JPH08256767A - 立体選択性の改変されたリパーゼ及びそれを用いた光学活性体の製造法 - Google Patents

立体選択性の改変されたリパーゼ及びそれを用いた光学活性体の製造法

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JPH08256767A
JPH08256767A JP8028640A JP2864096A JPH08256767A JP H08256767 A JPH08256767 A JP H08256767A JP 8028640 A JP8028640 A JP 8028640A JP 2864096 A JP2864096 A JP 2864096A JP H08256767 A JPH08256767 A JP H08256767A
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JP8028640A
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English (en)
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Yuji Nakanishi
雄二 中西
Kinya Kariya
金弥 苅谷
Yoshihiko Hirose
芳彦 広瀬
Seiji Sasaki
征治 佐々木
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Amano Enzyme Inc
Original Assignee
Amano Pharmaceutical Co Ltd
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract

(57)【要約】 【目的】光学活性な医薬品中間体の製造に用いる酵素の
立体選択性の改変法に関する。 【構成】１つ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換
することによって得ることができる、野生型酵素の立体
選択性が逆転したリパーゼ及びその製造法。詳細には22
1位のアミノ酸がLeuに、266位のアミノ酸をLeuに、287
位のアミノ酸をIleに置換されたシュードモナス属由来
のリパーゼ或いは221位のアミノ酸がLeuに、265位のア
ミノ酸をLeuに、286位のアミノ酸をIleに置換されたシ
ュードモナス属或いはクロモバクテリウム属由来のリパ
ーゼであり、これらを用いた光学活性１，４−ジヒドロ
ピリジン化合物の製造方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、光学活性な医薬品中間
体の製造に用いる酵素の立体選択性の改変法に関する。
より詳細には光学活性な１，４−ジヒドロピリジンモノ
カルボン酸化合物の製造に用いる酵素の立体選択性の改
変法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１，４−ジヒドロピリジンジカルボン酸
エステル体の不斉加水分解反応に酵素を使用する方法
は、既に知られ（特開平6-41075）、この酵素としてシ
ュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）に由
来するリパーゼ、例えばリパーゼＡＨ、リパーゼＰＳが
好ましいことも知られている（特開平5-284986）。
【０００３】但し、これらの酵素を用いた場合において
はその立体選択性が異なっている。即ち、リパーゼＡＨ
を用いた場合にはＳ体を生成するが、リパーゼＰＳを用
いた場合にはＲ体を生成する
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このように使用する酵
素によってその立体選択性が異なることがあるが、使用
する酵素による立体選択性は今まで予測不能であり、目
的の反応に合致する酵素のスクリーニング及び安価な酵
素の製造法の確立が、酵素を利用した光学活性医薬品中
間体の製造上大きな問題点であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】我々は、立体選択性が逆
のリパーゼＡＨ（Pseudomonas cepacia A-0727由来）と
リパーゼＰＳ（Pseudomonas cepacia M-12-33由来）の
一次構造を既に明らかにした（特開平6-153965、特開平
3-87187）。両リパーゼは相同性が95％と非常に高い事
実から、我々はこれらの違いを鋭意検討した結果、僅か
のアミノ酸の置換により立体選択性を逆転することがで
きることを見い出し、本発明を完成した。
【０００６】即ち、本発明は組換えＤＮＡ手法によって
得ることができる、野生型酵素の立体選択性が逆転した
新規リパーゼを提供する。更に本発明は、当該酵素を用
いた光学活性１，４−ジヒドロピリジン化合物の製造方
法をも提供する。
【０００７】リパーゼＡＨ、リパーゼＰＳのアミノ酸配
列を比較すると、何れのリパーゼも320アミノ酸より成
り、95％のアミノ酸残基が一致している。（配列番号：
１及び配列番号：２に示す。）よって、配列番号：１及
び配列番号：２の下線で示した16ヶ所（28位、36位、40
位、154位、187位、218位、221位、240位、243位、249
位、256位、259位、266位、276位、287位、300位）のア
ミノ酸残基の違いの一部或いは全部が立体選択性の違い
の原因と予想された。
【０００８】本発明者等はこれらのアミノ酸をランダム
に変異処理したところ、221位のPheをLeuに、266位のVa
lをLeuに、287位のLeuをIleに置換することによってそ
の立体選択性が逆転することを見い出した。
【０００９】更に、他のリパーゼ［例えば、Pseudomona
s mephitica var. lipolytica由来のリパーゼ（320アミ
ノ酸よりなり配列番号：３に示される）、Pseudomonas
sp.KWI-56由来のリパーゼ（320アミノ酸よりなり配列番
号：４に示される）、Pseudomonas cepacia DSM3959由
来のリパーゼ（320アミノ酸よりなり配列番号：５に示
される）］等も同様にこれらの位置（各配列図に下線で
示す）を置換することによって立体選択性を逆転させる
ことができる。
【００１０】また、Pseudomonas glumae PG1由来のリパ
ーゼ（319アミノ酸よりなり配列番号：６に示される）
及びChromobacterium viscosum由来のリパーゼ（319ア
ミノ酸よりなり配列番号：７に示される）においては、
221位のPheをLeuに、265位のValをLeuに、286位のLeuを
Ileに置換することによってその立体選択性が逆転す
る。
【００１１】このように我々は部位特異的変換の手法を
用いて、立体選択性変換に関与するアミノ酸残基を特定
することに成功した。このことは、先に述べた安価な酵
素の製造法の確立に関しては、一種類の高発現宿主ベク
ター系が確立出来れば、立体選択性等諸性質の異なる酵
素の生産には十分であることを実証した。
【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
用いられるリパーゼとしては、リパーゼＰＳとアミノ酸
配列の相同性が高いものであればその起源は問わない。
【００１３】例えば、Pseudomonas sp.KWI-56〔Agric.
