JP7349931B2

JP7349931B2 - 高ビリルビン血症の処置

Info

Publication number: JP7349931B2
Application number: JP2020028031A
Authority: JP
Inventors: ミンゴッツィ，フェデリコ; ロンジッティ，ジュゼッペ; コラウド，ファニー; ムーロ，アンドレス; ボルトルッシ，ジュリア
Original assignee: ジェネトン; インターナショナルセンターフォージェネティックエンジニアリングアンドバイオテクノロジー
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2023-09-25
Anticipated expiration: 2035-04-27
Also published as: CN114395559A; US20170028036A1; CA3205555A1; CN106459932A; EP3851537A1; US10471132B2; EP3134530A2; US20190374619A1; EP3134530B1; WO2015162302A2; DK3134530T3; JP2017513501A; AU2015250770A1; JP6730193B2; EP3851537B1; EP3546585A1; WO2015162302A3; CA2942451A1; AU2015250770B2; DK3851537T3

Description

発明の分野
本発明は、高ビリルビン血症の処置、特にクリグラー・ナジャー症候群の処置において有用である核酸配列に関する。より特定すると、本発明の核酸配列は、コドンの最適化されたヒトＵＧＴ１Ａ１コード配列である。

発明の背景
クリグラー・ナジャー症候群（ＣＮ）は、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子（ＯＭＩＭ２１８８００番）によってコードされるビリルビンＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素アイソザイム１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）の欠損に起因する重度の非抱合型高ビリルビン血症を有する常染色体劣性疾患である。ＣＮの罹患率は、出生時に約１００００００人につき１人の個体であり、これによりＣＮは極めて稀な疾病となっている。ＣＮの現在の療法は、血清ビリルビン値の上昇を防ぐための光線療法に依拠する。ＣＮＩＩ型としても知られる、軽度の病型では、フェノバルビタールを使用してビリルビン血症を低減させることができる。それにも関わらず、患者は、血中ビリルビンの生命を脅かす高値のリスクに潜在的に曝され、肝移植が依然として唯一の治癒的な処置である。その最も重度の病型では、光線療法を出生時から適用しなければ、該疾病は、ビリルビンにより誘発される神経障害に因り致命的である。療法が利用可能であるにも関わらず、ＣＮは依然として、成長中の光線療法の効力の低下、光線療法それ自体の限界に起因する悪いコンプライアンス（毎日１０～１２時間行なわれる必要がある）、及び経時的な病的な肝臓の変化の発生（これは肝移植を必要とする場合もある）をはじめとする多くの理由のために医療ニーズが充足されていない。

天然に存在するＧｕｎｎラット、及び、Ｇｕｎｎラットに存在するのと同じ突然変異を有するイタリア、トリエステのＩＣＧＥＢのＭｕｒｏ博士によって開発されたより近年の該疾病のノックインマウスモデル（Bortolussi et al., 2012）をはじめとする、該疾病の様々な動物モデルが存在する。Ｇｕｎｎラットは血清中に高いビリルビン値を呈し、それらは小脳低形成を有し；ＣＮのマウスははるかにより重度な表現型を有し、光線療法又は遺伝子療法で迅速に処置しなければ出生後すぐに死亡する（Bortolussi et al., 2012）。

ＣＮに対する遺伝子に基づいた療法を開発することを目指した以前の研究は、治療効力を、肝臓に送達されるＡＡＶベクターを使用して達成することができることを示した（Bortolussi et al., 2012; Seppen et al., 2006）。しかしながら、より効果的な治療戦略の必要性が依然として存在する。

ジルベール症候群（すなわちＧＳ；ＯＭＩＭ２１８８００番）は遺伝性肝疾患であり、遺伝性のビリルビン増多の最も一般的な要因である。それは人口の３～１２％以下に見られる。ＧＳはまた、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の突然変異によっても引き起こされる。それ故、高ビリルビン血症を低減することを目指した治療戦略は、ＧＳの処置においても有利に実施されるだろう。

発明の概要
本発明は、ヒトＵＧＴ１Ａ１ｃＤＮＡに由来するコドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１コード配列に関する。より特定すると、コドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１コード配列は、配列番号１の野生型ヒトコード配列と比較して増加したＧＣ含量を有し、かつ／又は、減少した数の代替オープンリーディングフレームを有する。例えば、本発明の核酸配列は、野生型ヒトＵＧＴ１Ａ１配列の配列と比較して、ＵＧＴ１Ａ１配列のＧＣ含量は少なくとも２、３、４、５、又は１０％増加している。特定の実施態様では、本発明の核酸配列は、野生型ヒトＵＧＴ１Ａ１配列の配列と比較して、ＵＧＴ１Ａ１配列のＧＣ含量は２、３、４、又はより好ましくは、５％又は１０％（好ましくは５％）増加している。特定の実施態様では、コドンの最適化されたヒトＵＧＴ１Ａ１タンパク質をコードしている本発明の核酸配列は「実質的に同一」であり、すなわち、配列番号２又は配列番号３の配列に対して、約７０％同一、より好ましくは約８０％同一、さらにより好ましくは約９０％同一、さらにより好ましくは約９５％同一、さらにより好ましくは約９７％、９８％、又はさらには９９％同一である。特定の実施態様では、本発明は、コドンの最適化されたヒトＵＧＴ１Ａ１タンパク質をコードしている核酸配列に関し、該核酸配列は、配列番号２又は配列番号３に示された配列を含む。

有利には、本発明のコドンの最適化された核酸は、ビリルビン値の改善された低下、及び／又は低減した免疫原性を提供する。

本発明は、本発明の核酸配列を含む核酸構築物にも関する。核酸構築物は、１つ以上の発現制御配列、又は導入遺伝子の発現を向上させる他の配列に作動可能に連結された、本発明の核酸配列を含む発現カセットに対応し得る。このような配列、例えばプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡシグナルなどは、当技術分野において公知である。特に、発現カセットはプロモーターを含み得る。プロモーターは、遍在的又は組織特異的プロモーター、特に肝特異的プロモーターであり得る。より特定すると、プロモーターは、肝特異的プロモーター、例えばα－１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）（配列番号４）、トランスサイレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターなどである。他の有用な肝特異的プロモーター、例えば、コールドスプリングハーバー研究所の編集した肝特異的遺伝子プロモーターデータベース（http://rulai.cshl.edu/LSPD/）に列挙されたプロモーターなどは当技術分野において公知である。代表的な遍在的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーター（ＣＭＶ）、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターなどが挙げられる。特定の実施態様では、プロモーターは、ＡｐｏＥ制御領域、例えばヒトＡｐｏＥ制御領域（又はヒトアポリポタンパク質Ｅ／Ｃ－Ｉ遺伝子座、肝制御領域ＨＣＲ－１－Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ３２５１０、配列番号１１に示されている）などのエンハンサー配列に結合している。特定の実施態様では、エンハンサー配列、例えばＡｐｏＥ配列は、上記に列挙されたプロモーター、特にｈＡＡＴプロモーターなどの肝特異的プロモーターに結合している。

