JP5286265B2

JP5286265B2 - 均一な幹細胞群を取得するための特定種類へ分化させるのにかかわる幹細胞の識別及び選択

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Publication number: JP5286265B2
Application number: JP2009523122A
Authority: JP
Inventors: アリニ，マウロ; シュトッダート，マーティン
Original assignee: アーオー−フォルシュングスインスティチュートダボス
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2006-08-11
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2026-08-11
Also published as: WO2008017171A1; JP2010500007A; CA2659418A1; CN101506352B; US8557584B2; EP1907531B1; CA2659418C; EP1907531A1; CN101506352A; US20090304652A1

Description

本発明は改変幹細胞（同じ特定表現型の幹細胞へ分化させるのにかかわる均一な改変幹細胞群）に関連し、特定の表現型へ分化させるのにかかわる単一の識別可能な幹細胞を生成する方法に関連し、さらに１種類の均一な幹細胞群を取得するための特定細胞へ分化させるのにかかわる、胚、胎児または成人幹細胞の識別及び選択のための方法に関する。

現在、異なる細胞のサンプルにおける幹細胞は、不均一な細胞群、すなわち異なる種類の細胞へ分化する可能性を有する多数の細胞の淀みとしてしか分離されることができない（例えば、骨髄穿刺液、臍帯血または血液サンプルからの造血及び非造血細胞）。これらの異種の細胞群（例えばＣＤ３４またはＣＤ１３３）に存在する細胞表面抗原を承認する抗体を用いて、「大まかな」いくつかの選択または強化がされることができる。一旦これらの抗体が細胞と化学反応すると、これらの細胞（ＣＤ３４またはＣＤ１３３陽性細胞として定義される）はＦＡＣＳ（抗体は、蛍光性マーカーを有する）、または磁気選択（ミルテニーバイオテック社からのＭＡＣＳ技術を使用する）によって分離されることができる。しかし、これらの抗原（それはＣＤ３４またはＣＤ１３３抗体と化学反応する）が異なる細胞に存在するという事実から、部分的な強化（または選択）が下記の手順で行われるとしても、上記の手順は異種の幹細胞群をもたらす。

この点について、本発明は救済策を提供することを目的とする。本発明は、同じ特定表現型へ分化及び、均一な群へ識別された幹細胞を選択するのにかかわる幹細胞を識別するための、幹細胞群における幹細胞の変換を可能にする幹細胞を提供する目的に基づく。

本発明は、他の幹細胞から識別および分離可能な、請求項１の特徴を表示する幹細胞、および請求項３６の特徴を表示する、本質的に同種の幹細胞群を取得するための方法を用いて前記課題を解決する。

本発明によって達成される１つの利点は、本質的に本発明に記載の幹細胞により、同じ種類へ分化させるのにかかわる幹細胞群が、インビトロで取得されることができ、生体内の目標応用として使われることができるというところにある。

本願明細書において用いられる全ての科学用語は、以下の意味を有することと理解される：
−本願明細書において使われる「導入する」という用語は、細胞への異種遺伝物質（ＤＮＡ）の変換またはトランスフェクションを意味し、ウィルストランスダクションおよび／または非ウィルス性トランスフェクション／変質を指す；
−「細胞ＤＮＡ」は、原型の幹細胞ＤＮＡ（すなわち細胞が自然に含むもの）を指す；
−「転写因子タンパク質」は、細胞における転写活性化を調整するタンパク質である。
−転写因子タンパク質は、ＤＮＡとの直接的結合または、他のＤＮＡ結合タンパク質との結合により、プロモータ及びエンハンサ配列要素の範囲に配置する。転写因子タンパク質の機能は、特定のＤＮＡ配列を結合することであり、その結合の結果として遺伝子発現の変化（転写とも呼ばれる）を調整することである；
−「特定のＤＮＡタンパク質−相互作用」は、ヌクレオチド配列に依存するＤＮＡタンパク質相互作用を指す；
−「特定の配列」は、「特定の」タンパク質、すなわち、このヌクレオチド配列と相互に作用するように予定されているタンパク質とのみ相互作用を可能にするヌクレオチド配列を指す；
−「細胞分化」は、細胞が特定の種類になる方法を指す；
−「転写」は、ＲＮＡがＤＮＡテンプレートを使用して合成される方法を指し、それによって、ＤＮＡからＲＮＡまで遺伝子の情報を転送する；
−「トランスレーション」は、ＲＮＡのヌクレオチド配列に含まれる情報を遺伝暗号によって指定された通りにポリペプチドの対応アミノ酸配列へ変換する方法を指す。
−「プロモータ」は、ＲＮＡポリメラーゼが転写するために結合するＤＮＡ配列を指す；
−「リポータ」は、容易に識別可能なタンパク質をコード化するプラスミドまたはＤＮＡ構造を指す。それは、特定のＤＮＡ配列または細胞群の範囲内でタンパク質を結合する特定のＤＮＡの存在を証明するのに役立つ。

本発明の特別な実施例において、タンパク質分子は、特定の表現型への変化と関連する遺伝子の発現を増加させる転写因子タンパク質である。多くの場合、遺伝子の一系統は、転写因子タンパク質と呼ばれている単一の要素によって制御される。このタンパク質は、特定のＤＮＡ配列を結合して、特定の表現型への変化と関連する遺伝子の発現を増加させる。転写因子タンパク質が初期表示遺伝子であり、細胞だけに表示されるので、それは、この特定の転写因子タンパク質と関連する特定の表現型になる（すなわち、各々の転写因子タンパク質は、転写因子タンパク質だけに固有な表現型になるように促進された幹細胞に存在する）。タンパク質分子は、人工的導入のＤＮＡ分子の結合部位配列との相互作用によって、さらに人工的導入のＤＮＡ分子の指標分子を符号化するＤＮＡ配列転写を始めやすく、タンパク質が指標分子の合成を始める。

更なる実施例において、人工的導入のＤＮＡ分子における結合部位配列は、それが最小プロモータ配列を経由して指標分子を符号化するＤＮＡ配列の発現を操縦するように、配置される。

更なる実施例において、最小プロモータ配列は、指標分子を符号化する結合部位配列及びＤＮＡ配列間の人工的導入のＤＮＡ分子に配置される。

細胞表現型は、非前駆細胞によって受けられる刺激物質に依存している。一旦刺激されると、他の遺伝子のスイッチを入れるのに対して、細胞は特定の遺伝子のスイッチを切ることによってその表現型を変える。上記の刺激物質は、物理的、化学的または生化学的刺激物質であることが可能である。物理的な刺激物質の例は、軟骨細胞分化の場合における骨格に接種される細胞のメカニカル負荷（圧縮及び剪断）の使用である。化学刺激物質の実施例は、骨原培養基にあるデキサメタゾンである。生化学刺激物質の実施例は、軟骨形成培養基のＴＧＦベータである。

更なる実施例において、指標分子は幹細胞サンプルから指標分子を含む幹細胞を選択及び除去する特性を有する。その識別および／または選択を可能にする指標分子の特性は、化学的、生化学的または物理的な特性であることが可能である。

他の一実施例において、指標分子は天然の幹細胞群と異種である細胞表面表示タンパク質であり、幹細胞におけるその存在が、さらに識別可能である。

更なる実施例において、指標分子は強磁性特性を有する。用語「強磁性」は、自然発生的な磁性を示すいずれかの材料の意味としてここで使われる：外部磁場がない場合のネット磁気能率。

他の一実施例において、人工的導入のＤＮＡ分子のＤＮＡ配列は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を符号化する配列、青ライトに暴露されるときに、緑色蛍光を発するクラゲＡｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａからのタンパク質である。ＧＦＰ遺伝子、特にシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）及び黄色の蛍光タンパク質（ＹＦＰ）から取得される色変異体が、さらに使われてもよい。前述の蛍光性指標分子の代わりとして、細胞に非中毒性であり、細胞に導入可能であり、いずれかの信号発見装置によっても検出されることができるいずれかの光／エネルギーを発する、いずれかの指標分子が、使われることができる。

蛍光指標分子、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用する場合、細胞は、蛍光性顕微鏡検査を使用して単分子層においてまたは、蛍光活性化セルソート（ＦＡＣＳ）を使用して単一の細胞懸濁液において識別されることができる。

フェリチンのような磁気指標分子を使用するときに、細胞は磁気捕獲システムを使用して分離されることができる。

細胞表面表示タンパク質（天然の幹細胞群と異種）を使用するときに、細胞は、導入タンパク質に対する蛍光標識された抗体を使用して識別されることができ、ＦＡＣＳによって分離されることができる。あるいは、細胞はＤＹＮＡＬビーズのようなビーズ捕獲システムを使用して分離されることができ、それによって、新しいエピトープに対して反応する抗体は、最初にＤＹＮＡＬビーズと結合され、そして、ビーズは重要な細胞を捕獲するために用いる。