Biol. Chem.,(1991)55,2349〕、Pseudomonas cepacia D
SM3959〔J. Bacteriol.,(1991)173,559〕、Pseudomonas
mephitica var. lipolytica〔特開平3-198778〕、Pseu
domonas glumae PG1〔Appl.Environ. Microbiol.,(199
2)58,3787〕、Chromobacterium viscosum〔特開平2-350
83〕由来のリパーゼ等が使用できる。本発明において
は、リパーゼＰＳを用いた場合について詳述する。これ
以外のリパーゼを用いた場合においても同様にして本発
明を適用することができる。
【００１４】遺伝子組換えによる酵素の大量生産系には
いかなる宿主ベクター系を用いても良い。宿主微生物は
原核生物、例えばグラム陰性菌、例えばEscherichia co
li、Pseudomonas putida、Pseudomonas cepacia等から
選択された菌株でも良く、又Bacillus属、Streptomyces
属細菌のようなグラム陽性菌でも良い。又宿主細胞は、
真核生物、例えばSaccharomyces属などの酵母でも良
く、又はAspergillus属などの糸状菌でも良い。
【００１５】最も好ましい宿主としては、本来のリパー
ゼ遺伝子を欠失させたPseudomonascepacia HW21株が挙
げられる。
【００１６】しかしながら、これらの何れの宿主・ベク
ター系においても、アミノ酸残基を置換したリパーゼ構
造遺伝子と同時に、リパーゼ生産に必須の遺伝子（特開
平3-87187）（activator,modulator,foldase,lipase-ch
aperone等と呼ばれる蛋白質をコードする）を共存させ
なければならない。
【００１７】本明細書において部位特異的変異蛋白質は
以下の如くアミノ酸の位置及び種類を、変異によって影
響を受けた元のアミノ酸残基の名称：突然変異の位置
（アミノ酸番号）：元のアミノ酸残基に置換導入された
アミノ酸残基の名称を示す略式表記によって示す。例え
ば、10位のプロリンがアラニンで置換された突然変異体
はPro10Alaと表記する。
【００１８】一方、本発明のリパーゼを用いた不斉合成
の基質として適する１，４−ジヒドロピリジン化合物と
しては一般式[Ｉ]
【００１９】
【化５】
【００２０】〔式中、Ｘは下記の一般式［II］
【００２１】
【化６】
【００２２】（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一でも異なっ
ていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ニ
トリル基又はトリフロロメチル基を表す。）或いは、ア
ルキル基（例えばメチル基、ベンジル基、シクロヘキシ
ル基等）を示し、Ｒ4はアシルオキシメチル基（例えば
ピバロイルオキシメチル基等）、置換基を有するアシル
オキシメチル基（例えば１−アセトキシエチル基等）、
アルコキシカルボニルオキシメチル基（例えば１−（エ
トキシカルボニルオキシ）エチル基）、（２−オキソ−
１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基、（５−置
換−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メ
チル基（例えば置換基としてはメチル基、エチル基等）
又はアシル基（例えばピバロイル基等）を表し、Ｒ5は
低級アルキル基（例えばメチル基、エチル基等）又は置
換基を持つアルキル基（例えば置換基としては弗素、塩
素、水酸基、低級アルコキシル基等）を表し、Ｒ6は水
素原子、低級アルコキシメチル基（例えばメトキシメチ
ル基、エトキシメチル基等）又は低級アシルオキシメチ
ル基（例えばピバロイルオキシメチル基等）を表す〕で
表されるプロキラルな１，４−ジヒドロピリジン化合物
であり、これを本発明のアミノ酸置換リパーゼを用いた
酵素触媒によって立体選択的に加水分解し、一般式[II
I]
【００２３】
【化７】
【００２４】〔式中、Ｘは下記の一般式［II］
【００２５】
【化８】
【００２６】（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一でも異なっ
ていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ニ
トリル基又はトリフロロメチル基を表す。）或いは、ア
ルキル基（例えばメチル基、ベンジル基、シクロヘキシ
ル基等）を示し、Ｒ4はアシルオキシメチル基（例えば
ピバロイルオキシメチル基等）、置換基を有するアシル
オキシメチル基（例えば１−アセトキシエチル基等）、
アルコキシカルボニルオキシメチル基（例えば１−（エ
トキシカルボニルオキシ）エチル基）、（２−オキソ−
１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基、（５−置
換−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メ
チル基（例えば置換基としてはメチル基、エチル基等）
又はアシル基（例えばピバロイル基等）を表し、Ｒ5は
低級アルキル基（例えばメチル基、エチル基等）又は置
換基を持つアルキル基（例えば置換基としては弗素、塩
素、水酸基、低級アルコキシル基等）を表し、Ｒ6は水
素原子、低級アルコキシメチル基（例えばメトキシメチ
ル基、エトキシメチル基等）又は低級アシルオキシメチ
ル基（例えばピバロイルオキシメチル基等）を表す〕で
表される１，４−ジヒドロピリジン化合物を生成し、そ
の不斉収率、反応収率共に満足する結果を得ることがで
き、変異前のリパーゼＰＳとは逆の立体配座を有する光
学活性体を得ることができる。
【００２７】本発明の反応は通常０から40℃、１から15
0時間で行い、反応系に酵素が分散するように行うのが
好ましい。反応に使用する酵素量は使用する酵素の純度
によって変化するが、基質に対する重量比で５％以上で
あれば良い。又、酵素はそのまま用いても良いが、適当
な担体に固定化して用いても良い。
【００２８】本発明の反応は、通常は水を含む有機溶媒
中で行われる。使用する有機溶媒としては特に制限され
るものではないが、例えば、ジエチルエーテル、イソプ
ロピルエーテル、エタノール、メタノール、アセトン、
ベンゼン、クロロホルム等を挙げることができる。反応
終了後に、酵素は常法に従って、例えば、濾紙を用いた
濾過等で簡単に除くことが出来る。反応生成物は、例え
ば水を多く含む場合はクロロホルム、ベンゼン、ジエチ
ルエーテル等で抽出・分離できる。更に生成物は例え
ば、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等を用いて容
易に精製できる。
【００２９】以下に実施例を用いて本発明を具体的に説
明するが、本願発明はこれらによって何等限定されるも
のではない。
【００３０】
【実施例】
実施例１ (1)リパーゼ遺伝子欠損宿主菌の構築 Pseudomonas cepacia M-12-33（FERM BP-2293）をニト
ロソグアニジン処理してグリシン、セリン要求性変異株
Pseudomonas cepacia HW15を分離した。本株は３−フォ
スフォヒドロキシピルビン酸を添加した合成培地では生
育せず、３−フォスフォセリン添加で生育可能なことか
ら、フォスフォセリントランスアミナーゼ遺伝子（serC
遺伝子）上に変異点があることを明らかにした。
【００３１】Pseudomonas cepacia M-12-33の染色体Ｄ
ＮＡ（調製法は特開平3-87187に従った）5.0μgをと
り、制限酵素EcoRIを添加し37℃で15分間部分分解し
た。
【００３２】ベクターpFL210（特開平6-153965に記載）
2.5μgに制限酵素EcoRIを加え、37℃、２時間反応させ
完全に分解した後、アルカリ性フォスファターゼにより
脱リン酸化した。
【００３３】両ＤＮＡを混合し、ＤＮＡリガーゼを加
え、16℃で一夜反応させた。連結したＤＮＡをエレクト
ロポレーション法でPseudomonas cepacia HW15に導入
し、グルコース 0.2％、KH2PO4 0.3％、Na2HPO4 0.6
％、NH4Cl 0.1％、NaCl 0.05％、MgSO4・7H2O 0.025％、
CaCl2・2H2O 0.015％、寒天 1.5％、カナマイシン 500μ
g／mlを含む寒天培地上で生育するコロニーを選択し
た。選択した形質転換体は何れも、serC遺伝子を含む1.
