一些具體例中，AAAV VP3衣殼蛋白包含一個修飾，視情況蛋白：蛋白結合對的第一成員，視情況其中該修飾在位置I444 (例如，G444)及/或I580 (例如，K580)處。在一些具體例中，髭頰蜥AAV VP3衣殼蛋白包含一個修飾，視情況蛋白：蛋白結合對的第一成員，視情況其中該修飾在位置I573 (例如，T573)及/或I436 (例如，G436)處。在一些具體例中，海獅VP3衣殼蛋白包含一個修飾，視情況蛋白：蛋白結合對的第一成員，視情況其中該修飾在選自由I429 (例如，N429)、I430 (例如，I430)、I431 (例如T431)、I432 (例如G432)、I433 (例如，S433)、I434 (例如T434)、I436 (例如，R436)、I437 (例如，D437)，和I565 (A565)組成之群的位置處。
在本發明的一些病毒顆粒具體例中，至少一個衣殼蛋白(視情況至少VP3衣殼)被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的第一成員。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含蛋白：蛋白結合對的第一成員。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包括蛋白：蛋白結合對的第二同源成員。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員藉由共價鍵(例如異肽鍵)結合。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員是SpyTag，且視情況蛋白：蛋白結合對的第二成員是SpyCatcher或KTag。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員是KTag，且視情況蛋白：蛋白結合對的第二成員是SpyTag。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員是SnoopTag，而蛋白：蛋白結合對的第二成員是SnoopCatcher。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員是isopeptag，而蛋白：蛋白結合對的第二成員是Pilin-C。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員是SpyTag002，而蛋白：蛋白結合對的第二成員是SpyCatcher002。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第二成員連接至靶向配體，例如結合部分，例如抗體或其片段。在一些具體例中，靶向配體可以視情況經由連接子在第二成員的C端處融合至蛋白：蛋白結合對的第二成員(例如SpyCatcher)，且該連接子在連接子C端處融合至SpyCatcher。在一些具體例中，連接子包含序列GSGESG (SEQ ID NO：49)。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤c-myc。
在本發明的一些病毒顆粒具體例中，至少一個衣殼蛋白(視情況至少VP3衣殼)被修飾成包含可偵測標籤。在一些具體例中，可偵測標籤包含AAV B1表位，例如胺基酸序列IGTRYLTR (SEQ ID NO：45)。
在本發明的一些病毒顆粒具體例中，至少一個衣殼蛋白(視情況至少VP3衣殼)被修飾成包含 (a) 蛋白：蛋白結合對的第一成員，該蛋白：蛋白結合對包含蛋白：蛋白結合對的至少一個成員，視情況其中該蛋白：蛋白結合對選自由SpyTag：SpyCatcher、SpyTag：KTag、Isopeptag：pilin‑C、SnoopTag：SnoopCatcher，SpyTag002：SpyCatcher002和c-myc：抗-c-myc抗體組成之群。 (b)       可偵測標籤，視情況其中該可偵測標籤包含如SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列或如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列， (c) 點突變，或 (d)       (a)、(b)和(c)的任何組合。
在本發明的一些病毒顆粒具體例中，至少一個衣殼蛋白(視情況至少VP3衣殼)被修飾成包含 (a) 蛋白：蛋白結合對的第一成員，其包含至少SpyTag，包含如SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列，及/或 (b)       可偵測標籤，包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列。
在一些具體例中，本發明的AAV顆粒包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：(a)如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列、(b)如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列、(c)如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列、(d)如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列、(e)如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列、(f)如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列、(g)如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列、(h)如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列、(i)如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列、(j)如SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列、(k)如SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列、(l)如SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列、(m)如SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列、(n)如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列、(o)如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列、(p)如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列、(q)如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列、(r)如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列、(s)如SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列、(t)如SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列、(u)如SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列、(v)如SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列、(w)如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列、(x)如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列、(y)如SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列、(z)如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列、(aa)如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列、(bb)如SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列、(cc)與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71具有至少95%同一性的胺基酸序列，以及(dd) (a)-(cc)中任一者所示胺基酸序列的任何VP2及/或VP3部分的胺基酸序列。
在本發明的一些病毒顆粒具體例中，其中AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白中之至少一者包含一個修飾，例如蛋白：蛋白結合對的第一成員，該病毒顆粒進一步包含參考衣殼蛋白(視情況除了該修飾以外對應於AAV VP1，VP2和VP3衣殼蛋白中之至少一者的衣殼蛋白)，使得衣殼為拼合衣殼。在一些具體例中，拼合衣殼包含經蛋白：蛋白結合對的第一成員修飾的VP1衣殼蛋白和參考VP1衣殼蛋白。在一些具體例中，拼合衣殼包含經蛋白：蛋白結合對的第一成員修飾的VP2衣殼蛋白和參考VP2衣殼蛋白。在一些具體例中，拼合衣殼包含經蛋白：蛋白結合對的第一成員修飾的VP3衣殼蛋白和參考VP3衣殼蛋白。
也描述了包含本發明AAV衣殼蛋白的本發明病毒顆粒。在本發明的一些具體例中，本發明的AAV衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV或遠親AAV之衣殼蛋白的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列，其中該AAV衣殼蛋白選自由以下組成之群：(a)嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中嵌合動物AAV VP1衣殼蛋白被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員、可偵測標籤，及/或點突變；(b)非嵌合AAV VP1衣殼蛋白，被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員及/或可偵測標籤；(c)嵌合VP2衣殼蛋白，視情況其中該嵌合AAV VP2衣殼蛋白被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員、可偵測標籤及/或點突變；(d)非嵌合AAV VP2衣殼蛋白，被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變；(e)嵌合AAV VP3衣殼蛋白，被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變；以及(f)非嵌合AAV VP3衣殼蛋白，被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變。
在本發明的一些AAV衣殼蛋白具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤在一側或兩側分別側接將蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤連接至衣殼蛋白的第一及/或第二連接子，其中第一及/或第二連接子的長度各自獨立地為至少一個胺基酸。在一些具體例中，第一和第二連接子不同。在一些具體例中，第一和第二連接子相同，且長度為10個胺基酸。
在一些具體例中，本發明的AAV衣殼蛋白包含一個可偵測標籤，視情況其中該可偵測標籤包含B1表位，其包含如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列。在一些具體例中，可偵測標籤包含c-myc。
在一些具體例中，本發明的AAV衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員和第二同源成員這兩者，視情況其中第一成員和第二成員藉由共價鍵(視情況異肽鍵)結合。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員是SpyTag，且視情況第二同源成員是SpyCatcher或KTag。在一些具體例中，第一成員是KTag，而第二同源成員是SpyTag。在一些具體例中，第一成員是SnoopTag，而第二同源成員是SnoopCatcher。在一些具體例中，第一成員是isopeptag，而第二同源成員是Pilin-C。在一些具體例中，第一成員是SpyTag002，而第二同源成員是SpyCatcher002。在一些具體例中，第一成員包含可偵測標籤，諸如但不限於c-myc，其中它的結合對是抗c-myc抗體或其一部分。在一些具體例中，第二成員可操作地連接至靶向配體，視情況其中該靶向配體是視情況靶向細胞標記的結合部分。在一些具體例中，結合部分是抗體或其一部分。在一些具體例中，結合部分視情況經由共價鍵(諸如但不限於異肽鍵)或連接子可操作地連接至蛋白：蛋白結合對的第二成員。在一些具體例中，結合部分經由融合在結合部分C端處的連接子而融合至蛋白：蛋白結合對的第二成員，其中該連接子在連接子C端處融合至第二成員，視情況其中該連接子包含如SEQ ID NO：49 (GSGESG)所示的序列。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員位於衣殼蛋白之VR I、VR II、VR III、VR IV、VR V、VR VI、VR VII、VR VIII，VR IX或HI環(loop)中的某個胺基酸位置處，視情況為衣殼蛋白的VR VIII或VR IV。
在本發明的一些AAV衣殼蛋白具體例中，非靈長類動物AAV是表2中所列的非靈長類AAV。在一些具體例中，非靈長類AAV是禽類AAV (AAAV)，海獅AAV或髭頰蜥AAV。在一些具體例中，非靈長類動物AAV是AAAV，且視情況AAAV衣殼蛋白的胺基酸序列包含一個在AAAV的VP1衣殼蛋白的位置I444或I580處的修飾。在一些具體例中，非靈長類動物AAV是有鱗目AAV，例如髭頰蜥AAV，且視情況髭頰蜥AAV的胺基酸序列包含一個在髭頰蜥AAV之VP1衣殼蛋白的位置I573或I436處的修飾。在一些具體例中，非靈長類動物AAV是哺乳動物AAV，例如海獅AAV，且視情況海獅AAV的胺基酸序列包含一個在選自由以下組成之群的位置處的修飾：海獅AAV之VP1衣殼蛋白的I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436，I437和A565。
本發明的非靈長類動物VP3衣殼蛋白包括非靈長類VP3衣殼，(a)其將另一(例如第二) AAV的基因體包入衣殼，及/或(b)其經突變。在一些具體例中，本發明的非人類動物AAV的VP3衣殼蛋白將不是非靈長類動物的第二AAV的基因體包入衣殼。在一些具體例中，本發明的非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白可操作地連接至蛋白：蛋白結合對的第一成員(視情況經由第一及/或第二連接子)及/或包含一個點突變，例如使得衣殼蛋白的天然向性被降低至消除及/或使得衣殼蛋白包含可偵測標籤。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤，其包含c-myc (SEQ ID NO：44)。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含蛋白：蛋白結合對的第一成員，以及視情況形成共價鍵之第二成員。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對選自由以下組成之群：(a) SpyTag：SpyCatcher、(b) SpyTag：KTag、(c) Isopeptag：pilin C、(d) SnoopTag：SnoopCatcher和I SpyTag002：SpyCatcher002。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白可包含(a) B1表位(SEQ ID NO：45)、(b) SpyTag，(c) SpyCatcher或(a)-(c)的任何組合。
在一些具體例中，本發明的非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白包含(視情況經由第一或第二連接子)可操作地連接的蛋白：蛋白結合對的第一成員。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白的可變區(VR)或其部分中發現的某個胺基酸位置處可操作地連接至該VP3衣殼，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至VP3衣殼。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白的VR I、VR II、VR III、VR IV、VR V、VR VI、VR VII、VR VIII，VR IX或HI環中發現的某個胺基酸位置處可操作地連接至該VP3衣殼，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至VP3衣殼。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白的VR VIII或VR IV中發現到的某個胺基酸位置處可操作地連接至該VP3衣殼，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至VP3衣殼。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白是選自表2中提供的非靈長類動物AAV的非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白是禽類AAV (AAAV)的VP3衣殼蛋白。在一些具體例中，AAAV的VP3衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員(例如，SpyTag)，其視情況經由第一及/或第二連接子在位置I444或I580處可操作地連接。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白是髭頰蜥AAV的VP3衣殼蛋白。在一些具體例中，髭頰蜥AAV的VP3衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員(例如，SpyTag)，其視情況經由第一及/或第二連接子在位置I573或I436處可操作地連接。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白是海獅AAV的VP3衣殼蛋白。在一些具體例中，海獅AAV的VP3衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員(例如，SpyTag)，其視情況經由第一及/或第二連接子在選自由以下組成之群的位置處可操作地連接：I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436、I437和I565，且視情況在選自由I429、I430、I431、I432、I433，I436和I437組成之群的位置處；且視情況在I432處。
本發明的非靈長類動物VP2衣殼蛋白包括非靈長類VP2衣殼，(a)其將另一(例如第二) AAV的基因體包入衣殼，及/或(b)其經突變。在一些具體例中，本發明的非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白將另一(例如第二) AAV的基因體包入衣殼。在一些具體例中，本發明的非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白可操作地連接至蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或包含一個點突變，例如使得衣殼蛋白的天然向性被降低至消除及/或使得衣殼蛋白包含可偵測標籤。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤，其包含c-myc (SEQ ID NO：44)。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含蛋白：蛋白結合對的第一成員，以及視情況形成共價鍵之第二成員。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對選自由以下組成之群：(a) SpyTag：SpyCatcher、(b) SpyTag：KTag、(c) Isopeptag：pilin C、(d) SnoopTag：SnoopCatcher和(e) SpyTag002：SpyCatcher002。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白可包含(a) B1表位(SEQ ID NO：45)、(b) SpyTag，(c) SpyCatcher，或(a)-(c)的任何組合。
在一些具體例中，本發明的非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白包含(視情況經由第一與第二連接子)可操作地連接的蛋白：蛋白結合對的第一成員。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白的可變區(VR)或其部分中發現的某個胺基酸位置處可操作地連接至該VP2衣殼，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至VP2衣殼。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白的VR I、VR II、VR III、VR IV、VR V、VR VI、VR VII、VR VIII，VR IX或HI環中發現的某個胺基酸位置處可操作地連接至該VP2衣殼，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至VP2衣殼。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白的VR VIII或VR IV中發現的某個胺基酸位置處可操作地連接至該VP2衣殼，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至VP2衣殼。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白是選自表2中提供的非靈長類動物AAV的非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白是禽類AAV (AAAV)的VP2衣殼蛋白。在一些具體例中，AAAV的VP2衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員(例如，SpyTag)，其視情況經由第一及/或第二連接子在位置I444或I580處可操作地連接。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白是髭頰蜥AAV的VP2衣殼蛋白。在一些具體例中，髭頰蜥AAV的VP2衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員(例如，SpyTag)，其視情況經由第一及/或第二連接子在位置I573或I436處可操作地連接。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白是海獅AAV的VP2衣殼蛋白。在一些具體例中，海獅AAV的VP2衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員(例如，SpyTag)，其視情況經由第一及/或第二連接子在選自由以下組成之群的某個位置處可操作地連接：I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436、I437和I565，且視情況在選自由I429、I430、I431、I432、I433，I436和I437組成之群的位置處；且視情況在I431處。
在一些具體例中，本發明的VP2衣殼蛋白可以是嵌合VP2衣殼蛋白，其包含呈可操作地連接的非靈長類動物AAV的一部分VP2衣殼蛋白與另一(例如第二) AAV的一部份VP2衣殼蛋白。在一些具體例中，嵌合VP2衣殼蛋白從N端到C端包含(a)另一(例如第二) AAV的一部份VP2衣殼蛋白可操作地連接至(b)非靈長類動物AAV的一部份VP2衣殼，其包含至少非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合VP2衣殼蛋白從N端到C端可包含(a)另一AAV之VP1/VP2共有區的胺基酸序列可操作地連接至(b)非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，另一AAV是非靈長類動物AAV。在一些其他具體例中，另一AAV是靈長類AAV。
在一些具體例中，本發明的嵌合VP2衣殼蛋白包含(a)靈長類AAV的一部份VP2衣殼蛋白可操作地連接至(b)非靈長類動物AAV的一部份VP2衣殼，其至少包含非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合VP2衣殼蛋白從N端到C端可包含(a)靈長類AAV的VP1/VP2共有區的胺基酸序列可操作地連接至(b)非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV1。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV2。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV3。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV4。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV5。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV6。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV7。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV8。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV9。在一些具體例中，非靈長類動物AAV是選自表2中提供的非靈長類動物AAV之群。在一些具體例中，非靈長類動物AAV是禽類AAV，髭頰蜥AAV或海獅AAV。
在一些具體例中，本發明的嵌合VP2衣殼蛋白包含(a) AAV2的一部份VP2衣殼蛋白可操作地連接至(b)非靈長類動物AAV的一部份VP2衣殼，其包含至少非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合VP2衣殼蛋白從N端到C端可包含(a) AAV2的VP1/VP2共有區的胺基酸序列可操作地連接至(b)非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。
在一些具體例中，本發明的嵌合AAV2/AAAV VP2衣殼蛋白包含(a) AAV2的一部份VP2衣殼蛋白可操作地連接至(b)禽類AAV (AAAV)的一部份VP2衣殼蛋白，其包含至少AAAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/AAAV VP2衣殼蛋白從N端到C端可包含(a) AAV2之VP1/VP2共有區的胺基酸序列可操作地連接至(b) AAAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。
在一些具體例中，本發明的嵌合AAV2/海獅AAV VP2衣殼蛋白包含(a) AAV2的一部分VP2衣殼蛋白可操作地連接至(b)海獅AAV的一部分VP2衣殼蛋白，其包含至少海獅AAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP2衣殼蛋白從N端到C端可包含(a) AAV2之VP1/VP2共有區的胺基酸序列可操作地連接至(b)海獅AAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。
在一些具體例中，本發明的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP2衣殼蛋白包含(a) AAV2的一部分VP2衣殼蛋白可操作地連接至(b)髭頰蜥AAV的一部分VP2衣殼蛋白，其包含至少髭頰蜥AAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP2衣殼蛋白從N端到C端可包含(a) AAV2之VP1/VP2共有區的胺基酸序列可操作地連接至(b)髭頰蜥AAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。
在一些具體例中，本發明的嵌合VP2衣殼蛋白可操作地連接至蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或包含點突變，例如使得衣殼蛋白的天然向性被降低至消除及/或使得衣殼蛋白包含可偵測標籤。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤，其包含c-myc (SEQ ID NO：44)。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含蛋白：蛋白結合對的第一成員，及視情況形成共價鍵的第二成員。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對選自由以下組成之群：(a) SpyTag：SpyCatcher、(b) SpyTag：KTag、(c) Isepteptag：pilinC，(d) SnoopTag：SnoopCatcher和(e) SpyTag002：SpyCatcher002。在一些具體例中，嵌合VP2衣殼蛋白可包含(a) B1表位(SEQ ID NO：45)、(b) SpyTag，(c) SpyCatcher或(a)-(c)的任何組合。
在一些具體例中，本發明的嵌合靈長類/非靈長類動物VP2衣殼蛋白(例如，嵌合AAV2/AAAV VP2衣殼蛋白、嵌合的AAV2/海獅AAV VP2衣殼蛋白、嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP2衣殼蛋白等)包含視情況經由第一或第二連接子可操作地連接的蛋白：蛋白結合對的第一成員。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在嵌合靈長類/非靈長類動物VP2衣殼蛋白的可變區(VR)或其部分中發現到的某個胺基酸位置處可操作地連接至該嵌合靈長類/非靈長類動物VP2衣殼蛋白(例如，嵌合AAV2/AAAV VP2衣殼蛋白、嵌合AAV2/海獅AAV VP2衣殼蛋白、嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP2衣殼蛋白等)，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至嵌合靈長類/非靈長類VP2衣殼蛋白。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在嵌合靈長類/非靈長類VP2衣殼蛋白的VR I、VR II、VR III、VR IV、VR V、VR VI、VR VII、VR VIII，VR IX或HI環中發現到的某個胺基酸位置處可操作地連接至嵌合靈長類/非靈長類VP2衣殼蛋白，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至VP2衣殼。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在嵌合靈長類/非靈長類VP2衣殼蛋白的VR VIII或VR IV中發現到的胺基酸位置處可操作地連接至嵌合靈長類/非靈長類VP2衣殼蛋白(例如，嵌合AAV2/AAAV VP2衣殼蛋白、嵌合AAV2/海獅AAV VP2衣殼蛋白、嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP2衣殼蛋白等)，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至嵌合靈長類/非靈長類VP2衣殼蛋白。在一些具體例中，嵌合AAV2/AAAV VP2衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員(例如，SpyTag)，其視情況經由第一及/或第二連接子在位置I444或I580處可操作地連接。在一些具體例中，嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP2衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員(例如，SpyTag)，其視情況經由第一及/或第二連接子在位置I573或I436處可操作地連接。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP2衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員(例如，SpyTag)，其視情況經由第一及/或第二連接子在選自由以下組成之群的某個位置處可操作地連接：I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436，I437和I565；視情況在選自由以下組成之群的位置處：I429、I430、I431、I432、I433，I436和I437；視情況在I431處。
本發明的非靈長類動物VP1衣殼蛋白包括非靈長類VP1衣殼，(a)其將另一(例如第二) AAV的基因體包入衣殼，及/或(b)其經突變。在一些具體例中，本發明之非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白將另一(例如第二) AAV之基因體包入衣殼。在一些具體例中，本發明之非靈長類動物的VP1衣殼蛋白可操作地連接至蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或包含點突變，例如使得衣殼蛋白的天然向性被降低至消除及/或使得衣殼蛋白包含可偵測標籤。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤，其包含c-myc (SEQ ID NO：44)。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含蛋白：蛋白結合對的第一成員，以及視情況形成共價鍵之第二成員。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對選自由以下組成之群：(a) SpyTag：SpyCatcher、(b) SpyTag：KTag、(c) Isopeptag：pilin C，(d) SnoopTag：SnoopCatcher和(e) SpyTag002：SpyCatcher002。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白可包含(a) B1表位(SEQ ID NO：45)、(b) SpyTag，(c) SpyCatcher或(a)-(c)的任何組合。
在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在本發明非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白的可變區(VR)或其部分中發現到的某個胺基酸位置處可操作地連接至該VP1衣殼，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至VP3衣殼。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白的VR I、VR II、VR III、VR IV、VR V、VR VI、VR VII、VR VII，VR IX或HI環中發現到的某個胺基酸位置處可操作地連接至該VP1衣殼，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至VP1衣殼。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白的VR VIII或VR IV中發現到的某個胺基酸位置處可操作地連接至該VP1衣殼，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至VP1衣殼。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白是選自表2中提供的非靈長類AAV之群的非靈長類AAV的VP1衣殼蛋白。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白是禽類AAV (AAAV)的VP1衣殼蛋白。在一些具體例中，AAAV的VP1衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員(例如SpyTag)，其視情況經由第一及/或第二連接子在位置I444或I580處可操作地連接。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白是髭頰蜥AAV的VP31衣殼蛋白。在一些具體例中，髭頰蜥AAV的VP1衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員(例如SpyTag)，其視情況經由第一及/或第二連接子在位置I573或I436處可操作地連接。在一些具體例中，非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白是海獅AAV的VP1衣殼蛋白。在一些具體例中，海獅AAV的VP1衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員(例如SpyTag)，其視情況經由第一及/或第二連接子在選自由以下組成之群的位置處可操作地連接：I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436，I437和I565，且視情況在選自由I429、I430、I431、I432、I433，I436和I437組成之群的位置處；且視情況在I431處。
在一些其他具體例中，本發明的VP1衣殼蛋白可以是嵌合VP1衣殼蛋白，其包含呈可操作地連接的非靈長類動物AAV的一部份VP1衣殼蛋白與另一AAV的一部份VP1衣殼蛋白，其中該另一AAV不是非靈長類動物AAV。在一些具體例中，嵌合VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a)另一AAV的一部份VP1衣殼蛋白，其包含至少另一AAV的PLA2 結構域，以及(b)非靈長類動物AAV的一部分VP1衣殼，其包含至少非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a)另一AAV的一部份VP1衣殼蛋白，其包含至少該另一AAV的VP1-u結構域，以及(b)非靈長類動物AAV的一部份VP1衣殼，其包含至少非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合VP1衣殼蛋白從N端到C端包含(a)另一(例如第二) AAV之VP1-u結構域和VP1/VP2共有區的胺基酸序列，以及(b)非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，另一AAV是非靈長類動物AAV。在一些其他具體例中，另一AAV是靈長類AAV。
在一些具體例中，嵌合VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a)靈長類AAV的一部份VP1衣殼蛋白，其包含至少靈長類AAV的PLA2 結構域，以及(b)非靈長類動物AAV的一部分VP1衣殼，其包含至少非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a)靈長類AAV的一部分VP1衣殼蛋白，其包含至少靈長類AAV的VP1-u結構域，以及(b)非靈長類動物AAV的一部分VP1衣殼，其包含至少非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a)靈長類AAV之VP1-u結構域和VP1/VP2共有區的胺基酸序列，以及(b)非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV1。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV2。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV3。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV4。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV5。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV6。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV7。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV8。在一些具體例中，靈長類AAV是AAV9。在一些具體例中，非靈長類動物AAV是選自表2中提供之非靈長類動物AAV之群。在一些具體例中，非靈長類動物AAV是禽類AAV，髭頰蜥AAV或海獅AAV。
在一些具體例中，嵌合VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a) AAV2的一部分VP1衣殼蛋白，其包含至少AAV2的PLA2 結構域，以及(b)非靈長類動物AAV的一部分VP1衣殼，其包含至少非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a) AAV2的一部分VP1衣殼蛋白，其包含至少AAV2的VP1-u結構域，以及(b)非靈長類動物AAV的一部分VP1衣殼，其包含至少非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合VP1衣殼蛋白從N端到C端包含(a) AAV2之VP1-u結構域和VP1/VP2共有區的胺基酸序列，以及(b)非靈長類動物之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。
在一些具體例中，嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a) AAV2的一部分VP1衣殼蛋白，其包含至少AAV2的PLA2 結構域，及(b)禽類AAV (AAAV)的一部分VP1衣殼，其包含至少AAAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a) AAV2的一部分VP1衣殼蛋白，其包含至少AAV2的VP1-u結構域，及(b) AAAV的一部分VP1衣殼蛋白，其包含至少AAAV之VP3衣殼的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a) AAV2之VP1-u結構域和VP1/VP2共有區的胺基酸序列，及(b) AAAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a) AAV2的一部分VP1衣殼蛋白，其包含至少AAV2的PLA2 結構域，及(b)海獅AAV的一部分VP1衣殼，其包含至少海獅之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a) AAV2的一部分VP1衣殼蛋白，其包含至少AAV2的VP1-u結構域，及(b)海獅的一部分VP3衣殼，其包含至少海獅之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a) AAV2之VP1-u結構域和VP1/VP2共有區的胺基酸序列，及(b)海獅之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。
在一些具體例中，嵌合AAV2/髭頰蜥VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a) AAV2的一部分VP1衣殼蛋白，其包含至少AAV2的PLA2 結構域，及(b)髭頰蜥AAV的一部分VP1衣殼，其包含至少髭頰蜥之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/髭頰蜥VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a) AAV2的一部分VP1衣殼蛋白，其包含至少AAV2的VP1-u結構域，及(b)髭頰蜥的一部分VP3衣殼，其包含至少髭頰蜥之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/髭頰蜥VP1衣殼蛋白從N端至C端包含(a) AAV2之VP1-u結構域和VP1/VP2共有區的胺基酸序列，及(b)髭頰蜥之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/髭頰蜥VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
在一些具體例中，嵌合VP1衣殼蛋白可操作地連接至蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或包含點突變，例如使得衣殼蛋白的天然向性被降低至消除及/或使得衣殼蛋白包含可偵測標籤。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤，其包含c-myc (SEQ ID NO：44)。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含蛋白：蛋白結合對的第一成員，以及視情況形成共價鍵之第二成員。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對選自由以下組成之群：(a) SpyTag：SpyCatcher、(b) SpyTag：KTag、(c) Isopeptag：pilin C，(d) SnoopTag：SnoopCatcher和(e) SpyTag002：SpyCatcher002。在一些具體例中，嵌合VP1衣殼蛋白可包含(a) B1表位(SEQ ID NO：45)、(b) SpyTag，(c) SpyCatcher或(a)-(c)的任何組合。
