CN109082402B - 一种aav-dj型腺相关病毒体外高效感染类器官的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程和细胞工程技术领域，具体为一种AAV‑DJ型腺相关病毒体外高效感染类器官的用途。本发明使用商业化的AAV‑DJ型腺相关病毒对人和小鼠的类器官进行体外平面化侵染，完成感染后再将平面化培养的类器官重新用3D培养体系培养72小时。最后采用荧光共聚焦显微照相技术结合流式细胞术检测类器官的感染效率。结果表明，AAV‑DJ病毒可以在体外高效感染人和小鼠的类器官，感染效率可达80％，甚至更高，远远优于已报道的类器官基因操作工具，为类器官体外研究的学者们解决了一大难题，也为肝脏再生的临床研究打下坚实的基础。

Description

一种AAV-DJ型腺相关病毒体外高效感染类器官的用途
技术领域
本发明属于基因工程和细胞工程技术领域，具体涉及一种AAV-DJ型腺相关病毒体外高效感染类器官的用途。
背景技术
类器官是一种接近于体内生理条件，具有自我更新能力和自我组织能力，且具有相应组织器官功能的一类细胞团。类器官来源原代组织，胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的其中之一，并依赖人工胞外基质（ECM）自我组织恢复成原始组织细胞结构。与传统的体外培养不同，类器官具有和原代组织类似的细胞组成和结构，并且包含小部分具有稳定基因组，自我更新和分化潜能的干细胞。另外一个重要的特点是类器官可以在体外无限扩增并可以和普通细胞一样进行冻存。另外，类器官基于ECM培养方式也提供了一种可以体外探究细胞微环境对类器官生长的影响。
这些独特的优势使得类器官在学术研究和工业技术中得到了广泛的应用。通过获取少量的器官组织，便可在体外迅速扩增得到大量的类器官，用于干细胞行为研究，药物筛选，疾病模型建立和遗传筛选。从健康人体和病人中获取的类器官还可以建立类器官样本库，供世界范围内的研究者进行相关研究。
类器官的基因工程改造是将具有功能基因片段高效导入类器官，经过表达后发挥功能。以CRISPR/Cas9修复囊泡纤维症病人来源的肠道类器官为例，将Cas9质粒，打靶质粒以及sgRNA导入类器官，Cas9蛋白发挥作用，将突变的CFTR位点修复，从而使其恢复正常生理功能。但是目前类器官导入外院基因的手段主要集中：1. 脂质体转染；2. 逆转录病毒感染；3. 电击转化等。其中，脂质体转染和电击转化都要求较高的细胞数目，并且最高效率只有30%，逆转录病毒感染后基因会整合至基因组，无法去除。
AAV因其无致病性、低免疫反应性、感染宿主广泛，瞬时表达效率高等优势，成为基因治疗领域应用前景最好的载体之一。但是AAV基因组存在包装容量有限，对多数组织转导效率不尽如人意等主要缺陷，成为困扰AAV在临床应用中的瓶颈问题。AAV-DJ型是一种经过随机同源重组和进化筛选得到的一种具有广泛感染效力的腺相关病毒。然而，针对AAV体外高效感染类器官的研究相对较少，因此，提供一种AAV体外高效感染类器官的方法，成为现阶段迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种AAV-DJ病毒在体外实验中的一种新用途，即体外高效感染类器官，在一些实施方式中，感染效率最高可达到80%以上
本发明提供的AAV-DJ型腺相关病毒体外高效感染类器官用途，所述的类器官为人和小鼠的上皮类器官，具体地，包括肝脏类器官、肠道类器官和肾类器官。具体步骤为：
（1）将刚脱离3D培养的类器官与AAV-DJ病毒感染液混匀，然后平面化共孵育，完成感染过程；
（2）感染完成后，类器官脱离平面化状态，重新回到3D立体培养的状态；
（3）经过3D培养48~72小时后，类器官经过固定，染色，制片，然后用荧光共聚焦显微镜观察拍照GFP荧光；类器官经过洗涤，消化，重悬，用于流式细胞术检测GFP阳性细胞群的比例，即感染效率。
步骤（1）中所述的AAV-DJ病毒感染液是将商业化的AAV-DJ（购于Vector Biolabs，货号：7078）按照需要感染的类器官细胞数目进行一定的比例稀释（一般为1:400~1:20，即20-400倍的稀释），优选的，MOI=10E6，稀释培养基为类器官培养所用的培养基。
步骤（1）中所述的平面化状态，是指类器官脱离原始的3D培养状态，在与病毒液混合后，均匀的滴在铺有商业化Matrigel（购于Corning, 货号：356231）的孔板中。