8Kb EcoRI断片を含んでいた。この断片の制限酵素切断
地図を図２に示す。
【００３４】Pseudomonas cepacia M-12-33の染色体よ
り分離したリパーゼ構造遺伝子（lipA）、リパーゼ発現
に必須な遺伝子（lip X）を含む6.1Kb EcoRV断片を大腸
菌用ベクターpBR322のPvuII切断部位に導入した。
【００３５】得られたプラスミドをXhoI、PvuIIで完全
分解し、Klenow断片で平滑末端化した。上記記載のserC
遺伝子を含む1.8Kb EcoRI断片を同様に平滑末端化し、
両ＤＮＡを連結して、大腸菌Escherichia coil C600に
導入し、lip A、lip X 両遺伝子の替わりにserC遺伝子
の挿入されたプラスミドを構築した。このプラスミドを
エレクトロポレーション法でPseudomonas cepacia HW15
に導入し、カナマイシン 500μg／mlを除いた上記合成
培地に生育し、更に0.1％乳化トリオレインを含むLB培
地（トリプトン 0.1％、イーストイクストラクト 0.5
％、NaCl 1.0％、寒天 1.5％）上でハローを形成しない
菌株を分離し、Pseudomonas cepacia HW21と命名した。
【００３６】Pseudomonas cepacia HW21の染色体ＤＮＡ
上にlip A、lip X遺伝子は存在せず、serC遺伝子が２個
（一方はＭ-12-33株由来、他方はHW15株由来）存在する
ことをサザンハイブリダイゼーション法で確認した。
【００３７】(2)アミノ酸置換発現用ベクターpLiP23の
構築 リパーゼＰＳ構造遺伝子のＣ末端部分に部位特異的変異
法〔Kunkel,J.A. et al.(1987)「Method Enzymol.」15
4,367〕を用いて新たにHindIII切断部位を創製した。
【００３８】
【００３９】このHindIII切断部位を含む3Kb ClaI-SmaI
断片をベクターpFL210に導入し、発現ベクターpLiP23を
構築した。（図３）
【００４０】(3)アミノ酸置換リパーゼの生産 MluI-HindIII断片を使用して部位特異的変異法により変
異を導入した。この断片をpLiP23中に連結し、Pseudomo
nas cepacia HW21を形質転換した。形質転換体を大豆油
2.0％、ペプトン 0.5％、肉エキス 0.3％、KH2PO4 0.1
％、MgSO4・7H2O0.02％、FeSO4・7H2O 0.001％、アデカノ
ール 0.005％より成る液体培地を含む坂口フラスコに接
種し、30℃、３日間振盪培養した。遠心分離により得た
上澄液を凍結乾燥し、アミノ酸置換リパーゼ約500mgを
得た。
【００４１】実施例２ 水を飽和したイソプロピルエーテル１mlにビス（プロピ
オニルオキシメチル）１，４−ジヒドロ−２，６−ジメ
チル−４−（ｍ−ニトロフェニル）−３，５−ピリジン
ジカルボキシレート25mgを溶解し、リパーゼＰＳ 25mg
を加え、20℃で攪拌しながら反応を行った。不溶物を濾
過し、ジクロロメタンで洗浄後、濾液を減圧濃縮し結晶
を得た。
【００４２】生成物の絶体配置は旋光度測定により決定
した。生成物をジアゾメタンのジエチルエーテル溶液で
処理し、キラルセル（Chiralcel）ADを付した高速液体
クロマトグラフィー（エタノール／ヘキサン＝１／19）
にかけて光学純度を測定した。
【００４３】実施例３ 実施例１に従って作製・調製した各種アミノ酸置換体を
用いて、実施例２の方法で立体選択性を測定した。その
結果を表１に示した。但し、表１において、％ｅｅ欄に
＊印がある場合は基質としてビス（ピバロイルオキシメ
チル）１，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−４−（ｍ
−ニトロフェニル）−３，５−ピリジンジカルボキシレ
ートを使用した結果を示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】221番目のPheをLeuに、266番目のValをLeu
に、更に287番目のLeuをIleに変換することにより立体
選択性の変換に成功した。
【００４６】
【発明の効果】本発明は、Pseudomonas cepacia M-12-3
3由来のリパーゼＰＳの３つのアミノ酸置換体を作成す
ることにより、その立体選択性を変換することに初めて
成功した。本発明により酵素触媒を用いた不斉合成反応
に用いる酵素の特異性の変換においても蛋白工学的手法
が有効なことが示された。
【００４７】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：３２０ 配列の型：アミノ酸 配列 Ala Asp Asn Tyr Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His 15 Gly Leu Thr Gly Thr Asp Lys Tyr Ala Gly Val Leu Asp Tyr Trp 30 Tyr Gly Ile Gln Glu Asn Leu Gln Gln His Gly Ala Thr Val Tyr 45 Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly 60 Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Tyr Val Lys Thr Val Leu Ala Ala 75 Thr Gly Ala Thr Lys Val Asn Leu Val Gly His Ser Gln Gly Gly 90 Leu Thr Ser Arg Tyr Val Ala Ala Val Ala Pro Asp Leu Val Ala 105 Ser Val Thr Thr Ile Gly Thr Pro His Arg Gly Ser Glu Phe Ala 120 Asp Phe Val Gln Gly Val Leu Ala Tyr Asp Pro Thr Gly Leu Ser 135 Ser Thr Val Ile Ala Ala Phe Val Asn Val Phe Gly Ile Leu Thr 150 Ser Ser Ser His Asn Thr Asn Gln Asp Ala Leu Ala Ala Leu Lys 165 Thr Leu Thr Thr Ala Gln Ala Ala Thr Tyr Asn