在一些具體例中，嵌合靈長類/非靈長類動物VP1衣殼蛋白(例如，嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白、嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白、嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP1衣殼蛋白質等)包含蛋白：蛋白結合對的第一成員，其視情況經由第一或第二連接子可操作地連接至其。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在嵌合靈長類/非靈長類動物VP1衣殼蛋白之可變區(VR)或其部分中發現到的某個胺基酸位置處可操作地連接至嵌合靈長類/非靈長類動物VP1衣殼蛋白(例如，嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白、嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白、嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP1衣殼蛋白等)，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至嵌合靈長類/非靈長類VP1衣殼蛋白。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在嵌合靈長類/非靈長類動物VP1衣殼蛋白的VR I、VR II、VR III、VR IV、VR V、VR VI、VR VII、VR VIII，VR IX或HI環中發現到的某個胺基酸位置處可操作地連接至嵌合靈長類/非靈長類動物VP1衣殼蛋白的VP1衣殼，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至靈長類/非靈長類動物VP1衣殼蛋白。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員在嵌合靈長類/非靈長類VP1衣殼蛋白的VR VIII或VR IV中發現到的某個胺基酸位置處可操作地連接至嵌合靈長類/非靈長類VP1衣殼蛋白(例如，嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白、嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白、嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP1衣殼蛋白等)，視情況其中蛋白：蛋白結合對的第一成員經由第一及/或第二連接子連接至嵌合靈長類/非靈長類VP1衣殼蛋白。
在一些具體例中，嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員，其視情況經由第一及/或第二連接子在位置I444或I580處可操作地連接。在一些具體例中，嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子在位置I444處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子序列在位置I580處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員，其視情況經由第一及/或第二連接子可操作地連接在選自由以下組成之群的位置處：I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436，I437和I565；視情況在選自由以下組成之群的位置處：I429、I430、I431、I432、I433，I436和I437；視情況在I432處。在一些具體例中，嵌合AAV2 /海獅AAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子序列在位置I432可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子序列在位置I565處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子序列在位置I429處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子序列在位置I430處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一及第二連接子序列在位置I431處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子序列在位置I433處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子序列在位置I434處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子序列在位置I435處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子序列在位置I436處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子序列在位置I437處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子序列在位置I432處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/海獅AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：71 所示的胺基酸序列。
在一些具體例中，嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP1衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員，其視情況經由第一及/或第二連接子可操作地連接在位置I436或I573處。在一些具體例中，嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子序列在位置I436處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。在一些具體例中，嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP1衣殼蛋白包含視情況經由第一和第二連接子序列在位置I573處可操作地連接的SpyTag。在一些具體例中，嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP1衣殼蛋白包含如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
在一些具體例中，本發明的衣殼蛋白進一步包含蛋白：蛋白結合對的第一成員和第二成員，視情況其中第二成員可操作地連接至靶向配體，視情況其中靶向配體為結合部分。在一些具體例中，結合部分是抗體或其部分。在一些具體例中，抗體或其部分融合至第二成員(例如SpyCatcher)。在一些具體例中，抗體或其部分是在其C端處融合至連接子(視情況包含如SEQ ID NO：49 (GSGESG)所示的連接子)，而連接子在連接子C端處融合至第二成員(例如SpyCatcher)。
在一些具體例中，本發明的衣殼蛋白可以包含可偵測標籤，該可偵測標籤可以視情況充當蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或用於偵測及/或分離衣殼蛋白。在一些具體例中，可偵測標籤是c-myc。在一些具體例中，可偵測標籤包含AAV B1表位，例如胺基酸序列IGTRYLTR (SEQ ID NO：45)。
本發明的AAV衣殼蛋白可包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：(a)如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列、(b)如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列、(c)如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列、(d)如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列、(e)如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列、(f)如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列、(g)如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列、(h)如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列、(i)如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列、(j)如SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列、(k)如SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列、(l)如SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列、(m)如SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列、(n)如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列、(o)如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列、(p)如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列、(q)如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列、(r)如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列、(s)如SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列、(t)如SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列、(u)如SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列、(v)如SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列、(w)如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列、(x)如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列、(y)如SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列、(z)如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列、(aa)如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列、(bb)SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列、(cc)與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO： ：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：53、SE Q ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，以及(dd) (a)-(cc)中任一者所示胺基酸序列的任何VP2及/或VP3部分的胺基酸序列。
在一些具體例中，本發明的衣殼蛋白由本發明的核酸分子編碼。本發明亦提供編碼本發明之衣殼蛋白的核酸分子。
本文描述包含編碼AAV VP1衣殼蛋白，AAV VP2衣殼蛋白及/或AAV VP3衣殼蛋白之AAV cap基因的核酸分子，其中該AAV cap基因或其部分包含與非靈長類動物AAV或其部分，或遠親AAV或其部分之cap基因的核酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的核酸序列，且其中該AAV cap基因進一步被修飾成包含(a)編碼蛋白：蛋白結合對之第一成員的核苷酸序列、(b)編碼可偵測標籤的核苷酸序列、(c)點突變、(d)嵌合核苷酸序列，或(e) (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合。在一些核酸分子具體例中，核酸包含AAV rep基因和AAV cap基因，其中整個AAV cap基因包含與非靈長類動物AAV或遠親AAV之cap基因的核酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的第一核酸序列，且其中AAV rep基因或其部分包含與第二AAV或其部分之rep基因的核酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的第二核酸序列，其中非靈長類動物AAV與第二AAV不同。在一些具體例中，本發明的核酸分子包含編碼AAV衣殼蛋白的AAVcap 基因，其中該AAVcap 基因包含與選自由以下組成之群的cap 基因的至少一部分核苷酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的核苷酸序列：(i)非靈長類動物AAV的cap 基因、(ii)遠親AAV的cap 基因，或(iii)其組合，其中該AAVcap 基因進一步被修飾成包含(a)編碼蛋白：蛋白結合對之第一成員的核苷酸序列、(b)編碼可偵測標籤的核苷酸序列、(c)點突變、(d)嵌合核苷酸序列，其包含另一(例如第二) AAVcap 基因的一部分核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接至AAVcap 基因的該核苷酸序列，該AAVcap 基因選自由非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合的cap 基因體成之群，(e) (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合。
在一些具體例中，本發明的核酸分子包含編碼AAV衣殼蛋白的AAVcap 基因，其中該AAVcap 基因包含與非靈長類動物AAV之cap 基因的至少一部分核苷酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的核苷酸序列，其中該AAVcap 基因進一步被修飾成包含(a)編碼蛋白：蛋白結合對之第一成員的核苷酸序列、(b)編碼可偵測標籤的核苷酸序列、(c)點突變、(d)嵌合核苷酸序列，其包含另一(例如第二) AAVcap 基因的一部分核苷酸序列，其可操作地連接至非靈長類動物AAV之cap 基因的核苷酸序列，(e) (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合。
在一些具體例中，本發明的核酸分子包含編碼AAV衣殼蛋白的AAVcap 基因，其中該AAVcap 基因包含與遠親動物AAV之cap 基因的至少一部分核苷酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的核苷酸序列，其中該AAVcap 基因進一步被修飾成包含(a)編碼蛋白：蛋白結合對之第一成員的核苷酸序列、(b)編碼可偵測標籤的核苷酸序列、(c)點突變，(d)嵌合核苷酸序列，其包含另一AAVcap 基因之一部分核苷酸序列，其可操作地連接至遠親動物AAV之cap 基因的核苷酸序列，(e) (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合。
在一些具體例中，本發明的核酸分子包含AAVrep 基因和AAVcap 基因，其中AAVcap 基因包含與選自由以下組成之群的cap 基因的核苷酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的第一核苷酸序列：(i)非靈長類動物AAV的cap 基因、(ii)遠親靈長類AAV的cap 基因，及(iv)其組合，其中該AAVrep 基因包含另一(例如第二AAV)之AAVrep 基因的第二核苷酸序列。
在一些具體例中，本發明的核酸分子包含AAVrep 基因和AAVcap 基因，其中AAVcap 基因包含第一核苷酸序列，一個與非靈長類動物AAV之cap 基因的核苷酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的核苷酸序列，其中AAVrep 基因包含第二核苷酸序列，一個與另一(例如第二AAV)之AAVrep 基因的核苷酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的核苷酸序列。
在一些具體例中，本發明的核酸分子包含AAVrep 基因和AAVcap 基因，其中AAVcap 基因包含與遠親動物AAV之cap 基因的第一核苷酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的核苷酸序列，其中該AAVrep 基因包含與另一(例如第二AAV)之AAVrep 基因的第二核苷酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的核苷酸序列。
在本發明的一些核酸分子具體例中，包含與非靈長類動物AAV的核苷酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的核苷酸序列的cap 基因的核苷酸序列、與遠親AAV的核苷酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的cap 基因核苷酸序列或其組合被修飾成包含(a)編碼蛋白：蛋白結合對的至少第一成員的核苷酸序列、(b)編碼可偵測標籤的核苷酸序列，及/或(c)編碼點突變的核苷酸序列。
在一些核酸具體例中，蛋白：蛋白結合對選自SpyTag：SpyCatcher、SpyTag：KTag、Isopeptag：pilin-C，SnoopTag：SnoopCatcher和SpyTag002：SpyCatcher002。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤，例如，c-myc，其包含如SEQ ID NO：44所示的序列。
在一些核酸具體例中，非靈長類動物AAV之cap 基因的核苷酸序列、遠親AAV之cap 基因的核苷酸序列，或其組合，被修飾成包含B1表位，該B1表位包含胺基酸序列IGTRYLTR (SEQ ID NO：45)。
在本發明一些核酸分子具體例中，非靈長類動物AAV之cap 基因的核苷酸序列、遠親AAV之cap 基因的核苷酸序列或者其組合，包含：一個編碼VP3衣殼蛋白或其部分的核苷酸序列，其包含與非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白之胺基酸序列，及/或遠親AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列。在一些具體例中，非靈長類動物AAV之cap 基因的核苷酸序列、遠親AAV的cap 基因的核苷酸序列，或者其組合，包含：一個編碼VP2衣殼蛋白或其部分的核苷酸序列，其包含與非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白之胺基酸序列，及/或遠親AAV之VP2衣殼蛋白的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列。在一些具體例中，非靈長類動物AAV之cap 基因的核苷酸序列、遠親AAV的cap 基因的核苷酸序列，或者其組合，包含：一個編碼VP1衣殼蛋白或其部分的核苷酸序列，其包含與非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白之胺基酸序列，及/或遠親AAV之VP1衣殼蛋白的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列。
在一些具體例中，本發明的核酸分子包含編碼本發明之非靈長類動物VP3衣殼蛋白的核苷酸序列。在一些具體例中，本發明的核酸分子包含編碼本發明之非靈長類動物VP3衣殼蛋白和本發明之非靈長類動物VP2衣殼蛋白的核苷酸序列。在一些具體例中，本發明的核酸分子包含編碼本發明之非靈長類動物VP3衣殼蛋白，本發明之VP2衣殼蛋白和本發明之VP1衣殼蛋白的核苷酸序列。
在一些具體例中，本發明之核酸分子的cap 基因編碼(i) VP1衣殼蛋白，其為(a)嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP1衣殼蛋白包含VP1特有區(VP1-u)，其包含與可操作地連接至VP1/VP2共有區之另一(例如第二) AAV的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列；以及VP3區，其包含與非靈長類AAV或遠親AAV之胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列；或(b) VP1衣殼蛋白，其包含與非靈長類AAV或遠親AAV之VP1衣殼蛋白的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列，(ii) VP2衣殼，其為(a)嵌合AAV VP2衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP2衣殼蛋白包含VP1/VP2共有區，該VP1/VP2共有區包含與另一(例如第二) AAV的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列，其可操作地連接至包含與非靈長類AAV之胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列的VP3區，或(b) VP2衣殼蛋白，其包含與非靈長類AAV之VP2衣殼蛋白的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列，及/或(iii) VP3衣殼蛋白，其包含與非靈長類AAV或遠親AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列。
在一些具體例中，本發明之核酸分子的cap 基因編碼(i)嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP1衣殼蛋白包含VP1特有區(VP1-u)，其包含與可操作地連接至VP1/VP2共有區之另一(例如) AAV的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列；以及VP3區，其包含與非靈長類AAV或遠親AAV之胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列、(ii)嵌合AAV VP2衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP2衣殼蛋白包含VP1/VP2共有區，其包含與可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP3區的另一(例如) AAV的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列，及/或(iii) VP3衣殼蛋白，其包含與非靈長類AAV或遠親AAV之胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列。
在一些具體例中，本發明之核酸分子的cap 基因編碼(i)嵌合AAV VP1衣殼蛋白，情況其中嵌合VP1衣殼蛋白包含VP1特有區(VP1-u)，其包含與可操作地連接至VP1/VP2共有區之另一AAV的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列；以及VP3區，其包含與非靈長類AAV或遠親AAV之胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列、(ii)嵌合AAV VP2衣殼蛋白，其包含與非靈長類AAV或遠親AAV的胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列，及(iii) VP3衣殼蛋白，其包含與非靈長類AAV或遠親AAV之胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列。
在一些具體例中，本發明之核酸分子的cap 基因編碼(i) VP1衣殼蛋白，其包含與非靈長類AAV或遠親AAV之胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列、(ii) VP2衣殼蛋白，其包含與非靈長類AAV或遠親AAV之胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列，及/或(iii)VP3衣殼蛋白，其包含與非靈長類AAV或遠親AAV之胺基酸序列相同或具有顯著同一性(例如至少95%序列同一性)的胺基酸序列。
在本發明的一些核酸分子具體例中，另一第二AAV是靈長類AAV或靈長類AAV的組合。在一些具體例中，另一AAV選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12，AAV13及其組合。在一些具體例中，另一AAV是AAV2。
在本發明的一些核酸分子具體例中，非靈長類AAV是在表2中列出的非靈長類AAV。在一些具體例中，非靈長類AAV是禽類AAV (AAAV)，海獅AAV或髭頰蜥AAV。在一些具體例中，非靈長類AAV是AAAV，且視情況AAAV衣殼蛋白的核苷酸序列包含一個在AAAV之VP1衣殼蛋白的位置I444或I580處的修飾。在一些具體例中，非靈長類AAV是有鱗目AAV，例如髭頰蜥AAV，且視情況髭頰蜥AAV的核苷酸序列包括一個在髭頰蜥AAV之VP1衣殼蛋白的位置I573或I436處的修飾。在一些具體例中，非靈長類動物AAV是哺乳動物AAV，例如海獅AAV，且視情況海獅AAV的核苷酸序列包含一個在選自由海獅AAV之VP1衣殼蛋白的位置I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436，I437和A565處的修飾。
本發明的核酸分子具體例可包含選自由以下組成之群的核苷酸序列：(a)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、(b)如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列、(c)如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列、(d)如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列、(e)如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列、(f)如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列、(g)如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列、(h)如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列、(i)如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列、(j)如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列、(k)如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列、(l)如SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列、(m)如SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列、(n)如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列、(o)如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列、(p)如SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列、(q)如SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列、(r)如SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列、(s)如SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列、(t)如SEQ ID NO：54所示的核苷酸序列、(u)如SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列、(v)如SEQ ID NO：58所示的核苷酸序列、(w)如SEQ ID NO：60所示的核苷酸序列、(x)如SEQ ID NO：62所示的核苷酸序列、(y)如SEQ ID NO：64所示的核苷酸序列、(z)如SEQ ID NO：66所示的核苷酸序列、(aa)如SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列、(bb)如SEQ ID NO：70所示的核苷酸序列，(cc)與SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、52、54、56、58、60、62、64、66，68或70中所示的核苷酸序列具有至少95%同一性的核苷酸序列，(dd)編碼VP2衣殼蛋白及/或VP3衣殼蛋白之(a)-(cc)的核苷酸序列的任一部分。
在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列，其部分及簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列，其一分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：54所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：58所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：60所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：62所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：64所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：66所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。在一些具體例中，核酸分子包含編碼VP2及/或VP3衣殼蛋白之如SEQ ID NO：70所示的核苷酸序列，其部分及其簡併變體。
在一些具體例中，編碼本發明VP1衣殼蛋白和視情況本發明VP2及/或VP3衣殼蛋白的核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些具體例中，啟動子選自病毒啟動子、細菌啟動子、哺乳動物啟動子(例如人類或非人類)、禽類啟動子、魚類啟動子，昆蟲啟動子及其任何組合。在一些具體例中，啟動子選自p40、SV40、EF、CMV、B19p6和CAG。在一些具體例中，啟動子是AAV p40啟動子。在一些具體例中，其中啟動子指導衣殼蛋白在包裝細胞中的表現。
在一些具體例中，本發明之核酸分子的cap 基因包含可操作地連接至啟動子。在一些具體例中，啟動子指導衣殼蛋白在包裝細胞中的表現。在一些具體例中，啟動子選自p40、SV40、EF (例如EF1α CMV)、B19p6和CAG。
在一些具體例中，本發明的核酸分子進一步包含編碼一或多個AAV Rep蛋白的第二核苷酸序列，視情況其中該第二核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些具體例中，一或多個Rep蛋白是靈長類動物AAV Rep蛋白。在一些具體例中，一或多個Rep蛋白是非靈長類動物AAV Rep蛋白。在一些具體例中，一或多個Rep蛋白選自Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，視情況一或多個Rep蛋白包含Rep78。在一些具體例中，可操作地連接至編碼一或多個AAV Rep蛋白之第二核苷酸序列的啟動子選自病毒啟動子、細菌啟動子、哺乳動物啟動子(例如人類或非人類)、禽類啟動子、魚類啟動子，昆蟲啟動子及其任何組合。在一些具體例中，可操作地連接至編碼一或多個AAV Rep蛋白之第二核苷酸序列的啟動子選自p19、p5、p40、SV40、EF (例如EF1α CMV) 、B19p6和CAG。在一些具體例中，啟動子指導衣殼蛋白在包裝細胞中的表現。在一些具體例中，可操作地連接至編碼一或多個AAV Rep蛋白之第二核苷酸序列的啟動子選自p19及/或p5。
包含本發明核酸分子所編碼之衣殼蛋白的組合物和包裝細胞，以及本發明核酸分子所編碼之衣殼蛋也是本發明的一部分。也描述了由本發明的包裝細胞所表現的病毒顆粒。
在一些具體例中，用於產生本發明AAV病毒顆粒的組合物和包裝細胞包含本發明的核酸分子，例如，包含編碼本發明AAV衣殼蛋白之本發明的cap 基因。在一些具體例中，本發明的組合物及/或包裝細胞包含本發明的核酸分子。在一些具體例中，cap 基因包含編碼VP2衣殼的核苷酸序列，其選自由以下組成之群：如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：5所示的核苷酸、如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列、SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：54所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：58所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：60所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：62所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：64所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：66所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：70所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、52，54、56、58、60、62、64、66、68或70所示核苷酸序列的任何部分；編碼VP3衣殼之如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70所示之核苷酸序列的任何部分，及其任何組合。
在一些具體例中，組合物和包裝細胞進一步包含核酸分子，其包含編碼一或多個AAV Rep蛋白的rep 基因，其中該rep 基因可操作地連接至啟動子，視情況其中rep 基因和cap 基因為兩個不同的AAV。在一些具體例中，可操作地連接至rep 基因的啟動子指導Rep蛋白在包裝細胞中的表現，例如，該啟動子選自p5、p19 SV40、EF、CMV、B19p6和CAG。在一些具體例中，一或多個Rep蛋白選自Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，視情況一或多個Rep蛋白包含Rep78。在一些具體例中，一或多個Rep蛋白是靈長類動物AAV Rep蛋白。在一些其他具體例中，一或多個Rep蛋白是非靈長類動物AAV Rep蛋白。在一些具體例中，一或多個Rep蛋白包含兩者。
在一些具體例中，本發明的組合物和包裝細胞還包含核酸分子，其包含在至少一側側接至少一個AAV反向末端重複(ITR)序列之感興趣核苷酸的核苷酸序列，該ITR被一或多個Rep蛋白所識別。在一些具體例中，感興趣核苷酸在另一側側接與該至少一個ITR的AAV相同的第二ITR。在一些具體例中，感興趣核苷酸在另一側側接第二ITR，其中第二ITR與該至少一個ITR為不同的AAV。
在一些具體例中，本發明的組合物及/或包裝細胞進一步包含核酸分子，該核酸分子包含側接5'和3' AAV反向末端重複(ITR)序列的感興趣核苷酸(例如，轉基因的核苷酸序列)，以使感興趣的病毒顆粒進一步包含基因體，該基因體包含側接5'和3' AAV ITR的感興趣核苷酸。
在一些具體例中，本發明的組合物及/或包裝細胞還包含編碼參考衣殼蛋白的核苷酸序列。
因此，在一些具體例中，本發明的組合物，包裝細胞及/或病毒顆粒進一步包含基因體，其自5'至3'包含：5' ITR、感興趣核苷酸和3' ITR。在一些具體例中，基因體進一步包含可操作地連接至感興趣核苷​酸的啟動子。在一些具體例中，5'和3' ITR來自相同物種的AAV。在一些具體例中，5'和3' ITR來自兩個不同物種的AAV。
在一些具體例中，感興趣核苷酸是報導子基因。在一些具體例中，報導子基因編碼β-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白(GFP)、增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、MmGFP、藍色螢光蛋白(BFP)、增強型藍色螢光蛋白(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黃色螢光蛋白(YFP)、增強型黃色螢光蛋白(eYFP)、祖母綠、CyPet、青色螢光蛋白(CFP)、天藍、T-藍寶石、螢光素酶，鹼性磷酸酶或其組合。
在一些具體例中，感興趣核苷酸編碼治療性蛋白質、自殺基因、抗體或其片段、CRISPR/Cas系統或其部分、反義寡核苷酸、核酶、RNAi分子或shRNA。
本文描述一種製造本發明之AAV病毒顆粒的方法，該方法包含在足以產生病毒顆粒的條件下培養包裝細胞，該包裝細胞包含(1)至少一個編碼一或多個AAV Rep蛋白的核苷酸序列，例如rep 基因，及(2)編碼AAV VP1衣殼蛋白的第一核苷酸序列，視情況編碼AAV VP2衣殼蛋白的第二核苷酸序列，以及編碼非靈長類動物AAV VP3衣殼蛋白的第三核苷酸序列(例如，本發明的第一，第二和第三核苷酸分子)和視情況(3)側接第二AAV之第一及/或第二ITR的感興趣核苷酸，其中該一或多個AAV Rep蛋白識別第二AAV的第一及/或第二ITR的識別位點，其中該第三核苷酸序列編碼本發明的非靈長類動物AAV VP3衣殼蛋白，且視情況其中該第一核苷酸序列編碼本發明的AAV VP1衣殼蛋白及/或第二核苷酸序列編碼本發明的AAV VP2衣殼蛋白。在一些具體例中，本發明的單一cap 基因包含第一，第二和第三核苷酸序列。在一些具體例中，單一包裝質體包含編碼一或多個AAV Rep蛋白的至少一個核苷酸序列以及分別編碼非靈長類動物之AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白和AAV VP3衣殼蛋白的第一、第二和第三核苷酸的任何組合。
在一些具體例中，該方法包含培養本發明的包裝細胞。在一些具體例中，該方法包含培養包含本發明核酸分子的本發明包裝細胞，其中該包裝細胞視情況進一步包含輔助質體及/或包含感興趣核苷酸的轉移質體。
一些方法具體例進一步包含從培養物上清液及/或細胞溶解產物中分離自互補的腺相關病毒顆粒。一些方法具體例進一步包含裂解包裝細胞並從培養物上清液及/或細胞溶解產物中分離單股腺相關病毒顆粒。一些具體例還包含a.清除細胞碎片、b.用Benzonase或DNase I和MgCl2處理含有病毒顆粒的上清液、c.濃縮病毒顆粒、d.純化病毒顆粒，和e. a.-d.的任何組合。
在一些具體例中，拼合病毒顆粒是藉由轉染將呈特定比例的混合物轉染至包裝細胞中而產生，該混合物包括第一cap 基因，其編碼包含蛋白：蛋白結合對之第一成員的VP衣殼蛋白；以及至少一個參考cap 基因，其編碼參考VP衣殼蛋白。在一些具體例中，本發明的拼合病毒顆粒可以用經修飾cap 基因：參考cap 基因的混合物來生成。在一些具體例中，經修飾cap 基因編碼包含一個修飾(例如，蛋白：蛋白結合對的第一成員)的AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白中的至少一者，而參考cap 基因編碼除了該修飾外對應於經修飾AAV VP1，VP2和VP3衣殼蛋白中的至少一者的參考衣殼蛋白。在一些具體例中，經修飾cap 基因編碼VP 1衣殼蛋白，其經修飾帶有蛋白：蛋白結合對之第一成員；而參考cap 基因編碼缺乏該修飾的參考VP 1衣殼蛋白。在一些具體例中，經修飾cap 基因編碼VP2衣殼蛋白，其經修飾帶有蛋白：蛋白結合對之第一成員；而參考cap 基因編碼缺少該修飾的參考VP2衣殼蛋白。在一些具體例中，經修飾cap 基因編碼VP3衣殼蛋白，其經修飾帶有蛋白：蛋白結合對之第一成員；而參考cap 基因編碼缺少該修飾的參考VP3衣殼蛋白。
一般而言，如本文所述的病毒顆粒包含病毒衣殼，其包含如本文所述的病毒衣殼蛋白，包括拼合病毒衣殼，其中該病毒衣殼將感興趣的核苷酸包入衣殼。在一些具體例中，感興趣核苷酸受到選自病毒啟動子、細菌啟動子、哺乳動物啟動子、禽類啟動子、魚類啟動子，昆蟲啟動子及其任何組合組成之群的啟動子所控制。在一些具體例中，感興趣核苷酸受到非人類啟動子所控制。在一些具體例中，啟動子是巨細胞病毒(CMV)啟動子。在一些具體例中，啟動子是EF (例如EF1α)啟動子。在一些具體例中，啟動子是CAG啟動子。在一些具體例中，啟動子是泛素蛋白C (UbC)啟動子。
通常，感興趣核苷酸可以是一或多個基因，其可編碼可偵測標籤，例如報導子或治療性多肽。在一些具體例中，感興趣核苷酸是報導子基因。在一些具體例中，感興趣核苷酸是報導子基因，其編碼選自綠色螢光蛋白、螢光素酶，β-半乳糖苷酶等組成之群的可偵測標籤。在一些具體例中，可偵測標籤是綠色螢光蛋白。在其他具體例中，感興趣核苷酸選自由自殺基因、編碼抗體或其片段的核苷酸、編碼CRISPR/Cas系統或其部分的核苷酸、編碼反義RNA的核苷酸、編碼siRNA的核苷酸、分泌酶、編碼治療性蛋白質的基因等組成之群。在一個具體例中，感興趣核苷酸編碼一種多結構域治療劑，例如，包含至少兩個提供兩種不同功能之結構域的蛋白質。
本文所述的組合物通常包含病毒顆粒，其包含如本文所述的病毒衣殼蛋白，例如包含含有病毒衣殼蛋白(包括一個拼合衣殼)的衣殼，其中該衣殼將感興趣核苷酸包入衣殼。在一些具體例中，本文所述的組合物包含(1)具有包含本文所述的病毒衣殼蛋白的衣殼的病毒顆粒，及(2)醫藥上可接受的載劑。
本文還描述了使用病毒衣殼蛋白、包含其的病毒顆粒、組合物等的方法。在一些具體例中，該等方法包含使目標細胞(其可以在活體外(例如，離體)或在活體內(例如在人類體內))與病毒顆粒接觸，該病毒顆粒包含如本文所述的病毒衣殼蛋白，其中該病毒衣殼或病毒顆粒包含靶向配體，其特異性結合至表現在目標細胞表面上的蛋白質。
如本文所述的病毒顆粒特別適合於將感興趣核苷酸靶向引入特定細胞，因為本文所述的病毒衣殼蛋白(等)針對其同源第二成員包含蛋白：蛋白結合對的第一成員，其可操作地連接至到靶向配體。在一些具體例中，靶向配體視情況經由連接子可操作地連接至蛋白質(第二成員)，例如融合至蛋白質。在一些具體例中，靶向配體可以是結合部分，例如天然配體、抗體、多特異性結合分子等。在一些具體例中，靶向配體是抗體或其部分。在一些具體例中，靶向配體是包含結合目標細胞上的細胞表面蛋白之可變域和重鏈恆定域的抗體。在一些具體例中，靶向配體是包含結合目標細胞上之細胞表面蛋白的可變域和IgG重鏈恆定域的抗體。在一些具體例中，靶向配體是包含結合目標細胞上之細胞表面蛋白的可變域和IgG重鏈恆定域的抗體，其中IgG重鏈恆定域例如經由連接子可操作地連接至與第一成員形成異肽共價鍵的蛋白質(例如，蛋白：蛋白結合對的第二成員)。在一些具體例中，本文所述的衣殼蛋白包含第一成員，該第一成員包含可操作地連接至病毒衣殼蛋白的SpyTag並共價連接至SpyTag；第二成員，其包含SpyCatcher，連接至包含抗體可變域和IgG重鏈結構域的靶向配體，其中SpyCatcher和IgG重鏈結構域經由胺基酸連接子例如GSGESG (SEQ ID NO：49)而連接。在一些具體例中，第二成員包含如SEQ ID NO：47所示的序列，其包含人類IgG4重鏈的一部分，該IgG4部分具有經由連接子(SEQ ID NO：49)連接至SpyCatcher (SEQ ID NO：43)之如SEQ ID NO：51所示的序列。
通常，靶向配體特異地結合至表現於哺乳動物(例如人類)真核細胞(例如目標細胞)表面上的細胞表面分子，例如寡糖、受體、細胞表面標記等。
儘管近年來經由AAV基因療法靶向特定細胞的重組方法已經得到增進，但是現有重組方法仍難以用於發展出能避開推測在生命早期生成的預先存在的抗體偵測及/或中和的AAV。本文描述一種利用下列來產生可用於定向基因療法(例如，將感興趣核苷酸引入感興趣特定細胞)之AAV病毒顆粒的方法：(1)非靈長類動物AAV或遠親AAV感染靈長類細胞的天然能力、(2)人類體內缺少對非靈長類動物AAV衣殼蛋白的NAb，以及若需要或必須(3)將蛋白：蛋白結合對之第一成員改造工程化至AAV衣殼蛋白中。本文描述一種核苷酸分子，其包含至少一種根據其所需功能而利用的AAVcap 基因。本發明的核苷酸分子包含來自非靈長類棟及/或遠親AAV之cap 基因或其部分(用於生產不容易被預先存在的Nab所識別的病毒衣殼)。非靈長類AAV之cap 基因或其部分被修飾成帶有蛋白：蛋白結合對之第一成員，包含靶向配體的第二成員可結合至第一成員並指導所得的AAV病毒顆粒的向性。
對於那些不能感染靈長類細胞的非靈長類動物AAV或遠親AAV來說，可以將cap 基因設計成編碼至少靈長類AAV VP1衣殼蛋白之磷脂酶A2 (PLA2 )結構域以及至少非人類靈長類AAV或遠親AAV之VP3衣殼蛋白的嵌合cap 基因。PLA2 結構域由VP1衣殼蛋白(更具體是VP1衣殼的VP1特有(VP1-u)區)所攜帶，並且在透過媒介病毒基因體從胞內體/溶小體轉移至細胞核以啟動複製的AAV感染期間被認為是重要的(Zadori et al., 2001, Dev Cell, 1(2):291-302)。VP3衣殼蛋白是AAV病毒顆粒的主要表面衣殼蛋白，且因此包含非靈長類動物AAV或遠親AAV之至少一部分VP3衣殼蛋白的病毒衣殼不容易被Nab所識別，該等Nab是在用靈長類AAV感染過程中，從靈長類中分離出對抗AAV血清病毒產生者。
