CN115838690A - 慢病毒转染类器官的方法与用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种慢病毒转染类器官的方法与用途，通过改变培养条件，使用慢病毒转染前先通过孔径不小于70μm滤网控制类器官球大小尽量均一化，然后将细胞均匀铺于超低吸附培养板中，超低吸附细胞培养板可以让细胞自发形成均匀大小和形状的球状体，能最大限度地减少细胞附着，在后续的转染过程中最大限度还原细胞3D状态下的转染，既提高效率也尽可能保持所有细胞3D的状态。同时增加离心转染25min~35min，提高转染效率，有助于后续病毒的转染。本申请通过用慢病毒载体转染类器官，转入的基因能够在类器官中稳定地表达，类器官也能稳定地生长和传代，具有转染效率高、细胞存活率高等技术效果。

Description

慢病毒转染类器官的方法与用途

技术领域

本申请属于基因工程和细胞工程领域，涉及一种慢病毒体外高效转染类器官的方法。

背景技术

细胞转染是指将外源分子导入真核细胞内以改变其基因型或表型能力的一种技术。转染的主要目的是通过增强或抑制特定基因在细胞中的表达，研究基因的功能或基因产物。根据导入的成分，转染可分为病毒转染和非病毒转染。非病毒转染包括物理和化学方法的转染，其代表性的方法分别有电穿孔法和脂质体转染法。病毒转染中根据病毒的类型包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等。病毒的转染效率比常规真核表达载体高很多，特别适合介导外源基因在难转染甚至无法转染的哺乳动物细胞中表达。

类器官（Organoids）是一类由干细胞，包括多能干细胞和成体干细胞在体外培养时形成的具有一定空间结构的组织类似物。肿瘤类器官（Tumor Organoids）由术后或活检肿瘤组织在体外培养时形成的，保留自身肿瘤组织3D结构，以及各项肿瘤学特征的微型培养物。通俗讲，肿瘤类器官即经体外3D培养的微肿瘤（Patient-derived organoids，PDOs）。类器官与传统细胞系模型相比，能高度还原来源肿瘤的组织形态和遗传特点。同时，类器官比人源性组织异种移植（PDX）模型操作更简便高效。类器官作为新一代人源化模型，能够更加真实地模拟组织器官在体内的细胞组成、生理功能和遗传特征，在临床医学和生命科学领域发挥重大作用。

传统技术中的腺病毒转染不能整合到细胞的基因组，无法稳定地表达，因此，腺病毒不适合做较长时间的细胞研究。现有的研究中使用慢病毒转染类器官的方法各有差异，存在转染效率不稳定或者细胞状态发生变化等技术缺陷。

