CN101426911B

CN101426911B - 具有对底物提高的亲和性的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，和用于测定肌酸酐的试剂组合物

Info

Publication number: CN101426911B
Application number: CN2007800145598A
Authority: CN
Inventors: 永井理惠; 北林雅夫; 西矢芳昭
Original assignee: Toyo Textile Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd; Toyo Textile Co Ltd
Priority date: 2006-04-25
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2027-04-20
Also published as: EP2011868A4; JP4214264B2; US20090170145A1; WO2007125824A1; ATE541035T1; CN101426911A; EP2011868A1; US7816116B2; EP2011868B1; JP2008136477A

Abstract

为了克服已知的肌酸酐酰胺水解酶的缺点，并且提供针对肌酸酐具有提高的亲和性或具有针对肌酸酐的减小的Km值的肌酸酐酰胺水解酶，并且还提供用于测定肌酸酐的试剂组合物，其适用于自动分析装置，并且在准确性、精确性和经济效率上是极好的。本发明公开了与未修饰的肌酸酐酰胺水解酶相比具有针对底物的提高的亲和性的修饰的肌酸酐酰胺水解酶。还公开了肌酸酐测定试剂，其包括所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶和用于检测过氧化氢的试剂。

Description

具有对底物提高的亲和性的修饰的肌酸酐酰胺水解酶,和用于测定肌酸酐的试剂组合物

技术领域

本发明涉及具有对底物提高的亲和性的修饰的肌酸酐酰胺水解酶(还表示为肌酸酐酰胺水解酶(creatinine amidohydrolase))，编码所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶的基因，生产所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶的方法，和所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶在肌酸酐测定试剂中的各种应用。

背景技术

对存在于血液或尿液中的肌酸酐的快速和准确的检测和测定对于诊断疾病如尿毒症、慢性肾炎、急性肾炎、巨人症和紧张性肌肉萎缩症非常重要。

与其它酶诸如肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶和过氧化物酶一起，肌酸酐酰胺水解酶(EC3.5.2.10)已经用作用来测定体液中的肌酸酐的酶，其是肌肉和肾脏疾病的临床诊断的指示剂。肌酸酐酰胺水解酶是作用在肌酸酐上，以在水的存在下催化从肌酸酐形成肌酸的可逆反应的酶。

已知这样的肌酸酐酰胺水解酶由假单胞菌属(Pseudomonas)(非专利文献1)和产碱菌属(Alcaligenes)(非专利文献2)种属的微生物生产。另外，作为肌酸酐酰胺水解酶的其它生产者，仅有黄杆菌属(Flavobacterium)，棒杆菌属(Corynebacterium)，微球菌属(Micrococcus)(专利文献1)，青霉菌属(Penicillium)(专利文献2)等种属的微生物是已知的。其中，已经分离了编码由恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)PS-7生产的肌酸酐酰胺水解酶的基因，并且已经公布了其氨基酸序列(专利文献3)。

非专利文献1：Journal of Biochemistry(生物化学杂志)，第86卷，1109-1117(1979)

非专利文献2：Chemical and Pharmaceutical Bulletin(化学和药物学公告)，第34卷，第1期，269-274(1986)

专利文献1：JP51-115989A

专利文献2：JP47-43281A

专利文献3：日本专利2527035

然而，由各种已知的微生物生产的肌酸酐酰胺水解酶作为用于临床检测的酶针对肌酸酐具有大的Km值，并且因此，应该将更多量的该酶加入到试剂组合物中。例如，报道从粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)TE3581衍生的酶(专利文献4)针对肌酸酐具有约42mM的Km值。从节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)TE1826衍生的另一种酶针对肌酸酐具有约66mM的更大的Km值(专利文献5)。

专利文献4：JP9-154574A

专利文献5：JP10-215874A

为了定量测定肌酸酐，通过用肌酸酐酰胺水解酶、肌酸脒基水解酶、和肌氨酸氧化酶处理样品中的肌酸酐，并且通过测定过氧化氢的方式测定所得到的过氧化氢而定量测定样品中的肌酸酐的方法是已知的。

为了实施这样的方法，通常使用普遍适用的自动分析仪，其中通过将试剂分成两部分或多部分，将所述部分以预先测定的加入顺序逐一加入到反应单元中，以作为整个步骤，使所述部分反应约数分钟-约20分钟，在该期间过程中随时间监测吸光度的增加和减少，并且分析和计算结果，而测定目标物质的浓度。存在许多可以用于这些自动分析仪中的已知的试剂。

非专利文献3：Medical Technology(医学技术)，第10卷，第7期，575-579(1982)

然而，在常规方法中，由于花费更长的时间阶段才能使反应达到终点，所以被分析的样品数目是有限的。另一方面，为了在短时间阶段内完成反应，应该升高加入的酶的量，这引起了经济问题。

附图简述

图1举例说明本发明的试剂和比较例的试剂的反应性评价的结果。

●：本发明的制剂

○：比较例的制剂

图2举例说明本发明的试剂和比较例的试剂的反应性评价的结果。

●：本发明的制剂

○：比较例的制剂

发明内容

本发明待解决的问题

本发明的一个目的是提供一种肌酸酐酰胺水解酶，如上文所提及，其克服已知的肌酸酐酰胺水解酶的缺点并且具有针对肌酸酐的提高的亲和性，即，具有针对肌酸酐的更小的Km值。

此外，考虑到上述情形，本发明的另一个目的是提供用于测定肌酸酐的试剂组合物，其适用于自动分析仪，并且准确性、精确性和经济效率极好。

解决问题的方式

在实现上述目的的集中研究后，本发明人依据蛋白质工程技术通过使用恶臭假单胞菌来源的上述肌酸酐酰胺水解酶的基因，成功制成了具有针对肌酸酐的更小的Km值的修饰的肌酸酐酰胺水解酶。本发明人还发现，在肌酸酐的定量测定中，达到反应终点所需要的时间阶段随着肌酸酐酰胺水解酶的Km值减小而变短。因此，完成了本发明。

即，本发明的构建如下：

[第1项]

一种修饰的肌酸酐酰胺水解酶，其与修饰前的亲和性相比具有提高的针对底物的亲和性，其中在构成具有未修饰的肌酸酐酰胺水解酶活性的蛋白的氨基酸序列中，在从所述底物的结合位点的10埃半径距离(radius)内和从α-螺旋末端的5个残基内的氨基酸通过删除、取代或添加一到几个氨基酸而进行修饰。

[第2项]

按照第1项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，其中在构成具有未修饰的肌酸酐酰胺水解酶活性的蛋白的氨基酸序列中的至少一个氨基酸被除野生型氨基酸的那些之外的氨基酸取代。

[第3项]

按照第1和2项任一项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，其与序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列具有50％或更多的同源性。

[第4项]

按照第1和2项任一项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，其与序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列具有80％或更多的同源性。

[第5项]

按照第1和2项任一项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，其中所述具有未修饰的肌酸酐酰胺水解酶活性的蛋白具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列。

[第6项]

按照第3-5项任一项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，其中在选自由序列表中SEQ ID No.2代表的氨基酸序列中的位置44、122、179、180和181组成的组的位置或与其等价的位置的至少一个氨基酸被其它氨基酸取代。

[第7项]

按照第3-5项任一项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，其中在序列表中SEQ ID No.2氨基酸序列的位置179或与其等价的位置的甘氨酸被丝氨酸取代。

[第8项]

按照第3-5项任一项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，其中在序列表中SEQ ID No.2氨基酸序列的位置179或与其等价的位置的甘氨酸被丙氨酸取代。

[第9项]

按照第3-5项任一项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，其中在序列表中SEQ ID No.2氨基酸序列的位置180或与其等价的位置的甘氨酸被丙氨酸取代。

[第10项]

按照第1-9项任一项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，其中与修饰前的该酶针对肌酸酐的Km值相比，修饰后该酶针对肌酸酐的Km值是修饰前的1/5或更小。

[第11项]