圖1中提供了包含靈長類AAV之rep 基因和嵌合cap 基因的核酸分子的非限制性說明。對於那些能夠感染靈長類細胞的非靈長類人類AAV遠親AAV來說，靈長類AAV的rep 基因如本文所述可操作地連接至嵌合cap 基因或非靈長類AAV的cap 基因。本文的實例證明，在具有輔助質體以及感興趣核苷酸之靈長類AAV基因體的包裝細胞株中表現時，這樣一個核酸分子能夠編碼適當的複製蛋白和衣殼蛋白，它們分別發揮複製和包入衣殼的功能，在活體內將靈長類AAV基因體包入能夠感染細胞的病毒顆粒中。此外，這些實例證明，經由使用蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員，可以容易地改造這種AAV病毒顆粒的向性，且此外，插入蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員並不會增加被對抗靈長類AAV感染所產生之Nab識別的可能性。因此，本文提供了經遺傳修飾的病毒顆粒、包含其的組合物以及其製備和使用的方法。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技藝中習於技藝者通常所理解的相同含義。
除非上下文另有明確指示，否則單數形式「一」和「該」包括複數個引用對象。因此，例如，提到「一種方法」包括一或多種本文所述類型的方法及/或步驟，及/或對於那些習於技藝者而言，在閱讀本揭示內容後將變得顯而易見者。
在蛋白質或其一部分的全長上，可以容易地確定胺基酸或核苷酸序列的「同一性百分比」或類似者。一部分的長度可以分別是至少約5個胺基酸或24個核苷酸，且分別可以是至多約700個胺基酸或2100個核苷酸。通常，當提到兩種不同腺相關病毒之間的「同一性」，「同源性」或「相似性」時，參照「比對」序列來決定「同一性」，「同源性」或「相似性」。「比對」序列或「比對」是指多個核酸序列或蛋白質(胺基酸)序列，與參考序列相比時，通常含有缺失或額外鹼基或胺基酸的校正。
比對可以使用多種公開或商用的多重序列比對程式中的任何一種來進行。序列比對程式可用於胺基酸序列，例如「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」，「MEME」和「Match-Box」程式。通常，儘管習於技藝者可以根據需要更改這些設定，但是這些程式中的任何一個都以預設設定來使用。或者，習於技藝者可以利用另一種演算法或電腦程式，該演算法或電腦程式至少提供與所引用的算法和程式所提供的同一性或比對水平。參見，例如J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999)。
多重序列比對程式也可用於核酸序列。此類程式的實例包括「Clustal W」、「CAP Sequence Assembly」，「MAP」和「MEME」，這些程式可透過網際網路上的Web伺服器進入。這種程式的其他來源是習於技藝者熟知的。或者，也可以使用Vector NTI設備。本領域中還已知許多可用於測量核苷酸序列同一性的演算法，包括上述程式中所包含的那些。作為另一個實例，可以使用FASTATM (GCG第6.1版中的程式)比較多核苷酸序列。FastaTM 提供查詢序列和搜尋序列之間最佳重疊區域的比對和序列同一性百分比。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可以使用FASTATM 及其預設參數(字長為6以及評分矩陣的NOPAM因子)來決定，如GCG第6.1版中所提供，其以引用的方式併入本文。
「顯著同一性」含括至少90% (例如至少93%、例如至少95%、例如至少96%、例如至少97%、例如至少98%、例如至少99%，或例如至少100%相同)的胺基酸或核酸序列比對。
術語「嵌合」含括分別包含來自至少兩種不同生物體的核酸序列或胺基酸序列的功能基因或多肽，例如，至少第一和第二AAV的基因或多肽的一部分，其中至少第一和第二部分可操作地連接。除非被指明為嵌合，否則核苷酸序列、基因，多肽和胺基酸被認為是非嵌合的，例如，包含僅只單一個生物體(例如單一個AAV)的核酸序列或胺基酸序列。
術語「抗體」包括免疫球蛋白分子，其包含四條多肽鏈，藉由雙硫鍵交互連結的兩條重(H)鏈以及兩條輕(L)鏈。每條重鏈含有一個重鏈可變域(VH )以及一個重鏈恆定區(CH )。重鏈恆定區包含至少三個結構域CH 1、CH 2、CH 3，以及視情況CH 4。每條輕鏈包含一個輕鏈可變域(CH )以及一個輕鏈恆定區(CL )。重鏈與輕鏈可變域可進一步分成具有超變異性的區域(命名為互補決定區(CDR))，其間散佈有較為守恆的區域(命名為骨架區(FR))。每條重鏈與輕鏈可變域包含三個CDR以及四個FR，按下列順序從胺基端往羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4 (重鏈CDR可縮寫為HCDR1、HCDR2與HCDR3；輕鏈CDR可縮寫為LCDR1，LCDR2與LCDR3)。典型四聚體抗體結構包括兩個相同的抗原結合結構域，其中每一者是藉由VH 和VL 結構域締合所形成，並且其中每一者與對應CH 和CL 結構域形成抗體Fv區。單結構域抗體包含單一抗原-結合結構域，例如VH 或VL 。抗體的抗原結合結構域(例如，識別並結合至抗原之特異性結合對的第一成員的抗體的一部分)也稱為「互補位」。它是抗體Fv區的一個小區域(具有5至10個胺基酸)，是片段抗原結合(Fab區)的一部分，並且可能包含抗體重鏈及/或輕鏈的一部分。當互補位以高親和力結合特異性結合對的第一成員時，互補位特異地結合特異性結合對的第一成員。術語「高親和力」抗體是指相對於其特異性結合對的目標第一成員具有約10-9 M或更低(例如約1 x 10-9 M、1 x 1010 M，1 x 10-11 M或大約1 x 10-12 M)的KD 。在一個具體例中，藉由表面電漿共振(例如BIACORETM )來測量KD ；在另一個具體例中，藉由ELISA來測量KD 。
片語「互補決定區」或術語「CDR」包括由生物體免疫球蛋白基因的核酸序列所編碼的胺基酸序列，其通常(即，在野生型動物中)出現於免疫球蛋白分子(例如，抗體或T細胞受體)的輕鏈或重鏈可變區中的兩個骨架區之間。CDR可以由例如生殖系序列或重排或未重排序列所編碼，且例如由幼稚或成熟的B細胞或T細胞所編碼。CDR可以進行體細胞突變(例如，與動物生殖系中所編碼的序列有所不同)，人類化及/或經胺基酸取代，添加或缺失來進行修飾。在一些情況下(例如，對於CDR3來說)，CDR可以由兩個或更多個(例如生殖系序列)不連續(例如，在未重排的核酸序列中)但在B細胞核酸序列中連續的序列(例如，生殖系序列)所編碼，例如，由於剪接或連接序列的結果(例如，VDJ重組以形成重鏈CDR3)。
片語「輕鏈」包括來自任何生物體的免疫球蛋白輕鏈序列，且除非另有指明，否則包括人類κ和λ輕鏈與一個的VpreB，以及替代輕鏈。除非另有指明，否則輕鏈可變域通常包括三個輕鏈CDR和四個骨架(FR)區。通常，全長輕鏈從胺基端到羧基端包括可變域和輕鏈恆定區，該可變域包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。輕鏈可變域由一個輕鏈可變區基因序列所編碼，其通常包含VL 和JL 段，從存在於生殖系中的全本V段和J段衍生而來。可以在IMGT數據庫www.imgt.org中找到各種生物體的V和J輕鏈段的序列，位置和命名。輕鏈包括例如那些在它們出現時未選擇地結合至被特異性結合對-結合蛋白之第一成員選擇地結合的特異性結合的第一或第二個第一成員。輕鏈還包括那些結合並識別，或幫助重鏈或另一條輕鏈結合與識別被它們出現之特異性結合對-結合蛋白的第一成員選擇地結合的特異性結合對的一或多個第一成員者。共用或通用的輕鏈包括衍生自人類Vκ1-39Jκ基因或人類Vκ3-20Jκ基因者，並且包括其體細胞突變(例如，親和力成熟)的形式。例示性人類VL 段包括人類Vκ1-39基因段、人類Vκ3-20基因段、人類Vλ1-40基因段、人類Vλ1-44基因段、人類Vλ2-8基因段、人類Vλ2-14基因段，和人類Vλ3-21基因段，並且包括其體細胞突變(例如，親和力成熟)的形式。可以製造出輕鏈，其包含來自一種生物體(例如人類或囓齒動物，例如大鼠或小鼠；或鳥類，例如雞)的可變域以及來自相同或不同生物體(例如人類或囓齒動物，例如大鼠或小鼠；或鳥類，例如雞)的恆定區。
術語「大約」或「約」包括在值的統計上有意義的範圍內。該範圍可以在給定值或範圍的一個數量級內，較佳在50%以內，更佳在20%以內，又更佳在10%以內，甚至更佳在5%以內。術語「大約」或「約」所含括的可容許變異取決於所研究的特定系統，且可為習於技藝者容易地理解。
片語「重鏈」或「免疫球蛋白重鏈」包括來自任何生物體的免疫球蛋白重鏈序列，包括免疫球蛋白重鏈恆定區序列。除非另有指明，否則重鏈可變域包括三個重鏈CDR和四個FR區。重鏈的片段包括CDR，CDR和FR及其組合。典型重鏈具有下列可變域(從N端到C端)、CH 1結構域、鉸鏈，CH 2結構域和CH 3結構域。重鏈的功能性片段包括能夠特異地識別特異性結合對之第一成員的片段(例如，以微莫耳、奈莫耳或皮莫耳的KD 識別特異性結合對的第一成員)(能夠表現並從細胞分泌)，並且包含至少一個CDR。重鏈可變域由可變區核苷酸序列所編碼，其通常包括從存在於生殖系之VH ，DH 和JH 段全本衍生而來的VH ，DH 和JH 段。可以在IMGT數據庫中找到各種生物體的V，D和J重鏈段的序列，位置和命名，該數據庫可經由全球資訊網(www)上的網際網路在URL 「imgt.org」進入。
術語「僅重鏈抗體」，「僅有重鏈的抗原結合蛋白」、「單結構域抗原結合蛋白」，「單結構域結合蛋白」或類似者是指包含免疫球蛋白樣鏈的單體或同二聚體免疫球蛋白分子，其包含可操作地連接至重鏈恆定區的可變域，該可變域不能與輕鏈締合，因為重鏈恆定區通常缺乏功能性CH 1結構域。因此，術語「僅重鏈抗體」，「僅重鏈抗原結合蛋白」、「單結構域抗原結合蛋白」，「單結構域結合蛋白」或類似者涵蓋了(i)單體單結構域抗原結合蛋白，包含免疫球蛋白樣鏈之一者，其包含可變域可操作地連接至缺乏功能性CH 1結構域的重鏈恆定區，或(ii)同二聚體單結構域抗原結合蛋白，包含兩個免疫球蛋白樣鏈，其中每一者包含可變域可操作地連接至缺乏功能性CH 1結構域之重鏈恆定區。在不同態樣中，同二聚體單結構域抗原結合蛋白包含兩個相同的免疫球蛋白樣鏈，其中每一者包含相同的可變域可操作地連接至缺乏功能性CH 1結構域之相同重鏈恆定區。此外，單結構域抗原結合蛋白的每條免疫球蛋白樣鏈包含可變域，其可以由重鏈可變區基因段(例如VH 、DH 、JH )，輕鏈基因段(例如VL 、JL )或其組合衍生而來，連接至重鏈恆定區基因(例如IgG、IgA、IgE，IgD或其組合)之重鏈恆定區(CH )基因序列(在CH 1編碼序列包含缺失或不活化突變)(與可選鉸鏈區)或其組合。包含衍生自重鏈基因段的可變域的單結構域抗原結合蛋白可以被稱為「VH -單結構域抗體」或「VH -單結構域抗原結合蛋白」，參見例如，美國專利第8754287號；美國專利公開案第20140289876號；第20150197553號；第20150197554號；第20150197555號；第20150196015號；第20150197556號和第20150197557號，其中每一者以全文引用的方式併入。包含衍生自輕鏈基因段的可變域的單結構域抗原結合蛋白可以被稱為或「VL -單結構域抗原結合蛋白」，參見例如，美國公開案第20150289489號，以全文引用的方式併入。
片語「輕鏈」包括來自任何生物體的免疫球蛋白輕鏈序列，且除非另有指明，否則包括人類κ和λ輕鏈與一個的VpreB，以及替代輕鏈。除非另有指明，否則輕鏈可變域通常包括三個輕鏈CDR和四個骨架(FR)區。通常，全長輕鏈從胺基端到羧基端包括可變域和輕鏈恆定區胺基酸序列，該可變域包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。輕鏈可變域由一個輕鏈可變區核苷酸序列所編碼，其通常包含輕鏈VL 和輕鏈JL 基因段，從存在於生殖系中的V和J基因段全本衍生而來。於IMGT數據庫中找到各種生物體的輕鏈V和J基因段的序列，位置和命名，其可經由網際網路在全球資訊網(www)在URL 「imgt.org」進入。輕鏈包括例如那些在它們出現時未選擇地結合至被特異性結合對-結合蛋白之第一成員選擇地結合的特異性結合的第一或第二個第一成員。輕鏈還包括那些結合並識別，或幫助重鏈在它們出現時結合並識別被特異性結合對-結合蛋白之第一成員結合之特異性結合對的一或多個第一成員者。輕鏈還包括那些結合並識別，或幫助重鏈在它們出現時結合並識別被特異性結合對-結合蛋白之第一成員結合之特異性結合對的一或多個第一成員者。共用或通用的輕鏈包括衍生自人類Vκ1-39Jκ5基因或人類Vκ3-20Jκ1基因者，並且包括其體細胞突變(例如，親和力成熟)的形式。
如本文所用，片語「可操作地連接」包括組分或要素彼此直接或間接交互作用或以其他方式相互協調以物理並置(例如，在三維空間中)的方式參與生物事件，其中並置實現或允許這種交互作用及/或協調發生。僅舉一個實例，當核酸中的控制序列(例如，表現控制序列)相對於編碼序列以其存在或不存在會影響到編碼序列的表現及/或活性時，被稱為「可操作地連接至」編碼序列。在許多具體例中，「可操作的連接」涉及相關組分或要素彼此共價鍵結。那些習於技藝者將容易理解，在一些具體例中，不需要共價鍵結來實現有效的可操作的連接。例如，在一些具體例中，與其所控制之編碼序列可操作地連接的核酸控制序列與感興趣核苷酸為連續的。或者或另外，在一些具體例中，一或多個這樣的控制序列反式作用或在相距一段距離處控制感興趣編碼序列。在一些具體例中，如本文所用術語「表現控制序列」是指對它們所接合之編碼序列的表現和加工是必需及/或充分的多核苷酸序列。在一些具體例中，表現控制序列可以是或包含合適的轉錄起始、終止，啟動子及/或增強子序列；有效的RNA加工信號，諸如剪接和聚腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA的序列；提高轉譯效率的序列(例如，Kozak共有序列)；提高蛋白質穩定性的序列；及/或在一些具體例中，增強蛋白質分泌的序列。在一些具體例中，一或多個控制序列在特定宿主細胞或生物體或其類型中優先地或專一地具有活性。僅舉一個實例，在原核生物中，控制序列通常包括啟動子，核醣體結合位點和轉錄終止序列；在真核生物中，在許多具體例中，控制序列通常包括啟動子，增強子及/或轉錄終止序列。那些習於技藝者從上下文中將會理解到，在許多具體例中，術語「控制序列」是指其存在對於表現和加工來說必不可少的組分，並且在一些具體例中包括其存在對表現有利的組分(包括，例如前導序列，靶向序列及/或融合伴侶序列)。
「重靶向」或「重定向」可包括以下情形：其中野生型顆粒靶向生物體內組織及/或多個器官中的數個細胞，並且藉由插入異源性胺基酸降低或消除了組織或器官的普遍靶向，而重靶向生物體內組織或特定器官中的更多特定細胞是利用結合該特定細胞所表現的標記的靶向配體(例如，經由靶向配體)來實現。這樣的重靶向或重定向還可以包括這樣的情況，其中野生型顆粒靶向組織，並且藉由插入異源性胺基酸將組織的靶向減少或消除，且使用靶向配體實現了向完全不同組織的重靶向。
「特異性結合對」，「蛋白：蛋白結合對」及類似者包括交互作用的兩個蛋白質(例如，第一成員(例如，第一多肽)和第二同源成員(例如，第二多肽))，其在允許或促進鍵形成的條件下形成鍵(例如，第一成員表位和識別該表位之抗體的第二成員抗原結合部分之間的非共價鍵)或共價異肽鍵。在一些具體例中，術語「同源」是指一起發揮作用的組分。表位及其同源抗體，特別是還可以充當可偵測標籤(例如，c-myc)的表位是本技藝所周知的。在Veggiani et al. (2014)Trends Biotechnol. 32:506中綜述了能夠交互作用形成共價異肽鍵的特定蛋白：蛋白結合對，並且包括肽：肽結合對，諸如SpyTag：SpyCatcher、SpyTag002：SpyCatcher002；SpyTag：KTag；isopeptag：pilin C；SnoopTag：SnoopCatcher等。通常，蛋白：蛋白結合對的第一成員是指蛋白：蛋白結合對的成員，其長度通常少於30個胺基酸，且其與第二同源蛋白形成共價異肽鍵，其中第二同源蛋白通常較大，但諸如在SpyTag：KTag系統中，其長度也可以少於30個胺基酸。
術語「異肽鍵」是指羧基或羧醯胺基團和胺基之間的醯胺鍵，其中至少一者不是衍生自蛋白質主鏈或可選地不是蛋白質主鏈的一部分。異肽鍵可以在單一蛋白質內形成，也可以出現在兩個肽或一個肽與蛋白質之間。因此，異肽鍵可以在單個蛋白質內在分子內形成，或在分子間(即在兩個肽/蛋白質分子之間，例如在兩個肽連接子之間)形成。通常，異肽鍵可以出現在離胺酸殘基與天冬醯胺酸、天冬胺酸，麩醯胺酸或麩胺酸殘基或蛋白質或肽鏈的末端羧基之間，或者可以發生在蛋白質或肽鏈的α-胺基端與天冬醯胺酸、天冬胺酸，麩醯胺酸或麩胺酸之間。涉及異肽鍵的該對的每個殘基在本文中稱為反應性殘基。在本發明的較佳具體例中，在離胺酸殘基和天冬醯胺酸殘基之間或在離胺酸殘基和天冬胺酸殘基之間可以形成異肽鍵。特別地，異肽鍵可發生在離胺酸的側鏈胺與天冬醯胺酸的羧醯胺基或天冬胺酸的羧基之間。
SpyTag：SpyCatcher系統描述於美國專利第9,547,003號和Zaveri et al. (2012)PNAS 109:E690-E697中，其各自以全文引用的方式併入本文，而且是衍生自釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes )纖網蛋白結合蛋白FbaB的CnaB2結構域。藉由切割結構域，Zakeri等人得到一個具有序列AHIVMVDAYKPTK (SEQ ID NO:42)的肽「SpyTag」，其與它的同源蛋白「SpyCatcher」形成一個醯胺鍵，SpyCatcher是一個具有如SEQ ID NO：43中所示胺基酸序列的112個胺基酸多肽。 (Zakeri (2012)，上文)。衍生自CnaB2結構域的其他特異性結合對是SpyTag：KTag，它在SpyLigase存在下形成一個異肽鍵。(Fierer (2014)PNAS 111:E1176-1181)藉由從含有反應性離胺酸的SpyCatcher切除β鏈來改造SpyLigase，產生KTag，這是10個殘基的蛋白：蛋白結合對的第一成員，具有胺基酸序列ATHIKFSKRD (SEQ ID NO:72)。SpyTag002：SpyCatcher002系統描述於Keeble et al (2017)Angew Chem Int Ed Engl 56:16521-25中，其以全文引用的方式併入本文。SpyTag002具有胺基酸序列VPTIVMVDAYKRYK，如SEQ ID NO：73所示，並結合SpyCatcher002。
在Veggiani (2016)PNAS 113:1202-07中描述了SnoopTag：SnoopCatcher系統。RrgA的D4 Ig樣結構域(肺炎鏈球菌的黏附物)被切割而形成SnoopTag (殘基734-745)和SnoopCatcher (殘基749-860)。SnoopTag和SnoopCatcher的培育會導致互補蛋白之間具有特異性的自發異肽鍵。Veggiani (2016)，上文。
isopeptag：pilin-C特異性結合對衍生自釀膿鏈球菌的主要菌毛蛋白Spy0128。(Zakeir and Howarth (2010)J. Am. Chem. Soc. 132:4526-27)。isopeptag具有胺基酸序列TDKDMTITFTNKKDAE，如SEQ ID NO：75所示，並結合菌毛蛋白-C (Spy0128的殘基18-299)。SnoopTag和SnoopCatcher的培育會導致互補蛋白之間具有特異性的自發異肽鍵。Zakeir and Howarth (2010)，上文。
術語「可偵測標籤」包括多肽序列，該多肽序列是特異性結合對的一個成員，例如，其經由非共價鍵以高親和力特異地結合另一個多肽序列(例如抗體互補位)。例示性且非限制性的可偵測標籤包括六組胺酸標籤、FLAG標籤、Strep II標籤、鏈抗生物素蛋白結合肽(SBP)標籤、鈣調蛋白結合肽(CBP)、麩胺硫S-轉移酶(GST)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、S標籤，HA標籤和c-myc (SEQ ID NO：44)。(在Zhao et al. (2013) J. Analytical Meth. Chem. 1-8中綜述；以引用的方式併入本文)。靈長類AAV的常見可偵測標籤是B1表位 (SEQ ID NO：45)。天然不包含B1表位的本發明非靈長類AAV衣殼蛋白可在本文中被修飾成包含B1表位。通常，非靈長類AAV衣殼蛋白可包含與衣殼蛋白的最後10個胺基酸內的B1表位具有實質同源性的序列。因此，在一些具體例中，本發明的非靈長類AAV衣殼蛋白可以在衣殼蛋白的最後10個胺基酸內被修飾為帶有一個但少於五個點突變，使得AAV衣殼蛋白包含B1表位。
術語「目標細胞」包括其中需要表現感興趣核苷酸的任何細胞。較佳地，目標細胞在其表面上表現出受體，其使細胞可以用靶向配體所靶向，如下所述。
術語「轉導」或「感染」或類似者是指藉由病毒顆粒將核酸引入至目標細胞細胞核。與轉導或類似者有關的術語效率，例如「轉導效率」是指在與一定數量之包含感興趣核苷酸的病毒顆粒一起培育後，表現感興趣核苷酸之細胞的部分(例如百分比)。確定轉導效率的已知方法包括經螢光報導子基因轉導之細胞的流式細胞術，用於表現感興趣核苷酸的RT-PCR等。
通常，「參考」病毒衣殼蛋白/衣殼/顆粒與測試病毒衣殼蛋白/衣殼/顆粒相同，但是效用要被測試的變化不同。例如，為了確定將特異性結合對的第一成員插入測試病毒顆粒中(例如對轉導效率)的效用，測試病毒顆粒的轉導效率(不存在或存在適當的靶向配體)可以與在每種情況下均與測試病毒顆粒相同(例如，其他點突變、感興趣核苷酸，病毒顆粒數目和目標細胞等)，但不存在特異性結合對之第一成員的參考病毒顆粒(在必要的情況下不存在或存在適當的靶向配體)的轉導效率進行比較。在一些具體例中，參考病毒衣殼蛋白是能夠與第二病毒衣殼蛋白形成衣殼者，該第二病毒衣殼蛋白被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，其中參考病毒衣殼蛋白不包含蛋白：蛋白結合對的第一成員，較佳其中參考病毒衣殼蛋白和經修飾病毒衣殼蛋白形成的衣殼是拼合衣殼。
腺相關病毒(AAV)
「AAV」是腺相關病毒的縮寫，並且可以被用於指代病毒本身或其衍生物。AAV是小型，無包膜的單股DNA病毒。通常，野生型AAV基因體為4.7 kb，其特徵在於兩個反向末端重複(ITR)序列和兩個開放閱讀框(ORF)，rep 和cap 。野生型rep 閱讀框編碼四個分子量為78 kD (「Rep78」)、68 kD (「Rep68」)，52 kD (「Rep52」)和40 kD (「Rep40」)的蛋白質。Rep78和Rep68由p5啟動子轉錄，而Rep52和Rep40由p19啟動子轉錄。這些蛋白質主要功能在調節AAV基因體的轉錄和複製。野生型cap 閱讀框編碼三個分子量為83-85 KD (VP1)，72-73 KD (VP2)和61-62 KD (VP3)的結構(衣殼)病毒蛋白(VP)。AAV病毒粒子(衣殼)中超過80%的總蛋白包含VP3；在成熟病毒粒子中，VP1、VP2和VP3的相對豐度為大約1：1：10，儘管據報導比例為1：1：8。Padron et al. (2005) J. Virology 79:5047-58。
各種AAV血清型的基因體序列，以及天然反向末端重複序列(ITR)，Rep蛋白和衣殼次單位的序列是本技藝中已知的。這樣的序列可以在文獻中或在諸如GenBank的公共數據庫中找到。參見例如GenBank登錄號NC_002077 (AAV1)、AF063497 (AAV1)、NC001401 (AAV-2)、AF043303 (AAV2)、NC_001729 (AAV3)、NC_001829 (AAV4)、U89790 (AAV4)、NC_006152 (AAV5)、AF513851 (AAV7)，AF513852 (AAV8)與NC_006261 (AAV8)；其揭示內容以引用的方式併入本文以供教示AAV核酸和胺基酸序列。還參見，例如Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555；Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823；Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309；Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939；Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994；Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208；Shade et al.,(1986) J. Virol. 58:921；Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854；Moris et al. (2004) Virology 33:375-383；美國專利公開案20170130245；國際專利公開案WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；以及美國專利第6,156,303號，其每一者以全文引用的方式併入。本文表2提供了各種非靈長類AAV的序列。
除非另有要求，否則「AAV」含括所有亞型以及天然存在的和經修飾的形式。AAV包括靈長類AAV (例如第1型AAV (AAV1)、第2型靈長類AAV (AAV2)、第3型靈長類AAV (AAV3)、第4型靈長類AAV (AAV4)、第5型靈長類AAV (AAV5)、第6型靈長類AAV (AAV6)，第7型靈長類AAV (AAV7)、第8型靈長類AAV (AAV8))，非靈長類動物AAV (例如，禽類AAV (AAAV))和其它非靈長類動物AAV，諸如哺乳動物AAV (例如，蝙蝠AAV、海獅AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV，山羊AAV和綿羊AAV等)、有鱗目AAV (例如，蛇AAV、髭頰蜥AAV)等，以及遠親AAV等。「靈長類AAV」指通常由靈長類分離而來的AAV。類似地，「非靈長類AAV」是指由非靈長類分離而來的AAV。「遠親AAV」如本文所用含括： 從靈長類或非靈長類動物分離而來之AAV，通常與一般人類群體的接觸有限， 從靈長類動物分離而來的AAV (例如靈長類AAV)，包括野生型VP1衣殼蛋白，其包含與下列中的每一者具有少於99% (例如小於95%、例如小於90%、例如少於85%)胺基酸序列同一性的胺基酸序列：AAV1的VP1衣殼蛋白、AAV2的VP1衣殼蛋白、AAV3的VP1衣殼蛋白、AAV4的VP1衣殼蛋白、AAV5的VP1衣殼蛋白、AAV6的VP1衣殼蛋白、AAV7的VP1衣殼蛋白、AAV8的VP1衣殼蛋白、AAV9的VP1衣殼蛋白、AAV10的VP1衣殼蛋白、AAV11的VP1衣殼蛋白、AAV12的VP1衣殼蛋白，和AAV13的VP1衣殼蛋白，及/或 從非靈長類動物分離而來的AAV (例如非靈長類動物AAV)，其包含野生型衣殼蛋白，其包含與表2中列出的每一個AAV具有小於99% (例如少於95%、例如少於90%、例如少於85%)胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
可以使用已知方法來評估血清陽性。例如，可以藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或其他基於免疫的已知分析來進行IgG的不存在的存在。為了偵測中和抗體，可以進行中和分析，其中將AAV顆粒與數量遞增(連續稀釋)之(i)特定受試者的血清或多個受試者的混合血清或(ii)由個別樣品或匯集血清樣品(例如來自數十或數百名捐贈者，代表特定群體的免疫球蛋白剖面)製備的經純化免疫球蛋白(IVIG或IgG)一起培育，然後偵測細胞感染(例如藉由追蹤報導子基因表現(例如，螢光素酶基因，GFP等)。然後將感染水平與未暴露於血清/IVIG/IgG的對照樣品中的水平進行比較。參見例如實例8。中和效價可以定義為與對照相比，例如IVIG/IgG的濃度或血清的最高稀釋係數，其導致報導子基因表現的抑制為50%或更大。在一個具體例中，其中與對照相比觀察到的受感染細胞數量減少超過70%的血清稀釋度被認為是中和活性陽性。可使用例如免疫墨點分析來研究與特定已知中和抗體的交互作用。
如本文所用，和基因(例如rep 、cap 等)有關之「[指定] AAV的…」，衣殼蛋白(例如，VP1衣殼蛋白、VP2衣殼蛋白、VP3衣殼蛋白等)、指定AAV之衣殼蛋白的區域(例如，PLA2 區、VP1-U區、VP1/VP2共有區、VP3區)、核苷酸序列(例如，ITR序列)，例如cap 基因或AAV2的衣殼蛋白等，含括除分別包含本文所示指定AAV的核酸序列或胺基酸序列的基因或多肽以外，也包括基因或多肽的變體，包括含有保留一或多個生物功能所必需之最少數量的核苷酸或胺基酸的變體。如本文所用，變體基因或變體多肽包含與指定AAV的基因或多肽在本文中所示的核酸序列或胺基酸序列有所不同的核酸序列或胺基酸序列，其中差異通常不會改變基因或多肽的至少一個生物學功能，及/或基因或多肽的譜系學特徵，例如，其中差異可能是因為遺傳密碼的簡併性、分離變異、序列長度等所致。例如，如本文所用的rep 基因和cap 基因可以含括與野生型基因不同的rep 和cap 基因，因為它們可以分別編碼一或多個Rep蛋白和Cap蛋白。在一些具體例中，Rep基因編碼至少Rep78及/或Rep68。在一些具體例中，cap 基因包括那些可能與野生型有差異者，因為一或多個選擇性起始密碼子或一或多個選擇性起始密碼子之間的序列被移除了，使得cap 基因僅編碼單個Cap蛋白質，例如，其中VP2及/或VP3起始密碼子被移除或被替換，使得cap 基因編碼功能性VP1衣殼蛋白，但不編碼VP2衣殼蛋白或VP3衣殼蛋白。 因此，如本文所用，rep 基因含括編碼功能性Rep蛋白的任何序列。cap 基因含括編碼至少一種功能cap 基因的任何序列。
眾所周知，野生型cap 基因受到rep ORF中發現的p40啟動子控制，從cap 基因的單個開放閱讀框表現所有三個VP1、VP2和VP3衣殼蛋白。術語「衣殼蛋白」，「Cap蛋白」與類似者包括病毒衣殼一部分的蛋白。就腺相關病毒來說，衣殼蛋白通常被稱為VP1、VP2及/或VP3，而且可由單個cap 基因所編碼。就AAV來說，自然界以重疊的方式從cap ORF選擇性轉譯起始密碼子使用產生三個AAV衣殼蛋白，儘管所有三種蛋白質使用共同的終止密碼子。野生型cap 基因的ORF從5'到3'編碼三個選擇性起始密碼子：「VP1起始密碼子」，「VP2起始密碼子」和「VP3起始密碼子」；以及一個「共同終止密碼子」。最大的病毒蛋白VP1通常是從VP1起始密碼子編碼到「共同終止密碼子」。VP2通常是從VP2起始密碼子編碼到共同終止密碼子，VP3通常是從VP3起始密碼子編碼到共同終止密碼子，因此，VP1在其N端處包含不與VP2或VP3共享的序列，被稱為VP1-特有區(VP1-u)。VP1-u區通常由野生型cap 基因從VP1起始密碼子編碼到「VP2起始密碼子」的序列所編碼。VP1-u包含一個可能對感染很重要的磷脂酶A2結構域(PLA2 )，以及可能有助於該病毒靶向至細胞核以供脫去衣殼和基因體釋放的核定位信號。VP1，VP2和VP3衣殼蛋白共有組成整個VP3的相同C端序列(在本文中也稱為VP3區)。VP3區由VP3起始密碼子編碼到共同終止密碼子。VP2具有與VP1共有的額外〜60個胺基酸。這個區域被稱為VP1/VP2共有區。
在一些具體例中，本發明的一或多個Cap蛋白可以由具有一或多個ORF的一或多個cap 基因所編碼。在一些具體例中，透過使用可操作地連接至至少一個表現控制序列的對應核苷酸序列以供在包裝細胞中表現，從含有超過一個ORF之編碼VP1、VP2及/或VP3的任何組合的核苷酸序列表現本發明的VP蛋白，其各自產生本發明的一或多個VP1、VP2及/或VP3衣殼蛋白。在一些具體例中，透過使用可操作地連接至一個表現控制序列的對應核苷酸序列以供在病毒複製細胞中表現，從包含一個ORF之編碼VP1、VP2或VP3中任一者的核苷酸序列單獨地表現本發明的VP蛋白，其各自產生本發明VP1、VP2或VP3衣殼蛋白中的僅只一者。在另一個具體例中，從包含一個ORF之編碼VP1、VP2及VP3衣殼蛋白的核苷酸序列表現VP蛋白，該核苷酸序列可操作地連接至至少一個表現控制序列以供在病毒複製細胞中表現，其各自產生VP1、VP2及VP3衣殼蛋白。因此，儘管本文提供的胺基酸位置可以相對於所參考的AAV的VP1衣殼蛋白提供，但是技術人員將能夠分別並且容易地確定相同胺基酸在AAV之VP2及/或VP3內的位置，以及不同AAV中胺基酸的對應位置。
片語「反向末端重複序列」或「ITR」包括有效複製所需的腺相關病毒基因體中的對稱核酸序列。ITR序列位於AAV DNA基因體的各個末端。ITRS作為病毒DNA合成的複製源點且是用於產生AAV顆粒(例如包入AAV顆粒)的必要順式組分。
AAV ITR包含複製蛋白Rep78或Rep68的識別位點。ITR的「D」區包含DNA缺口位點，DNA複製在該處開始並為核酸複製步驟提供方向性。在哺乳動物細胞中複製的AAV通常包含兩個ITR序列。
單個ITR可以在「A」區的兩股被改造成為帶有Rep結合位點，且在ITR回文每一側的兩個對稱「D」區的兩股上帶有Rep結合位點。在雙股環狀DNA模板上的這種工程改造建構物允許在兩個方向上進行的Rep78或Rep68引發的核酸複製。單個ITR就足以用於環狀顆粒的AAV複製。在生產本發明AAV病毒顆粒的方法中，rep 編碼序列編碼能夠結合包含在轉移質體上之ITR的Rep蛋白或Rep蛋白等效物。
當本發明的Cap蛋白在包裝細胞中與適當的Rep蛋白一起表現時，可以被包入包含感興趣核苷酸和偶數個兩個或更多個ITR序列的轉移質體。在一些具體例中，轉移質體包含一個ITR序列。在一些具體例中，轉移質體包含兩個ITR序列。
Rep78及/或Rep68結合至ITR髮夾序列上的特有和已知位點，並發揮作用以破壞和解開AAV基因體末端上的髮夾結構，從而提供進入病毒複製細胞的複製機制。眾所周知，藉由使用可操作地連接至至少一個表現控制序列的對應核苷酸序列以供在病毒複製細胞中表現，Rep蛋白可以從包含超過一個ORF之編碼Rep78、Rep68、Rep52及/或Rep40的任何組合的核苷酸序列被表現，其產生Rep78、Rep68、Rep52及/或Rep40 Rep蛋白中的一或多者。或者，藉由使用可操作地連接至一個表現控制序列的對應核苷酸序列以供在包裝細胞中表現，Rep蛋白可以從包含一個ORF之編碼Rep78、Rep68、Rep52或Rep40中任一者的核苷酸序列表現，其產生僅只Rep78、Rep68、Rep52或Rep40 Rep蛋白。在另一個具體例中，Rep蛋白可以從可操作地連接至至少一個表現控制序列以供在病毒複製細胞中表現的包含一個ORF之編碼Rep78和Rep52 Rep蛋白的核苷酸序列表現，其各自產生Rep78和Rep52 Rep蛋白。
在本發明之一個生產AAV病毒粒子(例如病毒顆粒)的方法中，本發明的rep 編碼序列和cap 基因也可以提供於單個包裝質體中(參見，例如圖1)。但是，習於技藝者將認知到，這種條件不是必需的。這樣的病毒顆粒可以包括或可以不包括基因體。
「嵌合AAV衣殼蛋白」包括AAV衣殼蛋白，其包含來自兩個或更多個不同AAV的胺基酸序列(例如部分)，並且能夠形成及/或形成AAV病毒衣殼/病毒顆粒。嵌合AAV衣殼蛋白由嵌合AAV衣殼基因編碼，例如，包含複數個(例如至少兩個)核酸序列的嵌合核苷酸，其中每一者與編碼不同AAV之衣殼蛋白的一部分衣殼基因相同，且其中多數共同編碼功能性嵌合AAV衣殼蛋白。嵌合衣殼蛋白締合至特定AAV表示，衣殼蛋白包含一或多個來自那個AAV的衣殼蛋白部分和一或多個來自不同AAV的衣殼蛋白部分。例如，嵌合AAV2衣殼蛋白包括包含一或多個AAV2之VP1、VP2及/或VP3衣殼蛋白部分，以及一或多個不同AAV之VP1、VP2及/或VP3衣殼蛋白部分。
術語「部分」是指至少5個胺基酸或至少15個核苷酸，但少於全長多肽或核酸分子，與該部分所衍生的序列具有100%同一性，參見Penzes (2015)J. General Virol . 2769。「部分」含括胺基酸或核苷酸的任何鄰接段，其足以確定該部分所衍生而來的多肽或核酸分子是「[指定] AAV的」或與特定AAV (例如非靈長類動物AAV或遠親AAV)具有「顯著同一性」。在一些具體例中，一部分包含至少5個胺基酸或15個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。在一些具體例中，一部分包含至少10個胺基酸或30個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。在一些具體例中，一部分包含至少15個胺基酸或45個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。在一些具體例中，一部分包含至少20個胺基酸或60個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。在一些具體例中，一部分包含至少25個胺基酸或75個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。在一些具體例中，一部分包含至少30個胺基酸或90個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。在一些具體例中，一部分包含至少35個胺基酸或105個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。在一些具體例中，一部分包含至少40個胺基酸或120個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性的。在一些具體例中，一部分包含至少45個胺基酸或135個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。在一些具體例中，一部分包含至少50個胺基酸或150個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。在一些具體例中，一部分包含至少60個胺基酸或180個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。在一些具體例中，一部分包含至少70個胺基酸或210個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。在一些具體例中，一部分包含至少80個胺基酸或240個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。在一些具體例中，一部分包含至少90個胺基酸或270個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。在一些具體例中，一部分包含至少100個胺基酸或300個核苷酸，與指定AAV相關的序列有100%同一性。
經修飾病毒衣殼蛋白、病毒顆粒、核酸
在一些具體例中，本發明的Cap蛋白(例如如本文所述的VP1衣殼蛋白，如本文所述的VP2衣殼蛋白，及/或如本文所述的VP3衣殼蛋白)被修飾成包含例如蛋白：蛋白結合對之第一成員、可偵測標籤、點突變等。
嵌合是一種如本文描述的修飾類型。一般來說，指定AAV的基因或多肽或其變體的修飾產生不同於本文針對指定AAV所述之核酸序列或胺基酸序列的核酸序列或胺基酸序列，其中修飾改變，賦予或去除一或多種生物學功能，但不改變該基因或多肽的譜系學特徵。修飾可包括插入(例如蛋白：蛋白結合對的第一成員)和點突變，例如使得衣殼蛋白的天然向性降低至被消除及/或使得衣殼蛋白包含可偵測標籤。較佳的修飾包括那些不改變，且較佳地經修飾衣殼減少低到沒有被預先存在的抗體所辨識，該預先存在的抗體在一般群體中於感染另一AAV過程期間產生(例如感染另一種血清型，諸如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVDJ、Anc80L65、AAV2G9、AAV-LK03、基於此類血清型的病毒粒子，當前使用的AAV基因治療方式的病毒粒子或其組合)。本文所述的其他修飾包括衣殼蛋白的修飾，使得其包含蛋白：蛋白結合對的第一成員、可偵測標籤等，該等修飾通常是在遺傳層面上的修飾，例如經由修飾cap 基因。
在一些具體例中，包含如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼是拼合衣殼，例如包含至少兩組VP1、VP2及/或VP3蛋白，其中每組由不同的cap 基因編碼。拼合衣殼在本文中一般是指被修飾成包含蛋白：蛋白結合對之第一成員的第一病毒衣殼蛋白，以及缺少蛋白：蛋白結合對之第一成員的第二病毒衣殼蛋白的拼合體(mosaic)。關於拼合衣殼，缺少蛋白：蛋白結合對的第一成員的第二病毒衣殼蛋白可以被稱為由參考cap 基因編碼的參考衣殼蛋白。 在一些拼合衣殼具體例中，較佳地當VP1、VP2及/或VP3殼體蛋白修飾成帶有蛋白：蛋白對之第一成員時不是嵌合衣殼蛋白，VP1、VP2及/或VP3參考衣殼蛋白可包含與被修飾成帶有蛋白：蛋白結合對之第一成員的病毒VP1、VP2及/或VP3衣殼蛋白的胺基酸序列相同的胺基酸序列，只是參考衣殼蛋白缺少蛋白：蛋白結合對的第一成員。在一些拼合衣殼具體例中，VP1、VP2及/或VP3 參考衣殼蛋白對應於經修飾成帶有蛋白：蛋白結合對之第一成員的病毒VP1、VP2及/或VP3衣殼蛋白，除了參考衣殼蛋白缺少蛋白：蛋白結合對的第一成員以外。在一些具體例中，VP1參考衣殼蛋白對應於經修飾成帶有蛋白：蛋白結合對之第一成員的病毒VP1衣殼蛋白，除了參考衣殼蛋白缺少蛋白：蛋白結合對的第一成員以外。在一些具體例中，VP2參考衣殼蛋白對應於經修飾成帶有蛋白：蛋白結合對之第一成員的病毒VP2衣殼蛋白，除了參考衣殼蛋白缺少蛋白：蛋白結合對的第一成員以外。在一些具體例中，VP3參考衣殼蛋白對應於經修飾成帶有蛋白：蛋白結合對之第一成員的病毒VP3衣殼蛋白，除了參考衣殼蛋白缺少蛋白：蛋白結合對的第一成員以外。在包含嵌合VP1、VP2及/或VP3衣殼蛋白進一步被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的第一成員的一些拼合衣殼具體例中，參考蛋白可以是其所衍生之部分形成一部分嵌合衣殼蛋白的對應衣殼蛋白。作為非限制性實例在一些具體例中，包含被修飾成含有蛋白：蛋白結合對之第一成員的嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白的拼合衣殼，可進一步包含下列作為參考衣殼蛋白：缺少該第一成員的AAV2 VP1衣殼蛋白、缺少第一成員的AAAV VP1衣殼蛋白、缺少第一成員的嵌合AAV2/AAAV VP1衣殼蛋白。類似地，在一些具體例中，包含被修飾成含有蛋白：蛋白結合對之第一成員的嵌合AAV2/AAAV VP2衣殼蛋白的拼合衣殼，可進一步包含下列作為參考衣殼蛋白：缺少該第一成員的AAV2 VP2衣殼蛋白、缺少第一成員的AAAV VP1衣殼蛋白、缺少第一成員的嵌合AAV2/AAAV VP2衣殼蛋白。在一些具體例中，包含被修飾成含有蛋白：蛋白結合對之第一成員的嵌合AAV2/AAAV VP3衣殼蛋白的拼合衣殼，可進一步包含下列作為參考衣殼蛋白：缺少該第一成員的AAV2 VP2衣殼蛋白、缺少第一成員的AAAV VP1衣殼蛋白、缺少第一成員的嵌合AAV2/AAAV VP3衣殼蛋白。在一些拼合衣殼具體例中，參考衣殼蛋白可以是任何衣殼蛋白，只要其缺少蛋白：蛋白結合對的第一成員，並且能夠形成被修飾成帶有蛋白：蛋白結合對之第一成員的第一衣殼蛋白的衣殼即可。
一般而言拼合顆粒可以藉由將經修飾和參考Cap 基因的混合物按指定比例轉染入生產細胞而產生。在顆粒中，蛋白質次單位的比例(例如，經修飾VP蛋白：未經修飾VP蛋白比例)可以，但不一定是在化學計量上反映編碼經修飾成帶有蛋白：蛋白結合對之第一成員的第一衣殼蛋白的cap 基因和一或多個參考cap 基因的至少兩種類型的比例，例如轉染至包裝細胞中經修飾cap 基因：參考cap 基因的比例。在一些具體例中，顆粒中的蛋白質次單位比例在化學計量上不反映轉染到包裝細胞中的經修飾cap 基因：參考cap 基因比例。
在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例範圍從約1：59至約59：1。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位為至少約1：1 (例如，拼合病毒顆粒包含約30個經修飾衣殼蛋白和約30個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：2 (例如，拼合病毒顆粒包含約20個經修飾衣殼蛋白和約40個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約3：5。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：3 (例如，拼合病毒顆粒包含約15個經修飾衣殼蛋白和約45個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：4 (例如，拼合病毒顆粒包含約12個經修飾衣殼蛋白和48個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：5 (例如，拼合病毒顆粒包含10個經修飾衣殼蛋白和50個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：6。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：7。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：8。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：9 (例如，拼合病毒顆粒包含約6個經修飾衣殼蛋白和約54個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：10。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1:11 (例如，拼合病毒顆粒包含約5個經修飾衣殼蛋白和約55個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：12。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：13。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：14 (例如，拼合病毒顆粒包含約4個經修飾衣殼蛋白和約56個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：15。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：19 (例如，拼合病毒顆粒包含約3個經修飾衣殼蛋白和大約57個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：29 (例如，拼合病毒顆粒包含約2個經修飾衣殼蛋白和約58個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約1：59。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約2：1 (例如，拼合病毒顆粒包含約40個經修飾衣殼蛋白和約20個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單比例為至少約5：3。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約3：1 (例如，拼合病毒顆粒包含約45個經修飾衣殼蛋白和約15個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約4：1 (例如，拼合病毒顆粒包含約48個經修飾衣殼蛋白和12個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約5：1 (例如，拼合病毒顆粒包含50個經修飾衣殼蛋白和10個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約6：1。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約7：1。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約8：1。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約9：1 (例如，拼合病毒顆粒包含約54個經修飾衣殼蛋白和約6個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約10：1。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約11：1 (例如，拼合病毒顆粒包含約55個經修飾衣殼蛋白和約5個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約12：1。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約13：1。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約14：1 (例如，拼合病毒顆粒包含約56個經修飾衣殼蛋白和約4個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約15：1。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約19：1 (例如，拼合病毒顆粒包含約57個經修飾衣殼蛋白和約3個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約29：1 (例如，拼合病毒顆粒包含約58個經修飾衣殼蛋白和約2個參考衣殼蛋白)。在一些拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例為至少約59：1。