特定の実施態様では、核酸構築物は、イントロン、特に、プロモーターとコード配列との間に配置されたイントロンを含む。イントロンが、ｍＲＮＡの安定性及びタンパク質の産生を高めるために導入されてもよい。特定の実施態様では、核酸構築物は、ヒトβグロビンｂ２（すなわちＨＢＢ２）イントロン、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）イントロン、ＳＶ４０イントロン、又はニワトリβ－グロビンイントロンを含む。特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、該イントロンに見られる代替オープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）の数を減少させるように又はさらには完全に除去するように設計された、改変されたイントロン（特に改変されたＨＢＢ２又はＦＩＸイントロン）を含有している。好ましくは、その長さが５０ｂｐ以上にわたり、かつ開始コドンを有するフレーム内に終止コドンを有する、ＡＲＦは除去される。ＡＲＦは、イントロンの配列を改変することによって除去され得る。例えば、改変は、ヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失によって、好ましくはヌクレオチドの置換によって行なわれ得る。一例として、関心対象のイントロンの配列に存在するＡＴＧ又はＧＴＧの開始コドン中の、１つ以上のヌクレオチド、特に１つのヌクレオチドを置換することにより、開始コドンではないコドンがもたらされ得る。例えば、関心対象のイントロン配列内の、ＡＴＧ又はＧＴＧを、開始コドンではないＣＴＧによって置換し得る。

核酸構築物に使用される古典的なＨＢＢ２イントロンは配列番号５に示されている。例えば、このＨＢＢ２イントロンを、該イントロン内の開始コドン（ＡＴＧ及びＧＴＧコドン）を排除することによって改変させ得る。特定の実施態様では、該構築物に含まれる改変されたＨＢＢ２イントロンは、配列番号６に示された配列を有する。核酸構築物に使用される古典的なＦＩＸイントロンは、ヒトＦＩＸの第一イントロンに由来し、これは配列番号７に示されている。ＦＩＸイントロンを、該イントロン内の開始コドン（ＡＴＧ及びＧＴＧコドン）を排除することによって改変させ得る。特定の実施態様では、本発明の構築物に含まれる改変されたＦＩＸイントロンは、配列番号８に示された配列を有する。核酸構築物に使用される古典的なニワトリβグロビンイントロンは配列番号９に示されている。ニワトリ－βグロビンイントロンを、該イントロン内の開始コドン（ＡＴＧ及びＧＴＧコドン）を排除することによって改変させ得る。特定の実施態様では、本発明の構築物に含まれる改変されたニワトリ－βグロビンイントロンは、配列番号１０に示された配列を有する。

本発明者らは、このような改変されたイントロン、特に改変されたＨＢＢ２又はＦＩＸイントロンが有利な特性を有し、導入遺伝子の発現を有意に改善させることができることを示した。さらに、本発明の構築物内に含まれるイントロン内のＡＲＦの数を減少させることによって、構築物の免疫原性も低減すると考えられている。

したがって、本発明はまた、発現カセットに使用されることを目的とし、かつ該カセットに配置された導入遺伝子の発現効率を高めるように改変された、イントロンに関する。特に、本発明は、公知のイントロンから導かれた改変されたイントロンに関するが、ここではＡＲＦの数は減少しているか、又はＡＲＦは完全に除去されている。特定の実施態様では、本発明は、減少した数のＡＲＦを有するか又はＡＲＦを全く有さない、改変されたＨＢＢ２イントロンに関する。さらに特定の実施態様では、改変されたＨＢＢ２イントロンは、配列番号６に示されたイントロンである。別の実施態様では、本発明は、減少した数のＡＲＦを有するか又はＡＲＦを全く有さない、改変されたＦＩＸイントロンに関する。さらに特定の実施態様では、改変されたＦＩＸイントロンは、配列番号８に示されたイントロンである。別の実施態様では、本発明は、減少した数のＡＲＦを有するか又はＡＲＦを全く有さない、改変されたニワトリβ－グロビンイントロンに関する。さらに特定の実施態様では、改変されたニワトリβ－グロビンイントロンは、配列番号１０に示されたイントロンである。本発明のさらなる態様は、本発明の改変されたイントロンを含む核酸構築物、ベクター、例えばウイルスベクター、特にＡＡＶベクター、及び、細胞に関する。核酸構築物は、追加の発現制御配列、例えばプロモーター及び／又はエンハンサー、例えば本明細書に記載されたものなどを含み得る。本明細書に開示されたような改変されたイントロンは、核酸構築物に配置された導入遺伝子、例えば治療用遺伝子のような関心対象の遺伝子の発現効率を高める。本発明のこの態様の文脈において、「治療用遺伝子」は、一般的に、病状の処置に有用である治療用タンパク質をコードする遺伝子をいう。治療用遺伝子は、発現されると、それが存在する細胞若しくは組織に対して、又は、該遺伝子が発現された患者に対して、有益な効果を付与する。有益な効果の例としては、容態若しくは疾病の兆候若しくは症状の寛解、容態若しくは疾病の予防若しくは抑制、又は、所望の特徴の付与が挙げられる。治療用遺伝子としては、患者の遺伝子欠損を部分的に又は完全に修正する遺伝子が挙げられる。特に、治療用遺伝子は、被験者の細胞又は組織中の欠損しているか、不完全であるか、又は最適未満である該タンパク質レベルによって引き起こされる欠損症を軽減するための、遺伝子療法において有用であるタンパク質をコードしている核酸配列であり得るがこれに限定されない。それ故、本発明は、本発明の改変されたイントロンを含み、かつさらには遺伝子療法に使用するための関心対象の治療用遺伝子を含む核酸構築物、ベクター、例えばウイルスベクター、特にＡＡＶベクター、及び、細胞に関する。本発明は、一般的に、被験者の細胞又は組織中の治療用遺伝子の発現によって処置され得る、あらゆる疾病の治療に適用され得る。これらとしては、例えば、増殖性疾患（癌、腫瘍、異形成など）、感染症；ウイルス性疾患（例えばＢ型又はＣ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、ヘルペス、レトロウイルスなどによって誘発された）；遺伝性疾患（嚢胞性線維症、ジストログリカノパチー、ミオパチー、例えばデュシェンヌ型筋ミオパチー；筋細管ミオパチー；血友病；鎌状赤血球貧血、鎌状赤血球症、ファンコニー貧血；糖尿病；筋萎縮性側索硬化症、モノニューロン病（mononeurones disease）、例えば脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、又はシャルコー・マリー・トゥース病；関節炎；重症複合免疫不全症（例えばＲＳ－ＳＣＩＤ、ＡＤＡ－ＳＣＩＤ、又はＸ－ＳＣＩＤ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖血小板減少症、Ｘ連鎖先天性好中球減少症、慢性肉芽腫症など）、心臓血管疾患（再狭窄、虚血、脂質異常症、ホモ接合性家族性高コレステロール血症など）、又は神経疾患（精神病、神経変性疾患、例えばパーキンソン病又はアルツハイマー病、ハンチントン病、耽溺（例えばタバコ、アルコール、又は薬物に対して）、癲癇、カナバン病、副腎白質ジストロフィーなど）、眼病、例えば網膜色素変性症、レーバー先天黒内障、レーバー遺伝性視神経症、シュタルガルト病；リソソーム蓄積症、例えばサンフィリポ症候群；高ビリルビン血症、例えばＣＮＩ型若しくはＩＩ型、又はジルベール症候群、ポンペ病などが挙げられる。上記のように及び以下の開示にさらに展開しているように、レシピエント宿主細胞において治療用遺伝子などの導入遺伝子の発現を奏功するためには、それは好ましくはプロモーターに、それ自身のプロモーター又は異種のプロモーターのいずれかに作動可能に連結されている。多くの適切なプロモーターが当技術分野において公知であり、その選択は、治療用遺伝子によってコードされる産物の所望の発現レベル；構成的発現、細胞特異的発現、又は組織特異的発現を所望するかどうかなどに依存する。改変されたイントロンを含む核酸構築物、該核酸構築物を含むベクター、又は、該構築物若しくは該ベクターを含む細胞はさらに、関心対象の遺伝子が上記に定義されているような治療用遺伝子である場合には、遺伝子療法又は細胞療法に使用され得る。