導入されたＤＮＡ分子は、例えばウィルス性トランスダクションによってまたは非ウィルス性トランスフェクションによって幹細胞に導入された。導入されたＤＮＡ分子は、幹細胞に導入されるが、幹細胞の原型の細胞ＤＮＡに導入されるわけではなく、それで、導入されたＤＮＡは、細胞分裂によって繰り返されるわけではなく、娘細胞のうちの１つだけにおいて現存する。上記の実施例の長所は、分離及び（多数の）細胞分裂の後に、変更されていない幹細胞の幹細胞群を取得するために、導入されたＤＮＡ分子を含む幹細胞が、取得された幹細胞群から分離されることができるという点に見られる。

更なる実施例において、人工的導入のＤＮＡ分子は、それぞれ異なる指標分子を符号化する少なくとも２つのＤＮＡ配列を含む。

それぞれ異なる指標分子を符号化する、少なくとも２つのＤＮＡ配列を含む人工的導入のＤＮＡ分子の実施例において、このＤＮＡは、タンパク質分子と相互に作用することが可能な１つの結合部位配列、１つの最小プロモータ配列及び異なる指標分子をそれぞれ符号化する２つのＤＮＡ配列を含んでもよく、それによって、これらのＤＮＡ配列は、各々に連結される。

タンパク質分子であり、人工的導入のＤＮＡ分子の結合部位配列と相互作用することが可能である（特定の表現型及びタンパク質分子間の相互関係は、図４に示される）幹細胞が、特定の表現型に分化させることにかかわる場合において、タンパク質分子は細胞に存在し、人工的導入のＤＮＡ配列の結合部位配列と相互に作用する。その結果、これらのＤＮＡ配列によって符号化される２つの異なる指標分子が合成される。上記の実施例の長所は、より十分な識別可能性の基準を満たすために指標分子の一つを選択可能で、より十分な選択可能性の基準を満たすために他の指標分子を選択可能であるという事実に示される。

更なる実施例において、人工的導入のＤＮＡ分子は、異なる指標分子をそれぞれ符号化する２つの配列を含み、このＤＮＡは、タンパク質分子と相互作用することが可能な１つの結合部位配列、１つの最小プロモータ配列及び指標分子を符号化する１つのＤＮＡ配列をそれぞれ含む２以上の配列ブロックを含んでもよく、それによって、２つのＤＮＡ配列は２つの異なる指標分子を符号化し、両方の結合部位配列は同じタンパク質分子と相互に作用することが可能である。この実施例は、さらに指標分子のうちの１つがより十分な識別可能性の基準を満たすために選択可能であり、他の指標分子がより十分な選択可能性の基準を満たすために選択可能であることを可能にする。

他の一実施例において、それぞれ異なる指標分子を符号化する２つの配列を含む人工的導入のＤＮＡ分子に、タンパク質分子と相互に作用可能な１つの結合部位配列（ＵＢＳ）をそれぞれ含む２以上の配列ブロック、１つの最小プロモータ配列（ＭＰ）及び指標分子を符号化する１つのＤＮＡ配列が設けられて、それによって、両方のＤＮＡ配列は、２つの異なる指標分子を符号化し、結合部位配列が、２つの異なるタンパク質分子と相互に作用することが可能であり、それによって、これらの異なるタンパク質分子は、細胞の２つの異なる表現型に対応する。上記の実施例の長所は、２つの異なる特定幹細胞表現型へ分化するのにかかわる幹細胞を含む２つの異なる幹細胞群が識別されることができ、幹細胞サンプルから分離されることができるというところにある。必要であれば、これらは後で混ぜ合わせられることができる。

例えば、配列ブロックは、以下の順序で同じＤＮＡ分子に物理的に結合されてもよい：
ＵＢＳ（例えば骨芽細胞のため）−ＭＰ−指標分子（緑色）−ＵＢＳ（例えば軟骨細胞のため）−ＭＰ−指標分子（青色）。

更なる実施例において、前述の配列ブロックの数は、任意に増加することができ、それによって、ＤＮＡ配列によって符号化されるそれぞれ異なる指標分子が、１つの特定の結合部位配列に対応するはずである。前述の実施例の長所は、１つのＤＮＡ分子だけが、取得された幹細胞サンプルの各細胞に人工的に導入され、前述の配列ブロックの十分な数によって、本質的に、取得された幹細胞サンプルの全ての細胞が、異種の幹細胞サンプルから、同じ特定の幹細胞表現型へ分化させるのにかかわる複数の均一な幹細胞群へ分離されることができるという点である。

別の実施例において、各々の幹細胞は、指標分子を符号化するＤＮＡ配列をそれぞれ含む少なくとも２つの導入ＤＮＡ分子を含み、それによって、導入されたＤＮＡ分子のＤＮＡ配列（４０）は、符号化する異なる指標分子である。さらに、異なる指標分子は、異なる特性を有してもよい。前述の実施例は、より良い識別及び選択を可能にする異なる特性を有する２つの指標分子の組合せの長所を可能にする。これはさらに多数の細胞型の同時選択を可能にし、そして、同じく分化経路を調査するための調査手段を提供する。

導入されたＤＮＡ分子は、さらに以下を含んでもよい：
−突然変異の最小プロモータ配列、ＤＮＡと非特異性の転写因子タンパク質間の相互作用を予防するために、それは、他の転写因子によって生じるいかなる小さい発現も除去する；
−少なくとも一つの追加的な結合部位配列（Ａ）。この実施例の長所は、更なる同一の配列を加えることによって、より多くの転写因子がＤＮＡ配列と相互に作用することができる、その結果、遺伝子発現はさらに強化される可能性がある。これは、さらに指標分子の数を増加させ、識別するのがより容易な所望の細胞を作る。

遺伝的に未変更の均一な群及び部分的に遺伝子が組み替えられた娘幹細胞を含む均一な幹細胞群および未変更の娘幹細胞は、再生医療目的のために使うことができる。群は、すでに周知の全ての幹細胞応用に適用でき、周知の従来技術応用に反して均一な群の長所を示す。ボーンの再生医療が分離されたもので生物学的適合性の骨格材料上へ未変更の幹細胞群が接種されることで、及び構造を骨欠陥に植設することで達成可能である。構造は、移植の前のインビトロの培養期間を有してもよく、有しなくてもよい。

あるいは、筋肉の場合、分離及び精製された細胞群は、直接欠陥に注入されてもよく、細胞が損傷の位置へ移動して修復を達成するように可能にする。

同じ特定表現型幹細胞へ分化させるのにかかわる均一な幹細胞群を用いて生成される組織疾患のインビボ治療のための薬品は、更なる混合剤（例えばホルモン、ビタミン、成長因子、更なるタンパク質、更なる酵素またはそれらの組合せと）と組み合わせて投与される可能性ができる。

更なる実施例において、幹細胞は前記幹細胞におけるタンパク質分子の存在を識別するために使われる。

更なる実施例において、幹細胞はタンパク質分子を含む幹細胞を選択するために使われる。

本発明の別の実施例は、同じ特定表現型の幹細胞へ分化させるのにかかわる本質的に均一な幹細胞群を含み、次の工程によって入手できる：
Ａ）異なる遺伝子を符号化する複数の配列及びＤＮＡタンパク質相互作用を可能にするプロモータを含む細胞ＤＮＡをそれぞれ含む幹細胞を含む幹細胞サンプルを集める；
Ｂ）少なくとも一つのＤＮＡ分子を改変幹細胞サンプルを生成する幹細胞サンプルの複数の幹細胞に人工的に導入する；それによって、導入されたＤＮＡ分子は、
Ｉ）タンパク質分子と相互に作用しやすい少なくとも一つの結合部位配列を含む；
ＩＩ）前記指標分子の識別を可能にする特性を有する指標分子を符号化する少なくとも一つのＤＮＡ配列；及び
ＩＩＩ）指標分子の遺伝子発現を可能にする、少なくとも一つの最小プロモータ配列；
Ｃ）培養基を改変幹細胞サンプルに加える；
Ｄ）特定の刺激物質を改変幹細胞サンプルに適用することによって、特定の刺激物質が、改変幹細胞サンプルにおける少なくとも一つの幹細胞のタンパク質分子を生成する；
Ｅ）幹細胞における指標分子の特性によってその存在を識別することによって、タンパク質分子を含む幹細胞を識別する；
Ｆ）それによって前記指標分子が、タンパク質分子及び導入されたＤＮＡ分子の結合部位配列（Ａ）間の相互作用によって始められるＤＮＡ配列の合成によって生成された；
Ｇ）前記本質的に均一な幹細胞群に対する指標分子の特性によって識別された幹細胞の選択。