在一些非拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例可以是1：0，其中非拼合病毒顆粒的每個衣殼蛋白被修飾成帶有蛋白：蛋白結合對的第一成員。在一些非拼合病毒顆粒具體例中，蛋白質次單位比例可為0：1，其中非拼合病毒顆粒的每個衣殼蛋白未被修飾成帶有蛋白：蛋白結合對的第一成員。
在一些具體例中，本發明的衣殼蛋白被修飾成包含可偵測標籤。許多可偵測標籤是本技藝已知的。(參見，例如：Nilsson et al. (1997) "Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of modified proteins" Protein Expression and Purification 11: 1-16，Terpe et al. (2003) "Overview of tag protein fusions: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems" Applied Microbiology and Biotechnology 60:523-533，以及其中的參考文獻)。可偵測標籤包括但不限於結合固定型二價陽離子(例如Ni2+ )的多組胺酸可偵測標籤(例如，His-6，His-8或His-10)、結合固定型抗生物素蛋白的生物素部分(例如，在活體內生物素化多肽序列上)、結合固定型麩胺硫的GST(麩胺硫S-轉移酶)序列、結合固定型S蛋白的S標籤、結合固定型抗體或其結構域或片段的抗原(包括，例如，結合對應抗體的T7、myc，FLAG和B標籤)、FLASH標籤(偶接至特定砷類部分的高度可偵測標籤)、結合固定型配體的受體或受體結構域(反之亦然)、結合固定型IgG的蛋白A或其衍生物(例如Z)、結合固定型直鏈澱粉的麥芽糖結合蛋白(MBP)、結合固定型白蛋白的白蛋白結合蛋白、結合固定型幾丁質的幾丁質結合結構域、結合固定型鈣調蛋白的鈣調蛋白結合肽，和結合固定型纖維素的纖維素結合結構域。另一種例示性可偵測標籤為SNAP-標籤，可購自Covalys (www.covalys.com)。在一些具體例中，本文揭示的可偵測標籤包括僅被抗體互補位識別的可偵測標籤。在一些具體例中，本文揭示的可偵測標籤包括被抗體互補位和其他特異性結合對識別的可偵測標籤。
在一些具體例中，可偵測標籤與免疫球蛋白恆定域形成結合對。在一些具體例中，可偵測標籤及/或可偵測標籤與金屬離子(例如，Ni2+ 、Co2+ 、Cu2+ 、Zn2+ 、Fe3+ 等)形成結合對。在一些具體例中，可偵測標籤選自由鏈抗生物素蛋白、Strep II、HA、L14、4C-RGD，LH和蛋白A。
在一些具體例中，可偵測標籤選自由FLAG、HA和c-myc (EQKLISEEDL；SEQ ID NO：44)組成之群。在一些具體例中，可偵測標籤是c-myc (SEQ ID NO：44)。
在一些具體例中，可偵測標籤是B細胞表位，例如，長度介於約1個胺基酸和約35個胺基酸，並與抗體互補位(例如，免疫球蛋白可變域)形成結合對。在一些具體例中，可偵測標籤包含B1表位(SEQ ID NO：45)。在一些具體例中，衣殼蛋白被修飾成在VP3區中包含B1表位。
在一些具體例中，本發明的衣殼蛋白包含肽：肽結合對的至少第一成員。
在一些具體例中，本發明的衣殼蛋白包含含有可偵測標籤之蛋白：蛋白結合對的第一成員，可偵測標籤也可用於偵測及/或分離Cap蛋白及/或用作蛋白：蛋白結合對的第一成員。在一些具體例中，可偵測標籤充當蛋白：蛋白結合對的第一成員，用於結合包含多特異性結合蛋白的靶向配體，該靶向配體可以結合可偵測標籤和由感興趣細胞表現的標靶。在一些具體例中，本發明的Cap蛋白包含含有c-myc (SEQ ID NO：44)的蛋白：蛋白結合對的第一成員。在例如WO2019006043中描述了可偵測標籤作為蛋白：蛋白結合對的第一成員的用途，其以全文引用的方式併入本文。
在一些具體例中，衣殼蛋白包含蛋白：蛋白結合對的第一成員，其中該蛋白：蛋白結合對形成共價異肽鍵。在一些具體例中，肽：肽結合對的第一成員經由異肽鍵共價結合至肽：肽結合對的同源第二成員，且視情況，其中肽：肽結合對的同源第二成員融合有一個靶向配體，該靶向配體結合由感興趣細胞所表現的標靶。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對可以選自由以下組成之群：SpyTag：SpyCatcher、SpyTag002：SpyCatcher002、SpyTag：KTag，Isopeptag：pilin-C和SnoopTag：SnoopCatcher。在一些具體例中，其中第一成員是SpyTag (或其生物活性部分)，而蛋白質(第二同源成員)是SpyCatcher (或其生物活性部分)。在一些具體例中，其中第一成員是SpyTag (或其生物活性部分)，而蛋白質(第二同源成員)是KTag (或其生物活性部分)。在一些具體例中，其中第一成員是KTag (或其生物活性部分)，而蛋白質(第二同源成員)是SpyTag (或其生物活性部分)。在一些具體例中，其中第一成員是SnoopTag (或其生物活性部分)，而蛋白質(第二同源成員)是SnoopCatcher (或其生物活性部分)。在一些具體例中，其中第一成員是Isopeptag (或其生物活性部分)，而蛋白質(第二同源成員)是Pilin-C (或其生物活性部分)。在一些具體例中，其中第一成員是SpyTag002 (或其生物活性部分)，而蛋白質(第二同源成員)是SpyCatcher002 (或其生物活性部分)。在一些具體例中，本發明的Cap蛋白包含SpyTag。蛋白：蛋白結合對之第一成員的用途描述於WO2019006046中，其全文併入本文。
在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤經由第一或第二連接子(例如長度為至少一個胺基酸的胺基酸間隔子)可操作地連接至本發明的Cap蛋白(與其框內轉譯，化學附接及/或由其展示)。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對的第一成員側接第一及/或第二連接子，例如第一及/或第二胺基酸間隔子，其中每一個間隔子的長度為至少一個胺基酸。
在一些具體例中，第一及/或第二連接子不同。在一些具體例中，第一及/或第二連接子的長度各自獨立地為一個或兩個胺基酸。在一些具體例中，第一及/或第二連接子的長度各自獨立地為一個，兩個或三個胺基酸。在一些具體例中，第一及/或第二連接子的長度各自獨立地為一個、兩個、三個或四個胺基酸。在一些具體例中，第一及/或第二連接子的長度各自獨立地為一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸。在一些具體例中，第一及/或第二連接子的長度各自獨立地為一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸。在一些具體例中，第一及/或第二連接子的長度各自獨立地為一個、兩個、三個、四個、五個或六個胺基酸。在一些具體例中，第一及/或第二連接子的長度各自獨立地為一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個胺基酸。在一些具體例中，第一及/或第二連接子的長度各自獨立地為一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個胺基酸。在一些具體例中，第一及/或第二連接子的長度各自獨立地為一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個胺基酸。在一些具體例中，第一及或第二連接子的長度各自獨立地為一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸。在一些具體例中，第一及或第二連接子的長度各自獨立地為一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸。
在一些具體例中，第一和第二連接子在序列及/或長度上是相同的，並且各自的長度是一個胺基酸。在一些具體例中，第一和第二連接子的長度相同，並且各自的長度為一個胺基酸。在一些具體例中，第一和第二連接子的長度相同，並且各自的長度為兩個胺基酸。在一些具體例中，第一和第二連接子的長度相同，並且各自的長度為三個胺基酸。在一些具體例中，第一和第二連接子長度相同，並且各自的長度為四個胺基酸，例如，連接子是GLSG (SEQ ID NO：37)。在一些具體例中，第一和第二連接子的長度相同，並且各自的長度為五個胺基酸。在一些具體例中，第一和第二連接子的長度相同，並且各自的長度為六個胺基酸，例如，第一和第二連接子各自包含GLSGSG的序列(SEQ ID NO：38)。在一些具體例中，第一和第二連接子的長度相同，並且各自的長度為七個胺基酸。在一些具體例中，第一和第二連接子的長度相同，並且各自的長度為八個胺基酸，例如，第一和第二連接子各自包含GLSGLSGS的序列(SEQ ID NO：39)。在一些具體例中，第一和第二連接子的長度相同，並且各自的長度為九個胺基酸。在一些具體例中，第一和第二連接子的長度相同，並且各自的長度為十個胺基酸，例如，第一和第二連接子各自包含GLSGLSGLSG (SEQ ID NO：40)或GLSGGSGLSG (SEQ ID NO： 41)的序列。在一些具體例中，第一和第二連接子的長度相同，並且各自的長度超過十個胺基酸。
通常，如本文所述蛋白：蛋白結合對胺基酸序列的第一成員(例如包含特異性結合對之第一成員本身或與一或多個連接子組合)的長度介於約5個胺基酸至約50個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為至少5個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為6個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為7個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為8個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為9個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為10個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為11個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為12個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為13個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為14個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為15個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為16個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為17個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為18個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為19個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為20個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為21個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為22個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為23個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為24個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為25個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為26個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為27個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為28個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為29個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為30個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為31個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為32個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為33個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為34個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為35個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為36個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為37個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為38個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為39個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為40個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為41個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為42個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為43個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為44個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為45個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為46個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為47個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為48個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為49個胺基酸。在一些具體例中，蛋白：蛋白結合對胺基酸序列之第一成員的長度為50個胺基酸。
由於至少大片段的高度守恆性以及大量密切相關的家族成員，因此可以藉由進行胺基酸比對或藉由比較衣殼結構來鑑定列舉之AAV以外的AAV的相對應插入位點。關於不同AAV衣殼蛋白的例示性比對，參見例如Rutledge et al . (1998)J. Virol. 72:309-19；Mietzsch et al. (2019)Viruses 11, 362, 1-34，與美國專利第9,624,274號，其每一者以全文引用的方式併入本文。舉例來說，Mietzsch et al. (2019)在圖7提供了來自不同細小病毒的條帶重疊圖(overlay of ribbons)，描繪了可變區VR I至VR IX。使用如其中所述的結構分析和序列分析，習於技藝者可以確定可變區中的哪些胺基酸對應於AAV的胺基酸序列，其可以容納插入蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤。
因此，在一些具體例中，在對應於選自由以下組成之群的胺基酸位置的胺基酸位置後，將蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤插入非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白中：AAV2衣殼蛋白VP1的G453、AAV2衣殼蛋白VP1的N587、AAV9衣殼蛋白VP1的G453和AAV9衣殼蛋白VP1的A589。在一些具體例中，將蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤插入與AAV2 VP1衣殼的N587和R588相對應的胺基酸之間的非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白中。非靈長類動物VP1衣殼蛋白的其他合適插入位點包括對應於下列者：AAV2的VP1衣殼蛋白的I-1、I-34、I-138、I-139、I-161、I-261、I-266、I-381、I-447、I-448、I-459、I-471、I-520、I-534、I-570、I-573、I-584、I-587、I-588、I‑591、I-657、I-664、I-713和I-716 (Wu et al. (2000)J. Virol. 74:8635-8647)。如本文所述的經修飾病毒衣殼蛋白可以是非靈長類動物衣殼蛋白，其包含被插入至對應選自由以下組成之群之AAV2衣殼蛋白的位置之位置中的蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤：I-1、I-34、I-138、I-139、I-161、I-261、I-266、I-381、I-447、I-448、I-459、I-471、I-520、I-534、I-570、I-573、I-584、I-587、I-588、I‑591、I-657、I-664、I-713、I-716及其組合。非靈長類動物AAV的其他合適插入位點包括那些對應於AAV1的I-587、AAV1的I-589、AAV3的I-585、AAV4的I-585，和AAV5的I-585。在一些具體例中，如本文所述的經修飾病毒衣殼蛋白可以是非靈長類動物衣殼蛋白，其包含被插入至對應於選自由以下組成之群的位置之位置中的蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤：I-587 (AAV1)、I-589 (AAV1)、I-585 (AAV3)、I-585 (AAV4)，I-585 (AAV5)及其組合。
在一些具體例中，在對應於選自由以下組成之群的胺基酸位置的胺基酸位置後，將蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤插入非靈長類動物AAV之VP1衣殼蛋白：禽類AAV衣殼蛋白VP1的I444、禽類AAV衣殼蛋白VP1的I580、髭頰蜥AAV衣殼蛋白VP1的I573、髭頰蜥AAV衣殼蛋白VP1的I436、海獅AAV衣殼蛋白VP1的I429、海獅AAV衣殼蛋白VP1的I430、海獅AAV衣殼蛋白VP1的I431、海獅AAV衣殼蛋白VP1的I432、海獅AAV衣殼蛋白VP1的I433、海獅AAV衣殼蛋白VP1的I434、海獅AAV衣殼蛋白VP1的I436、海獅AAV衣殼蛋白VP1的I437，與海獅AAV衣殼蛋白VP1的I565。
本文的命名I-###，I#或類似者是指插入位點(I)，其中###指定相對於AAV衣殼蛋白的VP1蛋白的胺基酸編號，但是這種插入可以直接在給定胺基酸的N端或C端，較佳在給定胺基酸之5個胺基酸N端或C端的序列中，較佳在給定胺基酸序列之3個，更佳2個，特別是1個胺基酸N端或C端中的一個胺基酸的C端。另外，本文所指的位置是相對於由AAV衣殼基因編碼的VP1蛋白，並且透過實施由適當衣殼基因編碼的VP1、VP2和VP3蛋白序列比對，可以容易地鑑定由衣殼基因編碼的VP2和VP3衣殼蛋白的相應位置(及其點突變)。
因此，由於衣殼蛋白是由具有交錯起始密碼子之同一基因的重疊閱讀框所編碼，插入cap基因的這些位點之一者的編碼核酸的對應位置中造成插入VP1、VP2及/或VP3中。是以，對於AAV2來說，例如，根據此命名法，胺基酸1和138之間的插入僅插入到VP1中，138和203之間的插入插入到VP1和VP2中，而203和C端之間的插入則插入到VP1、VP2和VP3，當然插入位置I-587也是如此。因此，本發明含括在VP1、VP2及/或VP3蛋白中具有對應插入之AAV的結構基因。
本文還提供了編碼本發明VP3衣殼蛋白的核酸。AAV衣殼蛋白可以，但不一定由具有交錯起始密碼子之同一基因的重疊閱讀框所編碼。在一些具體例中，編碼本發明VP3衣殼蛋白的核酸並不編碼本發明的VP2衣殼蛋白或VP1衣殼蛋白。在一些具體例中，編碼本發明VP3衣殼蛋白的核酸也可以編碼本發明的VP2衣殼蛋白，但是不編碼本發明的VP1衣殼。在一些具體例中，編碼本發明VP3衣殼蛋白的核酸還可編碼本發明的VP2衣殼蛋白和本發明的VP1衣殼。
在一些具體例中，包含含有蛋白：蛋白結合對之第一和第二成員(例如，其中第二成員可操作地連接至靶向配體，包含多特異性結合蛋白等)之經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼，能夠感染特定的細胞，例如，與經修飾病毒衣殼蛋白相同但缺少蛋白：蛋白結合對之第一成員或第二成員的對照病毒衣殼(例如包含對照衣殼蛋白)相較之下具有增強的能力以靶向並結合特定細胞。在一些具體例中，與對照病毒衣殼偵測不到的轉導效率相較之下，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼顯示出可偵測到的轉導效率。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出10%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出20%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出30%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出40%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出50%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出60%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出70%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出75%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出80%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出85%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出90%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出95%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出99%。
在一些具體例中，包含含有蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員(例如，其中該第二成員可操作地連接至靶向配體，包含多特異性結合蛋白等)之經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼能夠感染特定細胞，例如，與經修飾病毒衣殼蛋白相同但缺少蛋白：蛋白結合對之第一成員或第二成員或兩者的對照病毒衣殼(例如包含對照衣殼蛋白)相較之下具有增強的能力以靶向並結合特定細胞。在一些具體例中，與對照病毒的偵測步道的轉導效率相比，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出可偵測到的轉導效率。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出10%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出20%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出30%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出40%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出50%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出60%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出70%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出75%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出80%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出85%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出90%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出95%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出99%。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少1.5倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少2倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少3倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少4倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少5倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少6倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少7倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少8倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少9倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少10倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照衣殼的轉導效率高出至少20倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的適當第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少30倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少40倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少50倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少60倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少70倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少80倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少90倍。在一些具體例中，包含結合連接至靶向配體之蛋白：蛋白結合對的第一和第二成員的如本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的病毒衣殼展現出的轉導效率比對照病毒衣殼的轉導效率高出至少100倍。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白，並視情況含有蛋白：蛋白結合對之第一與第二成員(例如其中第二成員可操作地連接至靶向配體，包含多特異性結合蛋白等)的病毒顆粒在分離自人類患者的血清中，與適當對照病毒顆粒(例如包含AAV血清型之病毒衣殼，其一部分被納入本發明的病毒衣殼，例如作為含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列之病毒衣殼蛋白的一部份)相比，更能逃過被預先存在之抗體所中和。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒衣殼與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少2倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少2倍)。
在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少3倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少3倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少4倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少4倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少5倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少5倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少6倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少6倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少7倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少7倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少8倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少8倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少9倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少9倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少10倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少10倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少20倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少20倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少30倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少30倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少40倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少40倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少50倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少50倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少60倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少60倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少70倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少70倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少80倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少80倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少90倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少90倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒與適當對照病毒顆粒相較之下需要多出至少100倍的總IVIG或IgG以供中和(例如，50%或更多感染抑制)，例如(例如本發明的病毒顆粒的IC50值是對照病毒顆粒的至少100倍)。在一些具體例中，本發明之包含含有非靈長類動物AAV、遠親AAV或其組合之衣殼蛋白胺基酸序列的病毒衣殼蛋白的病毒顆粒當與與來自至少100；10,000；20,000；30,000；40,000；50,000；或更多人類捐贈者的匯聚人類血清Ig一起培育時，具有偵測不到的IC50。
靶向配體
本文所述的病毒顆粒可進一步包含靶向配體。
在本發明包含可偵測標籤的一些具體例中，靶向配體包含多特異性結合分子，其含有(I)抗體互補位，特異地結合可偵測標籤和(ii)第二結合結構域，特異地結合受體，其可結合至珠粒表面(例如，用於純化)或由目標細胞表現。因此，包含(i)特異地結合可偵測標籤之抗體互補位和(ii)特異地結合受體之第二結合結構域的多特異性結合分子靶向病毒顆粒。這樣的「靶向」或「定向」可以包括其中野生型病毒顆粒在生物體內靶向組織及/或數個器官中之數種細胞的情況，透過插入可偵測標籤，組織或器官的廣泛靶向被減少至消除，且利用多特異性結合分子實現在生物體內的組織或更為特異性器官中重新靶向更為特定的細胞。這樣的重靶向或重定向還可以包括以下情形：野生型病毒顆粒靶向組織，藉由插入可偵測標籤將組織的靶向性降低至消除，並且利用多特異性結合分子將其重靶向至完全不同的組織。如本文所述的抗體互補位通常包含至少一個特異地識別可偵測標籤的互補決定區(CDR)，例如具有重鏈及/或輕鏈可變域的CDR3區。在一些具體例中，多特異性結合分子包含抗體(或其部分)，其包含特異地結合可偵測標籤的抗體互補位。例如，多特異性結合分子可包含單結構域重鏈可變區或單結構域輕鏈可變區，其中該單結構域重鏈可變區或單結構域輕鏈可變區包含特異地結合可偵測標籤的抗體互補位。在一些具體例中，多特異性結合分子可包含Fv區，例如，多特異性結合分子可包含scFv，其包含特異性結合可偵測標籤的抗體互補位。在一些具體例中，本文所述的多特異性結合分子包含特異地結合c-myc (SEQ ID NO：44)的抗體互補位。
本發明的一個具體例是包含本發明經修飾的病毒衣殼蛋白的多聚體結構。多聚體結構包含至少5個，較佳至少10個，更佳至少30個，最佳至少60個經修飾病毒衣殼蛋白，其包含本文所述特異性結合對的第一成員。它們可以形成正常病毒衣殼(空病毒顆粒)或病毒顆粒(將感興趣核苷酸包入的衣殼)。對於本文所述經修飾病毒衣殼的用途來說，包含病毒基因體之病毒顆粒的形成是一個高度偏好的特徵。
本發明的另一個具體例是至少一種經修飾病毒衣殼蛋白及/或編碼其的核酸，較佳至少一個多聚體結構(例如，病毒顆粒)供製造的用途，以及將感興趣核苷酸轉移至目標細胞中的用途。
使用與製造方法
本文所述經修飾病毒衣殼蛋白的另一個具體例是其用於將感興趣核苷酸(例如報導子基因或治療性基因)遞送至目標細胞的用途。通常，感興趣核苷酸可以是轉移質體，當被含括在AAV顆粒中時，其通常可以包含側接報導子基因或治療性基因(其可以受到病毒或非病毒啟動子控制)的5'和3'反向末端重複序列(ITR)。在一個具體例中，感興趣核苷酸是一個轉移質體，從5'至3'包含：5' ITR、啟動子、基因(例如，報導子及/或治療性基因)和3' ITR。
有用啟動子的非限制性實例包括例如巨細胞病毒(CMV)啟動子、脾臟病灶形成病毒(SFFV)啟動子、延長因子1α (EF1a)啟動子(1.2 kb EFla啟動子或0.2 kb EFla啟動子)、嵌合EF 1a/IF4-啟動子和磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。內部增強子也可以存在於病毒建構物中以提高感興趣基因的表現。例如，可以使用CMV增強子(Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. 169:13，其以全文引用的方式併入本文)。在一些具體例中，CMV增強子可以與雞β-肌動蛋白啟動子組合使用。
多種報導子基因(或可偵測部分)可以被包入包含本文所述之經修飾病毒衣殼蛋白的多聚體結構內。例示性報導子基因包括，例如，β-半乳糖苷酶(編碼lacZ 基因)、綠色螢光蛋白(GFP)、增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、MmGFP、藍色螢光蛋白(BFP)、增強型藍色螢光蛋白(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黃色螢光蛋白(YFP)、增強型黃色螢光蛋白(eYFP)、祖母綠、CyPet、青色螢光蛋白(CFP)、天藍、T-藍寶石、螢光素酶，鹼性磷酸酶或其組合。本文所述的方法證明了使用編碼綠色螢光蛋白的報導子基因來建構靶向顆粒，但是，習於技藝者在閱讀過本份揭示內容後將理解，可以在不存在技藝中熟知之報導子基因或利用任何報導子基因的情況下產生本文所述的病毒衣殼。
多種治療性基因也可以被包入包含本文所述之經修飾病毒衣殼蛋白的多聚體結構，例如作為轉移顆粒的一部分。治療性基因的非限制性實例包括那些編碼毒素(例如自殺基因)、治療性抗體或其片段、CRISPR/Cas系統或其部分、反義RNA、siRNA、shRNA者等。
本發明的又一個具體例是一種製備經修飾衣殼蛋白的方法，該方法包含以下步驟： a)     在合適的條件下表現編碼經修飾衣殼蛋白的核酸，及 b)     分離步驟a)所表現的衣殼蛋白。
在一些具體例中，如本文所述的病毒顆粒包含拼合衣殼，例如包含如本文所述與參考衣殼蛋白呈某個比例之經遺傳修飾之衣殼蛋白的衣殼(與靶向配體不存在或存在共價鍵的情況下)。製造這樣一種拼合病毒顆粒的方法包含 a)     在適當條件下，以至少約60：1至約1：60的比例(wt/wt)(例如2：1、1：1、3：5、1：2、1：3等)表現編碼經修飾衣殼蛋白之核酸以及編碼參考衣殼蛋白的核苷酸，及 b)     分離步驟a)所表現的衣殼蛋白。
在一些具體例中，本文所述組合物包含，或本文所述方法以至少約60：1至約1：60的比例範圍合併經修飾cap 基因：參考cap 基因(或參考cap 基因的組合)，例如2：1、1：1、3：5、1：2、1：3等。在一些具體例中，該比例為至少約1：2。在一些具體例中，該比例為至少約1：3。在一些具體例中，該比例為至少約1：4。在一些具體例中，該比例為至少約1：5。在一些具體例中，該比例為至少約1：6。在一些具體例中，該比例為至少約1：7。在一些具體例中，該比例為至少約1：8。在一些具體例中，該比例為至少約1：9。在一些具體例中，該比例為至少約1：10。在一些具體例中，該比例為至少約1：11。在一些具體例中，該比例為至少約1：12。在一些具體例中，該比例為至少約1：13。在一些具體例中，該比例為至少約1：14。在一些具體例中，該比例為至少約1：15。在一些具體例中，該比例為至少約1：16。在一些具體例中，該比例為至少約1：17。在一些具體例中，該比例為至少約1：18。在一些具體例中，該比例為至少約1：19。在一些具體例中，該比例為至少約1：20。在一些具體例中，該比例為至少約1：25。在一些具體例中，該比例為至少約1：30。在一些具體例中，該比例為至少約1：35。在一些具體例中，該比例為至少約1：40。在一些具體例中，該比例為至少約1：45。在一些具體例中，該比例為至少約1：50。在一些具體例中，該比例為至少約1：55。在一些具體例中，該比例為至少約1：60。在一些具體例中，該比例為至少約2：1。在一些具體例中，該比例為至少約3：1。在一些具體例中，該比例為至少約4：1。在一些具體例中，該比例為至少約5：1。在一些具體例中，該比例為至少約6：1。在一些具體例中，該比例為至少約7：1。在一些具體例中，該比例為至少約8：1。在一些具體例中，該比例為至少約9：1。在一些具體例中，該比例為至少約10：1。在一些具體例中，該比例為至少約11：1。在一些具體例中，該比例為至少約12：1。在一些具體例中，該比例為至少約13：1。在一些具體例中，該比例為至少約14：1。在一些具體例中，該比例為至少約15：1。在一些具體例中，該比例為至少約16：1。在一些具體例中，該比例為至少約17：1。在一些具體例中，該比例為至少約18：1。在一些具體例中，該比例為至少約19：1。在一些具體例中，該比例為至少約20：1。在一些具體例中，該比例為至少約25：1。在一些具體例中，該比例為至少約30：1。在一些具體例中，該比例為至少約35：1。在一些具體例中，該比例為至少約40：1。在一些具體例中，該比例為至少約45：1。在一些具體例中，該比例為至少約50：1。在一些具體例中，該比例為至少約55：1。在一些具體例中，該比例為至少約60：1。
在一些具體例中，拼合病毒顆粒中的VP蛋白質次單位比例可以，但不一定在化學計量上反映經修飾cap 基因：參考cap 基因的比例。作為非限制性的例示性具體例，根據該方法所形成的拼合衣殼可以被認為具有，但不必然具有與用於生產拼合衣殼編碼相同的核酸的比例(wt：wt)相似的經修飾衣殼蛋白：參考衣殼蛋白比例。在一些具體例中，拼合衣殼包含約1：59至約59：1的蛋白質次單位比例。
本發明的更多具體例是一種用於改變病毒向性的方法，該方法包含以下步驟：(a)將編碼胺基酸序列的核酸插入編碼病毒衣殼蛋白的核酸序列中，以形成編碼包含胺基酸序列之經遺傳修飾的衣殼蛋白的核苷酸序列，及/或(b)在足以生產病毒顆粒的條件下培養包裝細胞，其中包裝細胞包含該核酸。本發明的另一個具體例是一種在衣殼蛋白表面上展示靶向配體的方法，該方法包含以下步驟：(a)在合適的條件下，表現編碼如本文所述的經修飾病毒衣殼蛋白的核酸(以及視情況與編碼參考衣殼蛋白的核苷酸一起)，其中該核酸編碼包含特異性結合對之第一成員的衣殼蛋白；(b)分離步驟(a)所表現之包含特異性結合對的第一成員的衣殼蛋白或包含其的衣殼；以及(c)在適於在第一和第二成員之間形成異肽鍵的條件下，將衣殼蛋白或衣殼與特異性結合對的第二同源成員一起培育，其中特異性結合對的第二同源成員與靶向配體融合。
在一些具體例中，包裝細胞還包含的輔助質體及/或含有感興趣核苷酸轉移質體。在一些具體例中，該等方法進一步包含從培養物上清液中分離自互補腺相關病毒顆粒。在一些具體例中，該等方法進一步包含溶解包裝細胞並從細胞溶解產物中分離單股腺相關病毒顆粒。在一些具體例中，該等方法進一步包含(a)清除細胞碎片、(b)用核酸酶(例如DNase I)和MgCl2 處理含有病毒顆粒的上清液、(c)濃縮病毒顆粒，(d)純化病毒顆粒，以及(e) (a)-(d)的任何組合。
可用於生產本文所述之病毒顆粒的包裝細胞包括，例如，允許病毒的動物細胞，或被修飾為允許病毒的細胞；或包裝細胞建構物，例如，使用轉形劑(諸如磷酸鈣)。用於生產本文所述病毒顆粒的包裝細胞株的非限制性實例包括，例如人類胚胎腎293 (HEK-293)細胞(例如，美國典型培養物保存中心[ATCC] CRL-1573)、含有SV40大T抗原的HEK-293細胞(HEK-293T或293T)、HEK293T/17細胞、人類肉瘤細胞株HT-1080 (CCL-121)、淋巴母細胞樣細胞株Raji (CCL-86)、膠質母細胞瘤-星形細胞瘤上皮樣細胞株U87-MG (HTB-14)、T淋巴瘤細胞HuT78 (TIB-161)、NIH/3T3細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)(例如ATCC編號CRL9618、CCL61、CRL9096)、HeLa細胞(例如ATCC編號CCL-2)、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例如ATCC編號CRL-1658)、Huh-7細胞、BHK細胞(例如ATCC編號CCL10)、PC12細胞(ATCC編號CRL1721)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC編號CRL1651)、RATI細胞、小鼠L細胞(ATCC編號CCLI.3)、HLHepG2細胞、CAP細胞，CAP-T細胞與類似者。