特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、５’から３’の方向に、エンハンサーの前に場合により配置されたプロモーター、本発明のコドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１コード配列、及びポリアデニル化シグナルを含む、発現カセットである。特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、５’から３’の方向に、エンハンサー（例えばＡｐｏＥ制御領域）の前に場合により配置されたプロモーター、イントロン（特に上記に定義されているようなイントロン）、本発明のコドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１コード配列、及びポリアデニル化シグナルを含む、発現カセットである。さらに特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、５’から３’の方向に、エンハンサー、例えばＡｐｏＥ制御領域、プロモーター、イントロン（特に上記に定義されているようなイントロン）、本発明のコドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１コード配列、及びポリアデニル化シグナルを含む、発現カセットである。

本発明はまた、本明細書に開示されているような核酸配列を含むベクターに関する。特に、本発明のベクターは、遺伝子療法に使用するのに適したベクターである。例えば、ベクターはプラスミドベクターであり得る。より特定すると、ベクターは、肝組織又は肝細胞を標的化する遺伝子療法に適したウイルスベクターである。この場合、本発明の核酸構築物はまた、当技術分野において周知であるように、効果的なウイルスベクターを産生するのに適した配列を含有している。さらに特定の実施態様では、ウイルスベクターはＡＡＶベクター、例えば肝組織又は肝細胞を形質導入するのに適したＡＡＶベクター、より特定すると、ＡＡＶ－１、－２、－５、－６、－７、－８、－９、－ｒｈ１０、－ｒｈ７４、－ｄｊなどのベクター又はレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターである。さらなる実施態様では、ＡＡＶベクターは、一本鎖又は自己相補性二本鎖のいずれかであるゲノムを含む。好ましくは、本発明の実施のために、ＡＡＶゲノムは一本鎖である。当技術分野において公知であるように、用途のために考えられる具体的なウイルスベクターに応じて、機能的なウイルスベクターを得るために、適切な配列が本発明の核酸構築物に導入されるだろう。適切な配列としては、ＡＡＶベクターではＡＡＶＩＴＲ、又はレンチウイルスベクターではＬＴＲが挙げられる。したがって、本発明はまた、各々の側のＩＴＲ又はＬＴＲによってフランキングされる、上記のような発現カセットに関する。

特に好ましい実施態様では、本発明は、一本鎖又は二本鎖の自己相補性ゲノム（例えば一本鎖ゲノム）に本発明の核酸構築物を含む、ＡＡＶベクターに関する。特定の実施態様では、核酸構築物は、配列番号２又は配列番号３に示された配列を含む。１つの実施態様では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ８ベクターである。さらに特定の実施態様では、該核酸は、プロモーター、特に遍在的又は肝特異的プロモーターに作動可能に連結されている。特定の変形の実施態様によると、プロモーターは遍在的プロモーター、例えばサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーター（ＣＭＶ）、ＰＧＫプロモーター、及びＳＶ４０初期プロモーターである。特定の変形では、遍在的プロモーターはＣＡＧプロモーターである。別の変形によると、プロモーターは、肝特異的プロモーター、例えばα－１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、トランスサイレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、及びチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターである。特定の変形では、肝特異的プロモーターは、配列番号４のｈＡＡＴ肝特異的プロモーターである。さらに特定の実施態様では、本発明のＡＡＶベクターのゲノムに含められた核酸構築物はさらに、上記したようなイントロン、例えばプロモーターとＵＧＴ１Ａ１タンパク質をコードしている核酸配列との間に配置されたイントロンを含む。ＡＡＶベクターゲノム内に導入された核酸構築物内に含まれ得る代表的なイントロンとしては、ヒトβグロビンｂ２（すなわちＨＢＢ２）イントロン、ＦＩＸイントロン、及びニワトリβ－グロビンイントロンが挙げられるがこれらに限定されない。ＡＡＶベクターのゲノム内の該イントロンは、古典的な（すなわち未改変の）イントロンであっても、又は、該イントロン内の代替オープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）の数を減少させるように若しくはさらには完全に除去するように設計された改変されたイントロンであってもよい。本発明の核酸がＡＡＶベクター内に導入されているこの実施態様の実践に使用され得る、改変されたイントロン及び未改変のイントロンは、上記に完全に記載されている。特定の実施態様では、本発明のＡＡＶベクター、特にＡＡＶ８ベクターは、そのゲノム内に、改変された（すなわち最適化された）イントロン、例えば配列番号７の改変されたＨＢＢ２イントロン、配列番号８の改変されたＦＩＸイントロン、及び配列番号１０の改変されたニワトリβ－グロビンイントロンを含む。

本発明はまた、本発明の核酸配列を用いて形質転換された、細胞、例えば肝細胞に関する。本発明の細胞を、それを必要とする被験者に、注射を介して、該被験者の肝臓又は血流に送達し得る。特定の実施態様では、本発明は、本発明の核酸配列を肝細胞に、特に、処置しようとする被験者の肝細胞に導入し、そして核酸が導入された該肝細胞を、被験者に投与することを含む。

本発明はまた、本発明の核酸、本発明のベクター、又は本発明の細胞から選択された活性物質を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、医薬組成物も提供する。

本発明はまた、本発明の核酸、ベクター、医薬組成物、又は細胞を、それを必要とする被験者に送達する工程を含む、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の突然変異によって引き起こされた高ビリルビン血症の処置法に関する。特定の実施態様では、高ビリルビン血症は、ＣＮＩ型若しくはＩＩ型、又はジルベール症候群である。

本発明はまた、医薬品として使用するための、本発明の核酸、ベクター、医薬組成物、又は細胞にも関する。

本発明はまた、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の突然変異によって引き起こされた高ビリルビン血症の処置法、特に、ＣＮＩ型若しくはＩＩ型、又はジルベール症候群の処置法に使用するための、本発明の核酸、ベクター、医薬組成物、又は細胞にも関する。