按照第1-9项任一项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，其中与修饰前的针对肌酸酐的Km值相比，修饰后针对肌酸酐的Km值是修饰前的1/2.5或更小。

[第12项]

编码按照第1-9项任一项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶的基因。

[第13项]

包括按照第12项的基因的载体。

[第14项]

用按照第13项的载体转化的转化体。

[第15项]

用于生产修饰的肌酸酐酰胺水解酶的方法，其包括培养按照第14项的转化体，并且从培养物收集肌酸酐酰胺水解酶。

[第16项]

用于测定肌酸酐的试剂，其包括按照第1-11项任一项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶。

[第17项]

用于测定肌酸酐的方法，其包括使用按照第1-11项任一项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶。

发明效果

依据本发明，产生有效用作临床检测试剂的酶并且具有更小的Km值的新型肌酸酐酰胺水解酶，并且在工业上以大量生产所述肌酸酐酰胺水解酶是可能的。

还依据本发明，将用于肌酸酐定量测定的酶的量减少到常规量的1/4，并且如果使用与所述常规量相同的量缩短达到反应终点的期间，因此缩短测定时间并且增加被分析的样品数目是可能的。

实施本发明的最佳方式

以下，将详细描述本发明。

肌酸酐酰胺水解酶是分类为EC3.5.2.10的酶。

与未修饰的肌酸酐酰胺水解酶比较，本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶具有对底物的提高的亲和性。对底物亲和性的提高意味着针对肌酸酐的Km值减小。

本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶优选地是这样的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，即，与修饰前相比，其在修饰后的针对肌酸酐的Km值是在修饰前的Km值的1/2.5或更小。更优选地，其是这样的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，即，与修饰前相比，其在修饰后的针对肌酸酐的Km值是在修饰前的Km值的1/5或更小。

备选地，本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶优选地是这样的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，即，其在修饰后的针对肌酸酐的Km值(通过下文所示的方法测定)是70mM或更小。更优选地，其是这样的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，即，其在修饰后的针对肌酸酐的Km值是55mM或更小。

备选地，本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶与序列表中SEQID No.2的氨基酸序列具有50％或更多(优选地80％或更多)的同源性。

所述Km值通过下述方法中的一种测定。

参考实施例1-3，Km值以下述方式测定：

在下文所述的测定肌酸酰胺水解酶活性的方法中，调节R2，以便底物，肌酸酐的浓度在反应时变成55.6，37.0，22.2，15.9或11.1mM，并且通过使用每种R2测量活性。Km值通过对这样测量的数据进行Lineweaber-Burk绘图而测定。

此外，参考实施例4和5中的Km值，其以下述方式测定：

在下述测量肌酸酰胺水解酶活性的方法中，调节第二试剂，以便底物，肌酸酐的浓度在反应时变成50，30，20，15或10mM(±10％的误差是允许的)，并且通过使用每种R2测量该酶的活性。Km值通过对这样测量的数据进行Lineweaber-Burk绘图而测定。

在本发明中，每个氨基酸用单字母编码或三字母编码表示。氨基酸突变的位置通过下述方式表示：例如，＂G179S＂意指在位置179的G(Gly)被S(Ser)取代。

从其获得本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶的要被修饰的肌酸酐酰胺水解酶的实例，包括来自于棒杆菌属、假单胞菌属、节杆菌属、黄杆菌属、微球菌属等种属的微生物的那些，但是不特别局限于此。

具体的实例包括来自于恶臭假单胞菌(PS-7)菌株的那些，其氨基酸序列由SEQ ID No.2表示，并且编码该氨基酸序列的基因由SEQ ID No.1表示。这些序列的每一个都在日本专利号2527035中得到描述。SEQ ID No.2中的氨基酸通过将甲硫氨酸视为1而编号。

从其获得本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶的要被修饰的肌酸酐酰胺水解酶的实例，不限于野生型的那种，并且还可以使用具有特定修饰的肌酸酐酰胺水解酶，只要其具有肌酸酐酰胺水解酶活性。这样的修饰的实例包括氨基酸的删除、取代或添加，分子间或分子内的交联，用糖链或其它官能团进行化学修饰等，但是没有特别限制。

特别地，可以修饰假单胞菌属或产碱菌属种属来源的酶或商购产品如由Toyobo有限公司(Toyobo Co.，Ltd.)生产的＂CNH-311＂、由Kikkoman公司(Kikkoman Corporate)生产的“肌酸酐酶(C1-E)”等。

与野生型的相比，本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶具有对底物提高的亲和性，其中在构成具有未修饰的肌酸酐酰胺水解酶活性的蛋白的氨基酸序列中，从所述底物的结合位点的10埃半径距离内和从α-螺旋末端的5个残基内的氨基酸通过删除、取代或添加一到几个氨基酸而进行修饰。与该底物的结合位点通过使用Swiss-Pdb Viewer(SPDBV)获得的与肌酸结合的肌酸酐酰胺水解酶的构象数据而确定。从所述底物结合位点的的距离也可以通过使用相同的软件确定。

在恶臭假单胞菌(PS-7)菌株来源的肌酸酐酰胺水解酶的氨基酸序列(SEQ ID No.2)的情形中，这样的修饰位点的具体的实例包括，Cys41，Met42，Asn43，Val44，Asp45，His120，Tyr121，Asn123，Ser124，Asp155，Glu177，His178，Gly179，Gly180，和Val181。

其中，通过用其它氨基酸取代与位置44、122、179、180和181相对应的至少一个氨基酸获得的肌酸酐酰胺水解酶优选地作为本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶。

特别地，SEQ ID No.2位置44的氨基酸优选地用精氨酸、甘氨酸或丝氨酸取代。

SEQ ID No.2位置44的氨基酸优选地用天冬酰胺取代。

SEQ ID No.2位置122的氨基酸优选地用天冬氨酸取代。

SEQ ID No.2位置179的氨基酸优选地用精氨酸或丙氨酸取代。

SEQ ID No.2位置180的氨基酸优选地用精氨酸或丙氨酸取代。

SEQ ID No.2位置181的氨基酸优选地用异亮氨酸取代。

在与位置44、122、179、180和181相对应的位点中，在位置122、179、180和181的氨基酸优选地用其它氨基酸取代。此外，更优选地，在位置179和180的氨基酸用其它氨基酸取代。

修饰位点可以是一个到几个位点。此外，修饰可以是氨基酸删除、取代或添加中的任一种，或者可以是它们的组合。

上述取代位点可以是在除恶臭假单胞菌(PS-7)菌株来源的之外的肌酸酐酰胺水解酶的氨基酸序列中与之等价的位置。是否是与之等价的位置可以基于它的一级和构象结构知识而确定。

尽管说明了恶臭假单胞菌来源的肌酸酐酰胺水解酶的构象结构，但是不存在显示通过蛋白质工程技术(非专利文献4和5)可以减小肌酸酐酰胺水解酶的Km值的描述.