さらに、本発明の別の実施例は、同じ特定表現型の幹細胞に分化させる幹細胞を含む本質的に均一な幹細胞群を含み、それによって各々の幹細胞が以下を含む：
Ａ）異なる遺伝子を符号化する複数の配列及びＤＮＡタンパク質相互作用を可能にするプロモータを含む細胞ＤＮＡ；
Ｂ）特定の刺激物質によって生成される少なくとも一つのタンパク質分子；
及び
Ｃ）幹細胞に人工的に導入される少なくとも一つのＤＮＡ分子、それによって導入されたＤＮＡ分子は以下を含む：
Ｉ）タンパク質分子と相互に作用しやすい少なくとも一つの結合部位配列；
ＩＩ）指標分子を符号化する少なくとも一つのＤＮＡ配列；及び
ＩＩＩ）指標分子の遺伝子発現を可能にする少なくとも一つの最小プロモータ配列、及び
Ｄ）導入のＤＮＡ分子の指標分子を符号化するＤＮＡ配列の合成によって生成される少なくとも一つの指標分子；それによって、
Ｅ）指標分子は、その識別のための特性を有する。

群の一実施例によれば、指標分子は前記指標分子を含む幹細胞の選択を可能にする特性を有する。

また、本発明の別の実施例は、次の工程によって入手できる幹細胞と同じ特定の表現型に分化させる本質的に均一な未変更の幹細胞群を含む：
Ａ）異なる遺伝子を符号化する複数の配列ＤＮＡタンパク質相互作用を可能にするプロモータを含む細胞ＤＮＡをそれぞれ含む幹細胞を含む幹細胞サンプルを集める；
Ｂ）少なくとも一つのＤＮＡ分子を改変幹細胞サンプルを生成する幹細胞サンプルの複数の幹細胞へ人工的に導入する；それによって導入されたＤＮＡ分子が以下を含む：
ｉ）タンパク質分子と相互に作用しやすい少なくとも一つの結合部位配列；
ｉｉ）前記指標分子の選択及び識別を可能にする特性を有する指標分子を符号化する少なくとも一つのＤＮＡ配列；及び
ｉｉｉ）指標分子の遺伝子発現を可能にする少なくとも一つの最小プロモータ配列；
Ｃ）培養基を改変幹細胞サンプルに加える；
Ｄ）特定の刺激物質を改変幹細胞サンプルに適用し、それによって特定の刺激物質が改変幹細胞サンプル内の少なくとも一つの幹細胞タンパク質分子を生成する；
Ｅ）指標分子特性によって幹細胞におけるその存在を識別することによって、タンパク質分子を含む幹細胞を識別する；
Ｆ）それによって、前記指標分子が、導入されたＤＮＡ分子のタンパク質分子及び結合部位配列（Ａ）間の相互作用によって始められるＤＮＡ配列の合成によって生成される；
Ｇ）本質的に均一な群に対する指標分子の特性による識別された幹細胞を選択する；
Ｈ）天然細胞分裂の後、指標分子特性によってその存在を識別することによって、人工的に導入されたＤＮＡ分子を含む娘幹細胞を識別する；
Ｉ）同じ特定表現型に分化することにかかわる未変更の本質的に均一な幹細胞群を取得するために、前記細胞分裂の後に取得された群から識別された娘幹細胞を選択及び除去する。

その群の他の実施例によれば、タンパク質分子は、特定の表現型への変化と関連している遺伝子の発現を増加させる転写因子タンパク質である。

群の他の実施例によれば、最小プロモータ配列は結合部位配列及び指標分子を符号化するＤＮＡ配列間の人工的に導入されたＤＮＡ分子に配置される。

群の他の実施例によれば、特定の刺激物質は、物理的、生物化学的、化学的刺激物質である。

さらにもう一つの群の実施例によれば、識別を可能にする指標分子の特性および／または前記指標分子の選択は、化学的、生化学的または物理的な特性である。

他の群の実施例によれば、導入されたＤＮＡ分子は、それぞれ異なる指標分子を符号化する少なくとも２つのＤＮＡ配列を含む。

さらに別の群の実施例によれば、群の幹細胞はそれぞれ、指標分子を符号化するＤＮＡ配列をそれぞれ含む少なくとも２つの導入されたＤＮＡ分子を含み、それによって、導入されたＤＮＡ分子のＤＮＡ配列が異なる指標分子を符号化する。

他の群の実施例によれば、異なる指標分子は、異なる特性を有する。

群の他の実施例によれば、導入されたＤＮＡ分子は、強磁性分子の特性を有する指標分子を符号化する配列を含む。

幹細胞の他の実施例によれば、導入されたＤＮＡ分子は、細胞表面表示タンパク質（天然の幹細胞群と異種）を符号化する配列を含む。

本発明の別の目的は、再生医療目的のための未変更群の使用である。

更なる本発明の目的は、組織及び血液疾患をインビボ治療する薬品の生成のための群の使用である。

なお、更なる本発明の目的は、組織及び血液疾患、特に白血病のインビトロ治療のための薬品の生成のための群の使用である。

本発明の別の目的は、薬品が更なる混合剤と組み合わせて投与される群の使用である。

さらにもう一つの本発明の目的は、混合剤がホルモン、ビタミン、成長因子、更なるタンパク質、更なる酵素またはそれの組合せによる群の使用である。

同じ特定の表現型へ分化させる本質的に均一な幹細胞群を取得する方法の更なる実施例は、次の工程を含む：
Ａ）複数の配列符号化された異なる遺伝子を含む細胞ＤＮＡをそれぞれ含む幹細胞及びＤＮＡタンパク質相互作用を可能にするプロモータを含む幹細胞サンプルを集める；
Ｂ）改変幹細胞サンプルを生成する幹細胞サンプルの複数の細胞に少なくとも一つのＤＮＡ分子を人工的に導入し、それによって、導入されたＤＮＡ分子が以下を含む：
Ｉ）タンパク質分子と相互に作用しやすい少なくとも一つの結合部位配列；
ＩＩ）指標分子の識別を可能にする特性を有する指標分子を符号化する少なくとも一つのＤＮＡ配列；及び
ＩＩＩ）指標分子の遺伝子発現を可能にする少なくとも一つの最小プロモータ配列；
Ｃ）培養基を改変幹細胞サンプルに加える；
Ｄ）特定の刺激物質を改変幹細胞サンプルに適用し、特定の刺激物質が、改変幹細胞サンプルの少なくとも一つの細胞のタンパク質分子を生成する；
Ｅ）幹細胞における指標分子の特性によるその存在の識別によるタンパク質分子を含む幹細胞の識別；
Ｆ）それによって前記指標分子がＤＮＡ配列の導入されたＤＮＡ分子のタンパク質分子及び結合部位配列間の相互作用によって始められる合成によって生成された；
Ｇ）本質的に均一な群に対する指標分子の特性による識別された幹細胞の選択。

上記の方法の別の実施例において、タンパク質分子は、特定の表現型への変化と関連する遺伝子の発現を増加させる転写因子タンパク質である。

上記の方法の更なる実施例において、最小プロモータ配列は結合部位配列及び指標分子を符号化するＤＮＡ配列間の人工的に導入されたＤＮＡ分子に配置される。

上記の方法のさらに別の実施例において、特定の刺激物質は、物理的、化学的または生化学的刺激物質である。

上記の方法のさらにもう一つの実施例において、前記指標分子の識別および／または選択を可能にする指標分子の特性は、化学的、生化学的または物理的な特性である。

上記の方法の更なる実施例において、指標分子は細胞表面表示タンパク質（天然の幹細胞群と異種）である。

上記の方法の別の実施例において、指標分子は強磁性特性を有する。

さらにもう一つの方法の実施例において、導入されたＤＮＡ分子のＤＮＡ配列は、以下のグループの指標分子を符号化する配列である：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）または黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）。

上記の方法の更なる実施例において、導入されたＤＮＡ分子は、それぞれ異なる指標分子を符号化する少なくとも２つのＤＮＡ配列を含む。

上記の方法の別の実施例において、指標分子を符号化する少なくとも一つのＤＮＡ配列をそれぞれ含む少なくとも２つの導入ＤＮＡ分子は、幹細胞サンプルの複数の幹細胞に人工的に導入され、それによって導入されたＤＮＡ分子のＤＮＡ配列が異なる指標分子を符号化する。

また上記の方法の更なる実施例において、異なる指標分子は、異なる特性を有する。

細胞ＤＮＡ及びタンパク質間の特定の相互作用によって、幹細胞の特定の表現型へ分子を分化させる未変更の幹細胞と同種の幹細胞群を取得する方法のさらにもう一つの実施例は、以下を有している追加的なステップを含む：
Ｈ）細胞分裂の後、指標分子特性によるその存在の識別による導入されたＤＮＡ分子を含む娘幹細胞の識別；
Ｉ）群から識別された娘幹細胞の選択及び除去。

