CN110186856B - 一种检测抗坏血酸浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测抗坏血酸浓度的方法。包括：1)标准曲线的绘制：用至少5组不同浓度的抗坏血酸标准溶液分别与五氧化二钒纳米颗粒进行反应，得到不同的混合液，并利用紫外可见光谱分别测其在400nm和700nm处的吸光强度；以所述700nm和400nm处的吸光强度的差值A700‑400为纵坐标，以所述抗坏血酸标准溶液的浓度为横坐标，进行线性拟合，得到标准曲线；2)将所述待测抗坏血酸溶液与所述五氧化二钒进行反应，得到混合液，测定其A700‑400，与步骤1)中标准曲线对比，即得。本发明利用五氧化二钒纳米材料的吸光信号的变化实现对抗坏血酸的快速、灵敏、准确的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种检测抗坏血酸浓度的方法。
背景技术
抗坏血酸是一种人体必需的维生素，对于预防和缓解坏血病、白癜风等疾病具有重要作用。此外，抗坏血酸还是一种高效安全的抗氧化剂，对于人体抗氧化应激损伤具有重要作用。检测血液中抗坏血酸浓度对于评估疾病发展和抗氧化应激水平具有重要作用。传统的抗坏血酸检测手段主要利用TMB比色法等实现。但是，血液中的血红素具有类过氧化氢酶性质，会对TMB显色产生影响。因此，目前常见的检测方法存在诸多缺陷，不能准确有效地进行血液中抗坏血酸浓度的定量检测。
发明内容
为了克服现有技术中的诸多缺陷，本发明提供了一种检测抗坏血酸浓度的方法，本发明利用五氧化二钒纳米颗粒的颜色信号的变化实现对抗坏血酸的快速、灵敏、准确的定量检测。
本发明所提供的检测抗坏血酸浓度的方法，包括如下步骤：
1)标准曲线的绘制：用多组已知的不同浓度的抗坏血酸标准溶液分别与五氧化二钒纳米材料水溶液进行反应，得到不同的混合液，利用紫外可见光谱分别测其在400nm和700nm处的吸光强度；以所述700nm和400nm处的吸光强度的差值(A700-400)为纵坐标，以所述抗坏血酸标准溶液的浓度为横坐标，进行线性拟合，得到标准曲线；
2)待测抗坏血酸溶液中抗坏血酸浓度的测定：将所述待测抗坏血酸溶液与所述五氧化二钒纳米材料水溶液进行反应，得到混合液，利用紫外可见光谱测定其A700-400，与步骤1)中所述标准曲线对比，即得到所述待测溶液中抗坏血酸浓度。
上述方法中，所述五氧化二钒纳米材料通过采用柠檬酸钠刻蚀块体五氧化二钒粉末制备得到；其中，所述可与抗坏血酸反应的柠檬酸钠与块体五氧化二钒粉末的质量比可为0.5～10：1，具体可为2：1；
所述制备五氧化二钒纳米材料的操作为：将块体五氧化二钒研磨成粉末，超声分散在去离子水中，再分别加入柠檬酸钠溶液、聚乙烯吡咯烷酮和过氧化氢溶液，在室温下搅拌后，加入丙酮后超声分散，离心分离，收集固体并用去离子水洗涤，即可。
所述五氧化二钒纳米材料为纳米颗粒，其直径可为3～12nm。
步骤1)中，所述多组可为至少5组；
所述抗坏血酸标准溶液的浓度可为50～500μM，具体可为50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM或500μM；
所述五氧化二钒纳米材料水溶液的摩尔浓度可为0.1mM～10mM，具体可为1mM。
所述五氧化二钒纳米材料水溶液与所述抗坏血酸标准溶液的体积比可为0.5～20：1，具体体积比可为1：1，体积比可为(50～2000)μL：100μL，具体体积比可为100μL：100μL；
步骤2)中，所述待测抗坏血酸溶液与所述五氧化二钒纳米材料水溶液的体积比同步骤1)中抗坏血酸标准溶液与五氧化二钒纳米材料水溶液的体积比；
步骤1)和步骤2)中，所述抗坏血酸标准溶液和所述待测抗坏血酸溶液均为其相应的水溶液形式；
所述反应的反应温度可为10～40℃，反应时间可为0.5～60min，具体可为在25℃反应10min。
采用紫外可见光谱法测定所述混合液的吸光强度；
所述紫外可见光谱法测定采用光的波长可为400～900nm，具体可为400nm和700nm。
所述五氧化二钒纳米材料在抗坏血酸溶液浓度检测中的应用也属于本发明的保护范围。