非专利文献4：Journal of Molecular Biology(分子生物学杂志)，第337卷，399-416(2004)

非专利文献5：Journal of Molecular Biology(分子生物学杂志)，第332卷，287-301(2004)

当在本发明人发现的恶臭假单胞菌来源的肌酸酐酰胺水解酶中的位置44、122、179、180和181的突变位点与构象结构进行比较时，发现位置44和122位于从α-螺旋末端的5个残基之内，并且位置179、180和181位于翼区(flap region)内。

非专利文献3描述肌酸酐酰胺水解酶的构象结构由7个α-螺旋结构和4个β结构组成，并且在肌酸酐酰胺水解酶与底物之间的结合引起在翼区内(在α5和α6结构之间)的构型变化。

当这一描述与本发明人特别获得的实验结果结合时，认为在α5和α6结构之间结构变化导致在翼区的构型改变，从而提高对底物的亲和性。

因此，本领域的技术人员可以无需过度的研究而获得具有对底物的亲和性的提高的作用的修饰的酶，其通过修饰不仅在位置44、122、179、180和181还在它们周围区域的氨基酸(特别是从翼区的α5和α6末端的5个残基之内的氨基酸，并且此外，除了翼区之外，邻近与底物的结合位点的氨基酸，特别是在从α螺旋末端的5个残基之内和10埃距离之内的氨基酸)，以在翼区引起构型改变。

还可以基于来自其它来源的肌酸酐酰胺水解酶的一级和构象结构的信息，评估在所述肌酸酐酰胺水解酶中的待修饰的氨基酸位置，以无需额外的研究而获得对底物的亲和性具有提高的作用的修饰的酶。

因此，本发明的技术构思不特别限于上述获得的修饰的肌酸酐酰胺水解酶。

在上文提及的解释中，对底物的结合位点是通过使用Swiss-Pdb Viewer(SPDBV)获得的处于与肌酸的结合状态的肌酸酐酰胺水解酶的构象信息数据而确定的位点。从所述底物的结合位点的距离还可以通过使用相同的软件而确定。

本文所用的α-螺旋是蛋白或多肽的二级结构中的一种，并且是具有5.4埃的螺距的螺旋结构，其通过每3.6个氨基酸残基螺旋式自我旋转的氨基酸链形成。其中的肽键在一个平面上，并且其中的-NH₂-和-CO-都形成氢键。

同源性可以通过使用GENETYX-WIN进行两种序列之间的同源性检索而确定为相同序列率(％)。

在本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶中，还可以在所述序列中进一步删除、取代或插入一部分其它氨基酸残基，或者可以添加或取代其它的氨基酸残基，只要基本上保持对肌酸酐的活性。

此外，只要基本上保持对肌酸酐的活性，本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶可以包括与所述肌酸酐酰胺水解酶连接或插入其中的标记如组氨酸标记的方面，另一种肽或另一种蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白或细胞色素)与所述肌酸酐酰胺水解酶的至少一个末端融合的方面，其中该酶用糖链或另一种化合物修饰的方面，以及其中所述肌酸酐酰胺水解酶通过二硫键或类似的分子内和/或分子间的交联的方面，或其中该酶通过接头肽偶联的方面。此外，本发明的酶还可以包括由一些野生型肌酸酐酰胺水解酶的片段组合组成的那些。

本发明还包括编码所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶的基因。

例如，可以通过修饰包含编码从不同来源(起源)如微生物获得的野生型肌酸酐酰胺水解酶的基因的DNA片段，而获得编码本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶的基因。其具体的实例包括细菌，诸如粪产碱菌、节杆菌属物种、黄杆菌属物种、产尿素棒杆菌(Corynebacterium ureafaciens)、噬肌酸棒杆菌(Corynebacterium creatinovorans)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、和恶臭假单胞菌。

编码本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶的基因优选地是在严格条件下与具有SEQ ID No.1表示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交并且编码具有肌酸酐酰胺水解酶活性的蛋白的DNA。

本发明的基因还可以包括通过进一步修饰在编码通过修饰编码野生型肌酸酐酰胺水解酶的基因而获得的修饰的肌酸酐酰胺水解酶的基因中的密码子应用而获得的基因，以便提高所述肌酸酐酰胺水解酶的表达量。

作为用于修饰编码野生型肌酸酐酰胺水解酶的基因的方法，可以使用修饰遗传信息的常规方法。即，通过修饰具有蛋白的遗传信息的DNA的特别的碱基，或者向所述DNA插入或从所述DNA删除特别的碱基，而制备具有修饰的蛋白的遗传信息的DNA。用于修饰DNA中特别的碱基的方法的具体的实例包括，例如，使用商购试剂盒(例如，由Clonetech生产的转化体定向位点诱变试剂盒(Transformer Site-directed MutagenesisKit)；由Stratagene生产的快速变化定向位点诱变试剂盒(Quick Change SiteDirected Mutagenesis Kit))或使用聚合酶链式反应(PCR)方法。

本发明还包括包含编码所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶的基因的载体，并且此外还包括用所述载体转化的转化体。

将这样构建的具有所述修饰的蛋白的遗传信息的DNA以它与质粒连接的状态结合到宿主微生物中，给出生产所述修饰的蛋白的转化体。例如，当将大肠杆菌(Escherichia coli)用作宿主微生物时，可以将质粒如pBluescript或pUC18用作载体。宿主微生物的实例包括大肠杆菌W3110、大肠杆菌C600、大肠杆菌JM109、大肠杆菌DH5α等。为了将所述重组载体引入到宿主微生物中，例如，在所述宿主微生物是大肠杆菌的情形中，重组DNA可以在钙离子的存在下或者备选地通过电穿孔进行结合。此外，可以使用商购的感受态细胞(例如，高感受态M109；其由Toyobo有限公司(Toyobo Co.，Ltd.)生产)。

这样的基因可以从这些菌株提取或者化学合成。此外，利用PCR方法可以获得包含所述肌酸酐酰胺水解酶基因的DNA片段。

在本发明中，例如，可以通过下列方法获得编码肌酸酐酰胺水解酶的基因。例如，分离、纯化恶臭假单胞菌(PS-7)菌株来源的染色体，并且通过超声、限制酶处理等进行裂解，以获得DNA片段，并且通过用DNA连接酶等处理将所述DNA片段在两种DNA的平端或黏端连接于线性表达载体，然后闭合环以构建重组载体。通过将所述重组载体引入到可复制的宿主微生物中，并且通过使用载体标记的标记和所表达的酶活性作为指示剂进行筛选，而获得包含具有编码所述肌酸酐酰胺水解酶的基因的重组载体的微生物。

然后，培养包含上述提及的重组载体的微生物，并且从所培养的微生物的细胞中分离和纯化所述重组载体，由此从表达载体收集编码所述肌酸酐酰胺水解酶的基因。具体地，例如，恶臭假单胞菌(PS-7)，即基因供体的染色体DNA，可以以下述方式收集。

将基因供体微生物进行振荡培养，例如，培养1-3天，将得到的培养物离心以收集细胞，并且将所述细胞进行裂解，以产生包含肌酸酐酰胺水解酶基因的裂解物。作为一种裂解方法，例如，将细胞用裂解酶诸如溶菌酶处理，并且如果需要，组合使用蛋白酶和其它酶以及表面活性剂诸如十二烷基硫酸钠(SDS)。此外，可以组合使用物理粉碎方法诸如冻融或弗氏压碎处理。

从这样获得的裂解物中分离和纯化DNA可以这样进行，例如，通过按照常规方式，适当地结合蛋白质去除处理诸如酚处理或蛋白酶处理，与核糖核酸酶处理，醇沉淀处理等。

对从微生物分离和纯化的DNA的裂解可以这样进行，例如，通过超声或限制酶处理。优选地，使用对特定核苷酸序列特异性的II型限制酶。

用于克隆的载体优选地是从噬菌体构建的载体或用于基因重组的质粒，其在宿主微生物中自动增殖。例如，当将大肠杆菌用作宿主微生物时，所述噬菌体的实例包括λgt10、λgt11等。当将大肠杆菌用作宿主微生物时，所述质粒的实例包括PBR322、PUC19、pBluescript等。

尽管可以在克隆过程中通过使用用于裂解微生物DNA即上文提及的编码肌酸酐酰胺水解酶的基因的供体的限制酶来裂解这样的载体而获得载体片段，但是限制酶不限于用于裂解所述微生物DNA的相同的酶。微生物DNA片段和载体DNA片段可以通过任何已知的方式利用DNA连接酶彼此连接，并且例如，通过使微生物DNA片段的黏端和载体片段的黏端退火，然后将得到物用适当的DNA连接酶连接，而制备所述微生物DNA片段和载体DNA片段的重组载体。如果需要，在退火后，可以将得到物引入到宿主微生物中，并且通过细胞内DNA连接酶连接，以获得重组载体。

在克隆中所用的宿主微生物没有特别限制，只要其中的重组载体是稳定的，可以自动增殖，并且允许外源基因的基因表达。其具体实例包括大肠杆菌W3110、大肠杆菌C600、大肠杆菌HB101、大肠杆菌JM109、大肠杆菌DH5α等。

