CN104133057B - 一种消除临床检验中抗坏血酸干扰的方法、试剂及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种临床检验试剂，在利用化学氧化法检测临床样本过程中消除抗坏血酸干扰，所述试剂含有过氧化物、过硫酸盐、亚硫酸盐、无机离子或具有氧化性的酸根离子。本发明还公开了含有上述试剂的试剂盒、所述试剂的制备方法以及在利用化学氧化法检测临床样本过程中消除抗坏血酸干扰的方法。本发明的试剂能够在临床检测过程中消除抗坏血酸的干扰提高检测结果的准确性。

Description

一种消除临床检验中抗坏血酸干扰的方法、试剂及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种临床检测试剂和方法，特别是涉及一种能消除抗坏血酸干扰的检测试剂，制备方法，试剂盒和在利用化学氧化法对底物进行检测的过程中消除抗坏血酸干扰的方法。

背景技术

抗坏血酸在体内参与多种反应，如参与氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。正常成人体内的抗坏血酸代谢活性池中约有1500mg抗坏血酸，最高储存峰值可达3000mg。

血清胆红素测定是临床医学中的一项重要常规检测项目，是黄疸性疾病诊断与鉴别诊断的重要指标，对了解疾病的发展意义重大。临床检测血清胆红素的常用商品试剂主要采用重氮法及化学氧化法。对于测定胆红素，化学氧化法测定试剂盒占领了很大的市场份额，其中包括了钒酸盐氧化法和亚硝酸盐氧化法。化学氧化法的本质是氧化还原反应，即在酸性条件下(pH2.6-3.4)，钒酸盐将胆红素(底物)特异性地氧化成胆绿素(产物)，测定胆红素氧化前后吸光度的差，可以计算出样本中胆红素的浓度。血清样本中的抗坏血酸是具有氧化还原性的物质，对化学氧化法的测定结果可能带来干扰，导致测定结果异常，影响临床结果的可靠性。

目前，市场上利用化学氧化法对底物进行检测的试剂，如以钒酸盐氧化法测定胆红素的试剂盒，对抗坏血酸的抗干扰能力普遍较差，这也是化学氧化法试剂存在的共同缺陷。然而，到目前为止仍没有相关的文献或专利报道如何解决在化学氧化法测定过程中抗坏血酸干扰的问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够消除抗坏血酸干扰的临床检验试剂。

本发明的另一目的是提供一种能够消除抗坏血酸干扰的临床检测试剂盒。

本发明的又一目的是提供在利用化学氧化法检测临床样本过程中消除抗坏血酸干扰的方法。

本发明的再一目的是提供一种能够消除抗坏血酸干扰的临床检验试剂的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

根据本发明的第一目的，本发明公开了一种临床检验试剂，在利用底物氧化剂氧化底物的临床检测过程中消除抗坏血酸干扰，含有以下五组氧化剂中的至少一组：

1)能在水溶液中产生过氧根离子的过氧化物，

2)能在水溶液中产生过硫酸根的过硫酸盐，

3)能在水溶液中产生亚硫酸根的亚硫酸盐，

4)具有氧化性的能在溶液中稳定存在的无机离子，

5)具有氧化性的酸根离子。

所述氧化剂能氧化临床检验样本中的抗坏血酸，且不影响底物与底物氧化剂的反应。

本发明再提供了所述过氧化物包括过氧化氢、过氧化脲、过氧乙酸、过氧化二叔丁基、过氧化环己酮、过氧化异丙苯、过氧化苯甲酰中的至少一种；所述过硫酸盐包括过硫酸钾，过硫酸钠、过硫酸铵中的至少一种；所述亚硫酸盐包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、亚硫酸氢钾、亚硫酸铵、亚硫酸氢铵中的至少一种；所述无机离子包括Cu²⁺、Mn³⁺、Fe³⁺、Ag⁺中的至少一种；所述具有氧化性的酸根离子包括高锰酸根离子、重铬酸根离子、次氯酸根离子中的至少一种。