步骤（2）中所述的类器官脱离平面化状态，重新回到3D立体培养的状态，是指类器官连同病毒液一起收集在离心管中，经过自然沉降，去除病毒液，再使用PBS冲洗两遍，去除PBS后，再用Matrigel重新包裹类器官，进行3D培养。
步骤（1）和步骤（2）中所述的类器官培养用培养基包括基础培养基AdvancedDMEM/F12（购于Thermo，货号：12634028）培养基和其他维持类器官正常生长的生长因子或小分子，具体的，其组分和含量如下：
100-1000ng/ml 终浓度的R-spondin1；
50-500ng/ml 终浓度的EGF；
100-1000ng/ml 终浓度的 FGF10；
25-250ng/ml 终浓度的 HGF；
10-100nm 终浓度的 Gastrin。
结果显示，采用上述方法感染的类器官，GFP阳性地细胞占总细胞数的80%以上，达到80%~90%，实现了对类器官的高效感染，这是其他基因转染方法所无法比拟的，取得了意料不到的技术效果。
相关数据显示，使用脂质体转染和电转可以实现将外源基因导入类器官，效率分别是30%和50%，远低于本发明。
与现有技术相比，本发明的优势在于：本发明AAV-DJ病毒体外感染人和鼠类器官，实现了对类器官的高效感染，感染效率可达80~90%，是其他基因转染方法所不能比拟的，为类器官体外基因功能研究解决了一大难题，也为类器官治疗的临床研究打下坚实基础。
附图说明
图1为AAV-DJ感染小鼠肝脏类器官72小时后，20倍共聚焦显微镜拍摄下的荧光图。
图2为AAV-DJ感染小鼠肝脏类器官72小时后，与对照一起进行的流式分析结果。
图3为AAV-DJ感染小鼠肠道类器官72小时后，20倍共聚焦显微镜拍摄下的荧光图。
图4为AAV-DJ感染小鼠肠道类器官72小时后，与对照一起进行的流式分析结果。
图5为AAV-DJ感染人肝脏类器官72小时后，20倍共聚焦显微镜拍摄下的荧光图。
图6为AAV-DJ感染人肝脏类器官72小时后，与对照一起进行的流式分析结果。
图7为AAV-DJ感染小鼠肾类器官72小时后，与对照一起进行的流式分析结果。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。另外，在下面的实施例中所采用的试剂和材料也均是市售可得的，如果未明确说明，则所采用的方法和条件，也均按照公知的方法和条件进行相关处理。
实施例1：肝脏类器官的分离与培养
肝脏类器官的分离与培养参照文献【Broutier, et al. (2016). Culture andestablishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3Dorganoids and their genetic manipulation. Nature protocols 11, 1724-1743.】报道的方法，从野生型C57/B6小鼠和人的肝脏组织中分离得到肝脏类器官，以用于病毒感染，具体的方法如下所述：
1、小鼠经安乐死后，立刻将其肝脏取出，至于4度预冷的基础培养基中，基础培养基成分为：Advanced DMEM/F12培养基、青链霉素、GlutaMax 和 HEPES；
2、用手术剪将肝脏剪成0.5mm3的小块，将其转移到15ml离心管，加入10ml清洗培养基（成分为：DMEM培养基、1%胎牛血清、1%青链霉素）反复吹打；
3、静置沉降，去除上清。再加入10ml清洗培养基，吹打，重复步骤2；
4、尽可能地去除多余地清洗培养基，加入事前37度预热的消化培养基，针对小鼠的肝脏，其成分为清洗培养基添加胶原酶和离析酶II，终浓度为0.125mg/ml, 添加脱氧核糖核酸酶I，终浓度为0.1mg/ml；针对人的肝脏，消化培养基的成分为EBSS基础培养基添加胶原酶D和脱氧核糖核酸酶I，终浓度分别为2.5mg/ml和0.1mg/ml；消化在37度培养箱进行；
5、每隔半小时取出少量样本进行镜检，针对小鼠，如果出现大量的胆管结构，即可停止消化；针对人，如果肝脏组织大部分（>80%）都已被消化为单细胞，即可停止消化，否则继续；
6、消化结束后，将上清转移到一个新的15ml离心管中，加入洗涤培养基至15ml，100g-300g离心5min，弃去上清；
7、重复步骤6；
8、加入10ml基础培养基重悬，100g-200g离心5min，弃去上清；
9、重复步骤8；
10、将沉淀用适量的Matrigel重悬，均匀地滴在24孔板中央，用墙头将包裹胆管地Matrigel铺开，但是不要碰到孔壁。37度静置5min；
11、每个孔加入类器官生长培养基，每隔3-5天换一次液。即完成肝脏类器官的分离与培养。
实施例2：肠道类器官的分离与培养