作为将重组载体引入到宿主微生物中所用的方法，当宿主微生物是大肠杆菌时，可以提及的是用钙处理的感受态细胞方法、电穿孔方法等。

当在营养培养基中培养时，这样获得的转化体微生物可以稳定地生产大量的肌酸酐酰胺水解酶。对将需要的重组载体引入到宿主微生物中的选择可以通过筛选在包含所述需要的DNA的载体中存在的药物抗性标记的表达而进行。

对通过上文提及的方法获得的肌酸酐酰胺水解酶基因的核苷酸序列通过在Science(科学)，214，1205(1981)中所述的双脱氧方法解译。另外，从这样确定的核苷酸序列推导肌酸酐酰胺水解酶的氨基酸序列。

当如上文提及所选择时，在重组载体中包含的肌酸酐酰胺水解酶基因可以容易地结合到可以在微生物中复制的重组载体中，所述微生物具有生产肌酸酐酰胺水解酶的能力，其通过用限制酶和PCR方法从包含所述肌酸酐酰胺水解酶基因的重组载体回收肌酸酐酰胺水解酶基因的DNA，并且将其与另一种载体片段连接而进行。用所述载体转化具有生产肌酸酐酰胺水解酶能力的微生物可以这样进行，例如，通过用钙处理的感受态细胞方法或电穿孔方法。

本发明还涉及用于生产修饰的肌酸酐酰胺水解酶的方法，其通过培养用包含编码所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶的基因的载体转化的转化体而进行。

另外，本发明的另一方面包括用于生产这样的肌酸酐酰胺水解酶的方法，当与相对应的野生型酶的针对肌酸酐的Km值相比时，所述酶针对肌酸酐的Km值减小，所述方法包括将肌酸酐酰胺水解酶进行权利要求1-9任一项所述的氨基酸诱变。

本发明的肌酸酐酰胺水解酶可以通过培养这样获得的转化体而生产。

例如，当在营养培养基中培养时，这样获得的转化体微生物可以可靠地生产大量的修饰的蛋白质。转化体即宿主微生物的培养条件可以通过考虑所述宿主微生物的物理性质而确定，并且在大多数情形中，培养在液体培养基中进行。在工业生产中伴随搅动或振荡的需氧培养是有利的。

通常用于微生物培养的宽泛种类的营养物用作培养基的营养来源。任何可同化的碳化合物可以用作碳源，并且其实例包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜、丙酮酸等。此外，任何可用的氮化合物可以用作氮源，并且其实例包括蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆渣碱提取物等。另外，如果需要，使用盐，诸如磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、以及镁、钙、钾、铁、锰和锌的盐，特别是氨基酸，特别是维生素等。

培养温度可以在允许微生物生长和所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶的生产的范围内适当地变化。然而，在具有生产肌酸酐酰胺水解酶的能力的微生物的情形中，温度优选地是约20-42℃。培养期间在某种程度上依据条件而变化。然而，培育通过选择所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶达到最大产量的时间而适当地终止。通常，培育进行约6-48小时。培养基的pH可以在允许微生物生长和所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶的生产的范围内适当地变化。然而，优选地，pH是在约6.0-9.0的范围内。

可以收集包含生产所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶的微生物的培养物并这样使用。然而，一般地，当所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶存在于培养物中时，将所述培养物分离成含有所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶的溶液和微生物细胞，例如，通过过滤或离心按照常规方法分离，并且然后使用所述溶液。如果所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶存在于微生物细胞中时，将所述微生物细胞从所得到的培养物中分离，例如，通过过滤或离心的方式，然后破裂，例如，通过机械方法或例如，使用溶菌酶的酶促方法，并且如果需要，向其中加入螯合剂如EDTA和表面活性剂，以溶解所述肌酸酐酰胺水解酶，从而获得作为水溶液的该酶。

例如，这样获得的含有肌酸酐酰胺水解酶的溶液可以在减压、或通过膜过滤、或通过盐析沉淀例如用硫酸铵或硫酸钠、或通过用亲水有机溶剂如甲醇、乙醇或丙酮进行分级沉淀，而进行浓缩。另外，热处理和等电点处理也是有效的纯化方法。然后，通过进行用吸附剂或凝胶过滤剂的凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析和/或亲和层析而获得纯化的肌酸酐酰胺水解酶。

例如，纯化的肌酸酐酰胺水解酶产物可以通过使用交联葡聚糖(Sephadex)凝胶(GE卫生保健生物科学(GE Healthcare Biosciences))的凝胶过滤和/或使用DEAE琼脂糖CL-6B(GE卫生保健生物科学(GEHealthcare Biosciences))、辛基琼脂糖CL-6B(GE卫生保健生物科学(GEHealthcare Biosciences))的柱层析等分离和纯化该酶而获得。优选地，所述纯化的酶产物纯化到这样的程度，以致在电泳(SDS-PAGE)中观察到单一条带。

这样获得的纯化的酶可以转化成粉末，例如，通过冻干，真空干燥、或喷雾干燥转化，并且对其进行销售。同时，所述纯化的酶可以通过将其溶解在磷酸缓冲溶液、Tris盐酸缓冲溶液或GOOD缓冲溶液中而进行使用。优选的是GOOD缓冲溶液，并且特别地，PIPES、MES或MOPS 缓冲溶液是特别优选的。可以进一步通过添加氨基酸诸如谷氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸和其它添加剂如血清白蛋白而稳定肌酸酐酰胺水解酶。

用于生产本发明的修饰的蛋白的方法没有特别限制，但是所述修饰的蛋白可以优选地通过下述方法生产。作为构成蛋白的氨基酸序列的修饰方法，可以使用修饰遗传信息的常规方法。即，通过改变携带所述蛋白的遗传信息的DNA的一个或多个特异碱基，或通过插入或删除它的一个或多个特异碱基而产生包含所述修饰的蛋白的遗传信息的DNA。用于修饰DNA中的碱基的具体方法的实例包括使用商购试剂盒(由Clonetech供应的转化体诱变试剂盒，由Stratagene供应的EXOIII/Mung bean检测试剂盒，由Stratagene供应的快速改变位点定向诱变试剂盒，等)和利用聚合酶链式反应(PCR)方法。

在本发明中，通过针对SEQ ID No.2所示的肌酸酐酰胺水解酶氨基酸序列的位置44、122、179、180和181，通过使用上文提及的诱变试剂盒在这些氨基酸位点引入突变，以制备随机突变体文库，并且通过利用在底物特异性中的改变作为指示剂而筛选所述突变体。结果，可以获得在针对肌酸酐的Km值上具有显著减小的修饰的肌酸酐酰胺水解酶。

本发明的另一个方面是用于测定肌酸酐的试剂，其包括具有55mM或更小的针对肌酸酐的Km值的肌酸酐酰胺水解酶、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、和过氧化氢检测试剂。

过氧化氢检测试剂的实例包括过氧化物酶、4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)、和Trinder试剂。

用于测定肌酸酐的试剂的一方面包括用于测定肌酸酐的组合物，其包括在权利要求1-13任一项中所述的修饰的肌酸酐酰胺水解酶。

用于测定肌酸酐的试剂的一方面包括用于确定肌酸酐的试剂盒，其包括权利要求1-13任一项所述的修饰的肌酸酐酰胺水解酶。

本发明的测定方法使用下述反应。

(a)通过肌酸酐酰胺水解酶从肌酸酐和水形成肌酸的反应

(肌酸酐酰胺水解酶)

肌酸酐+H₂O→肌酸

(b)通过肌酸脒基水解酶从在(a)中获得肌酸和水形成肌氨酸和尿素的反应

(肌酸脒基水解酶)

肌酸+H₂O→肌氨酸+尿素

(c)通过肌氨酸氧化酶从在(b)中获得的肌氨酸、水和氧气形成甘氨酸、甲醛和过氧化氢的反应

(肌氨酸氧化酶)