本発明の別の実施例において、幹細胞の異種の群は、少なくとも２つの異なる特定の表現型の幹細胞を分化させるのにかかわる幹細胞を含み、それによって、各々の幹細胞は：
Ａ）異なる遺伝子及びＤＮＡタンパク質相互作用を可能にするプロモータを符号化する複数の配列を含む細胞ＤＮＡと；
Ｂ）幹細胞サンプルの複数の細胞に人工的に導入される少なくとも２つの異なるＤＮＡ分子であって、それによって、各々の導入されたＤＮＡ分子が：
ａ）タンパク質分子と相互に作用しやすい少なくとも一つの結合部位配列と；
ｂ）前記指標分子の識別を可能にする特性を有する指標分子を符号化する少なくとも一つのＤＮＡ配列と；
ｃ）指標分子の遺伝子発現を可能にする少なくとも一つの最小プロモータ配列とを含み；それによって、
ｄ）異なる導入ＤＮＡ分子が、２つの異なる指標分子を符号化する２つの異なるＤＮＡ配列を含んでなる
ＤＮＡ分子と
を含み、
Ｃ）少なくとも一つの指標分子が、導入されたＤＮＡ分子のＤＮＡ配列の合成によって生成される前記指標分子の識別を可能にする特性を有し、それによって
Ｄ）同じ特定の表現型の幹細胞へ分化するのにかかわる幹細胞が同じ指標分子を含む。

さらに別の実施例において、本発明は、少なくとも２つの異なる特定の幹細胞表現型へ分化させる幹細胞を含む２つの異なる幹細胞群を含む。それによって、各々の幹細胞は以下を含む：
Ａ）異なる遺伝子及びＤＮＡタンパク質相互作用を可能にするプロモータを符号化する複数の配列を含む細胞ＤＮＡ；及び
Ｂ）幹細胞サンプルの複数の細胞にそれぞれ人工的に導入される少なくとも一つのＤＮＡ分子、それによって、各々の導入されたＤＮＡ分子が以下を含む：
ａ）タンパク質分子と相互に作用しやすい少なくとも一つの結合部位配列；
ｂ）前記指標分子の識別を可能にする特性を有する指標分子を符号化する少なくとも一つのＤＮＡ配列；
ｃ）指標分子の遺伝子発現を可能にする少なくとも一つの最小プロモータ配列；それによって、
ｄ）異なる導入されたＤＮＡ分子が、２つの異なる指標分子を符号化する２つの異なるＤＮＡ配列を含む；及び
Ｃ）導入されたＤＮＡ分子のＤＮＡ配列の合成によって生成される前記指標分子の識別を可能にする特性を有する少なくとも一つの指標分子、それによって
Ｄ）同じ特定の幹細胞表現型に分化させる幹細胞が同じ指標分子を含む。

２つの異なる幹細胞群の別の実施例において、少なくとも一つのＤＮＡ分子は、それぞれ幹細胞サンプルの全ての幹細胞に、ステップＢ）の方法で人工的に導入される。

また上記の群の更なる実施例において、異なる指標分子は、異なる特性を有する。

本発明及び本発明の追加的な構成は、いくつかの実施例の一部の略図により、より詳細に説明される。

幹細胞に人工的に導入されるＤＮＡ分子を略図で例示する。請求項１において定義される本発明による幹細胞を生成するために幹細胞に継代培養する過程を略図で例示する。同じ特定の種類に分化させる本質的に均一な幹細胞群を取得するための発明の方法によるインビトロの過程に関して略図で例示する。同じ特定の種類に分化させる本質的に均一な幹細胞群を取得するための発明の方法によるインビトロの過程に関して略図で例示する。同じ特定の種類に分化させる本質的に均一な幹細胞群を取得するための発明の方法によるインビトロの過程に関して略図で例示する。同じ特定の種類に分化させる本質的に均一な幹細胞群を取得するための発明の方法によるインビトロの過程に関して略図で例示する。同じ特定の種類に分化させる本質的に均一な幹細胞群を取得するための発明の方法によるインビトロの過程に関して略図で例示する。特定の刺激物質、特定の刺激物質の決定的な混合剤、幹細胞の特定の種類及び特定の表現型になるように促進される細胞において表示される特定の転写因子タンパク質間の相互関係を記載している表を示す。

図１は、人工的に幹細胞に導入されるＤＮＡ分子６に関する略図であり、このＤＮＡ分子６はプラスミド形であり、特定のタンパク質分子３と相互に作用することが可能である結合部位配列３０、遺伝子発現を可能にする最小プロモータ配列５０及び指標分子５（図１に図示されておらず）を符号化するＤＮＡ配列４０を含む。結合部位配列３０は、特定のタンパク質分子３だけと相互に作用することが可能である特定の配列であり、したがって、好ましい幹細胞の表現型に従い選択される（細胞表現型の依存および結合部位配列は、下記に与えられる）。最小プロモータ配列５０は、プロモータ配列の最も小さい断片であって、表示される指標分子５を符号化するＤＮＡ配列４０によって符号化される遺伝子を可能にする。結合部位配列３０と相互に作用する特性を有するタンパク質分子３の存在下で、タンパク質分子３が、結合する配列部位３０に結合するので、指標分子５を符号化するＤＮＡ配列４０の発現が最小プロモータ配列５０によって始められ、指標分子５が合成される。タンパク質分子３が結合部位配列３０と相互に作用しない場合において（導入されたＤＮＡ分子６の結合部位配列３０と相互に作用することが可能なタンパク質分子３が、幹細胞において現れない場合のみ）、指標分子が合成されないように、指標分子５を符号化するＤＮＡ配列４０が表示されることができなく、そのため、幹細胞におけるタンパク質分子３の存在が幹細胞における指標分子５の存在によって確認される。１つの結合部位配列３０、最小プロモータ配列５０及び指標分子を符号化する１つのＤＮＡ配列４０の代わりに、導入されたＤＮＡ分子６は、例えば他の指標分子５を符号化する追加的なＤＮＡ配列３０または遺伝子発現を強化している追加的な結合部位配列（３０）を含む可能性がある。

図２は、結合部位配列３０、最小プロモータ配列５０及び指標分子５を符号化するＤＮＡ配列４０を含む細胞ＤＮＡ２及び人工的に導入されたＤＮＡ分子６を含む幹細胞１を示す（図３Ｃ、３Ｄで示される）その識別を可能にする特性及び選択を有する。人工的に導入されたＤＮＡ分子６は、ウィルス・トランスダクションまたは非ウィルス・トランスフェクションによって幹細胞１へ導入されることができる。細胞に構造を往復させるためにウィルス・トランスダクションを使用することは、構造がアデノウィルスＤＮＡに挿入され、細胞がアデノウィルスの従来の方法を使用して感染されることを意味する。あるいは、アデノウィルス・システムは、準アデノウィルスであることが可能で、またはレトロウィルス及びレンチウィルスである。任意の市販の非ウィルス性システム、例えばリポソーム（例えばリポフェクトアミン）またはＡＭＡＸＡ技術、および早期確立方法、例えば、リン酸カルシウム・トランスフェクションまたは電気穿孔法が、さらに使われることができる。その細胞ＤＮＡ２及び人工的に導入されたＤＮＡ分子６に加えて、幹細胞１は、複数のタンパク質分子３を更に含む。幹細胞１におけるタンパク質分子３の存在は、特定の刺激物質１２を幹細胞１に適用することによって生じる。幹細胞１は、多数の細胞型を生成するために誘導されることができる強力な細胞である。生成される細胞表現型は、非前駆細胞によって受けられる刺激物質１２に依存している。一旦刺激されると、他のスイッチを入れるのに対して、幹細胞１は特定の遺伝子のスイッチを切ることによってその表現型を変える。タンパク質分子３は幹細胞の１つの表現型だけに特有である初期表示遺伝子である。その結果、タンパク質分子３の存在は幹細胞の表現型によって、特定の刺激物質１２を幹細胞１に適用することによって生じる。特定の刺激物質１２を適用すると、即座に、タンパク質分子３は、生成され、タンパク質分子３と相互に作用しやすい配列と結合し、遺伝子の発現を増加させる。タンパク質分子３は、さらに結合部位配列３０と結合し、前記結合によって、指標分子５を符号化するＤＮＡ配列４０及び指標分子５の原因合成の発現を引き起こす。