发明内容

基于此，本申请提供一种慢病毒转染类器官的方法，以解决现有的慢病毒转染类器官存在效率不稳定以及细胞状态发生变化的问题。

本申请的技术方案是，提供一种慢病毒转染类器官的方法，包括以下步骤：

步骤S1取待转染的类器官进行消化处理，将所述类器官的组成细胞分散，过滤。

步骤S2、将过滤收集的细胞于超低吸附培养容器中培养。

步骤S3、培养后加入MOI为0~20的慢病毒的病毒液后进行离心转染。

步骤S4、转染后孵育预设时间，去慢病毒后接种至基质胶内进行培养，2~3天换一次液，待类器官状态良好，筛选得慢病毒转染的类器官。

其中，步骤S1中所述过滤为采用孔径不小于70μm的滤网进行过滤，步骤S3中所述离心转染条件为400g~600g，28℃~35℃，转染25min~35min。

在其中一个实施例中，步骤S1中所述过滤为采用孔径70μm~100μm的滤网过滤。

在其中一个实施例中，步骤S3中所述离心转染条件为500g，32℃转染30min。

在其中一个实施例中，步骤S1中所述消化处理为采用胰酶进行处理。

在其中一个实施例中，所述胰酶的工作浓度为0.25w/v%~5w/v%。

在其中一个实施例中，步骤S3在离心转染时还向病毒液中加入polybrene辅助感染试剂。

在其中一个实施例中，加入在病毒液中的所述polybrene辅助感染试剂的终浓度为6μg/mL~10μg/mL。

在其中一个实施例中，步骤S4中采用嘌呤霉素作为筛选试剂进行筛选，可选地，嘌呤霉素的终浓度为2μg/mL。

在其中一个实施例中，所述类器官为肿瘤类器官。

本申请另一方面提供一种慢病毒转染的类器官，该类器官的制备方法包括上述的慢病毒转染类器官的方法中的步骤。

本申请通过改变培养条件，使用慢病毒转染前先通过孔径不小于70μm的滤网控制类器官消化后的分散球大小尽量均一化，然后将细胞均匀铺于超低吸附培养容器中培养。一方面，超低吸附细胞培养容器可以让细胞自发形成均匀大小和形状的球状体，能最大限度地减少细胞附着，在后续的转染过程中最大限度还原细胞3D状态下的转染，既提高效率也尽可能保持所有细胞3D的状态；另一方面，通过一定时间的培养使消化后的细胞（团）恢复状态利于提高后续转染的效率。此外，同时增加离心转染25min~35min，有助于提高转染效率。本申请通过用慢病毒载体转染类器官，转入的基因能够在类器官中稳定地表达，类器官也能稳定地生长和传代，具有转染效率高，细胞也具有较高存活率等技术效果。

附图说明

图1为本申请使用的Lenti-SpCas9-Puro-Tomato Red慢病毒载体系统的设计示意图，其中，LTR：长末端重复序列；CMV：巨细胞病毒启动子；SpCas9:一种高效、精准的基因编辑载体，它是基于最新一代的人工核酸内切酶 CRISPR/Cas9而研发而来，该载体含有一个敲除插入位点，仅靠单个载体就可以完成基因组DNA的编辑；EF1：启动子；Puro：puromycin抗性基因；T2A：能够在翻译后水平上自我剪切，保证目的蛋白与荧光蛋白同等水平翻译；Tomato:能发出红色荧光的蛋白基因。

图2为过表达相关基因的表达情况，其中，Cas9为目标蛋白，GAPDH为内参蛋白。

图3为荧光显微镜下蛋白表达情况。

图4为基于类器官的TP53基因失活突变结果，其中，TP53WT为TP53Wild Type野生型组，TP53Target组为TP53靶向敲除组，control为未处理组，Nultin-3为药物处理组。

具体实施方式

下面结合实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

术语

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，A，及/或，B，及/或，C，及/或，D的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。

本申请中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本申请中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。

本申请中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。

本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。

本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非与本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

慢病毒载体：慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷

型病毒（HIV-1）为基础发展起来的基因载体。慢病毒是一种逆转录病毒，能使外源基因整合入宿主的基因组稳定、长期表达，比一般的逆转录病毒具有更高的滴度和更广的宿主范围。携带外源基因的慢病毒载体与包装载体（产生病毒颗粒所需的辅助蛋白）一同转染包装细胞，即可进行病毒的包装。

包装好的慢病毒为假型病毒（毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代），然后分泌到细胞外的培养基中，经过离心取得上清液，再浓缩后的慢病毒液可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而实现外源基因在宿主细胞中的表达。本申请采用如图1所示的慢病毒载体系统。

慢病毒能够将病毒基因整合到细胞的基因组，可长时间稳定表达。而类器官是一种新型3D细胞模型，能够很好的还原来源组织的特性，还能够在体外进行稳定地传代培养。慢病毒转染与类器官技术有机结合有利于科学研究中的疾病模型构建、分子机制探究及药物靶点发现等。

类器官：常规类器官培养一般是将细胞包埋至基质胶（例如，Matrigel胶）内实现3D培养。Matrigel基底胶在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达的研究。

MOI：MOI是multiplicity of infection的缩写，即感染复数。传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。