上述检测抗坏血酸浓度的方法在检测全血中抗坏血酸的浓度中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明运用纳米材料在两个不同波长下的吸光强度差的变化实现对抗坏血酸的灵敏、准确的定量检测。具体通过测得的一系列已知浓度的待测成分的溶液在两个不同波长下的吸光强度差的值与浓度的线性图谱(回归系数R2≥0.99)，得到标准线性图谱；再测未知浓度的待测成分两个不同波长下的吸光强度差，与标准线性图谱对比即可得知。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明的方法能灵敏、准确地对待测液体中的抗坏血酸进行定量分析，提供了一种新的分析测试方法；
2)本发明方法中使用的材料更加简单，所需仪器的价格也更加低廉，能够实现低成本的多模式、阶梯化、灵敏、准确的定量分析；
3)本发明分析检测方法可用于食品、药品和活体样品等样品的检测。
4)可用于测量血液中的抗坏血酸含量，可避免血红素对检测结果的影响。
附图说明
图1为本发明实施例1中五氧化二钒纳米材料的透射电子显微镜照片和明场照片。
图2为本发明实施例1中五氧化二钒纳米材料在加入不同浓度抗坏血酸溶液后的紫外可见光谱。
图3为本发明实施例1中五氧化二钒纳米材料检测抗坏血酸的线性图谱。
图4为本发明实施例1中五氧化二钒纳米材料在加入其它类型还原剂后在700nm和400nm处的吸光强度差。
图5为本发明实施例2中五氧化二钒纳米材料检测血液中抗坏血酸浓度方法与TMB比色法和电化学法的比较。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例1中所用的五氧化二钒纳米材料是按照如下方法制备得到：
首先，将0.2g块体五氧化二钒研磨成粉末，超声分散于15mL去离子水中，然后加入到100mL的烧杯中。再分别加入10mL柠檬酸钠溶液(0.15M)、15mL聚乙烯吡咯烷酮(作用是增加反应溶液黏度，控制纳米材料的尺寸)(Mw＝15000，0.23mM)和150μL过氧化氢溶液(30wt％)(作用是为了保证五氧化二钒纳米颗粒不被柠檬酸钠还原)。在室温下搅拌30min后，向固体中加入适量丙酮后超声分散，离心分离；继续用去离子水洗涤几次后，即可得到五氧化二钒纳米材料，如图1所示。其中，五氧化二钒纳米材料为纳米颗粒，直径为3～12nm，五氧化二钒纳米材料的水溶液(此处浓度为1mg mL-1)为黄色。
实施例1、五氧化二钒纳米材料检测抗坏血酸溶液的浓度：
1)标准曲线的绘制：分别将100μL的50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM、500μM的抗坏血酸溶液与100μL浓度为1mM的五氧化二钒纳米材料水溶液均匀混合，于25℃下静置反应10min后，反应已完全，利用紫外可见光谱测定混合液的吸光光谱，如图2所示。从图2可得知：五氧化二钒纳米材料的水溶液在加入抗坏血酸后在400nm处的吸光度明显减小，在700nm处的吸光度明显增大。
处理数据得到吸光强度差的线性图谱，得到抗坏血酸水溶液的浓度与700nm和400nm处吸光强度差值(A700-400)的标准曲线，如图3所示。从图3可得知：标准图谱在50～500μM浓度范围内线性良好，相关系数R达到0.9998，最低检测限可达到50nM。
2)抗坏血酸水溶液浓度的检测：将100μL的300μM的抗坏血酸水溶液与100μL浓度为1mM的五氧化二钒纳米材料水溶液均匀混合，室温(25℃)静置反应10min后，反应已完全，于25℃下静置反应10min后，反应已完全，利用紫外可见光谱测定混合液的吸光光谱，计算A700-400，代入步骤1)中得到的标准曲线，即得到抗坏血酸水溶液的精确浓度为301.05μM。本发明测定得到的结果为301.05μM，相对误差为0.0035，与其已知浓度300μM相差可以忽略不计，说明本发明测定结果灵敏、准确。