本発明はさらに、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の突然変異によって引き起こされた高ビリルビン血症の処置に、特にＣＮＩ型若しくはＩＩ型、又はジルベール症候群の処置に有用な医薬品の製造における、本発明の核酸、ベクター、医薬組成物、又は細胞の使用にも関する。

発明の詳細な説明
「ＵＧＴ１Ａ１」という用語は、配列番号１に示される野生型ホモサピエンスＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素１ファミリー１、ポリペプチドＡ、（ＵＧＴ１Ａ１）ｃＣＤＮＡをいう（アクセッション番号ＮＭ＿０００４６３．２、これはＵＧＴ１Ａ１ヒトのｍＲＮＡのＣＤＳについてのリファレンス配列である；ＯＭＩＭにおける参照番号１９１７４０）。

「コドンの最適化された」という用語は、ヒトへの偏りを表現するコドン（すなわち、ヒト遺伝子においては一般的であるが、他の哺乳動物遺伝子又は哺乳動物以外の遺伝子においては一般的ではない）が、ヒトへの偏りを表現しない同義のコドン（同じアミノ酸をコードするコドン）へと変化していることを意味する。したがって、コドンの変化によって、コードされたタンパク質においてアミノ酸の変化は全く生じない。

配列番号２又は配列番号３に示された配列、特に配列番号２に示された配列は、本発明のコドンの最適化された核酸配列の好ましい実施態様である。

配列番号２及び配列番号３におけるコドン最適化から派生したＤＮＡ配列の変化は、ＵＧＴ１Ａ１配列のＧＣ含量のそれぞれ約５％及び約１０％の増加をもたらす。

また、「実質的に同一」である、すなわち、配列番号２又は配列番号３の配列に対して約７０％同一、より好ましくは約８０％同一、さらにより好ましくは約９０％同一、さらにより好ましくは約９５％同一、さらにより好ましくは約９７％、９８％、又はさらには９９％同一である、コドンの最適化されたヒトＵＧＴ１Ａ１タンパク質をコードしている本発明の核酸配列も本発明によって包含される。

「同一」は、２つの核酸分子間の配列同一性をいう。２つの比較される両方の配列における位置が、同じ塩基によって占有されている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンによって占有されている場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一率は、２つの配列によって共有される一致した位置の数を、比較される位置の数で割り、それに１００を乗じた関数である。例えば、２つの配列において１０個の位置のなかの６個の位置が一致する場合、２つの配列は６０％同一である。一般的に、最大の同一率が得られるように２つの配列を整列させて比較が行なわれる。当業者に公知である様々な生物情報学ツール、例えばＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡを使用して、核酸配列を整列させ得る。

コドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１コード配列又は本発明の改変されたイントロンに適用されているような「低減した免疫原性」という用語は、このコドンの最適化された遺伝子又は改変されたイントロンが、イントロン内、又はコード配列内、又はその両方において、減少した数の潜在的な代替オープンリーディングフレーム（すなわちＡＲＦ）を含み、これにより、野生型ｃＤＮＡ又は他のＵＧＴ１Ａ１ｃＤＮＡ変異体と比較して、特にコードされているｍＲＮＡからの潜在的な翻訳タンパク質副産物の数が制限することを意味する。特に、その長さが５０ｂｐ以上にわたり、かつ開始コドンを有するフレーム内に終止コドンを有するＡＲＦが減少している。

本発明の文脈において、「遺伝子療法」という用語は、疾病を処置する目的での個々の細胞への遺伝子／核酸の送達を含んだ、被験者の処置をいう。遺伝子の送達は、一般的に、ベクターとしても知られる、送達ビヒクルを使用して達成される。ウイルス性及び非ウイルス性ベクターが、患者の細胞に遺伝子を送達するために使用され得る。特に好ましいのはＡＡＶベクター、特にＡＡＶ８ベクターである。

本発明の核酸は、典型的には分子の３'末端に位置する、１つ以上のポリアデニル化シグナルを含み得ることが理解されるだろう。

本発明の核酸を送達するのに好ましいベクターは、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、又は非病原性のパルボウイルス、より好ましくはＡＡＶベクターである。ヒトパルボウイルスのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、感染した細胞のゲノムに組み込んで潜伏感染を確立することのできる、天然的に複製欠損である、ディペンドウイルスである。最後の特性は、哺乳動物のウイルス間では独特であるようである。なぜなら、組み込みは、第１９番染色体（１９ｑ１３．３－ｑｔｅｒ）に位置するＡＡＶＳ１と呼ばれるヒトゲノムの特定の部位で起こるからである。

それ故、ＡＡＶは、ヒト遺伝子療法のための潜在的なベクターとしてかなりの関心を集めている。ウイルスの好ましい特性には、ヒトの疾病を全く伴わないこと、分裂中及び分裂中ではない細胞の両方に感染できること、並びに、様々な組織に由来する多様な細胞系列に感染できることである。

ヒト又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され十分に特徴付けられたＡＡＶの血清型の中で、ヒト血清型２が、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶである。他の現在使用されているＡＡＶ血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、及びＡＡＶｄｊなどが挙げられる。さらに、天然ではない工学操作された変異体及びキメラＡＡＶも有用であり得る。

ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学的技術を使用して工学操作され得、これらの粒子を、細胞特異的に核酸配列を送達するために、免疫原性を最小限とするために、安定性及び粒子の寿命を調整するために、効果的な分解のために、核への正確な送達のために、最適化させることが可能となる。

ベクターへの構築のための望ましいＡＡＶ断片は、キャップタンパク質（ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３及び超可変領域を含む）、ｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０を含む）、及びこれらのタンパク質をコードする配列を含む。これらの断片は、様々なベクター系及び宿主細胞に容易に利用され得る。

Ｒｅｐタンパク質を欠失したＡＡＶ系の組換えベクターは、低い効率で宿主のゲノムに組み込み、標的細胞内で数年間持続することのできる安定な環状エピソームとして主に存在する。

天然のＡＡＶ血清型を使用する代わりに、人工的なＡＡＶ血清型（例えば、非天然のキャプシドタンパク質を有するＡＡＶを含むがこれに限定されない）を、本発明の文脈において使用し得る。このような人工的なキャプシドは、任意の適切な技術によって、異なる選択されたＡＡＶ血清型から、同じＡＡＶ血清型の非連続的な部分から、ＡＡＶではないウイルス源から、又は非ウイルス源から得ることのできる異種配列と組み合わせて、選択されたＡＡＶ配列（例えばｖｐ１キャプシドタンパク質の断片）を使用して作製され得る。人工的なＡＡＶ血清型は、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド、又は「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであり得るがこれらに限定されない。