肌氨酸+H₂O+O₂→甘氨酸+甲醛+过氧化氢

(d)检测在(c)中获得的过氧化氢的反应

例如，通过过氧化物酶从在(c)中获得的过氧化氢、4-氨基安替比林和Trinder试剂形成醌染料和水的反应

(过氧化物酶)

过氧化氢+4-氨基安替比林+Trinder试剂→醌染料+4H₂O

在本发明的测定方法中，使用具有55mM或更小的针对肌酸酐的Km值的肌酸酐酰胺水解酶。

这样的肌酸酐酰胺水解酶的来源的实例包括假单胞菌属、产碱菌属、棒杆菌属、节杆菌属、黄杆菌属、微球菌属等种属的微生物，并且要用的优选的水解酶包括，但不特别限于在[0012]-[0055]段和本文的比较例中所述的那些。

本发明用于肌酸酐测定的样本的实例包括生物样品诸如血液血清、尿和血浆，但不限于此。

在本发明的试剂中，组合物可以是各种形式，诸如液体(水溶液、混悬液等)、粉末、或冻干的粉末。冷冻干燥方法没有特别的限制，并且冷冻干燥可以通过常规方法施行。包含本发明的酶的组合物不限于冷冻干燥的粉末，并且可以用于通过重新溶解所述冷冻干燥的粉末而获得的溶液形式中。

在上文提及的每种形式中，本发明的试剂组合物可以根据其形状和应用处于纯化的状态或混合状态，并且如果需要，可以添加其它不同的添加剂，例如表面活性剂、稳定剂、赋形剂。

将这样的添加剂掺加到本发明的试剂中的方法没有特别限制。其实例包括将稳定剂掺加到含有肌酸酐酰胺水解酶的缓冲液中的方法，将肌酸酐酰胺水解酶掺加到含有稳定剂的缓冲液中的方法，将肌酸酐酰胺水解酶和稳定剂同时掺加到缓冲液中的方法，等。

用于本发明的肌酸脒基水解酶的来源没有特别限制。例如，可以使用节杆菌属或产碱菌属来源的肌酸脒基水解酶。作为商购产品，可以使用由Toyobo有限公司(Toyobo Co.，Ltd.)生产的＂CRH-221＂，由Kikkoman公司(Kikkoman Corporate)生产的“肌酸酐酶(C2-AT)”等。

用于本发明的肌氨酸氧化酶的来源没有特别限制。例如，可以使用棒杆菌属或节杆菌属来源的肌氨酸氧化酶。要用的商购产品包括由Toyobo有限公司生产的＂SAO-341＂、由Kikkoman公司生产的＂肌氨酸氧化酶(SOD-TE)＂等。

要用于本发明的肌酸酐酰胺水解酶的酶浓度没有特别限制，只要它适用于测定，但是优选地在1-1,000U/mL范围内。

肌酸酐脒基水解酶的酶浓度没有特别限制，只要它适用于测定，但是优选地在1-1,000U/mL范围内。

肌氨酸氧化酶的酶浓度没有特别限制，只要它适用于测定，但是优选地在1-1,000U/mL范围内。

用于本发明的过氧化物酶的来源没有特别限制，例如，可以使用辣根来源的过氧化物酶。要用的商购产品包括由Toyobo有限公司生产的＂PEO-301＂等。

除了上述成分之外，本发明用于测定肌酸酐的试剂包含缓冲剂，诸如磷酸盐、GOOD缓冲液或Tris缓冲液。此外，它可以包含用于捕获酶促反应的干扰离子的螯合剂，诸如EDTA或邻联茴香胺，用于去除抗坏血酸的抗坏血酸氧化酶，所述抗坏血酸是定量测定过氧化氢的干扰物质，各种表面活性剂诸如Triton X-100和NP-40，各种抗菌和杀菌物质，诸如链霉素和叠氮化钠等。可以将各种商购试剂用作这些添加剂。

所述试剂可以是单一试剂或两种或多种试剂的组合，但是考虑到本发明的优点更优选单一试剂，其操作更简单和更容易。此外，考虑到本发明的优点更优选液体试剂，其操作更简单和更容易。

所包含的缓冲溶液没有特别限制，但是，优选Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、GOOD缓冲液等。依据具体的应用，将缓冲液的pH调整在约5.0-10.0的范围内。在冷冻干燥产品中的缓冲剂的含量没有特别限制，但是优选地使用在0.1％(重量)或更多的范围内，特别优选0.1-30％(重量)。

另外，可以添加血清白蛋白。当血清白蛋白加入到上文提及的水性组合物中时，含量优选地为0.05-0.5重量％。

要用的白蛋白的实例包括牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等。BSA是特别优选的。白蛋白的含量优选地在1-80％(重量)，更优选地5-70％(重量)范围内。

在另一方面，在上文提及的每个实施方案中，本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶、测定肌酸酐的组合物和测定肌酸酐的试剂盒可以采用这样的组合物，即，其不含有除宿主来源的蛋白成分之外的蛋白。

除宿主来源的蛋白之外的蛋白成分的实例包括生物物质诸如BSA。

通过采用这样的组合物，认为可以减少肌酸酐测定系统中的非特异性反应。

要用的缓冲剂可以是常规缓冲剂，并且通常，优选使用能够将组合物的pH调整到5-10的缓冲剂。更优选地，缓冲剂的实例包括诸如硼酸和乙酸的缓冲剂，和GOOD缓冲剂诸如BES、N-二甘氨酸、Bis-Tris、CHES、EPPS、HEPES、HEPPSO、MES、MOPS、MOPSO、PIPES、POPSO、TAPS、TAPSO、TES、和曲辛(Tricine)。

缓冲剂在粉末组合物中的含量(W/W)优选为1.0％-50％。

另外，可以将氨基酸或有机酸添加到基本上由修饰的肌酸酐酰胺水解酶和缓冲剂组成的组合物中。所述组合物可以是水性组合物或冷冻干燥的产物，只要它含有这些成分。

在6.5-8.5pH范围内具有充分的缓冲能力的任何缓冲剂可以用作要用于本发明的缓冲剂。在上述pH范围内的缓冲剂的实例包括磷酸盐，Tris，二-Tris丙烷，N-tris(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(TES)，和3-(N-tris(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙烷磺酸(TAPSO)。因为它的低价和高稳定性，优选的是磷酸盐缓冲液。优选的浓度范围是20-200mM的磷酸盐，并且优选的pH是7-8。

在本发明中，用于检测来源于肌酸酐的过氧化氢的试剂没有特别限制，只要它是可以检测来源于肌酸酐的过氧化氢的试剂，并且优选地，它是过氧化物酶和过氧化氢-着色剂。过氧化物酶和过氧化氢-着色剂没有特别限制。优选的是在具有低胆红素干扰的溶液中稳定的指示剂。

要用的过氧化氢-着色剂的实例包括下述组合：

(1)4-氨基安替比林或3-甲基-2-苯并噻唑啉腙(MBTH)和

(2)苯酚或其衍生物，或苯胺或其衍生物。

苯酚衍生物的实例包括2-氯苯酚、4-氯苯酚、1，2-二氯苯酚等。

苯胺衍生物的实例包括N，N-二甲基苯胺，N，N-二乙基苯胺，N，N-二乙基-间甲苯胺，N，N-二甲基-间茴香胺，N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N′-乙酰基乙二胺，N-乙基-N-(β-羟基乙基)-间甲苯胺，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-间甲苯胺，N-乙基-N-磺基丙基-间甲苯胺，N-乙基-N-磺基丙基-3，5-二甲氧基苯胺，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，N-乙基-N-磺基丙基-间茴香胺，N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N′-琥珀酰乙二胺，N-乙基-N-(2-羟基-N-磺基丙基)-间茴香胺，等。

另外，可以使用无色染料，诸如10-X-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲基氨基-10H-吩噻嗪，二[8-二(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺或1，4-二(二甲基氨基)丙基联苯基-(2，7-二羟基-4-萘基)甲烷。