本发明还提供了在所述试剂中，所述过氧化物的浓度范围为0.01～2.0g/L，优选为0.05～1.0g/L，最优选为0.1～0.3g/L；所述过硫酸盐浓度范围为0.02～1.5g/L，优选为0.1～0.8g/L，最优选为0.3～0.5g/L；所述亚硫酸盐浓度范围为0.02～2.0g/L，优选为0.1～1.0g/L，最优选为0.4～0.6g/L；所述无机离子浓度范围为5×10^-5～2×10^-3mol/L，优选为1×10^-4～1.0×10^-3mol/L，其中所述Cu²⁺浓度最优选为6×10^-4～9×10^-4mol/L，所述Fe³⁺浓度最优选为1×10^-4～3×10^-4mol/L，所述Mn³⁺浓度最优选为3×10^-4～6×10^-4mol/L；所述具有氧化性的酸根离子浓度范围为6×10^-5～3×10^-3mol/L，优选为1×10^-4～7×10^-4mol/L，其中所述高锰酸根离子浓度最优选为2×10^-4～6×10^-4mol/L，所述重铬酸根离子浓度最优选为4×10^-4～7×10^-4mol/L；组合使用时每类氧化剂浓度范围为其单独使用时的浓度范围。

本发明的优选实施方式还提供了在所述试剂中，所述Cu²⁺来着硫酸铜；所述Fe³⁺来自三氯化铁；所述Mn³⁺来自乙酸锰；所述高锰酸根离子来着高锰酸钾；所述重铬酸根离子来着重铬酸钾。所述硫酸铜浓度为0.02～0.15g/L；所述三氯化铁浓度为0.01～0.10g/L；所述乙酸锰浓度为0.01～0.10g/L；所述高锰酸钾浓度为0.01～0.20g/L；所述重铬酸钾浓度为0.02～0.20g/L。

根据本发明的第二目的，本发明公开了一种临床检验试剂盒，所述试剂盒包括上述的试剂。

在本发明优选的实施方式中，所述底物氧化剂为钒酸盐，所述底物为胆红素。

根据本发明的第三目的，本发明公开了一种在利用化学氧化法检测临床样本过程中消除抗坏血酸干扰的方法，将上述试剂与临床检测样本反应，所述氧化剂将样本中的抗坏血酸氧化，且不与底物反应。

在本发明优选的实施方式中，所述化学氧化法为钒酸盐氧化法，所述底物为胆红素。

根据本发明的第四目的，本发明公开了一种临床检验试剂的制备方法，所述方法包括将所述五组氧化剂中的至少一组溶解于溶剂中，所述溶剂为水。

由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：

试验结果表明，本发明的所述五组氧化剂能氧化抗坏血酸，且不影响底物与底物氧化剂的反应，因此能够在化学氧化法检测底物的过程中用于消除抗坏血酸的干扰，增加检测结果的准确性。

特别地，在利用钒酸盐氧化法检测胆红素的试剂中，使用未添加本发明提供的氧化剂的胆红素检测试剂存在明显的抗坏血酸干扰，而加入本发明提供的氧化剂的配方的胆红素检测试剂对不同浓度的抗坏血酸具有明显的抗干扰的效果，而且在各氧化剂所述浓度范围内对测定结果基本无影响；另外氧化剂的加入对试剂的其他性能无影响，说明该氧化剂浓度不会干扰钒酸盐氧化胆红素的反应。因而采用本发明公开的化合物能增加血清胆红素测定的可靠性。