Gln Asn Tyr Pro 180 Ser Ala Gly Leu Gly Ala Ser Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Pro 195 Thr Glu Thr Val Gly Gly Asn Thr His Leu Leu Tyr Ser Trp Ala 210 Gly Thr Ala Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Leu Gly Val Thr Gly 225 Ala Thr Asp Thr Ser Thr Ile Pro Leu Val Asp Pro Ala Asn Val 240 Leu Asp Leu Ser Thr Leu Ala Leu Leu Gly Thr Gly Thr Val Met 255Ile Asn Arg Ala Ser Gly Gln Asn Asp Gly Leu Val Ser Lys Cys 270 Ser Ala Leu Tyr Gly Lys Val Leu Ser Thr Ser Tyr Lys Trp Asn 285 His Ile Asp Glu Ile Asn Gln Leu Leu Gly Val Arg Gly Ala Tyr 300 Ala Glu Asp Pro Val Ala Val Ile Arg Thr His Ala Asn Arg Leu 315 Lys Leu Ala Gly Val 320
【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：３２０ 配列の型：アミノ酸 配列 Ala Asp Asn Tyr Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His 15 Gly Leu Thr Gly Thr Asp Lys Tyr Ala Gly Val Leu Glu Tyr Trp 30 Tyr Gly Ile Gln Glu Asp Leu Gln Gln Arg Gly Ala Thr Val Tyr 45 Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly 60 Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Tyr Val Lys Thr Val Leu Ala Ala 75 Thr Gly Ala Thr Lys Val Asn Leu Val Gly His Ser Gln Gly Gly 90 Leu Thr Ser Arg Tyr Val Ala Ala Val Ala Pro Asp Leu Val Ala 105 Ser Val Thr Thr Ile Gly Thr Pro His Arg Gly Ser Glu Phe Ala 120 Asp Phe Val Gln Gly Val Leu Ala Tyr Asp Pro Thr Gly Leu Ser 135 Ser Thr Val Ile Ala Ala Phe Val Asn Val Phe Gly Ile Leu Thr 150 Ser Ser Ser Asn Asn Thr Asn Gln Asp Ala Leu Ala Ala Leu Lys 165 Thr Leu Thr Thr Ala Gln Ala Ala Thr Tyr Asn Gln Asn Tyr Pro 180 Ser Ala Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Pro 195 Thr Glu Thr Val Gly Gly Asn Thr His Leu Leu Tyr Ser Trp Ala 210 Gly Thr Ala Ile Gln Pro Thr Ile Ser Val Phe Gly Val Thr Gly 225 Ala Thr Asp Thr Ser Thr Ile Pro Leu Val Asp Pro Ala Asn Ala 240 Leu Asp Pro Ser Thr Leu Ala Leu Phe Gly Thr Gly Thr Val Met 255Val Asn Arg Gly Ser Gly Gln Asn Asp Gly Val Val Ser Lys Cys 270 Ser Ala Leu Tyr Gly Gln Val Leu Ser Thr Ser Tyr Lys Trp Asn 285 His Leu Asp Glu Ile Asn Gln Leu Leu Gly Val Arg Gly Ala Asn 300 Ala Glu Asp Pro Val Ala Val Ile Arg Thr His Ala Asn Arg Leu 315 Lys Leu Ala Gly Val 320
【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：３２０ 配列の型：アミノ酸 配列 Ala Asp Asp Tyr Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His 15 Gly Leu Thr Gly Thr Asp Lys Tyr Ala Gly Val Leu Glu Tyr Trp 30 Tyr Gly Ile Gln Glu Asp Leu Gln Gln His Gly Ala Thr Val Tyr 45 Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly 60 Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Tyr Val Lys Thr Val Leu Ala Ala 75 Thr Gly Ala Thr Lys Val Asn Leu Val Gly His Ser Gln Gly Gly 90 Leu Thr Ser Arg Tyr Val Ala Ala Val Ala Pro Asp Leu Val Ala 105 Ser Val Thr Thr Ile Gly Thr Pro His Arg Gly Ser Glu Phe Ala 120 Asp Phe Val Gln Gly Val Leu Ala Tyr Asp Pro Thr Gly Leu Ser 135 Ser Ser Val Ile Ala Ala Phe Val