L929細胞(Cosset et al (1995) J Virol 69,7430-7436中概述的FLY病毒包裝細胞系統)、NS0 (鼠類骨髓瘤)細胞、人類羊膜細胞(例如CAP，CAP-T)、酵母細胞(包括但不限於釀酒酵母，巴斯德畢赤酵母)、植物細胞(包括但不限於菸草NT1，BY-2)、昆蟲細胞(包括但不限於SF9，S2，SF21，Tni (例如High5))或細菌細胞(包括但不限於大腸桿菌)。
有關用於將核酸基因體包裝到假型病毒顆粒中的其他包裝細胞和系統，包裝技術和顆粒，參見例如Polo, et al, Proc Natl Acad Sci USA, (1999) 96:4598-4603。包裝方法包括使用永久表現病毒組分的包裝細胞，或利用質體瞬時轉染細胞。
更多具體例包括將病毒重定向及/或將報導子或治療性基因遞送至目標細胞的方法，該方法包含在活體外(例如，離體)或活體內轉導細胞的方法，該方法包含以下步驟：使目標細胞與包含本文所述衣殼的病毒顆粒接觸，其中該衣殼包含特異地結合目標細胞所表現之受體的靶向配體。在一些具體例中，目標細胞是在活體外(例如，離體)。在其它具體例中，目標細胞是在活體內在個體(例如人類)體內。
目標細胞
可使用本文揭示的經修飾病毒顆粒靶向廣泛多種的細胞以便遞送感興趣核苷酸。通常將基於感興趣核苷酸和所需效果來選定目標細胞。
在一些具體例中，可以遞送感興趣核苷酸以使目標細胞能夠生產彌補生物體缺陷(諸如酶缺乏或免疫缺陷(諸如X-連鎖嚴重合併性免疫不全))的蛋白質。因此，在一些具體例中，靶向通常在動物體內生產蛋白質的細胞。在其他具體例中，靶向蛋白質最為有益之區域中的細胞。
在其他具體例中，感興趣核苷酸(諸如編碼siRNA的基因)可以抑制特定基因在目標細胞中的表現。感興趣核苷酸可以例如抑制與病原體生命週期有關的基因表現。因此，可以靶向易受病原體感染或被病原體感染的細胞。在其他具體例中，感興趣核苷酸可以在目標細胞中抑制負責生產毒素的基因表現。
在其他具體例中，感興趣核苷酸可以編碼毒性蛋白，該毒性蛋白殺死其表現於中的細胞。在這種情況下，可以靶向腫瘤細胞或其他不樂見的細胞。
在其他具體例中，感興趣核苷酸編碼治療性蛋白。
一旦目標細胞的特定群體被鑑定為其中感興趣核苷酸的表現是期望的，選定在該目標細胞群體上特異地表現的目標受體。該目標受體可以僅在該細胞群體上表現，或者在該細胞群體上表現的程度比在其他細胞群體上表現的程度更高。表現越具特異性，就可以更特異地定向至目標細胞。取決於上下文，標記特異性的(以及因此基因遞送的)期望量可能有所改變。例如，為了引入毒性基因，最為偏好高特異性以避免殺死非靶向細胞。為了表現蛋白質以供收取，或表現需要全局影響的分泌產物，可能需要較差的標記特異性。
如上文所討論的，目標受體可以是任何靶向配體可識別或創建的受體。較佳地，目標受體是肽或多肽(諸如受體)。但是，在其他具體例中，目標受體可以是碳水化合物或可以被結合伴侶識別的其他分子。如果一個結合伴侶(例如配體)對於目標受體是已知的，則它可以用作親和力分子。但是，如果結合分子是未知的，則可以使用標準程序產生針對目標受體的抗體。然後可以將抗體用作為靶向配體。
因此，可以基於各種各樣的因素來選擇目標細胞，這些因素包括，例如(1)應用(例如，治療、表現待收集的蛋白質以及賦予抗病性)，以及(2)表現具有所需特異性之量的標記。
目標細胞在任何方面都沒有任何限制，並且包括生殖系細胞和細胞株，以及體細胞和細胞株。目標細胞可以是衍生自任一種來源的幹細胞。當目標細胞是生殖系細胞時，目標細胞較佳地選自單細胞胚胎和胚胎幹細胞(ES)。
醫藥組成物、劑型與投藥
另一個具體例提供了一種藥劑，其包含至少一種經修飾病毒衣殼蛋白和根據本發明的合適靶向配體及/或根據本發明的核酸。較佳地，這種藥劑可用作基因轉移顆粒。
本文還揭示了包含本文所述病毒顆粒及醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑的醫藥組合物。另外，本文揭示了包含本文所述病毒顆粒的醫藥劑型。
如本文所述，本文所述的病毒顆粒可用於各種治療性應用(活體內和離體)並用作研究工具。
基於本文揭示之病毒顆粒的醫藥組合物可以使用一或多種生理上可接受的載劑及/或賦形劑以任何常規方式來調配。可以將病毒顆粒調配成藉由例如注射，吸入或隔絕(透過口或鼻)或藉由經口、經頰、非經腸或經直腸投藥，或藉由直接投藥至腫瘤來給藥。
可以針對各種不同的投藥模式來調配醫藥組合物，包括全身，局部或定點投藥。可以在例如Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa.中找到技術和調配物。關於全身投藥，較佳為注射，包括肌肉內、靜脈內，腹膜內和皮下。為了注射之目的，可以將醫藥組合物調配於液體溶液中，較佳地調配於生理上相容的緩衝液中，例如漢克氏溶液(Hank’s solution)或林格氏溶液(Ringer’s solution)。另外，醫藥組合物可以以固體形式調配並在使用前才再溶解或懸浮。醫藥組合物的凍乾形式也是合適的。
關於經口投藥，醫藥組合物可以採取例如錠劑或膠囊的形式，其是藉由常規方式利用醫藥上可接受賦形劑來製備，諸如黏合劑(例如，預糊化玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂，滑石粉或二氧化矽)；崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或羥乙酸澱粉鈉)；或潤濕劑(例如月桂基硫酸鈉)。錠劑也可以藉由本技藝中周知的方法進行包衣。用於經口投藥的液體調配物可以採取例如溶液，糖漿或懸浮液的形式，或者它們可以以乾燥產品的形式呈現，以在使用前用水或其他合適的載體組成。這樣的液體調配物可以藉由常規方式與醫藥上可接受添加劑來製備，諸如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿，纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性載體(例如油、油性酯，乙醇或分餾植物油)；和防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。若適當的話，這些調配物還可以包含緩衝鹽、調味劑，著色劑和甜味劑。
可以將醫藥組合物調配成用於藉由注射(例如，藉由推注或連續輸注)進行非經腸投藥。注射用調配物可以呈單位劑型存在，例如在安瓿或多劑量容器中，加上視情況添加的防腐劑。醫藥組合物可以進一步於油性或水性載體中調配成懸浮液，溶液或乳劑，並且可以含有其他試劑，包括懸浮劑，穩定劑及/或分散劑。
另外，醫藥組合物也可以調配為貯庫調配物。這些長效調配物可以藉由植入(例如皮下或肌肉內)或肌肉內注射來投藥。因此，舉例來說，化合物可以與合適聚合或疏水性材料(例如，作為在可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂一起調配，或作為微溶的衍生物(例如，作為微溶的鹽)來調配。其他合適的遞送系統包括微球，其在長時間段內提供局部非侵入性遞送藥物的可能性。這個技術可以包括具有毛細血管前大小的微球，可以經由冠狀動脈導管將其注射到器官的任何選定部分，而不會引起發炎或缺血。所投與的治療劑在人體內從微球緩慢地釋出並被選定組織中存在的周圍細胞所吸收。
全身投藥也可以藉由穿黏膜或穿皮方式進行。關於穿黏膜或穿皮投藥，在調配物中使用適合要滲透的屏障的滲透劑。這樣的滲透劑在本技藝中通常是已知的，並且包括例如用於穿黏膜投藥的膽鹽和梭鏈孢酸衍生物。另外，可以使用清潔劑以促進滲透。穿黏膜投藥可以使用鼻噴霧劑或栓劑進行。關於局部投藥，本文所述的病毒顆粒可被調配成乳膏劑、油膏，凝膠或霜劑，如本技藝中通常已知的。洗滌液也可局部用於治療損傷或發炎，以加速癒合。
適於注射用途的醫藥形式可包括無菌水溶液或分散液；包括芝麻油，花生油或丙二醇水溶液的調配物；以及用於臨時製備無菌注射液或分散液的無菌粉劑。在所有情況下，該形式必須是無菌的並且必須是流體。它必須在製造條件和某些儲存參數的條件(例如冷藏和冷凍)下保持穩定，並且必須進行防腐以防微生物(諸如細菌和真菌)的作用所污染。
如果本文揭示的調配物在個體體內用作增強免疫反應的治療劑，則可以將治療劑調配成中性或鹽形式的組合物。醫藥上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質的游離胺基形成)，以及與無機酸(諸如例如鹽酸或磷酸)或有機酸(如乙酸、草酸、酒石酸，扁桃酸與類似者)所形成者。與游離羧基形成的鹽也可以衍生自無機鹼(諸如，例如鈉、鉀、銨，鈣或氫氧化鐵)，以及諸如有機鹼(如異丙胺、三甲胺、組胺酸，普羅卡因與類似者)。
載劑也可以是溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油，丙二醇和液體聚乙二醇與類似者)，其合適的混合物以及植物油。可以例如藉由使用包衣(諸如卵磷脂)，在分散的情況下且透過使用界面活性劑維持所需的粒徑來維持適當的流動性。可以藉由本技藝中已知的各種抗菌劑和抗真菌劑來預防微生物的作用。在許多情況下，較佳為包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。藉由在組合物中使用延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)，可以延長可注射組合物的吸收。
視需要，無菌注射溶液可藉由將所需量的活性化合物或建構物與上面列舉的各種其他成分併入適當的溶劑中，然後過濾滅菌來製備。
在調配之後，可以與劑量調配物相容的方式及以治療有效的量來投與溶液。該調配物易於以各種不同的劑型來投與，諸如上述可注射溶液的類型，但是也可以採用緩釋膠囊或微粒和微球與類似者。
舉例來說，關於在水溶液中的非經腸投藥，若需要的話，應適當地緩衝溶液，並且首先用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些特定的水溶液特別適合於靜脈內、腫瘤內、肌肉內，皮下和腹膜內投藥。在這種情況下，根據本揭示內容，那些習於技藝者將知道可以採用的無菌水性介質。例如，某劑量可以溶解在1 ml等滲NaCl溶液中，或者被添加到1000 ml皮下灌注液中，或者注射在建議的輸注部位處。
在任何情況下，負責投藥的人將決定用於個別個體的適當劑量。舉例來說，以每天或每週為基礎對個體投與本文所述的病毒顆粒持續一段時間，或以每月、每年兩次或每年為基礎，這取決於需求或對病原性生物的暴露或個體的病況(例如癌症)而定。
除了調配用於非經腸投藥(諸如靜脈內、腫瘤內，皮內或肌肉內注射)的化合物以外，其他醫藥上可接受的形式包括，例如錠劑或其他用於經口投藥的固體；脂質體調配物；定時釋放膠囊；可生物降解的和目前使用的任何其他形式。
還可以使用鼻內或可吸入溶液或噴霧劑，氣溶膠或吸入劑。鼻溶液可以是被設計成以滴劑或噴霧劑形式投與至鼻道的水溶液。可以製備鼻溶液，使得它們在許多方面與鼻分泌物相似。因此，水性鼻溶液通常是等滲的並且稍經緩衝以維持5.5至7.5的pH。另外，如果需要的話，可以將與眼科調配物中使用的那些相似的抗微生物防腐劑，以及適當藥物穩定劑併入調配物中。多種商業鼻調配物是已知的，並且可以包括例如抗生素和抗組織胺，並用於預防氣喘。
經口調配物可包括賦形劑，如例如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素，碳酸鎂與類似物。這些組成物採溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊，緩釋調配物或粉劑的形式。在某些明確的具體例中，經口醫藥組合物將包含惰性稀釋劑或可同化的可食用載劑，或者可以將它們封裝在硬殼或軟殼明膠膠囊中，或者可以將其壓製成錠劑，或者可以將其直接與膳食食品合併。關於經口治療性投藥，可以將活性化合物與賦形劑合併，並以可攝入錠劑、頰錠劑、片劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿，扁片與類似形式使用。
錠劑、片劑、丸劑，膠囊和類似者還可以包含下列：黏合劑，如黃耆膠、阿拉伯膠，玉米澱粉或明膠；賦形劑，諸如磷酸二鈣；崩解劑，諸如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉，海藻酸和類似物；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；以及甜味劑，例如蔗糖，乳糖或糖精可加入，或調味劑，諸如薄荷，冬青油或櫻桃調味劑。當劑量單位形式是膠囊時，除上述類型的材料外，它還可包含液體載劑。各種其他材料可以作為包衣存在或以其他方式改變劑量單位的物理形式。例如，錠劑，丸劑或膠囊可以用蟲膠，糖或兩者包衣。酏劑的糖漿可含有活性化合物蔗糖作為甜味劑，對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯作為防腐劑，染料和調味劑，諸如櫻桃或橙調味劑。
本文揭示的更多具體例可能涉及與方法和組合物一起使用的套組。套組還可包括合適的容器，例如小瓶、管子、微型或超微量離心管、試管、燒瓶、瓶，注射器或其他容器。如果提供了其他成分或試劑，則套組可以含有一或多個額外容器，可以在其中放置該試劑或成分。本文的套組通常還將包括用於密閉保存病毒顆粒和任何其他試劑容器以進行商業銷售的裝置。這樣的容器可以包括將期望在其中保留小瓶的注射或吹塑塑膠容器。視情況，所述組合物可能需要一或多種額外活性劑，例如例如消炎劑、抗病毒劑，抗真菌劑或抗菌劑或抗腫瘤劑。
本文揭示的組合物可以藉由技藝中已知的任何方式投與。例如，組合物可以包括向個體靜脈內、腫瘤內、皮內、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、局部、腫瘤內、肌肉內、鞘內、皮下、結膜下、囊內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、局部、藉由吸入、藉由注射、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由定位灌注、經由導管、經由灌洗，在霜劑中或在脂質組合物中。
習於技藝者已知的任何方法可用於大規模生產本文所述的病毒顆粒，包裝細胞和顆粒建構物。例如，可以在GMP條件下，在合格的初級CEF或其他方法來準備母種和工作種儲存液。包裝細胞可鋪在大表面積燒瓶上，生長至接近匯合，並純化病毒顆粒。可以收穫細胞，並分離且純化釋放到培養基中的病毒顆粒，或者藉由機械破壞釋放細胞內病毒顆粒(可以藉由大孔深度過濾去除細胞碎片，並用核酸內切酶消化宿主細胞DNA)。病毒顆粒可以隨後藉由切向流過濾和透濾來純化和濃縮。可以藉由用含有穩定劑的緩衝液稀釋來調配所得的濃縮物，將其填充到小瓶中並凍乾。組合物和調配物可以儲存以備稍後使用。關於使用，凍乾的病毒顆粒可以透過添加稀釋劑來還原。
可以藉由技藝中已知的任何方式調配和投與在組合療法中使用的某些其他試劑。
如本文揭示的組合物還可包含佐劑，諸如鋁鹽和其他礦物質佐劑、張力活性劑、細菌衍生物，載體和細胞介素。佐劑也可以具有拮抗性免疫調節特性。例如，佐劑可以刺激Th1或Th2免疫性。本文揭示的組合物和方法也可以包括輔助療法。
下列列出非限制性與例示性具體例。 具體例1.    一種包含AAV衣殼的AAV病毒顆粒， 其中該AAV衣殼的至少一個AAV衣殼蛋白包含選自由以下組成之群之衣殼蛋白的至少一部分胺基酸序列 非靈長類動物AAV的衣殼蛋白， 遠親AAV的衣殼蛋白，以及 其組合，且 其中該AAV衣殼的至少一個AAV衣殼蛋白被修飾成包含 (a)  蛋白：蛋白結合對的至少第一成員， (b) 可偵測標籤， (c)  點突變， (d)         包含另一個AAV衣殼蛋白之一部分胺基酸序列的嵌合胺基酸序列，其可操作地連接至選自由以下組成之群的衣殼蛋白的該胺基酸序列：非靈長類動物AAV的衣殼蛋白、遠親AAV的衣殼蛋白，或其組合，以及 (e)  (a)、(b)、(c)與(d)的任何組合。 具體例2.    一種包含AAV衣殼的AAV病毒顆粒， 其中該AAV衣殼的至少一個AAV衣殼蛋白包含非靈長類動物AAV之衣殼蛋白的至少一部分胺基酸序列， 其中該AAV衣殼的至少一個AAV衣殼蛋白被修飾成包含 (a)  蛋白：蛋白結合對的至少第一成員， (b) 可偵測標籤， (c)  點突變， (d) 包含另一個AAV衣殼蛋白之一部分胺基酸序列的嵌合胺基酸序列，其可操作地連接至非靈長類動物AAV的衣殼的該胺基酸序列，以及 (e)  (a)、(b)、(c)與(d)的任何組合。 具體例3.    一種包含AAV衣殼的AAV病毒顆粒， 其中該AAV衣殼的至少一個AAV衣殼蛋白包含遠親AAV之衣殼蛋白的至少一部分胺基酸序列， 其中該AAV衣殼的至少一個AAV衣殼蛋白被修飾成包含 (a) 蛋白：蛋白結合對的至少第一成員， (b)       可偵測標籤， (c) 點突變， (d)       包含另一個AAV衣殼蛋白之一部分胺基酸序列的嵌合胺基酸序列，其可操作地連接至遠親AAV的衣殼蛋白的該胺基酸序列，以及 (e) (a)、(b)、(c)與(d)的任何組合。 具體例4.    一種AAV病毒顆粒，包含 (A)至少一個AAV衣殼蛋白，包含選自由以下組成之群的胺基酸序列 (i)             非靈長類動物AAV之衣殼蛋白的胺基酸序列， (ii)           遠親AAV之衣殼蛋白的胺基酸序列，及 (iii)         其組合的胺基酸序列，以及 (B) 包含感興趣核苷酸以及包含另一AAV的至少一部分ITR序列之AAV ITR的AAV基因體。 具體例5.    一種AAV病毒顆粒，包含 (A)至少一個AAV衣殼蛋白，其包含非靈長類動物AAV之衣殼蛋白的胺基酸序列，以及 (B) 包含感興趣核苷酸以及包含另一AAV的至少一部分ITR序列之AAV ITR的AAV基因體。 具體例6.    一種AAV病毒顆粒，包含 (A)       至少一個AAV衣殼蛋白，其包含遠親AAV之衣殼蛋白的胺基酸序列，以及 (B) 包含感興趣核苷酸以及包含另一AAV的至少一部分ITR序列之AAV ITR的AAV基因體。 具體例7.    如前述具體例中任一項之AAV病毒顆粒，其中非靈長類動物AAV之衣殼蛋白，遠親AAV之衣殼蛋白，或其組合的該胺基酸序列被修飾成包含 (a)  蛋白：蛋白結合對之至少第一成員， (b) 可偵測標籤， (c)  點突變。 具體例8.    如具體例7之AAV顆粒，其中該蛋白：蛋白結合對選自SpyTag：SpyCatcher、SpyTag：KTag、Isopeptag：pilin‑C、SnoopTag：SnoopCatcher，及SpyTag002：SpyCatcher002。 具體例9.    如具體例7之AAV顆粒，其中蛋白，蛋白結合對之第一成員包含含有如SEQ ID NO:44所示序列的c-myc。 具體例10   如前述具體例中任一項之AAV顆粒，其中該可偵測標籤包含B1表位，該B1表位包含IGTRYLTR的胺基酸序列(SEQ ID NO：45)。 具體例11.  如前述具體例中任一項之AAV病毒顆粒，其中非靈長類動物AAV的衣殼蛋白、遠親AAV的衣殼蛋白或其組合的該胺基酸序列包含非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列及/或遠親AAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列。 具體例12.  如前述具體例中任一項之AAV病毒顆粒，其中非靈長類動物AAV的衣殼蛋白衣殼蛋白、遠親AAV的衣殼蛋白或其組合的該胺基酸序列包含非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白的胺基酸序列及/或遠親AAV的VP2衣殼蛋白的胺基酸序列。 具體例13.  如前述具體例中任一項之AAV病毒顆粒，其中非靈長類動物AAV的衣殼蛋白衣殼蛋白、遠親AAV的衣殼蛋白或其組合的該胺基酸序列包含非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白的胺基酸序列及/或遠親AAV的VP1衣殼蛋白的胺基酸序列。 具體例14.  如前述具體例中任一項之AAV病毒顆粒，其中該顆粒的衣殼包含 (i)             VP1衣殼蛋白，其為 嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP1衣殼蛋白包含另一個AAV的VP1特有區(VP1-u)可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP1/VP2共有區和VP3區，或 非靈長類AAV或遠親AAV的VP1衣殼蛋白， (ii)           VP2衣殼蛋白，其為 嵌合AAV VP2衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP2衣殼蛋白包含另一個AAV的VP1/VP2共有區可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP3區，或 非靈長類AAV或遠親AAV的VP2衣殼蛋白，以及 (iii)         非靈長類AAV或遠親AAV的VP3衣殼蛋白。 具體例15.  如前述具體例中任一項之AAV病毒顆粒，其中該顆粒的衣殼包含 (i)    嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP1衣殼蛋白包含另一個AAV的VP1特有區(VP1-u)可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP1/VP2共有區和VP3區， (ii)  嵌合AAV VP2衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP2衣殼蛋白包含另一個AAV的VP1/VP2共有區可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP3區，以及 (iii)             非靈長類AAV或遠親AAV的VP3衣殼蛋白。 具體例16.  如前述具體例中任一項之AAV病毒顆粒，其中該顆粒的衣殼包含 (i)             嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP1衣殼蛋白包含另一個AAV的VP1特有區(VP1-u)可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP1/VP2共有區和VP3區， (ii)  非靈長類AAV或遠親AAV的VP2衣殼蛋白，以及 (iii)             非靈長類AAV或遠親AAV的VP3衣殼蛋白。 具體例17.  如前述具體例中任一項之AAV病毒顆粒，其中該衣殼包含 (i)             非靈長類AAV或遠親AAV的VP1衣殼蛋白， (ii)           非靈長類AAV或遠親AAV的VP2衣殼蛋白，及 (iii)         非靈長類AAV或遠親AAV的VP3衣殼蛋白。 具體例18.  如前述具體例中任一項之AAV病毒顆粒，其中該另一AAV為靈長類AAV或靈長類AAV的組合。 具體例19.  如前述具體例中任一項之AAV病毒顆粒，其中該另一AAV選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其組合。 具體例20.  如前述具體例中任一項之AAV病毒顆粒，其中該另一AAV是AAV2。 具體例21.  如具體例1-2、4-5與7-20中任一項之AAV病毒顆粒，其中該非靈長類動物AAV是表2中列出非靈長類AAV。 具體例22.  如具體例1-2、4-5與7-21中任一項之AAV病毒顆粒，其中該非靈長類AAV是禽類AAV、海獅AAV或髭頰蜥AAV。 具體例23.  如具體例1-2、4-5與7-22中任一項之AAV病毒顆粒，其中該非靈長類動物AAV是AAAV。 具體例24.  如具體例1-2、4-5和7-23中任一項之AAV病毒顆粒，其中該修飾在AAAV之VP1衣殼蛋白的位置I444或I580處。 具體例25   如具體例1-2、4-5和7-22中任一項之AAV病毒顆粒，其中該非靈長類動物AAV是有鱗目AAV。 具體例26.  如具體例1-2、4-5，7-22與25中任一項之AAV病毒顆粒，其中有鱗目AAV是髭頰蜥AAV。 具體例27.  如具體例1-2、4-5，7-22與25-26中任一項之AAV病毒顆粒，其中該修飾在髭頰蜥AAV之VP1衣殼蛋白的位置I573或I436處。 具體例28.  如具體例1-2、4-5和7-22中任一項之AAV病毒顆粒，其中非靈長類動物AAV是哺乳動物AAV。 具體例29.  如具體例1-2、4-5，7-22及28中任一項之AAV病毒顆粒，其中哺乳動物AAV是海獅AAV。 具體例30.  如具體例1-2、4-5，7-22及28-29中任一項之AAV病毒顆粒，其中該修飾在選自由以下組成之群的位置處：海獅AAV之VP1的I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436、I437和A565。 具體例31.  如前述具體例中任一項之AAV病毒顆粒，其包含非靈長類動物AAV，遠親AAV或其組合的VP3衣殼蛋白，其中VP3衣殼蛋白被修飾成包含 (a) 蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，視情況其中蛋白：蛋白結合對選自由以下組成之群：SpyTag：SpyCatcher、SpyTag：KTag、Isopeptag：pilin–C，SnoopTag：SnoopCatcher和SpyTag002：SpyCatcher002 (b) 可偵測標籤，視情況其中可偵測標籤包含如SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列或如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列， (c) 點突變，或 (d) (a)，(b)和(c)的任何組合。 具體例32   如具體例31之AAV顆粒，其中非靈長類動物AAV，遠親AAV或其組合的VP3衣殼蛋白被修飾成包含 (a)  至少SpyTag，其包含如SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列及/或 (b)  可偵測標籤，其包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列。 具體例33.  如前述具體例中任一項之AAV顆粒，其包含將蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤可操作地連接至該AAV顆粒之衣殼的衣殼蛋白的第一及/或第二連接子。 具體例34.  如具體例33之AAV顆粒，其中該第一和第二連接子不同。 具體例35.  如具體例33或具體例34之AAV顆粒，其中該第一和第二連接子相同。 具體例36.  如具體例33-35中任一項之AAV顆粒，其中該第一及/或第二連接子的長度為10個胺基酸。 具體例37.  如前述具體例中任一項之AAV顆粒，其包含可操作地連接至該AAV顆粒之衣殼的衣殼蛋白的可變區的蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤。 具體例38.  如具體例1或具體例2之AAV顆粒，其包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含選自由以下組成之群的胺基酸序列： (a) 如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列， (b) 如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列， (c) 如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列， (d) 如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列， (e) 如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列， (f)  如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列， (g) 如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列， (h) 如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列， (i)  如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列， (j)  如SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列， (k) 如SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列， (l)  如SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列， (m) 如SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列， (n) 如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列， (o) 如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列， (p) 如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列， (q) 如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列， (r)  如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列， (s) 如SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列， (t)  如SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列， (u) 如SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列， (v) 如SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列， (w)       如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列， (x) 如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列， (y) 如SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列， (z) 如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列， (aa)  如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列， (bb) 如SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列， (cc)  與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO ：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71具有顯著序列同一性，例如至少95%同一性的胺基酸序列，及 (dd)      (a)-(cc)中任一者所示之胺基酸序列的任何VP2及/或VP3部分的胺基酸序列。 具體例39.  如前述具體例中任一項之AAV顆粒，其進一步包含參考衣殼蛋白，使得該衣殼為拼合衣殼(mosaic capsid)。 具體例40.  如前述具體例中任一項之AAV顆粒，其包含拼合衣殼，該拼合衣殼包含經修飾成帶有蛋白：蛋白結合對之第一成員的VP3衣殼蛋白和參考VP3衣殼蛋白。 具體例41.  一種包含非靈長類動物AAV或遠親AAV之衣殼蛋白的胺基酸序列的腺相關病毒(AAV)衣殼蛋白，其中該AAV衣殼蛋白選自由以下組成之群： (a) 嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中該嵌合動物AAV VP1衣殼蛋白被修飾成包含蛋白：蛋白結合對之至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變， (b) 非嵌合AAV VP1衣殼蛋白，被修飾成包含蛋白：蛋白結合對之至少第一成員及/或可偵測標籤， (c) 嵌合VP2衣殼蛋白，視情況其中該嵌合AAV VP2衣殼蛋白被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變， (d) 非嵌合AAV VP2衣殼蛋白，被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變， (e) 嵌合AAV VP3衣殼蛋白，被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變，及 (f)  非嵌合AAV VP3衣殼蛋白，被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變。 具體例42.  如具體例41之AAV衣殼蛋白，其中該蛋白：蛋白結合對的第一成員側接第一及/或第二連接子，該第一及/或第二連接子將該蛋白：蛋白結合對的第一成員連接至衣殼蛋白，且其中第一及/或第二連接子的長度各自獨立地為至少一個胺基酸。 具體例43.  如具體例42之AAV衣殼蛋白，其中該第一連接子和第二連接子不同。 具體例44.  如具體例42之AAV衣殼蛋白，其中該第一連接子和第二連接子相同，且長度為10個胺基酸。 具體例45.  如具體例41-44中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該衣殼蛋白進一步包含蛋白：蛋白結合對的第二同源成員，視情況其中該第一和第二成員藉由共價鍵(視情況異肽鍵)結合。 具體例46.  如具體例41-45中任一項之AAV衣殼蛋白，其中蛋白：蛋白結合對的第一成員包含SpyTag。 具體例47.  如具體例45或具體例46之AAV衣殼蛋白，其中該第二同源成員包含SpyCatcher。 具體例48.  如具體例45-47中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該第二同源成員包含KTag。 具體例49.  如具體例45之AAV衣殼蛋白，其中該第一成員是KTag，而該第二同源成員包含SpyTag。 具體例50.  如具體例45之AAV衣殼蛋白，其中該第一成員是SnoopTag，而該第二同源成員包含SnoopCatcher。 具體例51.  如具體例45之AAV衣殼蛋白，其中該第一成員是isopeptag，而該第二同源成員包含Pilin-C。 具體例52.  如具體例45之AAV衣殼蛋白，其中該第一成員是SpyTag002，而該第二同源成員包含SpyCatcher002。 具體例53.  如具體例45-52中任一項之AAV衣殼蛋白，其中第二成員可操作地連接至靶向配體，視情況其中該靶向配體是結合部分。 具體例54.  如具體例53之AAV衣殼蛋白，其中結合部分是抗體或其部分。 具體例55.  如具體例54之AAV衣殼蛋白，其中該抗體或其部分融合至SpyCatcher。 具體例56.  如具體例54或具體例55之AAV衣殼蛋白，其中該抗體或其部分在C端處融合至連接子，而該連接子在連接子C端處融合至SpyCatcher。 具體例57.  如具體例56之AAV衣殼蛋白，其中該連接子包含如SEQ ID NO：49 (GSGESG)所示的序列。 具體例58.  如具體例41-57中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該可偵測標籤包含B1表位，該B1表位包含如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列。 具體例59.  如具體例41-58中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該非靈長類動物AAV是表2中列出的非靈長類AAV。 具體例60.  如具體例41-59中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該非靈長類AAV是禽類AAV，海獅AAV或髭頰蜥AAV。 具體例61.  如具體例41-60中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該非靈長類動物AAV是AAAV。 具體例62.  如具體例41-61中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該修飾在AAAV的VP1衣殼蛋白的位置I444或I580處。 具體例63.  如具體例41-60中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該非靈長類動物AAV是有鱗目AAV。 具體例64.  如具體例41-60和63中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該有鱗目AAV是髭頰蜥AAV。 具體例65.  如具體例41-60和63-64中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該修飾在髭頰蜥AAV的VP1衣殼蛋白的位置I573或I436處。 具體例66.  如具體例41-60中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該非靈長類動物AAV是哺乳動物AAV。 具體例67.  如具體例41-60和66中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該哺乳動物AAV是海獅AAV。 具體例68.  如具體例41-60和66-67中任一項之AAV衣殼蛋白，其中修飾是在選自由以下組成之群的位置處：海獅AAV之VP1的I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436、I437和A565。 具體例69.  如具體例41-68中任一項之AAV衣殼蛋白，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列： (a) 如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列， (b) 如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列， (c) 如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列， (d) 如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列， (e) 如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列， (f)  如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列， (g) 如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列， (h) 如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列， (i)  如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列， (j)  如SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列， (k) 如SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列， (l)  如SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列， (m) 如SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列， (n) 如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列， (o) 如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列， (p) 如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列， (q) 如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列， (r)  如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列， (s) 如SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列， (t)  如SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列， (u) 如SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列， (v) 如SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列， (w)       如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列， (x) 如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列， (y) 如SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列， (z) 如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列， (aa)  如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列， (bb) 如SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列， (cc)  與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO ：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71具有顯著序列同一性，例如至少95%同一性的胺基酸序列，及 (dd)      (a)-(cc)中任一者所示之胺基酸序列的任何VP2及/或VP3部分的胺基酸序列。 具體例70.  如具體例41-69中任一項之AAV衣殼蛋白，其中蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤。 具體例71.  如具體例70之AAV衣殼蛋白，其中該可偵測標籤包括c-myc (SEQ ID NO：44)。 具體例72.  一種AAV顆粒，其包含如具體例41-71中任一項之AAV衣殼蛋白。 具體例73.  一種核酸，其包含編碼如具體例41-71中任一項之AAV衣殼蛋白的cap 基因。 具體例74.  一種核酸分子，其包含編碼AAV衣殼蛋白的AAVcap 基因， 其中AAVcap 基因包含選自由以下組成之群的cap 基因的至少一部分核苷酸序列： (i)  非靈長類動物AAV的cap 基因， (ii) 遠親AAV的cap 基因，或 (iii) 其組合， 其中該AAVcap 基因進一步被修飾成包含 (a) 編碼蛋白：蛋白結合對之第一成員的核苷酸序列， (b) 編碼可偵測標籤的核苷酸序列， (c) 點突變， (d) 嵌合核苷酸序列，包含可操作地連接至AAVcap 基因的該核苷酸序列的另一AAVcap 基因的一部分核苷酸序列，該AAVcap 基因選自由cap 基因非靈長類動物AAV，遠親AAV或其組合組成之群， (e) (a)、(b) 、(c)和(d)的任何組合。 具體例75.  一種核酸分子，其包含編碼AAV衣殼蛋白的AAVcap 基因， 其中AAVcap 基因包含非靈長類動物AAV之cap 基因的至少一部分核苷酸序列 其中該AAVcap 基因進一步被修飾成包含 (a) 編碼蛋白：蛋白結合對之第一成員的核苷酸序列， (b) 編碼可偵測標籤的核苷酸序列， (c) 點突變， (d) 嵌合核苷酸序列，包含可操作地連接至cap 基因非靈長類動物AAV的該核苷酸序列的另一個AAVcap 基因的一部份核苷酸序列， (e) (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合。 具體例76.  一種核酸分子，其包含編碼AAV衣殼蛋白的AAVcap 基因， 其中AAVcap 基因包含遠親動物AAV之cap 基因的至少一部分核苷酸序列 其中該AAVcap 基因進一步被修飾成包含 (a) 編碼蛋白：蛋白結合對之第一成員的核苷酸序列， (b) 編碼可偵測標籤的核苷酸序列， (c) 點突變， (d) 嵌合核苷酸序列，包含可操作地連接至cap 基因遠親動物AAV的該核苷酸序列的另一個AAVcap 基因的一部份核苷酸序列， (e) (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合。 具體例77.  一種核酸分子，包含AAVrep 基因和AAVcap 基因， 其中AAVcap 基因包含選自由以下組成之群的cap 基因的第一核苷酸序列 (i)  非靈長類動物AAV的cap 基因， (ii) 遠親AAV的cap 基因，以及 (iii) 其組合， 其中AAVrep 基因包含另一個AAV之AAVrep 基因的第二核苷酸序列。 具體例78.  一種核酸分子，包含AAVrep 基因和AAVcap 基因， 其中AAVcap 基因包含非靈長類動物AAV之cap 基因的第一核苷酸序列， 其中AAVrep 基因包含另一個AAV之AAVrep 基因的第二核苷酸序列。 具體例79.  一種核酸分子，包含AAVrep 基因和AAVcap 基因， 其中AAVcap 基因包含遠親動物AAV之cap 基因的第一核苷酸序列， 其中AAVrep 基因包含另一個AAV之AAVrep 的基因的第二核苷酸序列。 具體例80.  如具體例73-79中任一項之核酸分子，其中cap 基因可操作地連接至啟動子。 具體例81.  如具體例80之核酸分子，其中該啟動子指導衣殼蛋白在包裝細胞中的表現。 具體例82.  如具體例80或具體例81之核酸分子，其中啟動子選自p40、SV40、EF、CMV、B19p6和CAG。 具體例83.  如具體例73-82中任一項之核酸分子，其中非靈長類動物AAV的cap 基因，遠親AAV的cap 基因，或其組合的該核苷酸序列被修飾成包含 (a) 編碼蛋白：蛋白結合對之至少第一成員的核苷酸序列， (b) 編碼可偵測標籤的核苷酸序列，及/或 (c) 編碼點突變的核苷酸序列。 具體例84.  如具體例83的核酸分子，其中蛋白：蛋白結合對選自SpyTag：SpyCatcher、SpyTag：KTag、Isopeptag：pilin-C，SnoopTag：SnoopCatcher和SpyTag002：SpyCatcher002。 