図３Ａは、細胞ＤＮＡ２を含む複数の幹細胞を含む幹細胞サンプル１０に関して略図で例示する。タンパク質分子３と相互に作用しやすい結合部位配列３０、最小プロモータ配列５０及び自己識別及び選択を可能にする特性を有する指標分子５を符号化するＤＮＡ配列４０をそれぞれ含むＤＮＡ分子６が、改変幹細胞サンプル１１を生成するために、人工的に幹細胞サンプル１０のそれぞれの幹細胞に導入された。幹細胞サンプル１０の各細胞におけるＤＮＡ分子６の人工的導入の後に、特定の刺激物質１２（図２に示される）が、改変幹細胞サンプル１１に加えられた。多能性から幹細胞の特定の表現型まで、改変幹細胞サンプル１１の幹細胞の一部の変更を生成している特定の刺激物質１２は、改変幹細胞サンプル１１に加えられた。特定の刺激物質１２を改変幹細胞サンプル１１に適用すると、幹細胞の一部は、特定の刺激物質１２に対応する幹細胞の特定の表現型になるように刺激された。これらの幹細胞１は、さらに少なくとも一つの生成されたタンパク質分子３（図３Ｂ）を含む。特定の刺激物質１２のために、取得されたタンパク質分子３は、初期の表示遺伝子タンパク質であり、転写因子の機能を有し、すなわち、対応する特定のＤＮＡ配列と相互に作用しやすい。

前記手順の結果、幹細胞サンプル１０は、人工的に導入されたＤＮＡ分子６をそれぞれ含む幹細胞を含む改変幹細胞サンプル１１に変化され、それによって改変幹細胞サンプル１１が２つのグループの幹細胞を含む：
− グループＡ：幹細胞（これは刺激されて、幹細胞の特定の表現型になった）、それによって、この表現型に特有なタンパク質分子が人工的に導入されたＤＮＡ分子６の結合部位配列３０と相互に作用しやすい；及び
− グループＢ：幹細胞、これは刺激されても、特定の表現型にならなかった（すなわち、それが細胞に存在しないのでこの表現型に特有なタンパク質分子は、人工的に導入されたＤＮＡ分子６の結合部位配列３０と相互に作用しやすくなるわけではない）。

図３Ｃは、特定の刺激物質１２によって刺激されるとともに、タンパク質分子３を含むグループＡの幹細胞１が特定の種類になることを図式的に示し、それは、人工的に導入されたＤＮＡ分子６の結合部位配列３０と相互に作用しやすい。幹細胞１へのＤＮＡ分子６の人工的導入及び特定の刺激物質１２を幹細胞サンプル１０に適用することによる幹細胞１の刺激の後に、幹細胞１の表現型に固有な遺伝子の天然発現および人工的に導入されたＤＮＡ分子６の他方結合部位配列３０を増加させるために、生成タンパク質分子３が、細胞ＤＮＡ２の特定の配列と相互に作用し、それによって、結合部位配列３０が、天然遺伝子発現の間、タンパク質分子３と相互に作用する細胞ＤＮＡ２の特定の配列と同一である。タンパク質分子３及び細胞ＤＮＡ２間の相互作用のために、タンパク質分子３に固有な天然遺伝子発現が進行する。タンパク質分子３及び結合部位配列３０間の相互作用のために、指標分子５を符号化するＤＮＡ配列４０の発現は、最小プロモータ配列５０によって始められ、指標分子５は合成される。

図３Ｃにおいて図解される手順の結果として、グループＡの幹細胞は、幹細胞サンプル１０から指標分子５の識別及び選択を可能にする特性を有する指標分子５の存在により、グループＢの幹細胞と異なる。

図３Ｄは、同じ特定表現型及び、残りの幹細胞を含む更なる異種の幹細胞群１８に分化させるのにかかわる幹細胞だけを含む均一な幹細胞群１７へ異種の幹細胞群の幹細胞の分離及び識別の手順を図解する。目標幹細胞１の識別及び選択は、任意の探知器装置によって達成されることができ、それによって、幹細胞１の特定の表現型を示している幹細胞１の指標分子５の存在が、指標分子５の特性によって観察されることができる。幾つの探知器装置の例は、前述されている。

アデノウィルスまたは他のいずれかの非積分ウィルス・システムを使用するとき、人工的に導入されたＤＮＡ分子６は、幹細胞に導入されるが、細胞ＤＮＡ２にリンクされない。したがって、人工的に導入されたＤＮＡ分子６は、天然細胞分裂の間、自己複製されないので、他のものが未変更のままであるのに対して、それぞれの幹細胞１の娘細胞のうちの１つだけが、導入されたＤＮＡ分子６を含む。図３Ｅは、群１７の幹細胞１の天然細胞分裂の手順を図解し、それは、人工的に導入されたＤＮＡ分子６を含む娘幹細胞２０および、同じ特定の表現型へ分化させるのにかかわる複数の未変更幹細胞を含む幹細胞群を生成する。修飾された娘細胞（すなわち人工的に導入されたＤＮＡ分子６を含む娘細胞）は、未変更の幹細胞だけを含む均一な未変更の幹細胞群１９を取得するために、前記識別及び選択手順によって幹細胞の均一な群１７から識別及び選択され得る。

類似して、図３Ａ−３Ｅに示される手順に、幹細胞の任意の幹細胞サンプルは、同じ特定の表現型へ分化させるのにかかわる幹細胞を含む別の均一な群に分離されることができ、それによって、多くのＤＮＡ分子６（均一な群に選ばれるために要求される細胞表現型の数に対応する）は、生成され、それぞれのＤＮＡ分子６が結合部位配列３０、最小プロモータ配列５０及び指標分子５を符号化するＤＮＡ配列４０を含み、それによって、それぞれの異なるＤＮＡ分子６の結合部位配列３０が、識別されるために要求される異なる細胞表現型に対応し、それぞれの異なるＤＮＡ分子６の指標分子５を符号化するＤＮＡ配列４０が、異なる指標分子５の配列を符号化する。クローニングの後、各種類の生成されたＤＮＡ分子６は、人工的に幹細胞のそれぞれの幹細胞に導入される。上記の手順によって取得される幹細胞サンプルは、多くの異なる特定表現型へ分化させるのにかかわる複数の幹細胞１を含み、それによって、細胞のそれぞれの表現型は、異なる指標分子５の異なる特性によって識別されることができる。あるいは、ＤＮＡ分子６は、複数の結合する配列３０、最小プロモータ配列５０及び指標分子５を符号化するＤＮＡ配列４０を含むことができ、１つのＤＮＡ分子が、異なる種類のタンパク質分子３、特定の指標分子５の生成に導いている各々のタンパク質分子３を結合することができるように前述の方法で配置される。

ＤＮＡ配列の前記導入のために、非ウィルス性トランスフェクションのための以下の例が適切である。骨芽細胞に分化するのにかかわる間充織幹細胞が例として使われた；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を符号化する配列は、トランスフェクションする。Ｒｕｎｘ２ＤＮＡリポータ構造は、以下の明細書において、少なくとも以下を含む人工的に導入されたＤＮＡ分子を指す：
ｉ）Ｒｕｎｘ２結合部位（すなわち、配列は人工的に導入されたＤＮＡ分子及びＲｕｎｘ２タンパク質間の相互作用に影響する）；
ｉｉ）ＤＮＡ転写の開始に影響している最小のプロモータ；及び
ｉｉｉ）配列符号化緑色蛍光性分子（ＧＦＰ）（すなわち指標分子、それは、前記指標分子の識別及び選択を可能にする化学的、物理的または生化的特性を有する）
ＤＮＡリポータ構造によって、ＧＦＰ発現がＲｕｎｘ２転写因子タンパク質の結合によって駆動され、標準の分子クローン技術を使用してプラスミドにクローンがつくられる。正確な方法は、使用されるプラスミドに依存する。プラスミド／リポータ構造は、再懸濁されるものが体積の小さいバッファである前に、ＤＮＡを浄化及び殺菌するために、エタノールによって沈殿される。分離された幹細胞は、９６のウェルプレートにおいて平板培養され、連続希薄法は、単一の細胞群を含むウェルを生成するために創設される。細胞は、５％のＣＯ^２培養器内で３７℃で、１０％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＤＭＥＭ培養基において一晩育てられる（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ／ＶｏｇｔＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅの最小必須培養液）。２４時間の培養の後に、ＤＮＡが３．８４ｍｌの無血清ＤＭＥＭに希釈され（簡単にボルテックスされる）、リポソーム試薬が加えられる。ＤＮＡ及びリポソームの正確な値は、各プラスミド及び細胞型のために最適化されることを必要とされるが、一般的な値は、無血清培地１ｍｌあたり、１μｇＤＮＡ及び１０μｌのリポソーム試薬である。完全な培養基は細胞から吸い込まれ、それらは無血清培地で一度洗浄される。それから、１ウェルにつき、無血清培地の４０μｌＤＮＡが加えられる。細胞は、５％のＣＯ^２培養器の中で３７℃で、３時間培養される。それから、１ウェルにつき２００μｌの完全な培養基が加えられ、細胞は、１６乃至２４時間更に育てられる。培養基は、それから除去され、１ウェルにつき２５０μｌのＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、１０％のＦＣＳ、非必須アミノ酸、０．１ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸塩及び１０ｎＭデキサメタゾン（骨原培養基）を有する１０ｍＭ β−グリセロリン酸塩と取り替えられる。細胞は、現在引き続いて緑色繁栄期をモニタされる（それは、緑色蛍光タンパク質の存在及びしたがって、Ｒｕｎｘ２の存在を示す）。