附图说明

图1.抗坏血酸竞争性抑制胆红素反应示意图

图2.氧化剂与抗坏血酸反应示意图

其中左边的结构式为还原型抗坏血酸，右边的结构式为氧化型抗坏血酸。

具体实施方式

本发明的底物是指，待测定的未知化合物，如胆红素检测中的胆红素。底物氧化剂是指，在化学氧化法中，氧化底物生成产物的氧化剂，如钒酸盐氧化法中的钒酸盐。

为解决化学氧化法检验分析时，样本中抗坏血酸干扰测定结果的问题，我们在检测试剂中加入了以下五组氧化剂中的至少一组，这些氧化剂能氧化抗坏血酸，而不会影响底物与底物氧化剂的正常反应，所加入的氧化剂可以是以下中的至少一组：

1)过氧化物，包括过氧化氢、过氧化脲、过氧乙酸、过氧化二叔丁基、过氧化环己酮、过氧化异丙苯、过氧化苯甲酰等一些能在水溶液中能产生具有氧化性的过氧根离子的物质；

2)过硫酸盐：包括过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵等一些能在水溶液中产生具有氧化性的过硫酸根的物质；

3)亚硫酸盐：包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、亚硫酸氢钾、亚硫酸铵、亚硫酸氢铵等一些能在溶液中产生具有氧化性的亚硫酸根的物质；

4)无机离子：包括Cu²⁺、Mn³⁺、Fe³⁺、Ag⁺及一些具有氧化性的能在溶液中稳定存在的金属离子；

5)其它具有氧化性的酸根离子：包括高锰酸根离子、重铬酸根离子、次氯酸根离子等一些具有一定氧化性的酸根离子。

本发明所述过氧化物类氧化剂的浓度可以为0.01～2.0g/L，优选0.05～1.0g/L，最优选为0.1～0.3g/L。

本发明所述过硫酸盐类氧化剂的浓度可以为0.02～1.5g/L，优选0.1～0.8g/L，最优选为0.3～0.5g/L。

本发明所述亚硫酸盐类氧化剂的浓度可以为0.02～2.0g/L，优选0.1～1.0g/L，最优选为0.4～0.6g/L。

本发明所述无机离子的浓度可以为5×10^-5～2×10^-3mol/L，优选1×10^-4～1×10^{- 3}mol/L，更优选的离子为Cu²⁺、Fe³⁺、Mn³⁺，优选浓度为Cu²⁺是6×10^-4～9×10^-4mol/L，Fe³⁺浓度为1×10^-4～3×10^-4mol/L，Mn³⁺浓度为3×10^-4～6×10^-4mol/L。例如，Cu²⁺可以来自硫酸铜，优选浓度0.02～0.15g/L，Fe³⁺可以来自三氯化铁，优选浓度0.01～0.10g/L，Mn³⁺来自乙酸锰，优选浓度0.01～0.10g/L。

本发明所述其它具有氧化性的酸根离子的浓度可以为6×10^-5～3×10^-3mol/L,优选1×10^-4～7×10^-4mol/L，更优选的酸根离子为高锰酸根离子和重铬酸根离子，高锰酸根离子优选浓度为2×10^-4～6×10^-4mol/L，重铬酸根离子优选浓度为4×10^-4～7×10^-4mol/L。例如，高锰酸根离子可以来自高锰酸钾，优选浓度0.01～0.20g/L，重铬酸根离子可以来自重铬酸钾，优选浓度0.02～0.20g/L。

组合使用时每种氧化剂浓度在本发明所述的各种氧化剂单独使用时的浓度范围内即可。

由于以上五组氧化剂中的至少一组具有氧化抗坏血酸且不影响底物与底物氧化物正常反应的特点，可在化学氧化法检测底物的过程中用于消除抗坏血酸的干扰。因此，将上述试剂与各种常规的、利用化学氧化法对底物进行检测的试剂相结合后，能够得到可消除抗坏血酸的干扰又不影响检测准确性的新的检测试剂盒，其制备方法是将上述氧化剂添加并溶解在原常规试剂中。

