CN101419172A

CN101419172A - 一种唾液乙醇含量检测试剂

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Publication number: CN101419172A
Application number: CNA2008100438010A
Authority: CN
Inventors: 胡小龙; 周华山; 刘原; 朱凯
Original assignee: SHANGHAI JINLONG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI JINLONG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2008-09-25
Filing date: 2008-09-25
Publication date: 2009-04-29

Abstract

本发明涉及临床检测技术领域，具体涉及一种唾液乙醇含量检测试剂。本发明公开了一种唾液乙醇含量检测试剂，其特征在于在5.0×5.0mm²固相或半固相载体上负载包含了：乙醇脱氢酶1.25－0.5U；辅酶NAD 0.05－0.2mg；四氮唑盐0.025－0.2mg。本发明唾液乙醇含量检测试剂具有高度的特异性、灵敏度高、反应快速，不含毒性物质，可口含检测，安全可靠；且无需借助复杂的传感器主机出示结果，可直接与比色卡对照读数；同时具有更好的热稳定性，在室温下可以保存2年。本发明试剂测定结果重复性好、便于携带、制备工艺简单，成本低廉，易于产业推广，便于现场检测，可用于酒后驾车的检测和作为法医尸检的简易工具。

Description

一种唾液乙醇含量检测试剂

技术领域

本发明涉及临床检测技术领域，具体涉及一种唾液乙醇含量检测试剂。

背景技术

近年来，酒后引起的刑事案件和酒后驾车引起的交通事故案件不断上升。目前，许多国家都制定了血液中乙醇浓度与交通事故责任认定的关系，建立了多种能够检测血液中乙醇含量的方法。如GM/MS等仪器检测乙醇成分，虽然这些方法可以准确定量，但是存在着购买仪器价格昂贵，检测成本高，需专门培训，无法在案发现场快速检测的缺点。呼气式乙醇测定仪可以在现场使用，但是价格也十分昂贵，而且不卫生，容易发生交叉感染疾病。

大量的研究表明，人体在摄入酒精后唾液和血液中的酒精浓度几乎相等，血液/唾液的比值大约是1.07。在酶学反应的基础上，唾液乙醇检测试剂条可以用来检测唾液中的酒精含量，间接可以反映血液中的酒精的浓度。其方法适合在现场使用。

目前，根据唾液和血液中乙醇含量一致性的实验基础，唾液中乙醇含量检测试剂已经开发成功并投入使用，但是，根据文献查阅的结果和市场调查中发现，大部分唾液中乙醇含量检测试剂都是利用乙醇氧化酶催化酒精释放过氧化氢，再通过辣根过氧化物酶催化底物TMB(N，N，N’，N’-四甲基联苯胺)显色反应。这些技术和制作工艺在很多专利和文献中都有描述，例如：

中国专利申请03128880.4公开了一种应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，其配方为：缓冲系统用量0.5～0.8M，pH值6.5～8.0；表面活性剂是丁二酸二辛酯磺酸钠(AOT)，用量0.1％～0.3％(v/v)；乙醇氧化酶(AOD)活化剂是叠氮化钠(NaN₃)，用量0.05％～0.10％(w/v)；还原剂用量0.01％～0.10％(w/v)；稳定剂是VI型玻化载体，由山梨醇、明胶、右旋糖苷和植物种子粗提液组成，用量5％～15％(w/v)；显色剂用量1.0％～2.5％(w/v)；显色剂溶剂是二甲苯原液；助染剂是褚红染料，用量0.5％～1.5％(w/v)；乙醇氧化酶用量30～45u/ml；过氧化物酶采用辣根过氧化物酶(HRP)，用量450～650u/ml。

中国专利申请200510013235.5公开了一种制备检测唾液酒精含量试纸的方法，选取纯棉浆滤纸，做试纸的底物载体，应用固相或半固相化学技术，将四甲基联苯胺、磷酸盐缓冲液、辣根过氧化物酶及乙醇氧化酶和牛血清白蛋白依次加入各试剂到试纸上，分步真空干燥。

中国专利200520025467.8公开了一种检测唾液酒精含量的试纸，包括具有试剂物的试纸本体和承载该试纸本体的支持体，其中，所述的试纸本体由内之外依次形成如下试纸层：真空干燥固化的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺试纸层、真空干燥固化的磷酸盐缓冲液试纸层、真空干燥固化的辣根过氧化物酶试纸层、真空干燥固化的乙醇氧化酶和牛血清白蛋白试纸层。