したがって、本発明は、コドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１コード配列である、本発明の核酸を含む、ＡＡＶベクターに関する。本発明の文脈において、ＡＡＶベクターは、関心対象の標的細胞、特に肝細胞を形質導入することのできるＡＡＶキャプシドを含む。特定の実施態様によると、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－１、－２、－５、－６、－７、－８、－９、－ｒｈ１０、－ｒｈ７４、－ｄｊなどの血清型である。さらに特定の実施態様では、ＡＡＶベクターは、シュードタイプ化ベクターであり、すなわちそのゲノム及びキャプシドは、血清型の異なるＡＡＶに由来する。例えば、シュードタイプ化ＡＡＶベクターは、そのゲノムがＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ｒｈ１０、ｒｈ７４、又はｄｊ血清型に由来し、そのキャプシドが別の血清型に由来するベクターであり得る。例えば、シュードタイプ化ベクターのゲノムは、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、１０、ｒｈ１０、ｒｈ７４、又はｄｊ血清型に由来し得、そのキャプシドはＡＡＶ８又はＡＡＶ９血清型に由来し、特にＡＡＶ８血清型に由来する。

別の実施態様では、キャプシドは改変されたキャプシドである。本発明の文脈において、「改変されたキャプシド」は、キメラキャプシドであり得るか、又は、１つ以上の野生型ＡＡＶＶＰキャプシドタンパク質に由来する１つ以上の変異ＶＰキャプシドタンパク質を含むキャプシドであり得る。特定の実施態様では、ＡＡＶベクターはキメラベクターであり、すなわち、そのキャプシドは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型に由来するＶＰキャプシドタンパク質を含むか、又は、少なくとも２つのＡＡＶ血清型に由来するＶＰタンパク質領域若しくはドメインを合体させた少なくとも１つのキメラＶＰタンパク質を含む。肝細胞を形質導入するのに有用であるこのようなキメラＡＡＶベクターの例は、Shen et al., Molecular Therapy, 2007及びTenney et al., Virology, 2014に記載されている。例えば、キメラＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８キャプシド配列と、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、９、１０、ｒｈ１０、ｒｈ７４、又はｄｊ血清型の配列との組合せから得ることができる。別の実施態様では、ＡＡＶベクターのキャプシドは、肝臓への高い指向性を呈する、１つ以上の変異ＶＰキャプシドタンパク質、例えば国際公開公報第２０１５０１３３１３号に記載のもの、特にＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４及びＲＨＭ１５－６キャプシド変異体を含む。

別の実施態様では、改変されたキャプシドは、間違いを起こしがちなＰＣＲ及び／又はペプチド挿入（例えばBartel et al., 2011に記載）によって挿入されたキャプシドの改変からも得られる。さらに、キャプシド変異体は、チロシン突然変異体などの単一アミノ酸変化を含み得る（例えば、Zhong et al., 2008に記載）。

さらに、ＡＡＶベクターのゲノムは、一本鎖又は自己相補性二本鎖ゲノムのいずれかであり得る（McCarty et al., Gene Therapy, 2003）。自己相補性二本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ末端反復配列の１つから、末端分離部位（terminal resolution site）（ｔｒｓ）を欠失させることによって作製される。これらの改変されたベクター（その複製ゲノムは、野生型ＡＡＶゲノムの長さの半分である）は、ＤＮＡ二量体をパッケージングする傾向を有する。好ましい実施態様では、本発明の実践で実行されるＡＡＶベクターは、一本鎖ゲノムを有し、さらに好ましくはＡＡＶ８、ＡＡＶ２、又はＡＡＶ５キャプシド、より好ましくはＡＡＶ８キャプシドを含む。

実施例で以下に具現された具体的な送達システムとは別に、様々な送達システムが公知であり、これを使用して本発明の核酸を投与することができ、例えば、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル、コドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１コード配列を発現することのできる組換え細胞中への封入、レセプター媒介エンドサイトーシス、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての治療用核酸の構築などがある。核酸の投与法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の核酸配列は、ベクター化されていようがいまいが、任意の慣用的な経路によって、例えば、注入又はボーラス注射によって、上皮裏打ち又は皮膚粘膜裏打ち（例えば口腔粘膜、直腸粘膜、及び腸粘膜など）を通しての吸収によって投与され得、他の生物学的に活性な物質と一緒に投与され得る。投与は全身性又は局所性であり得る。さらに、本発明の医薬組成物を被験者の肝臓に任意の適切な経路によって導入することが望ましくあり得る。さらに、裸ＤＮＡ、例えばミニサークル及びトランスポゾンを、送達又はレンチウイルスベクターのために使用することができる。さらに、遺伝子編集技術、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲも、本発明のコード配列を送達するのに使用することができる。

特定の実施態様では、本発明の医薬組成物を、処置の必要な領域、すなわち肝臓に局所投与することが望ましくあり得る。これは、例えば、埋込剤を用いて達成され得、該埋込剤は、多孔性、非多孔性、又はゲル性材料、例えば膜、例えばシリコン製の膜、又は繊維である。

別の実施態様では、本発明の核酸は、小胞、特にリポソームで送達され得る。

さらに別の実施態様では、本発明の核酸は、放出制御システムで送達され得る。

本発明はまた、本発明の核酸、又は本発明のベクター、又は本発明の細胞を含む、医薬組成物も提供する。このような組成物は、治療有効量の治療剤（本発明の核酸、ベクター、又は細胞）及び薬学的に許容される担体を含む。特定の実施態様では、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府若しくは州政府の規制当局によって認可されていること、又は、米国薬局方若しくは欧州薬局方、又は動物及びヒトにおける使用のための他の一般的に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルをいい、これと共に治療剤が投与される。このような薬学的担体は、無菌液体、例えば水及び油、例えば原油、動物、植物、又は合成を起源とする油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであり得る。医薬組成物を静脈内投与する場合には水が好ましい担体である。食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射液のために使用することができる。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、ブドウ糖、乳糖、スクロース、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。

該組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝化剤も含有することができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの剤形をとることができる。経口用製剤は、標準的な担体、例えば医薬等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。適切な薬学的担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、被験者への適切な投与のための剤形を提供するように、適切な量の担体と一緒に、好ましくは精製形態の、治療有効量の治療剤を含有するだろう。特定の実施態様では、本発明の核酸、ベクター、又は細胞は、リン酸緩衝化食塩水を含みかつ０．２５％のヒト血清アルブミンの補充された、組成物中に製剤化される。別の特定の実施態様では、本発明の核酸、ベクター、又は細胞は、全組成物の重量に対して０．０１～０．０００１重量％の最終濃度、例えば０．００１重量％の濃度の乳酸リンゲル液及び非イオン性界面活性剤、例えばプルロニックＦ６８を含む、組成物中に製剤化される。該製剤はさらに、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、例えば０．２５％のヒト血清アルブミンを含み得る。保存又は投与のいずれかのための他の適切な製剤は、特に国際公開公報第２００５／１１８７９２号又はAllay et al., 2011から当技術分野において公知である。

好ましい実施態様では、該組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物と同じ慣用的な手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要であれば、該組成物はまた、可溶化剤と、注射部位における疼痛を和らげるための局所麻酔剤、例えばリグノカインとを含み得る。