对于这一目的，许多商购的试剂是可利用的。

在本发明中优选地用于检测来源于肌酸酐的过氧化氢的指示剂的实例包括联苯胺、无色染料、4-氨基安替比林、苯酚、萘酚和苯胺衍生物。更优选的指示剂是4-氨基安替比林和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-间甲苯胺(TOOS)。对于4-氨基安替比林，优选的浓度范围是0.05-10mM，对于TOOS是0.05-10mM。

在本发明中用于检测来源于肌酸酐的过氧化氢的过氧化物酶优选地是辣根过氧化物酶，因为高纯度和低价的商业产品是可以获得的。酶浓度应该足够高以进行快速和完全的反应，并且因此，优选地在1,000-50,000U/L。

可以将亚铁氰化物添加到所述试剂中，以最小化胆红素的干扰。然而，金属离子诸如亚铁氰化物的存在可以使指示剂和该酶不稳定。本发明的试剂的稳定性足够高，以允许加入亚铁氰化物。亚铁氰化物的优选的浓度范围是1-400μM，并且最大浓度是抑制酶活性的浓度。

可以加入无活性的蛋白，以进一步提高所述试剂的稳定性。无活性的蛋白包括血清白蛋白、球蛋白和纤维蛋白。优选的蛋白是牛血清白蛋白，并且其优选的浓度(重量/体积)是0.05-1％。更低的浓度可以是有用的。优选的无活性的蛋白是不包含引起酶分解的蛋白酶杂质的蛋白。

肌酸酐浓度通过使用给定体积的样品和给定体积的试剂而确定。在混合后尽可能迅速地测量吸光度，以在由肌酸酐代谢引起的吸光度的显著变化之前测定样品空白。第一吸光度测量优选地在混合后0.5-5秒的期间进行。第二吸光度测量在吸光度变得恒定后进行，典型地在当在37℃在5mg/dL的肌酸酐浓度进行反应3-5分钟后进行。典型地，用具有已知肌酸酐浓度的水性的或血液血清溶液稳定所述试剂。

本发明通过使用测定肌酸酐的试剂组合物来测定肌酸酐的方法包括使样品与含有肌酸酐酰胺水解酶、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林和Trinder试剂的试剂进行反应，并且测定得到的醌染料的颜色强度。

在另一个实施方案中，本发明包括通过使用按照权利要求1-13任一项的修饰的肌酸酐酰胺水解酶来测定肌酸酐的方法。

本发明还包括提高肌酸酐测定系统中的测定反应性的方法，其包括在使用肌酸酐酰胺水解酶的肌酸酐测定系统中使用按照权利要求1-13任一项的氨基酸-突变的肌酸酐酰胺水解酶。

本发明还包括生产测定反应性提高的肌酸酐测定组合物的方法，其包括在使用肌酸酐酰胺水解酶的肌酸酐测定系统中使用按照权利要求1-13任一项的氨基酸-突变的肌酸酐酰胺水解酶。

如将在以下实施例中描述的，本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶具有显著低于野生型肌酸酐酰胺水解酶的针对肌酸酐的Km值的针对肌酸酐的Km值。这表明，减少例如用于临床样品的肌酸酐测定中的肌酸酐酰胺水解酶的量，并且因此减少所述测定的成本，是可能的。

实施例

以下，将参考实施例更具体地描述本发明。

实施例1

制备修饰的肌酸酐酰胺水解酶基因

制备恶臭假单胞菌PS-7菌株的染色体DNA，并且然后按照日本专利号2527035和Biosci.Biotech.Biochem.(生物科学生物技术生物化学)，59，7，p.1331-1332(1995)中所述的方法，制备包含来源于所述菌株的肌酸酐酰胺水解酶基因的表达质粒pCNH5-13。

野生型肌酸酐酰胺水解酶的表达质粒pCNH5-13是通过将编码恶臭假单胞菌PS-7菌株来源的肌酸酐酰胺水解酶的结构基因插入到载体pBluescript SK(-)的多克隆位点而获得的质粒。核苷酸序列由序列表中的SEQ ID No.1表示，并且从所述核苷酸序列推导的肌酸酐酰胺水解酶氨基酸序列由序列表中的SEQ ID No.2表示。

然后，通过使用PCNH5-13，在序列表中显示的SEQ ID No.3的合成的寡核苷酸，以及与其互补的合成的寡核苷酸，并且通过使用QuickChange^TM位点定向诱变试剂盒(商标名，由STRATAGENE供应)按照其流程，进行诱变，然后确定所述核苷酸序列，以获得编码突变的肌酸酐酰胺水解酶的重组质粒(pCNHM1)，在所述突变的肌酸酐酰胺水解酶中，SEQ ID No.2的氨基酸序列的第179位甘氨酸被丝氨酸取代。

按照如上文提及的相同的方式，通过使用PCNH5-13，在序列表中所示的SEQ ID No.4的合成的寡核苷酸以及与其互补的合成的寡核苷酸，并且通过使用QuickChange^TM位点定向诱变试剂盒(商标名，由STRATAGENE供应)进行诱变，以获得编码突变的肌酸酐酰胺水解酶的重组质粒(pCNHM2)，在所述突变的肌酸酐酰胺水解酶中，SEQ ID No.2的氨基酸序列的第179位甘氨酸被丙氨酸取代。

按照如上文提及的相同的方式，通过使用PCNH5-13，在序列表中所示的SEQ ID No.5的合成的寡核苷酸以及与其互补的合成的寡核苷酸，并且通过使用QuickChange^TM位点定向诱变试剂盒(商标名，由STRATAGENE供应)进行诱变，以获得编码突变的肌酸酐酰胺水解酶的重组质粒(pCNHM3)，在所述突变的肌酸酐酰胺水解酶中，SEQ ID No.2的氨基酸序列的第180位甘氨酸被丙氨酸取代。

按照如上文提及的相同的方式，通过使用PCNH5-13，在序列表中所示的SEQ ID No.6的合成的寡核苷酸以及与其互补的合成的寡核苷酸，并且通过使用QuickChange^TM位点定向诱变试剂盒(商标名，由STRATAGENE供应)进行诱变，以获得编码突变的肌酸酐酰胺水解酶的重组质粒(pCNHM4)，在所述突变的肌酸酐酰胺水解酶中，SEQ ID No.2的氨基酸序列的第180位甘氨酸被丝氨酸取代。

按照如上文提及的相同的方式，通过使用PCNH5-13，在序列表中所示的SEQ ID No.7的合成的寡核苷酸以及与其互补的合成的寡核苷酸，并且通过使用QuickChange^TM位点定向诱变试剂盒(商标名，由STRATAGENE供应)进行诱变，以获得编码突变的肌酸酐酰胺水解酶的重组质粒(pCNHM5)，在所述突变的肌酸酐酰胺水解酶中，SEQ ID No.2的氨基酸序列的第181位缬氨酸被异亮氨酸取代。

按照如上文提及的相同的方式，通过使用PCNH5-13，在序列表中所示的SEQ ID No.8的合成的寡核苷酸以及与其互补的合成的寡核苷酸，并且通过使用QuickChange^TM位点定向诱变试剂盒(商标名，由STRATAGENE供应)进行诱变，以获得编码突变的肌酸酐酰胺水解酶的重组质粒(pCNHM6)，在所述突变的肌酸酐酰胺水解酶中，SEQ ID No.2的氨基酸序列的第44位天冬氨酸被精氨酸取代。

按照如上文提及的相同的方式，通过使用PCNH5-13，在序列表中所示的SEQ ID No.9的合成的寡核苷酸以及与其互补的合成的寡核苷酸，并且通过使用QuickChange^TM位点定向诱变试剂盒(商标名，由STRATAGENE供应)进行诱变，以获得编码突变的肌酸酐酰胺水解酶的重组质粒(pCNHM7)，在所述突变的肌酸酐酰胺水解酶中，SEQ ID No.2的氨基酸序列中的第44位天冬氨酸被甘氨酸取代。