具體例85.  如具體例83之核酸分子，其中蛋白：蛋白結合對的第一成員包含c-myc，其包含如SEQ ID NO：44所示的序列。 具體例86.  如具體例83-85中任一項之核酸分子，其中可偵測標籤包含B1表位，該B1表位包含IGTRYLTR的胺基酸序列(SEQ ID NO：45)。 具體例87.  如具體例73-86中任一項之核酸分子，其中cap 基因非靈長類動物AAV，遠親AAV的cap 基因，或其組合的該核苷酸序列包含編碼非靈長類動物AAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列及/或遠親AAV的VP3衣殼蛋白的胺基酸序列的核苷酸序列。 具體例88.  如具體例73-87中任一項之核酸分子，其中cap 基因非靈長類動物AAV，遠親AAV的cap 基因，或其組合的該核苷酸序列包含編碼非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白的胺基酸序列及/或遠親AAV的VP2衣殼蛋白的胺基酸序列的核苷酸序列。 具體例89.  如具體例73-87中任一項之核酸分子，其中cap 基因非靈長類動物AAV，遠親AAV的cap 基因，或其組合的該核苷酸序列包含編碼非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白的胺基酸序列及/或遠親AAV的VP1衣殼蛋白的胺基酸序列的核苷酸序列。 具體例90.  如具體例73-89中任一項之核酸分子，其中cap 基因編碼 (i)  VP1衣殼蛋白，其為 嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP1衣殼蛋白包含另一個AAV的VP1特有區(VP1-u)可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP1/VP2共有區和VP3區，或 非靈長類AAV或遠親AAV的VP1衣殼蛋白， (ii) VP2衣殼蛋白，其為 嵌合AAV VP2衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP2衣殼蛋白包含另一個AAV的VP1/VP2共有區可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV的VP3區，或 非靈長類AAV或遠親AAV的VP2衣殼蛋白，及/或 (iii)       非靈長類AAV或遠親AAV的VP3衣殼蛋白。 具體例91.  如具體例73-90中任一項之核酸分子，其中cap 基因編碼 (i)  嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP1衣殼蛋白包含另一個AAV的VP1特有區(VP1-u)可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP1/VP2共有區和VP3區， (ii) 嵌合AAV VP2衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP2衣殼蛋白包含另一個AAV的VP1/VP2共有區可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV的VP3區，及/或 (iii)非靈長類AAV或遠親AAV的VP3衣殼蛋白。 具體例92.  如具體例73-90中任一項之核酸分子。其中cap 基因編碼 (i)  嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中嵌合VP1衣殼蛋白包含另一個AAV的VP1特有區(VP1-u)可操作地連接至非靈長類AAV或遠親AAV之VP1/VP2共有區和VP3區， (ii) 非靈長類AAV或遠親AAV的VP2衣殼蛋白，及 (iii)       非靈長類AAV或遠親AAV的VP3衣殼蛋白。 具體例93.  如具體例73-90中任一項之核酸分子，其中cap 基因編碼 (i)  非靈長類AAV或遠親AAV的VP1衣殼蛋白， (ii) 非靈長類AAV或遠親AAV的VP2衣殼蛋白，及/或 (iii) 非靈長類AAV或遠親AAV的VP3衣殼蛋白。 具體例94.  如具體例73-93中任一項之核酸分子，其中該另一個AAV是靈長類AAV或靈長類AAV的組合。 具體例95.  如具體例73-94中任一項之核酸分子，其中該另一個AAV選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其組合。 具體例96.  如具體例73-95中任一項之核酸分子，其中該另一個AAV是AAV2。 具體例97.如具體例73-75、77-78和80-96中任一項之核酸分子，其中該非靈長類動物AAV是表2中列出的非靈長類AAV。 具體例98.  如具體例73-75、77-78和80-97中任一項之核酸分子，其中該非靈長類AAV是禽類AAV，海獅AAV或髭頰蜥AAV。 具體例99.  如具體例73-75、77-78和80-98中任一項之核酸分子，其中非靈長類動物AAV是AAAV。 具體例100. 如具體例73-75，77-78，和80-99中任一項之核酸分子，其中該修飾在AAAV之VP1衣殼蛋白的密碼子編碼位置I444或I580處。 具體例101. 如具體例73-75，77-78和80-98中任一項之核酸分子，其中該非靈長類動物AAV是有鱗目AAV。 具體例102. 如具體例73-75，77-78、80-98和101中任一項之核酸分子，其中該有鱗目AAV是髭頰蜥AAV。 具體例103. 如具體例73-75，76-77和80-98和101-102中任一項之核酸分子，其中該修飾是在髭頰蜥AAV之VP1衣殼蛋白的密碼子編碼位置I573或I436處。 具體例104. 如具體例73-75，76-77和80-98中任一項之核酸分子，其中該非靈長類動物AAV是哺乳動物AAV。 具體例105. 如具體例73-75，77-78、80-98和104中任一項之核酸分子，其中該哺乳動物AAV是海獅AAV。 具體例106. 如具體例73-75、77-78，80-98和105中任一項之核酸分子，其中該修飾在選自由以下組成之群的位置處：海獅AAV之VP1的I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436、I437和A565。 具體例107. 如具體例73-106中任一項之核酸分子，其包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a) 如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列， (b) 如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列， (c) 如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列， (d) 如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列， (e) 如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列， (f)  如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列， (g) 如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列， (h) 如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列， (i)  如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列， (j)  如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列， (k) 如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列， (l)  如SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列， (m) 如SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列， (n) 如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列， (o) 如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列， (p) 如SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列， (q) 如SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列， (r)  如SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列， (s) 如SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列， (t)  如SEQ ID NO：54所示的核苷酸序列， (u) 如SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列， (v) 如SEQ ID NO：58所示的核苷酸序列， (w)       如SEQ ID NO：60所示的核苷酸序列， (x) 如SEQ ID NO：62所示的核苷酸序列， (y) 如SEQ ID NO：64所示的核苷酸序列， (z) 如SEQ ID NO：66所示的核苷酸序列， (aa)  如SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列， (bb) 如SEQ ID NO：70所示的核苷酸序列， (cc)  與如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或其編碼VP2衣殼之任一者具有顯著序列同一性，例如至少95%同一性的核苷酸序列，及 (dd)      編碼VP2衣殼蛋白及/或VP3衣殼蛋白之(a)-(s)的任一部分核苷酸序列。 具體例108. 如具體例73-107中任一項之核酸分子，其進一步包含編碼一​​或多個AAV Rep蛋白且可操作地連接至啟動子的AAVrep 基因。 具體例109. 如具體例108之核酸分子，其中啟動子選自由p5、p19 SV40、EF、CMV，B19p6和CAG組成之群。 具體例110. 如具體例108或具體例109之核酸分子，其中一或多個Rep蛋白選自Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。 具體例111. 如具體例108-110中任一項之核酸分子，其中一或多個Rep蛋白包含Rep78。 具體例112. 具體例108-110中任一項之核酸分子，其中一或多個Rep蛋白是靈長類動物AAV Rep蛋白。 具體例113. 一種AAV衣殼蛋白，其包含具體例73-112的核酸分子中任一者的胺基酸序列。 具體例114. 一種AAV顆粒，其包含具體例113的衣殼蛋白。 具體例115. 一種用於生產AAV顆粒的包裝細胞，包含含有如具體例73-112中任一項之cap 基因的核酸分子。 具體例116. 如具體例115之包裝細胞，其進一步包含含有編碼一或多個AAV Rep蛋白的rep 基因的核酸分子，其中該rep 基因可操作地連接至啟動子，視情況其中rep 基因和cap 基因是來自兩種不同的AAV。 具體例117. 如具體例116之包裝細胞，其中可操作地連接至rep 基因的啟動子指導Rep蛋白在包裝細胞中的表現。 具體例118. 如具體例116或具體例117之包裝細胞，其中啟動子選自p5、p19 SV40、EF、CMV、B19p6和CAG。 具體例119. 如具體例116-118中任一項之包裝細胞，其中一或多個Rep蛋白選自Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。 具體例120. 如具體例116-119中任一項之包裝細胞，其中一或多個Rep蛋白包含Rep78。 具體例121. 如具體例116-120中任一項之包裝細胞，其中一或多個Rep蛋白是靈長類動物AAV Rep蛋白。 具體例122. 如具體例116-120中任一項之包裝細胞，其中一或多個Rep蛋白是非靈長類動物AAV Rep蛋白。 具體例123. 如具體例116-122中任一項之包裝細胞，其進一步包含核酸分子，該核酸分子包含在至少一側側接至少一個AAV反向末端重複(ITR)序列的感興趣核苷酸的核苷酸序列，該ITR被一或多個Rep蛋白識別。 具體例124. 如具體例123之包裝細胞，其中該核苷酸在另一側側接同一AAV的第二ITR作為至少一個ITR。 具體例125. 如具體例124之包裝細胞，其中該核苷酸在另一側側接第二ITR，其中該第二ITR與該至少一個ITR具有不同的AAV。 具體例126. 如具體例123-125中任一項之包裝細胞，其中該感興趣核苷酸是報導子基因。 具體例127. 如具體例126之包裝細胞，其中該報導子基因編碼β-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白(GFP)、增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、MmGFP、藍色螢光蛋白(BFP)、增強型藍色螢光蛋白(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黃色螢光蛋白(YFP)、增強型黃色螢光蛋白(eYFP)、祖母綠、CyPet、青色螢光蛋白(CFP)、天藍、T-藍寶石、螢光素酶、鹼性磷酸酶或其組合。 具體例128. 如具體例123-125中任一項之包裝細胞，其中該感興趣核苷酸編碼治療性蛋白、自殺基因、抗體或其片段、CRISPR/Cas系統或其一部分、反義寡核苷酸、核酶、RNAi分子或shRNA分子。 具體例129. 如具體例115-133中任一項之包裝細胞，其進一步包含編碼參考衣殼蛋白的核苷酸序列。 具體例130. 一種生產病毒顆粒的方法，其包含在足以生產病毒顆粒的條件下培養如具體例115-129中任一項之包裝細胞。 具體例131. 如具體例130之方法，其中包裝細胞還包含輔助質體及/或包含感興趣核苷酸的轉移質體。 具體例132. 如具體例130或具體例131之方法，進一步包含一或多個以下步驟： a.   清除細胞碎片， b.   用Benzonase或DNase I和MgCl2處理含有病毒顆粒的上清液， c.   濃縮病毒顆粒 d.   純化病毒顆粒，以及 e.   a-d的任何組合， 視情況，其中病毒顆粒是自互補腺相關病毒顆粒及/或從培養物上清液分離。 具體例133. 一種依據具體例130-132中任一項之方法製造的AAV顆粒。 具體例134. 如具體例1-40、72，114和133中任一項的AAV顆粒，其進一步包含感興趣核苷酸。 具體例135. 如具體例134之AAV顆粒，其中感興趣核苷酸是報導子基因。 具體例136. 如具體例135之AAV顆粒，其中報導子基因編碼β-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白(GFP)、增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、MmGFP、藍色螢光蛋白(BFP)、增強型藍色螢光蛋白(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黃色螢光蛋白(YFP)、增強型黃色螢光蛋白(eYFP)、祖母綠、CyPet、青色螢光蛋白(CFP)、天藍、T-藍寶石、螢光素酶、鹼性磷酸酶或其組合。 具體例137. 如具體例134之AAV顆粒，其中感興趣核苷酸編碼治療性蛋白、自殺基因、抗體或其片段、CRISPR/Cas系統或其一部分、反義寡核苷酸、核酶、RNAi分子或shRNA分子。 具體例138. 一種醫藥組合物，包含(a)如具體例1-40、72、114和133中任一項之AAV顆粒，包含如具體例41-71和113中任一項之AAV衣殼蛋白的AAV顆粒，或如具體例130-132中任一項方法製得的AAV顆粒，以及(b)醫藥上可接受的載劑或賦形劑。 具體例139. 一種將感興趣核苷酸遞送至目標細胞的方法，該方法包含使目標細胞與(a)如具體例1-40、72，114和133中任一項之AAV顆粒接觸，或(b)使目標細胞與如具體例138之組合物接觸。 具體例140. 如具體例139之方法，其中該AAV顆粒的衣殼包含特異地結合在目標細胞表面上表現之蛋白質的靶向配體。 具體例141. 如具體例139或具體例140之方法，其中接觸是離體進行。 具體例142. 如具體例139或具體例140之方法，其中目標細胞是在個體體內。 具體例143. 如具體例142之方法，其中個體是人類。 具體例144. 如具體例139-143中任一項之方法，其中目標細胞是人類細胞。 具體例145. 如具體例139-144中任一項之方法，其中感興趣核苷酸編碼治療性蛋白、自殺基因、抗體或其片段、CRISPR/Cas系統或其一部分、反義寡核苷酸、核酶，RNAi分子或shRNA分子。 表2
Figure 02_image001
表2-續
Figure 02_image003
表2-續
Figure 02_image005
表2-續
Figure 02_image007
表2-續
Figure 02_image009
實例
提供以下實例僅用於說明性目的，而不是要限制本發明的範疇。
材料與方法
細胞株和抗體
將所有293細胞株和293T細胞株維持在補充有10% FBS，1% Pen/Strep和1% L-麩醯胺酸的DMEM中。293 hErbB2和293hASGR1/2細胞株是藉由用表現對應cDNA的顆粒來進行親本293細胞的慢病毒轉導而產生。所有細胞株均從Regeneron TC核心設施獲得。B1抗體識別AAV VP1，VP2和VP3共有的線性表位。
AAV衣殼蛋白建構物
編碼所需AAV衣殼序列的GeneBlock或用於所需AAV衣殼序列之聚合酶鏈反應擴增的引子(包括SpyTag插入物、側翼連接子胺基酸和其他點突變)是購自IDT，並根據製造商的程序(NEB)使用Gibson Assembly選殖到pAAV R2C2中。
SpyCatcher融合至抗體
編碼SpyCatcher的GeneBlock是購自IDT，而Gibson Assembly在每個建構物C端處用於將編碼序列符合讀框地選殖到抗體重鏈的表現質體中，並被一個撓性胺基酸連接子GSGESG (SEQ ID NO：49)隔開。
製備AAV病毒顆粒
使用以下質體，利用PEI Pro或PEI Max藉由轉染293T包裝細胞來產生病毒：pAd Helper，含有AAV2 ITR的編碼報導子蛋白的基因體質體，以及編碼AAV Rep和Cap基因的pAAV-CAP質體，連同或不連同編碼scFv或抗體重鏈和輕鏈的其他質體。如上所述，scFv和抗體重鏈建構物均在其C端處融合至SpyCatcher。轉染在OptiMEM中進行，且在8小時後將培養基更換為補充有10% FBS、1% Pen/Strep和1% L-Glut的DMEM。轉染後，在未更換培養基的情況下，在150 mM NaCl中進行了另一種轉染程序。
將經轉染的包裝細胞在37℃下培育3天，然後使用標準的凍融程序從細胞溶解產物中收集病毒。簡言之，透過刮取和抽吸來吸移包裝細胞。移除上清液，並將細胞重新懸浮於50mM Tris-HCl；150mM氯化鈉；和2 mM MgCl2 [pH 8.0]或25mM Tris-HCl；100mM NaCl；1mM MgCl2 ；2.5mM KCl；0.001% Pluronic F68 [pH 7.4]的溶液中。經由三個連續的凍融循環，藉由誘導細胞溶解來釋放細胞內病毒顆粒，凍融循環包括在乾冰/乙醇浴和37℃水浴之間穿梭細胞懸浮液並劇烈渦旋。在37℃下用EMD Millipore Benzonase (50 U/ml細胞溶解產物)處理溶解產物60分鐘同時偶爾混合來降低黏度。然後透過離心沉澱碎片，並將所得上清液進行處理，以製備粗溶解產物製品或進一步用於碘克沙醇(iodixanol)梯度純化。關於粗溶解產物製品，使上清液通過0.22 µm PVDF Millex-GV過濾器過濾，直接到帶有Ultracel-100膜(100 KDa MWCO)濾筒的Amicon Ultra-15離心過濾器單元的上腔室中。以5-10分鐘的間隔離心過濾器單元，直到在上腔室中達到所需的體積，然後將濃縮的粗製病毒吸移到低蛋白結合管中並保存在4℃下。為了進行碘克沙醇梯度純化，將溶解產物通過0.2 µm PES Nalgene Rapid-Flow過濾器過濾。藉由切向流過濾和用補充有0.001% Pluronic F-68的1xPBS透濾分別濃縮含有AAV的培養基。將澄清的溶解產物或濃縮培養基加載到不連續碘克沙醇梯度，並使用SW 32 Ti轉子在10℃下以29,600 rpm離心16至18小時。從40%和60%碘克沙醇溶液之間的界面上除去病毒級分，並使用標稱分子量極限為100 KDa的Amicon Ultra離心過濾器交換至補充有0.001% Pluronic F-68的1xPBS中。使用已知濃度病毒的標準曲線，藉由qPCR來確定效價(每毫升載體基因體vg/mL)。
細胞感染/轉導以及流式細胞計數/發光分析
為了感染細胞，將病毒顆粒直接加入培養中的細胞培養基內，並將混合物在37℃下培育過夜。關於利用粗溶解產物進行轉導，24小時後置換每孔中的培養基，並培育細胞3-5天。為了評估GFP表現，在感染後第3、4或5天，用胰蛋白酶消化細胞，將其再懸浮於含2% FBS的PBS中，並在BD FACSCanto流式細胞儀上收集GFP+細胞的百分比，且使用FlowJo軟體進行分析。為了評估NanoLuc表現，在感染後第2天或第3天，將細胞溶解於1x被動裂解緩衝液(Promega)中，並與Nano-Glo螢光素酶分析試劑一起培育。使用SpectraMax讀盤器評估發光。
在IgG存在下的中和分析
病毒顆粒與濃度遞增之製備於PBS中的經純化人類IgG混合，並將病毒顆粒和IgG的混合物在37℃下培育30分鐘以使其結合。為了感染細胞，將病毒顆粒直接添加到培養中的細胞培養基，並將混合物在37℃下培育2天。在感染後第2天，使用Nanoglo螢光素酶分析(Promega)測量Nanoluc表現，並在讀盤儀(PerkinElmer)上收集RLU數據。
西方墨點分析
藉由西方墨點分析監測經SpyTag標籤AAV蛋白VP1、VP2和VP3與經SpyCatcher標籤抗體或scFv之間的反應。將具有還原劑的Novex® Tris-甘胺酸SDS樣品緩衝液添加到等體積的粗病毒製品中，並將樣品加熱至85℃歷時5分鐘，然後冷卻至室溫，並加載到預鑄的4-12% Tris-甘胺酸凝膠(Invitrogen)中。藉由還原型SDS-PAGE分離蛋白質，並經由濕轉移將其印漬到PVDF上。將膜用5%奶阻斷，並用在TBST中以1：100稀釋的小鼠單株B1抗體(ARP American Research Products, Inc.)在4℃下探測過夜。墨點在TBST中洗滌，用抗小鼠HRP偶聯抗體探測，並在Bio-Rad ChemiDoc MP成像儀上使用化學發光偵測試劑進行偵測。
蛋白質染色分析
藉由SDS-PAGE凝膠的蛋白質染色分析來監測AAV蛋白VP1、VP2和VP3的相對表現。根據製造商的說明書，使用NuPAGE LDS樣品緩衝液和還原劑(Invitrogen)製備AAV樣品。將樣品加熱到95℃持續10分鐘，然後冷卻到室溫並加載到預鑄的4-12% NuPAGE Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上。分離蛋白質後，將凝膠在50%甲醇；7%乙酸中固定，於SYPRO Ruby凝膠染料(Invitrogen)中染色，並在10%甲醇；7%乙酸中洗滌。在Bio-Rad ChemiDoc MP成像儀上取得凝膠影像。
實例1. 非靈長類AAV嵌合顆粒可被製造並且經由親和力層析純化
如上所述，藉由用以下質體和數量轉染一個15 cm盤的293T包裝細胞來產生各種病毒： pAd Helper                                                            8µg pAAV-UbC-螢火蟲螢光素酶                               4µg pRep Cap質體構築體                                            4µg Rep Cap質體構築體包括： pRep2 Cap AAV2 VP1 AAAV VP2 VP3 pRep2 Cap AAV2 VP1 海獅VP2 VP3 pRep2 Cap AAV2 VP1 髭頰蜥VP2 VP3
接著經由親和力層析純化粗病毒製品，並透過西方墨點評估存在於輸入，流通(FT)和溶離份中的衣殼蛋白(圖2)。來自所有三種病毒的衣殼蛋白均存在於層析管柱輸入中，其在流通時減少，並存在於溶離份中，暗示用於純化靈長類衍生衣殼(諸如AAV2)的親和力管柱方法也可用於非靈長類AAV的純化。
在以下每個實例中，pRep2 Cap AAV2 VP1 AAAV VP2 VP3質體(包含AAV2的rep 基因和嵌合cap 基因，嵌合cap 基因編碼含有與AAAV的VP1/VP2共有區可操作地連接的AAV2的VP1-u區的嵌合VP1衣殼蛋白，AAAV VP2衣殼蛋白，以及AAAV VP3衣殼蛋白)用「pAAV R2Cap AAV2/AAAV」表示。pRep2 Cap AAV2 VP1海獅VP2 VP3質體(包含AAV2的rep 基因和嵌合cap 基因，嵌合cap 基因編碼含有與海獅AAV的VP1/VP2共有區可操作地連接的AAV2的VP1-u區的嵌合VP1衣殼蛋白，海獅VP2衣殼蛋白，以及海獅VP3衣殼蛋白)用「pAAV R2Cap AAV2/海獅」表示。pRep2 Cap AAV2 VP1髭頰蜥VP2 VP3質體(包含AAV2的rep 基因和嵌合cap 基因，嵌合cap 基因編碼含有與髭頰蜥AAV的VP1/VP2共有區可操作地連接的AAV2的VP1-u區的嵌合VP1衣殼蛋白，髭頰蜥VP2衣殼蛋白，以及髭頰蜥VP3衣殼蛋白)用「pAAV R2Cap AAV2/髭頰蜥」表示。
實例2. 將肽插入禽類AAV衣殼的VP3區中是耐受良好的，並且可以經由SpyCatcher-SpyTag媒介抗體共價附接至病毒顆粒
使用PyMol建模預測了禽類AAV的推定可變環IV和可變環VIII內的可能肽插入位點(圖3A)，並選殖出對應的SpyTag插入建構物。如上所述，每種病毒是利用以下質體和數量轉染一個15 cm盤的293T包裝細胞而產生： pAd Helper                                                            16µg pAAV-CAG-GFP                                                  8µg pAAV R2CapX                                                     8µg pAAV R2CapX建構物包括： pAAV R2Cap AAV2/AAAV無SpyTag pAAV R2Cap AAV2/AAAV G444 連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580 連接子6 SpyTag 或 pAd Helper                                                             16µg pAAV-CAG-GFP                                                   8µg pAAV R2Cap AAV2/AAAV無SpyTag                 6.7ug 連同 pAAV R2Cap AAV2/AAAV G444 連接子6 SpyTag    1.3µg 或 pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580 連接子6 SpyTag    1.3µg
缺乏SpyTag插入的嵌合AAV2/AAAV顆粒，以及在如上列出衣殼中的不同位置處帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/AAAV顆粒與含有ITR2的AAV基因體一起包裝。為了了解是否可以成功地形成嵌合AAV2/AAAV衣殼並與含有AAV2 ITR的基因體包裝在一起，進行了定量PCR來測量帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/AAAV顆粒的效價(每毫升的基因體數或vg/mL)相對於缺少SpyTag插入的嵌合AAV2/AAAV顆粒的效價(圖3B)。測得的效價證明，嵌合AAV2/AAAV顆粒可以與AAV2 ITR基因體一起包裝。缺乏SpyTag插入的嵌合AAV2/AAAV顆粒和帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/AAAV顆粒之間的嵌合AAV2/AAAV顆粒的效價相似。
接下來，在有與沒有結合至ASGR1之經SpyCatcher標籤抗體的情況下，缺乏SpyTag插入的嵌合AAV2/AAAV顆粒和帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/AAAV顆粒。藉由西方墨點監測經SpyTag標籤嵌合AAV2/AAAV蛋白VP1，VP2和VP3與經SpyCatcher標籤抗ASGR1重鏈之間的反應；依據SDS-PAGE，與經SpyCatcher標籤抗體反應的經SpyTag標籤衣殼顯示大小增加。在經SpyCatcher標籤抗ASGR1 mAb存在的情況下，與單獨經SpyTag標籤AAAV衣殼蛋白相比，經SpyTag標籤嵌合AAV2/AAAV衣殼蛋白的表觀大小有所增加(圖3C)。這表明經SpyTag標籤嵌合AAV2/AAAV顆粒能夠與經SpyCatcher標籤抗ASGR1 mAb成功形成共價鍵。
實例3. 將肽插入海獅AAV衣殼的VP3區中是耐受良好的，並且可以經由SpyCatcher-SpyTag媒介抗體共價附接至病毒顆粒
使用PyMol建模預測了海獅AAV的推定可變環IV和可變環VIII內的可能肽插入位點(圖4A)，並選殖出對應的SpyTag插入建構物。如上所述，每種病毒是利用以下質體和數量轉染一個15 cm盤的293T包裝細胞而產生： pAd Helper                                                     8µg pAAV-CAG-GFP                                           4µg pAAV R2CapX                                              4µg pAAV R2CapX建構物包括： pAAV R2Cap AAV2/海獅無SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅 N429連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅 P430連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅 T431連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅 G432連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅 S433連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅 T434連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅 R436連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅 D437連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅 A565連接子6 SpyTag 或 pAd Helper                                                     8µg pAAV-CMV-GFP                                          4µg pAAV R2Cap AAV2/海獅無SpyTa                3.3ug 連同 pAAV R2Cap AAV2/海獅G432連接子6 SpyTag     0.7µg 或 pAAV R2Cap AAV2/海獅A565連接子6 SpyTag     0.7µg
缺乏SpyTag插入的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒，以及在如上列出衣殼中的不同位置處帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒與含有ITR2的AAV基因體一起包裝。為了了解是否可以成功地形成嵌合AAV2/海獅AAV衣殼並與含有AAV2 ITR的基因體包裝在一起，進行了定量PCR來測量帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒的效價(每毫升基因體數或vg/mL)相對於缺少SpyTag插入的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒的效價(圖4B，5A)。測得的效價證明，缺乏SpyTag插入的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒可以與AAV2 ITR基因體一起包裝。缺乏SpyTag的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒和在位置N429、P430、T431、G432、S433、R436與D437帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒之間的效價相似，但嵌合AAV2/海獅AAV顆粒對在位置T434或位置A565中的SpyTag插入的耐受不佳且產生的效價不足。
接下來，在有和沒有結合至HER2之經SpyCatcher標籤抗體的情況下，培育缺乏SpyTag的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒和帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒。藉由西方墨點偵測經SpyTag標籤嵌合AAV2/海獅AAV蛋白VP1、VP2和VP3與經SpyCatcher標籤抗HER2重鏈之間的反應；依據SDS-PAGE，與經SpyCatcher標籤抗體反應的經SpyTag標籤衣殼蛋白顯示大小增加。在經SpyCatcher標籤抗HER2 mAb存在的情況下，與單獨經SpyTag標籤嵌合AAV2/海獅AAV衣殼蛋白相比，所有可偵測到的經SpyTag標籤嵌合AAV2/海獅AAV衣殼蛋白的表觀大小均有所增加(圖4C，5B)。這表明經SpyTag標籤嵌合AAV2/海獅AAV顆粒能夠與經SpyCatcher標籤抗HER2 mAb成功形成共價鍵。測量到效價低的經SpyTag標籤嵌合AAV2/海獅AAV顆粒(在T434和A565處有SpyTag插入)在西方墨點上沒有任何可偵測到的蛋白質(圖4C，5B)。
實例4. 將肽插入髭頰蜥AAV衣殼的VP3區中是耐受良好的，並且可以經由SpyCatcher-SpyTag媒介抗體共價附接至病毒顆粒
使用PyMol建模預測了禽類AAV的推定可變環IV和可變環VIII內的可能肽插入位點(圖6A)，並選殖出對應的SpyTag插入建構物。如上所述，每種病毒是利用以下質體和數量轉染一個15 cm盤的293T包裝細胞而產生： pAd Helper                                                            8µg pAAV-CMV-GFP                                                 4µg pAAV R2CapX                                                     4µg pAAV R2CapX建構物包括： pAAV R2Cap AAV2/髭頰蜥無SpyTag pAAV R2Cap AAV2/髭頰蜥G436連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/髭頰蜥T573連接子6 SpyTag 或 pAd Helper                                                                   8µg pAAV-CMV-GFP                                                        4µg pAAV R2Cap AAV2/髭頰蜥無SpyTag                      3.3ug 連同 pAAV R2Cap AAV2/髭頰蜥G436連接子6 SpyTag   0.7µg 或 pAAV R2Cap AAV2/髭頰蜥T573連接子6 SpyTag    0.7µg
缺乏SpyTag插入的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒，以及在如上列出衣殼中的不同位置處帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒與含有ITR2的AAV基因體一起包裝。為了了解是否可以成功地形成嵌合AAV2/髭頰蜥AAV衣殼並與含有AAV2 ITR的基因體包裝在一起，進行了定量PCR來測量帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒的效價(每毫升的基因體數或vg/mL)相對於缺乏SpyTag的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒的效價(圖6B)。測得的效價證明，嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒可以與AAV2 ITR基因體一起包裝。帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒的效價小於缺乏SpyTag的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒的效價。
接下來，在有和沒有結合至HER2之經SpyCatcher標籤抗體的情況下，培育缺乏SpyTag的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒和帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒。藉由西方墨點偵測經SpyTag標籤嵌合AAV2/髭頰蜥AAV蛋白VP1、VP2和VP3與經SpyCatcher標籤抗HER2重鏈之間的反應；依據SDS-PAGE，與經SpyCatcher標籤抗體反應的經SpyTag標籤衣殼蛋白顯示大小增加。在經SpyCatcher標籤抗HER2 mAb存在的情況下，與單獨經SpyTag標籤嵌合AAV2/髭頰蜥AAV衣殼蛋白相比，經SpyTag標籤嵌合AAV2/髭頰蜥AAV衣殼蛋白的表觀大小均有所增加(圖6C)。這表明經SpyTag標籤嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒能夠與經SpyCatcher標籤抗HER2 mAb成功形成共價鍵。
實例5.    抗體結合至在殘基G444或K580處被插入禽類AAV衣殼之肽在活體外指導抗原特異性靶定
如上所述，每種病毒是利用以下質體和數量轉染一個15 cm盤的293T包裝細胞而產生： pAd Helper                                                            16µg pAAV-CAG-GFP                                                  8µg pAAV R2CapX                                                     8µg pAAV R2CapX建構物包括 pAAV R2Cap AAV2/AAAV無SpyTag pAAV R2Cap AAV2/AAAV G444連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580連接子6 SpyTag 有或沒有 SpyCatcher-融合Vh重鏈質體                               1.5µg Vk輕鏈質體                                                          3µg
在編碼SpyCatcher-抗GLP1R(一種結合至GLP1R並在重鏈C端處融合至SpyCatcher的抗體)、SpyCatcher-賀癌平(一種結合HER2並在重鏈C端處融合至SpyCatcher的抗體)，或SpyCatcher-抗ASGR1 (一種結合ASGR1並在重鏈C端處融合至SpyCatcher的抗體)的抗體重鏈和輕鏈存在或不存在的情況下，生產缺乏SpyTag的嵌合AAV2/禽類AAV顆粒，以及在如上列出衣殼中的不同位置處帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/禽類AAV顆粒。藉由流式細胞計數分析評估如上所述被病毒顆粒感染的細胞以監測轉導。結合至HER2-靶向抗體的嵌合AAV2/AAAV特異地感染HER2+細胞，(圖7A)，而結合至對照非靶向抗GLP1R抗體的嵌合AAV2/AAAV顯示在任一種細胞類型中有少許背景感染(圖7A，7B)。結合至ASGR1靶向抗體的嵌合AAV2/AAAV特異地感染ASGR1+細胞，而ASGR1-細胞展現出少許背景感染(圖7B)。
實例6.    抗體結合至在殘基G432處被插入海獅AAV衣殼之肽在活體外指導抗原特異性靶定
如上所述，每種病毒是利用以下質體和數量轉染一個15 cm盤的293T包裝細胞而產生： pAd Helper                                                            16µg pAAV-CAG-GFP                                                  8µg pAAV R2Cap AAV2/海獅無SpyTag                    8ug 或 pAd Helper                                                            16µg pAAV-CAG-GFP                                                  8µg pAAV R2Cap AAV2/海獅無SpyTag                    4ug 連同 pAAV R2CapX                                     4ug pAAV R2CapX建構物包括： pAAV R2Cap AAV2/海獅N429連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅P430連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅T431連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅G432連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅S433連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅R436連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅D437連接子6 SpyTag 有或沒有 SpyCatcher-融合Vh重鏈質體                        1.5µg Vk輕鏈質體                                                   3µg
在編碼SpyCatcher-抗GLP1R (一種結合GLP1R並在重鏈C端處融合至SpyCatcher的抗體)、SpyCatcher-賀癌平(一種結合HER2並在重鏈C端處融合至SpyCatcher的抗體)，或SpyCatcher-抗ASGR1 (一種結合ASGR1並在重鏈C端處融合至SpyCatcher的抗體)的抗體重鏈和輕鏈存在或不存在的情況下，生產缺乏SpyTag的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒，以及在如上列出衣殼中的位置G432處帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒。藉由流式細胞計數分析評估如上所述被病毒顆粒感染的細胞以監測轉導。在G432處帶有SpyTag並結合至HER2-靶向抗體的嵌合AAV2/海獅AAV特異地感染HER2+細胞，而HER2-細胞展現出少許背景感染(圖8A)，同時結合至對照非靶向抗GLP1R抗體的嵌合AAV2/AAAV顯示在任一種細胞類型中有少許背景感染(圖8A，8B)。在G432處帶有SpyTag且結合至ASGR1靶向抗體的嵌合AAV2/海獅AAV特異地感染ASGR1+細胞，而ASGR1-細胞展現出少許背景感染(圖8B)。
在編碼SpyCatcher-賀癌平(一種結合HER2並在重鏈C端處融合至SpyCatcher的抗體)的抗體重鏈和輕鏈存在或不存在的情況下，生產缺乏SpyTag的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒，以及在如上列出衣殼之預測可變環4中的不同位置處帶有SpyTag插入的一組嵌合AAV2/海獅AAV顆粒。藉由流式細胞計數分析評估如上所述被病毒顆粒感染的細胞以監測轉導。在衣殼內之許多不同位置處帶有SpyTag插入並結合至HER2靶向抗體的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒特異地感染HER2+細胞，而沒有SpyTag的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒展現出少許HER2+細胞背景感染(圖9)。這暗示著，嵌合AAV2/海獅AAV衣殼內的多個位點適於SpyTag插入並使用SpyCatcher-融合抗體方法進行重靶向。
實例7.    抗體結合至在殘基G436或T573處被插入髭頰蜥AAV衣殼之肽在活體外指導抗原特異性靶定