ＣＮの処置に効果的であろう本発明の治療剤（すなわち核酸、ベクター、又は細胞）の量は、標準的な臨床的技術によって決定され得る。さらに、インビボ及び／又はインビトロアッセイを場合により使用して、最適な投与量範囲を予測するのを助けることができる。製剤中に使用される正確な用量はまた、投与経路及び疾病の重度にも依存し、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。必要とする被験者へ投与される核酸、ベクター、又は細胞の用量は、投与経路、処置される具体的な疾病、被験者の年齢、又は必要とされる治療効果にとって必要な発現レベルを含むがこれらに限定されない、いくつかの因子に基づいて変更されるだろう。当業者は、当技術分野におけるその知識に基づいて、これらの因子及び他の因子に基づいて必要とされる投与量の範囲を容易に決定することができる。ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターを被験者に投与することを含む処置の場合、典型的なベクターの投与量は、体重１kgあたり少なくとも１×１０^８個のベクターゲノム（vg/kg）、例えば少なくとも１×１０^９vg/kg、少なくとも１×１０^１０vg/kg、少なくとも１×１０^１１vg/kg、少なくとも１×１０^１２vg/kg、少なくとも１×１０^１３vg/kg、又は少なくとも１×１０^１４vg/kgである。

図１は、野生型ＵＧＴ１Ａ１又は２つのコドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１配列を発現しているプラスミドを用いてトランスフェクトされたＨｕｈ－７細胞において観察されたメッセンジャーＲＮＡのレベル（パネルＡ）、及び、同じ試料中のＵＧＴ１Ａ１タンパク質のウェスタンブロットによる定量（パネルＢ）を示したグラフを含む。図２は、ルシフェラーゼの発現における様々なイントロンの最適化の効果（パネルＡ）、並びに、ＵＧＴ１Ａ１のＲＮＡ及びタンパク質発現レベルに対するＨＢＢ２最適化の効果（パネルＢ）を示したグラフを含む。図３は、コドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１コード配列を含有し、かつ、野生型（ＵＧＴ１Ａ１２．０）又は最適化（ＵＧＴ１Ａ１２．１）ＨＢＢ２イントロンのいずれかを含有している、２つのベクターからのＵＧＴ１Ａ１タンパク質の発現を示した、ウェスタンブロットゲルの写真である。図４は、野生型ＵＧＴ１Ａ１ベクター（Ａ）及びコドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１ｖ２．１ベクター（Ｂ）内の代替リーディングフレーム（ＡＲＦ）のコンピューターを用いての分析の図解である。図５は、コドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１ベクター又はＰＢＳを様々なラット株へと注射した後に毎週測定された総ビリルビン（ＴＢ）のレベルを示したグラフである。図６は、低用量のコドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１ベクター又はＰＢＳを様々なラット株へと注射した後に毎週測定された総ビリルビン（ＴＢ）のレベル（図５に報告されたデータと比較して）を示したグラフである。図７は、（Ａ）３つのＵＧＴ１Ａ１ベクターを注射した後に毎週測定された総ビリルビン（ＴＢ）のレベル（図８に報告されたデータと比較して）を示したグラフ；（Ｂ）３つのベクターを用いて処置されたラットから得られた肝抽出物のウェスタンブロットの写真及びその相対的定量；及び（Ｃ）雄及び雌の動物の両方への注射から４か月後のＡＡＶ８－ｖ２．１ＵＧＴ１Ａ１の効力の長期評価を提示したグラフを含む。図８は、クリグラー・ナジャー症候群のマウスモデルにおいて重度の高ビリルビン血症（総ビリルビン、mg/dlとして表現）を修正する様々な構築物の能力を示したグラフである。非処置動物（ＵＮＴＲ）が報告されている。

範囲：この開示全体を通して、本発明の様々な態様を、範囲の形式で提示することができる。範囲の形式での記載は単に簡便性及び簡潔性のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として捉えられるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、具体的に開示された全ての可能な部分範囲、並びに、その範囲内の個々の数値を有すると考えられるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示された部分範囲、並びに、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６などを有すると考えられるべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用される。

本明細書に引用された各々及びそれぞれの特許、特許出願、及び刊行物の開示は、これによって、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

さらに記載することなく、当業者は、上の記載及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明の化合物を製造及び使用し、特許請求された方法を実践することができると考えられる。

実施例
本発明は、以下の実験例及び添付の図面への参照によってさらに詳述されている。これらの実施例は、単に説明のためだけに提供され、制限するためではない。

材料及び方法
コドン最適化及びＡＡＶベクター構築物：
ＵＧＴ１Ａ１は、いくつかの異なるアルゴリズムに従ってコドン最適化を受けた。さらに、隠れた転写開始部位の除去を、構築物全体を対して実施した。得られた構築物を、発現プラスミドに導入するか、又は、ＡＡＶ血清型８ベクターにパッケージングするかのいずれかを行ない、そして効力についてインビトロ及びインビボ（ラット及びマウス）で試験した。

これらの構築物のために以下の略称を、この実験部全体を通して使用する：
－ＷＴ．０：野生型ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子及び野生型ＨＢＢ２イントロン（配列番号５）；
－ＷＴ：野生型ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子及びいくつかのＡＲＦが除去された最適化されたバージョンのＨＢＢ２イントロン（配列番号６）；
－ｖ２（又はｖ２．０）：コドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子バージョン２．０（配列番号２）及び野生型ＨＢＢ２イントロン（配列番号５）を含む；
－ｖ２．１：コドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子バージョン２．０（配列番号２）及びいくつかのＡＲＦが除去された最適化されたバージョンのＨＢＢ２イントロン（配列番号６）を含む；
－ｖ３：コドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子バージョン３（配列番号３）を、いくつかのＡＲＦが除去された最適化されたバージョンのＨＢＢ２イントロン（配列番号６）と共に含む；
－ＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｗｔＵＧＴ１Ａ１：ｈＡＡＴプロモーター野生型ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子の制御下で野生型構築物を含有しているＡＡＶ８ベクター；
－ＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｃｏＵＧＴ１Ａ１ｖ２：ｈＡＡＴプロモーターの制御下でｖ２構築物を含有しているＡＡＶ８プロモーター；
－ＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｃｏＵＧＴ１Ａ１ｖ２．１：ｈＡＡＴプロモーターの制御下でｖ２．１構築物を含有しているＡＡＶ８ベクター；
－ＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｃｏＵＧＴ１Ａ１ｖ３：ｈＡＡＴプロモーター野生型の制御下でｖ３構築物を含有しているＡＡＶ８ベクター。

インビトロでのアッセイ：
ヒト肝細胞の細胞株Ｈｕｈ７を、０、５０００（５）、１００００（１０）、若しくは２５０００（２５）の漸増する感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入したか、又は、指定されたプラスミド及びリポフェクタミンを用いてトランスフェクトした。形質導入から４８時間後、細胞を収集し、溶解し、ミクロソーム抽出物を調製し、ウェスタンブロット上にのせ、そこでヒトＵＧＴ１に対するポリクローナル抗体を使用してタンパク質を検出した。構成的に発現されているタンパク質のカルネキシンをローディング対照として使用した。

ミクロソーム調製のために使用された細胞の部分を、トリゾールを用いてのｍＲＮＡの抽出のために使用した。抽出されたｍＲＮＡをＤＮＡｓｅを用いて処理し、逆転写し、ＵＧＴ１Ａ１配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ヒト血清アルカリホスファターゼに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを標準化のために使用した。