在本发明一个优选的实施方式中，所述检测试剂盒为钒酸盐氧化法检测胆红素的试剂盒，用于氧化底物的底物氧化剂为钒酸盐，底物为胆红素。临床检验样本中的抗坏血酸会干扰检测，样本中的抗坏血酸会和胆红素竞争与钒酸盐反应(图1)，形成竞争性抑制效应，导致测定值偏低。虽然提高钒酸盐浓度有可能氧化抗坏血酸，但是增加的钒酸盐浓度会明显降低试剂的其它性能，如大大增加试剂空白吸光度，试剂体系不稳定，测定重复性不好等。因此，增加钒酸盐浓度不能作为消除抗坏血酸干扰的方案。我们将上述特定的五组氧化剂中的至少一组按照上述浓度添加到钒酸盐氧化法测定胆红素试剂盒的试剂1中，加入样本孵育时可以氧化血清样本中的抗坏血酸，使其从还原型抗坏血酸变成氧化型抗坏血酸(图2)，从而达到消除其对胆红素的检测产生干扰的目的。本发明所述的氧化剂的氧化还原性质适中，既不与样本中的胆红素或钒酸盐发生反应，影响反应曲线和测定结果，又能够达到消除抗坏血酸干扰的效果。每一种氧化剂的使用浓度与本身的氧化性强弱密切有关，总体原则是在能氧化样本中的抗坏血酸又不和胆红素发生反应的浓度范围内。

在本发明具体的实施方式中公开了一种包括将所述五组氧化剂中的至少一组溶解于溶剂中的胆红素检测试剂的制备方法，所述溶剂为水。胆红素检测试剂除了上述钒酸盐氧化剂以及上述五组氧化剂中的至少一组外，还包括本领域技术人员熟知的常规检测胆红素的配方成分。在本发明一个具体的实施方式中，上述常规检测胆红素的配方成分包括试剂1和试剂2，试剂1能消除检测中抗坏血酸的干扰，试剂2能将直接胆红素氧化为胆绿素。其中试剂1含有上述五组氧化剂中的至少一组。

所述试剂1中除了上述的氧化剂外还包括柠檬酸，盐酸羟胺，硫脲和表面活性剂，各成分的浓度可以采用本领域技术人员熟知常规使用的浓度。其中柠檬酸提供适当的pH缓冲体系；盐酸羟胺和硫脲作为间接胆红素和钒酸盐氧化的抑制剂，增强反应特异性；表面活性剂促进样本中各物质的溶解，减少样本中难溶物或浊脂等对测定结果的影响。所述试剂2则包括磷酸二氢钠和偏钒酸钠。其中磷酸二氢钠提供中性缓冲体系以稳定钒酸盐，偏钒酸钠作为底物氧化剂氧化样本中的直接胆红素。以上试剂1和试剂2中除本发明特定的氧化剂外，其余成分可以采用本领域技术人员熟知的常规用于钒酸盐氧化法检测胆红素的配方替换。试验结果表明本发明的五组氧化剂中的至少一组加入这些配方后，同样能够消除抗坏血酸的干扰、提高这些配方检测胆红素的准确性。

以下结合实施例对本发明进行进一步说明。

试验结果表明，未添加本发明公开的氧化剂的配方存在明显的抗坏血酸干扰，而加入本发明公开的氧化剂的配方具有明显的消除抗坏血酸干扰的效果(实施例1至实施例5)，而且在各氧化剂所述浓度范围内对测定结果基本无影响。同时，氧化剂对不同浓度的抗坏血酸具有明显的消除干扰效果，而且氧化剂的加入对样本测定结果无影响(实施例6)，说明该氧化剂浓度不会干扰钒酸盐氧化胆红素的反应。

实施例1 过氧化物的消除抗坏血酸干扰试验

配方表

试剂1 (pH3.0)

过氧化脲(或过氧化氢，或过氧乙酸) 具体用量见表1

H₂O 加至 1.0L

试剂2 (pH7.0)