如上所述，每種病毒是利用以下質體和數量轉染一個15 cm盤的293T包裝細胞而產生： pAd Helper                                                     8µg pAAV-CMV-GFP                                          4µg pAAV R2CapX                                              4µg pAAV R2CapX建構物包括： pAAV R2Cap AAV2/髭頰蜥無SpyTag pAAV R2Cap AAV2/髭頰蜥G436連接子6 SpyTag pAAV R2Cap AAV2/髭頰蜥T573連接子6 SpyTag 或 pAd Helper                                                            8µg pAAV-CMV-GFP                                                 4µg pAAV R2Cap AAV2髭頰蜥無SpyTag                 3.4ug 連同 pAAV R2Cap AAV2/髭頰蜥G436連接子6 SpyTag       0.6µg 或 pAAV R2Cap AAV2/髭頰蜥T573連接子6 SpyTag        0.6µg 有或沒有 SpyCatcher-融合Vh重鏈質體                               1.5µg Vk輕鏈質體                                                          3ug
在編碼SpyCatcher-賀癌平(一種結合HER2並在重鏈C端處融合至SpyCatcher的抗體)或SpyCatcher-抗ASGR1 (一種結合ASGR1並在重鏈C端處融合至SpyCatcher的抗體)的抗體重鏈和輕鏈存在或不存在的情況下，生產缺乏SpyTag的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒，以及在如上列出衣殼中的不同位置處帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒。藉由流式細胞計數分析評估如上所述被病毒顆粒感染的細胞以監測轉導。結合至HER2-靶向抗體的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV特異地感染HER2+細胞(圖10A)。結合至ASGR1靶向抗體的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV特異地感染ASGR1+細胞，而ASGR1-細胞展現出少許背景感染(圖10B)。
實例8. 結合抗體的禽類AAV與海獅AAV在更高含量之經純化人類免疫球蛋白存在下比AAV2更可以感染細胞
為了探查嵌合AAV2/AAAV和嵌合AAV2/海獅AAV顆粒受到人類血清中發現的抗體中和的敏感性，我們進行了中和分析，其中將AAV顆粒與從數十至數千位人類捐贈者的匯集血清樣品製備而來的數量遞增的IgG (hIgG)一起培育，該數十至數千位人類捐贈者的匯集血清樣品代表了人類群體中免疫球蛋白剖面。
如上所述，每種病毒是利用以下質體和數量轉染一個15 cm盤的293T包裝細胞而產生： pAd Helper                                                            16µg pAAV-CMV-Nanoluc                                                   8µg p抗-hASGR1 SpyCatcher Vh                                       3µg p抗-hASGR1 Vk                                                          6µg 連同： pAAV R2C2 N587 Myc                                               7.5µg pAAV R2C2 G453連接子10 SpyTag                           0.5µg 或： pAAV R2Cap AAV2/AAAV無SpyTag                       5µg pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580連接子6 SpyTag  3µg 或： pAAV R2Cap AAV2/海獅無SpyTag                          5µg pAAV R2Cap AAV2/海獅G432連接子10 SpyTag     3µg
在編碼SpyCatcher-抗ASGR1 (一種結合hASGR1並在重鏈C端處融合至SpyCatcher的抗體)的抗體重鏈和輕鏈存在下，生產拼合AAV2，在如上列出衣殼內帶有SpyTag插入的拼合嵌合AAV2/AAAV顆粒以及在如上列出衣殼內帶有SpyTag插入的拼合嵌合AAV2/海獅AAV顆粒。然後將顆粒在濃度遞增的hIgG存在下於37℃下培育30分鐘，接著將病毒顆粒和hIgG的混合物加入表現hASGR1的細胞中。藉由Nanoglo螢光素酶分析評估如上所述被病毒顆粒所感染的細胞以監測轉導。
圖11A顯示在所指示的hIgG濃度存在下，經所指示病毒顆粒感染之ASGR1+細胞的原始Nanoluc螢光素酶活性。與結合至抗ASGR1抗體的拼合AAV2顆粒相比，需要更高量的hIgG才能抑制結合至抗ASGR1抗體的拼合嵌合AAV2/AAAV顆粒的感染，並且甚至需要更高量的hIgG來抑制結合至抗ASGR1抗體的拼合嵌合AAV2/海獅AAV顆粒的感染。針對每個AAV血清型，圖11B顯示經僅PBS條件(無hIgG)常規化之圖11A的Nanoluc螢光素酶數據，以便直接比較彼此三種AAV血清型。需要更高濃度的hIgG才能降低結合至抗ASGR1抗體的拼合嵌合AAV2/AAAV顆粒和結合至抗ASGR1抗體的拼合嵌合AAV2/海獅AAV顆粒的Nanoluc螢光素酶表現。就兩個獨立的實驗來說，抑制感染達50% (IC50值)所需的每孔hIgG濃度顯示於圖11C中。結合至抗ASGR1抗體的拼合嵌合AAV2/AAAV顆粒的hIgG IC50值和結合至抗ASGR1抗體的拼合嵌合AAV2/海獅AAV顆粒的hIgG IC50值比結合至抗ASGR1抗體的拼合AAV2顆粒的hIgG IC50值高出更多。尤其是，拼合嵌合AAV2/海獅AAV顆粒似乎在所有hIgG測試濃度下(除了最高濃度以外)都不受人類抗體所影響。
實例9.    禽類AAV可以在活體內重靶向至ASGR1
為了確定結合至對ASGR1具特異性之抗體的病毒顆粒是否能夠在活體內重靶向至表現hASGR1的肝臟細胞，經過遺傳修飾以使其肝臟細胞在C57BL/6背景上表現hASGR1的小鼠被靜脈內注射帶有螢火蟲螢光素酶報導子基因並經由SpyCatcher-SpyTag結合至對hASGR1具特異性的抗體，或靶向人類GLP1R的對照抗體的拼合嵌合AAV2/AAAV病毒顆粒。注射磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)的小鼠用作額外對照。
如上所述，每種病毒是利用以下質體和數量轉染一個15 cm盤的293T包裝細胞而產生： 禽類AAV抗人類GLP1R/抗人類ASGR1螢光素酶 pAd Helper                                                                  16µg pAAV-UbC-螢火蟲螢光素酶                                     8µg pAAV R2Cap AAV2/AAAV無SpyTag                       5µg pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580連接子SpyTag     3µg 有或沒有 p抗-hGLP1R或抗-hASGR1 SpyCatcher Vh                2.5µg p抗-hGLP1R或抗-hASGR1 Vk                                   5µg
圖12顯示動物在注射PBS或拼合嵌合AAV2/AAAV病毒顆粒(如上文所述結合至靶向hASGR1的抗體或靶向hGLP1R的抗體作為非靶向對照)後33天的發光。使用異氟烷麻醉活體動物，注射螢光素受質，並在10分鐘後使用IVIS Spectrum活體內成像系統(PerkinElmer)進行成像。圖12A顯示，使用拼合嵌合AAV2/AAAV-SpyTag-SpyCatcher-Vh複合物進行感染僅在注射有hASGR1-重靶向拼合嵌合AAV2/AAAV之表現hASGR1小鼠的肝臟內偵測到，而在注射PBS或對照非靶向hGLP1R重靶向拼合嵌合AAV2/AAAV之表現hASGR1的小鼠的肝臟中並未偵測到。在圖12B中使用IVIS Spectrum活體內成像系統(PerkinElmer)對從活體小鼠偵測到的螢火蟲螢光素酶信號的平均輻射量進行定量，並且在圖12C中在解剖受感染小鼠後對個別器官進行離體成像的平均輻射量加以定量。這些圖證明，拼合嵌合AAV2/AAAV僅在結合至hASGR1特異性抗體時才能特異地轉導表現hASGR1的小鼠的肝臟。
實例10. 海獅AAV在活體外轉導小鼠的肝臟與肺臟
為了確定結合至對ASGR1具特異性之抗體的病毒顆粒是否能夠在活體內重靶向到表現hASGR1的肝臟細胞，經過遺傳修飾以使其肝臟細胞在C57BL/6背景上表現hASGR1的小鼠被靜脈內注射帶有螢火蟲螢光素酶報導子基因並經由SpyCatcher-SpyTag結合至對hASGR1具特異性的抗體，或靶向人類GLP1R的對照抗體的拼合嵌合AAV2/海獅AAV病毒顆粒。注射磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)的小鼠用作額外對照。
如上所述，每種病毒是利用以下質體和數量轉染一個15 cm盤的293T包裝細胞而產生： 海獅AAV抗-人類GLP1R/抗-人類ASGR1螢光素酶 pAd Helper                                                                   16µg pAAV-UbC-螢火蟲螢光素酶                                      8µg pAAV R2Cap AAV2/海獅無SpyTag                          5µg pAAV R2Cap AAV2/海獅G432連接子10 SpyTag     3ug 有或沒有 p抗-hGLP1R或抗-hASGR1 SpyCatcher Vh                2.5µg p抗-hGLP1R或抗-hASGR1 Vk                                   5µg
圖13顯示了動物在注射PBS或拼合嵌合AAV2/海獅AAV病毒顆粒(如上文所述結合至靶向hASGR1的抗體或靶向hGLP1R的抗體作為非靶向對照) 後33天的發光。使用異氟烷麻醉活體動物，注射螢光素受質，並在10分鐘後使用IVIS Spectrum活體內成像系統(PerkinElmer)進行成像。圖13A顯示，使用拼合嵌合AAV2/海獅AAV-SpyTag-SpyCatcher-Vh複合物進行感染在注射有hASGR1-重靶向嵌合AAV2/海獅AAV以及對照非靶向hGLP1R重靶向拼合嵌合AAV2/海獅AAV之表現hASGR1小鼠中均偵測到。這暗示著，嵌合AAV/海獅AAV2能夠自然轉導小鼠肝臟與其他器官，不需要重靶向抗體協助。在圖13B中使用IVIS Spectrum活體內成像系統(PerkinElmer)對從活體小鼠偵測到的螢火蟲螢光素酶信號的平均輻射量進行定量，並且在圖13C中在解剖受感染小鼠後對個別器官進行離體成像的平均輻射量加以定量。這些圖證明，拼合嵌合AAV2/海獅AAV在結合至hASGR1特異性抗體或非靶向對照hGLP1R特異性對照抗體時轉導表現hASGR1的小鼠的肝臟以及肺臟。
實例11. 嵌合AAV2/海獅AAV在小鼠內耳中展現某些天然向性
如上所述，每種病毒是利用以下質體和數量轉染一個15 cm盤的293T包裝細胞而產生： pAd Helper                                                     16µg pAAV-CAG-GFP                                           8µg pAAV R2Cap AAV2/海獅無SpyTag             8µg
為了確定嵌合AAV2/海獅AAV對小鼠體內的特定組織是否具有天然向性，從新生小鼠中解剖柯蒂氏器、離體培養，然後使用AAV2/海獅AAV病毒顆粒感染培養物。感染後三天，用Myo7a將耳蝸毛細胞染成紅色，表現GFP的病毒作為轉導標記。觀察到多種細胞類型有穩健轉導(圖14)，暗示嵌合AAV2/海獅AAV顆粒能夠自然轉導內耳。
實例12.  用海獅AAV的同源序列部分或完全置換嵌合AAV2/海獅AAV衣殼的B1表位的耐受良好且提高轉導效率。
在AAV2/海獅嵌合體的表位B1 (圖15A)內進行修飾，且B1表位序列在Y730處或從I705到H712被同源海獅衣殼序列置換。如上所述，每種病毒是每盤利用以下質體和數量轉染五個、十個或二十個15 cm盤的HEK 293T包裝細胞而產生： pAd Helper                                                            12µg pAAV-CMV-X                                                            6µg pAAV-CMV-X建構物包括： pAAV-CMV-NanoLuc螢光素酶 pAAV-CMV-螢火蟲螢光素酶 pAAV R2CapX                                                     10µg pAAV R2CapX建構物包括： pAAV R2Cap AAV2/海獅AAV無SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅AAV無SpyTag/Y730F pAAV R2Cap AAV2/海獅AAV無SpyTag/無B1
將如上文所述缺乏SpyTag插入並在衣殼內包含B1表位序列修飾的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒與含ITR2的AAV基因體包裝在一起。為了了解是否可以成功形成帶有經修飾B1表位的嵌合AAV2/海獅衣殼並與含有AAV2 ITR的基因體包裝在一起，相對於具有B1表位修飾的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒，進行定量PCR以測定具有B1表位的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒的效價(每毫升載體基因體數量或vg/mL)(圖15B)。測得的效價證實，具有B1表位修飾的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒可以與AAV2 ITR基因體一起包裝。在有或沒有B1表位修飾的情況下，嵌合AAV2/海獅顆粒之間的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒的效價相似。
VP1、VP2和VP3被組裝至帶有經修飾B1表位的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒中的存在，我們是藉由SDS-PAGE和蛋白質染色來監測。結果指明，相對於VP2和VP3，VP1在AAV2/海獅AAV病毒顆粒(其中B1表位已經被同源海獅AAV衣殼序列完全置換)中表現的比例比在AAV2/海獅AAV病毒顆粒(帶有B1表位或在B1表位中有Y730F突變)中表現的比例還大(圖15C)。這個觀察結果與在如由NanoLuc螢光素酶活性測定HEK 293T細胞的轉導效率增加相關聯(圖15D)。
為了確定帶有B1表位被AAV海獅序列完全置換的AAV2/海獅AAV顆粒的轉導效率增加是否會在活體內再現，向C57BL/6小鼠靜脈內注射帶有螢火蟲螢光素酶報導子基因的嵌合AAV2/海獅顆粒。注射磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)的小鼠用作額外對照。
圖16顯示如上所述動物用PBS或嵌合AAV2/海獅病毒顆粒注射後34天的發光數據。使用異氟烷麻醉活體動物，注射螢光素受質，並在10分鐘後使用IVIS Spectrum活體內成像系統(PerkinElmer)進行成像。解剖受感染小鼠後，對各個器官離體成像的平均輻射量進行定量。圖顯示，嵌合AAV2/海獅AAV可以轉導肝臟和肺臟。含有B1表位修飾(其中其完全被同源海獅AAV衣殼序列置換)的AAV2/海獅AAV對心臟具有增長的向性，並且在肝臟和肺臟中的轉導略有增進。
實例13. AAV2和海獅AAV衣殼序列之間嵌合界面的調整或使用完全由AAV海獅組成的衣殼序列具有良好耐受性。
進行修飾來調整AAV2和海獅衣殼序列之間的嵌合界面，以生成轉錄本，其中VP1和VP2特有序列衍生自AAV2或海獅AAV或其組合(圖17)。如上所述，每種病毒是利用以下質體和數量轉染五個、十個或二十個15 cm盤的HEK 293T包裝細胞而產生： pAd Helper                                                            12µg pAAV-CMV-NanoLuc螢光素酶                          6µg pAAV R2CapX                                                     10µg pAAV R2CapX建構物包括： pAAV R2Cap AAV2/海獅AAV無SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅AAV無SpyTag v2 pAAV R2Cap AAV2/海獅AAV無SpyTag v3 pAAV R2Cap AAV2/海獅AAV無SpyTag v4 pAAV R2Cap AAV2/海獅AAV無SpyTag v5
具有如上所述的嵌合AAV2和AAV海獅衣殼序列之間的選擇性界面的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒與含ITR2的AAV基因體包裝在一起。為了了解這些選擇性性嵌合AAV2/海獅衣殼是否可以成功形成並與含有AAV2 ITR的基因體包裝在一起，進行定量PCR來測定純化自溶解產物或上清液的病毒顆粒的效價(每毫升載體基因體數量或vg/mL)(圖18A)。測得的效價證明，具有選擇性嵌合界面的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒可以與AAV2 ITR基因體一起包裝。從溶解產物中純化的嵌合AAV2/海獅顆粒之間的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒的效價相似(除了v3以外)。從培養基中純化的AAV2/海獅AAV無SpyTag v5顆粒的效價略高於從溶解產物中純化的效價。如藉由嵌合AAV2/海獅AAV顆粒的NanoLuc螢光素酶活性測定，在選擇性界面位置之間的HEK 293T細胞轉導效率相當(圖18B與18C)。
B1表位序列被修飾成具有選擇性界面位點的AAV2/海獅嵌合體中的完全同源海獅衣殼序列，以確定B1修飾是否會像對AAV2/海獅AAV無SpyTag所做的那樣以類似方式提高轉導。如上所述，每種病毒是每盤利用以下質體和數量轉染五個、十個或二十個15 cm盤的HEK 293T包裝細胞而產生： pAd Helper                                                            12µg pAAV-CMV-螢火蟲螢光素酶                             6µg pAAV R2CapX                                                     10µg pAAV R2CapX建構物包括： pAAV R2Cap AAV2/海獅AAV無SpyTag pAAV R2Cap AAV2/海獅AAV無SpyTag/無B1 v2 pAAV R2Cap AAV2/海獅AAV無SpyTag/無B1 v3 pAAV R2Cap AAV2/海獅AAV無SpyTag/無B1 v4 pAAV R2Cap AAV2/海獅AAV無SpyTag/無B1 v5
為了確定帶有B1表位被AAV海獅序列完全置換的選擇性嵌合AAV2/海獅AAV顆粒的轉導效率增加是否會導致活體內轉導提高，向C57BL/6小鼠靜脈內注射帶有螢火蟲螢光素酶報導子基因的嵌合AAV2/海獅顆粒。注射磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)的小鼠用作額外對照。
圖18D顯示動物如上所述在注射PBS或嵌合AAV2/海獅病毒顆粒後46天的發光數據。使用異氟烷麻醉活體動物，注射螢光素受質，並在10分鐘後使用IVIS Spectrum活體內成像系統(PerkinElmer)進行成像。解剖受感染小鼠後，對各個器官離體成像的輻射量進行定量。圖顯示，嵌合AAV2/海獅AAV可以轉導肝臟，肺臟和心臟。AAV2/海獅AAV無SpyTag/無B1 v5 (SEQ ID NO：71)轉導組織的能力指出，除了嵌合AAV2/海獅AAV衣殼顆粒外，完全由海獅衣殼(非嵌合衣殼蛋白)組成的AAV衣殼顆粒可以用作基因轉移載體。
儘管已經參考許多具體例特定示出並說明了本發明，但是那些習於技藝者將理解，可以在不偏離本發明的精神與範疇的情況下對本文揭示的各種具體例進行形式和細節上的改變，且本文所揭示的各種具體例並不希望限制申請專利範圍的範疇。儘管類似於或等同於本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料都可以用於實施或測試本發明，但是現在描述一些較佳的方法和材料。本文引用的所有出版物均透過全文引用的方式併入本文作為說明。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技藝中的通常技術人員一般所理解的相同含義。
無
圖1提供了本發明Rep-Cap表現質體的說明性(未按比例)，非限制性和例示性具體例，其可用於產生AAV嵌合病毒顆粒。靈長類AAV序列顯示為空心盒，而非靈長類動物AAV序列以實心盒顯示。僅出於例示性目的，還描繪了例示性非限制性位置(未按比例)以供插入(1)蛋白：蛋白結合對的第一成員，用於指導包含所編碼VP1、VP2和VP3蛋白之組裝衣殼的向性(非靈長類動物AAV的衣殼序列內的實線)，以及(2)可偵測標籤，其用於偵測所編碼VP1、VP2和VP3蛋白(非靈長類動物AAV的衣殼序列內的虛線)。如圖1中所示的Rep-Cap表現質體可用於生產包含感興趣核苷酸的AAV病毒顆粒，該感興趣核苷酸側接靈長類AAV的5'和3'反向末端重複(ITR)序列。
圖2提供了使用B1抗體的西方墨點，B1抗體識別被工程改造至嵌合靈長類/非靈長類動物AAVcap 基因(參見圖1)中的B1表位，以分析所得嵌合靈長類/非靈長類動物AAV VP1蛋白、非靈長類動物AAV VP2蛋白和非靈長類動物AAV VP3蛋白。靈長類AAV為AAV2，而非靈長類動物AAV為(A)禽類AAV，(B)海獅AAV或(C)髭頰蜥AAV。西方墨點分析了在經由親和力層析法純化AAV顆粒的各個步驟期間所收集的蛋白質樣品，包括輸入樣品，流通(FT)份和來自親和力層析管柱的溶離份。
圖3A提供了非限制性的預測禽類AAV VP3條帶結構，強調K580和G444作為蛋白：蛋白結合對之第一成員的非限制性插入位點。圖3B提供了從一組嵌合AAV2/禽類AAV病毒顆粒，或含不具SpyTag的AAV2/禽類AAV顆粒混有在指示位置處帶有SpyTag肽插入的AAV2/禽類AAV顆粒的拼合顆粒的粗製病毒製品中獲得之病毒效價的qPCR定量，該組嵌合AAV2/禽類AAV病毒顆粒在指定位置處沒有SpyTag或包含SpyTag插入。圖3C提供了使用B1抗體的西方墨點，B1抗體識別被工程改造至嵌合AAV2/禽類AAV VP1、VP2與VP3衣殼蛋白中的線性表位，分析和SpyCatcher融合的抗ASGR1抗體「SpyC-抗-ASGR1 mAb」，與一組在指定位置處缺乏或帶有SpyTag插入的嵌合AAV2/禽類AAV病毒顆粒，或含缺乏SpyTag的嵌合AAV2/禽類AAV顆粒混有在指示位置處帶有SpyTag肽插入的嵌合AAV2/禽類AAV顆粒的拼合顆粒之間的反應。
圖4A提供了非限制性的預測海獅AAV VP3條帶結構，強調A565和G432作為蛋白：蛋白結合對之第一成員的非限制性插入位點。圖4B提供了從一組嵌合AAV2/海獅AAV病毒顆粒，或者含不具SpyTag的AAV2/海獅AAV顆粒混有在指定位置處帶有SpyTag肽插入的AAV2/海獅AAV顆粒的拼合顆粒的粗製病毒製品中獲得之病毒效價的qPCR定量，該組嵌合AAV2/海獅AAV病毒顆粒在指定位置處沒有SpyTag或包含SpyTag插入。圖4C提供了使用B1抗體的西方墨點，B1抗體識別被工程改造至嵌合AAV2/海獅AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白中的線性表位，分析和SpyCatcher融合的抗HER2抗體(賀癌平(HERCEPTIN®))「SpyC-抗HER2 mAb」，與一組在指定位置處缺乏或帶有SpyTag插入的AAV2/海獅AAV病毒顆粒，或包含缺乏SpyTag的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒混有在指定位置處帶有SpyTag肽插入的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒的拼合AAV2/海獅AAV顆粒之間的反應。
圖5提供了(A)從一組AAV2/海獅AAV病毒顆粒的粗製病毒製品中獲得之病毒效價的qPCR定量，該組AAV2/海獅AAV病毒顆粒在指定位置處不具SpyTag或帶有SpyTag插入，以及(B)使用B1抗體的西方墨點，B1抗體識別經工程改造至嵌合AAV2/海獅AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白中的線性表位，分析和SpyCatcher融合的抗HER2抗體(HERCEPTIN®)「SpyC-mAb」，與一組在指示位置處不具SpyTag或帶有SpyTag插入的海獅AAV病毒顆粒之間的反應。
圖6A提供了非限制性的預測髭頰蜥AAV VP3條帶結構，強調T573和G436作為蛋白：蛋白結合對之第一成員的非限制性插入位點。圖6B提供了從一組嵌合AAV2/髭頰蜥AAV病毒顆粒，或者含不具SpyTag的AAV2/髭頰蜥AAV顆粒混有在指定位置處帶有SpyTag肽插入的AAV2/髭頰蜥AAV顆粒的拼合顆粒的粗製病毒製品中獲得之病毒效價的qPCR定量，該組嵌合AAV2/髭頰蜥AAV病毒顆粒在指定位置處沒有SpyTag或包含SpyTag插入。圖6C提供了使用B1抗體的西方墨點，B1抗體識別被工程改造至嵌合AAV2/髭頰蜥AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的線性表位，分析和SpyCatcher融合的抗HER2抗體(HERCEPTIN®)，與在指定位置處缺乏或帶有SpyTag插入的一組AAV2/髭頰蜥AAV病毒顆粒，或包含缺乏SpyTag之嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒混有在指示位置處帶有SpyTag肽插入的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒的拼合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒之間的反應。
圖7A提供了從流式細胞儀獲得的散佈圖，評估被無SpyTag的嵌合AAV2/AAAV顆粒、嵌合AAV2/AAAV G444連接子6 SpyTag顆粒，或嵌合AAV2/AAAV K580連接子6 SpyTag顆粒感染的HER2陽性(+) 293 hErbB2細胞的綠色螢光蛋白(GFP)表現。經由SpyTag (SEQ ID NO：42)將嵌合AAV2/AAAV G444連接子6 SpyTag顆粒和嵌合AAV2/AAAV K580連接子6 SpyTag顆粒接合至對抗GLP1R的不相干同型對照抗體或與SpyCatcher (SEQ ID NO：43)融合的抗HER2抗體(HERCEPTIN®)。病毒表現GFP作為轉導標記。圖7B提供了從流式細胞儀獲得的散佈圖，評估被無SpyTag的嵌合AAV2/AAAV顆粒或嵌合AAV2/AAAV K580連接子6 SpyTag顆粒感染的親本ASGR1陰性(-) 293細胞或ASGR1陽性(+) 293 hASGR1細胞的綠色螢光蛋白(GFP)表現。嵌合AAV2/AAAV K580連接子6 SpyTag顆粒經由SpyTag接合至與SpyCatcher融合之對抗GLP1R的不相干同型對照抗體，或經由SpyTag結合至特異地結合ASGR1之與SpyCatcher融合的抗體。病毒表現GFP作為轉導標記。
圖8A提供了從流式細胞儀獲得的散佈圖，評估被無SpyTag的嵌合AAV2/海獅顆粒，或嵌合AAV2/海獅G432連接子6 SpyTag顆粒感染的HER2陽性(+) 293 hErbB2或HER2陰性(-) 293親本細胞的綠色螢光蛋白(GFP)表現。經由SpyTag將嵌合AAV2/海獅AAV G432連接子6 SpyTag顆粒接合至針對GLP1R之與SpyCatcher融合的不相干同型對照抗體，或經由SpyTag接合至與SpyCatcher (SEQ ID NO：43)融合的抗HER2抗體(HERCEPTIN®)。病毒表現GFP作為轉導標記。圖8B提供了從流式細胞儀獲得的散佈圖，評估被無SpyTag的嵌合AAV2/海獅顆粒感染的ASGR1陽性(+) 293 hASGR1或ASGR1陰性(-) 293親本細胞，或被嵌合AAV2/海獅G432連接子6 SpyTag顆粒感染的細胞的綠色螢光蛋白(GFP)表現。經由SpyTag將嵌合AAV2/海獅G432連接子6 SpyTag顆粒接合至與SpyCatcher融合之對抗GLP1R的不相干同型對照抗體，或經由SpyTag接合至特異地結合ASGR1之SpyCatcher融合抗體。病毒表現GFP作為轉導標記。
圖9提供了從流式細胞術獲得的散佈圖，評估被一組嵌合AAV2/海獅AAV病毒顆粒感染的HER2-陽性(+) 293的綠色螢光蛋白(GFP)表現，該組嵌合AAV2/海獅AAV病毒顆粒是在指定位置處無SpyTag或包含SpyTag插入的AAV2/海獅AAV顆粒。經由SpyTag將插入嵌合AAV2/海獅顆粒的SpyTag接合至與SpyCatcher (SEQ ID NO：43)融合的抗HER2抗體(HERCEPTIN®)。病毒表現GFP作為轉導標記。
圖10A提供了從流式細胞儀獲得的散佈圖，評估「未感染」或被缺乏SpyTag的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒，嵌合AAV2/髭頰蜥T573連接子6 SpyTag拼合顆粒，或嵌合AAV2/髭頰蜥AAV G436連接子6 SpyTag拼合顆粒感染的HER2陽性(+) 293 hErbB2細胞的綠色螢光蛋白(GFP)表現。經由SpyTag將嵌合AAV2/髭頰蜥T573連接子6 SpyTag拼合顆粒與嵌合AAV2/髭頰蜥G436連接子6 SpyTag拼合顆粒結合至與SpyCatcher (SEQ ID NO：43)融合的抗HER2抗體(HERCEPTIN®)。病毒表現GFP作為轉導標記。圖10B提供了從流式細胞儀獲得的散佈圖，評估被無SpyTag的嵌合AAV2/髭頰蜥AAV顆粒、嵌合AAV2/髭頰蜥T573連接子6 SpyTag顆粒，或嵌合AAV2/髭頰蜥AAV T573連接子6 SpyTag抗ASGR1顆粒感染的ASGR1陽性(+) 293 hASGR1或ASGR1陰性(-) 293親本細胞的綠色螢光蛋白(GFP)表現。經由SpyTag將嵌合AAV2/髭頰蜥T573連接子6 SpyTag抗ASGR1顆粒接合至特異地結合ASGR1之SpyCatcher融合抗體。病毒表現GFP作為轉導標記。
圖11A提供Nanoluc螢光素酶分析的結果，評估在指定濃度的經純化人類IgG存在下，以「AAV2抗ASGR1」顆粒、嵌合AAV2/AAAV抗ASGR1顆粒或嵌合AAV2/海獅AAV抗ASGR1顆粒感染後，hASGR1陽性(+)細胞的Nanoluc報導子表現。經由SpyTag將所有顆粒接合至特異地結合ASGR1的SpyCatcher融合抗體。病毒表現Nanoluc作為轉導標記。圖11B提供了圖11A中的圖式定量，但已相對「僅PBS」條件進行常規化。圖11C提供了IC50值的表格，是有關於中和指定病毒達50%所需的IgG濃度。
圖12提供(A)靜脈內注射磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，或5.0x1011 個病毒基因體(vg)/動物的經SpyTag標籤嵌合AAV2/AAAV顆粒後33天，在肝臟細胞上表現人類ASGR1的經遺傳修飾小鼠(ASGR1人類化小鼠)的發光影像，經SpyTag標籤嵌合AAV2/AAAV顆粒帶有感興趣螢火蟲螢光素酶核苷酸，並經過(1) SpyCatcher抗人類ASGR1抗體或(2) SpyCatcher抗人類GLP1R抗體(對照mAb)修飾。病毒表現螢火蟲螢光素酶表現作為轉導標記。用異氟烷麻醉小鼠，注射螢光素受質，並在10分鐘後使用IVIS Spectrum活體內成像系統(PerkinElmer)成像；(B)在圖A中所描繪發光影像內的個別動物的平均輻射量的定量；和(C)從圖A中所描繪動物之解剖器官(肝臟和肺臟)的平均輻射量的定量。
圖13提供(A)靜脈內注射磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，或5.0x1011 個病毒基因體(vg)/動物的經SpyTag標籤嵌合AAV2/海獅AAV顆粒後33天，在肝臟細胞上表現人類ASGR1的經遺傳修飾小鼠(ASGR1人類化小鼠)的發光影像，經SpyTag標籤嵌合AAV2/海獅AAV顆粒帶有感興趣螢火蟲螢光素酶核苷酸，並經過(1) SpyCatcher抗人類ASGR1抗體或(2) SpyCatcher抗人類GLP1R抗體(對照mAb)修飾。病毒表現螢火蟲螢光素酶作為轉導標記。用異氟烷麻醉小鼠，注射螢光素受質，並在10分鐘後使用IVIS Spectrum活體內成像系統(PerkinElmer)成像；(B)在圖A中所描繪發光影像內的個別動物的平均輻射量的定量；和(C)從圖A中所描繪動物之解剖器官(肝臟和肺臟)的平均輻射量的定量。
圖14提供了用缺乏SpyTag的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒感染後3天，新生小鼠內耳柯蒂氏器外植體培養物的免疫螢光影像。病毒表現GFP作為轉導標記(綠色)，並用偵測Myo7a的抗體標記毛細胞(紅色)。
圖15A提供AAV2或包含B1表位修飾以將其完全或只在殘基730處置換為同源海獅AAV序列之AAV2/海獅嵌合序列的C端16個胺基酸比對。闡明了B1單株抗體表位。圖15B提供自不具SpyTag或不具SpyTag且含有B1表位修飾以將其完全或只在殘基730處置換為同源海獅AAV序列之嵌合AAV2/海獅AAV2顆粒的經純化病毒製品得到的病毒效價的qPCR定量。圖15C提供使用SYPRO Ruby的蛋白凝膠染色，分析不具SpyTag或不具SpyTag且含有B1表位修飾以將其完全或只在殘基730處置換為同源海獅AAV序列之嵌合AAV2/海獅AAV顆粒的VP1，VP2和VP3衣殼蛋白表現。圖15D提供在各種感染倍數(MOI)下被不具SpyTag或不具SpyTag且含有B1表位修飾以將其完全或只在殘基730處置換為同源海獅AAV序列之嵌合AAV2/海獅AAV顆粒感染之HEK293T細胞溶解產物而來的NanoLuc螢光素酶表現的發光評估。病毒表現NanoLuc螢光素酶作為轉導標記。
圖16提供靜脈內注射磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，或5.0x1011 個病毒基因體(vg)/動物的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒後34天，小鼠的解剖器官的平均輻射量的定量，嵌合AAV2/海獅AAV顆粒帶有感興趣螢火蟲螢光素酶核苷酸，並藉由不具SpyTag或不具SpyTag且含有B1表位修飾以將其完全或只在殘基730處置換為同源海獅AAV序列進行修飾。病毒表現螢火蟲螢光素酶作為轉導標記。用異氟烷麻醉小鼠，注射螢光素受質，並在10分鐘後使用IVIS Spectrum活體內成像系統(PerkinElmer)成像。
圖17提供了可用於產生AAV嵌合病毒顆粒的本發明Rep-Cap表現質體的說明性(未按比例)，非限制性和例示性具體例。靈長類AAV序列顯示為空心盒，而海獅AAV序列以實心盒顯示。僅出於例示性目的，例示性非限制性位置(未按比例)還描繪(1)靈長類和海獅衣殼序列之間的選擇性界面位置(靈長類動物AAV衣殼序列內的黑虛線)以及(2)用於偵測所編碼VP1、VP2和VP3蛋白的可偵測標籤(非靈長類動物AAV衣殼序列內的虛線)。如圖17中所示的Rep-Cap表現質體可用於產生包含感興趣核苷酸的AAV病毒顆粒，該感興趣核苷酸側接靈長類AAV的5'和3'反向末端重複(ITR)序列。
圖18A提供了不具SpyTag並包含AAV2和海獅衣殼序列之間的選擇性界面位置的嵌合AAV2/海獅AAV顆粒的經純化病毒製品得到的病毒效價的qPCR定量。製品是由細胞溶解產物(v2-v4)或細胞溶解產物與培養基(v5)純化而來。圖18B和圖18C提供在各種感染倍數(MOI)下被不具SpyTag和具AAAV2和海獅衣殼序列之間的選擇性界面位置之AAV2/海獅AAV顆粒感染的HEK293T細胞溶解產物而來的NanoLuc螢光素酶表現的發光評估。AAV2/海獅AAV無SpyTag的歷史數據集用作為參考。病毒表現NanoLuc螢光素酶作為轉導標記。圖18D提供靜脈內注射磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，或5.0x1011 個病毒基因體(vg)/動物的AAV2/海獅AAV顆粒後56天，小鼠的解剖器官的平均輻射量的定量，AAV2/海獅AAV顆粒帶有感興趣螢火蟲螢光素酶核苷酸，並藉由不具SpyTag，或不具SpyTag且具有B1表位被完全置換為同源海獅AAV序列在AAV2和海獅衣殼序列之間有或沒有選擇性界面位置進行修飾。病毒表現螢火蟲螢光素酶為轉導標記。用異氟烷麻醉小鼠，注射螢光素受質，並在10分鐘後使用IVIS Spectrum活體內成像系統(PerkinElmer)成像。
無
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Claims (138)

  1. 一種重組AAV病毒顆粒，其包含(i)包含AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的AAV衣殼，以及(ii)被包裝在AAV衣殼內之包含AAV反向末端重複(ITR)序列的核酸序列， 其中AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP1衣殼蛋白的任何部分、AAV VP2衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白的任何部分、AAV VP3衣殼蛋白及AAV VP3衣殼蛋白的任何部分中的至少一者，包含與非靈長類動物AAV或其部分、或遠親(remote) AAV或其部分之衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， 其中 I.     AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白中的至少一者包含選自由以下組成之群的修飾： (a)  蛋白：蛋白結合對的第一成員，其中該蛋白：蛋白結合對指導AAV病毒顆粒的向性， (b)  可偵測標籤， (c)  點突變，較佳地其中該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或創造可偵測標籤， (d)  嵌合胺基酸序列，及 (e)  (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合，及/或 II.    ITR序列或其部分，其包含與第二AAV的ITR序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的核酸序列，其中第二AAV與非靈長類動物AAV或遠親AAV不相同，以及 其中重組AAV病毒顆粒能夠感染哺乳動物宿主，較佳靈長類宿主。
  2. 一種重組AAV病毒顆粒，其包含(i)包含AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的AAV衣殼，及(ii)被包裝在AAV衣殼內之包含AAV反向末端重複(ITR)序列的核酸序列， 其中AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP1衣殼蛋白的任何部分、AAV VP2衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白的任何部分，AAV VP3衣殼蛋白及AAV VP3衣殼蛋白的任何部分中的至少一者，包含與非靈長類動物AAV或其部分之衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且 其中AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白中的至少一者包含選自由以下組成之群的修飾： (a)    蛋白：蛋白結合對的第一成員，其中該蛋白：蛋白結合對指導AAV病毒顆粒的向性， (b)    可偵測標籤， (c)    點突變，較佳地其中該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或創造可偵測標籤， (d)    嵌合胺基酸序列，及 (e)    (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合， 其中整個ITR序列或一部分ITR序列包含與非靈長類動物AAV的ITR具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的核酸序列，視情況其中ITR序列包含嵌合核酸序列，且其中與非靈長類AAV的ITR具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的一部分嵌合核酸序列可操作地連接至與第二AAV之ITR具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的一部分嵌合核酸序列，其中第二AAV與非靈長類動物AAV不相同，以及 其中重組AAV病毒顆粒能夠感染哺乳動物宿主，較佳靈長類宿主。
  3. 一種重組AAV病毒顆粒，其包含(i)包含AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的AAV衣殼，以及(ii)被包裝在AAV衣殼內之包含AAV反向末端重複(ITR)序列的核酸序列， 其中AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP1衣殼蛋白的任何部分、AAV VP2衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白的任何部分、AAV VP3衣殼蛋白，以及AAV VP3衣殼蛋白的任何部分中的至少一者，包含與非靈長類動物AAV或其一部分之衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，視情況其中AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白中的至少一者包含選自由以下組成之群的修飾： (a)    蛋白：蛋白結合對的第一成員，其中蛋白：蛋白結合對指導AAV病毒顆粒的向性， (b)    可偵測標籤， (c)    點突變，較佳地其中該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或創造可偵測標籤，及 (d)    (a)-(d)的任何組合， 其中該ITR序列或其部分包含與第二AAV的ITR序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的核酸序列，其中該第二AAV與非靈長類動物AAV不相同，以及 其中重組AAV病毒顆粒能夠感染哺乳動物宿主，較佳靈長類宿主。
  4. 一種重組AAV病毒顆粒，其包含(i)包含AAV VP1、VP2和VP3衣殼蛋白的AAV衣殼，以及(ii)被包裝在AAV衣殼內之包含AAV反向末端重複(ITR)序列的核酸序列， 其中AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP1衣殼蛋白的任何部分、AAV VP2衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白的任何部分、AAV VP3衣殼蛋白，以及AAV VP3衣殼蛋白的任何部分中的至少一者包含嵌合胺基酸序列，該嵌合胺基酸序列含有(A)與非靈長類動物AAV衣殼蛋白或其部分的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，可操作地連接至(B)與第二AAV衣殼蛋白或其部分的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， 其中該第二AAV與非靈長類動物AAV不相同， 其中該重組AAV病毒顆粒能夠感染哺乳動物宿主，較佳靈長類宿主，且視情況 其中包含嵌合胺基酸序列的AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP1衣殼蛋白的任何部分、AAV VP2衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白的任何部分、AAV VP3衣殼蛋白，以及AAV VP3衣殼蛋白的任何部分中的至少一者進一步包含選自由以下組成之群的修飾 (a)    蛋白：蛋白結合對的第一成員， (b)    可偵測標籤，及 (c)    (a)與(b)的任何組合。
  5. 如前述請求項中任一項之重組AAV顆粒，其中蛋白：蛋白結合對選自SpyTag：SpyCatcher、SpyTag：KTag、Isopeptag：pilin-C，SnoopTag：SnoopCatcher和SpyTag002：SpyCatcher002。
  6. 如前述請求項中任一項之重組AAV顆粒，其中蛋白：蛋白結合對的第一成員包含c-myc，其包含如SEQ ID NO：44所示的序列。
  7. 如前述請求項中任一項之重組AAV顆粒，其中可偵測標籤包含B1表位，其包含IGTRYLTR的胺基酸序列(SEQ ID NO：45)。