コンピューターを用いての分析：
代替リーディングフレーム（ＡＲＦ）分析を、VectorNTIソフトウェア（Life Technologies）Classic startに存在するＯＲＦ分析ツールを用いて２つのＵＧＴ１Ａ１配列のコード鎖に対して実施し、真核細胞のための終止部位を利用した（それぞれ開始部位としてＡＴＧ、終止部位としてＴＡＡＴＧＡＴＡＧ）。その長さが５０ｂｐ以上にわたり、開始コドンを有するフレーム内に終止コドンを有する場合に、ＡＲＦが考慮された。

動物：
ＵＧＴ１Ａ１遺伝子に欠損を呈する６～８週令のＧｕｎｎラットに、ベクターを注射した。ベクターを、０．５mlの容量で尾静脈を介して送達した。血清試料を１週間に１回、回収し、総ビリルビン（ＴＢ）値をモニタリングした。処置されていない罹患動物及び野生型又は健康な同腹仔を対照として使用した。

Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドのＵｇｔ１突然変異マウスは以前に作製されている（Bortolussi et al., 2012）。野生型同腹仔を対照として使用した。マウスを、施設ガイドライン、並びに地域倫理委員会及び関連する規制当局によって承認された実験手順に従って、動物実験のためのＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵを十分に尊重して、飼育し取り扱った。Ｕｇｔ１ａ遺伝子の遺伝子突然変異を、ＦＶＢ／ＮＪマウス株に導入した。この研究に使用された動物は、それぞれＣ５７Ｂｌ／６マウス及びＦＶＢ／ＮＪと９回を超える戻し交配後に得られた、少なくとも９９．８％のＣ５７Ｂｌ／６マウス又はＦＶＢ／ＮＪ遺伝的バックグラウンドであった。マウスを、１２／１２時間の明暗サイクルを有する温度制御された環境で保った。該マウスは標準的な固形飼料及び水を自由に受け取った。ベクターを出生後２日目（Ｐ２）に腹腔内に注射し、ビリルビン値を、ベクターの注射から４週間後にアッセイした。

ＡＡＶの用量：
投与されたベクターの用量を、図の説明文に示した。

ラットの血清の調製：
血液試料を、後眼窩静脈叢への穿刺によって１週間に１回乾燥シリンジへ回収した。血液を４℃で８０００rpmで遠心分離にかけ、分注し、－２０℃で凍結させた。

マウスの血漿の調製：
血液試料を、突然変異型及び野生型の同腹仔への注射から４週間後に、心臓穿刺によってＥＤＴＡ入りの回収用シリンジに回収した。血液を２５００rpmで遠心分離にかけ、血漿を回収し、分注し、－８０℃で凍結させた。全ての手順を薄暗い所で実施して、ビリルビンの分解を回避した。

ラットのビリルビンの測定：
血清中の総ビリルビンの測定を、ビリルビンアッセイキット（Abnova、参照番号KA1614）を使用して製造業者によって記載されているように行なった。本発明者らは、５０μLの容量の血清を使用して、分析を実施した。５３０nmでの吸光値を、マルチプレートリーダー（PerkinElmer EnSpire）を使用することによって得た。

マウスのビリルビンの測定：
血漿中の総ビリルビンの測定を、Direct and Total Bilirubin Reagentキット（BQ Kits, San Diego, CA）を使用して、製造業者によって記載されているように、小さな改変を加えて実施した：反応の規模を小さくし、それを最終容量３００μl（６０００μlの代わりに）で、僅か１０μlの血漿を用いて実施した。３つの市販のビリルビン参照標準物質（対照血清Ｉ、対照血清ＩＩ、及びビリルビン検量用試料、Diazyme Laboratories, Poway, CA, USA）を、品質対照として各セットの分析に含めた。５６０nmでの吸光値を、マルチプレートリーダー（Perkin Elmer Envision Plate Reader, Walthman, MA, USA）を使用することによって得た。

肝臓抽出物に対するウェスタンブロット：
３つのベクターの中のいずれか１つを注射した動物から得られた瞬間凍結させた肝臓を迅速にホモジナイズした。ホモジネートを、ミクロソームの調製のために使用した。その後、ミクロソーム抽出物をウェスタンブロットにのせ、そこで、ヒトＵＧＴ１に対するポリクローナル抗体を使用してタンパク質を検出した。タンパク質のバンドを定量した。

結果
ヒトＵＧＴ１Ａ１コード配列のコドンの最適化されたバージョンを作製し、発現プラスミドに導入した。２つの最適化されたＵＧＴ１Ａ１コード配列（ｖ２及びｖ３配列）、及び野生型配列を、Ｈｕｈ－７細胞にトランスフェクトした。得られた結果を図１に報告する。この実験は、２つのコドン最適化配列が、インビトロでヒト細胞内で野生型配列よりも効率的に翻訳されることを示す。

図２のパネルＡでは、ｈＡＡＴプロモーターの転写制御下でルシフェラーゼを発現しているプラスミドを用いてのトランスフェクションによって、Ｈｕｈ－７細胞において産生されたルシフェラーゼレベルが示されている。様々なイントロン配列が、ルシフェラーゼコード配列の５’にクローニングされている。そのなかの２つ、すなわちＨＢＢ２及びＦＩＸイントロンが、野生型の該イントロンの配列において同定されたＡＴＧコドン内の１つのヌクレオチドを置換することによって行なわれた配列内のＡＲＦの除去によって最適化された。肝細胞株における最適化構築物の発現は、イントロン配列からのＡＲＦの除去が、インビトロでどちらの場合においてもルシフェラーゼの発現を増加させ、最適化されたＨＢＢ２イントロンが特に強力であることを示す。パネルＢでは２つのプラスミドを比較し、どちらもｈＡＡＴプロモーターの転写制御下でＵＧＴ１Ａ１を発現している。Ｖ２．０は野生型ＨＢＢ２イントロンを含有し、一方、ｖ２．１は、最適化バージョンを含有している。示されたデータは、ｖ２．１プラスミドが、ｖ２．０よりも５０％多くＵＧＴ１Ａ１を発現し、ｍＲＮＡレベルは全く増加していないことを示す。

コドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１バージョン２．０及び２．１ＡＡＶ８ベクター（それぞれ、ＵＧＴ１Ａ１２．０及びＵＧＴ１Ａ１２．１）をインビトロで試験した。ＵＧＴ１Ａ１２．０ベクター及びＵＧＴ１Ａ１２．１ベクターは、それらが野生型ＨＢＢ２イントロン（配列番号５）又は改変されたＨＢＢ２イントロン（ここではＡＲＦが除去されている）（配列番号６）をそれぞれ含有しているという事実によってのみ異なる。得られた結果を図３に報告する。この実験は、コドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１ベクターバージョン２．１が、インビトロでヒト細胞内で２．０バージョンよりも強力であることを示す。