中国专利申请200610029610.X公开了一种检测唾液中乙醇含量的试剂条和试剂盒，通过试剂条中乙醇氧化酶、过氧化物酶将N，N，N’，N’-四甲基联苯胺氧化后颜色改变的深浅，半定量地检测唾液中乙醇的含量。该方法简便、易携带，灵敏度高、反应速度快、稳定性高，尤其适合现场检测。

这些专利都是集中在如何用干化学试纸法准确的测定样品中乙醇和含量，以及如何将乙醇氧化酶进行固化，但是却忽视了几个关键的技术问题：1)乙醇氧化酶的专一性较差，对大多数醇类如甲醇、异丙醇等非乙醇物质也具有很强的氧化作用，在检测过程中这些物质具有很大的干扰作用。2)乙醇氧化酶极不稳定，其活性难以长期保持的特点，导致了目前该产品的稳定性差异大，3)反应体系中的过氧化氢和TMB的显色反应，容易受到一些还原性物质如抗坏血酸(维生素C)的干扰，4)目前的乙醇检测试剂条的显色底物是TMB(N，N，N’，N’-四甲基联苯胺)，是辣根过氧化物酶的最常用底物，但是它很难溶于水，在目前制备乙醇检测试剂过程中，底物TMB是用二甲苯来溶解，然后通过挥发作用除去有机溶剂，如果挥发不彻底，无疑是对健康有害的。另外，底物TMB极不稳定，需避光保存，容易被其他氧化剂氧化而变色，导致唾液乙醇检测试剂的长时间保存后出现蓝色本底，对检测结果产生干扰。在制备检测试纸的过程中，先将乙醇氧化酶干燥于试纸上，在加上TMB二甲苯溶液进行二次干燥过程。二次干燥对于温度敏感的乙醇氧化酶的活性影响甚大，同时，有机溶剂二甲苯对于乙醇氧化酶和辣根过氧化物酶的活性也有不同程度的抑制作用，导致产品的活性参差不齐。

发明内容

针对上述现有唾液乙醇含量检测试剂存在的不足，本发明公开了一种唾液乙醇含量检测试剂，其特征在于在5.0 x 5.0mm²固相或半固相载体上负载包含了：

乙醇脱氢酶 1.25—0.5U；

辅酶NAD 0.05—0.2mg；

四氮唑盐 0.025—0.2mg。

本发明原理是利用酶学反应基础之上的显色反应，乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，ADH)是一种含锌酶类。其分子由两个亚基组成，其中一个位于酶的活性中心，另一个起稳定四级结构的作用。在辅酶I存在的条件下，它催化乙醇发生脱氢反应，乙醇脱氢酶将乙醇催化成乙醛同时，NAD在转化NADH，与四氮唑盐发生反应而显色，具体的反应原理如下：

在以上反应中，四氮唑盐的蓝色深浅和显色速度的快慢与样品中乙醇的含量成线形关系，并最终作为一种半定量的检测的指标。

在一些实施方式里，所述四氮唑盐可为氯化-2，3，5-三苯基四氮唑或氯化硝基四氮唑蓝(NBT)。

在一些实施方式里，所述固相或半固相载体为滤纸。

在一些实施方式里，所述5.0 x 5.0mm²固相或半固相载体上还包含抗坏血酸氧化物酶0.05—0.3U。大部分水果类饮料和口香糖中都含有某些还原剂如维生素C对唾液乙醇检测试剂条有很大的影响，主要原因是这些还原剂阻止了显色底物的氧化，给检测带来干扰。

在一些实施方式里，所述固相或半固相载体还包含0.1M磷酸缓冲盐，pH6.0-8.5，其中pH优选7.5。磷酸缓冲盐可使检测反应更为灵敏。

在一些实施方式里，所述5.0 x 5.0mm²固相或半固相载体上还包含稳定剂0.1—0.3mg，所述稳定剂可为明胶、琼脂、硅胶或褐藻胶中之一或它们的任何组合。所述稳定剂可使乙醇脱氢酶在常温下可以长期保持活性。

本发明唾液乙醇含量检测试剂具有高度的特异性、灵敏度高、反应快速，不含毒性物质，可口含检测，安全可靠；且无需借助复杂的传感器主机出示结果，可直接与比色卡对照读数；同时具有更好的热稳定性，在室温下可以保存2年。本发明试剂测定结果重复性好、便于携带、制备工艺简单，成本低廉，易于产业推广，便于现场检测，可用于酒后驾车的检测和作为法医尸检的简易工具。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。实施例中所涉及的酶和试剂均为市售。