  8. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中衣殼蛋白或其部分包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  9. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中衣殼蛋白或其部分包含與非靈長類動物AAV之VP2衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  10. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中衣殼蛋白或其部分包含與非靈長類動物AAV之VP1衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  11. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中 (i)    VP1衣殼蛋白包含 嵌合胺基酸序列，視情況其中嵌合AAV VP1衣殼蛋白的VP1特有區(VP1-u)包含與第二AAV的VP1-u的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中嵌合AAV VP1衣殼的VP1/VP2共有區和VP3區包含與非靈長類動物AAV的VP1/VP2共有區和VP3區的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，或 與非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， (ii)   VP2衣殼蛋白包含 嵌合胺基酸序列，視情況其中嵌合AAV VP2衣殼蛋白的VP1/VP2共有區包含與第二AAV的VP1/VP2共有區的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中嵌合VP2衣殼蛋白的VP3區包含與非靈長類動物AAV的VP3區至少95%同一性，或 與非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， (iii)  VP3衣殼蛋白，包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  12. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中 (i) VP1衣殼蛋白包含嵌合胺基酸序列，視情況其中該嵌合AAV VP1衣殼蛋白之VP1特有區(VP1-u)包含一個與第二AAV的VP1-u之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中該嵌合AAV VP1衣殼之VP1/VP2共有區與VP3區包含與非靈長類動物AAV之VP1/VP2共有區和VP3區的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列； (ii) VP2衣殼蛋白包含嵌合胺基酸序列，視情況其中該嵌合AAV VP2衣殼蛋白之VP1/VP2共有區包含一個與第二AAV的VP1/VP2共有區之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中該嵌合VP2衣殼蛋白之VP3區包含與非靈長類動物AAV之VP3區至少95%同一性，及 (iii) VP3衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  13. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中 (i) AAV VP1衣殼蛋白包含嵌合胺基酸序列，視情況其中該嵌合AAV VP1衣殼蛋白之VP1特有區(VP1-u)包含與第二AAV的VP1-u之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中該嵌合AAV VP1衣殼之VP1/VP2共有區和VP3區包含與非靈長類動物AAV之VP1/VP2共有區和VP3區的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， (ii) VP2衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP2衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，以及 (iii) VP3衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  14. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中 (i) VP1衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP1衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， (ii) VP2衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP2衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，及 (iii) VP3衣殼蛋白包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  15. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中第二AAV是靈長類AAV或靈長類AAV的組合。
  16. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中第二AAV選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其組合。
  17. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中第二AAV是AAV2。
  18. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中非靈長類動物AAV是選自表2中列出之群的非靈長類AAV。
  19. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中非靈長類動物AAV是禽類AAV (AAAV)，海獅AAV或髭頰蜥AAV。
  20. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中非靈長類動物AAV是AAAV。
  21. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中修飾在AAAV的VP1衣殼蛋白的位置I444或I580處。
  22. 如請求項1-19中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中非靈長類動物AAV是有鱗目AAV。
  23. 如請求項1-19與22中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中有鱗目AAV是髭頰蜥AAV。
  24. 如請求項1-19與22-23中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中修飾係在髭頰蜥AAV之VP1衣殼蛋白的位置I573或I436處。
  25. 如請求項1-19中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中非靈長類動物AAV是哺乳動物AAV。
  26. 如請求項1-19與25中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中哺乳動物AAV是海獅AAV。
  27. 如請求項1-19與25-26中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中修飾在選自由以下組成之群的位置處：海獅AAV之VP1的I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436，I437和A565
  28. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中該VP3衣殼蛋白被修飾成包含 (a)    蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，視情況其中該蛋白：蛋白結合對選自由SpyTag：SpyCatcher、SpyTag：KTag、Isopeptag：pilin-C，SnoopTag：SnoopCatcher和SpyTag002：SpyCatcher002組成之群， (b)    可偵測標籤，視情況其中可偵測標籤包含如SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列或如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列， (c)    點突變，或 (d)    (a)、(b)和(c)之任何組合。
  29. 如請求項28之重組AAV病毒顆粒，其中VP3衣殼蛋白被修飾成包含 (a)   至少SpyTag，其包含如SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，及/或 (b)   可偵測標籤，其包含如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列。
  30. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其包含第一及/或第二連接子，其將蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤可操作地連接至該AAV顆粒的衣殼的衣殼蛋白。
  31. 如請求項30之重組AAV病毒顆粒，其中第一和第二連接子不同。
  32. 如請求項30之重組AAV病毒顆粒，其中第一和第二連接子相同。
  33. 如請求項30-32中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中第一及/或第二連接子的長度為10個胺基酸。
  34. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其包含可操作地連接至該AAV顆粒之衣殼的衣殼蛋白的可變區之蛋白：蛋白結合對的第一成員及/或可偵測標籤。
  35. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含選自由以下組成之群的胺基酸序列： (a) 如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列， (b) 如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列， (c) 如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列， (d) 如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列， (e) 如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列， (f)  如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列， (g) 如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列， (h) 如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列， (i)  如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列， (j)  如SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列， (k) 如SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列， (l)  如SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列， (m) 如SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列， (n) 如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列， (o) 如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列， (p) 如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列， (q) 如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列， (r)  如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列， (s) 如SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列， (t)  如SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列， (u) 如SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列， (v) 如SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列， (w)       如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列， (x) 如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列， (y) 如SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列， (z) 如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列， (aa)  如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列， (bb) 如SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列， (cc)  與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO ：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71具有顯著序列同一性，例如至少95%同一性的胺基酸序列，及 (dd) (a)-(cc)中任一者所示之胺基酸序列的任何VP2及/或VP3部分的胺基酸序列。
  36. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其進一步包含參考衣殼蛋白，使得該衣殼為拼合衣殼(mosaic capsid)。
  37. 如前述請求項中任一項之重組AAV病毒顆粒，其中VP3衣殼蛋白包含帶有蛋白：蛋白結合對之第一成員的修飾，其中該衣殼進一步包含缺乏蛋白：蛋白結合對之第一成員的參考VP3衣殼蛋白。
  38. 一種包含胺基酸序列的腺相關病毒(AAV)衣殼蛋白，其中該胺基酸序列或其部分與非靈長類動物AAV或其部分、或遠親AAV或其部分之衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)， 其中該AAV衣殼蛋白選自由以下組成之群 (a)   嵌合AAV VP1衣殼蛋白，視情況其中該嵌合AAV VP1衣殼蛋白被修飾成包含蛋白：蛋白結合對之至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變，該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或創造可偵測標籤， (b)   非靈長類動物AAV或遠親AAV的非嵌合AAV VP1衣殼蛋白，其被修飾成包含蛋白：蛋白結合對之至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變，該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或創造可偵測標籤， (c)   嵌合VP2衣殼蛋白，視情況其中該嵌合AAV VP2衣殼蛋白被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變，該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或創造可偵測標籤， (d)   非靈長類動物AAV或遠親AAV的非嵌合AAV VP2衣殼蛋白，其被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變，該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或創造可偵測標籤， (e)   嵌合AAV VP3衣殼蛋白，其被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變，該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或創造可偵測標籤，及 (f)    非人類AAV或遠親AAV的非嵌合AAV VP3衣殼蛋白，被修飾成包含蛋白：蛋白結合對的至少第一成員，可偵測標籤及/或點突變，該點突變降低AAV病毒顆粒的天然向性及/或創造可偵測標籤。
  39. 如請求項38之AAV衣殼蛋白，其中該蛋白：蛋白結合對的第一成員側接第一及/或第二連接子，該第一及/或第二連接子將該蛋白：蛋白結合對的第一成員連接至衣殼蛋白，且其中第一及/或第二連接子的長度各自獨立地為至少一個胺基酸。
  40. 如請求項39之AAV衣殼蛋白，其中該第一連接子和第二連接子不同。
  41. 如請求項39之AAV衣殼蛋白，其中該第一連接子和第二連接子相同，且長度為10個胺基酸。
  42. 如請求項38-41中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該衣殼蛋白進一步包含蛋白：蛋白結合對的第二同源成員，視情況其中該第一和第二成員藉由共價鍵(視情況異肽鍵)結合。
  43. 如請求項38-42中任一項之AAV衣殼蛋白，其中蛋白：蛋白結合對的第一成員包含SpyTag。
  44. 如請求項42或請求項43之AAV衣殼蛋白，其中該第二同源成員包含SpyCatcher。
  45. 如請求項42-44中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該第二同源成員包含KTag。
  46. 如請求項42之AAV衣殼蛋白，其中該第一成員是KTag，而該第二同源成員包含SpyTag。
  47. 如請求項42之AAV衣殼蛋白，其中該第一成員是SnoopTag，而該第二同源成員包含SnoopCatcher。
  48. 如請求項42之AAV衣殼蛋白，其中該第一成員是isopeptag，而該第二同源成員包含Pilin-C。
  49. 如請求項42之AAV衣殼蛋白，其中該第一成員是SpyTag002，而該第二同源成員包含SpyCatcher002。
  50. 如請求項42-59中任一項之AAV衣殼蛋白，其中第二成員可操作地連接至靶向配體，視情況其中該靶向配體是結合部分。
  51. 如請求項50之AAV衣殼蛋白，其中結合部分是抗體或其部分。
  52. 如請求項51之AAV衣殼蛋白，其中該抗體或其部分融合至SpyCatcher。
  53. 如請求項51或請求項52之AAV衣殼蛋白，其中該抗體或其部分在C端處融合至連接子，而該連接子在連接子C端處融合至SpyCatcher。
  54. 如請求項53之AAV衣殼蛋白，其中該連接子包含如SEQ ID NO：49 (GSGESG)所示的序列。
  55. 如請求項38-54中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該可偵測標籤包含B1表位，該B1表位包含如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列。
  56. 如請求項38-55中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該非靈長類動物AAV是表2中列出的非靈長類AAV。
  57. 如請求項38-56中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該非靈長類AAV是禽類AAV (AAAV)，海獅AAV或髭頰蜥AAV。
  58. 如請求項38-57中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該非靈長類動物AAV是AAAV。
  59. 如請求項38-58中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該修飾在AAAV的VP1衣殼蛋白的位置I444或I580處。
  60. 如請求項38-56中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該非靈長類動物AAV是有鱗目AAV。
  61. 如請求項38-56與60中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該有鱗目AAV是髭頰蜥AAV。
  62. 如請求項38-56與60-61中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該修飾係在髭頰蜥AAV的VP1衣殼蛋白的位置I573或I436處。
  63. 如請求項38-56中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該非靈長類動物AAV是哺乳動物AAV。
  64. 如請求項38-56與63中任一項之AAV衣殼蛋白，其中該哺乳動物AAV是海獅AAV。
  65. 如請求項38-56與63-64中任一項之AAV衣殼蛋白，其中修飾是在選自由以下組成之群的位置處：海獅AAV之VP1的I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436、I437和A565。
  66. 如請求項38-65中任一項之AAV衣殼蛋白，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列 (a) 如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列， (b) 如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列， (c) 如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列， (d) 如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列， (e) 如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列， (f)  如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列， (g) 如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列， (h) 如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列， (i)  如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列， (j)  如SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列， (k) 如SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列， (l)  如SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列， (m) 如SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列， (n) 如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列， (o) 如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列， (p) 如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列， (q) 如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列， (r)  如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列， (s) 如SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列， (t)  如SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列， (u) 如SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列， (v) 如SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列， (w)       如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列， (x) 如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列， (y) 如SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列， (z) 如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列， (aa)  如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列， (bb) 如SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列， (cc)  與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO ：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71具有顯著序列同一性，例如至少95%同一性的胺基酸序列，及 (dd) (a)-(cc)中任一者所示之胺基酸序列的任何VP2及/或VP3部分的胺基酸序列。
  67. 如請求項38-66中任一項之AAV衣殼蛋白，其中蛋白：蛋白結合對的第一成員包含可偵測標籤。
  68. 如請求項67之AAV衣殼蛋白，其中該可偵測標籤包括c-myc (SEQ ID NO：44)。
  69. 一種AAV顆粒，其包含如請求項38-68中任一項之AAV衣殼蛋白。
  70. 一種核酸分子，其包含編碼如請求項38-68中任一項之AAV衣殼蛋白的cap 基因。
  71. 一種核酸分子，其包含編碼AAV VP1衣殼蛋白、AAV VP2衣殼蛋白及/或AAV VP3衣殼蛋白的AAVcap 基因， 其中AAVcap 基因或其部分包含與非靈長類動物AAV或其部分、或遠親AAV或其部分的cap 基因的核酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的核酸序列， 其中該AAVcap 基因進一步被修飾成包含 (a)    編碼蛋白：蛋白結合對之第一成員的核苷酸序列， (b)    編碼可偵測標籤的核苷酸序列， (c)    點突變， (d)    嵌合核苷酸序列，或 (e)    (a)、(b)、(c)和(d)的任何組合。
  72. 一種核酸分子，其包含AAVrep 基因和AAVcap 基因， 其中整個AAVcap 基因包含與非靈長類動物AAV或遠親AAV的cap 基因的核酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的第一核酸序列，及 其中AAVrep 基因或其部分包含與第二AAV或其部分的rep 基因的核酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的第二核酸序列， 其中非靈長類動物AAV與第二AAV不同。
  73. 如請求項70-72中任一項之核酸分子，其中cap 基因可操作地連接至啟動子。
  74. 如請求項73之核酸分子，其中該啟動子指導衣殼蛋白在包裝細胞中的表現。
  75. 如請求項73或請求項74之核酸分子，其中啟動子選自p40、SV40、EF、CMV、B19p6和CAG。
  76. 如請求項70-75中任一項之核酸分子，其中AAVcap 基因被修飾成包含 (a)  編碼蛋白：蛋白結合對之至少第一成員的核苷酸序列， (b)  編碼可偵測標籤的核苷酸序列，及/或 (c)  編碼點突變的核苷酸序列。
  77. 如請求項76之核酸分子，其中蛋白：蛋白結合對選自SpyTag：SpyCatcher、SpyTag：KTag、Isopeptag：pilin-C，SnoopTag：SnoopCatcher和SpyTag002：SpyCatcher002。
  78. 如請求項76之核酸分子，其中蛋白：蛋白結合對的第一成員包含c-myc，其包含如SEQ ID NO：44所示的序列。
  79. 如請求項76-78中任一項之核酸分子，其中可偵測標籤包含B1表位，該B1表位包含IGTRYLTR的胺基酸序列(SEQ ID NO：45)。
  80. 如請求項70-79中任一項之核酸分子，其中cap 基因編碼VP3衣殼蛋白，其中VP3衣殼蛋白或其部分包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  81. 如請求項70-80中任一項之核酸分子，其中cap 基因編碼VP2衣殼蛋白，其中VP2衣殼蛋白或其部分包含與非靈長類動物AAV之VP2衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  82. 如請求項70-81中任一項之核酸分子，其中cap 基因編碼VP1衣殼蛋白，其中VP1衣殼蛋白或其部分包含與非靈長類動物AAV之VP1衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  83. 如請求項70-82中任一項之核酸分子，其中cap 基因編碼 (i)    VP1衣殼蛋白，其包含 嵌合胺基酸序列，視情況其中嵌合AAV VP1衣殼蛋白的VP1特有區(VP1-u)包含與第二AAV的VP1-u之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中嵌合AAV VP1衣殼的VP1/VP2共有區和VP3區包含與非靈長類動物AAV的VP1/VP2共有區和VP3區具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，或 與非靈長類動物AAV的VP1衣殼蛋白具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， (ii)   VP2衣殼蛋白，其包含 嵌合胺基酸序列，視情況其中嵌合AAV VP2衣殼蛋白的VP1/VP2共有區包含與第二AAV的VP1/VP2共有區的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中嵌合VP2衣殼蛋白的VP3區包含與非靈長類動物AAV的VP3區具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，或 與非靈長類動物AAV的VP2衣殼蛋白具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，及/或 (iii)  VP3衣殼蛋白，其包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  84. 如請求項70-83中任一項之核酸分子，其中cap 基因編碼 (i) VP1衣殼蛋白，其包含嵌合胺基酸序列，視情況其中該嵌合AAV VP1衣殼蛋白之VP1特有區(VP1-u)包含與第二AAV的VP1-u之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中該嵌合AAV VP1衣殼之VP1/VP2共有區與VP3區包含與非靈長類動物AAV之VP1/VP2共有區和VP3區的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列； (ii) VP2衣殼蛋白，其包含嵌合胺基酸序列，視情況其中該嵌合AAV VP2衣殼蛋白之VP1/VP2共有區包含與第二AAV的VP1/VP2共有區之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中該嵌合VP2衣殼蛋白之VP3區包含與非靈長類動物AAV之VP3區的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，及/或 (iii) VP3衣殼蛋白，其包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  85. 如請求項70-84中任一項之核酸分子，其中cap 基因編碼 (i) VP1衣殼蛋白，其包含嵌合胺基酸序列，視情況其中該嵌合AAV VP1衣殼蛋白之VP1特有區(VP1-u)包含與第二AAV的VP1-u之胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，且其中該嵌合AAV VP1衣殼之VP1/VP2共有區和VP3區包含與非靈長類動物AAV之VP1/VP2共有區和VP3區的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， (ii) VP2衣殼蛋白，其包含與非靈長類動物AAV之VP2衣殼蛋白具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，以及 (iii) VP3衣殼蛋白，其包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  86. 如請求項70-83中任一項之核酸分子，其中cap 基因編碼 (i) VP1衣殼蛋白，其包含與非靈長類動物AAV之VP1衣殼蛋白具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列， (ii) VP2衣殼蛋白，其包含與非靈長類動物AAV之VP2衣殼蛋白具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列，及 (iii) VP3衣殼蛋白，其包含與非靈長類動物AAV之VP3衣殼蛋白的胺基酸序列具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的胺基酸序列。
  87. 如請求項70-86中任一項之核酸分子，其中該第二AAV是靈長類AAV或靈長類AAV的組合。
  88. 如請求項70-87中任一項之核酸分子，其中該第二AAV選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其組合。
  89. 如請求項70-88中任一項之核酸分子，其中該第二AAV是AAV2。
  90. 如請求項70-89中任一項之核酸分子，其中該非靈長類動物AAV是選自表2中列出的非靈長類AAV的非靈長類AAV。
  91. 如請求項70-90中任一項之核酸分子，其中該非靈長類AAV是禽類AAV，海獅AAV或髭頰蜥AAV。
  92. 如請求項70-91中任一項之核酸分子，其中非靈長類動物AAV是AAAV。
  93. 如請求項70-92中任一項之核酸分子，其中該修飾係在AAAV之VP1衣殼蛋白的密碼子編碼位置I444或I580處。
  94. 如請求項70-91中任一項之核酸分子，其中該非靈長類動物AAV是有鱗目AAV。
  95. 如請求項70-91與94中任一項之核酸分子，其中該有鱗目AAV是髭頰蜥AAV。
  96. 如請求項70-91與94-95中任一項之核酸分子，其中該修飾是在髭頰蜥AAV之VP1衣殼蛋白的密碼子編碼位置I573或I436處。
  97. 如請求項70-91中任一項之核酸分子，其中該非靈長類動物AAV是哺乳動物AAV。
  98. 如請求項70-91與97中任一項之核酸分子，其中該哺乳動物AAV是海獅AAV。
  99. 如請求項70-91與97-98中任一項之核酸分子，其中該修飾在選自由以下組成之群的位置處：海獅AAV之VP1的I429、I430、I431、I432、I433、I434、I436、I437和A565。
  100. 如請求項70-99中任一項之核酸分子，其包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： (a)   如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列， (b)   如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列， (c)   如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列， (d)   如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列， (e)   如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列， (f)    如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列， (g)   如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列， (h)   如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列， (i)    如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列， (j)    如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列， (k)   如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列， (l)    如SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列， (m)  如SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列， (n)   如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列， (o)   如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列， (p)   如SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列， (q)   如SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列， (r)    如SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列， (s)   如SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列， (t)    如SEQ ID NO：54所示的核苷酸序列， (u)   如SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列， (v)   如SEQ ID NO：58所示的核苷酸序列， (w)  如SEQ ID NO：60所示的核苷酸序列， (x)   如SEQ ID NO：62所示的核苷酸序列， (y)   如SEQ ID NO：64所示的核苷酸序列， (z)   如SEQ ID NO：66所示的核苷酸序列， (aa)  如SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列， (bb) 如SEQ ID NO：70所示的核苷酸序列， (cc)  與如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或其編碼VP2衣殼之任一者具有顯著序列同一性(例如至少95%同一性)的核苷酸序列， (dd) 編碼VP2衣殼蛋白及/或VP3衣殼蛋白之(a)-(s)的任一部分核苷酸序列。
  101. 如請求項70-100中任一項之核酸分子，其進一步包含編碼一或多個AAV Rep蛋白且可操作地連接至啟動子的AAVrep 基因。
  102. 如請求項101之核酸分子，其中啟動子選自由p5、p19 SV40、EF、CMV、B19p6和CAG組成之群。
  103. 如請求項101或請求項102之核酸分子，其中一或多個Rep蛋白選自Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。
  104. 如請求項101-103中任一項之核酸分子，其中一或多個Rep蛋白包含Rep78。
  105. 如請求項101-104中任一項之核酸分子，其中一或多個Rep蛋白是靈長類動物AAV Rep蛋白。
  106. 一種AAV衣殼蛋白，其包含如請求項70-105之一者的核酸分子所編碼的胺基酸序列。
  107. 一種AAV顆粒，其包含如請求項106的衣殼蛋白。
  108. 一種用於生產AAV顆粒的包裝細胞，其包含如請求項70-105中任一項之核酸分子。
  109. 如請求項108之包裝細胞，其進一步包含含有編碼一或多個AAV Rep蛋白的rep 基因的核酸分子，其中該rep 基因可操作地連接至啟動子，視情況其中rep 基因和cap 基因是來自兩種不同的AAV。
  110. 如請求項109之包裝細胞，其中可操作地連接至rep 基因的啟動子指導Rep蛋白在包裝細胞中的表現。
  111. 如請求項109或請求項110之包裝細胞，其中啟動子選自p5、p19 SV40、EF、CMV、B19p6和CAG。
  112. 如請求項109-111中任一項之包裝細胞，其中一或多個Rep蛋白選自Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。
  113. 如請求項109-112中任一項之包裝細胞，其中一或多個Rep蛋白包含Rep78。
  114. 如請求項109-113中任一項之包裝細胞，其中一或多個Rep蛋白是靈長類動物AAV Rep蛋白。
  115. 如請求項109-114中任一項之包裝細胞，其中一或多個Rep蛋白是非靈長類動物AAV Rep蛋白。
  116. 如請求項109-115中任一項之包裝細胞，其進一步包含核酸分子，該核酸分子包含在至少一側側接至少一個AAV反向末端重複(ITR)序列的感興趣核苷酸的核苷酸序列，該ITR被一或多個Rep蛋白識別。
  117. 如請求項116之包裝細胞，其中該核苷酸在另一側側接同一AAV的第二ITR作為至少一個ITR。
  118. 如請求項117之包裝細胞，其中該核苷酸在另一側側接第二ITR，其中該第二ITR與該至少一個ITR具有不同的AAV。
  119. 如請求項116-118中任一項之包裝細胞，其中該感興趣核苷酸是報導子基因。
  120. 如請求項119之包裝細胞，其中該報導子基因編碼β-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白(GFP)、增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、MmGFP、藍色螢光蛋白(BFP)、增強型藍色螢光蛋白(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黃色螢光蛋白(YFP)、增強型黃色螢光蛋白(eYFP)、祖母綠、CyPet、青色螢光蛋白(CFP)、天藍(Cerulean)、T-藍寶石、螢光素酶、鹼性磷酸酶或其組合。
  121. 如請求項116-118中任一項之包裝細胞，其中該感興趣核苷酸編碼治療性蛋白、自殺基因、抗體或其片段、CRISPR/Cas系統或其一部分、反義寡核苷酸、核酶、RNAi分子或shRNA分子。
  122. 如請求項108-121中任一項之包裝細胞，其進一步包含編碼參考衣殼蛋白的核苷酸序列。
  123. 一種生產病毒顆粒的方法，其包含在足以生產病毒顆粒的條件下培養如請求項108-122中任一項之包裝細胞。
  124. 如請求項123之方法，其中包裝細胞還包含輔助質體及/或包含感興趣核苷酸的轉移質體。
  125. 如請求項123或請求項124之方法，其進一步包含一或多個以下步驟： a.  清除細胞碎片， b. 用Benzonase或DNase I和MgCl2處理含有病毒顆粒的上清液， c.  濃縮病毒顆粒， d. 純化病毒顆粒，以及 e.  a-d的任何組合， 視情況其中病毒顆粒是自互補腺相關病毒顆粒及/或從培養物上清液分離。
  126. 一種如請求項123-125中任一項之方法製造的AAV顆粒。
  127. 如請求項1-37、69、107和126中任一項的AAV顆粒，其包含感興趣核苷酸。
  128. 如請求項127之AAV顆粒，其中感興趣核苷酸是報導子基因。
  129. 如請求項128之AAV顆粒，其中報導子基因編碼β-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白(GFP)、增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、MmGFP、藍色螢光蛋白(BFP)、增強型藍色螢光蛋白(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黃色螢光蛋白(YFP)、增強型黃色螢光蛋白(eYFP)、祖母綠、CyPet、青色螢光蛋白(CFP)、天藍、T-藍寶石、螢光素酶、鹼性磷酸酶或其組合。
  130. 如請求項127之AAV顆粒，其中感興趣核苷酸編碼治療性蛋白、自殺基因、抗體或其片段、CRISPR/Cas系統或其一部分、反義寡核苷酸、核酶、RNAi分子或shRNA分子。
  131. 一種醫藥組合物，其包含(a)如請求項1-37、69、107和126-130中任一項之AAV顆粒，包含如請求項38-68和106中任一項之AAV衣殼蛋白的AAV顆粒，或如請求項123-125中任一項之方法製得的AAV顆粒，以及(b)醫藥上可接受的載劑或賦形劑。
  132. 一種將感興趣核苷酸遞送至目標細胞的方法，該方法包含使目標細胞與(a)如請求項1-37、69、107和126-130中任一項之AAV顆粒，包含如請求項38-68和106中任一項之AAV衣殼蛋白的AAV顆粒，或如請求項123-125中任一項之方法製得的AAV顆粒，或(b)如請求項131之組合物接觸。
  133. 如請求項132之方法，其中該AAV顆粒的衣殼包含特異地結合在目標細胞表面上表現之蛋白質的靶向配體。
  134. 如請求項132或請求項133之方法，其中接觸是離體進行。
  135. 如請求項132或請求項133之方法，其中目標細胞是在個體體內。
  136. 如請求項135之方法，其中個體是靈長類動物，較佳人類。
  137. 如請求項132-136中任一項之方法，其中目標細胞是人類細胞。
  138. 如請求項132-137中任一項之方法，其中感興趣核苷酸編碼治療性蛋白、自殺基因、抗體或其片段、CRISPR/Cas系統或其一部分、反義寡核苷酸、核酶、RNAi分子或shRNA分子。
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