Western Blot：蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

Nutlin-3：全称为（±）-4-[4,5-Bis（4-chlorophenyl）-2-（2-isopropoxy-4-methoxy-phenyl）-4,5-dihydro-imidazole-1-carbonyl]-piperazin-2-one，是一种常用的可以通透细胞膜的MDM2拮抗剂，也是p53信号通路的激活剂（p53 pathway activator）。Nutlin-3对于MDM2的作用有很高的选择性，IC50达到90nM。Nutlin-3通过和MDM2结合，抑制MDM2和p53的相互作用，从而激活p53并诱导细胞凋亡。

Matrigel基质胶:细胞与基底膜间的相互作用是调控细胞行为的重要因素之一，基质胶主要成分包括：层黏连蛋白、胶原IV等，同时含TGF-β成纤维细胞生长因子、组织纤维酶原活化因子以及其它在EHS肿瘤中自然表达的生长因子等。Matrigel基质胶是复杂的混合物，目前BD生化试剂有Matrigel这类成品出售。在室温下，Matrigel可自动聚集产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料。Matrigel基质胶用于制备各种要求的基底膜基质，用于细胞信号研究，诸如：鼠肾干细胞形成肾小管过程中生长因子作用研究，鼠乳腺上皮干细胞的基因表达研究等。

DMEM/F12培养基：是在DMEM培养基的基础上，添加F12培养基中更为丰富的营养成分，含有多种微量元素，广泛应用于多种哺乳类细胞的培养。

RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer）：RIPA主要是从动物组织和动物细胞中抽取的可溶性蛋白。RIPA裂解液是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。

本申请的技术方案是，提供一种慢病毒转染类器官的方法，包括以下步骤：

步骤S1、取待转染的类器官进行消化处理，将所述类器官的组成细胞分散，过滤。

步骤S2、将过滤收集的细胞于超低吸附培养容器中培养。

步骤S3、培养后加入MOI为0~20的慢病毒的病毒液后进行离心转染。例如可以培养12h、13h、14h、15h、16h后加入MOI为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。

步骤S4、转染后孵育预设时间，去慢病毒后接种至基质胶内进行培养，2~3天换一次液，待类器官状态良好，筛选得慢病毒转染的类器官。例如可以是4h、5h、6h。

在一个具体的示例中，步骤S1中过滤为采用孔径不小于70μm滤网进行过滤，步骤S3中离心转染条件为400g~600g，28℃~35℃，转染25min~35min。离心400g、450g、500g、550g、600g，温度28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃。

可选地，步骤S1中过滤为采用孔径70μm~100μm的滤网过滤。例如可以是70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm滤网。

在一个具体的示例中，步骤S3中离心转染条件为500g，32℃转染30min。

可选地，步骤S1中所述消化处理为采用胰酶进行处理。

进一步可选地，胰酶的工作浓度为0.25w/v%~5w/v%。例如0.25w/v%、0.5w/v%、0.75w/v%、1w/v%、1.25w/v%、1.5w/v%、1.75w/v%、2w/v%、2.25w/v%、2.5w/v%、2.75w/v%、3w/v%、3.25w/v%、3.5w/v%、3.75w/v%、4w/v%、4.25w/v%、4.5w/v%、4.75w/v%、5w/v%。

在一个具体的示例中，步骤S3离心转染还向病毒液中加入polybrene辅助感染试剂。

Polybrene（聚凝胺）是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA转染实验以增强脂质体的转染效率。Polybrene目前广泛用于逆转录病毒及慢病毒介导的基因转染，作用机理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。

在一个具体的示例中，加入在病毒液中的polybrene辅助感染试剂的终浓度为6μg/mL~10μg/mL。例如可以是6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL。

在其中一个实施例中，步骤S4中所述筛选试剂为嘌呤霉素，可选地，嘌呤霉素的终浓度为2μg/mL。

嘌呤霉素（puromycin；PM）是一种蛋白质合成抑制剂，它具有与tRNA分子末端类似的结构，能够同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合，并掺入到生长的肽链中，所以用作筛选所需的慢病毒转染后的类器官。