实施例1.唾液乙醇含量检测试剂的制备

1)配制乙醇脱氢酶和抗坏血酸氧化物酶溶液

取褐藻胶10mg，明胶200mg，乙醇脱氢酶500单位，辅酶NAD 3.0克，抗坏血酸氧化物酶1000单位，溶于20ml pH 7.5的0.1M磷酸盐。

2)配制四氮唑蓝溶液

2.0克四氮唑盐溶于20ml的双蒸水中。

3)酶和底物的固相化制备反应垫：

将0.5CM宽的3M滤纸浸入以上的酶/四氮唑盐(1:1)混合液中，取出滤纸在50OC热风、避光下干燥10分钟。

4)制备试剂条

把干燥后的反应垫贴在单面含胶的白色聚酯板距前端1.0CM处，再在聚酯板前端粘贴长约2.5CM的吸水纸，用切纸机切成宽0.5cm的长条，即制成检测试剂条。

实施例2.唾液乙醇含量检测试剂的

用正常人的唾液配制乙醇溶液，浓度分别为：0，20，80和300mg/dL，同时配制相同浓度的甲醇和异丙醇溶液。另外，配制含有10mg/ml的维生素C的不同浓度的乙醇溶液。

将实施例1制备的试剂条的吸水端插入样品中10秒中后取出，放置5分钟观察反应垫的颜色变化。

结果：

乙醇(mg/dL)	20	80	300
乙醇(mg/dL)	20	80	300	检测结果	微黄色	淡蓝色	蓝色	深蓝色
甲醇(mg/dL)	20	80	300	检测结果	微黄色	淡蓝色	蓝色	深蓝色
甲醇(mg/dL)	20	80	300	检测结果	微黄色	微黄色	微黄色	微黄色
异丙醇(mg/dL)	20	80	300	检测结果	微黄色	微黄色	微黄色	微黄色
异丙醇(mg/dL)	20	80	300	检测结果	微黄色	微黄色	微黄色	微黄色
乙醇(mg/dL)+维生C(10mg/ml)	20	80	300	检测结果	微黄色	微黄色	微黄色	微黄色
乙醇(mg/dL)+维生C(10mg/ml)	20	80	300	检测结果	微黄色	淡蓝色	蓝色	深蓝色

本发明所述检测试剂条最终是通过四氮唑盐的显色来判断乙醇的含量，此反应体系中底物的颜色变化与乙醇浓度呈比例的梯度变化，反应体系呈蓝色。低浓度则显示为蓝色，而高浓度乙醇显示为深蓝色。本试剂条结果通过肉眼可以明显判别20-300mg/dL不同浓度的乙醇含量，可以进行半定量测试。同时，相同浓度的甲醇、异丙醇均不会产生颜色变化，说明本试剂条对甲醇、异丙醇不发生交叉反应。另外，含有10mg/ml维生素C的乙醇样品测试显示，其颜色的变化与不含维生素C的样品没有明显的区别。说明维生素C对本试剂条的检测结果没有干扰。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims

1.一种唾液乙醇含量检测试剂，其特征在于5.0 x 5.0mm²固相或半固相载体上负载包含了：

乙醇脱氢酶 1.25—0.5U；

辅酶NAD 0.05—0.2mg；

四氮唑盐 0.025—0.2mg。

2.如权利要求1所述的唾液乙醇含量检测试剂，其特征在于所述固相或半固相载体为滤纸。

3.如权利要求1所述的唾液乙醇含量检测试剂，其特征在于所述四氮唑盐可为氯化-2，3，5-三苯基四氮唑或氯化硝基四氮唑蓝。

4.如权利要求1所述的唾液乙醇含量检测试剂，其特征在于所述四氮唑盐为氯化硝基四氮唑蓝。

5.如权利要求1所述的唾液乙醇含量检测试剂，其特征在于所述5.0 x 5.0mm²固相或半固相载体上还包含抗坏血酸氧化物酶0.05—0.3U。

6.如权利要求1所述的唾液乙醇含量检测试剂，其特征在于所述固相或半固相载体还包含0.1M磷酸缓冲盐，pH6.0-8.5。

7.如权利要求6所述的唾液乙醇含量检测试剂，其特征在于所述pH值为7.5。

8.如权利要求1所述的唾液乙醇含量检测试剂，其特征在于所述5.0 x 5.0mm²固相或半固相载体上还包含稳定剂0.1—0.3mg，所述稳定剂可为明胶、琼脂、硅胶或褐藻胶中之一或它们的任何组合。