単一の緑色細胞は、分離され、更に膨張されることが可能で、すべてが骨芽細胞になる予定である細胞の群に導く。

本発明及び本発明の更なる展開は、以下の応用例実施例において更に詳細に説明される。

実施例１：
この実施例は、より正確に本発明による本質的に均一な間充織幹細胞群を取得するための手順を説明し、それは図示する実施例にあり、この実施例だけに本発明の範囲を限定するべきでない。実施例は、骨芽細胞だけに分化する幹細胞を取得する方法を指し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が指標分子として使われる。

材料：
殺菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２、フィコール、メチレンブルー。

培養基：
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ／ＶｏｇｔＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅの最小必須培養液：１Ｌの培養基のための粉、０．１１ｇ／Ｌのナトリウム・ピルビン酸塩及び３．７ｇ／Ｌのナトリウム炭酸水素塩を加え、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（胎児性子牛血清）抗生物質／抗真菌溶液（１００Ｘ）（液体、１ｍＬを各１００ｍＬの培養基に加える）、Ｔ−Ｆｌａｓｋｓ７５ｃｍ^２／２５０ｍＬ。

手順：
腸骨稜から取得されるヒト骨髄穿刺液が、１ｍＬの吸引につき４ｍＬのＤＭＥＭ／５％ＦＣＳで希釈された。サンプルは、それから５分間１０００ｒｐｍで遠心分離機で分離された。肥沃な層及び上澄みは取り除かれ、残りのペレットは、４ｍＬのＤＭＥＭ／５％ＦＣＳの中で再懸濁された。

１ｍＬの不希釈吸引につき２．６ｍＬの室温フィコールは、５０ｍＬ−ファルコン・チューブに置かれ、吸引／ＤＭＥＭは、フィコールの上の非常に穏やかなピペットであった。サンプルは、それから正確に２０分間室温で、８００ｇで遠心分離機で分離され、最も低いレベルで加速／減速される。単核細胞は、注射器またはピペットを使用して集められた分裂期を形成した。５ｍＬのＤＭＥＭ／５％ＦＣＳが、収集した分裂期のｍＬごとに加えられ、穏やかに混合されて、室温で１５分間４００ｇで遠心分離機で分離される。上澄みは吸引され、洗浄ステップは繰り返された。

最終的な細胞ペレットは、１０ｍＬの培養基において再懸濁された。７５ｃｍ^２−フラスコにつき４×１０^６細胞は１５ｍＬの培養基に配置され、細胞をフラスコの下部に付着させるために、９５％湿度で２−３日間、３７℃、５％のＣＯ_２下に置く。

上記の手順によれば、分離された間充織幹細胞は、さらに間充織幹細胞を表現するために考慮される（適切な刺激物質の追加で骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、その他に分化させることが可能である）。

取得された間充織幹細胞の淀みから、骨芽細胞だけに分化させるのにかかわる幹細胞が、以下の手順によって分離される：
Ｒｕｎｘ２ＤＮＡリポータ構造は、標準分子クローン技術を使用して、ｐＳｈｕｔｔｌｅベクタ（ＳｔａｔａｇｅｎｅからのｐＡｄＥａｓｙアデノウィルス構造キットの一部）にクローンがつくられた。Ｒｕｎｘ２駆動緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）リポータを含むｐＳｈｕｔｔｌｅベクタは、熱ショック変質によってバクテリアに加えられた。有能なバクテリア（ＤＮＡプラスミドを受け入れるバクテリア）ＸＬ−１０Ｇｏｌｄが、使われた。１００マイクロリットルの冷却したバクテリアが１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに配置されるとともに、４μｌのβ−メルカプトエタノールが加えられ、穏やかに混ぜられた。細胞はそれから１０分間氷の上で培養され、Ｒｕｎｘ２駆動ＧＦＰリポータを含むｐＳｈｕｔｔｌｅベクタ０．１−５０ｎｇが加えられる。細胞は、それから３０分間氷の上で培養され、それから３０秒間４２℃の水に浸液された。氷の上で更に２分間培養した後に、０．９ｍｌのあらかじめ暖められた（４２℃）ＮＺＹ＋培養基（ＮＺＹ＋は、バクテリアを育てるための周知の培養基である）に加えられ、チューブは振とうとともに３７℃で培養された。サンプルは、それからカナマイシン抗生物質を含むＬＢ培地プレート上へ平板培養され、一晩３７℃で配置された。プラスミドを含むバクテリアだけが、抗生物質に耐性であって、コロニーを形成する。３６時間までの培養の後、個体コロニーは採集され、１０ｍｌのＬＢ−カナマイシン培養液の中で一晩育成された。２４時間の培養後、プラスミドはそれから標準のプラスミドミニプレップ技術を使用してバクテリアから分離された。

分離されたプラスミドは、それからＰｍｅｌ規制酵素によって線形にされ、再浄化されて、それから３７℃で３０分間アルカリリン酸塩で処理される。線形にされ、脱リン酸化されたプラスミドは、それからアガロース・ゲル電気泳動法によって精製され、１μｇ／μｌ濃度の殺菌したｄＨ_２Ｏ内で再懸濁された。

アデノウィルス・ベクタを生成するために、４０μｌの冷却したＢＪ５１８３バクテリアが、冷却した１．５ｍｌの遠心分離機チューブに配置された。１μｌ（１μｇ）の線形にされ、ｐＳｈｕｔｔｌｅにおいて脱リン酸化されたＲｕｎｘ２ＤＮＡリポータ構造及び１μｌ（１００ｎｇ／μｌ）のｐＡｄＥａｓｙ−１ベクタ（ＳｔａｔａｇｅｎｅからのｐＡｄＥａｓｙアデノウィルス構造キットの一部）が、加えられて、穏やかに混ぜられた。この混合物は、冷却した電気穿孔法キュベットへ転送されて、以下の設定の電気で一度、パルスされた：２００ｏｈｍ，２．５ｋＶ，２５μＦ。電気穿孔の後、１ｍｌの殺菌したルーリア培養液が、直ちに加えられた。混合物は、それからＬＢ−カナマイシン・アガロース・プレートに加えられ、一晩３７℃で培養された。２４時間までの培養の後、プレート上の最も小さいコロニーのうちの１０個が選択され、振とうとともに３７℃で一晩５ｍｌのＬＢ−カナマイシン培養液で育てられる。最も小さいコロニーは、Ｒｕｎｘ２ＤＮＡリポータ構造が組換えによってｐＳｈｕｔｔｌｅベクタからｐＡｄＥａｓｙベクタへ変質するようである。２４時間までの培養の後、組み換え型ベクタ（Ｒｕｎｘ２ＤＮＡリポータ構造を含むｐＡｄＥａｓｙ）が、標準のプラスミド・ミニプレップ技術を使用してバクテリアから分離された。プラスミドは、塩基配列決定によって調査され、適切な組み換え型を確実にするためにＰａｃｌ消化が、生成された。

ｐＳｈｕｔｔｌｅのための前記のように、Ｒｕｎｘ２ＤＮＡリポータ構造を含むｐＡｄＥａｓｙアデノウィルス・ベクタがそれからＸＬ−１０金バクテリアに変化された。アデノウィルスは、それからＡＤ−２９３哺乳類の細胞を使用して、Ｒｕｎｘ２ＤＮＡリポータ構造を含むｐＡｄＥａｓｙＤＮＡベクタから生成された。ＡＤ−２９３細胞は、一皿ごと７ｘ１０^５細胞の濃度で６０−ｍｍ組織培養皿に平板培養され、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養基において育てられる。細胞が７０％の密集の場合、それらは、ＰＢＳによって二回洗浄され、２５μｍのクロロキンを含む４ｍｌのＤＭＥＭ及び７％の修飾ウシ血清が加えられた。細胞は、５％ＣＯ_２の培養器において３７℃で３０分間培養された。

細胞が培養している間に、再懸濁されたＲｕｎｘ２ＤＮＡリポータを含む５μｇのＰａｃｌ消化組み換え型アデノウィルス・ベクタは、ｄＨ_２Ｏにおいて２２５μｌの最終的ボリュームを構成する。ｖｉｒａｐａｃｋ（商標）トランスフェクション・キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からの２５μｌの溶液１及び２５０μｌの溶液２が、２２５μｌのＤＮＡ懸濁液に加えられた。これは、徐々に混合されて、１０分間室温で培養された。徐々に混合されたＤＮＡ懸濁液は、それから細胞液滴に培養基をなだらかに渦巻きながら加えられた。ＤＮＡを有する細胞は、ＣＯ_２培養器内で３７℃で３時間培養された。培養基は、除去され、徐々に、２５μＭのクロロキンを含む４ｍｌの培養基と取り替えられる。培養基を除去し、通常の完全な培養基と取り替える前に、細胞は、ＣＯ_２培養器内において３７℃で更に６時間培養された。