図４は、野生型ＵＧＴ１Ａ１ベクター（Ａ）及びコドンの最適化されたＵＧＴ１Ａ１ｖ２．１ベクター（Ｂ）内の代替リーディングフレーム（ＡＲＦ）のコンピューターを用いての分析の結果を示す。ｖ２．１ベクターは、野生型配列と比較して少数のＡＲＦしか有さず、ほとんどがプロモーターに対して逆方向である。さらに、本発明者らは、図４で、ＨＢＢ２イントロン（Ａに提示された野生型ＵＧＴ１Ａ１構築物に使用される）に通常存在するＡＲＦ９及び１０が、ＵＧＴ１Ａ１ｖ２．１最適化ベクターに導入された配列番号６の改変されたＨＢＢ２イントロンから除去されていることが分かる。

次いで、コドンの最適化されたＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｃｏＵＧＴ１Ａ１ｖ２．１ベクターを、５×１０^１２vg/kgの用量で投与した。尾静脈へのベクターの注射を、６週令のホモ接合型Ｇｕｎｎラット（ＵＧＴ１Ａ１－／－）で実施した。図５のグラフには、ＰＢＳの注射された野生型Ｇｕｎｎラット（ＷＴ、灰色の線）、ヘテロ接合型Ｇｕｎｎラット（ＵＧＴ１Ａ１＋／－、点線）、及びホモ接合型Ｇｕｎｎラット（黒線）への注射後、毎週測定された総ビリルビン（ＴＢ）レベルが示されている。全てのデータは、平均値±標準誤差として表現されている。コドンの最適化されたベクターの注射により、疾病の表現型は完全に修正された。

ＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ＵＧＴ１Ａ１ｖ２．１ベクターは、５×１０^１１vg/kgの用量でも投与された。ベクターが、６週令のホモ接合型Ｇｕｎｎラット（ＵＧＴ１Ａ１－／－）への尾静脈への注射によって投与された。図６のグラフには、ＰＢＳの注射された野生型Ｇｕｎｎラット（ＷＴ、灰色の線）、ヘテロ接合型Ｇｕｎｎラット（ＵＧＴ１Ａ１＋／－、点線）、及びホモ接合型Ｇｕｎｎラット（黒線）への注射後、毎週測定された総ビリルビン（ＴＢ）レベルが示されている。全てのデータは、平均値±標準誤差として表現されている。コドンの最適化されたベクターの注射により、疾病の表現型は完全に修正された。

２つのコドンの最適化された（ｖ２．１及びｖ３）及び野生型ＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ＵＧＴ１Ａ１ベクターをさらに、５×１０^１１vg/kgの用量で投与した。尾静脈へのベクターの注射を、６週令のホモ接合型Ｇｕｎｎラット（ＵＧＴ１Ａ１－／－）で実施した。図７Ａのグラフには、注射後、毎週測定された総ビリルビン（ＴＢ）のレベルが示されている。全てのデータは平均値±標準誤差として表現されている。図７のパネルＡに示されているように、３つのベクターの注射により、疾病の表現型は完全に修正された。注射から２か月後、動物を屠殺し、ＵＧＴ１Ａ１タンパク質レベルを、肝臓ホモジネートのウェスタンブロットによって定量した。パネルＢには、ＵＧＴ１Ａ１タンパク質に対して特異的である抗体を用いてのウェスタンブロットの写真が示されている。バンドの定量は、たとえ差異が、様々な動物で観察された発現レベルの大きなばらつきに因り有意ではなくても、ＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｃｏＵＧＴ１Ａ１ｖ２．１で処置されたラットにおけるＵＧＴ１Ａ１タンパク質の量の増加を示した。

５×１０^１２vg/kgのＡＡＶ８－ｖ２．１ＵＧＴ１Ａ１ベクターを注射した２カ月令のＧｕｎｎラットにおいて長期の効力を評価した。注射から４か月後、血液中の平均ビリルビンレベルは、雄ラットにおいて１．７５mg/dL（０日目における初期レベル：７．４９、７７％の減少）、雌ラットにおいて０．８５mg/dL（０日目における初期レベル：６．１５mg/dL、８６％の減少）である。表現型の長期修正を示すこの結果は、様々な構築物を使用して雌ラットにおいてビリルビン基線レベルの僅か５０％の減少を報告した、Pastore et al.の以前の研究と比較して特に顕著である。まとめると、示されたデータは、ＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｃｏＵＧＴ１Ａ１ｖ２．１に適用された本発明のプロセスにより、ＣＮを治癒するために開発された他のベクターと比較してより良好なインビボでの効力を有するベクターがもたらされたことを示した。

本発明者らはまた、クリグラー・ナジャー症候群のマウスモデルにおける総ビリルビンの修正効力を試験した。図８は、注射から１か月後の総ビリルビン（ＴＢ）レベルを示したグラフである。動物に、出生後２日目（Ｐ２）に３×１０^１０vg/マウスの用量を注射した。

１５日間の光線療法を用いて生存を維持していた非処置の罹患動物を、対照として使用した（ＵＮＴＲ（ＰＴ)）。

この実験は、バージョン２．１ベクターが、全てのベクターの中で最も高いレベルの総ビリルビン修正をもたらすことを示す。全てのデータは、平均値±標準偏差として表現される。各々の点は、一匹の動物を示す。

参考文献

Claims

減少した数の代替オープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）を有するか又はＡＲＦを全く有さない改変されたイントロンであり、配列番号５のＨＢＢ２イントロンに比べて改変されたＨＢＢ２イントロンである、イントロン。
配列番号６の改変されたＨＢＢ２イントロンである、請求項１のイントロン。
請求項１又は２記載のイントロンを含む、核酸構築物。
関心対象の遺伝子及び１つ以上の追加の発現制御配列、例えばプロモーター及び／又はエンハンサーをさらに含む、請求項３の核酸構築物。
プロモーターが、遍在的な又は組織特異的なプロモーター、特に肝臓特異的プロモーターである、請求項４の核酸構築物。
請求項１又は２記載のイントロン又は請求項３～５のいずれか一項記載の核酸構築物を含む、ベクター。
ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである、請求項６記載のベクター。
一本鎖又は二本鎖自己相補性ＡＡＶベクターである、請求項６又は７記載のベクター。
ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ由来キャプシド、例えばＡＡＶ－１、－２、－５、－６、－７、－８、－９、－ｒｈ１０、－ｒｈ７４、－ｄｊキャプシドを有するか、又はキメラキャプシドを有する、請求項７又は８記載のベクター。
ＡＡＶベクターがＡＡＶ８キャプシドを有する、請求項７～９のいずれか一項記載のベクター。
シュードタイプ化ＡＡＶベクターである、請求項７～１０のいずれか一項記載のベクター。
請求項３～５のいずれか一項記載の核酸構築物又は請求項６～１１のいずれか一項のベクターを用いて形質転換された単離細胞。
肝細胞又は筋肉細胞である、請求項１２記載の細胞。
関心対象の遺伝子が、遺伝子療法又は細胞療法の方法に使用するための治療用遺伝子である、請求項３～５のいずれか一項の核酸構築物、請求項６～１１のいずれか一項のベクター、又は請求項１２～１３のいずれか一項記載の細胞。