按照如上文提及的相同的方式，通过使用PCNH5-13，在序列表中所示的SEQ ID No.10的合成的寡核苷酸以及与其互补的合成的寡核苷酸，并且通过使用QuickChange^TM位点定向诱变试剂盒(商标名，由STRATAGENE供应)进行诱变，以获得编码突变的肌酸酐酰胺水解酶的重组质粒(pCNHM8)，在所述突变的肌酸酐酰胺水解酶中，SEQ ID No.2的氨基酸序列的第44位天冬氨酸被丝氨酸取代。

按照如上文提及的相同的方式，通过使用PCNH5-13，在序列表中所示的SEQ ID No.12的合成的寡核苷酸以及与其互补的合成的寡核苷酸，并且通过使用QuickChange^TM位点定向诱变试剂盒(商标名，由STRATAGENE供应)进行诱变，以获得编码突变的肌酸酐酰胺水解酶的重组质粒(pCNHM9)，在所述突变的肌酸酐酰胺水解酶中，SEQ ID No.2的氨基酸序列的第122位谷氨酸被天冬氨酸取代。

实施例2

制备修饰的肌酸酐酰胺水解酶

用每种重组的质粒，pCNHM1，pCNHM2，pCNHM3，pCNHM4，pCNHM5，pCNHM6，pCNHM7，pCNHM8或pCNHM9转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，以获得相对应的转化体。

将5ml生产-CNH的培养基(1％聚胨，2％酵母提取物，1％氯化钠，和5mM氯化锰)置于检测管中，并且在121℃高压灭菌20分钟。在静置冷却后，将通过过滤单独除菌的青霉素加入其中，以致它的浓度为100μl/ml。在其中接种先前在含有100μl/ml青霉素的LB琼脂培养基上在37℃培养16小时的单个大肠杆菌DH5α(pCNHM1)菌落，然后在37℃振荡需氧培养22小时。

通过离心收集微生物细胞，悬浮在50mM磷酸钾缓冲溶液(pH7.5)中，通过超声破裂，并且离心以获得上清作为粗酶溶液。所述突变体命名为CNHM1。

按照与上文提及的相同的方式，制备具有每种重组质粒pCNHM2，pCNHM3，pCNHM4，pCNHM5，pCNHM6，pCNHM7，pCNHM8，pCNHM9或pCNHM10的大肠杆菌DH5α转化体，以获得相对应的纯化的酶产物。所获得的酶产物分别命名为CNHM2，CNHM3，CNHM4，CNHM5，CNHM6，CNHM7，CNHM8，和CNHM9。

比较例1

制备野生型肌酸酐酰胺水解酶

作为比较例，按照上文提及的相同的方式，制备具有PCNH5-13的大肠杆菌DH5α转化体，以在修饰前获得纯化的酶产物。

实施例3

评价修饰的肌酸酐酰胺水解酶1

将在实施例2中获得的包括突变的肌酸酐酰胺水解酶(CNHM1，CNHM2，CNHM3，CNHM4，CNHM5，CNHM6，CNHM7，CNHM8和CNHM9)的各种肌酸酐酰胺水解酶的每一种和在比较例1中获得的肌酸酐酰胺水解酶加入到50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)中，以致浓度变成1.67U/mL，并且通过上文提及的活性测定方法测定所述肌酸酐酰胺水解酶活性。结果总结在表1中。从表1看出，证实与修饰前的该酶的Km值相比，本发明的修饰的肌酸酐酰胺水解酶具有更小的Km值。

在实施例1-3中，肌酸酐酰胺水解酶的活性以下述方式测定。对于本发明中的酶活性，酶的单位(U)定义为在下述条件下每分钟产生1μmole肌酸所需要的酶的量。

反应混合物的组成

R1

0.58M HEPES，pH 8

0.005％4-氨基安替比林

0.015％苯酚

60U/ml肌酸脒基水解酶

12U/ml肌氨酸氧化酶

6U/mL过氧化物酶

R2

0.25M肌酸酐

0.27N HCl

测定通过将200μl的R1，60μl的R2和10μl的酶溶液混合，然后在37℃反应10分钟而进行。然后，通过使用HITACHI7060自动分析仪测量在505nm吸光度的改变。

下表1总结本发明的新型肌酸酐酰胺水解酶和野生型肌酸酐酰胺水解酶针对肌酸酐的Km值。如从表1看出，本发明的新型的肌酸酐酰胺水解酶具有比野生型肌酸酐酰胺水解酶的Km值更低的Km值。

表1

酶	Km(mM)
		野生型	81
CNHM1	16
		CNHM2	28
CNHM3	27
		CNHM4	35
CNHM5	49
		CNHM6	49
CNHM7	53
		CNHM8	50
CNHM9	37

实施例4

评价使用修饰的肌酸酐酰胺水解酶而测定肌酸酐的试剂的反应性

将100μl/mL在实施例2中获得的突变的肌酸酐酰胺水解酶(CNHM1)加入到上文提及的第二试剂中，以制备用于确定肌酸酐的液体试剂(本发明的试剂)。将100U/mL恶臭假单胞菌来源的野生型肌酸酐酰胺水解酶(产品编号：CNH-311，由Toyobo有限公司供应)加入到上述提及的第二试剂中，以获得作为对照的测定肌酸酐的液体试剂(比较例的试剂)。

本发明的试剂和比较例的试剂的反应性通过使用5mg/dL肌酸酐进行的测定而进行比较。如在图1中所示，本发明的试剂具有达到终点所需要的缩短的时间期间。

实施例5

对于与野生型酶的反应性相同的反应性所需要的修饰的肌酸酐酰胺水解酶的量

将100U/mL在实施例2中获得的突变的肌酸酐酰胺水解酶(CNHM1)加入到上文提及的第二试剂中，以制备用于测定肌酸酐的液体试剂(本发明试剂的试剂)。作为对照，将400U/mL恶臭假单胞菌来源的野生型肌酸酐酰胺水解酶(产品编号：CNH-311，由Toyobo有限公司供应)加入到上文提及的第二试剂中，以制备作为对照的用于测定肌酸酐的液体试剂(比较例的试剂)。

本发明的试剂和比较例的试剂的反应性通过使用5mg/dL肌酸酐的测定而进行比较。如在图2中所示，对于获得相同反应性的肌酸酐酰胺水解酶，本发明的试剂的肌酸酐酰胺水解酶的单位是比较例的试剂的肌酸酐酰胺水解酶单位的1/4。

在实施例4和5中，使用具有下述组成的第一和第二试剂通过下述方法测量5mg/dl的肌酸酐。

第一试剂

50mM MOPS缓冲液(pH7.5)

10mM NaCl

0.1％Triton X-100

0.14g/l TOOS

60U/mL肌酸脒基水解酶(CRH-221，由Toyobo有限公司供应)

16U/mL肌氨酸氧化酶(SAO-351，由Toyobo有限公司供应)

第二试剂

50mM MOPS缓冲液(pH7.5)

0.1％Triton X-100

10U/mL过氧化物酶(PEO-301，由Toyobo有限公司供应)

0.6g/l4-氨基安替比林

缩略词如下所述：

TOOS：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺

测定方法

使用日立(Hitachi)7060自动分析仪。将270μL第一试剂加入到6μL样品中，并且将混合物在37℃温育5分钟，以进行第一反应。然后，将90μL第二试剂加入其中，并且将混合物温育5分钟，以进行第二反应。通过二终点方法测定第一和第二反应的546nm处的吸光度，其中做出在液体体积校正后的吸光度之间的差异。从纯水和水性5mg/dL肌酸酐溶液的吸光度计算肌酸酐浓度未知的样品的肌酸酐浓度。

工业适用性

本发明提供对底物具有提高的亲和性的肌酸酐酰胺水解酶。所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶可以用作测定肌酸酐的试剂。另外，按照本发明，将用于定量分析肌酸酐的酶的量减少到常规分析所用的酶量的1/4是可能的。此外，减少测定的时间阶段并且因此增加要分析的样品的数目也是可能的，因为当使用与常规分析中所用的相同量的酶时，达到终点所需要的反应时间被缩短了。