７−１０日以後に、細胞は増大して現れた。培養基は除去され、０．５ｍｌのＰＢＳが加えられた。細胞は、細胞スクレイパーでこすり落され、１．７ｍｌのチューブへ移された。４回の冷凍−解凍−手順の後に、細胞は、１０分間室温で１２，０００ｇの遠心分離機で分離され、上澄みは、等分していた。生のウィルス株を−８０℃で保存する。

アデノウィルス・ベクタに感染する幹細胞は、９６ウェルプレートにおいて平板培養された。連続希薄は、単一細胞群を含むウェルを生成するために創設された。感染の日に、ウィルスは４０μｌ無血清培養基と混ぜ合わせられ、ウェルあたり１００ＭＯＩの最終濃度になった。加えられるボリュームは、ウェルベースをカバーするために必須最小限であるべきである。培養基は間充織幹細胞から除去され、ウィルス懸濁液混合物が徐々に加えられた。ウィルス混合物は、ＣＯ_２培養器内において３７℃で３時間培養された。２００μｌのＤＭＥＭ培養基は、正常なものとしてＣＯ_２培養器内に３７℃で加えられた。２４時間の後、培養基は２５０μｌのウェルＩＭＤＭ、１０％のＦＣＳ、非必須アミノ酸、０．１ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸塩及び１０ｎＭデキサメタゾン（骨原培養基）を有する１０ｍＭ β−グリセロリン酸塩と取り替えられた。細胞は、引き続いて緑色蛍光性のためにモニタされた（それは、緑色蛍光タンパク質の存在及びそれゆえにＲｕｎｘ２の存在を示す）。

単一の緑色細胞は、分離されて、更に拡大され、全てが骨芽細胞になる予定である細胞群に導く。

単分子層拡張の間、ＧＦＰ発現ベクタは失われる。これは、遺伝子が組み替えられていなかった細胞の群を残す。

必須の表現型が、三次元の誘導を好む場合（例えば軟骨細胞）、間充織幹細胞は、低い密度のヒドロゲルで接種されることができる（例えばアルギン酸塩）。指標分子の存在による識別される細胞は、それからジェル内で後で混合群から分離されることができる。

実施例２−５
あるいは、同じ特定の表現型へ分化させるのにかかわる任意の更なる均一な幹細胞群が、上記の方法によって入手可能である。図４に基づく表は、特定の刺激物質及びこれらの刺激物質の決定的な混合剤の幾つの実施例を図解するが、それらは、特定の表現型へ分化させることにかかわる幹細胞群および、幹細胞の表現型に固有な対応転写因子タンパク質を取得するために使われることができる。