磷酸二氢钠 1.0g

偏钒酸钠 0.5g

H₂O 加至 1.0L

应用本发明实施例测定样本中直接胆红素的方法如下：样本(校准管以校准品作为样本)加试剂1混匀，37℃孵育3～5min后读取吸光度A1；加入试剂2，混匀，37℃反应5min后读取吸光度A2；根据公式：直接胆红素含量＝测定吸光度(A2-A1)×校准液/校准吸光度(A2-A1)得出直接胆红素的含量。其中，测定波长为450nm，样本(校准品)用量7μL，试剂1用量200μL，试剂2用量50μL。

其它实施例的测试方法同上。

称取配方表中的物质，按表1中的量称取其中的过氧化物，以水为溶剂，室温下，搅拌溶解，加氢氧化钠或者盐酸调节pH值，定容，分别配制含不同种类和浓度过氧化物的试剂1，同法配制试剂2，得到配方2-10的试剂盒，配方1是不含过氧化物的试剂盒。取2个直接胆红素浓度水平的血清空白样本，加入抗坏血酸纯品制备所需浓度抗坏血酸样本，用上述的测定方法检测样本中的直接胆红素。结果见表1。结果显示，使用含有所述过氧化物的试剂盒检测抗坏血酸样本时，检测结果与空白样本的干扰偏差，明显小于不含所述过氧化物的试剂盒，消除干扰的效果明显。

表1.过氧化物的消除抗坏血酸试验结果

1，空白样本为新鲜的病人混合血清；2，含50mg/dL抗坏血酸样本为直接在新鲜的病人混合血清中添加抗坏血酸纯品至50mg/dL的浓度，1dL＝100mL；3，测定水平为不同直接胆红素含量水平的血清样本；4，所用的氧化剂如果是固体，直接称取，如果是液体，根据重量换算成体积后量取。以下实施例中与此相同。

实施例2 过硫酸盐的消除抗坏血酸干扰试验

配方表

试剂1 (pH3.0)

过硫酸钾(或过硫酸钠) 具体用量见表2

H₂O 加至 1.0L

试剂2 (pH7.0)

磷酸二氢钠 1.0g

偏钒酸钠 0.5g

H₂O 加至 1.0L

称取配方表中的物质，按表2中的量称取其中的过硫酸盐，按实施例1中的制备方法，分别配制含不同种类和浓度过硫酸盐的试剂盒(配方12-17)，配方11是不含过硫酸盐的试剂盒。检测用样本和检测方法同实施例1。结果见表2。结果显示，使用含有所述过硫酸盐的试剂盒检测抗坏血酸样本时，检测结果与空白样本的干扰偏差，明显小于不含所述过硫酸盐的试剂盒，消除干扰的效果明显。

表2.过硫酸盐的消除抗坏血酸试验结果

实施例3 亚硫酸盐的消除抗坏血酸干扰试验

配方表

试剂1 (pH3.0)

亚硫酸钠(或亚硫酸氢纳) 具体用量见表3

H₂O 加至 1.0L

试剂2 (pH7.0)

磷酸二氢钠 1.0g

偏钒酸钠 0.5g

H₂O 加至 1.0L

称取配方表中的物质，按表3中的量称取其中的亚硫酸盐，按实施例1中的制备方法，分别配制含不同种类和浓度亚硫酸盐的试剂盒(配方19-24)，配方18是不含亚硫酸盐的试剂盒。检测用样本和检测方法同实施例1。结果见表3。结果显示，使用含有所述亚硫酸盐的试剂盒检测抗坏血酸样本时，检测结果与空白样本的干扰偏差，明显小于不含所述亚硫酸盐的试剂盒，消除干扰的效果明显。

表3.亚硫酸盐的消除抗坏血酸试验结果

实施例4 无机离子的消除抗坏血酸干扰试验

配方表

试剂1 (pH3.0)