序列表

<110>东洋纺织株式会社

<120>具有对底物提高的亲和性的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，和用于测定肌酸酐的试剂组合物

<130>070002PC1

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1474

<212>DNA

<213>恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)

<400>1

atgagcaaga gtgtttttgt aggtgagctg acctggaagg agtacgaggc gcgtgtcgcg 60

gcaggtgact gcgtgctcat gctgccggtc ggcgccctgg aacagcacgg ccatcacatg 120

tgcatgaacg tcgatgtgct gctgcccacg gcggtgtgca agcgggtcgc cgagcgcatt 180

ggtgcgctgg tcatgccggg gctgcagtac ggctacaagt cccagcagaa gtccggcggc 240

ggcaatcact tccccggcac caccagcctg gatggcgcca ccctgactgg cacggtgcag 300

gacatcatcc gcgagctggc gcgccatggt gcgcgtcgcc tggtactgat gaacggccac 360

tacgaaaatt ccatgttcat cgtcgaaggc atcgacctcg ccctgcgcga gctgcgctat 420

gccggcatcc aggacttcaa agtggtggtg ctctcctact gggacttcgt caaggacccg 480

gctgtgatcc agcagctcta tcccgagggc ttcctcggct gggacatcga gcacggcggc 540

gtcttcgaga cctccctgat gctggctttg tacccggacc tggtggacct ggaccgcgtc 600

gtcgatcacc cacctgcaac cttcccaccc tatgacgtgt ttccggtcga cccggcccgt 660

acgccggcgc cgggcactct gtcgtcggcg aatgagcaag agtgtttttg taggtgagct 720

gacctggaag gagtacgagg cgcgtgtcgc ggcaggtgac tgcgtgctca tgctgccggt 780

cggcgccctg gaacagcacg gccatcacat gtgcatgaac gtcgatgtgc tgctgcccac 840

ggcggtgtgc aagcgggtcg ccgagcgcat tggtgcgctg gtcatgccgg ggctgcagta 900

cggctacaag tcccagcaga agtccggcgg cggcaatcac ttccccggca ccaccagcct 960

ggatggcgcc accctgactg gcacggtgca ggacatcatc cgcgagctgg cgcgccatgg 1020

tgcgcgtcgc ctggtactga tgaacggcca ctacgaaaat tccatgttca tcgtcgaagg 1080

catcgacctc gccctgcgcg agctgcgcta tgccggcatc caggacttca aagtggtggt 1140

gctctcctac tgggacttcg tcaaggaccc ggctgtgatc cagcagctct atcccgaggg 1200

cttcctcggc tgggacatcg agcacggcgg cgtcttcgag acctccctga tgctggcttt 1260

gtacccggac ctggtggacc tggaccgcgt cgtcgatcac ccacctgcaa ccttcccacc 1320

ctatgacgtg tttccggtcg acccggcccg tacgccggcg ccgggcactc tgtcgtcggc 1380

gaagacggcc agccgagaga agggcgagtt gatcctggag gtctgcgtcc agggcattgc 1440

cgacgctatc cgcgaggagt tcccgcccac ctga 1474

<210>2

<211>260

<212>PRT

<213>恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)

<400>2

Met Ser Lys Ser Val Phe Val Gly Glu Leu Thr Trp Lys Glu Tyr Glu

1 5 10 15

Ala Arg Val Ala Ala Gly Asp Cys Val Leu Met Leu Pro Val Gly Ala

20 25 30

Leu Glu Gln His Gly His His Met Cys Met Asn Val Asp Val Leu Leu

35 40 45

Pro Thr Ala Val Cys Lys Arg Val Ala Glu Arg Ile Gly Ala Leu Val

50 55 60

Met Pro Gly Leu Gln Tyr Gly Tyr Lys Ser Gln Gln Lys Ser Gly Gly

65 70 75 80

Gly Asn His Phe Pro Gly Thr Thr Ser Leu Asp Gly Ala Thr Leu Thr

85 90 95

Gly Thr Val Gln Asp Ile Ile Arg Glu Leu Ala Arg His Gly Ala Arg

100 105 110

Arg Leu Val Leu Met Asn Gly His Tyr Glu Asn Ser Met Phe Ile Val

115 120 125

Glu Gly Ile Asp Leu Ala Leu Arg Glu Leu Arg Tyr Ala Gly Ile Gln

130 135 140

Asp Phe Lys Val Val Val Leu Ser Tyr Trp Asp Phe Val Lys Asp Pro

145 150 155 160

Ala Val Ile Gln Gln Leu Tyr Pro Glu Gly Phe Leu Gly Trp Asp Ile

165 170 175

Glu His Gly Gly Val Phe Glu Thr Ser Leu Met Leu Ala Leu Tyr Pro

180 185 190

Asp Leu Val Asp Leu Asp Arg Val Val Asp His Pro Pro Ala Thr Phe

195 200 205

Pro Pro Tyr Asp Val Phe Pro Val Asp Pro Ala Arg Thr Pro Ala Pro

210 215 220

Gly Thr Leu Ser Ser Ala Lys Thr Ala Ser Arg Glu Lys Gly Glu Leu

225 230 235 240

Ile Leu Glu Val Cys Val Gln Gly Ile Ala Asp Ala Ile Arg Glu Glu

245 250 255

Phe Pro Pro Thr

260

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的寡核苷酸序列

<400>3

ggctgggaca tcgagcacag cggcgtcttc gagacctcc 39

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的寡核苷酸序列

<400>4

ggctgggaca tcgagcacgc aggcgtcttc gagacctcc 39

<210>5

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的寡核苷酸序列

<400>5

tgggacatcg agcacggcgc cgtcttcgag acctccctg 39

<210>6

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的寡核苷酸序列

<400>6

tgggacatcg agcacggcag cgtcttcgag acctccctg 39

<210>7

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的寡核苷酸序列

<400>7

gacatcgagc acggcggcat cttcgagacc tccctgatg 39

<210>8

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的寡核苷酸序列

<400>8

catcacatgt gcatgaaccg cgatgtgctg ctgcccacg 39

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的寡核苷酸序列

<400>9

catcacatgt gcatgaacgg cgatgtgctg ctgcccacg 39

<210>10

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的寡核苷酸序列

<400>10

catcacatgt gcatgaacag cgatgtgctg ctgcccacg 39

<210>11

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的寡核苷酸序列

<400>11

catcacatgt gcatgaacaa tattgtgctg ctgcccacg 39

<210>12

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的寡核苷酸序列

<400>12

ctgatgaacg gccactacga caattccatg ttcatcgtc 39

Claims

1.一种由序列表中SEQ ID No.2表示的氨基酸序列组成的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，其中选自由其位置44、122、179、180和181组成的组的位置的一个氨基酸被其它氨基酸置换，其中序列表中SEQ ID No.2表示的氨基酸序列的位置44的天冬氨酸被精氨酸、甘氨酸或丝氨酸置换，序列表中SEQ ID No.2表示的氨基酸序列的位置122的谷氨酸被天冬氨酸置换，序列表中SEQ ID No.2表示的氨基酸序列的位置179的甘氨酸被丝氨酸或丙氨酸置换，序列表中SEQ ID No.2表示的氨基酸序列的位置180的甘氨酸被丙氨酸或丝氨酸置换，或序列表中SEQ ID No.2表示的氨基酸序列的位置181的缬氨酸被异亮氨酸置换。

2.编码按照权利要求1的修饰的肌酸酐酰胺水解酶的基因。

3.包括按照权利要求2的基因的载体。

4.用按照权利要求3的载体转化的转化体。

5.用于生产修饰的肌酸酐酰胺水解酶的方法，其包括培养按照权利要求4的转化体，并且从培养物收集肌酸酐酰胺水解酶。

6.用于测定肌酸酐的试剂，其包括按照权利要求1的修饰的肌酸酐酰胺水解酶。

7.权利要求1的修饰的肌酸酐酰胺水解酶在制备用于测定肌酸酐的试剂中的用途。