在一个具体的示例中，所述类器官为肿瘤类器官，肿瘤类器官是取自患者体内原发性肿瘤，在实验室中培养出的微型3D肿瘤细胞模型。

本申请另一方面提供一种慢病毒转染的类器官，该类器官的制备方法包括所述慢病毒转染类器官的方法中的步骤。

实施例1

（一）类器官的培养或制备

（1）取冻存的类器官，37℃解冻后，加入5mLPBS，300g离心5min，轻轻吸弃上清。

（2）加10mL PBS重悬漂洗细胞，300g离心5min，轻轻吸弃上清。

（3）取50μL类器官完全培养基重悬底部细胞，并放置于冰上预冷，整个实验过程在冰上进行。将枪头插入预冷的PBS中反复吹打几次预冷枪头，吸取250 μL基质胶加入重悬的细胞中，轻轻吹打混匀，避免气泡产生。

（4）预冷枪头后吸30μL每滴细胞悬液接种至细胞孔板中。

（5）迅速将细胞孔板翻转，置于37℃，体积浓度为5%的CO₂培养箱内孵育10min~15min使基质胶凝固。

（6）加液培养：待基质胶凝固后加入2.5mL类器官培养基，并置于37℃，体积浓度为5%的CO₂培养箱内培养；根据类器官生长状况，2~3天换一次液。

（7）培养一周后，收集基质胶团，与液体一起转入离心管中，轻轻吹打几次。300g离心5min，弃上清。

（8）加入3mL类器官消化液于37℃消化3min，期间颠倒混匀若干次。

（9）加入6mL DMEM/F12（10%FBS），于300g离心5min，弃上清。

（10）取10mL PBS重悬细胞，300g离心5min，弃上清。

（11）用类器官培养基重悬细胞，通过70μm细胞滤网过滤后取500μL类器官转移至24孔低吸附孔板，置于37℃，体积浓度为5%的CO₂培养箱内，过夜恢复状态。

（二）转染

（1）慢病毒转染使用感染复数（MOI）范围为0~20。用100μL病毒（500,000个感染病毒颗粒）加入至上述培养的肿瘤类器官培养孔中。

（2）以终浓度8μg/mL的量加入polybrene辅助感染试剂，用封口膜封严24孔板，在500g，32℃的条件下离心转染30min。

（3）取出24孔板，向病毒转染孔中添加500uL类器官培养基，至于37°C，体积浓度为5%的CO₂中孵育5h。

（4）收集孔中类器官和病毒的混合液，加入10mL培养基，300g离心5min，轻轻吸弃上清。

（5）取50μL类器官完全培养基重悬底部细胞，并放置于冰上预冷，整个实验过程在冰上进行。将枪头插入预冷的PBS中反复吹打几次预冷枪头，吸取250μL基质胶加入重悬的细胞中，轻轻吹打混匀，避免气泡产生。

（6）预冷枪头后吸30μL每滴细胞悬液接种至细胞孔板中。

（7）迅速将细胞孔板翻转，置于37℃，体积浓度为5%的CO₂培养箱内孵育10min~15min使基质胶凝固。

（8）加液培养：待基质胶凝固后加入2.5mL类器官培养基，并置于37℃，5%CO₂培养箱内培养；根据类器官生长状况，2~3天换一次液。

（9）待类器官状态良好，加入终浓度2μg/mL puromycin（Invitrogen），用于筛选抗puromycin的类器官，处理3天后换液，此步骤重复3次。

实施例2：蛋白过表达的检测和荧光检测转染是否成功

收集并消化转染后的类器官，用RIPA蛋白裂解液提取并收集蛋白，用BCA蛋白质浓度检测试剂盒和酶标仪测定其浓度后，进行Western Blot检测，期间用Cas9的抗体孵育，其检测结果如图2所示。