小肠类器官的分离与培养参照文献【Sato, et al. (2009). Single Lgr5 stemcells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.Nature 459, 262-265.】报道的的方法，从野生型C57/B6小鼠和人的肝脏组织中分离得到小肠类器官，以用于病毒感染，具体的方法如下所述：
1、小鼠经安乐死后，将小肠取出，置于4度预冷的PBS缓冲液里；
2、用手术剪将小肠纵切，并用PBS缓冲液冲洗3遍，以去除食糜；
3、用手术刀仔细刮去小肠内壁的小肠绒毛；
4、将剩余的部分剪切成5mm长度的肠片并用含有10mM EDTA的PBS缓冲液于冰上孵育40分钟；
5、用新鲜预冷的PBS缓冲液换去含有EDTA的PBS缓冲液，在其中用移液器和10ml的移液管剧烈地反复吹打肠片，使大量地小肠陷窝从肠片脱落到上清中；
6、所获上清用70 μm孔径地细胞筛（购于BD公司，货号352350），以去除残存地小肠绒毛，在经过600rpm转速离心3min去除散落地单细胞。离心后地沉淀为较为纯净地小肠陷窝；
7、将每100个分离的陷窝与50 μl预冷的Matrigel混匀后平铺于24孔板的一个孔中，静置5min后。最后加入400 μl含有50ng/ml EGF、100ng/ml Noggin和500ng/ml R-spondin1的小肠基本培养基（具体成分为：Advanced DMEM/F12培养基、青链霉素、GlutaMAX、N2、B27和N-乙酰半胱氨酸）。
实施例3：AAV-DJ病毒感染类器官（此处以肝脏类器官为例，小肠和肾类器官操作类似）
1、将处于3D培养的类器官连同基质胶一起从孔板中分离出来，并用PBS冲洗一次孔板，收集于1.5ml离心管中；
2、900rpm转速离心1min，去除上清；
3、加入1ml PBS缓冲液，充分吹打混匀，以去除黏附在类器官周围的基质胶；
4、1000 rpm转速离心1min，去除上清；
5、取40 μl预冷的Matrigel均匀的铺在24孔板中，放置10min使其凝固；
6、将AAV-DJ病毒用400 μl 类器官培养基稀释，按MOI=10E6（MOI越高，感染效率越高），即感染10000个细胞只需加入1 μl AAV-DJ 病毒（滴度为10E13 vgs/ml）；
7、用加入病毒的培养基重悬步骤4中的类器官沉淀，将类器官病毒培养基混合液均匀地滴在步骤5中的铺有Matrigel的24孔板中。37度，CO2培养箱过夜；
8、将过夜感染的类器官用移液器轻缓吹打，使其脱离2D培养的Matrigel，收集在1.5ml离心管中；
9、900 rpm转速离心1min, 弃去上清；
10、加入1ml PBS缓冲液重悬，1000rpm转速离心1min，弃去上清；
11、取50 μl预冷的Matrigel与步骤10得到的类器官沉淀混匀，均匀地铺在24孔板的一孔中，室温放置10min使基质胶完全凝固；
12、加入类器官培养基，继续3D培养。
实施例4：荧光共聚焦显微拍摄检测感染效率
1、将感染后培养72小时的类器官连同基质胶一起从孔中分离出来，并用PBS冲洗一次孔板，收集于1.5ml离心管中；
2、900rpm转速离心1min，去除上清；
3、加入1ml PBS缓冲液，充分吹打混匀，以去除黏附在类器官周围的基质胶；
4、1000rpm转速离心1min，去除上清；
5、加入500 μl 4度预冷的多聚甲醛溶液，室温固定20min；
6、1000 rpm转速离心1min，去除上清；
7、加入1ml PBS缓冲液，充分吹打混匀，以出去残留的多聚甲醛；
8、将沉淀在离心管底部的类器官用50 μl PBS溶液悬起后，滴在载玻片上，吸取多余的液体；
9、悬空滴加含有DAPI的固定液（购于中杉金桥，货号：ZLI 9557 ），盖上盖玻片，室温避光放置半小时后即可用于荧光观察。
实施例5：流式细胞术检测感染效率
1、将感染后培养72小时的类器官连同基质胶一起从孔中分离出来，并用PBS冲洗一次孔板，收集于1.5ml离心管中；
2、rpm转速离心1min，去除上清；
3、加入1ml PBS缓冲液，充分吹打混匀，以去除黏附在类器官周围的基质胶；
4、1000 rpm转速离心1min，去除上清；
5、加入200 μl 1X Tryple Select（购于Thermo，货号：12563011），37度消化15min, 每隔5min吹打一次；
6、2000 rpm转速离心2min，去除上清；
7、加入500 μl 类器官培养基重悬沉淀，用70 μm的滤网过滤掉没有消化干净的细胞团，滤液即可直接用于流式细胞仪上样分析。