Claims

以下のステップを含む、同じ特定の表現型に分化させるのにかかわる本質的に均一な未改変成人幹細胞の群（１７）をインビトロで取得するための方法：
Ａ）異なる遺伝子及びＤＮＡタンパク質相互作用を可能にするプロモータを符号化する複数の配列を含む細胞ＤＮＡ（２）をそれぞれ含む幹細胞を含む幹細胞サンプル（１０）を集めるステップ；
Ｂ）改変幹細胞サンプル（１１）を生成している幹細胞サンプル（１０）の複数の細胞に少なくとも一つのＤＮＡ分子（６）を人工的に導入するステップであって、それによって、導入されたＤＮＡ分子は、幹細胞に導入されるが、幹細胞の原型の細胞ＤＮＡに導入されるわけではなく、導入されたＤＮＡは、細胞分裂によって複製されるわけではなく、娘細胞のうちの１つだけにおいて現存し、それによって、導入されたＤＮＡ分子（６）が：
Ｉ）タンパク質分子（３）と相互に作用しやすい少なくとも一つの結合部位配列（３０）であって、それによって結合部位配列（３０）は、特定のタンパク質分子（３）だけと相互に作用することが可能である特定の配列であり、所望の幹細胞の表現型に従い選択されてなる結合部位配列（３０）；
ＩＩ）その識別を可能にする特性を有する指標分子（５）を符号化する少なくとも一つのＤＮＡ配列（４０）；および
ＩＩＩ）前記指標分子（５）の遺伝子発現を可能にする少なくとも一つの最小プロモータ配列（５０）；
を含んでなるステップ；
Ｃ）培養基を改変幹細胞サンプル（１１）に加えるステップ；
Ｄ）特定の刺激物質（１２）を改変幹細胞サンプル（１１）に適用することによって、特定の刺激物質（１２）が、改変幹細胞サンプル（１１）の少なくとも一つの細胞のタンパク質分子（３）を生成するステップ；
Ｅ）指標分子（５）の特性による、幹細胞（１）におけるその存在の識別によって、タンパク質分子（３）を含む幹細胞（１）を識別するステップ；
Ｆ）それによって前記指標分子（５）が、導入されたＤＮＡ分子（６）のタンパク質分子（３）と結合部位配列（３０）との間の相互作用によって始められるＤＮＡ配列（４０）の合成によって生成されるステップ；
Ｇ）本質的に均一な群（１７）に対する指標分子（５）の特性によって、識別された幹細胞（１）を選択するステップ；
Ｈ）天然細胞分裂の後、指標分子（５）の特性によるその存在の識別による、人工的に導入されたＤＮＡ分子（６）を含む娘幹細胞（２０）を識別するステップ；
Ｉ）識別された娘幹細胞（３１）を群（１７）から選択し除去するステップ。
タンパク質分子（３）が特定の表現型への変化と関連する遺伝子の発現を増加させる転写因子タンパク質である請求項１に記載の方法。
最小プロモータ配列（５０）が、指標分子（５）を符号化する結合部位配列（３０）とＤＮＡ配列（４０）との間の人工的に導入されたＤＮＡ分子（６）内に配置される請求項１または２に記載の方法。
特定の刺激物質（１２）が物理的、化学的、生化学的刺激物質である請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
前記指標分子（５）の識別および／または選択を可能にする指標分子（５）の特性が化学的、生化学的または物理的な特性である請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
指標分子（５）が、天然の幹細胞群と異種であり、細胞表面発現タンパク質である請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
指標分子（５）が強磁性特性を有する請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
導入されたＤＮＡ分子（６）のＤＮＡ配列（４０）が以下のグループの指標分子を符号化する配列である請求項１−７のいずれか１項による方法：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）または黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）。
導入されたＤＮＡ分子（６）が、それぞれ異なる指標分子（５）を符号化する少なくとも２つのＤＮＡ配列（４０）を含む請求項１−８のいずれか１項に記載の方法。
指標分子（５）を符号化する少なくとも一つのＤＮＡ配列（４０）をそれぞれ含む少なくとも２つの導入されたＤＮＡ分子（６）が、幹細胞サンプルの複数の幹細胞に人工的に導入され、それによって、導入されたＤＮＡ分子（６）のＤＮＡ配列（４０）が異なる指標分子（５）を符号化する請求項１−９のいずれか１項に記載の方法。
異なる指標分子（５）が異なる特性を有する請求項１０に記載の方法。
次のステップによってインビトロで取得できる成人幹細胞（１）の本質的に均一な群（１７）：
Ａ）異なる遺伝子及びＤＮＡタンパク質相互作用を可能にするプロモータを符号化する複数の配列を含む細胞ＤＮＡ（２）をそれぞれ含む幹細胞を含む幹細胞サンプル（１０）を集めるステップ；
Ｂ）改変幹細胞サンプル（１１）を生成する幹細胞サンプル（１０）の複数の幹細胞に少なくとも一つのＤＮＡ分子（６）を人工的に導入するステップであって、それによって、導入されたＤＮＡ分子は、幹細胞に導入されるが、幹細胞の原型の細胞ＤＮＡに導入されるわけではなく、導入されたＤＮＡは、細胞分裂によって複製されるわけではなく、娘細胞のうちの１つだけにおいて現存し、それによって、前記導入されたＤＮＡ分子（６）が：
Ｉ）タンパク質分子（３）と相互に作用しやすい少なくとも一つの結合部位配列（３０）であって、それによって結合部位配列（３０）は、特定のタンパク質分子（３）だけと相互に作用することが可能である特定の配列であり、所望の幹細胞の表現型に従い選択されてなる結合部位配列（３０）と、
ＩＩ）前記指標分子（５）の識別を可能にする特性を有する指標分子（５）を符号化する少なくとも一つのＤＮＡ配列（４０）と、
ＩＩＩ）指標分子（５）の遺伝子発現を可能にする少なくとも一つの最小プロモータ配列（５０）と
を含んでなるステップ；
Ｃ）培養基を改変幹細胞サンプル（１１）に加えるステップ；
Ｄ）特定の刺激物質（１２）を改変幹細胞サンプル（１１）に適用することによって、特定の刺激物質（１２）が、改変幹細胞サンプル（１１）の少なくとも一つの幹細胞のタンパク質分子（３）を生成するステップ；
Ｅ）指標分子（５）の特性による、幹細胞（１）におけるその存在の識別によって、タンパク質分子（３）を含む幹細胞（１）を識別するステップ；
Ｆ）それによって前記指標分子（５）が、導入されたＤＮＡ分子（６）のタンパク質分子（３）と結合部位配列（Ａ）との間の相互作用によって始められるＤＮＡ配列（４０）の合成によって生成されるステップ；
Ｇ）幹細胞（１）の前記本質的に均一な群（１７）に対する指標分子（５）の特性によって、識別された幹細胞（１）を選択するステップ。
幹細胞の同じ特定表現型へ分化させるのにかかわる幹細胞を含む本質的に均一な成人幹細胞の群（１７）であって、各々の幹細胞が：
Ａ）ＤＮＡタンパク質相互作用を可能にする異なる遺伝子及びプロモータを符号化する複数の配列を含む細胞ＤＮＡ（２）と；
Ｂ）特定の刺激物質（１２）によって生成される少なくとも一つのタンパク質分子（３）と；
Ｃ）幹細胞（１）に人工的に導入される少なくとも一つのＤＮＡ分子（６）であって、それによって、導入されたＤＮＡ分子は、幹細胞に導入されるが、幹細胞の原型の細胞ＤＮＡに導入されるわけではなく、導入されたＤＮＡは、細胞分裂によって複製されるわけではなく、娘細胞のうちの１つだけにおいて現存し、それによって、導入されたＤＮＡ分子（６）が：
Ｉ）タンパク質分子（３）と相互に作用しやすい少なくとも一つの結合部位配列（３０）であって、それによって結合部位配列（３０）は、特定のタンパク質分子（３）だけと相互に作用することが可能である特定の配列であり、所望の幹細胞の表現型に従い選択されてなる結合部位配列（３０）と；
ＩＩ）指標分子（５）を符号化する少なくとも一つのＤＮＡ配列（４０）と；
ＩＩＩ）指標分子（５）の遺伝子発現を可能にする少なくとも一つの最小プロモータ配列（５０）；
とを含んでなるＤＮＡ分子（６）と；
Ｄ）導入されたＤＮＡ分子（６）の指標分子（５）を符号化するＤＮＡ配列（４０）の合成によって生成される少なくとも一つの指標分子（５）と
を含み、それによって
Ｅ）前記指標分子（５）はその識別のための特性を有し、
Ｆ）前記タンパク質分子（３）は、特定表現型への変化と関連する遺伝子の発現を増加させる特定の転写因子タンパク質であってなる
成人幹細胞の群（１７）。
指標分子（５）が、前記指標分子（５）を含む幹細胞（１）の選択を可能にする特性を有する請求項１２または１３に記載の群（１７）。
最小プロモータ配列（５０）が、指標分子（５）を符号化する結合部位配列（３０）とＤＮＡ配列（４０）との間の人工的に導入されたＤＮＡ分子（６）内に配置される請求項１２−１４のいずれか１項に記載の群（１７）。
特定の刺激物質（１２）が、物理的、生化学的または化学的刺激物質である請求項１２−１５のいずれか１項に記載の群（１７）。
前記指標分子（５）の選択および／または識別を可能にする指標分子（５）の特性が化学的、生化学的または物理的特性である請求項１２−１６のいずれか１項に記載の群（１７）。
導入されたＤＮＡ分子（６）が、それぞれ異なる指標分子（５）を符号化する少なくとも２つのＤＮＡ配列（４０）を含む請求項１２−１７のいずれか１項に記載の群（１７）。
前記群（１７）の各々の幹細胞（１）が、指標分子（５）を符号化するＤＮＡ配列（４０）をそれぞれ含む少なくとも２つの導入されたＤＮＡ分子（６）を含み、それによって導入されたＤＮＡ分子（６）のＤＮＡ配列（４０）が異なる指標分子（５）を符号化する請求項１２−１８のいずれか１項に記載の群（１７）。
異なる指標分子（５）が異なる特性を有する請求項１９に記載の群（１７）。
導入されたＤＮＡ分子（６）が、強磁性分子の特性を有する指標分子を符号化する配列を含む請求項１２−２０のいずれか１項に記載の群（１７）。
請求項１−１１のいずれか１項に記載の方法によって取得される群（１７）、または請求項１２−２１のいずれか１項に記載の群（１７）の再生医療目的でインビトロでの使用。
少なくとも２つの幹細胞の異なる特定の表現型に分化することにかかわり、各々の幹細胞が以下を含む、幹細胞を含む不均一な成人幹細胞群：
Ａ）ＤＮＡタンパク質相互作用を可能にする異なる遺伝子及びプロモータを符号化する複数の配列を含む細胞ＤＮＡ（２）と；
Ｂ）幹細胞サンプル（１０）の複数の細胞に人工的に導入される少なくとも２つの異なるＤＮＡ分子（６）であって、それによって、導入されたＤＮＡ分子は、幹細胞に導入されるが、幹細胞の原型の細胞ＤＮＡに導入されるわけではなく、導入されたＤＮＡは、細胞分裂によって複製されるわけではなく、娘細胞のうちの１つだけにおいて現存し、それによって各々の導入されたＤＮＡ分子（６）が：
ａ）タンパク質分子（３）と相互に作用しやすい少なくとも一つの結合部位配列（３０）であって、それによって結合部位配列（３０）は、特定のタンパク質分子（３）だけと相互に作用することが可能である特定の配列であり、所望の幹細胞の表現型に従い選択されてなる結合部位配列（３０）と；
ｂ）前記指標分子（５）の識別を可能にする特性を有する指標分子（５）を符号化する少なくとも一つのＤＮＡ配列（４０）と；
ｃ）前記指標分子（５）の遺伝子発現を可能にする、少なくとも一つの最小プロモータ配列（５０）とを含み、それによって、
ｄ）前記異なる導入されたＤＮＡ分子（６）が、２つの異なる指標分子（５）を符号化する２つの異なるＤＮＡ配列（４０）を含んでなる、
ＤＮＡ分子（６）と；
Ｃ）前記導入されたＤＮＡ分子（６）のＤＮＡ配列（４０）の合成によって生成された前記指標分子（５）の識別を可能にする特性を有する少なくとも一つの指標分子（５）；
とを含み、それによって
Ｄ）同じ特定の幹細胞の表現型に分化するのにかかわる幹細胞が、同じ指標分子（５）を含んでなる成人幹細胞群。
幹細胞の少なくとも２つの異なる特定の表現型へ分化させるのにかかわる、成人幹細胞を含む２つの異なる幹細胞群であって、それによって、各々の幹細胞が：
Ａ）ＤＮＡタンパク質相互作用を可能にする異なる遺伝子及びプロモータを符号化する複数の配列を含む細胞ＤＮＡ（２）と；
Ｂ）幹細胞サンプル（１０）の複数の細胞に、それぞれ人工的に導入される少なくとも一つのＤＮＡ分子（６）であって、それによって、導入されたＤＮＡ分子は、幹細胞に導入されるが、幹細胞の原型の細胞ＤＮＡに導入されるわけではなく、導入されたＤＮＡは、細胞分裂によって複製されるわけではなく、娘細胞のうちの１つだけにおいて現存し、
それによって各々の導入されたＤＮＡ分子（６）が：
ａ）タンパク質分子（３）と相互に作用しやすい少なくとも一つの結合部位配列（３０）であって、それによって結合部位配列（３０）は、特定のタンパク質分子（３）だけと相互に作用することが可能である特定の配列であり、所望の幹細胞の表現型に従い選択されてなる結合部位配列（３０）と；
ｂ）前記指標分子（５）の識別を可能にする特性を有する指標分子（５）を符号化する少なくとも一つのＤＮＡ配列（４０）と；
ｃ）指標分子の遺伝子発現を可能にする、少なくとも一つの最小プロモータ配列（５０）とを含み；それによって、
ｄ）異なる導入されたＤＮＡ分子（６）が、２つの異なる指標分子（５）を符号化する２つの異なるＤＮＡ配列（４０）
を含んでなるＤＮＡ分子（６）と；
Ｃ）導入されたＤＮＡ分子（６）のＤＮＡ配列（４０）の合成によって生成される前記指標分子（５）の識別を可能にする特性を有する少なくとも一つの指標分子（５）と
を含み；それによって
Ｄ）同じ特定の幹細胞の表現型に分化するのにかかわる幹細胞が、同じ指標分子（５）を含んでなる幹細胞群。
前記Ｂ）において、少なくとも一つのＤＮＡ分子（６）がそれぞれ幹細胞サンプル（１０）のすべての幹細胞に人工的に導入される請求項２４に記載の幹細胞（１）の２つの異なる幹細胞群。
異なる指標分子（５）が異なる特性を有する請求項２４に記載の幹細胞群。