转染成功的类器官直接在荧光显微镜下观测，结果如图3所示。

蛋白表达结果显示，过表达组成功表达了Cas9基因，而对照组未表达。

内参GAPDH在过表达组和对照组中均表达，说明慢病毒感染类器官后的体系是有效的。

通过荧光显微镜观测，过表达组能看到红色的类器官，而对照组未发现。该结果表明过表达系统已成功导入到类器官且相关基因得到表达。

实施例3：对靶基因从DNA、蛋白水平来检测基因编辑是否成功

往转染后的类器官培养基中加入Nultin-3，用于检测TP53基因是否被靶向敲除，3天后在显微镜下观测类器官的生长状况，结果如图4中的a所示。

提取转染后的类器官的DNA，对TP53基因进行PCR扩增，用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，其酶切结果如图4中的b所示。

同时，对PCR产物进行一代测序，测序结果如图4中的c所示。提取转染后的类器官的蛋白，进行Western Blot检测，期间用TP53的抗体孵育，其检测结果如图4中的d所示。

由于慢病毒载体中的SpCas9具有靶向敲除TP53基因某个位点的功能，为了检测TP53基因是否被敲除，从基因和蛋白的进行检测。

结果显示：如图4中的a：Nultin-3药物是一种MDM2-P53结合的抑制剂，能够使细胞凋亡。加入Nultin-3处理后，TP53野生型类器官在显微镜下未观测到类器官的存在，而靶向敲除的类器官依然能够在镜下观测到清晰的形态。这表明靶向敲除TP53基因成功。

如图4中的b：为酶切后的PCR产物，具有多个条带，而野生型只有一个条带，表明靶向敲除TP53基因成功。

如图4中的c：TP53基因测序结果显示，实验组已被切除一个碱基T，而野生型基因序列完整。

如图4中的d：Western blot结果显示，对照组成功表达了TP53基因，而实验组未表达，表明基因TP53敲除成功。内参GAPDH在过表达组和对照组中均表达，说明慢病毒感染类器官后的体系是有效的。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种慢病毒转染类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1、取待转染的类器官进行消化处理，将所述类器官的组成细胞分散，过滤；

步骤S2、将过滤收集的细胞于超低吸附培养容器中培养；

步骤S3、培养后加入MOI为0~20的慢病毒的病毒液后进行离心转染；

步骤S4、转染后孵育预设时间，去慢病毒后接种至基质胶内进行培养，2~3天换一次液，待类器官状态良好，筛选得慢病毒转染的类器官；

其中，步骤S1中所述过滤为采用孔径不小于70μm的滤网进行过滤，步骤S3中所述离心转染条件为400g~600g，28℃~35℃，转染25min~35min。

2.根据权利要求1所述的慢病毒转染类器官的方法，其特征在于，步骤S1中所述过滤为采用孔径70μm~100μm的滤网过滤。

3.根据权利要求1所述的慢病毒转染类器官的方法，其特征在于，步骤S3中所述离心转染条件为500g，32℃转染30min。

4.根据权利要求1所述的慢病毒转染类器官的方法，其特征在于，步骤S1中所述消化处理为采用胰酶进行处理。

5.根据权利要求4所述的慢病毒转染类器官的方法，其特征在于，所述胰酶的工作浓度为0.25w/v%~5w/v%。

6.根据权利要求1所述的慢病毒转染类器官的方法，其特征在于，步骤S3在离心转染时还向病毒液中加入polybrene辅助感染试剂。

7.根据权利要求6所述的慢病毒转染类器官的方法，其特征在于，加入在病毒液中的所述polybrene辅助感染试剂的终浓度为6μg/mL~10μg/mL。

8.根据权利要求1~7任一项所述的慢病毒转染类器官的方法，其特征在于，步骤S4中采用嘌呤霉素作为筛选试剂进行筛选，可选地，嘌呤霉素的终浓度为2μg/mL。

9.根据权利要求1~7任一项所述的慢病毒转染类器官的方法，其特征在于，所述类器官为肿瘤类器官。

10.一种慢病毒转染的类器官，其特征在于，该类器官的制备方法包括权利要求1~9任一项所述的慢病毒转染类器官的方法中的步骤。

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