Asn Val Phe Gly Ile Leu Thr 150 Ser Ser Ser His Asn Thr Asn Gln Asp Ala Leu Ala Ser Leu Lys 165 Thr Leu Thr Thr Ala Gln Ala Ala Ala Tyr Asn Gln Asn Tyr Pro 180 Ser Ala Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Pro 195 Thr Glu Thr Val Gly Gly Asn Thr His Leu Leu Tyr Ser Trp Ala 210 Gly Thr Ala Ile Gln Pro Thr Leu Ser Val Phe Gly Val Thr Gly 225 Ala Thr Asp Thr Ser Thr Ile Pro Leu Val Asp Pro Ala Asn Ala 240 Leu Asp Pro Ser Thr Leu Ala Leu Phe Gly Thr Gly Thr Val Met 255 Ile Asn Arg Gly Ser Gly Pro Asn Asp Gly Leu Val Ser Lys Cys 270 Ser Ala Leu Tyr Gly Gln Val Leu Ser Thr Ser Tyr Lys Trp Asn 285 His Ile Asp Glu Ile Asn Gln Leu Leu Gly Val Arg Gly Ala Asn 300 Ala Glu Asp Pro Val Ala Val Ile Arg Thr His Ala Asn Arg Leu 315 Lys Leu Ala Gly Val 320
【００５０】配列番号：４ 配列の長さ：３２０ 配列の型：アミノ酸 配列 Ala Asp Gly Tyr Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His 15 Gly Leu Ser Gly Thr Asp Lys Tyr Ala Gly Val Val Glu Tyr Trp 30 Tyr Gly Ile Gln Glu Asp Leu Gln Gln Asn Gly Ala Thr Val Tyr 45 Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe Gln Ser Asp Asp Gly Ala Asn Gly 60 Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Tyr Val Lys Thr Val Leu Ala Ala 75 Thr Gly Ala Thr Lys Val Asn Leu Val Gly His Ser Gln Gly Gly 90 Leu Thr Ser Arg Tyr Val Ala Ala Val Ala Pro Asp Leu Val Ala 105 Ser Val Thr Thr Ile Gly Thr Pro His Arg Gly Ser Glu Phe Ala 120 Asp Phe Val Gln Asn Val Leu Ala Tyr Asp Pro Thr Gly Leu Ser 135 Ser Ser Val Ile Ala Ala Phe Val Asn Val Phe Gly Ile Leu Thr 150 Ser Ser Ser His Asn Thr Asn Gln Asp Ala Leu Ala Ala Leu Gln 165 Thr Leu Thr Thr Ala Arg Ala Ala Thr Tyr Asn Gln Asn Tyr Pro 180 Ser Ala Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Pro 195 Thr Glu Thr Val Gly Gly Asn Thr His Leu Leu Tyr Ser Trp Ala 210 Gly Thr Ala Ile Gln Pro Thr Leu Ser Val Phe Gly Ile Thr Gly 225 Ala Thr Asp Thr Ser Thr Val Pro Leu Val Asp Leu Ala Asn Val 240 Leu Asp Pro Ser Thr Leu Ala Leu Phe Gly Thr Gly Thr Val Met 255 Ile Asn Arg Gly Ser Gly Gln Asn Asp Gly Leu Val Ser Lys Cys 270 Ser Ala Leu Tyr Gly Lys Val Leu Ser Thr Ser Tyr Lys Trp Asn 285 His Leu Asp Glu Ile Asn Gln Leu Leu Gly Val Arg Gly Ala Tyr 300 Ala Glu Asp Pro Val Ala Val Ile Arg Thr His Ala Asn Arg Leu 315 Lys Leu Ala Gly Val 320
【００５１】配列番号：５ 配列の長さ：３２０ 配列の型：アミノ酸 配列 Ala Ala Gly Tyr Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His 15 Gly Leu Ser Gly Thr Asp Lys Tyr Ala Gly Val Leu Glu Tyr Trp 30 Tyr Gly Ile Gln Glu Asp Leu Gln Gln Asn Gly Ala Thr Val Tyr 45 Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly 60 Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Tyr Val Lys Thr Val Leu Ala Ala 75 Thr Gly Ala Thr Lys Val Asn Leu Val Gly His Ser Gln Gly Gly 90 Leu Ser Ser Arg Tyr Val Ala Ala Val Ala Pro Asp Leu Val Ala 105 Ser Val Thr Thr Ile Gly Pro Ala Asp Arg Gly Ser Glu Phe Ala 120 Asp Phe Val Gln Asp Val Leu Ala Tyr Asp Pro