硫酸铜(或三氯化铁，乙酸锰) 具体用量见表4

H₂O 加至 1.0L

试剂2 (pH7.0)

磷酸二氢钠 1.0g

偏钒酸钠 0.5g

H₂O 加至 1.0L

称取配方表中的物质，按表4中的量称取其中的无机盐，按实施例1中的制备方法，分别配制含不同种类和浓度无机离子的试剂盒(配方26-34)，配方25是不含所述无机离子的试剂盒。检测用样本和检测方法同实施例1。结果见表4。结果显示，使用含有所述无机离子的试剂盒检测抗坏血酸样本时，检测结果与空白样本的干扰偏差，明显小于不含所述无机离子的试剂盒，消除干扰的效果明显。

表4.无机离子的消除抗坏血酸试验结果

实施例5：具有氧化性的酸根离子的消除抗坏血酸干扰试验

配方表

试剂1 (pH3.0)

高锰酸钾(或重铬酸钾) 具体用量见表5

H₂O 加至 1.0L

试剂2 (pH7.0)

磷酸二氢钠 1.0g

偏钒酸钠 0.5g

H₂O 加至 1.0L

称取配方表中的物质，按表5中的量称取含酸根的盐，按实施例1中的制备方法，分别配制含不同种类和浓度酸根离子的试剂盒(配方36-41)，配方35是不含所述酸根离子的试剂盒。检测用样本和检测方法同实施例1。结果见表5。结果显示，使用含有所述酸根离子的试剂盒检测抗坏血酸样本时，检测结果与空白样本的干扰偏差，明显小于不含所述酸根离子的试剂盒，消除干扰的效果明显。

表5.具有氧化性的酸根离子的消除抗坏血酸试验结果

实施例6：消除不同浓度抗坏血酸干扰的试验

取2个直接胆红素浓度水平的血清空白样本，加入不同量的抗坏血酸纯品分别制成所需浓度的抗坏血酸样本，用上述的配方1、3和13的试剂盒和上述的测定方法检测样本中的直接胆红素。结果见表6，显示随着样本中抗坏血酸浓度的增大，无本发明氧化剂的试剂盒(表6中表示为配方1)检测结果的偏差越来越大，在30mg/dl时已超过10％，而含有本发明所述氧化剂的试剂盒(表6中表示为配方3和13)，偏差均小于10％，消除抗坏血酸的作用显著。对比空白样本的检测结果，在两个测定水平上，配方3和13的检测结果与配方1的基本一致，表明本发明所述的氧化剂不会影响正常的底物氧化剂对底物的氧化，不影响正常的底物氧化反应。

表6.氧化剂消除不同浓度抗坏血酸干扰的试验结果

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种利用化学氧化法检验胆红素的临床检验试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含一种临床检验试剂和底物氧化剂，所述临床检验试剂在利用化学氧化法检测胆红素的临床检测过程中消除抗坏血酸干扰，所述临床检验试剂含有能在水溶液中产生过硫酸根的过硫酸盐，所述过硫酸盐包括过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵中的至少一种，所述过硫酸盐浓度范围为0.1～0.8g/L，所述临床检验试剂能氧化临床检验样本中的抗坏血酸，且不影响底物与底物氧化剂的反应，所述底物氧化剂为钒酸盐。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述底物为胆红素。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述过硫酸盐浓度范围为0.3～0.5g/L。

4.一种在利用化学氧化法检测胆红素临床样本过程中消除抗坏血酸干扰的方法，其特征在于：将试剂与临床检测样本反应，所述试剂含有以下氧化剂：

能在水溶液中产生过硫酸根的过硫酸盐，所述过硫酸盐浓度范围是0.3～0.5g/L，

所述氧化剂将样本中的抗坏血酸氧化，且不影响底物与底物氧化剂的反应。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述化学氧化法为钒酸盐氧化法。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述底物为胆红素。