3)五氧化二钒对抗坏血酸水溶液的选择性：分别配置1mM半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽、酪氨酸和多巴胺水溶液，并与100μL浓度为1mM的五氧化二钒纳米材料水溶液均匀混合，室温(25℃)静置反应10min后，反应已完全，于25℃下静置反应10min后，反应已完全，利用紫外可见光谱测定混合液的吸光光谱，计算A700-400，如图4所示。从图4可得知：与低浓度的抗坏血酸水溶液(100μM)相比，高浓度的其他还原剂半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽、酪氨酸和多巴胺水溶液(1mM)不能引起五氧化二钒纳米材料的吸光强度变化。因此，五氧化二钒纳米材料对抗坏血酸水溶液具有良好的选择性。
实施例2、五氧化二钒纳米材料检测全血中抗坏血酸的浓度：
将5mg抗坏血酸溶解于10mL血液中。将100μL的溶解有抗坏血酸的血液与100μL浓度为1mM的五氧化二钒纳米材料水溶液均匀混合，室温(25℃)静置反应10min后，反应已完全，于25℃下静置反应10min后，反应已完全，利用紫外可见光谱测定混合液的吸光光谱，计算A700-400，代入步骤1)中得到的标准曲线，即得到血液中抗坏血酸的精确浓度为302.87μM。本发明测定得到的结果为302.87μM，相对误差为0.0096。
作为对照，TMB比色法也用于全血中抗坏血酸浓度检测，按照如下方法进行操作：Microchimica Acta,2018,185,131。用TMB比色法测得血液中抗坏血酸的精确浓度为317.67μM。本发明测定得到的结果为317.67μM，相对误差为0.0589，远大于本发明的方法。
Claims (6)
1.一种检测抗坏血酸浓度的方法，包括如下步骤：
1）标准曲线的绘制：用多组已知的不同浓度的抗坏血酸标准溶液分别与五氧化二钒纳米材料水溶液进行反应，得到不同的混合液，利用紫外可见光谱分别测其在400 nm和700nm处的吸光强度；以所述700 nm和400 nm处的吸光强度的差值A700-400为纵坐标，以所述抗坏血酸标准溶液的浓度为横坐标，进行线性拟合，得到标准曲线；
所述五氧化二钒纳米材料通过采用柠檬酸钠刻蚀块体五氧化二钒粉末制备得到；
2）待测抗坏血酸溶液中抗坏血酸浓度的测定：将所述待测抗坏血酸溶液与所述五氧化二钒纳米材料水溶液进行反应，得到混合液，利用紫外可见光谱测定其A700-400，与步骤1）中所述标准曲线对比，即得到所述待测溶液中抗坏血酸浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，柠檬酸钠与块体五氧化二钒粉末的质量比为0.5~10：1；
所述五氧化二钒纳米材料为纳米颗粒，其直径为3~12 nm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1）中，所述多组为至少5组；
所述抗坏血酸标准溶液的浓度为50~500 μM；
所述五氧化二钒纳米材料水溶液的摩尔浓度为0.1 mM~10 mM；
所述五氧化二钒纳米材料水溶液与所述抗坏血酸标准溶液的体积比为0.5~20：1。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2）中，所述待测抗坏血酸溶液与所述五氧化二钒纳米材料水溶液的体积比同步骤1）中抗坏血酸标准溶液与五氧化二钒纳米材料水溶液的体积比；
步骤1）和步骤2）中，所述抗坏血酸标准溶液和所述待测抗坏血酸溶液均为其相应的水溶液形式；
所述反应的反应温度为10~40℃，反应时间为0.5~60 min。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中，采用紫外可见光谱法测定所述混合液的吸光强度；
所述紫外可见光谱法测定采用光的波长为400~900 nm。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法在检测全血中抗坏血酸浓度中的应用。
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