Thr Gly Leu Ser 135 Ser Ser Val Ile Ala Ala Phe Val Asn Val Phe Gly Ile Leu Thr 150 Ser Ser Ser His Asn Thr Asn Gln Asp Ala Leu Ala Ala Leu Gln 165 Thr Leu Thr Thr Ala Arg Ala Ala Thr Tyr Asn Gln Asn Tyr Pro 180 Ser Ala Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Pro 195 Thr Glu Thr Val Gly Gly Asn Thr His Leu Leu Tyr Ser Trp Ala 210 Gly Thr Ala Ile Gln Pro Thr Leu Ser Val Phe Gly Val Thr Gly 225 Ala Thr Asp Thr Ser Thr Leu Pro Leu Val Asp Pro Ala Asn Val 240 Leu Asp Leu Ser Thr Leu Ala Leu Phe Gly Thr Gly Thr Val Met 255 Ile Asn Arg Gly Ser Gly Gln Asn Asp Gly Leu Val Ser Lys Cys 270 Ser Ala Leu Tyr Gly Lys Val Leu Ser Thr Ser Tyr Lys Trp Asn 285 His Leu Asp Glu Ile Asn Gln Leu Leu Gly Val Arg Gly Ala Tyr 300 Ala Glu Asp Pro Val Ala Val Ile Arg Thr His Ala Asn Arg Leu 315 Lys Leu Ala Gly Val 320
【００５２】配列番号：６ 配列の長さ：３１９ 配列の型：アミノ酸 配列 Ala Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Val Ile Leu Val His 15 Gly Leu Ala Gly Thr Asp Lys Phe Ala Asn Val Val Asp Tyr Trp 30 Tyr Gly Ile Gln Ser Asp Leu Gln Ser His Gly Ala Lys Val Tyr 45 Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly 60 Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Tyr Val Lys Gln Val Leu Ala Ala 75 Thr Gly Ala Thr Lys Val Asn Leu Ile Gly His Ser Gln Gly Gly 90 Leu Thr Ser Arg Tyr Val Ala Ala Val Ala Pro Gln Leu Val Ala 105 Ser Val Thr Thr Ile Gly Thr Pro His Arg Gly Ser Glu Phe Ala 120 Asp Phe Val Gln Asp Val Leu Lys Thr Asp Pro Thr Gly Leu Ser 135 Ser Thr Val Ile Ala Ala Phe Val Asn Val Phe Gly Thr Leu Val 150 Ser Ser Ser His Asn Thr Asp Gln Asp Ala Leu Ala Ala Leu Arg 165 Thr Leu Thr Thr Ala Gln Thr Ala Thr Tyr Asn Arg Asn Phe Pro 180 Ser Ala Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Ala 195 Thr Glu Thr Val Gly Gly Ser Gln His Leu Leu Tyr Ser Trp Gly 210 Gly Thr Ala Ile Gln Pro Thr Ser Thr Val Leu Gly Val Thr Gly 225 Ala Thr Asp Thr Ser Thr Gly Thr Leu Asp Val Ala Asn Val Thr 240 Asp Pro Ser Thr Leu Ala Leu Leu Ala Thr Gly Ala Val Met Ile 255 Asn Arg Ala Ser Gly Gln Asn Asp Gly Leu Val Ser Arg Cys Ser 270 Ser Leu Phe Gly Gln Val Ile Ser Thr Ser Tyr His Trp Asn His 285 Leu Asp Glu Ile Asn Gln Leu Leu Gly Val Arg Gly Ala Asn Ala 300 Glu Asp Pro Val Ala Val Ile Arg Thr His Val Asn Arg Leu Lys 315 Leu Gln Gly Val 319
【００５３】配列番号：７ 配列の長さ：３１９ 配列の型：アミノ酸 配列 Ala Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Val Ile Leu Val His 15 Gly Leu Ala Gly Thr Asp Lys Phe Ala Asn Val Val Asp Tyr Trp 30 Tyr Gly Ile Gln Ser Asp Leu Gln Ser His Gly Ala Lys Val Tyr 45 Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly 60 Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Tyr Val Lys Gln Val Leu Ala Ala 75 Thr Gly Ala Thr Lys Val Asn Leu Ile Gly His Ser Gln Gly Gly 90 Leu Thr Ser Arg Tyr Val Ala Ala Val Ala Pro Gln Leu Val Ala 105 Ser Val Thr Thr Ile Gly Thr Pro His Arg Gly Ser Glu Phe Ala 120 Asp Phe Val Gln