CN110146700B - 人类肺干细胞的分选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肺组织干细胞的分选方法，尤其是一种人类肺干细胞的分选方法。包括处理肺组织，抗体孵育以及流式分选等步骤，利用该方法分选人类肺干细胞可以直接对人类肺干细胞进行研究，首次解决了阻碍人类干细胞研究的难题。
Description
技术领域
本发明涉及一种肺组织干细胞的分选方法，尤其是一种人类肺干细胞的分选方法。
背景技术
肺气道上皮的修复存在多种机制。肺外干细胞（骨髓、外周血、胚胎等来源）可迁移到损伤的肺部，但是这些细胞对气道上皮修复的贡献，远不及肺内干细胞。人类肺干细胞主要包括肺泡Ⅱ型细胞、Club细胞、基底细胞。肺干细胞的功能失调与多种肺疾病相关，包括哮喘、COPD、肺纤维化等等。但是，目前缺乏对人类肺干细胞功能研究的有效手段，严重阻碍了对人类肺干细胞的研究。尽管临床检验可以一定程度上反应肺干细胞的功能及状态，但是不能作为直接证据来研究干细胞的功能，加之志愿者难以募集，试验阶段疗效不稳定等原因，进一步限制了科学工作者对肺干细胞的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种人类肺干细胞的分选方法。
本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种人类肺干细胞的分选方法,包括下述步骤：
1) 将肺组织剪成1cm3小块,使用HBSS清洗(用冷HBSS洗，如果血过多，可以增加洗的遍数。注意：可以在4℃条件下，用HBSS，振荡洗涤。)后，转移至有盖培养皿机械剁碎成肺靡(注意：用无尘纸巾擦干组织，同时，尽可能的去除内脏的胸膜腔。)，并转移至50ml离心管中；
2）将37℃ Liberase TM加入到步骤1）得到的离心管中；添加比例为：每1cm3 的肺组织添加10mL的工作液；
3）将步骤2）得到的离心管，放入混匀仪（Thermomixer，Eppendorf）中，1000 rpm，37℃，摇动45 min；取出，移液管上下吹打至大块的组织分离开，继续放入混匀仪，1000rpm，37℃，摇动15 min；确保制成单细胞悬浮液；
4）再次用10ml移液器上下吹打，利用多选择性细胞过滤器，过滤肺组织消化液；滤去胞外基质；(注意：多选择性细胞过滤器组成（从上到下）：粉红色（500μm），橙色（300μm），黄色（100μm）和绿色（连接环）。滤过后，用20mL的含有2%FBS的HBSS清洗过滤器。)
5）用50ml含有2%FBS的HBSS重悬步骤4）得到的肺组织消化液，4℃，400g，离心5分钟；(如果上清比较混沌，可以重新将上清收集到新的50mL离心管，离心，收集更多的细胞)倾倒或吸出上清液，用含有2%FBS的HBSS多次重悬肺组织细胞团；此处一般为2-3次；
6）倾倒或吸出上清液，用2-5mL红细胞裂解液重悬细胞团，在冰上孵育2分钟，期间温和振荡得到裂解液；
7）立即添加20mL含有2%FBS的HBSS，稀释裂解液；4℃，400g，离心5分钟，弃去上清，用移液管吸取1mL含有2%FBS的HBSS重悬细胞团，然后添加9mL含2%FBS的HBSS，总体积为10mL；
8）用70μM的过滤网，将细胞过滤到50mL离心管中，以滤掉红细胞膜；4℃，400g，离心5分钟，用含有2%FBS的HBSS重悬细胞；细胞计数；
9）抗体孵育；一抗7AAD PE-Cy5，Anti-Human CD326 (EpCAM) PE-Cyanine7，Anti-CD271 (NGF Receptor) PE，anti-human HTII，孵育45分钟；二抗Anti-Human CD31(PECAM-1) Biotin，anti-human CD45 Biotin ，Streptavidin APC-eFluor® 780，孵育40分钟；
10）流式分选；排除7AAD阳性细胞，CD31阳性细胞，CD45阳性细胞；注意：7AAD阳性细胞为死细胞，CD31阳性细胞为内皮细胞，CD45阳性细胞为血系细胞。选择EpCAM阳性，HTII阳性，NGFR阴性为肺泡Ⅱ型细胞；选择EpCAM阳性，HTII阴性，NGFR阴性为Club细胞；选择选择EpCAM阳性，HTII阴性，NGFR阳性为基底细胞。
37℃ Liberase TM的制备方法为：将Liberase TM溶解在HBSS中，制备0.25 U/ml的Liberase TM工作液，37℃孵育待用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明中，以医疗废弃组织为材料，分选人类肺干细胞，利用此方法，可以直接对人类肺干细胞进行研究，首次解决了阻碍人类干细胞研究的难题。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
一种人类肺干细胞的分选方法，具体步骤如下：
1) 将肺组织剪成1cm3小块,使用HBSS清洗(用冷HBSS洗，如果血过多，可以增加洗的遍数。注意：可以在4℃条件下，用HBSS，振荡洗涤。)后，转移至有盖培养皿机械剁碎成肺靡(注意：用无尘纸巾擦干组织，同时，尽可能的去除内脏的胸膜腔。)，并转移至50ml离心管中；