Claims (3)

1.一种AAV-DJ型腺相关病毒体外高效感染类器官的用途，所述的类器官为人或小鼠的上皮类器官，包括肝脏类器官、肠道类器官和肾类器官；
具体步骤如下：
（1）将刚脱离3D培养的类器官与AAV-DJ病毒感染液混匀，然后平面化共孵育，完成感染过程；
（2）感染完成后，类器官脱离平面化状态，重新回到3D立体培养的状态；
（3）经过3D培养48~72小时后，类器官经过固定，染色，制片，然后用荧光共聚焦显微镜观察拍照GFP荧光；类器官经过洗涤，消化，重悬，用于流式细胞术检测GFP阳性细胞群的比例，即感染效率；
步骤（1）中所述的平面化状态，是指类器官脱离原始的3D培养状态，在与病毒液混合后，均匀的滴在铺有商业化Matrigel的孔板中；
步骤（2）中所述的类器官脱离平面化状态，重新回到3D立体培养的状态，是指类器官连同病毒液一起收集在离心管中，经过自然沉降，去除病毒液，再使用PBS冲洗两遍，去除PBS后，再用Matrigel重新包裹类器官，进行3D培养。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（1）中所述的AAV-DJ病毒感染液是将商业化的AAV-DJ按照需要感染的类器官细胞数目进行一定的比例稀释，稀释用培养基为类器官培养所用的培养基。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中所述的类器官培养用的培养基包括基础培养基Advanced DMEM/F12培养基和其他维持类器官正常生长的生长因子或小分子，其组分和含量如下：
100-1000ng/ml 终浓度的R-spondin1；
50-500ng/ml 终浓度的EGF；
100-1000ng/ml 终浓度的 FGF10；
25-250ng/ml 终浓度的 HGF；
10-100nM 终浓度的Gastrin。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110129368B (zh) * 2019-04-22 2021-03-09 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 一种感染支持细胞和毛细胞的aav载体
CN111454878B (zh) * 2020-03-13 2024-04-16 张高华奥生命科学(上海)有限公司 类器官病毒感染模型的构建方法和应用
CN111394299B (zh) * 2020-03-26 2020-12-25 南京鼓楼医院 一种肝脏类器官的体外构建方法及应用
CN114107388A (zh) * 2021-11-12 2022-03-01 复旦大学附属中山医院 一种腺病毒转染类器官的方法
CN114736866A (zh) * 2022-03-21 2022-07-12 深圳大学总医院 胆管癌类器官培养基及培养方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1582330A (zh) * 2001-10-23 2005-02-16 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司 体外微器官及其相关用途
CN102010851A (zh) * 2001-10-23 2011-04-13 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司 体外微器官及其相关用途
WO2013029030A1 (en) * 2011-08-24 2013-02-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University New aav capsid proteins for nucleic acid transfer
CN106459932A (zh) * 2014-04-25 2017-02-22 吉尼松公司 高胆红素血症的治疗
WO2017143100A1 (en) * 2016-02-16 2017-08-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Novel recombinant adeno-associated virus capsids resistant to pre-existing human neutralizing antibodies

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1582330A (zh) * 2001-10-23 2005-02-16 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司 体外微器官及其相关用途
CN102010851A (zh) * 2001-10-23 2011-04-13 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司 体外微器官及其相关用途
WO2013029030A1 (en) * 2011-08-24 2013-02-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University New aav capsid proteins for nucleic acid transfer
CN106459932A (zh) * 2014-04-25 2017-02-22 吉尼松公司 高胆红素血症的治疗
WO2017143100A1 (en) * 2016-02-16 2017-08-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Novel recombinant adeno-associated virus capsids resistant to pre-existing human neutralizing antibodies

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gene manipulation in liver ductal organoids by optimized recombinant adeno-associated virus vectors;Jinsong Wei et al.;《J. Biol. Chem.》;20190731;第294卷(第38期);第14096-14104页 *
小鼠小肠类器官体外培养体系的建立与应用;万光升 等;《中国实验动物学报》;20171031;第25卷(第5期);第513-518页 *

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