Asp Val Leu Lys Thr Asp Pro Thr Gly Leu Ser 135 Ser Thr Val Ile Ala Ala Phe Val Asn Val Phe Gly Thr Leu Val 150 Ser Ser Ser His Asn Thr Asp Gln Asp Ala Leu Ala Ala Leu Arg 165 Thr Leu Thr Thr Ala Gln Thr Ala Thr Tyr Asn Arg Asn Phe Pro 180 Ser Ala Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Ala 195 Thr Glu Thr Val Gly Gly Ser Gln His Leu Leu Tyr Ser Trp Gly 210 Gly Thr Ala Ile Gln Pro Thr Ser Thr Val Leu Gly Val Thr Gly 225 Ala Thr Asp Thr Ser Thr Gly Thr Leu Asp Val Ala Asn Val Thr 240 Asp Pro Ser Thr Leu Ala Leu Leu Ala Thr Gly Ala Val Met Ile 255 Asn Arg Ala Ser Gly Gln Asn Asp Gly Leu Val Ser Arg Cys Ser 270 Ser Leu Phe Gly Gln Val Ile Ser Thr Ser Tyr His Trp Asn His 285 Leu Asp Glu Ile Asn Gln Leu Leu Gly Val Arg Gly Ala Asn Ala 300 Glu Asp Pro Val Ala Val Ile Arg Thr His Val Asn Arg Leu Lys 315 Leu Gln Gly Val 319
【図面の簡単な説明】
【図１】Pseudomonas cepacia M-12-33の染色体より分
離したリパーゼ構造遺伝子の制限酵素切断地図を示す。
【図２】ベクターpLiP23を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 佐々木 征治 愛知県西春日井郡西春町大字九之坪西城屋 敷51 天野製薬株式会社中央研究所内

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】１つ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸に
    置換することによって得ることができる、野生型酵素の
    立体選択性が逆転したリパーゼ。
  2. 【請求項２】１つ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸に
    置換することにより、野生型酵素の立体選択性が逆転し
    たリパーゼを製造する方法。
  3. 【請求項３】221位のアミノ酸がLeuに、266位のアミノ
    酸をLeuに、287位のアミノ酸をIleに置換されたシュー
    ドモナス属由来のリパーゼ。
  4. 【請求項４】221位のアミノ酸がLeuに、265位のアミノ
    酸をLeuに、286位のアミノ酸をIleに置換されたシュー
    ドモナス属或いはクロモバクテリウム属由来のリパー
    ゼ。
  5. 【請求項５】一般式［Ｉ］ 【化１】 〔式中、Ｘは下記の一般式［ＩＩ］ 【化２】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一でも異なっていてもよ
    く、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ニトリル基又
    はトリフロロメチル基を表す。）或いは、アルキル基を
    示し、Ｒ4はアシルオキシメチル基、置換基を有するア
    シルオキシメチル基、アルコキシカルボニルオキシメチ
    ル基、（２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イ
    ル）メチル基、（５−置換−２−オキソ−１，３−ジオ
    キソレン−４−イル）メチル基又はアシル基を表し、Ｒ
    5は低級アルキル基又は置換基を持つアルキル基を表
    し、Ｒ6は水素原子、低級アルコキシメチル基又は低級
    アシルオキシメチル基を表す〕で表される１，４−ジヒ
    ドロピリジン化合物に酵素を作用させ、一般式［ＩＩ
    Ｉ］ 【化３】 〔式中、Ｘは下記の一般式［ＩＩ］ 【化４】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一でも異なっていてもよ
    く、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ニトリル基又
    はトリフロロメチル基を表す。）或いは、アルキル基を
    示し、Ｒ4はアシルオキシメチル基、置換基を有するア
    シルオキシメチル基、アルコキシカルボニルオキシメチ
    ル基、（２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イ
    ル）メチル基、（５−置換−２−オキソ−１，３−ジオ
    キソレン−４−イル）メチル基又はアシル基を表し、Ｒ
    5は低級アルキル基又は置換基を持つアルキル基を表
    し、Ｒ6は水素原子、低級アルコキシメチル基又は低級
    アシルオキシメチル基を表し、＊は光学活性点を表す〕
    で表される１，４−ジヒドロピリジン化合物の合成方法
    において、請求項１、請求項３又は請求項４記載のリパ
    ーゼを用いることを特徴とする光学活性１，４−ジヒド
    ロピリジン化合物の製造方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000060587A (ja) * 1998-08-27 2000-02-29 Nagase Seikagaku Kogyo Kk 新規な油脂組成物の製造方法および用途
WO2021020458A1 (ja) * 2019-08-01 2021-02-04 天野エンザイム株式会社 新規リパーゼ及びその用途

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