2）将37℃ Liberase TM加入到步骤1）得到的离心管中；添加比例为：每1cm3 的肺组织添加10mL的工作液；37℃ Liberase TM的制备方法为：将Liberase TM溶解在HBSS中，制备0.25 U/ml 的Liberase TM工作液，37℃孵育待用。
3）将步骤2）得到的离心管，放入混匀仪（Thermomixer，Eppendorf）中，1000rpm，37℃，摇动45 min；取出，移液管上下吹打至大块的组织分离开，继续放入混匀仪，1000rpm，37℃，摇动15min；确保制成单细胞悬浮液；
4）再次用10ml移液器上下吹打，利用多选择性细胞过滤器，过滤肺组织消化液；滤去胞外基质；(注意：多选择性细胞过滤器组成（从上到下）：粉红色（500μm），橙色（300μm），黄色（100μm）和绿色（连接环）。滤过后，用20mL的含有2%FBS的HBSS清洗过滤器。)
5）用50ml含有2%FBS的HBSS重悬步骤4）得到的肺组织消化液，4℃，400g，离心5分钟；(如果上清比较混沌，可以重新将上清收集到新的50mL离心管，离心，收集更多的细胞)倾倒或吸出上清液，用含有2%FBS的HBSS多次重悬肺组织细胞团；此处一般为2-3次；
6）倾倒或吸出上清液，用2-5mL红细胞裂解液重悬细胞团，在冰上孵育2分钟，期间温和振荡得到裂解液；
7）立即添加20mL含有2%FBS的HBSS，稀释裂解液；4℃，400g，离心5分钟，弃去上清，用移液管吸取1mL含有2%FBS的HBSS重悬细胞团，然后添加9mL含2%FBS的HBSS，总体积为10mL；
8）用70μM的过滤网，将细胞过滤到50mL离心管中，以滤掉红细胞膜；4℃，400g，离心5分钟，用含有2%FBS的HBSS重悬细胞；细胞计数；
9）抗体孵育；一抗7AAD PE-Cy5，Anti-Human CD326 (EpCAM) PE-Cyanine7，Anti-CD271 (NGF Receptor) PE，anti-human HTII，孵育45分钟；二抗Anti-Human CD31(PECAM-1) Biotin，anti-human CD45 Biotin ，Streptavidin APC-eFluor® 780，孵育40分钟；
10）流式分选；排除7AAD阳性细胞，CD31阳性细胞，CD45阳性细胞；注意：7AAD阳性细胞为死细胞，CD31阳性细胞为内皮细胞，CD45阳性细胞为血系细胞。选择EpCAM阳性，HTII阳性，NGFR阴性为肺泡Ⅱ型细胞；选择EpCAM阳性，HTII阴性，NGFR阴性为Club细胞；选择选择EpCAM阳性，HTII阴性，NGFR阳性为基底细胞。
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (1)
1.一种人类肺干细胞的分选方法,其特征在于，包括下述步骤：
1) 将肺组织剪成1cm3小块,使用HBSS清洗后，转移至有盖培养皿机械剁碎成肺糜，并转移至50ml离心管中；
2）将37℃ Liberase TM加入到步骤1）得到的离心管中；添加比例为：每1cm3的肺组织添加10mL的Liberase TM工作液；该步骤中37℃ Liberase TM的制备方法为：将Liberase TM溶解在HBSS中，制备0.25 U/ml 的Liberase TM工作液，37℃孵育待用；
3）将步骤2）得到的离心管，放入混匀仪中，1000 rpm，37℃，摇动45 min；取出，移液管上下吹打至大块的组织分离开，继续放入混匀仪，1000 rpm，37℃，摇动15 min；确保制成单细胞悬浮液；
4）用10ml移液器上下吹打，利用多选择性细胞过滤器，过滤肺组织消化液；滤去胞外基质；
5）用50ml含有2%FBS的HBSS重悬步骤4）得到的肺组织消化液，4℃，400g，离心5分钟；倾倒或吸出上清液，用含有2%FBS的HBSS多次重悬肺组织细胞团；
6）倾倒或吸出上清液，用2-5mL红细胞裂解液重悬细胞团，在冰上孵育2分钟，期间温和振荡得到裂解液；
7）立即添加20mL含有2%FBS的HBSS，稀释裂解液；4℃，400g，离心5分钟，弃去上清，用移液管吸取1mL含有2%FBS的HBSS重悬细胞团，然后添加9mL含2%FBS的HBSS，总体积为10mL；
8）用70μM的过滤网，将细胞过滤到50mL离心管中，以滤掉红细胞膜；4℃，400g，离心5分钟，用含有2%FBS的HBSS重悬细胞；细胞计数；
9）抗体孵育；一抗7AAD PE-Cy5，Anti-Human CD326 PE-Cyanine7，Anti-CD271 PE，anti-human HTII，孵育45分钟；二抗Anti-Human CD31 Biotin，anti-human CD45 Biotin，Streptavidin APC-eFluor® 780，孵育40分钟；
10）流式分选；排除7AAD阳性细胞，CD31阳性细胞，CD45阳性细胞；选择EpCAM阳性，HTII阳性，NGFR阴性为肺泡Ⅱ型细胞；选择EpCAM阳性，HTII阴性，NGFR阴性为Club细胞；选择EpCAM阳性，HTII阴性，NGFR阳性为基底细胞。
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